ES3074791T3 - Métodos y composiciones para la generación de clústeres mediante amplificación en puente - Google Patents

Métodos y composiciones para la generación de clústeres mediante amplificación en puente

Info

Publication number
ES3074791T3
ES3074791T3 ES19813785T ES19813785T ES3074791T3 ES 3074791 T3 ES3074791 T3 ES 3074791T3 ES 19813785 T ES19813785 T ES 19813785T ES 19813785 T ES19813785 T ES 19813785T ES 3074791 T3 ES3074791 T3 ES 3074791T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amplification
nucleic acid
stranded
nucleic acids
site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19813785T
Other languages
English (en)
Inventor
Jonathan Mark Boutell
Oliver Miller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Illumina Cambridge Ltd
Original Assignee
Illumina Cambridge Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Illumina Cambridge Ltd filed Critical Illumina Cambridge Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES3074791T3 publication Critical patent/ES3074791T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/319—Exonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/543—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the use of two or more capture oligonucleotide primers in concert, e.g. bridge amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para reducir los pasos utilizados en la generación de grupos monoclonales mediante la combinación de las enzimas utilizadas para la linealización y la eliminación de los cebadores de superficie no utilizados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Métodos y composiciones para la generación de clústeres mediante amplificación en puente
[0003] Descripción
[0004] Campo
[0005] La presente descripción se refiere, entre otras cosas, a la amplificación de los ácidos nucleicos diana para generar clústeres de amplicones para la secuenciación, particularmente en el contexto de reducir los pasos implicados en la obtención de información de secuencia de una muestra.
[0006] Antecedentes
[0007] La tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS) se basa en la secuenciación altamente paralela de poblaciones monoclonales de amplicones que se produjeron a partir de un único ácido nucleico diana. Los métodos de NGS han aumentado considerablemente la velocidad de secuenciación y la producción de datos, lo que ha dado como resultado un rendimiento masivo de muestras de las plataformas de secuenciación actuales. Es muy deseable reducir aún más el tiempo de secuenciación de un molde, pero es necesario mantener relaciones señal/ruido útiles, la intensidad y un mayor porcentaje de clústeres que pasan el filtro, todo lo cual contribuye a una mayor producción de datos y la calidad de datos. La reducción del tiempo de secuenciación de una plantilla puede lograrse mediante la combinación de pasos separados; sin embargo, los pasos separados con frecuencia no pueden combinarse debido a incompatibilidades. Por ejemplo, la actividad de una enzima puede inhibirse por el producto de otra enzima, por lo tanto se requiere el uso de las enzimas en pasos separados.
[0008] Resumen de la solicitud
[0009] La técnica de secuenciación de próxima generación (NGS) se basa en la secuenciación altamente paralela de poblaciones monoclonales de amplicones que se produjeron a partir de un único ácido nucleico diana. Se requieren múltiples pasos para producir las poblaciones monoclonales de amplicones y para la secuenciación, y cada paso se suma al tiempo total requerido antes de que puedan obtenerse los datos de secuencia útiles para una muestra. Por ejemplo, son necesarios múltiples pasos para producir las poblaciones monoclonales de amplicones, incluyendo la unión y a continuación la amplificación de los ácidos nucleicos diana presentes en los sitios de amplificación de una matriz. Los inventores han descubierto que pueden combinarse dos pasos separados utilizados en la producción de amplicones monoclonales. En los métodos rutinarios estándar, durante la producción de amplicones monoclonales, los sitios de amplificación se tratan con una exonucleasa y, a continuación, se tratan en un paso separado con enzimas glicosilasas que producen selectivamente un espacio de un solo nucleótido en una ubicación predeterminada. Los pasos se realizan en ese orden porque producir el espacio de un solo nucleótido también produce una estructura, un 3'-fosfato, que inhibe la actividad de la exonucleasa. Inesperadamente, los inventores descubrieron que la exonucleasa y las glicosilasas podían combinarse en un solo paso con poco o ningún efecto perjudicial sobre las métricas primarias, la calidad de lectura, la indexación dual o las métricas de construcción del genoma. Esto da como resultado una secuenciación más rápida, ya que ahora se realizan dos pasos al mismo tiempo. También tiene la ventaja de reducir el número y las cantidades de reactivos, reduciendo de este modo el coste total para el consumidor.
[0010] La invención se ha definido en las reivindicaciones adjuntas.
[0011] En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones según la reivindicación 1. La composición incluye una uracil-ADN-glicosilasa, una endonucleasa y una exonucleasa que tiene una actividad de exonucleasa de ADN monocatenario de 3' a 5'. Las reivindicaciones dependientes 2 a 5 exponen aspectos de ciertas realizaciones de las composiciones de la presente invención.
[0012] En un segundo aspecto, la presente invención también proporciona métodos como se definen en la reivindicación 6 para preparar ácidos nucleicos para una reacción de secuenciación. El método incluye proporcionar una matriz que tiene una pluralidad de sitios de amplificación. Los sitios de amplificación incluyen una pluralidad de ácidos nucleicos de captura unidos a los sitios de amplificación, en donde una primera población de la pluralidad de ácidos nucleicos de captura incluye un sitio de escisión. Los sitios de amplificación también incluyen una pluralidad de ácidos nucleicos diana modificados bicatenarios clonales, en donde ambas cadenas de cada ácido nucleico diana bicatenario se unen en sus extremos 5' a un ácido nucleico de captura, en donde una cadena se une a un ácido nucleico de captura que incluye el sitio de escisión, y en donde el sitio de escisión se coloca en una región bicatenaria de cada molécula bicatenaria. El método también incluye poner en contacto la matriz con una composición que incluye al menos una enzima para producir un sitio abásico en el sitio de escisión y una exonucleasa que tiene una actividad exonucleasa de 3' a 5’ sobre ADN monocatenario, en donde la escisión ocurre en el sitio de escisión, en donde la escisión convierte una cadena de ácidos nucleicos diana bicatenarios en una primera cadena unida al sitio de amplificación y una segunda cadena que no está unida al sitio de amplificación, y en donde los ácidos nucleicos de captura monocatenarios que comprenden un extremo 3' libre se reducen en longitud mediante la exonucleasa.
[0013] Las reivindicaciones dependientes 7 a 15 exponen aspectos de ciertas realizaciones de los métodos de la presente invención.
[0015] Definiciones
[0017] Debe entenderse que los términos utilizados en la presente memoria adoptarán su significado habitual en la técnica correspondiente, salvo que se especifique otra cosa. A continuación se exponen varios términos utilizados en la presente memoria, y sus significados.
[0019] Como se utiliza en la presente memoria, cuando el término “amplicón” se utiliza en referencia a un ácido nucleico, significa el producto de copiar el ácido nucleico, en donde el producto tiene una secuencia de nucleótidos que es igual o complementaria a al menos una porción de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico. Un amplicón puede producirse por cualquiera de una variedad de métodos de amplificación que utilicen el ácido nucleico, p. ej. un ácido nucleico diana o un amplicón del mismo, tal como un molde, incluyendo, por ejemplo, extensión por polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), extensión por ligamiento o reacción en cadena de ligamiento. Un amplicón puede ser una molécula de ácido nucleico que tenga una sola copia de una secuencia de nucleótidos particular (p. ej., un producto de extensión por polimerasa) o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos (p. ej., un producto concatamérico de RCA). Un primer amplicón de un ácido nucleico diana es normalmente una copia complementaria. Los amplicones posteriores son copias que se crean, después de la generación del primer amplicón, a partir del ácido nucleico diana o del primer amplicón. Un amplicón posterior puede tener una secuencia que sea sustancialmente complementaria a la del ácido nucleico diana o sustancialmente idéntica a la del ácido nucleico diana.
[0021] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “sitio de amplificación” se refiere a un sitio en o sobre una matriz donde se pueden generar uno o más amplicones. Un sitio de amplificación puede configurarse además para contener, sujetar o unir al menos un amplicón que se genera en el sitio.
[0023] Como se utiliza en la presente memoria, el término “matriz” se refiere a una población de sitios que pueden diferenciarse entre sí según la ubicación relativa. Las diferentes moléculas que se encuentran en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una sola molécula de ácido nucleico diana que tenga una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tengan la misma secuencia (y/o secuencia complementaria, de la misma). Los sitios de una matriz pueden ser diferentes casillas situadas en el mismo sustrato. Como casillas ilustrativas se incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, perlas (u otras partículas) en o sobre un sustrato, proyecciones desde un sustrato, crestas sobre un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser diferentes sustratos, cada uno con una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a diferentes sustratos según las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Como matrices ilustrativas en que se ubican distintos sustratos en una superficie se incluyen, sin limitación, las que tienen perlas en pocillos.
[0025] Como se utiliza en la presente memoria, cuando el término “capacidad” se utiliza en referencia a un sitio y a un material de ácido nucleico, significa la cantidad máxima de material de ácido nucleico, p. ej., amplicones procedentes de un ácido nucleico diana, que puede ocupar el sitio. Por ejemplo, el término puede referirse al número total de moléculas de ácido nucleico que pueden ocupar el sitio en una condición particular. También pueden utilizarse otras medidas incluyendo, por ejemplo, la masa total de material de ácido nucleico o el número total de copias de una secuencia de nucleótidos particular que puede ocupar el sitio en una condición particular. Normalmente, la capacidad de un sitio para un ácido nucleico diana será sustancialmente equivalente a la capacidad del sitio para amplicones del ácido nucleico diana.
[0027] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “agente de captura” se refiere a un material, producto químico, molécula o resto del mismo, que es capaz de acoplarse, retener o unirse a una molécula diana (p. ej., un ácido nucleico diana). Los agentes de captura ilustrativos incluyen, sin limitarse a, un ácido nucleico de captura que es complementario de al menos una parte de un ácido nucleico diana modificado (p. ej., una secuencia de unión de captura universal), un miembro de un par de unión receptor-ligando (p. ej. avidina, estreptavidina, biotina, lectina, carbohidrato, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) capaz de unirse a un ácido nucleico diana modificado (o resto de unión unido al mismo), o un reactivo químico capaz de formar un enlace covalente con un ácido nucleico diana modificado (o resto de unión unido al mismo). En una realización, un agente de captura es un ácido nucleico. También se puede utilizar un agente de captura de ácido nucleico como un cebador de amplificación.
[0028] Los términos “P5” y “P7” pueden utilizarse para referirse a un agente de captura de ácido nucleico. Los términos “P5'” (P5 prima) y “P7'” (P7 prima) se refieren al complemento de P5 y P7, respectivamente. Se entenderá que en los métodos presentados en la presente memoria puede utilizarse cualquier agente de captura de ácido nucleico adecuado, y que el uso de P5 y P7 son sólo realizaciones ilustrativas. Los usos de agentes de captura de ácido nucleico tales como P5 y P7 en células de flujo son conocidos en la técnica, como se ilustra mediante las descripciones de WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151 y WO 2000/018957.
[0029] Un experto en la técnica reconocerá que un agente de captura de ácido nucleico también puede actuar como un cebador de amplificación. Por ejemplo, cualquier agente de captura de ácido nucleico adecuado puede actuar como cebador de amplificación directo, ya sea inmovilizado o en solución, y puede ser útil en los métodos presentados en la presente memoria para la hibridación a una secuencia (p. ej., una secuencia de unión de captura universal) y la amplificación de una secuencia. Por ejemplo, cualquier agente de captura de ácido nucleico adecuado puede actuar como cebador de amplificación inverso, ya sea inmovilizado o en solución, y puede ser útil en los métodos presentados en la presente memoria para la hibridación a una secuencia (p. ej., una secuencia de unión de captura universal) y la amplificación de una secuencia. En vista del conocimiento general disponible y las enseñanzas de la presente memoria, un experto en la técnica comprenderá cómo diseñar y usar secuencias que sean adecuadas para la captura y amplificación de ácidos nucleicos diana como se presentan en la presente memoria.
