FI103342B - Menetelmä G-CSF:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi - Google Patents

Description

, 103342

Menetelmä G-CSF:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi Tämä hakemus on jakamalla erotettu FI-hakemuksesta 900178.

5

Keksinnön alue

Keksintö koskee menetelmää granulosyytin pesäk-kekasvua stimuloivan tekijän (G-CSF) eristämiseksi ja puhdistamiseksi G-CSF:ää tuottavasta mikro-organismista.

10 G-CSF:ää voidaan käyttää eläinten infektioiden hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi. G-CSF voi erityisesti olla ihmisen G-CSF (hG-CSF) tai naudan G-CSF (bG-CSF). G-CSF voi olla peräisin luonnollisesta lähteestä tai se voi olla peräisin geneettisesti muunnelluista prokaryoottisista tai euka-15 ryoottisista isäntäsoluista, jotka sisältävät yhdistelmä-plasmidin tai virus-DNA-vektorit, jotka sisältävät ihmisen tai naudan G-CSF-geenin tai geneettisesti muunnellut ihmisen tai naudan G-CSF-geenit tai synteettiset ihmisen tai naudan G-CSF-geenit.

20 Keksinnön tausta

Eläinten infektiot johtavat miljardien dollareiden häviöihin vuosittain liha- ja meijeriteollisuudessa. Vaikka nykyään käytetään antibiootteja eläinten infek-. tioissa jonkinmoisella menestyksellä, valtavia menetyksiä 25 tapahtuu. Esimerkkejä tällaisista infektioista ovat lehmien utaretulehdus ja nautakarjan kuljetushalvaus.

Nautaeläimet A. Utaretulehdus

Kallein ongelma maitotaloudessa nykyään on utare-• 30 tulehdus. Utaretulehdus määritellään maitorauhasen tuleh dukseksi. Sitä voi esiintyä millä tahansa nisäkkäällä, esimerkiksi lehmillä, emälampailla ja vuohilla, mutta naudan utaretulehduksella on suurin taloudellinen merkitys. Naudan utaretulehdus on märehtijöiden, kuten lehmien, uta-35 reen infektio, jonka aiheuttavat pääasiallisesti gram- 2 103342 positiiviset ja gram-negatiiviset bakteerit ja erikoisesti voimaperäisten maidontuottoyksikköjen lehmissä. Bakteeri-infektio johtaa maitorauhasen (nimittäin nännien ja utareen) tulehdukseen. Tauti on erikoisen ongelmallinen ja 5 taloudellisesti huomattavan merkittävä, koska patogeeni siirtyy helposti yhdestä eläimestä toiseen lypsyprosessin aikana. Joitakin pääasiallisia patogeenisiä mikro-organismeja, jotka aiheuttavat naudan utaretulehdusta, ovat Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae.

10 Streptococcus uberis. Streptococcus dvsgalactiae.

Escherichia coli. Aerobacter aeroaenes. Klebsiella pneumoniae ja Pseudomonas aeruginosa. Katso myös Bovine Mastitis. toimittanut Glenys Bloomfield, V&O Publications 1987, joka lisätään tähän viitteksi. Nämä mikro-organismit 15 tunkeutuvat utareeseen nännin kanavan läpi ja aiheuttavat maitoa tuottavan kudoksen tulehduksen aiheuttaen arpikudoksen muodostumisen, joka, kerran muodostuttuaan, voi aiheuttaa pysyvän maidon tuoton vähenemisen lehmällä. Tulehdus voi myös muuttaa maidon koostumusta, määrää, ulko-20 näköä ja laatua.

On olemassa naudan utaretulehduksen eri muotoja tai tyyppejä, vaihdellen vakavuudeltaan ja oireiltaan, sisältäen seuraavat: (1) Utaretulehdus: Utareontelon invaasio mikro-or-25 ganismilla, joka jakaantuu rauhasen sisällä ja aiheuttaa tulehduksen; (2) Ei-kliininen tai subkliininen utaretulehdus; Utaretulehduksen muoto, jossa ei ole yhtään rauhasen turpoamista tai havaittavaa maidon epänormaaliutta, vaikka 30 maidossa onkin muutoksia, jotka voidaan todeta erikoistes-teillä. Tämän tyyppinen utaretulehdus on verrattomasti yleisin ja aiheuttaa suurimmat kokonaismenetykset useimmissa karjalaumoissa. Sitä nimitetään usein "piilotetuksi" utaretulehdukseksi; 3 103342 (3) Kliininen utaretulehdus; Utaretulehduksen muoto, jossa on havaittavissa epänormaaleja utareen ja erityksen tiloja. Lievä kliininen utaretulehdus sisältää muutoksia maidossa, kuten hiutaleita, hyytymiä ja vetisen tai 5 epätavallisen ulkonäön. Utareen lämpeneminen ja herkkyys ovat vähäisiä tai niitä ei ole, mutta voi olla merkkejä turpoamisesta. Vakava kliininen utaretulehdus sisältää nopean alun, jossa tapahtuu infektoituneen neljänneksen turpoaminen, joka neljännes on kuuma, kova ja herkkä. Mai-10 to on epänormaalia ja maidontuotto laskee. Joskus utareen paikallisten vaikutusten lisäksi lehmä itse tulee sairaaksi. On merkkejä kuumeesta, nopeasta pulssista, depressiosta, heikkoudesta ja ruokahalun häviämisestä. Näiden tilojen yhdistelmää sanotaan usein akuutiksi svsteemiseksi 15 utaretulehdukseksi. koska vaikutus ei koske vain utaretta vaan koko eläintä; ja (4) Krooninen utaretulehdus; Utaretulehduksen muoto, jonka on aiheuttanut jatkuva utaretulehdus, joka esiintyy useimman aikaa ei-kliinisenä muotona, mutta 20 ajoittain voi kehittyä aktiiviseksi kliiniseksi muodoksi.

Näiden "kuohahdusten" jälkeen ei-kliininen muoto palautuu väliaikaisesti. (Katso yleisesti Current Concepts of Bovine Mastitis, julkaissut The National Mastitis Council, Inc., 2. painos, 1978, sivu 5).

25 Utaretulehdus aiheuttaa jatkuvasti suuria taloudel lisia menetyksiä meijeriteollisuudelle. Utaretulehdus vaikuttaa karjalauman tuottavuuteen monilla tavoilla sekä suorasti että epäsuorasti, sisältäen: (1) maidontuoton häviämisen; (2) infektoituneiden lehmien korkeammat hyl-30 käysmäärät; (3) maidon arvon alenemisen; (4) antibiootti hoidon jälkeisen maidon hylkäämisen; (5) eläinlääkärikustannukset (antibiootit ja eläinlääkärin käynnit); ja (6) kuolemat. (Bovine Mastitis. Glenys Bloomfield, supra. sivu 33). Arvioitu vuosikustannus Yhdysvalloissa on 1 miljardi 35 dollaria yksistään maidon osalta. Hoito- ja hylkäyskustan- 4 103342 nukset nostavat tätä arviota kokonaiskustannukseen noin 1,5-2 miljardia dollaria vuodessa Yhdysvalloissa ja tämä edustaa utaretulehduksen vaikutusta vain 5 %:lle maailman meijerieläimistöstä. (Current Concepts of Bovine Mastitis.

5 suora. sivu 7) . Maapallon lukujen ollessa luonnosteluas- teella USDA:n laatimat luonnokset paljastavat maailman laajuisen menetyksen nousevan yli 20 miljardiin dollariin vuosittain.

Tehokkaiden yhdisteiden, joita käytetään nauta-10 eläinten utaretulehduksen hoitamiseen tai ehkäisemiseen, pitäisi antaa seuraavat tulokset: (1) useimpien tai kaik kien yllä olevien patogeenien pitäisi olla herkkiä yhdisteelle, kun patogeeni on maidossa ja muissa utarenesteis-sä; (2) terapeuttisen vaikutuksen pitäisi olla suhteelli-15 sen nopea; (3) koostumuksen aktiivisten tai muiden aineksien puolesta lehmän utareelle tai nänneille ei pitäisi aiheutua merkittävää ärsytystä; ja (4) aktiivisen yhdisteen ei pitäisi säilyä maidossa paljon pitempää aikaa kuin mitä tarvitaan terapeuttiseen aktiivisuuteen, maidon mene-20 tyksen pienentämiseksi, joka maito täytyy hylätä niin kauan kuin vierasta yhdistettä on läsnä. Naudan utaretulehduksen hoitoon käytettävälle koostumukselle on olemassa muitakin vaatimuksia, mutta yllä olevat neljä kriteeriä ovat eräät kaikista tärkeimmistä.

25 Antibioottilääkitys on ollut pääasiallisin osa uta retulehduksen kontrollistrategiasta. Taulukossa 1 on yhteenveto useista utaretulehduksen hoidossa käytetyistä antibiooteista: 5 103342

Taulukko 1

Utaretulehduksen hoidossa käytetyt bakteerien vastaiset aineet 5 Ryhmä Yhdisteet 1. Beeta-laktaami-antibiootit

Penisilliinit Ampisilliini

Kloksasilliini

Hetasilliini 10 Nafsilliini

Penisilliini G (bentsyylipeni-silliini) Prokaiinipeni- 15 silliini

Kefalosporiinit Kefoperatsoni**

Keturoksiimi Kefalonium Kefapiriini 20 Kefoksatsoli1

Kefrasetriili1 2. Aminoqlvkosidiantibiootit Framysetiini

Neomysiini

Novobiosiini 25 Streptomysiini 3. Makrolidiantibiootit Erytromysiini 4. Tetrasvkliinit Klooritetrasyk- liini

Oksitetrasykliini

30 5. Polvoeotidiantibiootit Polymyksiini B

Ensimmäisen sukupolven; ** kolmannen sukupolven Bovine Mastitis, supra, sivu 70.

β 103342

Utaretulehduksen antibioottihoito annetaan tavallisesti maitorauhasen sisäisillä infuusioilla joko maitoa tuottaviin lehmiin, kun utaretulehdus on havaittu, tai ehtyneisiin lehmiin (kuivalehmäterapia) . (Bovine Mastitis.

5 supra, sivu 69) . Vakavan kliinisen taudin tapauksissa antibiootit täytyy antaa parenteraalisesti (maitorauhasen sisäiset infuusiot ovat tehottomia maitotiehyiden tukkeutumisen vuoksi) (Ibid.).

Aiemmat toiveet, että antibiootit sallisivat taudin 10 täydellisen kontrollin, eivät ole toteutuneet. Yksikään yllä mainituista tähän mennessä käytetyistä antibiooteista ei ole ollut täydellisen tyydyttävä. Lisäksi on havaittu antibioottihoidon korvauksen ei-antibioottisilla kemote-rapeuttisilla lääkeyhdisteillä olevan hyvin toivottavaa 15 seuraavista syistä: (1) Ihmislääkityksessä tehokkaita antibiootteja ei pitäisi käyttää eläinlääkityksessä, jotta ei muodosteta resistenttejä bakteerikantoja, joita esiintyy ihmisen taudeissa; 20 (2) Antibiootit tulisi varata sellaisiin tauteihin, joihin ei ole olemassa mitään kemoterapeuttista lääkeyhdistettä, koska on osoitettu, että bakteerikannat muodostavat resistenssin antibiootille sen laajan käytön jälkeen; ja 25 (3) Staphylococcus aureus. yksi yllä mainituista patogeeneistä, on jo muodostanut resistenssin useimpia naudan utaretulehduksen hoidossa käytettyjä antibiootteja vastaan.

Eräs menetelmä hoitamiseksi ei-antibioottisella ke-30 moterapeuttisella lääkeyhdisteellä on kuvattu US-patentis-sa 4 610 993, jossa esitetään menetelmä eläinten hoitamiseksi naudan utaretulehduksen suhteen tehokkaalla määrällä ainakin yhtä pyridiini-N-oksidi-disulfidiyhdistettä. Toinen samojen keksijöiden menetelmä on kuvattu US-patentissa 7 103342 4 401 666, jossa esitetään menetelmä eläinten hoitamiseksi naudan utaretulehduksen suhteen tehokkaalla määrällä ainakin yhtä pyridiini-N-oksidin metallisuolaa.

Näistä useista julkaistuista menetelmistä huolimat-5 ta jää erittäin tärkeäksi löytää menetelmiä, joiden kustannus /hyöty- suhde on hyvä, joissa käytetään ei-antibioot-tisia yhdisteitä, ja jotka oleellisesti pystyvät ratkaisemaan tähän mennessä käytettyjen antibioottien aiheuttamat haittapuolet ja silti ovat tehokkaita hoidettaessa ja 10 ehkäistäessä utaretulehdusta.

B. Kulietushalvaus

Toinen tavallinen karjateollisuuteen vaikuttava tauti on kuljetushalvaus (naudan hengitystiesairaus). Hengitystiesairaudet ovat jatkuvasti pääasiallisin syy liha-15 karjan tautimenetyksiin. Vuoden mittaisessa tautitutkimuk-sessa koskien 407 000:ää lihakarjan vuoden ikäistä eläintä, hengitystiesairauksien havaittiin olevan vastuussa noin 3/4:sta kliinisistä diagnooseista ja noin 2/3:sta ruumiinavausdiagnooseista.

20 Termiä "kuljetushalvaus" käytetään kuvaamaan hen- gitystiesairausyhdistelmää, joka havaitaan 6 kuukauden ikäisessä tai vanhemmassa karjassa kuljetuksen jälkeen joko syöttöpaikoille tai laitumelle. Vieroituksen, kastraation, sarvien poiston, paaston, tungoksen, infektoivil-25 le aineksille altistumisen, ruokavalion muutosten, ympä ristön äärilämpötilojen ja muiden stressitekijöiden aiheuttamat stressit yhdistettynä virus-, bakteeri-, mykoplasma- ja/tai klamydiainfektioihin myötävaikuttavat kulje-tushalvauskompleksiin. Eri maatilojen ja/tai myyntinavet-30 tojen vasikoiden sekoittaminen edesauttaa suuresti altis tumista infektoiville aineksille. Populaatioiden sekoittaminen voi olla tärkeämpi altistava tekijä kuljetushal-vaukselle kuin stressitekijät, vaikka tauti voi ilmaantua ilman sekoittamista ja stressitekijöitä, jotka tavallises- 8 103342 ti dramaattisesti pahentavat hengitystiesairautta. Yritykset alentaa vieroituksen, kastraation, sarvien poiston, jne., aiheuttamaa stressiä ja karjan totuttaminen uusiin ruokavalioihin päiviä tai viikkoja ennen kuljetusta, ovat 5 joskus onnistuneet (mutta eivät ehkä ole taloudellisia) alentamaan kuljetushalvauksen esiintymistiheyttä. Rokotus joitakin kuljetushalvaukseen osallistuvia infektoivia aineksia vastaan auttaa joskus, mutta rokotteita on saatavissa ja ne ovat tehokkaita vain joitakin harvoja tauti-10 kompleksiin osallistuvia tunnettuja aiheuttajia vastaan.

On yleisessä tiedossa, että perussyy useimmissa kuljetushalvaustautikuolemissa on bakteeripneumonia eli kouhkokuume (tavallisesti Pasteurella). Pasteurella haemo-lytica. varsinkin tyyppi IA, on yleisin hengitystiesaira-15 ustapauksista eristetty bakteeri Pohjois-Amerikassa. Yritykset kokeellisesti tuottaa bakteeripneumoniaa karjassa ovat yleensä epäonnistuneet ilman ankaraa stressiä ja hengitystielle aiheutettua altistavaa vammaa. Yleensä uskotaan, että stressin aikana virukset, mykoplasma ja/tai 20 klamydia aiheuttavat useimmin alkuvamman hengitystielle, joka vamma altistaa vaikealle bakteeri-infektiolle ja taudille .

Tyypillisen kliinisen hengitystiesairauden puhkeaminen alkaa tavallisesti tuntien tai päivien sisällä kar-25 jän saapumisesta syöttöpaikkaan. Juuri kuljetetulla karjalla, joka painaa välillä 300 - 500 naulaa, sairastuvuus hengitystiesairauteen on tavallisesti 20 - 80 % ja kuolevuus 1 - 10 % tai enemmän. Kun analysoidaan karjan seerumia nelinkertaisen vasta-aineen nousun suhteen (serokon-30 versio) ja kun hengitystie ja sen eritteet altistetaan mikrobiologisille eristyksille, voidaan tunnistaa lukematon joukko etiologisia aineita. Monien eläinten, sairaiden ja näennäisesti terveiden, voidaan osoittaa läpikäyneen yhden tai useamman aineen aiheuttaman infektion (hengitys- 9 103342

tiesairaus johtuu luultavasti vain harvoin yhdestä infek-toivasta aineesta). Vaikka naudan hengitystiesairauskomp-leksi on tunnistettavissa kliinisesti syöttöpaikassa saapumisen jälkeen, kliinisen taudin aiheuttavat infektiot 5 alkavat mahdollisesti myyntinavetoissa, joissa eri maatilojen karja ensiksi kootaan yhteen. Katso myös Bovine Respiratory Disease. Loan, R.W., Texas A&M

University Press, 1984, joka liitetään tähän viitteeksi. Sikaeläimet 10 Hengitystiesairaudet, varsinkin pneumonia, maksavat sikateollisuudelle satoja miljoonia dollareita vuosittain. Se on ongelma numero 1 kasvatuksen loppujakson aikana, joka vie puolet sian elämästä. Joitakin yleisiä pneumoniaan liittyviä patogeenejä ovat Pasteurella multocida.

15 Mycoplasma hvopneumonia. Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumonia. Streptococcus suis. Salmonella choler-suis. Bordetella bronchiseptica. pseudorabies-virus ja sian influenssavirus.

Haemophilus Actinobacillus pleuropneumoniae on pää-20 asiallisin syy sikojen pneumoniaan. Tauti on levinnyt maailman laajuiseksi ja on yksi taloudellisesti tärkeimmistä sian sairauksista. Vuonna 1985 sikojen hengitystiesairauksien arvioitiin aiheuttaneen 208 miljoonan dollarin menetykset tuottajille. Pleuropneumonia on pelätyin hen-25 gitystiesairaus, koska rokotteet eivät onnistu ehkäisemään infektioita tai jatkuvasti infektoituneiden kantajaeläin-ten esiintymisiä.

Suojaamattomassa laumassa tapahtuneen pleuropneu-monian akuutin puhkeamisen taloudellinen vaikutus on il-,· 30 meinen kuoleman johdosta aiheutuneiden menetysten ollessa välillä 0,4 % - 24 % ja sairastuvuuden ollessa 8,5 % -40 %. Akuutin taudin hoidossa on luotettu antibioottien käyttöön. Antibioottien rutiinikäyttöä ollaan nopeasti rajoittamassa julkisen huolestumisen ja hallituksen pai-35 nostuksen vuoksi.

10 103342

Sian pleuropneumonian yksityiskohtaiset histomor-fologiset ja bakteriologiset tutkimukset paljastavat, että i) taudin alussa suuri määrä neutrofiilejä paikantuu in-fektiokohtaan; ii) on olemassa suhde sikojen kyvyssä ra-5 joittaa infektio keuhkoon, sillä tavoin estäen baktere-mian, ja eloonjäännin välillä; ja iii) kiertävien neutro-fiilien kokeellinen vähentäminen johtaa ankarampaan tautiin .

Hevoseläimet 10 Ensimmäiset kaksi elinviikkoa (neonataaliaika) on aika, jolloin varsoilla esiintyy ankara tauti tai menehtyminen infektion johdosta (verenmyrkytys) . Vastasyntyneen verenmyrkytys edustaa merkittäviä menetyksiä hevosteolli-suudelle. Verenmyrkytykseen sairastuneissa varsoissa neut-15 rofiilien lukumäärä on tavallisesti hyvin alhainen (neutropenia) ja tämä on yksi syy 60 - 75 % kuolevuuteen vastasyntyneiden varsojen verenmyrkytyksissä.

Gram-negatiivien aiheuttamaa verenmyrkytystä pienemmät ongelmat, kuten luu- ja nivelvammat, suolitulehdus, 20 napalaskimon tulehdus, hengitystiesairaus ja huono kehittyminen, aiheuttavat myös merkittäviä menetyksiä hevos-teollisuudessa. Immunoglobuliinitasot eivät ole korreloineet hyvin infektiosuojauksen kanssa 20 %:n verenmyrkytykseen sairastuneista varsoista omatessa kaksi kertaa suosi-25 teltavan IgG-tason (400 mg/ml). Kriittisesti sairaan verenmyrkytykseen sairastuneen varsan tehokkaallakin hoidolla eloonjääntitaso on vain 25 - 40 %. Neutrofiilitoiminnan on määritelty oleellisesti alentuneen varsoilla, joille ei anneta riittävästi ternimaitoa. Vastasyntyneellä varsalla . 30 tämä yhdessä verenmyrkytyksen myötä usein kehittyvän neut- ropenian kanssa ovat tärkeitä syitä suureen kuolevuuteen ja ehkä infektion alkamiseen.

Granulosvvtin pesäkekasvua stimuloiva tekijä

Granulosyytin pesäkekasvua stimuloiva tekijä (G-35 CSF) on yksi useista glykoproteiinikasvutekijöistä, jotka “ 103342 tunnetaan pesäkekasvua stimuloivina tekijöinä (CSF:t), koska ne ylläpitävät hemopoieettisten kantasolujen kasvua. G-CSF stimuloi luuytimen spesifisten kantasolujen kasvua ja niiden erilaistumista granulosyyteiksi. Se erotetaan 5 muista CSF:stä kykynsä suhteen sekä stimuloida neutrofii-listen granulosyyttien pesäkkeen muodostusta puolikiin-teällä agarilla että indusoida jyrsijän myelomonosyyttis-ten leukemiasolujen terminaalinen erilaistuminen in vitro. Granulosyytin pesäkekasvua stimuloiva tekijä on vahva 10 neutrofiilien kasvun ja kypsymisen stimuloija in vivo [Cohen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (1987) 84: 2484 - 2488]. G-CSF kykenee myös indusoimaan kypsien neutrofiili-en toiminnallisen aktiivisuuden tai "primauksen" in vitro [Weisbart, R.H., Gasson, C.G., ja D.W. Golde, Annals of 15 Internal Medicine (1989) 110: 297 - 303]. G-CSF:n on osoitettu aktivoivan ihmisen granulosyyttejä ja parantavan kemotaktisen peptidin, N-formyyli-metionyyli-leusyyli-fe-nyylialaniinin, stimuloimaa superoksidin vapautusta [S. Kitagawa et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1987) 20 144: 1143 - 1146 ja C.F. Nathan, Blood (1989) 74: 301 - 306], ja aktivoivan ihmisen neutrofiilien IgA-välitteistä fagosytoosia [Weisbart, R.H. et ai., Nature (1988) 332: 647 - 649] .

Neutrofiilit ovat isännän puolustusmekanismin 25 kriittinen osa bakteeri- ja sieni-infektioita vastaan. G-CSF kykenee indusoimaan kohoamisen kiertävien neutrofiilien kokonaismäärässä ja parantaa neutrofiilien toimintaa.

Ihmisen yhdistelmä-G-CSF:n cDNA:n kloonaus ja eks-pressio on kuvattu ja on varmistettu, että yhdistelmä-·' 30 G-CSF omaa useimmat, ellei kaikki, luonnollisen molekyylin biologiset ominaisuudet [Souza, L. et ai., Science (1986) 232, 61 - 65]. cDNA:n ja genomisten DNA-kloonien sekvenssianalyysit ovat sallineet aminohapposekvenssin päättelyn ja paljastavat, että proteiini on 204 aminohapon pituinen 12 103342 ja siinä on 30 aminohapon pituinen signaalisekvenssi. Kypsä proteiini on 174 aminohapon pituinen eikä siinä ole yhtään mahdollisia N-sidoksellisia glykosylaatiokohtia, mutta useita mahdollisia kohtia O-sidosvälitteiseen glykosy-5 laatioon.

Ihmisen G-CSF:n kloonauksen ja sitä koodittavan cDNA:n ekspression on kuvannut kaksi ryhmää [Nagata, S. et ai. . Nature 319 (1986) 415 - 418, Souza, L.M. et ai., Science 232 (1986) 61 - 65] . Ensimmäinen julkaisu, joka 10 kuvaa G-CSF:n cDNA-kloonia, ehdotti, että kypsä proteiini oli 177 aminohapon pituinen. Kirjoittajat julkaisivat, että he olivat myös tunnistaneet cDNA-kloonin G-CSF:lle, joka klooni kooditti proteiinia, jolta puuttui kolmen aminohapon pituinen jakso. Tämä lyhyempi G-CSF:n cDNA-muo-15 to ekspressoi odotettua G-CSF-aktiivisuutta. Toinen jul kaisu kuvaa tälle lyhyelle muodolle identtistä cDNA-sek-venssiä eikä mainitse mitään muista muunnoksista. Koska nämä kirjoittajat varmistivat, että lyhyt cDNA ekspressoi G-CSF:ää odotetulla biologisen aktiivisuuden profiililla, 20 on luultavaa, että tämä on tärkeä G-CSF:n muoto ja että pitempi muoto on joko vähäisempi mRNA:n syntyessä muodostunut muunnelma tai kloonauksella keinotekoisesti saatu tulos.

Matsumoto et ai., Infection and Immunity, osa 55, 25 numero 11 (1987) 2715, raportoivat ihmisen G-CSF:n suojaa-vasta vaikutuksesta mikrobi-infektiota vastaan neutro-peenisessa hiiressä.

Seuraavat patenttijulkaisut koskevat G-CSF:ää: WO-A-8 703 689, Kirin/Amgen, kuvaa hybridoomia, jotka * 30 tuottavat ihmisen G-CSF:lie spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, ja näiden käyttöä G-CSF:n puhdistuksessa, WO-A-8702060, Biogen, esittää ihmisen G-CSF:n kaltaisia polypeptideja ja menetelmiä niiden tuottamiseksi, US-pa-tentti 4 810 643, Amgen, esittää ihmisen G-CSF:n kaltaisia 13 103342 polypeptideja, niitä koodittavia sekvenssejä ja menetelmiä niiden tuottamiseksi, ja WO-A-8 604 605 ja WO-A-8 604 506, Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha, esittävät ihmisen G-CSF:ää koodittavan geenin ja ihmisen G-CSF:ää sisältäviä 5 infektioinhibiittoreita.

Keksintö koskee menetelmää G-CSF:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi G-CSF:ää tuottavasta mikro-organismista.

Keksinnön muut piirteet ja ominaisuudet tulevat ilmeisiksi otettaessa huomioon seuraava kuvaus ja patent-10 tivaatimukset.

Keksinnön kuvaus

Keksintö koskee siis menetelmää G-CSF:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi G-SCF:ää tuottavasta mikro-organismista .