[0031] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “secuencia universal” se refiere a una región de secuencia que es común a dos o más ácidos nucleicos diana, donde las moléculas también tienen regiones de secuencia que difieren entre sí. Una secuencia universal que está presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la captura de múltiples ácidos nucleicos diferentes utilizando una población de ácidos nucleicos de captura que son complementarios a una parte de la secuencia universal, p. ej., una secuencia de unión de captura universal. Los ejemplos no limitativos de secuencias de unión de captura universales incluyen secuencias que son idénticas o complementarias a los cebadores P5 y P7. Similarmente, una secuencia universal presente en distintos miembros de una colección de moléculas puede permitir la replicación o amplificación de múltiples ácidos nucleicos diferentes utilizando una población de cebadores universales que sean complementarios a una parte de la secuencia de universal, p. ej., un sitio de unión de cebadores universal. Las moléculas de ácido nucleico diana se pueden modificar para unir adaptadores universales (también denominados en la presente memoria adaptadores), por ejemplo, en uno o ambos extremos de las diferentes secuencias diana, como se describe en la presente memoria.
[0033] Como se utiliza en la presente memoria, el término “adaptador” y sus derivados, p. ej., adaptador universal, se refiere generalmente a cualquier oligonucleótido lineal que pueda ligarse a un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, el adaptador es sustancialmente no complementario al extremo 3' o al extremo 5' de cualquier secuencia diana presente en una muestra. En algunas realizaciones, las longitudes adecuadas del adaptador están en el intervalo de aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 12-60 nucleótidos y aproximadamente 15-50 nucleótidos de longitud. En general, el adaptador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos y/o ácidos nucleicos. En algunos aspectos, el adaptador puede incluir uno o más grupos escindibles en una o más ubicaciones. En otro aspecto, el adaptador puede incluir una secuencia que sea sustancialmente idéntica, o sustancialmente complementaria, a al menos una parte de un cebador, por ejemplo, un ácido nucleico de captura. En algunas realizaciones, el adaptador puede incluir un código de barras, también denominado índice o etiqueta, para ayudar en la corrección de errores, identificación o secuenciación posteriores. Los términos “adaptor” y “adapter” se usan indistintamente.
[0035] Como se define en la presente memoria, “muestra” y sus derivados se utilizan en su sentido más amplio e incluye cualquier muestra de ensayo, cultivo y similares que se sospeche que incluyen un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la muestra comprende ADN, ARN, APN, ANB, formas quiméricas o híbridas de ácidos nucleicos. La muestra puede incluir cualquier espécimen biológico, clínico, quirúrgico, agrícola, atmosférico o acuático que contenga uno o más ácidos nucleicos. El término incluye también cualquier muestra aislada de ácido nucleico tal como ADN genómico, espécimen de ácido nucleico congelado en fresco o fijado en formol e incluido en parafina. También se contempla que la muestra pueda ser de un único individuo, una colección de muestras de ácido nucleico de miembros genéticamente relacionados, muestras de ácido nucleico de miembros genéticamente no relacionados, muestras de ácido nucleico (emparejadas) de un único individuo tal como una muestra de tumor y una muestra de tejido normal, o muestra de una sola fuente que contiene dos formas distintas de material genético, tal como ADN materno y fetal obtenido de un sujeto materno, o la presencia de ADN bacteriano contaminante en una muestra que contiene ADN vegetal o animal. En algunas realizaciones, la fuente de material de ácido nucleico puede incluir ácidos nucleicos obtenidos de un recién nacido, por ejemplo, como se utiliza típicamente para el cribado de recién nacidos.
[0037] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “población clonal” y “población monoclonal” se utilizan indistintamente y se refiere a una población de ácidos nucleicos que es homogénea con respecto a una secuencia de nucleótidos particular. La secuencia homogénea tiene típicamente una longitud de al menos 10 nucleótidos, pero puede ser incluso más larga incluyendo, por ejemplo, una longitud de al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500 o al menos 1000 nucleótidos. Una población clonal puede proceder de un solo ácido nucleico diana. Normalmente, todos los ácidos nucleicos de una población clonal tendrán la misma secuencia de nucleótidos. Se entenderá que, en una población clonal, puede producirse un pequeño número de mutaciones (p. ej., debidas a artefactos de amplificación) sin apartarse de la clonalidad. También se entenderá que una pequeña cantidad de ácidos nucleicos diana diferentes (por ejemplo, debido a un ácido nucleico diana que no fue amplificado o se amplificó en un grado limitado) puede estar presente en una población clonal sin apartarse de la clonalidad.
[0039] Como se utiliza en la presente memoria, el término “diferente”, cuando se usa en referencia a ácidos nucleicos, significa que los ácidos nucleicos tienen secuencias de nucleótidos que no son iguales entre sí. Dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes en toda su longitud. Alternativamente, dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes en una porción sustancial de su longitud. Por ejemplo, dos o más ácidos nucleicos pueden tener porciones de secuencias de nucleótidos diana que son diferentes entre sí y al mismo tiempo tener una región de secuencia universal que son iguales entre sí. Como se utiliza en la presente memoria, el término “diferente”, cuando se utiliza en referencia a los sitios de amplificación, significa que los sitios de amplificación están presentes en distintas ubicaciones separadas en la misma matriz.
[0040] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “acceso fluídico”, cuando se usa en referencia a una molécula en un fluido y un sitio en contacto con el fluido, se refiere a la capacidad de la molécula de moverse en o a través del fluido para entrar en contacto o entrar en el sitio. La expresión también puede referirse a la capacidad de la molécula para separarse o salir del sitio para entrar en la solución. El acceso fluídico puede tener lugar cuando no hay barreras que impidan que la molécula entre en el sitio, entre en contacto con el sitio, se separe del sitio y/o salga del sitio. Sin embargo, se entiende que el acceso fluídico existe incluso si la difusión se retarda, reduce o altera, siempre que no se impida absolutamente el acceso.
[0042] Como se utiliza en la presente memoria, el término “bicatenario”, cuando se usa en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa que sustancialmente todos los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico están unidos por enlaces de hidrógeno a un nucleótido complementario. Un ácido nucleico parcialmente bicatenario puede tener al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de sus nucleótidos con un enlace de hidrógeno a un nucleótido complementario.
[0044] Como se utiliza en la presente memoria, cuando el término “cada uno” se utiliza en referencia a una colección de artículos, pretende identificar un artículo individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a cada artículo de la colección, a menos que el contexto indique otra cosa con claridad.
[0046] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “volumen excluido” se refiere al volumen del espacio ocupado por una molécula particular con exclusión de otras moléculas similares.
[0048] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “región intersticial” se refiere a un área en un sustrato o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Por ejemplo, una región intersticial puede separar una característica de una matriz de otra característica de la matriz. Las dos regiones que están separadas entre sí pueden ser discretas, sin contacto entre sí. En otro ejemplo, una región intersticial puede separar una primera parte de una característica de una segunda parte de una característica. La separación proporcionada por una región intersticial puede ser una separación parcial o total. Las regiones intersticiales tendrán típicamente un material de superficie que difiere del material de superficie de las casillas de la superficie. Por ejemplo, las casillas de una matriz pueden tener una cantidad o concentración de agentes de captura superior a la cantidad o concentración presente en las regiones intersticiales. En algunas realizaciones, los agentes de captura pueden no estar presentes en las regiones intersticiales.
[0050] Como se utiliza en la presente memoria, el término “polimerasa” pretende ser concordante con su uso en la técnica e incluye, por ejemplo, una enzima que produce una réplica complementaria de una molécula de ácido nucleico utilizando el ácido nucleico como cadena molde. De forma típica, las polimerasas de ADN se unen a la hebra molde y luego se mueven hacia abajo de la cadena molde añadiendo secuencialmente nucleótidos al grupo hidroxilo libre del extremo 3’ de una cadena en crecimiento de ácido nucleico. Las ADN polimerasas sintetizan de forma típica moléculas de ADN complementarias a partir de patrones de ADN y las ARN polimerasas sintetizan de forma típica moléculas de ARN a partir de patrones de ADN (transcripción). Las polimerasas pueden utilizar una cadena corta de ARN o ADN, llamada cebador, para iniciar el crecimiento de la cadena. Como se describe en detalle en la presente memoria, las polimerasas pueden utilizarse durante una amplificación para producir clústeres clonales, pueden utilizarse durante una reacción de secuenciación para determinar la secuencia de un ácido nucleico y pueden utilizarse diferentes polimerasas en cada uno de estos aspectos. Algunas polimerasas pueden desplazar la cadena, secuencia arriba del sitio donde están añadiendo bases a una cadena. Se dice que dichas polimerasas desplazan la cadena, lo que significa que tienen una actividad que elimina una cadena complementaria de una cadena molde que lee la polimerasa. Las polimerasas ilustrativas que tienen una actividad de desplazamiento de cadena incluyen, sin limitarse a, el fragmento grande de Bsu (Bacillus subtilis), polimerasa Bst (Bacillus stearothermophilus), polimerasa exo-Klenow o exopolimerasa T7 de grado de secuenciación. Algunas polimerasas degradan la cadena delante de ellas, reemplazándola efectivamente por la cadena en crecimiento por detrás (actividad exonucleasa 5'). Algunas polimerasas tienen una actividad que degrada la cadena detrás de ellas (actividad exonucleasa 3'). Se han modificado algunas polimerasas útiles, ya sea por mutación o de otro modo, para reducir o eliminar la actividad exonucleasa 3' y/o 5'.
[0052] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ácido nucleico” pretende ser concordante con su uso en la técnica e incluye los ácidos nucleicos naturales y análogos funcionales de los mismos. Los análogos funcionales particularmente útiles pueden hibridarse a un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden usarse como un molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un nexo de cadena principal alternativo que incluye cualquiera de una variedad de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos naturales generalmente tienen un azúcar desoxirribosa (p. ej., en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar ribosa (p. ej., en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que se conocen en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden incluir bases naturales o no naturales. En este sentido, un ácido desoxirribonucleico natural puede tener una o más bases seleccionadas de adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas de uracilo, adenina, citosina o guanina. En la técnica se conocen bases no naturales y útiles que pueden incluirse en un ácido nucleico. El término “diana”, cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico, pretende ser un identificador semántico para el ácido nucleico en el contexto de un método o composición expuesto en la presente memoria y no limita necesariamente la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indica explícitamente. Un ácido nucleico diana que tiene una secuencia universal en cada extremo, por ejemplo un adaptador universal en cada extremo, puede denominarse ácido nucleico diana modificado.
[0053] Como se utiliza en la presente memoria, el término “transporte” se refiere al movimiento de una molécula a través de un líquido. El término puede incluir transporte pasivo, tal como el movimiento de moléculas a lo largo de su gradiente de concentración (p. ej., difusión pasiva). El término también puede incluir transporte activo mediante el cual las moléculas pueden moverse a lo largo de su gradiente de concentración o en contra de su gradiente de concentración. Por lo tanto, el transporte puede incluir la aplicación de energía para mover una o más moléculas en una dirección deseada o en una ubicación deseada, tal como un sitio de amplificación.
[0054] Como se utiliza en la presente memoria, el término “velocidad”, cuando se utiliza en referencia al transporte, amplificación, captura u otros procesos químicos, pretende ser concordante con su significado en cinética química y cinética bioquímica. Las velocidades de dos procesos se pueden comparar con respecto a velocidades máximas (p. ej., en saturación), velocidades previas al estado estacionario (p. ej., antes del equilibrio), constantes de velocidad cinética u otras medidas conocidas en la técnica. En realizaciones particulares, se puede determinar una velocidad para un proceso particular con respecto al tiempo total para completar el proceso. Por ejemplo, se puede determinar una velocidad de amplificación con respecto al tiempo necesario para que se complete la amplificación. Sin embargo, no es necesario determinar una velocidad para un proceso particular con respecto al tiempo total para completar el proceso.
[0055] El término “y/o” significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de cualquiera de dos o más de los elementos enumerados.