15 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että 1) mikro-organismi hajotetaan, ja liukenematon, G-CSF:ää sisältävä materiaali erotetaan liukoisesta pro-teiinimateriaalista, 20 2) G-CSF liuotetaan ja hapetetaan denaturoivan liuottavan aineen ja hapettavan aineen läsnä ollessa, 3) denaturoiva liuottava aine erotetaan G-CSF:stä kvaternaarisia ammoniumryhmiä sisältävää anioninvaihto-hartsia, kuten Dowex®-anioninvaihtohartsia, käyttäen, 25 4) G-CSF:lie suoritetaan anioninvaihtokromatogra- fia, jota seuraa kationinvaihtokromatografia, ja 5) puhdistettu G-CSF otetaan talteen.

Kuvataan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät tehokkaan määrän keksinnön mukaisesti saatua 30 polypeptidituotetta yhdessä sopivien laimentimien, adju-vanttien ja/tai kantajien kanssa, jotka ovat käyttökelpoisia eläinten hoidossa.

Keksinnön mukaisesti saatua G-CSF:ää, edullisesti hoidettavan eläimen geenistä peräisin olevaa G-CSF.-ää, 35 voidaan käyttää infektioiden hoitamiseksi ja ehkäisemisek- 1« 103342 si eläimissä, kuten nautaeläimissä. Erityisesti G-CSF:ää voidaan käyttää nautaeläinten utaretulehduksen tai kulje-tushalvauksen hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi, vastasyntyneen varsan verenmyrkytyksen hoitamiseksi tai ehkäisemi-5 seksi, ja sian infektioiden, kuten pleuropneumonian, hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi. G-CSF on siis tehokas hoitamaan tai ehkäisemään erilaisia infektioita eläimissä, erikoisesti nisäkkäissä,nautaeläimissä, siipikarjassa, sioissa, hevosissa, koirissa ja kissoissa.

10 G-CSF:ää voidaan myös käyttää profylaktisena hoito na lisäämään isännän puolustusta eläimillä, joilla on riski saada bakteeri-, hiiva- tai sieni-infektio. G-CSF:ää voidaan käyttää esimerkiksi profylaktisena hoitona normaaleilla ihmispotilailla, joilla on riski saada pneumonia 15 (esim. sairaalapneumonia), leikkaushaavainfektioita, virtsatieinfektioita ja suolistoinfektioita. Termi "normaali" tässä käytettynä merkitsee eläintä, jolla on normaali im-muunitoiminta ja normaali veren valkosolumäärä ja solujen erilaistuminen. Kuvaus eri sairaalainfektioista, joita 20 vastaan profylaktista hoitoa voidaan käyttää, on esitetty julkaisussa Nelson et ai., J- Critical Illness, sivut 12 -24 (huhtikuu 1988), joka liitetään tähän viitteksi. Profy-laktisesti G-CSF annetaan tyypillisesti 0-3 vuorokautta ennen tapahtumaa (esim. leikkausta, suonen kanylointia, 25 katetrin asettamista, kurkkuputken asettamista), jossa on infektioriski. G-CSF annetaan ihon alaisesti tai intra-ventrikulaarisesti päivittäin annoksena, joka vaihtelee 1-20 ^g/kg, suositeltavammin 3-15 μg/kg. Alan asiantuntija tietää, miten annos säädetään.

• 30 Keksinnön mukaisesti saatua G-CSF:ää voidaan myös käyttää hoidettaessa potilasta juuri tai pian sen jälkeen, suositeltavasti kahdeksan tunnin, suositeltavimmin neljän tunnin sisällä siitä, kun potilas on saanut tapaturmassa vamman (esim. ihmisen tai eläimen pureman, ampuma-aseen 35 tai veitsen haavan tai muun pistohaavan), joka vaatii lää- is 103342 kinnällistä tai kirurgista toimenpidettä. G-CSF annetaan ennen infektion tunnistamista (esim. potilaan kudosten tai kehon nesteiden mikrobiologisella tai histologisella vakio tutkimuksella) tai kliinistä ilmenemistä ja oireita 5 (esim. märkivä tulehduserite, vilunväreet, kuume).

Karjaa hoidetaan profylaktisesti ennen kuljetusta tai muita tapahtumia, jotka voivat heikontaa karjaa, jotta tehostetaan ja pohjustetaan niiden kykyä torjua infektioita. G-CSF:n anto voidaan suorittaa silloin, kun karjaa 10 käsitellään, nimittäin rokotetaan, polttomerkitään, jne. Käsittely G-CSF:llä voidaan suorittaa myös kuivalehmätera-pian aikana ja/tai juuri ennen, kun lehmä synnyttää synnytyksen jälkeisten kohdunsisäisten infektioiden ja utaretulehduksen todennäköisyyden alentamiseksi imetyksen alku-15 vaiheissa. Katso Kehrli et ai., Am. J. Vet. Res., 50, numero 2 (1989) 207, jossa kuvataan naudan neutrofiilien toiminta synnytysperiodin aikana. Tavanomaisesti juuri ennen synnytystä ei anneta mitään antibioottihoitoa, koska jäänteet, jotka ilmestyvät lehmänmaitoon, tekevät sen 20 käyttökelvottomaksi.

G-CSF:llä tarkoitetaan yhtä hematopoieettisista kasvutekijöistä, jotka tunnetaan granulosyytin pesäkemuo-dostusta stimuloivina tekijöinä. G-CSF:n biologiset aktiivisuudet sisältävät: pienten kantasolujen erilaistumisen 25 stimuloimisen erilaisiksi verisolulinjoiksi, näiden ve- risolulinjojen kasvun stimuloimisen ja kypsien verisolujen lopullisen erilaistumisen stimuloimisen näistä linjoista. Utaretulehduksen hoitamiseen tai ehkäisemiseen käytetyn G-CSF:n polypeptidin suositeltavat lähteet ovat ihminen ja . .· 30 nauta, ja se voi olla luonnollista alkuperää tai yhdistel- mä-DNA-tekniikalla valmistettujen isäntäsolujen tuote, jotka isäntäsolut sisältävät G-CSF:ää koodittavan DNA-sek-venssin.

G-CSF-geeniä koodittava DNA on genominen DNA-sek-35 venssi, cDNA-sekvenssi tai valmistettu (tai synteettinen) 1« 103342 DNA-sekvenssi, jota ekspressoidaan prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa isäntäsolussa polypeptidinä, jolla on osa tai kaikki luonnollisesti esiintyvän G-CSF:n primaarisen rakenteen konformaatioista ja yksi tai useampi sen biolo-5 gisista ominaisuuksista. Biologisesti toimivaa plasmidia tai virus-DNA-vektoria, jotka sisältävät G-CSF:ää koodit-tavan DNA-sekvenssin, voidaan käyttää transformoitaessa tai transfektoitaessa prokaryoottinen tai eukaryoottinen isäntäsolu tuottamaan solulinjat, jotka ekspressoivat 10 G-CSF-polypeptidiä, glykosyloituna tai glykosyloitumatto- mana.

Ihmisen G-CSF:n eri muodot, jotka ovat käyttökelpoisia menetelmässä utaretulehduksen hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi, ja näiden valmistus ja puhdistus, on kuvattu 15 yksityiskohtaisesti US-patentissa 4 810 643, joka lisätään tähän viitteksi. US-patentissa 4 810 643 kuvataan uusia geenisegmentteja, biologisesti toimivia yhdistelmäplasmi-deja ja virus-DNA-vektoreita ja prokaryoottisia ja euka-ryoottisia isäntäsoluja, jotka sisältävät G-CSF-geenin 20 tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostetun G-CSF-geeni-muunnoksen. Isäntäsolut ekspressoivat biologisesti aktiivista G-CSF:ää tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua G-CSF-muunnosta.

, FI-patenttihakemus 900178 kuvaa naudan G-CSF-geenin 25 eristyksen ja karakterisoinnin ja se kuvaa erikoisesti uusia geenisegmenttejä, biologisesti toimivia yhdistelmä-plasmideja ja virus-DNA-vektoreita, ja prokaryoottisia ja eukaryoottisiä isäntäsoluja, jotka sisältävät naudan G-CSF-geenin tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostetun nau-: 30 dan G-CSF-geenimuunnoksen. Yhdistelmäplasmideilla tai vi rus -DNA- vektoreilla transformoidut tai transfektoidut isäntäsolut ekspressoivat biologisesti aktiivista naudan G-CSF:ää tai yhdistelmä-DNA-tekniikoilla muodostettua naudan G-CSF:n muunnosta.

17 103342 G-CSF:n puhdistaminen G-CSF tuotetaan liukenemattomassa muodossa E. coli-kannassa. Puhdistusmenetelmä kehitettiin monomeerisen hapettuneen tuotteen saamisen varmistamiseksi. Tämän saavut-5 tamiseksi proteiini liuotetaan denaturoivan aineen läsnä ollessa ja sen annetaan hapettua tämän denaturoivan aineen läsnä ollessa. Hapettunut proteiini poistetaan sitten denaturoivasta aineesta ja puhdistetaan homogeeniseksi. Seu-raavassa kuvataan menetelmä ihmisen G-CSF:n puhdistamisek-10 si ilmoittaen erot, joita tehdään puhdistettaessa naudan G-CSF.

Soluhaiotus 350 g jäädytettyä solutahnaa yhdistetään 2-3 litran kanssa 1 mM ditiotreitolia (DTT) ja dispersoidaan huo-15 lellisesti. Sitten solususpensio ajetaan Gaulin-homogeni-saattorin läpi sopiva määrä syklejä, jotta saadaan aikaan suurempi kuin 95 % soluhajotus. Liemi jäähdytetään 5 ± 3 °C:seen ennen homogenisaatiota ja alle 18 °C:seen homogeni-saattorin läpi ajettujen syklien välillä. Homogenisaatio-20 liemi sentrifugoidaan saaden talteen pelletti, joka sisältää yli 95 % G-CSF:stä, joka oli alunperin läsnä solutah-nassa. (Naudan G-CSF:n hajotusseos ei sisällä DTT:tä).

Uuttaminen . Homogenisoitu pelletti dispersoidaan sitten noin 3 25 litraan 1 % deoksikolaatti (DOC), 5 mM DTT, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-liuosta, pH 9. Suspensiota sekoitetaan 15 - 20 °C:ssa 30 - 40 minuuttia ja sentrifugoidaan sitten. (Tätä DOC-uutosvaihetta ei käytetä naudan G-CSF:lle). Sitten pelletti suspendoidaan uudelleen noin 3 litraan kylmää 30 vettä ja sentrifugoidaan uudelleen. G-CSF saadaan talteen pelletistä kokonaissaannolla yli 80 %. Vaihtoehtona deok-sikolaatille käytetään muuta sappisuolaa tai ionitonta de-tergenttiä.

18 103342

Liuotus ia hapetus

Yllä olevista uutoksista saatu lopullinen pelletti suspendoidaan noin 2,5 litraan 2 % Sarkosyl, 40 mM Tris (pH 8,0) liuokseen ja annetaan liueta 15 - 20 °C:ssa 30 mi-5 nuuttia. Lisätään kuparisulfaattia niin, että loppukonsen-traatioksi tulee 40 μΜ ja seoksen annetaan sekoittua ainakin 12 tuntia 15 - 20 °C:ssa. Noin 70 % G-CSF:stä hapettuu oikeaksi monomeeriseksi muodoksi tämän menetelmän aikana.

Sarkosvl'in poistaminen 10 Tuloksena syntynyt liuennut proteiiniseos sentri- fugoidaan liukenemattomien soluroskien poistamiseksi ja sitten laimennetaan nelinkertaisesti 13,3 mM Tris-liuok-sella, pH 7,7. Sitten lisätään noin 2000 g Dowex'ia, joka on tasapainotettu 20 mM Tris-puskurissa, pH 7,7. Dowex on 15 ioninvaihtohartsi. Katso Dowex: Ion Exchange. The Dow Chemical Company, Midland, MI (1988), joka lisätään tähän viitteeksi. Edullisesti käytetään Dowex 1X4 verkkokoon 20 - 50 omaavaa tyyppi-l:tä, joka on vahva emäksinen an-ioninvaihtohartsi, kloridimuoto. Hartsi on 4 % ristisi-20 dottu styreeni-divinyylibentseenipolymeerimatriisi sisältäen kvaternaarisia toiminnallisia ammoniumryhmiä, jotka toimivat ioninvaihtokohtina. "Tyyppi 1" tarkoittaa, että ammoniumryhmä koostuu typpiatomista, joka on sitoutunut . polymeeriseen bentsyyliryhmään, joka on kiinnittynyt mat- 25 riisiin, ja kolmesta metyyliryhmästä. Verkkokoko mitataan märästä hartsista US-standardin mukaisella seulalla. Ammoniumryhmä on positiivisesti varautunut; tämä toiminnallinen ryhmä vaihtaa siihen liittyneen kloridi-ionin toisiin negatiivisesti varautuneisiin ioneihin reversiibelil-30 lä reaktiolla. Dowex 2 -hartsi on tyyppi II-hartsi, jossa yksi metyyliryhmistä on korvattu etanoliryhmällä.

19 103342

Tyyppi I

5 1 ΓfH3 Ί ° <--Γ V CHi—Ν—CHa ί UJ CHa ίο

Tyyppi II

15 _ __, CHa ~1 + > ί \ ι Cl

5--(' VCHa—N—CHa—CHaOH

“ \=/ U

20 '-H*

Tyyppi I- ja tyyppi II-hartsit eroavat pääasiassa af-25 finiteettiensa suhteen hydroksidi-ioniin suhteessa muihin anioneihin ja kemialliselta stabiilisuudeltaan. Tyyppi II-hartsit muutetaan tehokkaammin hydroksidimuotoon kuin tyyppi I -hartsit, mutta tyyppi I -hartsit ovat luontaisesti stabiilimpia kemiallisesti, varsinkin hydroksidimuo-30 dossa.

Kvaternaariset ammoniumanioninvaihtohartsit ovat erittäin ionisoituneita ja niitä voidaan käyttää koko pH-alueella. Niitä voidaan käyttää myös suolan hajotusreak-tioissa, joissa neutraali suola muutetaan vastaavaksi 35 emäkseksi.

20 1 0 3 3 4 2

Muut ioninvaihtohartsit, joilla on vahvat anionin-vaihto-ominaisuudet, joissa varaus on kiinnostuksen kohteena oleville proteiineille luoksepääsemätön, ovat vaihtoehtoja Dowex'in käytölle esillä olevassa keksinnössä.

5 Tämän seoksen annetaan sekoittua ainakin yksi tunti 15 - 20 °C:ssa Sarkosyl'in (N-lauroyylisarkosiinin natrium-suola) (Sigma) poistamiseksi proteiiniliuoksesta ja sitten Dowex suodatetaan pois. Voidaan saada talteen enemmän kuin 80 % oikein hapettunutta G-CSF-muotoa. (Naudan G-CSF:ää 10 käsitellään 2-8 °C:ssa tämän vaiheen aikana).

Anioninvaihtokromatografia (tätä vaihetta ei käytetä naudan G-CSF:lle)

Tuloksena syntynyt proteiiniliuos lisätään DEAE-selluloosa (Whatman DE-52 tai vastaava) pylvääseen, joka 15 on tasapainotettu 20 mM Tris-liuoksessa, pH 7,7. Pylväs pestään 20 mM Tris-liuoksella, pH 7,7, kunnes eluantin absorbanssi 280 nm:llä on suunnilleen nolla. G-CSF eluoi-daan sitten pylväästä 20 mM Tris, 40 mM NaCl-liuoksella, pH 7,7.

20 Kationinvaihtokromatografia DEAE-pylväästä saadun eluaatin pH säädetään pH 5,4:ksi 50 % etikkahapolla ja laimennetaan ainakin kaksinkertaisesti 5 mM natriumasetaatilla, pH 5,4. Liuos laitetaan nopean virtausnopeuden omaavaan CM-Sepharose-pylvää-25 seen, joka on tasapainotettu 20 mM natriumasetaatissa, pH 5,4. Lisäyksen jälkeen pylväs pestään 20 mM natriumasetaatilla, pH 5,4, kunnes absorbanssi 280 nm:llä on suunnilleen nolla. G-CSF eluoidaan sitten 20 mM natriumasetaatti, 37,5 mM NaCl-liuoksella, pH 5,4. (Naudan G-CSF eluoidaan 30 150 mM NaCl:lla samassa puskurissa).

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää naudan G-CSF:n restriktiokartan;

Kuvio 2a kuvaa naudan G-CSF:n kypsää proteiinia koodittavaa aluetta; 35 Kuvio 2b on kypsän proteiinin aminohapposekvenssi; 2i 103342

Kuvio 3 on ihmisen G-CSF:n genominen sekvenssi;

Kuvio 4 on ensimmäisen naudan G-CSF:n synteettisen geenin (bG-CSF dna) DNA-sekvenssi;

Kuvio 5 kuvaa oligot, joita käytettiin rakennet-5 taessa toisen naudan G-CSF:n synteettisen geenin (bG-CSF dna4) alayksiköt;

Kuvio 6 esittää naudan G-CSF:n synteettisen geenin bG-CSF dna4:n kaksi alayksikköä;

Kuvio 7 esittää naudan bG-CSF:n synteettisen geenin 10 dna4:n koodittamat aminohapot;

Kuviot 8-12 ovat graafiset esitykset tuloksista, jotka saatiin esimerkissä 4, jotka koskevat Pasteurella hemolvtica-kannalla infektoitujen lehmien hoitoa G-CSF:llä; 15 Kuviot 13 - 17 osoittavat tulokset, jotka saatiin esimerkissä 5, jotka koskevat G-CSF:n käyttöä naudan hengitystiesairauden säätelyssä;

Kuviot 18 - 20 osoittavat tulokset, jotka saatiin esimerkissä 6, jossa tutkitaan G-CSF:n vaikutusta hengi-20 tystiesairauteen;

Kuviot 21 - 23 ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka saatiin esimerkissä 7, jotka koskevat lehmien infektoimista Klebsiella pneumonia-kannalla: ja

Kuviot 24 - 26 ovat graafisia esityksiä tuloksista, 25 jotka saatiin esimerkissä 8, jossa koliformisen utaretulehduksen omaavia lehmiä hoidettiin G-CSF:llä.

Kuviot 27 - 29 ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka saatiin esimerkeissä 9-11.

Esimerkki 1 30 a) Naudan G-CSF:n genomisen kirjaston seulonta cDNA-kloonia, joka koodittaa ihmisen G-CSF:ää, kuten on kuvattu US-patentissa 4 810 643, käytettiin seulottaessa genomista kloonia, joka sisältää naudan G-CSF-gee-nin. Faagissa (Charon 28) oleva naudan genominen kirjas-35 to, joka oli valmistettu Woychick et ai., Nucleic Acids 22 1 0 3 3 4 2

Research 10 (22) : 7197 - 7210 (1982) kuvaaman menetelmän mukaisesti ja saatu J. Bloom'lta ja F. Rothman'lta, mal-jattiin E. coli -kannassa K802 ja seulottiin käyttäen nick-transloitua koetinta, joka sisältää ihmisen G-CSF:n 5 cDNA-fragmentin, joka on eristetty HgiAI-kohdasta Stul-kohtaan. Yhteensä noin 1,2 x 106 faagia maljättiin 12:lie 15 cm Petri-maljalle, plakit kerättiin ja hybridisoitiin koettimeen käyttäen menetelmiä, jotka on kuvattu kirjassa Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 10 (1982). Löydettiin yhteensä 7 positiivista kloonia. Kolme kloonia, jotka antoivat vahvimmat signaalit autoradiogra-fiassa toisen seulonnan jälkeen, kasvatettiin 1 litran viljelmissä ja faagi-DNA valmistettiin, kuten on kuvattu kirjassa maniatis et ai., Molecular Cloning. A Laboratory 15 Manual (1982). Tämä DNA kartoitettiin restriktioentsyymi-digestiolla ja Southern-blottauksella käyttäen radioaktiivista HaiAI-StuI-koetinta. Kartoitustulokset osoittivat, että noin 3 000 emäksen pituinen BamHI- fragmentti sisälsi koko G-CSF-alueen. DNA kloonista 2 digestoitiin BamHI-ent-20 syymillä vapauttaen noin 3000 emäsparin pituinen naudan G-CSF: n sisältävä fragmentti, joka seuraavaksi jatkokloonat-tiin pUC9:ään ja lisäkartoitettiin restriktioendonukle-aasidigestioilla ja Southern-blottauksella.

Naudan G-CSF-geenin sisältävän genomisen DNA:n 25 restriktioendonukleaasikartta (noin 3,0 kiloemästä) on esitetty kuviossa 1. Naudan kypsää G-CSF:ää koodittavan alueen koko sekvenssi määritettiin jatkokloonaamalla fragmentit M13:een ja sekvensoimalla ne dideoksimenetelmällä, jonka ovat kuvanneet Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 30 USA. 74: 5463 (1977). Sekvenssit varmistettiin tai niitä laajennettiin käyttäen samojen kloonien sisäisiä aluk-keita. Koodittavan alueen sekvenssi pääteltiin suoralla vertailulla ihmisen genomiseen G-CSF-sekvenssiin (kuvio 3) ja se on esitetty kuviossa 2a. mRNA:n muodostuksen raja-35 kohtien ja proteiinin aminopään prosessointien oletettiin 23 1 0 3 3 4 2 tapahtuvan samoissa kohdissa kuin ihmisen G-CSF:llä. DNA-sekvenssi koodittaa kypsää proteiinia, jolla on sama pituus kuin ihmisen G-CSF:llä (174 aminohappoa), ja proteiinit ovat 82 % homologisia.

5 b) Naudan synteettisten 6-CSF-geenien rakentaminen ja naudan G-CSF:n ekspressio

Kuvataan tuotettujen geenien valmistusta, jotka geenit koodattavat naudan G-CSF:ää ja sisältävät E. coli-bakteerin suosimia kodoneita, ja naudan G-CSF:n ekspres-10 siota.

Synteettiset geenit suunniteltiin sallimaan naudan granulosyytin pesäkekasvua stimuloivan tekijän (bG-CSF) ekspressio E. coli-bakteerissa (bG-CSF dna (kuvio 4) ja bG-CSF dna4 (kuviot 5 - 7)). bG-CSF on 174 aminohapon pi-15 tuinen ja on 82 % homologinen ihmisen G-CSF-muodolle (174 aminohappoa). Naudan proteiini sisältää viisi varattua jäännöstä enemmän (arg ja glu) kuin hG-CSF ja sen uskotaan siksi olevan hydrofiilisempi.

bG-CSF dna (kuvio 4) ja bG-CSF dna4 (kuviot 5-7) 20 -geenit suunniteltiin niin, että niillä oli suurin mahdol linen taipumus E. coli-bakteerin suosimille kodoneille. bG-CSF dna-geeniin sisällytettiin koodittavan alueen lisäksi aloitus-ATG, ribosomin sitoutumiskohta, kaksi lope-tuskodonia ja 5'-päähän Xbal- ja 3'-päähän BamHI-restrik-25 tiokohta. bG-CSF dna4-geeni suunniteltiin myös omaamaan pienimmät mahdolliset sekundaari-interaktiot ja riittävästi yksittäisiä restriktiokohtia alayksiköiden liittämiseksi ja geenin käsittelyä varten. Yksittäiset BamHI- ja Pstl-kohdat sisällytettiin kohtiin, jotka olivat identti-30 siä niiden kohtien kanssa, jotka on löydetty hG-CSF-gee-nistä, jotka on esitetty julkisessa US-patentissa 4 810 643. Tämä sallii ainutlaatuisten ihmis/nauta-hybridigee-nien ja niiden proteiinituotteiden valmistuksen.

Geeni suunniteltiin kahtena alayksikkönä (alayk-35 sikkö I Xbal-Hindlll ja alayksikkö II Hindlll-EcoRI) sek- 24 103342 vensointi/ekspressiovektoreihin kloonausta varten (kuvio 6). Alayksikkö I sisältää lyhyen 'leader' -sekvenssin, jolla on Xbal-kloonauspää, ja ribosomin sitoutumiskohta (RBS). Alayksikkö II sisältää redundantin lopetuskodonipa-5 rin ja EcoRI-kloonauspään.

Lyhyesti esitettynä käytetyt menetelmät olivat yleisesti sellaiset kuin on kuvattu Alton et ai.'in kanssa yhteisomistetussa esityksessä, PCT julkaisu numero WO83/04 053, joka liitetään tähän viitteeksi. Geenit suun-10 niteltiin niin, että aluksi koottiin osaoligonukleotidit (kuvio 5) useiksi duplekseiksi, jotka vuorostaan koottiin kahdeksi erilliseksi alueeksi (kuvio 6) . Nämä alueet suunniteltiin helposti amplifioitaviksi ja niin, että ne poistettaessa amplifikaatiosysteemistä voidaan koota peräkkäin 15 tai useiden fragmenttiligaatiovaiheiden kautta sopivaan ekspressiovaktoriin.

Alueiden I ja II rakennus on kuvattu kuvissa 5 ja 6. Rakennetaessa aluetta I, kuten on esitetty kuvissa 5 ja 6, koottiin 16 oligonukleotidia 8 dupleksiksi. 8 dupleksia 20 ligoitiin sitten muodostamaan alue I. Kuviosta 6 voidaan myös huomata, että alue I sisältää ylävirralla olevan Xbal-entsyymin eri pituiset juosteet omaavan pään ja ala-virralla olevan HindiII-entsyymin eri pituiset juosteet omaavan pään, jotka ovat käyttökelpoisia amplifikaatio- ja 25 ekspressiovektoreihin ja alueeseen II ligaatiota varten.

Alue II rakennettiin, kuten on esitetty kuvissa 5 ja 6. Tätä rakennetta varten koottiin 16 oligonukleotidia 8 dupleksiksi. 8 dupleksia ligoitiin sitten muodostamaan alue II, kuten on esitetty kuviossa 6. Kuten kuviossa 6 on 30 myös esitetty, alue II sisältää ylävirralla olevan HindiII-entsyymin eri pituiset juosteet omaavan pään ja alavirralla EcoRI-entsyymin eri pituiset juosteet omaavan pään, jotka ovat käyttökelpoisia amplifikaatio- ja ekspressiovektoreihin ja alueeseen I ligaatiota varten.

25 103342

Vaikka mitä tahansa sopivaa vektoria voidaan käyttää tämän DNA:n ekspressoimiseksi, ekspressioplasmidi pCFM1156 voidaan helposti rakentaa plasmidista pCFM836, jonka rakentaminen on kuvattu julkaistussa EP-patenttiha-5 kemuksessa numero 136 490 ja US-patentissa 4 710 473, jotka molemmat liitetään tähän viitteiksi. pCFM836 katkaistaan ensin Ndel-entsyymillä ja sitten tehdään päät tasaisiksi Poli-entsyymillä niin, että molemmat olemassa olevat Ndel-kohdat tuhoutuvat. Seuraavaksi vektori kat-10 kaistaan Clal- ja SacII-entsyymeillä olemassa olevan poly-linkkerialueen poistamiseksi ennen ligaatiota korvaavan polylinkkerialueen kanssa. Tämä korvaava polylinkkerialue voi olla rakennettu menetelmän mukaisesti, jonka menetelmän ovat kuvanneet Alton et ai., suora. Ekspression sääte-15 ly tapahtuu pCFM1156-plasmidissa lambda PL-promoottorin avulla, joka itse voi olla CI857-repressorigeenin säätelyn alaisuudessa (sellaisen, joka on E. coli-kannassa K12 Htrp tai FM5). FM5:n ovat kuvanneet Burnette et ai., BIO/TECH-NOLOGY osa 6, sivu 699 (1988).