[0056] Las palabras “preferido(a)” y “preferiblemente” se refieren a realizaciones de la invención que pueden proporcionar determinados beneficios, en determinadas circunstancias. Sin embargo, en las mismas circunstancias o en otras, también pueden preferirse otras realizaciones. Además, la mención de una o más realizaciones preferidas no implica que otras realizaciones no sean útiles y no pretende excluir otras realizaciones del alcance de la invención.
[0057] Los términos “comprende” y variaciones del mismo no tienen un significado limitativo cuando estos términos aparecen en la descripción y en las reivindicaciones.
[0058] Se entiende que siempre que en la presente memoria se describan realizaciones con las frases “incluye”, “que incluye” o “incluyendo” y similares, también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”.
[0059] A menos que se especifique de cualquier otra manera, “un”, “uno”, “una”, “el”, “la” y “al menos un, uno, una”, se usan indistintamente y significan uno(a) o más de uno(a).
[0060] Las condiciones que son “adecuadas” para que ocurra un evento, tal como la digestión de un ácido nucleico mediada por exonucleasa, o condiciones “adecuadas”, son condiciones que no impiden que tales eventos ocurran. Por lo tanto, estas condiciones permiten, potencian, facilitan y/o favorecen el evento.
[0061] Como se utiliza en la presente memoria, “proporcionar” en el contexto de una composición, un artículo o un ácido nucleico significa fabricar la composición, artículo o ácido nucleico, adquirir la composición, artículo o ácido nucleico, o de lo contrario obtener el compuesto, composición, artículo o ácido nucleico.
[0062] También en la presente memoria, las enumeraciones de intervalos numéricos mediante extremos incluyen todos los números comprendidos dentro de ese intervalo (p. ej., 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
[0063] A lo largo de la presente memoria descriptiva, la referencia a “una realización”, a “determinadas realizaciones” o a “algunas realizaciones” etc., significa que, en al menos una realización de la exposición, se incluye un rasgo, una configuración, una composición o una característica particular descrita en relación con la realización. Por lo tanto, la aparición de dichas expresiones en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva, no se refieren necesariamente a la misma realización de la exposición. Además, los rasgos, configuraciones, composiciones o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
[0064] En la descripción de la presente memoria, pueden describirse realizaciones particulares de forma aislada por motivos de claridad. A menos que se especifique expresamente lo contrario que las casillas de una realización particular son incompatibles con las casillas de otra realización, ciertas realizaciones pueden incluir una combinación de casillas compatibles descritas en la presente memoria en relación con una o más realizaciones.
[0065] En cualquier método expuesto en la presente memoria que incluya distintas etapas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden factible. Y, según sea apropiado, puede realizarse cualquier combinación de dos o más etapas simultáneamente.
[0066] El resumen anterior de la presente invención no está destinado a describir cada realización descrita o cada implementación de la presente invención. La descripción siguiente ilustra más particularmente las realizaciones ilustrativas. En varios lugares de la solicitud, se proporciona orientación a través de listados de ejemplos, ejemplos que se pueden utilizar en diversas combinaciones. En cada caso, el listado citado sirve solo como un grupo representativo y no debe interpretarse como un listado excluyente.
[0067] Breve descripción de las figuras
[0068] La siguiente descripción detallada de las realizaciones ilustrativas de la presente exposición puede entenderse mejor cuando se lee junto con los siguientes dibujos.
[0069] Lasfiguras 1A-1Dmuestran dibujos esquemáticos de una realización de preparación de un ácido nucleico para secuenciación según diversos aspectos de la descripción presentada en la presente memoria.
[0070] Lafigura 2muestra el efecto de 3'-fosfato y glicosilasas de ADN sobre la actividad de la exonucleasa I. El panel izquierdo muestra la presencia de las glicosilasas de ADN y la exonucleasa en cada carril de una celda de flujo. Las glicosilasas de ADN se añadieron primero, seguidas de la adición de la exonucleasa. La excepción es el carril 4, en el que las glicosilasas de ADN y la exonucleasa se añadieron simultáneamente. El panel central muestra una celda de flujo con los carriles 1 a 8 numerados de arriba a abajo y la ausencia de señal en los carriles 3 a 5. El panel derecho muestra los resultados en fluorescencia de los carriles, donde los carriles 3 a 5 no tienen esencialmente fluorescencia. Lafigura 3muestra los resultados de las ejecuciones de secuenciación como se describe en los ejemplos 1 y 3. Los dibujos esquemáticos no son necesariamente a escala. Los mismos números que se utilizan en las figuras se refieren a los mismos componentes, etapas y similares. Sin embargo, se entenderá que el uso de un número para referirse a un componente en una figura dada no pretende estar limitado al componente en otra figura etiquetada con el mismo número. Además, el uso de números distintos para referirse a componentes no pretende indicar que los distintos componentes numerados no puedan ser iguales o similares a otros componentes numerados.
[0071] Descripción detallada de realizaciones ilustrativas
[0072] En la presente memoria se presentan métodos y composiciones relacionados con la secuenciación de ácidos nucleicos. La presente descripción proporciona métodos que incluyen la preparación de ácidos nucleicos para una reacción de secuenciación, la generación de clústeres clonales y la fabricación de una matriz de ácidos nucleicos en una superficie. En una realización, un método incluye proporcionar una matriz que incluye una pluralidad de sitios de amplificación. Cada sitio de amplificación incluye una pluralidad de amplicones bicatenarios. Por ejemplo, enla figura 1Ase muestra un sitio de amplificación10con un miembro de una pluralidad de amplicones bicatenarios11.
[0073] Una pluralidad de ácidos nucleicos de captura se une a la superficie del sitio de amplificación. Están presentes al menos dos poblaciones de ácidos nucleicos de captura y, en algunas realizaciones, están presentes tres o más poblaciones. Al menos una población de los ácidos nucleicos de captura incluye un sitio de escisión. En una realización, el sitio de escisión incluye un residuo de uracilo. Cada molécula de amplicón bicatenario tiene una estructura en puente, donde están unidas en sus extremos 5' a un ácido nucleico de captura y no están unidas a la matriz en sus extremos 3'. El sitio de escisión se coloca en una región bicatenaria de cada molécula bicatenaria. Por ejemplo, como se muestra enla figura 1A, se muestran dos poblaciones de ácidos nucleicos de captura. Se muestra una población ya sea unida13en un extremo de cada amplicón o unida13'a la superficie del sitio de amplificación10pero no unida a un amplicón11.También se muestra una segunda población de ácidos nucleicos de captura, ya sea unida14en el otro extremo de cada amplicón o unida14'a la superficie del sitio de amplificación10pero no unida a un amplicón11.También se muestra en lafigura 1Ael sitio de escisión (marcado con una X en el ácido nucleico13de captura).
[0074] El método incluye además poner en contacto los sitios de amplificación de la matriz con una enzima que escinde una cadena de ADN en el sitio de escisión y una exonucleasa que tiene una actividad de exonucleasa de ADN monocatenario de 3' a 5'. La exonucleasa actúa para digerir los ácidos nucleicos de captura monocatenarios que comprenden un extremo 3'-OH libre. Por ejemplo, como se muestra enla figura 1B,el sitio de escisión X en el amplicón11se escinde dejando un ácido nucleico13" de captura acortado. Los ácidos13'y14'nucleicos de captura no unidos ya no están presentes en el sitio10de amplificación.
[0075] En una realización, la secuencia de la cadena unida puede determinarse utilizando una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena, donde el extremo 3' del ácido nucleico de captura acortado(13" en lafigura 1B)se utiliza como el cebador para la iniciación de la síntesis de ADN. En algunas realizaciones, la enzima que escinde una cadena de ADN en el sitio de escisión modificará el extremo 3' del ácido nucleico de captura acortado para terminar en un 3'-fosfato. El 3'-fosfato puede eliminarse mediante una fosfatasa antes de comenzar la reacción de secuenciación.
[0076] En lugar de secuenciar la cadena unida, el método también puede incluir someter los amplicones bicatenarios escindidos a condiciones de desnaturalización para eliminar la parte de la cadena escindida(15'en lafigura 1B)que no está unida a la matriz. Esto da como resultado ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados. Por ejemplo, como se muestra enla figura 1C,la cadena de ADN que no está unida ya no está hibridada con la cadena16unida y se ha perdido.
[0077] En una realización, los ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados pueden rehibridarse con el ácido13"nucleico de captura acortado. Por ejemplo, como se muestra enla figura 1D,la cadena16de ADN unida se rehibrida con el ácido nucleico de captura acortado13”.
[0078] Matrices
[0079] Una matriz de sitios de amplificación utilizada en un método expuesto en la presente memoria puede estar presente como uno o más sustratos. Los tipos ilustrativos de materiales de sustrato que se pueden usar para una matriz incluyen vidrio, vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos, microesferas (p. ej., partículas inertes y/o magnéticas), plásticos, polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice, materiales a base sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibras ópticas, polímeros y placas de multipocillo (p. ej., de microtitulación). Los plásticos ilustrativos incluyen acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos y Teflon™. Los materiales a base de sílice ilustrativos incluyen silicio y diversas formas de silicio modificado.
[0080] En realizaciones particulares, un sustrato puede estar dentro o ser parte de un recipiente tal como un pocillo, tubo, canal, cubeta, placa de Petri, frasco o similares. Un recipiente particularmente útil es una celda de flujo, por ejemplo, como se describe en la patente US-8.241.573 o Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008). Las celdas de flujo ilustrativas son las que son comercializados por Illumina, Inc. (San Diego, California). Otro recipiente particularmente útil es un pocillo en una placa de multipocillo o en una placa de microtitulación.
[0081] En algunas realizaciones, los sitios de amplificación de una matriz pueden configurarse como casillas sobre una superficie. Las casillas pueden estar presentes en cualquiera de una variedad de formatos deseados. Por ejemplo, los sitios pueden ser pocillos, huecos, canales, crestas, regiones elevadas, clavijas, postes o similares. En una realización, los sitios de amplificación pueden contener perlas. Sin embargo, en realizaciones particulares los sitios no necesitan contener una perla o partícula. Los sitios ilustrativos incluyen pocillos que están presentes en sustratos utilizados para plataformas comerciales de secuenciación vendidas por 454 LifeSciences (una subsidiaria de Roche, Basilea, Suiza) o Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad California). Otros sustratos que tienen pocillos incluyen, por ejemplo, fibra óptica grabada y otros sustratos descritos en la patente US-6.266.459; patente US-6.355.431; patente US-6.770.441; patente US-6.859.570; patente US-6.210.891; patente US-6.258.568; patente US-6.274.320; patente US-8.262.900; patente US-7.948.015; solicitud de patente US-2010/0137143; patente US-8.349.167 o la publicación PCT N.° WO 00/63437. En varios casos, los sustratos se ilustran en estas referencias para aplicaciones que utilizan perlas en los pocillos. Los sustratos que contienen pocillos se pueden usar con o sin perlas en los métodos o composiciones de la presente memoria. En algunas realizaciones, los pocillos de un sustrato pueden incluir material de gel (con o sin perlas) como se expone en la patente US-9.512.422.
[0082] Los sitios de amplificación de una matriz pueden ser casillas metálicas sobre una superficie no metálica tal como vidrio, plástico u otros materiales ilustrados en la presente memoria. Puede depositarse una capa metálica sobre una superficie utilizando métodos conocidos en la técnica tales como grabado por plasma húmedo, grabado por plasma seco, deposición de capas atómicas, grabado por haz de iones, deposición química de vapor, pulverización catódica al vacío o similares. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de instrumentos comerciales según sea apropiado, incluido, por ejemplo, los sistemas FlexAL®, Opal®, Ionfab 300Plus® u Optofab 3000® (Oxford Instruments, Reino Unido). También se puede depositar una capa de metal mediante evaporación por haz de electrones o pulverización catódica como se expone en Thornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7:239-60 (1977). Las técnicas de deposición de capa metálica, tales como las ilustradas en la presente memoria, pueden combinarse con técnicas de fotolitografía para crear regiones o parches metálicos sobre una superficie. Se proporcionan métodos ilustrativos para combinar técnicas de deposición de capas metálicas y técnicas de fotolitografía en la patente US- 8.778.848 y la patente US-8.895.249. Una variedad de características puede aparecer como una cuadrícula de puntos o manchas. Las casillas pueden ubicarse en un patrón repetitivo o en un patrón irregular no repetitivo. Los patrones particularmente útiles son patrones hexagonales, patrones rectilíneos, patrones en cuadrícula, patrones que tienen simetría reflectante, patrones que tienen simetría rotacional o similares. Los patrones asimétricos también pueden resultar útiles. La inclinación puede ser la mismo entre diferentes pares de casillas vecinas más cercanas o la inclinación puede variar entre diferentes pares de entidades vecinas más cercanas. En realizaciones particulares, las características de una matriz pueden tener cada una un área mayor que aproximadamente 100 nm<2>, 250 nm<2>, 500 nm<2>, 1 µm<2>, 2,5 µm<2>, 5 µm<2>, 10 µm<2>, 100 µm<2>o 500 µm<2>. Alternativamente o de forma adicional, las características de una matriz pueden tener cada una un área menor que aproximadamente 1 mm<2>, 500 µm<2>, 100 µm<2>, 25 µm<2>, 10 µm<2>, 5 µm<2>, 1 µm<2>, 500 nm<2>o 100 nm<2>. De hecho, una región puede tener un tamaño que esté en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ilustrados anteriormente.
[0084] Para realizaciones que incluyen una matriz de casillas en una superficie, las casillas pueden ser discretas estando por regiones intersticiales. El tamaño de las características y/o el espaciado entre las regiones puede variar de tal modo que las matrices puedan ser de alta densidad, densidad media o menor densidad. Las matrices de alta densidad se caracterizan por tener regiones separadas por menos que aproximadamente 15 µm. Las matrices de densidad media tienen regiones separadas por aproximadamente 15 a 30 µm, mientras que las matrices de baja densidad tienen regiones separadas por más de 30 µm. Una matriz útil en la descripción puede tener regiones que estén separadas por menos de 100 µm, 50 µm, 10 µm, 5 µm, 1 µm o 0,5 µm.
[0086] En realizaciones particulares, una matriz puede incluir una colección de perlas u otras partículas. Las partículas pueden suspenderse en una solución o pueden ubicarse en la superficie de un sustrato. Los ejemplos de matrices de perlas en solución son las comercializadas por Luminex (Austin, Tex., EE. UU.). Los ejemplos de matrices que tienen perlas ubicadas sobre una superficie incluyen aquellas en donde las perlas están ubicadas en pocillos tales como una matriz BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) o sustratos utilizados en plataformas de secuenciación de 454 LifeSciences (una subsidiaria de Roche, Basilea, Suiza) o de Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Otras matrices que tienen perlas ubicadas sobre una superficie se describen en la patente US-6.266.459; patente US-6.355.431; patente US-6.770.441; patente US-6.859.570; patente US-6.210.891; patente US-6.258.568; patente US-6.274.320; solicitud de patente US-2009/0026082 A1; solicitud de patente US-2009/0127589 A1; solicitud de patente US-2010/0137143 A1; solicitud de patente US-2010/0282617 A1; o la publicación PCT n.° WO 00/63437. Varias de las referencias anteriores describen métodos para unir ácidos nucleicos diana a perlas antes de cargar las perlas en o sobre un sustrato de matriz. Sin embargo, se entenderá que las perlas pueden fabricarse para incluir cebadores de amplificación y las perlas pueden utilizarse, a continuación, para cargar una matriz, formando de este modo sitios de amplificación para uso en un método expuesto en la presente memoria. Como se expuso anteriormente en la presente memoria, los sustratos se pueden usar sin perlas. Por ejemplo, los cebadores de amplificación se pueden unir directamente a los pocillos o al material de gel en los pocillos. Por lo tanto, las referencias son ilustrativas de materiales, composiciones o aparatos que pueden modificarse para su uso en los métodos y composiciones expuestos en la presente memoria.
[0088] Los sitios de amplificación de una matriz pueden incluir una pluralidad de agentes de captura capaces de unirse a ácidos nucleicos diana. En una realización, un agente de captura incluye un ácido nucleico de captura. La secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de captura es complementaria a una secuencia universal de los ácidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de captura también puede actuar como un cebador para la amplificación del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, una población de ácido nucleico de captura incluye un cebador P5 o el complemento del mismo. En algunas realizaciones, los sitios de amplificación también incluyen una pluralidad de un segundo ácido nucleico de captura, y este segundo ácido nucleico de captura puede incluir un cebador P7 o el complemento del mismo. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de captura puede incluir un sitio de escisión. Los sitios de escisión en un ácido nucleico de captura se describen con mayor detalle en la presente memoria.
[0090] En realizaciones particulares, puede unirse un agente de captura, tal como un ácido nucleico de captura, a los sitios de amplificación. Por ejemplo, el agente de captura se puede unir a la superficie de una casilla de una matriz. La unión puede realizarse a través de una estructura intermedia tal como una perla, partícula o gel. Un ejemplo de unión de ácidos nucleicos de captura a una matriz mediante un gel se describe en la patente US-8.895.249 y además ilustrada por celdas de flujo disponibles comercialmente de Illumina Inc. (San Diego, CA, EE. UU) o descritas en la patente WO 2008/093098. Los geles ilustrativos que pueden usarse en los métodos y aparatos expuestos en la presente memoria incluyen, pero no se limita a, los que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; una estructura de malla polimérica, tal como gelatina; o una estructura de polímero reticulada, tal como poliacrilamida, SFA (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente US-2011/0059865 A1) o PAZAM (véase, por ejemplo, solicitud provisional de patente series US-61/753.833 y la patente US-9.012.022. La unión mediante una perla se puede lograr como se ilustra en la descripción y la bibliografía citada expuesta anteriormente en la presente memoria.
[0092] En algunas realizaciones, las casillas en la superficie de un sustrato de matriz no son contiguas y están separadas por regiones intersticiales de la superficie. Son ventajosas las regiones intersticiales que tienen una cantidad o concentración sustancialmente menor de agentes de captura, en comparación con las casillas de la matriz. Las regiones intersticiales que carecen de agentes de captura son particularmente ventajosas. Por ejemplo, una cantidad relativamente pequeña o ausencia de restos de captura en las regiones intersticiales favorece la ubicación de los ácidos nucleicos diana y de los clústeres generados posteriormente en las casillas deseadas. En realizaciones particulares, las casillas pueden ser casillas cóncavas en una superficie (p. ej., pocillos) y las casillas pueden contener un material de gel. Las casillas que contienen gel pueden estar separadas entre sí por regiones intersticiales en la superficie donde el gel está sustancialmente ausente o, si está presente, el gel es sustancialmente incapaz de soportar la ubicación de ácidos nucleicos. Los métodos y composiciones para fabricar y utilizar sustratos que tienen características que contienen gel, tales como pocillos, se exponen en la solicitud de patente provisional US-61/769.289.
[0093] Ácidos nucleicos diana
[0095] Una matriz utilizada en un método descrito en la presente memoria incluye ácidos nucleicos diana modificados bicatenarios. Los términos “ácido nucleico diana”, “fragmento diana”, “fragmento de ácido nucleico diana”, “molécula diana” y “molécula de ácido nucleico diana” se utilizan indistintamente para referirse a moléculas de ácido nucleico donde se desea la identificación de su secuencia de nucleótidos. El ácido nucleico diana puede ser esencialmente cualquier ácido nucleico de secuencia conocida o desconocida. Puede ser, por ejemplo, un fragmento de ADN genómico o ADNc. La secuenciación puede resultar en la determinación de la secuencia de toda o una parte de la molécula diana. Las dianas pueden proceder de una muestra primaria de ácido nucleico fragmentada al azar. En una realización, las dianas pueden procesarse en moldes adecuados para la amplificación mediante la colocación de secuencias de amplificación universales, por ejemplo, secuencias presentes en un adaptador universal, en los extremos de cada fragmento de diana. Un ácido nucleico diana que tiene un adaptador universal en cada extremo, puede denominarse como un “ácido nucleico diana modificado.” Los adaptadores universales se detallan en la presente memoria.
[0097] La muestra primaria de ácido nucleico puede originarse en forma de ADN bicatenario (ADNbc) (p. ej., fragmentos de ADN genómico, productos de PCR y amplificación y similares) a partir de una muestra o puede originarse en forma monocatenaria a partir de una muestra, como ADN o ARN, y haberse convertido en forma de ADNbc. A modo de ejemplo, las moléculas de ARNm pueden copiarse en ADNc bicatenarios adecuados para el uso en un método descrito en la presente memoria, utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. La secuencia precisa de las moléculas de polinucleótido de una muestra primaria de ácido nucleico generalmente no es material de la descripción, y puede ser conocida o desconocida.
[0099] En una realización, las moléculas de polinucleótido primarias de una muestra de ácido nucleico primaria son moléculas de ADN. Más particularmente, las moléculas de polinucleótido primarias representan todo el complemento genético de un organismo, y son moléculas de ADN genómico que incluyen tanto secuencias de intrones como de exones, así como secuencias reguladoras no codificantes, tales como secuencias promotoras y potenciadoras. En una realización, pueden utilizarse subconjuntos particulares de secuencias de polinucleótido o ADN genómico, tales como, por ejemplo, cromosomas particulares. Aún más en particularmente, se desconoce la secuencia de las moléculas de polinucleótido primarias. Todavía más particularmente, las moléculas de polinucleótido primarias son moléculas de ADN genómico humano. Los fragmentos de ADN diana pueden tratarse química o enzimáticamente antes o después de cualquier proceso de fragmentación al azar, y antes o después del ligamiento de las secuencias adaptadoras universales.
[0100] La muestra de ácido nucleico puede incluir material de elevado peso molecular tal como ADN genómico (ADNg). La muestra puede incluir material de bajo peso molecular, tal como moléculas de ácido nucleico obtenidas de muestras de ADN fijadas en formalina e incluidas en parafina o archivadas. En otra realización, el material de bajo peso molecular incluye ADN fragmentado enzimática o mecánicamente. La muestra puede incluir ADN circulante extracelular. En algunas realizaciones, la muestra puede incluir moléculas de ácido nucleico obtenidas de biopsias, tumores, raspados, hisopados, sangre, moco, orina, plasma, semen, cabello, microdisecciones por captura con láser, resecciones quirúrgicas y otras muestras obtenidas clínicas o de laboratorio. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra epidemiológica, agrícola, forense o patógena. En algunas realizaciones, la muestra puede incluir moléculas de ácido nucleico obtenidas de un animal tal como una fuente humana o de mamífero. En otra realización, la muestra puede incluir moléculas de ácido nucleico obtenidas a partir de una fuente no mamífera tal como una planta, una bacteria, un virus o un hongo. En algunas realizaciones, la fuente de las moléculas de ácido nucleico puede ser una muestra o especie archivada o extinta.
[0102] Además, los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden ser útiles para amplificar una muestra de ácido nucleico que tiene moléculas de ácido nucleico de baja calidad, tal como ADN genómico degradado y/o fragmentado de una muestra forense. En una realización, las muestras forenses pueden incluir ácidos nucleicos obtenidos de la escena de un crimen, de una base de datos de ADN de personas desaparecidas, de un laboratorio asociado con una investigación forense o de muestras forenses obtenidas por autoridades encargadas del cumplimiento de la ley, uno o más servicios militares o cualquier tal personal. La muestra de ácido nucleico puede ser una muestra purificada o un lisado que contiene ADN en bruto, por ejemplo obtenido de un hisopado bucal, papel, tela u otro sustrato que puede estar impregnado con saliva, sangre u otros fluidos corporales. Como tal, en algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico puede incluir cantidades bajas de, o partes fragmentadas de ADN, tal como ADN genómico. En algunas realizaciones, las secuencias diana pueden presentarse en uno o más fluidos corporales que incluyen, aunque no de forma limitativa a, sangre, esputo, plasma, semen, orina y suero. En algunas realizaciones, las secuencias diana pueden obtenerse a partir de cabello, piel, muestras de tejido, autopsias o restos de una víctima. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que incluyen una o más secuencias diana se pueden obtener de un animal muerto o un ser humano fallecido. En algunas realizaciones, las secuencias diana pueden incluir ácidos nucleicos obtenidos de ADN no humano, tal como ADN microbiano, vegetal o entomológico. En algunas realizaciones, las secuencias diana o las secuencias diana amplificadas están dirigidas a fines de identificación de seres humanos. En algunas realizaciones, puede utilizarse un método descrito en la presente memoria para identificar las características de una muestra forense. En algunas realizaciones, un método descrito en la presente memoria puede utilizarse para métodos de identificación humana que utilizan uno o más cebadores específicos de diana o uno o más cebadores específicos de diana diseñados utilizando criterios conocidos de diseño de cebadores. En una realización, una muestra forense o de identificación humana que contiene al menos una secuencia diana puede amplificarse utilizando uno cualquiera o más cebadores específicos de diana utilizando los criterios conocidos de cebadores.