20 Alue I kloonattiin aluksi Ml3:een Xbal-kohdasta

HindiII-kohtaan ja sekvensoitiin dideoksimenetelmällä, jonka ovat kuvanneet Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74 : 5463 (1977) . Alue II kloonattiin M13:een HindiII-kohdasta EcoRI-kohtaan ja sekvensoitiin myös dideoksimene-25 telmällä. Alue I katkaistiin M13:sta Xbal-kohdasta

HindiII-kohtaan ja alue II katkaistiin M13:sta Hindlll-kohdasta EcoRI-kohtaan. Sitten nämä kaksi fragmenttia li-goitiin pCFM1156:n, joka oli katkaistu Xbal-kohdasta EcoRI-kohtaan, kanssa ja transformoitiin E. coli-kantaan 30 FM5 (tai muihin sopiviin E. coli-isäntäsoluihin. jotka ovat alan asiantuntijalle tunnettuja) muodostamaan pCFM1156bG-CSF.

Tämä plasmidi sisältää lambda PL-promoottori/ope-raattori-alueen ja omaa lämpöherkän repiikonin. Kun E.

35 coli-kantaa FM5, joka sisältää pCFM1156bG-CSF:n, vil- 26 1 0 3 3 4 2 jellään 28 °C:ssa, plasmidin kopioluku pysyy 10 - 20 kopio-na/solu ja transkriptiota lambda PL-promoottorista säädellään lämpöherkällä repressorilla. Kasvu 42 °C:ssa johtaa kasvaneeseen kopiolukuun ja lambda PL-promoottorin vapautu-5 miseen repressiosta. Naudan yhdistelmä-G-CSF alkaa kasaantumaan kohonneissa lämpötiloissa promoottorin aktivaation ja plasmidin amplifikaation seurauksena. Lambda PL-promoot-tori sijaitsee juuri ylävirtaan naudan G-CSF:n ribosomin sitoutumiskohdasta ja aloitusmetioniinikodonista. Trans-10 kription terminaattori, t-oop, sijaitsee juuri alavirtaan kahdesta translaation lopetuskodonista lähellä geenin 31 -päätä. Kannat, jotka sisältävät plasmidin pCFM1156bG-CSF, ekspressoivat f-metbG-CSF:ää niin, että jopa 5 % solun kokonaisproteiinista on sitä.

15 Naudan G-CSF:n ekspression kohottamiseksi synteet tinen geeni kloonattiin pCFM1156bG-CSF:stä pCFM536:een Xbal-kohdasta Koni-kohtaan muodostamaan pCFM536bG-CSFl. Tämä rakenne transformoitiin FM5-soluihin ja naudan G-CSF ekspressoitui niin, että jopa 10 % kokonaisproteiinista 20 oli sitä. Käyttäen oligonukleotidia TTA ATA ATG ATC CCA TTA GGT CCT GCA CGT TCT, suoritettiin kohdennettu mutageneesi (katso menetelmä esimerkistä 3) kohdilla 3, 4 ja 5 olevien proliini-, leusii-ni- ja glysiinikodonien muuttamiseksi CCG:stä, CTC:stä ja 25 GGC:stä CCA:ksi, TTA:ksi ja GGT:ksi. Tämä uusi rakenne, pCFM536bG-CSF2, transformoitiin FM5-soluihin ja tällä rakenteella naudan G-CSF:ää ekspressoitiin niin, että jopa 30 % kokonaisproteiinista oli sitä.

c) E. coli-bakteerin tuottaman naudan G-CSF:n puh- 30 distus 1. Soluhajotus ja Sarkosyl-liuotus ja hapetus

Noin 100 grammaa solutahnaa punnittiin erilleen ja suspendoitiin uudelleen 2,5 litraan vettä. Solut disper-soitiin sopivalla sekoittajalla, kunnes ne olivat täydel-35 lisesti dispersoituneet. Suspensio ajettiin Gaulin-homo- 27 103342 genisaattorin läpi neljä kertaa 8000 psigtllä pitäen lämpötila alle 18 °C:ssa. Homogenaatti sentrifugoitiin Beckman J2-21-sentrifuugissa käyttäen JA-10-roottoria 10 000 kierrosta minuutissa 4 °C:ssa 30 minuuttia. Supernatantti kaa-5 dettiin pois ja hylättiin. Pelletti suspendoitiin uudelleen 2,5 litraan kylmää vettä ja sentrifugoitiin J2-21-sentrifuugissa käyttäen JA-10-roottoria 10 000 kierrosta minuutissa 4 °C:ssa 30 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja hylättiin. Pelletit suspendoitiin uudelleen 380 ml 10 vettä ja lisättiin 20 ml 1 M Tris-liuosta, pH 8, 100 ml 10 % Sarkosyl'iä ja 0,5 ml 1 % kuparisulfaattipentahyd-raattia. Seosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Materiaali sentrifugoitiin J2-21-sentrifuugissa käyttäen JA-10-roottoria 30 minuuttia 10 000 kierrosta minuutissa 15 4 °C:ssa. Supernatantti kaadettiin pois ja säästettiin.

Pelletit hylättiin.

2. Sarkosyl'in poistaminen Dowex'lla Supernatanttiin lisättiin noin 500 ml kylmää vettä ja 1 litra kylmää 20 mM Tris-liuosta, pH 8, plus 400 gram-20 maa Dowex'ia (tasapainotettu 20 mM Tris-liuoksessa, pH 8). Seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 90 minuuttia. Liemi suodatettiin pylvään läpi ja läpivirrannut neste kerättiin. Resii-ni pestiin 400 ml:lla 20 mM Tris-liuosta, pH 7,7, ja tämä pesuneste lisättiin läpivirranneeseen nesteeseen saaden 25 2,4 litraa.

3. Nopean virtauksen omaava CM-Sepharose-kromato-grafia

Materiaalin pH säädettiin 5,4:ään käyttäen 50 % etikkahappoa ja sitten sentrifugoitiin J2-2l-sentrifuugis-30 sa käyttäen JA-10-roottoria 10000 kierrosta minuutissa 4 °C:ssa 25 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja säästettiin. Pelletti hylättiin. Supernatantti lisättiin suoraan 80 ml:n CM-Sepharose-ioninvaihtajapylvääseen, joka 011 tasapainotettu 20 mM natriumasetaatissa, pH 5,4. Pyl-35 väs pestiin 100 mM NaCl:lla aloituspuskurissa ja eluoitiin 28 103342 sitten 150 mM NaCl:lla aloituspuskurissa. Kerättiin noin 850 ml eluaattia, joka sisälsi härän G-CSF:ää.

4. Diasuodatus CM-Sepharose-pylvään materiaalin 150 mM NaCl eluu-5 tin pH säädettiin 3,5:een 0,1 N HCl:llä ja sitten diasuo-datettiin käyttäen tangentiaalivirtausultrasuodatuslaitet-ta (Pellicon), joka oli varustettu 10000 MW-kalvoilla( 0,35 mM HCl-vesi-liuosta, pH 3,5, vastaan. Lopullinen tilavuus säädettiin niin, että saatiin naudan G-CSF:n kon-10 sentraatioksi 2 mg/ml.

Esimerkki 2

Naudan G-CSF-analogien rakentaminen Tämä esimerkki koskee yhdistelmä-DNA-menetelmien käyttöä muodostettaessa naudan G-CSF-analogeja, joissa 15 kysteiini kohdalla 17 korvattiin erikseen seriinillä.

Kohdennetut mutageneesimenetelmät, jotka ovat kuvanneet Souza et ai., PCT W085/00 817, julkaistu helmikuun 28, 1985, joka liitetään tähän viitteeksi, suoritettiin käyttäen oligonukleotidia CTGCTGAAATCCCTCGAACAG.

20 E. coli-bakteerin tuottaman naudan G-CSF-analogin puhdistus 1. Soluhajotus ja urealiuotus ja hapetus

Noin 100 grammaa solutahnaa punnittiin erilleen ja suspendoitiin uudelleen 2,5 litraan vettä. Solut disper-25 soitiin sopivalla sekoittajalla, kunnes ne olivat täydellisesti dispersoituneet. Suspensio ajettiin Gaulin-homo-genisaattorin läpi neljä kertaa 8000 psigrllä pitäen lämpötila alle 18 °C:ssa. Homogenaatti sentrifugoitiin J2-21-sentrifuugissa käyttäen JA-10-roottoria 10 000 kierrosta 30 minuutissa 4 °C:ssa 30 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja hylättiin. Pelletit suspendoitiin uudelleen 2,5 litraan kylmää vettä ja sentrifugoitiin J2-21-sentrifuu-gissa käyttäen JA-10-roottoria 10 000 kierrosta minuutissa 4 °C:ssa 30 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja 35 hylättiin. Pelletit suspendoitiin uudelleen 120 mlraan 29 1 0 3 3 4 2 vettä ja lisättiin 40 ml 1 M Tris-liuosta, pH 8,5, ja 640 ml 10 M ureaa. Seosta sekoitettiin 2-3 tuntia huoneen lämpötilassa ja sitten laimennettiin 1:10 20 mM Tris-li-uoksella, pH 8,5. Seosta sekoitettiin sitten yli yön huo-5 neen lämpötilassa. Materiaali sentrifugoitiin Beckman J6-B-sentrifuugissa JS 4,2-roottorissa 4200 kierrosta minuutissa 4 °C:ssa 45 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja säästettiin. Pelletit hylättiin. Supernatantti säädettiin pH 5,4:ään 50 % etikkahapolla ja materiaali sentrifu-10 goitiin J6B-sentrifuugissa käyttäen JS 4,2-roottoria 4200 kierrosta minuutissa 4 °C:ssa 45 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja säästettiin. Seos laitettiin sitten suoraan 100 ml:n CM-Sepharose-ioninvaihtajapylvään päälle, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumasetaatissa, pH 5,4. 15 Pylväs pestiin 100 mM NaCl:lla aloituspuskurissa ja eluoi-tiin sitten 150 mM NaCl:lla aloituspuskurissa. Noin 775 ml naudan G-CSF:ää sisältävää eluaattia kerättiin.

2. Diasuodatus CM-Sepharose-pylvään materiaalin 150 mM NaCl-eluu-20 tin pH säädettiin 3,5:een 0,1 N HClrllä ja sitten diasuo-datettiin käyttäen tangentiaalivirtausultrasuodatuslaitet-ta (Pellicon), joka oli varustettu 10 000 MW-kalvoilla, 0,35 mM HCl-vesi-liuosta, pH 3,5, vastaan. Lopullinen tilavuus säädettiin niin, että naudan G-CSF:n konsentraatio » 25 oli 2 mg/ml.

Esimerkki 3

Pasteurella hemolytica-bakteerin infektion hoito G-CSF-tutkimus suoritettiin karjalla, joka oli altistettu Pasteurella hemolvtica-bakteerille. Noin 60 kg 30 painavat vasikat jaettiin kahteen 11 eläimen ryhmään. Molemmille ryhmille annettiin 5 ml bakteereita (3 x 107/ml) henkitorven sisäisesti päivänä 1. Neljä tuntia ennen altistusta vasikoita käsiteltiin laimealla etikkahappoliuok-sella (pH noin 5,5) antamalla henkitorveen. Ryhmää, joka 35 sai ihon alaisesti annettua ihmisen G-CSF:ää (10 μg/kg), 30 103342 oli esikäsitelty 4 vuorokautta ennen infektiota ja sitä käsiteltiin päivittäin tutkimuksen jäljellä olevat 9 vuorokautta .

Koko karja, lukuunottamatta yhtä kontrolliryhmän 5 eläintä, osoitti pneumonian kliiniset (subjektiivinen pisteytys) ja histologiset merkit. Vaikka G-CSF:llä käsitelty karja ei ollut suojattu infektiota vastaan, niiden kliininen tila tutkimuksen lopussa oli parempi kuin kontrolliryhmän, perustuen ei ainoastaan niiden kliinisiin pis-10 teisiin vaan myös keuhkoista saatuihin patologisiin pisteisiin (%). Lisäksi 3 lehmää kontrolliryhmästä kuoli, kun taas yhtään käsitellystä ryhmästä ei kuollut. Kuvio 8 esittää valkoisten verisolujen määrän (WBC) ajan funktiona. Kuvio 9 esittää neutrofiilimäärän ajan funktiona. Ku-15 vio 10 kuvaa band-solujen määrän ajan funktiona. Neutro-fiilimäärä sisältää Seg'ien (kypsimmät neutrofiilit) ja Band'ien (hiukan vähemmän kypsiä kuin Seg'it) kokonaismäärät. Kuvio 11 esittää sairastuvuuden ajan funktiona ja kuvio 12 esittää prosenttisen keuhkovaikutuksen (prosent-20 tia keuhkoista vaikutuksen alaisena) ajan funktiona.

Esimerkki 4 G-CSF:n käyttö ehkäisevänä/terapeuttisena aineena naudan hengitystiesairauden kontrolloimiseksi Tämän tutkimuksen tarkoitus oli osoittaa ihmisen G-25 CSF:n tehokkuus Pasteurella hemolytica-bakteerin aiheuttaman naudan hengitystiesairauden (BRD) kontrolloimisessa. Ryhmät olivat seuraavat (10 vasikkaa/ryhmä):

Ryhmä 1: infektoidut, ei lääkitystä Ryhmä 2: infektoidut, lääkitys (aloitettu 5 vuoro-30 kautta ennen altistusta)

Ryhmä 3: infektoidut, lääkitys (aloitettu 12 tuntia ennen altistusta)

Hankittiin 1-2 vuorokauden ikäisiä Holsteinin härän vasikoita. Vasikat sijoitettiin erillisiin vasikkakar-35 sinoihin ja niiden ruokavalio aloitettiin 1 gallonan mai- 31 103342 toannoksella, joka jaettiin kahtena annoksena per vuorokausi. 7 vuorokauden ikäisenä tarjottiin vapaasti vasikka-viljaa ja 7 vuorokauden ikäisenä tarjottiin vapaasti vettä .

5 Viisi vuorokautta ennen altistusta (päivä -5) kaik ki ryhmän 2 vasikat saivat 10 Mg/kg/vasikka G-CSF:ää annettuna SQ, SID. 12 tuntia ennen altistusta (päivä -1/2) ryhmän 3 vasikat saivat 10 ug/kg/vasikka G-CSF:ää annettuna SQ, SID. Ryhmän 1 vasikat saivat liuoskontrollia al-10 käen altistuksesta (päivä 0). Vasikat saivat lääkitystä päivään 9 asti (päivä ennen tutkimuksen loppua).

Lääkitys annettiin 0,27 mg/ml vahvuisena liuoksena ja annettiin injektoimalla 10 μg/kg, SQ, SID. Liuoskont-rolli annettiin injektoimalla 2 millilitraa, SQ, SID.

15 Käsittelytasot olivat seuraavat: Ryhmä 1: Liuos- kontrolli, Ryhmä 2: G-CSF 10 Mg/kg, SQ, SID alkaen päivästä -5, Ryhmä 3: 10 ^g/kg, SQ, SID.

Vasikat altistettiin 25 vuorokauden ikäisinä (päivä 0) . Neljä tuntia ennen altistusta vasikoita käsiteltiin 20 laimealla etikkahappoliuoksella (pH noin 5,5) antaen hen-kitorveen. Altistus Pasteurella hemolvtica-bakteerilla tapahtui injektoimalla 5 millilitraa yli yön kasvanutta lihaliemiviljelmää, jossa oli 1 x 108 altistavaa organismia. Vasikoita tarkkailtiin yhteensä 10 vuorokautta.

25 Päivänä 10 vasikat lopetettiin ja suoritettiin ruu miinavaus. Keuhkot pisteytettiin pneumoniatason suhteen ja tehtiin viljelyt bakteriologiaa varten. Kuvio 14 (katso kuvio 13) esittää kolmen ryhmän suhteellisen sairastuvuuden. Sairastuvuus perustui kehon lämpötilaan, ruuan kulu-30 tukseen ja mielialaan. Kuviot 15, 16 ja 17 kuvaavat WBC:tä (valkoisten verisolujen määrä), PMN:ää (neutrofiilit) ja band-solujen määrään ajan funktiona, vastaavassa järjestyksessä .

32 1 0 3 3 4 2

Esimerkki 5 G-CSF:n vaikutus vasikoiden hengitystiesairauden esiintymistiheyteen ja kestoon ja immunologisiin ja kliinispatologisiin parametreihin 5 Tämän tutkimuksen tarkoitus oli määrittää vaikutus, joka ihmisen G-CSF:n annolla on vasikoiden hengitystiesairauden esiintymistiheyteen ja kestoon. Tarkastetut parametrit sisältävät sairastuvuuden, kuolleisuuden, täydelliset verilaskut ja responssin antigeeneille ja antigee-10 nien muistamisen. Tutkimus suoritettiin kaupallisessa va-sikkanavetassa.

Kuusikymmentä (60) Holsteinin härän vasikkaa, noin 21 vuorokauden ikäisiä, hankittiin ja sijoitettiin vasik-kanavettaan kolmen vuorokauden aikana (päivä -3 - päivä 15 -1). Kun vasikat sijoitettiin navettaan, ne määrättiin yhteen kahdesta ryhmästä. Vasikat sijoitettiin erillisiin vasikkakarsinoihin, joita oli 30 karsinaa rivissä, kaksi riviä ja 4 jalan levyinen käytävä rivien välissä. Vasikat sijoitettiin vuorottaisella tavalla. Joka päivä sijoitet-20 tiin parillinen määrä vasikoita. Vasikoiden tutkimus aloitettiin sinä päivänä, jona ne sijoitettiin navettaan. Tutkimuksen päivä 1 oli silloin, kun vasikka todella sijoitettiin navettaan. Toisin sanoen oli kolme päivää 1 riip-. puen todellisesta aloituspäivästä. Kaikki seuraavat päivät 25 parustuivat todelliseen aloituspäivään.

Aloittaen päivänä 1 ryhmän 1 vasikat saivat päivittäin 10 μg/kg kehon painoa olevan G-CSF-injektion. Ryhmän 2 vasikat saivat päivittäin liuoskontrolli-injektiot. Injektioita jatkettiin 21 peräkkäisenä päivänä.

30 Aloittaen päivästä 1, eläinten terveydestä huoleh tiva teknikko tarkkaili vasikoita päivittäin hengitystiesairauden merkkien suhteen. Fyysiset merkit, joita tarkkailtiin, olivat kehon lämpötila, ruokahalu, hengitysno-peus ja mieliala. Tarkkailua jatkettiin 30 peräkkäistä 35 päivää (päivä 1 - päivä 30). Kaikki vasikat, jotka osoit- 33 103342 tivat merkkejä hengitystiesairaudesta (katso diagnoosin kriteerit alla), sijoitettiin alla mainitun käsittelyaika-taulun mukaiseen terapiaan. Kaikki käsittelyt merkittiin ylös. Kaikille vasikoille, jotka kuolivat tutkimuksen ai-5 kana, tehtiin ruumiinavaus.

Päivinä 1 (ennen injektioiden aloitusta), 7, 14, 21 ja 28, kaikilta vasikoilta otettiin verta täydellisiä ve-rilaskuja (CBC) varten. Verta otettiin lisäksi CBCrtä varten hengitystiesairauden l:nä ja 4:nä päivänä. Suoritetut 10 kokeet sisälsivät pakatun solutilavuuden laskun (PCV), puna- ja valkosolujen kokonaismäärät ja erilaistuneiden solujen määrän.

Kaikille vasikoille, jotka olivat sairastumassa, aloitettiin terapia. Terapian kesto ja tyyppi merkittiin 15 muistiin.

Ryhmien 1 ja 2 välillä tehtiin vertailut G-CSF:n vaikutusten suhteen täydellisiin verilaskuihin, hengitystiesairauteen sairastuvuuteen, joka määritettiin päivittäisillä tarkasteluilla, ja kuolevuuteen.

34 103342

HENGITYSTIESAIRAUDEN TARKKAILUKRITEERIT

NORMAALI EPÄNORMAALI

KEHON LÄMPÖTILA < 103,5 > 103,5 5 RUOKAHALU 1 2, 3 ja 4 1 = juo koko määrän maitoa 2 = juo 3/4 maidosta 3 = juo 1/2 maidosta 10 4 = juo < 1/2 maidosta HENGITYSNOPEUS 1 2 ja 3 1 = normaali 2 = hiukan kohonnut 15 3 = erittäin kohonnut MIELIALA 1 2, 3 ja 4 1 = normaali 2 = hiukan masentunut 20 3 = keskinkertaisesti masentunut 4 = vakavasti masentunut Käsittelyaikataulu Käsittely numero 1: 5 mg oksitetrasykliiniä/naula, . IM. Terapian kesto perustui vasikan responssiin. Terapiaa • · 25 jatkettiin 2 vuorokautta sen jälkeen, kun parametrit olivat normalisoituneet lyhimmän käsittelyn ollessa 4 vuorokautta ja pisimmän 8 vuorokautta. Jos vasikat eivät res-pondoineet käsittelylle numero 1, niille aloitettiin käsittely numero 2.

30 Käsittely numero 2: 25 mg sulfadimetoksiinia/naula, • PO, ensimmäisenä päivänä, 12,5 mg/naula toisena ja seuraa- vina päivinä. Pisin käsittelyaika oli 5 vuorokautta.

Kuvio 18 esittää käsittelypäivät ryhmän 1 vasikoille (jotka saivat G-CSF:ää), jotka sairastuivat ensimmäise- 35 1 0 3 3 4 2 nä käsittelypäivänä (Tl), toisena käsittelypäivänä (T2), ... toisen käsittelytavan ensimmäisenä päivänä (T1B), ...

toisen käsittelytavan viidentenä päivänä (T5B). Käsitellyllä ryhmällä oli johdonmukaisesti pienempi määrä koko-5 naiskäsittelyjä kussakin käsittelypisteessä. Käsiteltyjen ja kontrollien välillä on vähäinen suuntaus suurempia eroja kohti käsittelykertojen lisääntyessä. Esimerkiksi, aloittaen T4:stä, ero käsiteltyjen ja kontrollivasikoiden välillä kohoaa noin 40 %:n parantumiseen verrattuna aikai-10 sempien käsittelyjen 15 %:iin.

Kuvio 19 kuvaa käsittelyjen kokonaismäärän per vuorokausi kontrolleille verrattuna käsiteltyihin vasikoihin. Tämä osoittaa jälleen vähenemisen käsittelyissä, joita käsitellyt vasikat tarvitsevat verrattuna kontrolleihin. 15 Parantuminen vaihtelee ajoittain lähes 50 %-.sta 0 %:iin. Kokonaisparantumis-% käsitellyille vasikoille on 36 %.

Kuvio 20 kuvaa niiden vasikoiden määrää per vuorokausi, joiden lämpötilat ovat yli 103,5 °F. Tulokset ovat erittäin hyvin yhdenmukaisia kokonaiskäsittelypäivien suh-20 teen. Käsiteltyjen vasikoiden lämpötiloissa on johdonmukainen parantuminen verrattuna kontrolleihin. Prosenttinen parantuminen on pääpiirtein sama kuin kokonaiskäsittely-päivät (39,9 %).

. G-CSF, annettuna nuorille lihavasikoille ennen nii- • · 25 den infektoitumista BRD:llä ja infektion aikana, alentaa merkittävästi hengitystiesairauden ankaruutta ja pituutta verrattuna näennäislääkkeellä käsiteltyihin kontrolleihin. G-CSF:llä käsitellyillä vasikoilla oli vähemmän hengitystiesairautta (27 %) verrattuna kontrolleihin ja ne myös 30 tulivat terveemmiksi nopeammin (47 % parannus).

Esimerkki 6

Klebsiella-pneumonia Tämän tutkimuksen aihe oli määrittää, sallisiko kiertävien neutrofiiliryhmän solujen lisääminen meijeri- 36 103342 lehmän respondoida sopivammalla tavalla maitorauhasen bak-teerialtistukseen.

G-CSF PROTOKOLLA: 1) Ihmisen G-CSF:n antaminen alkoi kaksi vuorokaut-5 ta saapumisen ja alkutarkastuksen (iltalypsy) jälkeen ja sen antamista jatkettiin iltalypsyn aikana yhteensä 15 vuorokautta.

2) Annos/reitti: 10 μg/kg päivittäin ihon alaisella annolla.

10 3) Kontrollialtistusryhmä sai 1,0 £ig/kg G-CSF:ää (päivittäin) ihon alaisella annolla 8 vuorokauden ajan alkaen päivänä 12.

UTARETULEHDUSALTISTUSMALLI: 1) Organismi: Klebsiella pneumoniae-bakteeria an- 15 nettiin kuudennen päivän aamuna G-CSF-annon alkamisesta.

2) Annos: 1,0 ml (noin 200 000 CFU:ta) annettiin aseptisesti viirutiehyen kautta vasempaan takaneljännek-seen (D). Loppuja neljänneksiä käytettiin kontrolleina.

3) Yhtään maitonäytettä ei otettu 3 tuntiin altis-20 tuksen jälkeen bakteerien asettautumisen sallimiseksi nel- j ännekseen.

4) Antibioottiterapiahoitoa ei käytetty kokeen aikana lukuunottamatta nesteterapiaa, jos oli tarpeellista.

KOERYHMÄT: • · 25 Tx altistus (n=3) lehmien korvamerkkien numerot: 736, 924, 964

Tx kontrolli (n=3) lehmien korvamerkkien numerot: 248, 293, 790

Kontrollialtistus (n=3) lehmien korvamerkkien numerot: 30 124, 771, 4179 ' Edustavat tulokset on esitetty kuvioissa 21 - 23.

24 tuntia altistuksen jälkeen riippumaton lääkäri teki tunnustelututkimuksen kaikille 36 utareelle. Lääkäri poimi infektoidut neljännekset yhteensä 36 neljänneksestä; 37 103342 nämä olivat altistetut neljännekset kolmesta käsittelemättömästä lehmästä.

Esimerkki 7

Menetelmä koliformisen utaretulehduksen ehkäisemi-5 seksi Tämä esimerkki koskee menetelmää, jossa käytetään G-CSF:ää koliformisen utaretulehduksen ehkäisemiseksi maitoa erittävillä lehmillä. Ihmisen G-CSF:n tehokkuuden testaamiseksi koliformisen utaretulehduksen ehkäisemisessä 10 maitoa erittävillä meijerilehmillä, lehmille tehtiin koe-altistus patogeenisellä E. coli-bakteerilla.