[0103] Los ejemplos adicionales no limitativos de fuentes de muestras biológicas pueden incluir organismos completos así como una muestra obtenida de un paciente. La muestra biológica se puede obtener de cualquier fluido o tejido biológico y puede estar en una diversidad de formas, incluyendo fluido y tejido líquidos, tejido sólido y formas conservadas tales como formas secas, congeladas y fijadas. La muestra puede ser de cualquier tejido biológico, célula o fluido. Dichas muestras incluyen, pero no se limita a, esputo, sangre, suero, plasma, células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos), líquido ascítico, orina, saliva, lágrimas, esputo, fluido vaginal (flujo), lavados obtenidos durante un procedimiento médico (p. ej., lavados pélvicos u otros lavados obtenidos durante una biopsia, endoscopia o cirugía), tejido, aspirado del pezón, muestras de biopsia con aguja gruesa o de biopsia con aguja fina, fluidos corporales que contienen células, ácidos nucleicos flotantes libres, líquido peritoneal y líquido pleural, o células a partir de los mismos. Las muestras biológicas también pueden incluir cortes de tejidos tales como cortes congelados o fijados tomados con fines histológicos o células microdiseccionadas o partes extracelulares de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra de sangre, tal como, por ejemplo, una muestra de sangre entera. En otro ejemplo, la muestra es una muestra de gota de sangre seca sin procesar. En aún otro ejemplo, la muestra es una muestra fijada con formalina e incluida en parafina. En otro ejemplo más, la muestra es una muestra de saliva. En aún otro ejemplo, la muestra es una muestra de gota de saliva seca.
[0105] Las muestras biológicas ilustrativas de las que se pueden obtener ácidos nucleicos diana incluyen, por ejemplo, las procedentes de un eucariota, por ejemplo un mamífero, tal como un roedor, ratón, rata, conejo, cobaya, ungulado, caballo, oveja, cerdo, cabra, vaca, gato, perro, primate, primate humano o no humano; una planta, tal comoArabidopsis thaliana,maíz, sorgo, avena, trigo, arroz, colza, o soja; un alga tal comoChlamydomonas reinhardtii;un nematodo tal comoCaenorhabditis elegans;un insecto, tal comoDrosophila melanogaster,mosquito, mosca de la fruta, abeja melífera o araña; un pez, tal como el pez cebra; un reptil; un anfibio tal como una rana oXenopus laevis;unDictyostelium discoideum; un hongo, tal como levadura, tal comoPneumocystis carinii, Takifugu rubripes,levadura, tal comoSaccharamoyces cerevisiaeoSchizosaccharomyces pombe;oPlasmodium falciparum. Los ácidos nucleicos diana también pueden derivarse de un procariota tal como una bacteria,Escherichia coli, estafilococos oMycoplasma pneumoniae;un arqueón; un virus tal como el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana; o un viroide. Los ácidos nucleicos diana pueden derivarse de un cultivo homogéneo o población de organismos o, alternativamente, de una colección de varios organismos diferentes, por ejemplo, en una comunidad o ecosistema.
[0107] Fragmentación aleatoria se refiere a la fragmentación de una molécula de polinucleótido de una muestra primaria de ácido nucleico de forma no ordenada por métodos enzimáticos, químicos o mecánicos. Dichos métodos de fragmentación se conocen en la técnica y usan métodos estándar (Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tercera edición). En una realización, la fragmentación se puede lograr usando un proceso al que frecuentemente se hace referencia como “tagmentación”. La tagmentación utiliza un complejo de transposoma y se combina en un solo paso de fragmentación y ligamiento para añadir adaptadores universales (Gunderson y col., documento WO 2016/130704). Para mayor claridad, generar fragmentos más pequeños de un fragmento mayor de ácido nucleico mediante la amplificación específica por PCR de dichos fragmentos más pequeños no equivale a fragmentar la pieza más grande de ácido nucleico, ya que la pieza más grande de la secuencia de ácido nucleico permanece intacta (es decir, no se fragmenta por la amplificación por PCR). Además, la fragmentación aleatoria está diseñada para producir fragmentos independientemente de la identidad de secuencia o posición de los nucleótidos que comprenden y/o rodean la ruptura. Más particularmente, la fragmentación al azar se realiza por medios mecánicos tales como la nebulización o la sonicación para producir fragmentos de unos 50 pares de bases de longitud a aproximadamente 1500 pares de bases de longitud, aún más particularmente de 50-700 pares de bases de longitud, todavía más particularmente de 50-400 pares de bases de longitud. Más particularmente, el método se utiliza para generar fragmentos más pequeños de 50 - 150 pares de bases de longitud
[0109] La fragmentación de moléculas de polinucleótido por medios mecánicos (nebulización, sonicación y cizallamiento hidrodinámico mediante Hydroshear, por ejemplo) da como resultado fragmentos con una mezcla heterogénea de extremos romos y de extremos protuberantes 3' y 5'. Por lo tanto, es deseable reparar los extremos del fragmento utilizando métodos o kits (tal como el kit de reparación de extremos del terminador de ADN Lucigen) conocidos en la técnica para generar extremos que sean óptimos para la inserción, por ejemplo, en sitios romos de vectores de clonación. En una realización particular, los extremos de los fragmentos de la población de ácidos nucleicos son extremos romos. Más particularmente, los extremos de los fragmentos tienen extremos romos y están fosforilados. El resto fosfato puede introducirse mediante tratamiento enzimático, por ejemplo, utilizando polinucleótido cinasa.
[0110] Una población de ácidos nucleicos diana puede tener una longitud de cadena promedio que se desea o que sea apropiada para una aplicación particular de los métodos o composiciones expuestos en la presente memoria. Por ejemplo, la longitud de cadena promedio puede ser menor que aproximadamente 100.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 5.000 nucleótidos, 1.000 nucleótidos, 500 nucleótidos, 100 nucleótidos o 50 nucleótidos. Alternativamente, o de forma adicional, la longitud promedio de cadena puede ser mayor que aproximadamente 10 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 500 nucleótidos, 1000 nucleótidos, 5000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos o 100.000 nucleótidos. La longitud promedio de cadena para una población de ácidos nucleicos diana puede estar en un intervalo entre un valor máximo y mínimo expuesto en la presente memoria. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o fabricados o utilizados de otro modo en la presente memoria) pueden tener una longitud de cadena promedio que está en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ilustrados anteriormente.
[0112] En algunos casos, una población de ácidos nucleicos diana puede producirse en condiciones o configurarse de otro modo para que tenga una longitud máxima para sus miembros. Por ejemplo, la longitud máxima para los miembros que se usan en uno o más pasos de un método expuesto en la presente memoria o que están presentes en una composición particular puede ser de menos que 100.000 nucleótidos, menos que 50.000 nucleótidos, menos que 10.000 nucleótidos, menos que 5.000 nucleótidos, menos que 1.000 nucleótidos, menos que 500 nucleótidos, menos que 100 nucleótidos o menos que 50 nucleótidos. Alternativamente o de forma adicional, una población de ácidos nucleicos diana puede producirse en condiciones o de lo contrario configurarse para tener una longitud mínima para sus elementos. Por ejemplo, la longitud mínima para los miembros que se usan en un o más pasos de un método expuesto en la presente memoria o que están presentes en una composición particular puede ser de más que 10 nucleótidos, más que 50 nucleótidos, más que 100 nucleótidos, más que 500 nucleótidos, más que 1.000 nucleótidos, más que 5.000 nucleótidos, más que 10.000 nucleótidos, más que 50.000 nucleótidos o más que 100.000 nucleótidos. La longitud de cadena máxima y mínima para los ácidos nucleicos diana en una población puede estar en un intervalo entre un valor máximo y mínimo expuesto anteriormente. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o fabricados o utilizados de otro modo en la presente memoria) pueden tener longitudes de cadena máximas y/o mínimas en un intervalo entre los límites superior e inferior ilustrados anteriormente.
[0114] En una realización particular, las secuencias de fragmentos diana se preparan con nucleótidos protuberantes individuales mediante, por ejemplo, la actividad de determinados tipos de polimerasa de ADN tal como la polimerasa Taq o la polimerasa Klenow exo minus que tiene una actividad de transferasa terminal no dependiente de molde que añade un único desoxinucleótido, por ejemplo, desoxiadenosina (A) a los extremos 3' de, por ejemplo, un producto de PCR. Dichas enzimas pueden utilizarse para añadir un único nucleótido 'A' al extremo romo 3' de cada cadena de los fragmentos diana bicatenarios. Por lo tanto, podría añadirse una 'A' al extremo 3' de cada cadena de extremos reparados de los fragmentos diana bicatenarios por reacción con la polimerasa Taq o Klenow exo minus, mientras que la construcción de polinucleótido adaptador universal podría ser una construcción de T con una protuberancia 'T' compatible presente en el extremo 3' de cada región de ácido nucleico bicatenario del adaptador universal. Esta modificación de extremo también impide el autoligamiento tanto del vector como de la diana, de tal modo que existe una tendencia hacia la formación de ácidos nucleicos diana que tienen un adaptador universal en cada extremo.
[0115] En algunos casos, los ácidos nucleicos diana que se obtienen de tales fuentes se pueden amplificar antes de su uso en un método o composición de la presente memoria. Se puede utilizar cualquiera de una diversidad de técnicas de amplificación conocidas, incluyendo, pero no se limita a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) o la amplificación primaria al azar (RPA). Se entenderá que la amplificación de los ácidos nucleicos diana antes de su uso en un método o composición expuesta en la presente memoria es opcional. Como tales, los ácidos nucleicos diana no se amplificarán antes de su uso en algunas realizaciones de los métodos y composiciones expuestos en la presente memoria. Los ácidos nucleicos diana pueden proceder opcionalmente de bibliotecas sintéticas. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden tener composiciones de ADN o ARN naturales o pueden ser análogos de los mismos.
[0117] Adaptadores universales
[0119] Un ácido nucleico diana usado en un método o composición descrito en la presente memoria incluye un adaptador universal unido a cada extremo. Un ácido nucleico diana que tiene un adaptador universal en cada extremo, puede denominarse como un “ácido nucleico diana modificado”. Los expertos en la técnica conocen los métodos para unir un adaptador universal a cada extremo de un ácido nucleico diana utilizado en un método descrito en la presente memoria. La unión puede realizarse mediante técnicas estándar de preparación de bibliotecas utilizando ligamiento (solicitud de patente US-2018/0305753), o mediante tagmentación utilizando complejos de transposasa (Gunderson y col., patente WO 2016/130704).