12 maidonerityksen keskivaiheilla olevaa Holsteinin meijerilehmää määrättiin umpimähkäisesti yhteen kahdesta ryhmästä. Koetutkimuksessa käytettiin vain lehmiä, joiden 15 maitoviljelmät olivat koliformien suhteen negatiivisia ja jotka olivat negatiivisia CMT:ssä (California Mastitis Test). Kaksi ryhmää olivat: Ryhmä 1 (infektoidut, ei lääkitystä saavat kontrollit) ja ryhmä 2 (infektoidut, joita lääkittiin 3 μg G-CSF:ää/kg).

20 Perusmenetelmässä lehmiä käsiteltiin G-CSF:llä (ryhmä 2) päivinä 1 - 17, sitten altistettiin päivänä 10 ja lopuksi tarkkailtiin kuolevuutta ja sairastuvuutta päivinä 11 - 21. Ryhmä 1 sai suolaliuoksesta koostuvia näen- , näislääkeinjektioita päivinä 1-17.

• « 38 103342

Spesifinen aikataulu oli seuraava:

PÄIVÄ G-CSF CBC1 CMI2 SCC3 MAITO- PLASEBO KEHON

VILJELY LÄMPÖTILA

5 0 / / / / / 1 / / 2 / / 3 / / 4 / / 10 5 / / Il 6 / / 7 / / 8 / /

9 / / III

15 10 / // // / /

Altistus

11 / / III

12 / / III

13// Il 20 14 / / / / / / 15 / / / / / 16 / / Il 17 / / Il 18 / / 25 19 II / 20 / / 21 111/ / “•Täydelliset verilaskut, California Mastitis Test, 3Somaat-30 tisten solujen laskut, hankittu HMS:ltä ' Kaikkia lehmiä tarkkailtiin kahdesti vuorokaudessa (aamupäivällä ja iltapäivällä) ja merkittiin ylös kaikki epänormaalit kliiniset havainnot (nimittäin ruokahalu, tulehdusmerkit, jaloittelu, mieliala, jne.). Lehmien uta-35 reet tutkittiin kerran vuorokaudessa (aamupäivällä) koko 39 1 0 3 3 4 2 tutkimusajan merkiten ylös epänormaalit havainnot. Kaikki koe- ja kontrollikokoonpanojen injektiot annettiin 8-10 välillä aamupäivällä. Lehmät lypsettiin kahdesti vuorokaudessa ja kaikki maito hylättiin. Tutkimuksen aikana ei 5 annettu mitään muita lääkityksiä.

Altistus sisälsi virulentin E. coli-viljelmän mai-torauhasen sisäisen infuusion yhteen neljännekseen. Altistus titrattiin ennen tutkimuksen alkua niin, että saatiin aikaan keskinkertainen sairastuvuus.

10 Lehmiä elätettiin päivään 31 asti (14 vuorokautta viimeisen G-CSF-annoksen jälkeen) ja sitten myytiin teurastettavaksi. Kaikille lehmille, jotka kuolivat tutkimuksen aikana, tehtiin ruumiinavaus ja ne myytiin.

Vertailut kontrolli- ja käsittelyryhmien välillä 15 tehtiin G-CSF-.n tehokkuuden suhteen ehkäisemään lehmiä saamasta E. coli-bakteerin maitorauhasen sisäisestä infuu-siosta johtuvaa koliformista utaretulehdusta. Tulokset on esitetty graafisesti kuvioissa 24 - 26. Maitoviljelypis-teiden (1 = 1-100 E. coli-pesäkettä; 2 = 100 - 500 E. co-20 l_i-pesäkettä; 3 = enemmän kuin 500 E. coli-pesäkettä) (kuvio 24), kliinisten pisteiden, jotka ovat maitopisteiden (0 = normaali maito, 1 = vetinen/kokkareinen, 2 = enemmän vetinen/kokkareinen, 3 = erittäin vetinen/kokkareinen) ja .· utarepisteiden (0 = normaali, 1 = hiukan turvonnut/kova, 2 25 = keskinkertaisesti turvonnut/kova, 3 = ankarasti turvon- nut/kova) (kuvio 25) yhdistelmä ja California Mastitis Test1 in (CMT) pisteiden (negatiivinen ja häivähdys= 0) (kuvio 26) tulokset osoittavat, että käsittely G-CSF:llä yllä kuvatuissa koeolosuhteissa oli erittäin tehokas pie-' 30 nentäen taudin ankaruutta ja nopeuttaen maitoa tuottavien meijerilehmien parantumista. Niin ollen tehokkaan hoito-määrän utaretulehduksen hoitamiseksi osoitettiin olevan 3 μg/kg.

40 1 0 3 3 4 2

Esimerkki 8

Maitoatuottavien meijerilehmien, joille annetaan granulosyytin pesäkekasvua stimuloivaa tekijää ennen kolifomaisen (E. coli) rintatulehduksen induk-5 tiota, hemogrammimuutokset Tämän tutkimuksen alkuperäinen tarkoitus oli määrittää, nopeuttaisiko käsittely G-CSF:llä parantumista kokeellisesti aikaansaadusta utaretulehduksesta. Tässä kokeessa annetut ympit eivät tuottaneet merkittäviä klii-10 nisiä merkkejä ja kaikki lehmät poistivat infektion 24 tunnin sisällä ymppäyksen jälkeen. Niin ollen G-CSF:n terapeuttista vahvuutta ei voitu arvioida. Tämän tutkimuksen lopullinen aihe oli arvioida ihmisen G-CSF:n aikaan saamat hematologiset muutokset annoksella 3 μg/'kg naudan perifee-15 risessä veressä.

Kahdeksan tervettä Holstein'in lehmää, jotka olivat maidontuotantonsa toisella puoliskolla, infektoitiin mai-torauhasen sisäisellä E. coli-isolaatin ymppäyksellä. Käytettiin utaretulehduksesta peräisin olevaa E. coli-iso-20 laattia, jota oli kasvatettu 14 - 16 tuntia tryptokaasi-soija-lihaliemessä. Neljälle lehmälle annettiin G-CSF:ää, jäljellä olevat neljä muodostivat infektoidun kontrolliryhmän .

, , Aluksi annettiin 803,7 CFU:ta sisältävä ymppi mai- > · 25 torauhasen sisäisesti oikeaan takaneljännekseen. Tämä ei onnistunut saamaan aikaan kliinistä utaretulehdusta. Toinen ja kolmas ymppi sisältäen 44 000 CFU:ta ja 842 000 CFU:ta, vastaavassa järjestyksessä, annettiin 2 vuorokautta myöhemmin ja 6 tunnin välein toisistaan. Toiseen ja • 30 kolmanteen ymppäykseen käytettiin vasempaa takaneljännes- tä. Aika nolla otettiin toisen ymppäyksen aloituksesta.

Neljä näistä 8 lehmästä valittiin umpimähkäisesti ja niille injektoitiin ihon alaisesti ihmisen G-CSF:ää noin 6 tuntia ymppäyksen jälkeen. Yksittäinen injektio 35 annettiin kullekin näistä lehmistä iltalypsyn jälkeen seu- 41 103342 raavat 4 vuorokautta. Käytetty annos oli 3 Mg/kg kullakin kerralla. Jäljelle jääneet E. coli-kannalla altistetut 4 lehmää eivät saaneet mitään hoitoa.

Perustason hematologia saatiin kolmena peräkkäisenä 5 päivänä ennen käsittelyä ja päivinä 0 - 12 E. coli-ymp-päyksen jälkeen. Verinäytteet kerättiin häntäsuonesta EDTA:ta sisältäviin koeputkiin.

Hematogrammi sisälsi valkoisten verisolujen kokonaismäärän (WBC), erilaistuneiden solujen määrän, punaso-10 lujen kokonaismäärän (RBC), pakattujen solujen tilavuuden (PCV) ja plasmaproteiinien (PlPr) määritykset. Kaikki näytteet käsiteltiin 3 tunnin sisällä keräyksestä ja erotukset tehtiin Wright-Giemsa-värjätyistä sivelynäytteistä. Puna-ja valkosolulaskut suoritettiin käyttäen Coulter-las-15 kuria mallia F.

Yksikään lehmistä ei osoittanut systeemisiä merkkejä sairaudesta kokeen aikana. Noin 6 tuntia ymppäyksen jälkeen joidenkin lehmien infektoitu neljännes turposi, tuli punaiseksi ja kiinteäksi. Näiden lehmien neljännek-20 sien turvotus oli vain heikkoa 12:sta tunnin aikana.

Niiden 4 lehmän, joille annettiin G-CSF:ää, hemo-grammeille oli ominaista keskinkertainen leukosytoosi 24 tunnin sisällä ensimmäisestä injektiosta. Havaittu leuko-. sytoosi koostui pääasiassa kypsistä, ei-myrkyllisistä 25 neutrofiileistä. Toisena käsittelypäivänä perifeerisessä veressä havaittiin band-neutrofiilejä. Suurin muutos vasemmalle oli 2,5 x 103/μ1 band-soluja, joka havaittiin lehmällä numero 768. Aika, jolloin suurin muutos vasempaan tapahtui, oli verrannollinen aikaan, jolloin segmentoidut 30 neutrofiilit saavuttivat suurimmat arvonsa. Annosten an toväli oli tarpeeksi lyhyt aiheuttamaan lääkkeen lisävaikutus neutrofiilien lukumääriin, jotka eivät palanneet perustasoille injektioiden välillä. Kun injektiot lopetettiin, solumäärä laski samalla nopeudella, jolla oli kohon-35 nut.

42 103342

Noin päivänä 7 laskut palasivat tasolle, joka oli noin 2-3 kertaa perustason arvo ja ne pysyivät tällä tasolla lopun käsittelyäjän.

Suurimmat valkoisten verisolujen määrät ja segmen-5 toituneiden neutrofiilien määrät havaittiin suunnilleen päivänä 5. Seuraava taulukko osoittaa nämä solumäärät käsitellyille ja käsittelemättömille ryhmille päivänä 0 ja päivänä 5. Muutoksen suuruus (%) solumäärissä päivien 0 ja 5 välissä osoitetaan vain käsitellylle ryhmälle.

10 KÄSITTELEMÄTTÖMÄT MÄÄRÄT (x 103/μ1) LEHMÄ NUMERO Päivä 0 Päivä 5

Seg WBC Seg WBC

15 326 3,8 11,6 2,5 8,8 801 2,9 8,3 2,4 7,4 574 4,4 11,1 1,9 6,8 825 3,5 10,2 2,8 8,3

20 G-CSF-KÄSITELLYT

MÄÄRÄT (X 103/μ1) LEHMÄ NUMERO Päivä 0 Päivä 5 % kohoaminen

Seg WBC Seg WBC Seg (%) WBC (%) 768 2,9 11,7 8,9 21,1 300 180 25 767 4,7 10,4 21,5 28,44 500 270 773 4,2 11 22,6 32,3 500 290 324 4,6 10,3 21,8 32,6 500 320 Käsittelemättömällä ryhmällä oli merkittävät muu-30 tokset solumäärissä päivien 0 ja 5 välissä. Käsitellyllä : ryhmällä oli 3-5 kertaiset nousut neutrofiilimäärissään ja 2 - 3 kertaiset nousut WBC-määrissään.

Joillain lehmillä (326, 801, 574, 825, 767, 768) oli pieni alentuminen niiden WBC määrässä 6 tuntia ymp-35 päyksen jälkeen.

43 1 0 3 3 4 2 Käsitellyn ryhmän lehmällä numero 324 oli korkea normaali WBC ja PIPr ja matala normaali PCV ennen koetta ja kokeen aikana. Nämä laboratorioepänormaaliudet yhdessä heikon limamärkäisen nenäeritteen kanssa antoivat olettaa 5 kroonisen tautiprosessin olemassaolon. Mielenkiintoisesti tällä lehmällä oli suurin nousu neutrofiilimäärässä (500 %) yhdessä pienimmän vasempaan tapahtuneen maksimimuutok-sen (< 400/μ1) kanssa.

Käsiteltyjen ja käsittelemättömien lehmien muiden 10 valkoisten verisolujen määrissä ei ollut mitään muutoksia kokeen aikana. Mitään muutoksia ei myöskään havaittu punasolu- tai plasmaproteiiniparametreissa kummallakaan ryhmällä .

Pääteltiin, että: 15 1. Ihmisen G-CSF stimuloi naudan neutrofiilien gra- nulopoieesia.

2. Ihmisen G-CSF annettuna päivittäin annoksena 3 Mg/kg aiheuttaa 3-5 kertaisen nousun segmentoitujen neutrofiilien määrässä 4 vuorokauden kuluttua yhdessä ai- 20 noastaan pienen vasempaan tapahtuneen muutoksen kanssa.

3. Heikko kokeellisesti aikaan saatu utaretulehdus yhdessä neljänneksessä ei huononna G-CSF:n aiheuttamaa luuytimen stimulaatiota.

. Seuraavat esimerkit suunniteltiin määrittämään, 25 voisiko G-CSF-terapia ehkäistä kuolevuutta infektiotaudin eläinmalleissa.

PSEUDOMONAS AERUGINOSA-PNEUMONIAN HAMSTERIMALLI

Bakteerit Näissä kokeissa käytetty P. aeruginosa-kanta PA02 30 eristettiin vatsainfektion omaavan ihmispotilaan verestä.

PA02-kantaa viljeltiin eksponentiaaliseen vaiheeseen tryp-tikaasi-soija-lihaliemessä (TSB)(Difco) ja sitten pienet määrät tätä viljelmää varastoitiin jäädytettynä 70 °C:ssa 40 %:ssa glyserolissa, kunnes käytettiin. 1,5 ml:n määrät 35 PA02-kantaa sulatettiin, lisättiin 50 ml:aan TSB:tä ja 44 103342 inkuboitiin 4 tuntia ravistelijapulloissa 37 °C:ssa. Logaritmisen kasvuvaiheen organismit kerättiin sentrifugoimal-la 2000 x g, pestiin kahdesti steriilillä 0,9 % suolaliuoksella ja suspendoitiin uudelleen haluttuun konsen-5 traatioon spektrofotometrisesti määritettynä. Kaikki bak-teeriympit vahvistettiin kvantitatiivisilla viljelmillä käyttäen spiraalista maljauslaitetta (Spiral Systems, Cincinnati) .

Eläimet 10 Virusvasta-aineista vapaat naaraspuoliset kultaiset syyrianhamsterit, jotka painoivat 80 - 100 grammaa, saatiin Charles River'Itä Kanadasta (Quebec) ja niitä pidettiin karanteenissa 5 vuorokautta. 5 eläimen ryhmiä kasvatettiin häkeissä, jotka oli varustettu erillisillä suo-15 datinkansilla. Eläimille suotiin vapaa pääsy vedelle ja standardille hasmsteriruoalle (Tecklad, Winfield, Iowa), kunnes tuli ilta ennen infektiota. Silloin eläimet laitettiin paastolle yli yön. Ihmisen granulosyytin pesäkekasvua stimuloivaa yhdistelmätekijää (G-CSF) tai antoliuosta (5 % 20 dekstroosi steriilissä vedessä) annettiin ihon alaisesti kokonaistilavuuden ollessa 0,1 ml. Eläimille annettiin G-CSF:ää tai antoliuosta kahdesti vuorokaudessa (bid) noin 8 aamupäivällä ja 3 iltapäivällä. G-CSF-injektioita jatkettiin eloon jääneillä eläimillä 3 vuorokautta infektion 25 jälkeen. Eläimet infektoitiin 12-2 välissä iltapäivällä.

Henkitorven sisäistä ymppäystä varten hamsterit nukutettiin antamalla vatsaonteloon 75 mg/kg Nembutal'ia (50 mg/ml; Abbott). Eläimet laitettiin 30 asteen tasoon kallistetulle tasolle, leuat avattiin ja 0,25 ml bakteeri-30 suspensiota annettiin henkitorveen käyttäen taivutettua ' 22-väljyistä neulaa, jossa oli tasapäiseksi tehty 2,5 tuu maa pitkä kärki. Bakteeriymppäyksen jälkeen eläimiä ravisteltiin varovasti 15 sekuntia ympin levittämiseksi. Eläinten annettiin toipua nukutuksesta 37 °C:een lämpöpehmus-35 teillä. Ainoastaan niitä eläimiä, jotka toipuivat nukutuk- 45 103342 sesta, käytettiin kokeessa. Eläimiä tarkasteltiin säännöllisesti. Eläimet, jotka osoittivat erittäin suuren sairastuvuuden oireita (kykenemättömiä kävelemään tai pysymään pystyssä), lopetettiin tuskattomasti sidotut silmät omaa-5 van tarkkailijan toimesta ja laskettiin kuolemaksi. Esimerkki 9 G-CSF:n käyttö profylaktisena/terapeuttisena aineena bakteeripneumonian ehkäisemiseksi hamstereilla Tämän kokeen tarkoitus oli määrittää eri G-CSF-an-10 noksien tehokkuus ehkäistäessä Pseudomonas aeruginosa-bak-teerin aiheuttama tappava hengitystieinfektio. Ryhmät olivat seuraavat (15 hamsteria/ryhmä):

Ryhmä 1: infektoitu, ei-lääkitystä (ainoastaan an-toliuos) 15 Ryhmä 2: infektoitu, lääkitys G-CSF:llä 5 jxg/kg bid

Ryhmä 3: infektoitu, lääkitys G-CSF:llä 15 Mg/kg bid

Ryhmä 4: infektoitu, lääkitys G-CSF:llä 50 /xg/kg bid 20 Annosten antaminen eläimille aloitettiin päivää ennen bakteerialtistusta. Niin ollen eläimet saivat 3 annosta ennen infektiota ja eloon jääneet eläimet jatkoivat G-CSF:n saamista bid. Noin 5 x 107 pesäkettä muodostavaa PA02-yksikköä (CFU) annettiin jokaiselle hamsterille. Ku-25 vio 27 esittää kunkin ryhmän suhteellisen kuolevuuden ajan suhteen. Kaikilla kolmella hamsteriryhmällä, jotka saivat G-CSF:ää, oli merkittävästi vähemmän kuolevuutta kuin niillä eläimillä, jotka saivat vain antoliuosta.

Kaikilla ryhmillä oli merkittävä käsittelyvaikutus 30 (p < 0,001) laskettuna Log Rank Chi Square-analyysillä. Hamstereilla, joita oli esikäsitelty G-CSF:llä 5 μg/kg bid ennen infektiota, ei ollut merkittävästi alentunut kuole-vuustaso verrattuna kontrollieläimiin. Kuitenkin eläimet, joita oli esikäsitelty 15 /xg/kg G-CSF:ää bid, erosivat 35 merkittävästi kontrolleista (p < 0,001). Eläimillä, jotka « 103342 saivat 50 μg/kg bid G-CSF:ää, oli myös merkittävästi alentunut kuolevuus (p < 0,001). 15 Mg/kg bid ja 50 ug/kg bid annokset eivät eronneet toisistaan merkittävästi.

Esimerkki 10 5 G-CSF:n annosaikataulun vaikutus Pseudomonas aeruginosa-keuhkoinfektion omaavien hamstereiden kuolevuuteen Tämän kokeen tarkoitus oli määrittää se aikamäärä, joka tarvitaan G-CSF-terapian aloituksen ja infektioaltis-10 tuksen välillä pienentyneen kuolevuuden aikaan saamiseksi.

Ryhmä 1: infektoidut, ei lääkitystä (ainoastaan antoliuosta)

Ryhmä 2: infektoidut, lääkitys 15 μg/kg bid aloittaen noin 30 tuntia ennen infektiota. Eläimet saivat 3 15 annosta G-CSF:ää ennen altistusta.

Ryhmä 3: infektoidut, lääkitys 15 μg/kg bid aloittaen 5 tuntia ennen altistusta.

Eläimille annettiin noin 5 x 107 CFU PA02:sta henki-torven sisäisesti. G-CSF-annostus jatkui bid-aikataulun 20 mukaisesti 3,5 vuorokautta eloon jääneillä eläimillä. Kuvio 28 esittää kuolevuutta ajan suhteen kaikissa eläinryhmissä. Molemmilla lääkitystä saaneilla ryhmillä oli merkittävästi alentunut kuolevuus verrattuna eläimiin, jotka eivät saaneet lääkitystä.

25 Kaikille ryhmille oli merkittävä käsittelyvaikutus (p < 0,001) laskettuna Log Rank Chi Square-analyysillä. Hamstereilla, joita oli esikäsitelty 5 tuntia ennen infektiota, oli merkittävästi alentunut kuolevuus (p < 0,001) verrattuna kontrollieläimiin. Hamsterit, joita oli esikä-30 sitelty 30 tuntia ennen infektiota, erosivat myös merkittävästi (p < 0,001) kontrollieläimistä.

Candida albicans-ovelonefriitin rottamalli Organismi Tässä kokeessa käytettyä kliinistä Candida ai-35 bicans-isolaattia pidettiin yllä Sabouraud-dekstroosiagar- 47 103342 vinopinnoilla. C. albicans-kantaa kasvatettiin yli yön Sabouraud-dekstroosi-lihaliemessä. C. albicans-kanta eristettiin sentrifugoimalla 2000 x g 10 minuuttia 4 °C:ssa. Pelletti pestiin kahdesti fosfaatilla puskuroidulla suola-5 liuoksella (PBS), suspendoitiin uudelleen PBS:ään ja säädettiin haluttuun konsentraatioon, kun oli laskettu käyttäen hemosytometriä. Kaikki ympit varmistettiin suorittamalla kvantitatiiviset viljelyt.

Eläimet 10 Naaraspuoliset Sprague-Dawley-rotat, jotka painoi- vat 150 - 200 grammaa, saatiin Harlan-Sprague-Dawley,

Inc.'lta (Indianapolis, IN) ja niitä pidettiin karanteenissa 5 vuorokautta. 4 eläimen ryhmiä kasvatettiin roikkuvissa metallilankahäkeissä ja niille sallittiin va- 15 paa pääsy standardille rottaruoalle ja vedelle. Eläimille annettiin G-CSF:ää tai antoliuosta (PBS) kahdesti vuorokaudessa alkaen infektioaltistusta edeltävänä päivänä. Eloon jääneille eläimille jatkettiin G-CSF:n tai anto-liuoksen antamista bid 10 vuorokauden ajan.

20 Laskimon sisäistä ymppäystä varten rotat nukutet tiin eetterillä. 0,1 ml tilavuus C. albicans-kantaa injektoitiin häntäsuoneen.

Ryhmä 1: infektoidut, ei lääkitystä (ainoastaan · antoliuosta) 25 Ryhmä 2: infektoidut, lääkitys G-CSG:llä 50 μg/kg bid alkaen noin 30 tuntia ennen infektiota.

Kuvio 29 esittää kuolevuuden ajan suhteen kussakin eläinryhmässä. Eläimille annettiin 1,3 x 106 CFU:ta C. al-bicans-kantaa. Ryhmässä, joka sai G-CSF:ää, ei tapahtunut 30 yhtään kuolemaa.

Kaikille ryhmille oli merkittävä käsittelyvaikutus (p < 0,01) laskettuna Log Rank Chi Square-analyysillä.

Eläimillä, joita oli esikäsitelty G-CSF:llä, oli merkittävästi alentunut kuolevuustaso (p < 0,001) verrattuna 4β 103342 kontrollieläimiin. Rotat, joita käsiteltiin G-CSF:llä infektion jälkeen, eivät eronneet merkittävästi kontrolleista .

Esimerkki 11 5 G-CSF annettuna kasvaville sioille

Naudan G-CSF:ää annettiin kasvaville sioille (noin 30 kg) seuraavasti:

Annos = 5 Mg/kg kehon painoa/päivä Antoreitti: ihon alle 10 n = 6 sikaa

Neutrofiilitasot olivat, kuten alla on osoitettu: Päivä Neutrofiileiä (keskiarvo) 0 3108 2 29922 15 4 24595 6 42713

Tutkimus 6 normaalilla kasvavalla sialla osoitti neutrofiilitasojen nousevan dramaattisesti 2 vuorokauden sisällä ja saavuttavan 13 kertaa korkeamman tason 6 vuoro-20 kauden päivittäisen annon jälkeen.

Esimerkki 12 G-CSF annettuna normaaleille vastasyntyneille varsoille

Naudan G-CSF:ää annettiin normaaleille vastasynty-25 neille varsoille aloittaen 1 päivän ikäisenä seuraavasti: Annos = 10 ja 20 μg/kg kehon painoa/päivä Antoreitti: lihaksen sisäisesti n = 5 varsaa Päivä 0 = päivä ennen ensimmäistä G-CSF antoa 30 Neutrofiilitaso oli, kuten alla on osoitettu: 49 103342

Neutrofiilimäärä

Varsa Annos Päivä Päivä Päivä Päivä Päivä Päivä numero (uq/kg) 0 1 2 3 4 5 1 20 4950 17473 28072 35524 30874 38263 52 10 6708 16195 27807 28560 26960 26535 3 10 5016 10472 6715 16112 19975 16464 4 10 6480 6225 4400 5610 10332 15372 5 10 9156 10406 11692 11304 13588 17300

Tutkimuksessa, jossa annettiin G-CSF:ää 5 vastasyntyneelle 10 varsalle päivittäin, neutrofiilien tasot nousivat aina 3,5-kertaisiksi 24 tunnin sisällä ja aina 7,5-kertaisiksi 5 vuorokauden sisällä annoksesta riippuen.

Samalla kun esillä oleva keksintö on kuvattu suositeltavien suoritustapojen avulla, on ymmärrettävä, että 15 alan asiantuntijat saattavat keksiä muunnelmia ja modifikaatioita. Sen vuoksi on tarkoitettu, että liitetyt patenttivaatimukset peittävät kaikki sellaiset vastaavat muunnelmat, jotka kuuluvat patenttivaatimuksissa kuvatun keksinnön piiriin.

Claims (6)

1. Menetelmä G-CSF:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi G-CSF:ää tuottavasta mikro-organismista, t u n - 5. e t t u siitä, että 1. mikro-organismi hajotetaan, ja liukenematon, G-CSF:ää sisältävä materiaali erotetaan liukoisesta pro-teiinimateriaalista,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että G-CSF on met-hG-CSF.

2. G-CSF liuotetaan ja hapetetaan denaturoivan 10 liuottavan aineen ja hapettavan aineen läsnä ollessa, 3. denaturoiva liuottava aine erotetaan G-CSF:stä kvaternaarisia ammoniumryhmiä sisältävää anioninvaihto-hartsia, kuten Dowex®-anioninvaihtohartsia, käyttäen,

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että vaiheessa 2) käytetty denaturoiva liuottava aine on sarkosyyli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapettava aine on CuS04.

4. G-CSF:lie suoritetaan anioninvaihtokromatogra- 15 fia, jota seuraa kationinvaihtokromatografia, ja 5. puhdistettu G-CSF otetaan talteen.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että anioninvaihtohartsi on Dowex®- anioninvaihtohartsi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että G-CSF on hG-CSF ja vaiheen 1) jälkeen seuraa vaihe, jossa uutetaan G-CSF-materiaali 30 deoksikolaatilla. 51 103342