[0121] En una realización, los ácidos nucleicos diana bicatenarios de una muestra, p. ej., una muestra fragmentada, se tratan ligando primero moléculas de adaptador universal idénticas (“adaptadores con emparejamiento erróneo”, las características generales las cuales se definen más adelante y se describen adicionalmente en Gormley y col., patente US-7.741.463, y Bignell y col., patente US-8.053.192) a los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos diana bicatenarios. En una realización, el adaptador universal incluye las secuencias de unión de captura universales necesarias para inmovilizar los ácidos nucleicos diana en una matriz para su posterior secuenciación. En otra realización, se usa un paso de PCR para modificar adicionalmente el adaptador universal presente en cada extremo de los ácidos nucleicos diana antes de la inmovilización y la secuenciación. Por ejemplo, se lleva a cabo una reacción de extensión de cebador inicial utilizando un sitio de unión de cebador universal en que se forman productos de extensión complementarios con ambas cadenas de cada ácido nucleico diana individual y se añade una secuencia de unión de captura universal. Los productos de extensión de cebador resultantes, y opcionalmente las copias amplificadas de los mismos, proporcionan colectivamente una biblioteca de ácidos nucleicos diana modificados que pueden inmovilizarse y a continuación secuenciarse. El término “biblioteca” se refiere a la colección de ácidos nucleicos diana que contienen secuencias comunes conocidas en sus extremos 3' y 5', y también puede denominarse biblioteca modificada en 3' y 5'.
[0122] Los adaptadores universales utilizados en el método de la descripción se denominan adaptadores 'con emparejamiento erróneo' debido a que, como se explica en detalle en la presente memoria, los adaptadores incluyen una región de emparejamiento erróneo de secuencia, es decir, no se forman por hibridación de cadenas de polinucleótido totalmente complementarias.
[0123] Los adaptadores con emparejamiento erróneo para el uso en la presente memoria se forman mediante hibridación de dos cadenas de polinucleótido parcialmente complementarias para proporcionar, cuando las dos cadenas están hibridadas, al menos una región bicatenaria, también denominada como una región de ácido nucleico bicatenario, y al menos una región no emparejada monocatenaria, también denominada como una región de cadenas de ácido nucleico monocatenarias no complementarias.
[0124] La región bicatenaria del adaptador universal es una región bicatenaria corta, que incluye típicamente 5 o más pares de bases consecutivos, formados por hibridación de las dos cadenas de polinucleótido parcialmente complementarias. Este término se refiere a una región bicatenaria de ácido nucleico en que las dos cadenas están hibridadas y no implica ninguna conformación estructural particular.
[0125] Es generalmente ventajoso que la región bicatenaria sea lo más corta posible sin pérdida de función. En este contexto, 'función' se refiere a la capacidad de la región bicatenaria para formar un dúplex estable en condiciones de reacción estándar para una reacción de ligamiento de ácido nucleico catalizada por enzima, que serán bien conocidas por el lector experto (p. ej., incubación a una temperatura en el intervalo de 4 °C a 25 °C en un tampón de ligamiento apropiado para la enzima), de tal modo que las dos cadenas que forman el adaptador universal permanezcan parcialmente hibridadas durante el ligamiento del adaptador universal a una molécula diana. No es absolutamente necesario que la región bicatenaria sea estable en las condiciones normalmente utilizadas en los pasos de hibridación de la extensión de cebador o en las reacciones PCR.
[0126] La región bicatenaria de los adaptadores universales suele ser idéntica en todos los adaptadores universales utilizados en un ligamiento. Dado que los adaptadores universales se ligan a ambos extremos de cada molécula diana, el ácido nucleico diana modificado estará flanqueado por secuencias complementarias procedentes de la región bicatenaria de los adaptadores universales. Cuanto más larga sea la región bicatenaria y, por tanto, las secuencias complementarias procedentes de la misma en las construcciones de ácido nucleico diana modificado, mayor será la posibilidad de que la construcción de ácido nucleico diana modificado sea capaz de plegarse y emparejarse consigo misma en estas regiones de autocomplementariedad interna en las condiciones de hibridación utilizadas en la extensión de cebadores y/o la PCR. Por lo tanto, generalmente se prefiere que la región bicatenaria tenga 20 o menos, 15 o menos, o 10 o menos pares de bases de longitud para reducir este efecto. La estabilidad de la región bicatenaria puede aumentarse y, por lo tanto, su longitud verse potencialmente reducida, por la inclusión de nucleótidos no naturales que muestran emparejamiento de bases más fuerte que los pares de bases estándar de Watson-Crick. En una realización, las dos cadenas del adaptador universal son el 100 % complementarias en la región bicatenaria. Se apreciará que pueden tolerarse uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos dentro de la región bicatenaria, siempre que las dos cadenas sean capaces de formar un dúplex estable en condiciones de ligadura convencionales.
[0127] Los adaptadores universales para el uso en la presente memoria generalmente incluyen una región bicatenaria que forma el extremo 'ligable' del adaptador, p. ej., el extremo que está unido a un ácido nucleico diana bicatenario en la reacción de ligamiento. El extremo ligable del adaptador universal puede ser romo o, en otras realizaciones, puede haber presentes protuberancias 5' o 3' cortas de uno o más nucleótidos para facilitar/propiciar el ligamiento. El nucleótido terminal 5' en el extremo ligable del adaptador universal esta típicamente fosforilado para permitir la unión fosfodiéster a un grupo hidroxilo 3' en el polinucleótido diana.
[0128] El término “región no emparejada” se refiere a una región del adaptador universal, la región de cadenas de ácido nucleico monocatenarias no complementarias, en donde las secuencias de las dos cadenas de polinucleótido que forman el adaptador universal presentan un grado de no complementariedad de tal modo las dos cadenas no son capaces de hibridarse completamente entre sí en condiciones estándar de hibridación estándar para una reacción de extensión de cebador o de PCR. La región o regiones no emparejadas pueden presentar cierto grado de hibridación en condiciones de reacción estándar para una reacción de ligamiento catalizada por enzimas, siempre que las dos cadenas vuelvan a la forma monocatenaria en condiciones de hibridación en una reacción de amplificación.
[0129] Debe entenderse que la “región no emparejada” está proporcionada por diferentes partes de las mismas dos cadenas de polinucleótido que forman la(s) región(es) bicatenaria(s). Los emparejamientos erróneos en la construcción del adaptador pueden tomar la forma de una cadena más larga que la otra, de modo que hay una región monocatenaria en una de las cadenas, o una secuencia seleccionada de tal manera que las dos cadenas no hibridan y, por lo tanto, forman una región monocatenaria en ambas cadenas. Los emparejamientos erróneos también pueden tomar la forma de 'burbujas', en donde ambos extremos de la construcción o construcciones del adaptador universal son capaces de hibridar entre sí y formar un dúplex, pero la región central no. Las partes de la cadena o cadenas que forman la región no emparejada no están hibridadas en condiciones en que otras partes de las mismas dos cadenas hibridan para formar una o más regiones bicatenarias. Para evitar dudas, debe entenderse que una protuberancia monocatenaria o de una sola base en el extremo 3' de un dúplex de polinucleótido que posteriormente se somete a ligamiento con las secuencias diana no constituye una “región no emparejada” en el contexto de esta descripción.
[0130] El límite menor de la longitud de la región no emparejada típicamente estará determinado por la función, por ejemplo, la necesidad de proporcionar una secuencia adecuada para i) la unión de un cebador para extensión de cebador, PCR y/o secuenciación (por ejemplo, unión de un cebador a un sitio de unión de cebador universal), o para ii) la unión de una secuencia de unión de captura universal a un ácido nucleico de captura para la inmovilización de un ácido nucleico diana modificado a una superficie. Teóricamente no hay límite superior en la longitud de la región no emparejada, excepto que generalmente es ventajoso minimizar la longitud total del adaptador universal, por ejemplo, para facilitar la separación de adaptadores universales no unidos de construcciones de ácido nucleico diana modificado tras el paso de ligamiento. Por lo tanto, generalmente se prefiere que la región no emparejada tenga menos de 50, o menos de 40, o menos de 30, o menos de 25 nucleótidos consecutivos de longitud.
[0131] La región de cadenas de ácido nucleico monocatenario no complementario incluye al menos una secuencia de unión de captura universal en el extremo 3'. El extremo 3' de un adaptador universal incluye una secuencia de unión de captura universal que se hibridará con un ácido nucleico de captura presente en sitios de amplificación de una matriz. Opcionalmente, el extremo 5' de un adaptador universal incluye una segunda secuencia de unión de captura universal unida a cada extremo de un ácido nucleico diana, donde la segunda secuencia de unión de captura universal se hibridará con un ácido nucleico diferente de captura presente en sitios de amplificación de una matriz.
[0132] La región de cadenas de ácido nucleico monocatenario no complementario típicamente también incluye al menos un sitio de unión de cebador universal. Un sitio de unión de cebador universal es una secuencia universal que puede usarse para la amplificación y/o la secuenciación de un ácido nucleico diana ligado al adaptador universal.
[0133] La región de cadenas de ácido nucleico monocatenario no complementario también puede incluir al menos un índice. Puede utilizarse un índice como marcador característico de la fuente de ácidos nucleicos diana particulares sobre una matriz (patente US-8.053.192). Generalmente, el índice es una secuencia sintética de nucleótidos que forma parte del adaptador universal que se añade a los ácidos nucleicos diana como parte del paso de preparación de la biblioteca. En consecuencia, un índice es una secuencia de ácido nucleico que está unida a cada una de las moléculas diana de una muestra particular, cuya presencia es indicativa de, o se utiliza para identificar, la muestra o fuente de la que se aislaron las moléculas diana. En una realización, puede utilizarse un sistema de índice dual. En un sistema de índice dual, el adaptador universal unido a los ácidos nucleicos diana incluye dos secuencias de índice diferentes (la solicitud de patente US-2018/0305750, la solicitud de patente US-2018/0305751, la solicitud de patente US-2018/0305752 y la solicitud de patente US-2018/0305753).
[0134] Preferiblemente, el índice puede ser de hasta 20 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de 1 a 10 nucleótidos y muy preferiblemente de 4 a 6 nucleótidos de longitud. Un índice de cuatro nucleótidos ofrece una posibilidad de multiplexar 256 muestras en la misma matriz, un índice de seis bases permite procesar 4096 muestras en la misma matriz.
[0135] En una realización, la secuencia de unión de captura universal es parte del adaptador universal cuando se liga a los fragmentos diana bicatenarios, y en otra realización el sitio de unión de extensión de cebador universal se añade al adaptador universal después de que el adaptador universal se liga a los fragmentos diana bicatenarios. La adición puede lograrse utilizando métodos rutinarios, incluyendo métodos basados en amplificación, tal como PCR.
[0136] La secuencia de nucleótidos precisa de los adaptadores universales generalmente no es material para la descripción y puede ser seleccionada por el usuario de tal modo que los elementos de secuencia deseados se incluyan finalmente en las secuencias comunes de la pluralidad de diferentes ácidos nucleicos diana modificados, por ejemplo, para proporcionar las secuencias de unión de captura universal y los sitios de unión para conjuntos particulares de cebadores de amplificación universales y/o cebadores de secuenciación. Pueden incluirse elementos de secuencia adicionales, por ejemplo, para proporcionar sitios de unión para cebadores de secuenciación que se utilizarán finalmente en la secuenciación de ácidos nucleicos diana en la biblioteca, en la secuenciación de un índice o productos derivados de la amplificación de los ácidos nucleicos diana en la biblioteca, por ejemplo, en un soporte sólido.
[0137] Aunque la secuencia de nucleótidos precisa del adaptador universal es generalmente no limitante para la descripción, las secuencias de las cadenas individuales en la región no emparejada deben ser de tal manera que ninguna cadena individual presente ninguna autocomplementariedad interna que pudiera conducir a una autohibridación, formación de estructuras de horquilla, etc., en condiciones de hibridación estándar. La autohibridación de una cadena en la región no emparejada debe impedirse ya que esto puede evitar o reducir la unión específica de un cebador de amplificación a esta cadena.
[0138] Los adaptadores con emparejamiento erróneo se forman preferiblemente a partir de dos cadenas de ADN, pero pueden incluir mezclas de nucleótidos naturales y no naturales (p. ej., uno o más ribonucleótidos) unidos mediante una mezcla de enlaces de cadena principal de enlaces fosfodiéster y no fosfodiéster.
[0139] Ligamiento y amplificación de adaptadores universales
[0140] Los métodos de ligamiento son conocidos en la técnica y utilizan métodos estándar. Dichos métodos utilizan enzimas ligasa, tales como la ADN ligasa, para efectuar o catalizar la unión de los extremos de las dos cadenas de polinucleótido de, en este caso, el adaptador universal y los ácidos nucleicos diana bicatenarios, de forma que se formen enlaces covalentes. El adaptador universal puede contener un resto 5'-fosfato para facilitar el ligamiento al 3'-OH presente en el fragmento diana. El ácido nucleico diana bicatenario contiene un resto 5'-fosfato, bien residual del proceso de corte, bien añadido utilizando un paso de tratamiento enzimático, y ha sido reparado en sus extremos, y opcionalmente extendido en una base o en bases protuberantes, para dar un 3'-OH adecuado para el ligamiento. En este contexto, unión significa enlace covalente de cadenas de polinucleótido que no estaban previamente unidas covalentemente. En un aspecto particular de la descripción, dicha unión tiene lugar mediante la formación de un enlace fosfodiéster entre las dos cadenas de polinucleótido, pero pueden usarse otros medios de enlace covalente (por ejemplo, enlaces de cadena principal de enlaces no fosfodiéster).
[0141] Como se analiza en la presente memoria, en una realización los adaptadores universales usados en el ligamiento están completos e incluyen una secuencia de unión de captura universal y otras secuencias universales, por ejemplo, un sitio de unión de cebador universal y una secuencia índice. La pluralidad resultante de ácidos nucleicos diana modificados puede utilizarse para preparar muestras inmovilizadas para secuenciación.
[0142] Además, como se analiza en la presente memoria, en una realización los adaptadores universales utilizados en el ligamiento incluyen un sitio de unión de cebador universal y una secuencia de índice, y no incluyen una secuencia de unión de captura universal. La pluralidad resultante de ácidos nucleicos diana modificados se puede modificar además para incluir secuencias específicas, tales como una secuencia de unión de captura universal. Los métodos para la adición de secuencias específicas, tales como una secuencia de unión de captura universal, a cebadores universales que se ligan a fragmentos diana bicatenarios incluyen métodos basados en amplificación tales como PCR, y son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Bignell y col. (documento US 8,053,192) y Gunderson y col. (documento WO2016/130704).
[0143] En las realizaciones donde se modifica un adaptador universal, se prepara una reacción de amplificación. Los expertos en la técnica conocen el contenido de una reacción de amplificación e incluyen sustratos apropiados (tales como los dNTP), enzimas (p. ej., una ADN polimerasa) y componentes de tampón necesarios para una reacción de amplificación. Generalmente, las reacciones de amplificación precisan al menos dos cebadores de amplificación, frecuentemente denominados cebadores “directos” e “inversos” (oligonucleótidos cebadores) que son capaces de hibridarse específicamente con una parte de la secuencia de polinucleótido a amplificarse, p. ej., un ácido nucleico diana modificado, bajo condiciones encontradas en el paso de hibridación de cebador de cada ciclo de una reacción de amplificación. Se apreciará que si los cebadores contienen cualquier secuencia de nucleótidos que no hibrida con los ácidos nucleicos diana modificados en el primer ciclo de amplificación, entonces esta secuencia puede copiarse a los productos de amplificación. Por ejemplo, el uso de cebadores que tienen secuencias de unión de captura universal, p. ej., secuencias que no se hibridan con los ácidos nucleicos diana modificados, las secuencias de unión de captura universal se incorporarán al amplicón resultante.
[0144] Los cebadores de amplificación son generalmente estructuras de polinucleótido monocatenarios. También pueden contener una mezcla de bases naturales y no naturales y también enlaces de la cadena principal naturales y no naturales, siempre que cualquier modificación no natural no impida la función como un cebador, definiéndose como la capacidad de hibridarse con una cadena de polinucleótido molde durante las condiciones de la reacción de amplificación y para actuar como un punto de iniciación para la síntesis de una nueva cadena de polinucleótido complementaria a la cadena molde. Los cebadores pueden incluir de forma adicional modificaciones químicas no nucleotídicas, por ejemplo fosforotioatos para aumentar la resistencia a exonucleasas, siempre que las modificaciones no impidan la función del cebador.
[0145] Amplificación para generar clústeres
[0146] Puede producir una matriz que incluye sitios de amplificación, cada uno de los cuales incluye una población clonal (también denominada como un clúster) de amplicones bicatenarios, utilizando métodos conocidos por el experto en la técnica. En una realización, se utilizan métodos de amplificación isotérmica, e incluyen producir la población clonal de amplicones bicatenarios a partir de un ácido nucleico diana individual que ha sembrado el sitio. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación continúa hasta que se genera una cantidad suficiente de amplicones para llenar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. De esta manera, llenar un sitio ya sembrado hasta su capacidad excluye sustancialmente la llegada de los ácidos nucleicos diana en el sitio, produciendo así una población clonal de amplicones en el sitio. Por lo tanto, es deseable en algunas realizaciones que la velocidad en la que se generan los amplicones para llenar la capacidad de los sitios de amplificación supere la velocidad en la que los ácidos nucleicos diana individuales se transportan a los sitios de amplificación individuales.
[0147] En algunas realizaciones, los métodos de amplificación incluyen, aunque no de forma limitativa a, la amplificación en fase sólida, amplificación por polonias, amplificación de colonias, PCR en emulsión, RCA en perlas, RCA en superficie o SDA en superficie. En algunas realizaciones, se utilizan métodos de amplificación que dan como resultado la amplificación de moléculas de ADN libres en solución o unidas a una matriz adecuada por solo un extremo de la molécula de ADN. En algunas realizaciones, los métodos que se basan en PCR en puente, donde ambos cebadores de PCR se unen a una superficie (véase, p. ej., la patente WO 2000/018957, patente US- 7.972.820; patente US-7.790.418 y Adessi y col., Nucleic Acids Research (2000): 28(20): E87) se utilizan. En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden crear una “tecnología de colonias de polimerasa”, o “polonia”, que se refiere a una amplificación multiplex que mantiene el clúster espacial de amplicones idénticos (véase el sitio web de Harvard Molecular Technology Group y Lipper Center for Computational Genetics). Estas incluyen, por ejemplo, las polonias in situ (Mitra and Church, Nucleic Acid Research 27, e34, 15 de diciembre de 1999), la amplificación por círculo rodante (RCA)in situ(Lizardi y col., Nature Genetics 19, 225, julio de 1998), PCR en puente (patente US-5.641.658), PCR en placa PicoTiter (Leamon y col., Electrophoresis 24, 3769, noviembre de 2003) y PCR en emulsión (Dressman y col., PNAS 100, 8817, 22 de julio de 2003). En algunas realizaciones, se utilizan métodos que se basan en la exclusión cinética, donde la amplificación facilitada por recombinasa y las condiciones isotérmicas amplifican la biblioteca (patente US-9.309.502, patente US-8.895.249, patente US-8.071.308).
[0149] En algunas realizaciones, la clonalidad aparente puede lograrse incluso si un sitio de amplificación no se llena hasta su capacidad antes de que un segundo ácido nucleico diana comience la amplificación en el sitio. En algunas condiciones, la amplificación de un primer ácido nucleico diana puede continuar hasta un punto en que se produce una cantidad suficiente de copias para superar o saturar eficazmente la producción de copias de un segundo ácido nucleico diana que se transporta al sitio. Por ejemplo, en una realización que utiliza un proceso de amplificación en puente en una característica circular con un diámetro menor de 500 nm, se ha determinado que después de 14 ciclos de amplificación exponencial para un primer ácido nucleico diana, la contaminación de un segundo ácido nucleico diana en el mismo sitio producirá una cantidad insuficiente de amplicones contaminantes para afectar negativamente al análisis de secuenciación por síntesis en una plataforma de secuenciación Illumina.
[0151] No es necesario que los sitios de amplificación en una matriz sean completamente clonales en todas las realizaciones. En cambio, para algunas aplicaciones, un sitio de amplificación individual puede estar predominantemente poblado con amplicones de un primer ácido nucleico diana y también puede tener un nivel bajo de amplicones contaminantes de un segundo ácido nucleico diana. Una matriz puede tener uno o más sitios de amplificación que tengan un nivel bajo de amplicones contaminantes siempre que el nivel de contaminación no tenga un impacto inaceptable en un uso posterior de la matriz. Por ejemplo, cuando la matriz va a utilizarse en una aplicación de detección, un nivel aceptable de contaminación sería un nivel que no altere la relación señal a ruido o la resolución de la técnica de detección de una forma inaceptable. En consecuencia, en general, la clonalidad aparente será relevante para un uso o aplicación particular de una matriz creada mediante los métodos expuestos en la presente memoria. Niveles de contaminación ilustrativos que pueden ser aceptables en un sitio de amplificación individual para aplicaciones particulares incluyen, aunque no de forma limitativa, como máximo 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % o 25 % de amplicones contaminantes. Una matriz puede incluir uno o más sitios de amplificación que tengan estos niveles ilustrativos de amplicones contaminantes. Por ejemplo, hasta un 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o incluso 100 % de los sitios de amplificación en una matriz pueden tener algunos amplicones contaminantes.
[0153] En algunas realizaciones, el método para hacer una matriz útil en un método descrito en la presente memoria puede realizarse en condiciones en donde los ácidos nucleicos diana se transportan (p. ej., mediante difusión) a los sitios de amplificación a medida que la amplificación ocurra. Por lo tanto, algunos métodos de amplificación pueden aprovechar tanto una velocidad de transporte relativamente lenta como una producción relativamente lenta de un primer amplicón con respecto a la formación posterior de amplicones. Por ejemplo, puede realizarse una reacción de amplificación expuesta en la presente memoria de tal modo que los ácidos nucleicos diana se transporten desde la solución a los sitios de amplificación simultáneamente con (i) la producción de un primer amplicón, y (ii) la producción de los amplicones posteriores en otros sitios de amplificación de la matriz. En realizaciones particulares, la velocidad promedio a la que se generan los amplicones posteriores en los sitios de amplificación puede superar la velocidad promedio a la que los ácidos nucleicos diana se transportan de la solución a los sitios de amplificación. En algunos casos, se puede generar un número suficiente de amplicones a partir de un único ácido nucleico diana en un sitio de amplificación individual para llenar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. La velocidad a la que se generan amplicones para llenar la capacidad de los respectivos sitios de amplificación puede, por ejemplo, superar la velocidad a la que los ácidos nucleicos diana individuales se transportan de la solución a los sitios de amplificación.
[0155] Una composición para amplificar los ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación, denominada en la presente memoria como un “reactivo de amplificación”, típicamente es capaz de producir copias rápidamente de ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación. Un reactivo de amplificación utilizado en un método de la presente descripción incluirá generalmente una polimerasa y nucleótidos trifosfato (los NTP). Puede utilizarse cualquiera de una variedad de polimerasas conocidas en la técnica, pero en algunas realizaciones, puede ser preferible utilizar una polimerasa que sea exonucleasa negativa. Los ejemplos de polimerasas de ácido nucleico adecuadas para el uso en las realizaciones de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa a, la ADN polimerasa (tal como el fragmento de Klenow, ADN polimerasa T4, polimerasaBst (Bacillus stearothermophilus), ADN polimerasas termoestables (tales como ADN polimerasa Taq, Vent, Deep Vent, Pfu, Tfl y n.° 9), así como sus derivados modificados genéticamente (TaqGold, VentExo, Pfu exo). En algunas realizaciones, un reactivo de amplificación también puede incluir recombinasa, proteína accesoria y proteína de unión al ADN monocatenario (SSB) para la amplificación facilitada por recombinasa.
[0156] Los NTP pueden ser desoxirribonucleótidos trifosfato (los dNTP) para realizaciones donde se realizan copias de ADN. Típicamente, las cuatro especies naturales, dATP, dTTP, dGTP y dCTP, estarán presentes en un reactivo de amplificación de ADN; sin embargo, se pueden utilizar análogos si se desea. Los NTP pueden ser ribonucleótidos trifosfato (rNTP) para realizaciones donde se realizan copias de ARN. Típicamente, las cuatro especies naturales, rATP, rUTP, rGTP y rCTP, estarán presentes en un reactivo de amplificación de ARN; sin embargo, se pueden utilizar análogos si se desea. Los NTP pueden modificarse con un grupo fluorescente o radiactivo. Se ha desarrollado una gran variedad de ácidos nucleicos modificados sintéticamente para métodos químicos y biológicos con el fin de aumentar la detectabilidad y/o la diversidad funcional de los ácidos nucleicos. Estas moléculas funcionalizadas/modificadas (p. ej., análogos de nucleótidos) pueden ser totalmente compatibles con las enzimas polimerizantes naturales, manteniendo las propiedades de emparejamiento de bases y replicación de las contrapartes naturales.
[0157] En consecuencia, se añaden otros componentes de la solución de amplificación a la elección de la polimerasa, y corresponden esencialmente a los compuestos conocidos en la técnica por ser eficaces para apoyar la actividad de cada polimerasa. La concentración de compuestos como el sulfóxido de dimetilo (DMSO), albúmina de suero bovino (BSA), polietilenglicol (PEG), betaína, Triton X-100, desnaturalizante (p. ej., formamida) o MgCl<2>es bien conocida en la técnica anterior por ser importante para tener una amplificación óptima y, por lo tanto, el operador puede ajustar fácilmente tales concentraciones para los métodos de la presente descripción basándose en los ejemplos presentados más adelante y los conocimientos generalmente disponibles.
[0158] La velocidad a la que se produce una reacción de amplificación se puede aumentar aumentando la concentración o cantidad de uno o más de los componentes activos de una reacción de amplificación. Por ejemplo, la cantidad o concentración de polimerasa, nucleótidos trifosfato o cebadores. En algunos casos, uno o más componentes activos de una reacción de amplificación que aumentan en cantidad o concentración (o se manipulan de otro modo en un método expuesto en la presente memoria) son componentes no de ácido nucleico de la reacción de amplificación. La velocidad de amplificación también se puede aumentar en un método expuesto en la presente memoria ajustando la temperatura. Por ejemplo, la velocidad de amplificación en uno o más sitios de amplificación se puede aumentar aumentando la temperatura en el sitio o sitios hasta una temperatura máxima donde la velocidad de reacción disminuye debido a la desnaturalización u otros acontecimientos adversos. Las temperaturas óptimas o deseadas pueden determinarse a partir de propiedades conocidas de los componentes de amplificación en uso o empíricamente para una mezcla de reacción de amplificación determinada. Tales ajustes, pueden realizarse basándose en prediccionesa prioride la temperatura de fusión (T<m>) del cebador o empíricamente. En ciertas realizaciones, la temperatura de una reacción de amplificación es de al menos 35 °C a no más de 70 °C. Por ejemplo, una reacción de amplificación puede ser de al menos 35 °C a no más de 42 °C, o de al menos 57 °C a no más de 63 °C.
[0159] La velocidad a la que se produce una reacción de amplificación se puede aumentar aumentando la actividad de uno o más reactivos de amplificación. Por ejemplo, se puede añadir un cofactor que aumente la velocidad de extensión de una polimerasa a una reacción donde se utiliza la polimerasa. En algunas realizaciones, pueden añadirse cofactores metálicos tales como magnesio, zinc o manganeso a una reacción de polimerasa o puede añadirse betaína.
[0160] Preparación de muestras inmovilizadas para secuenciación
[0161] El resultado de la amplificación en puente es una población de productos de amplificación clonales “en puente” en los sitios de amplificación. Ambas cadenas del ácido amplicón están inmovilizadas en la superficie de un sitio de amplificación en los extremos 5', donde esta unión se deriva de la unión original de los ácidos nucleicos de captura (por ejemplo, véase lafigura 1A, donde se representa un amplicón bicatenario11en una orientación “en puente”). Los amplicones dentro de los sitios de amplificación serán clonales y se derivarán de la amplificación de un único ácido nucleico diana, o con niveles aceptables de otro amplicón como se describe en la presente memoria.
[0162] Una gran cantidad de ácidos nucleicos de captura no utilizados permanecen en la superficie del sitio de amplificación después de la amplificación para formar un clúster clonal de productos de amplificación en puente, además de los extremos 3' libres de cada una de las cadenas de los amplicones bicatenarios en puente. La presencia de los ácidos nucleicos de captura no utilizados puede contribuir a un aumento del ruido y, por lo tanto, típicamente se eliminan poniendo en contacto la matriz con una nucleasa en condiciones adecuadas para que la nucleasa digiera los ácidos nucleicos de captura no utilizados. En una realización, la nucleasa es una exonucleasa, tal como una exonucleasa que tiene una actividad exonucleasa de 3' a 5’ sobre ADN monocatenario. Un ejemplo de tal exonucleasa es la exonucleasa I. El tratamiento con nucleasa va seguido del lavado de la matriz para eliminar la nucleasa y los nucleótidos y/o ácidos nucleicos resultantes de los sitios de amplificación.
[0163] Para facilitar la secuenciación, una de las cadenas de la estructura bicatenaria en puente puede eliminarse selectivamente de la superficie para permitir la hibridación eficiente de un cebador de secuenciación con la cadena inmovilizada restante. La eliminación selectiva de una cadena específica se denomina en la presente memoria “linealización”. En la presente memoria se describen ejemplos de métodos adecuados para la linealización, y se describen con más detalle en la solicitud WO 2007/010251 y la publicación de solicitud de patente US-2012/0309634.
[0164] En una realización, la linealización se logra escindiendo una cadena de los amplicones bicatenarios en puente, y a continuación sometiendo la estructura resultante a condiciones que eliminan la cadena que ya no está unida a la superficie del sitio de amplificación. La escisión puede lograrse mediante el uso de un ácido nucleico de captura que incluye un sitio de escisión. El sitio de escisión se encuentra típicamente en una ubicación que da como resultado que una parte sustancial de una cadena de la estructura en puente esté libre de la superficie del sitio de amplificación - ya no esté inmovilizada - y sea susceptible de pérdida después del paso de eliminación. Por ejemplo, como se muestra enla figura 1B,el sitio de escisión X en el amplicón11se escinde dejando un ácido nucleico13"de captura acortado. Una cadena16de la estructura en puente permanece inmovilizada en su extremo 5' con respecto al sitio10de amplificación y la otra cadena15'ya no está inmovilizada debido a la escisión en X. En una realización, el extremo 3' de la cadena16permanece hibridado con bases complementarias del ácido nucleico13"de captura acortado manteniendo de este modo la estructura en puente después de la linealización. El número de bases complementarias entre el extremo 3' de la cadena16y el ácido nucleico13"de captura acortado que mantienen la estructura de puente varía dependiendo de las condiciones predominantes, y puede determinarse por el experto en la técnica.
[0166] En una realización, un sitio de escisión se trata para eliminar un nucleótido y fabrica un sitio abásico. Un “sitio abásico” es una posición de nucleótido en un ácido nucleico de la cual se ha eliminado el componente base. Los sitios abásicos pueden formarse químicamente en condiciones artificiales o por la acción de enzimas. Una vez formados, los sitios abásicos pueden escindirse (p. ej., mediante tratamiento con una endonucleasa u otra enzima de escisión monocatenaria, exposición al calor o álcali), al proporcionar un medio para la escisión específica de sitio de un ácido nucleico.
[0168] En una realización, puede crearse un sitio abásico en una posición predeterminada en una cadena de un amplicón inmovilizado. Esto puede lograrse, por ejemplo, incorporando un nucleótido específico en la posición predeterminada.
[0169] En una realización, se incorpora una desoxiuridina (U) en uno de los ácidos nucleicos de captura unidos a la superficie de un sitio de amplificación. La enzima uracil-ADN-glicosilasa (UDG) puede utilizarse, a continuación para eliminar la base uracilo, generando un sitio abásico en una cadena. La cadena de polinucleótido que incluye el sitio abásico puede escindirse, a continuación en el sitio abásico mediante tratamiento con endonucleasa (p. ej., DN-glicosilasaliasa endonucleasa VIII), calor o álcali. En una realización particular, se utiliza el reactivo USUARIO disponible en New England Biolabs (NEB n. M5505S) para la creación de un espacio de un solo nucleótido en una base de uracilo en un inmovilizado. En una realización, los sitios de amplificación se exponen a una mezcla que contiene la glicosilasa apropiada y una o más endonucleasas adecuadas, típicamente en una relación de actividad de al menos aproximadamente 2:1. El tratamiento con enzimas endonucleasas da lugar a un resto 3'-fosfato en el sitio de escisión, que puede eliminarse con una fosfatasa adecuada, tal como la fosfatasa alcalina. Por ejemplo, como se muestra enla figura 1B,si el sitio de escisión X se produce utilizando el reactivo USUARIO, el ácido nucleico13"de captura acortado terminará con un grupo 3'-fosfato.
[0171] En una realización, se incorpora una 8-oxo-guanina en uno de los ácidos nucleicos de captura unidos a la superficie de un sitio de amplificación. La enzima FPG glicosilasa puede utilizarse para eliminar la base 8-oxo-guanina, generando un sitio abásico en una cadena. En otra realización, se incorpora una desoxiinosina en uno de los ácidos nucleicos de captura unidos a la superficie de un sitio de amplificación, y la enzima glicosilasa Alka puede utilizarse a continuación, para eliminar la base de desoxiinosina, generando un sitio abásico en una cadena.
[0173] Las ventajas de este método incluyen la opción de liberar un grupo fosfato 3' libre en la cadena escindida, que después del tratamiento con fosfatasa puede proporcionar un punto de iniciación para secuenciar una región de la cadena complementaria (por ejemplo, secuenciar una región de la cadena16de lafigura 1B).Dado que la reacción de escisión requiere un residuo, por ejemplo, desoxiuridina, que no se produce de forma natural en el ADN, pero que por lo demás es independiente del contexto de secuencia, si solo se incluye una base no natural, no existe posibilidad de que la escisión mediada por glicosilasa se produzca en otros lugares en posiciones no deseadas del dúplex. Otra ventaja obtenida por la escisión de los sitios abásicos en una sección bicatenaria de un amplicón inmovilizado generado por la acción de la UDG sobre el uracilo es que la primera base incorporada en una reacción de secuenciación por síntesis que se inicia en el grupo hidroxilo 3' libre formado por la escisión siempre será T. Como resultado, para todos los clústeres clonales en diferentes sitios de amplificación de una matriz que se escinden de esta manera para producir moldes de secuenciación, la primera base incorporada universalmente en toda la matriz será T. Esto puede proporcionar un ensayo independiente de la secuencia para la intensidad de clústeres individuales al inicio de una ejecución de secuenciación.
[0175] Los expertos en la técnica saben que los pasos de adición de exonucleasa y de linealización son necesariamente pasos separados. El tratamiento con enzimas endonucleasas da lugar a un resto 3'-fosfato en el sitio de escisión, y se sabe que la presencia de fosfato 3' inhibe la actividad de la exonucleasa I (Lehman y Nussbaum, 1964, J. Biol. Chem., 239: 2628-2636). Los inventores realizaron el descubrimiento inesperado y sorprendente de que tanto los pasos de exonucleasa como de linealización pueden ocurrir al mismo tiempo mediante la combinación de las enzimas. La reducción de estos dos pasos en uno da como resultado ejecuciones de secuenciación más rápidas, ya que ahora se realizan dos pasos simultáneamente. Además, la combinación de ambos pasos no tiene un efecto perjudicial sobre las métricas primarias, la calidad de lectura, la indexación dual ni las métricas de construcción del genoma.
[0176] La generación y escisión de un sitio abásico dan como resultado un extremo 5' libre en la cadena que ya no está inmovilizado en la superficie (por ejemplo, como se muestra en lafigura 1B,una cadena16de la estructura en puente permanece inmovilizada en su extremo 5' con respecto al sitio10de amplificación y la otra cadena15'ya no está inmovilizada debido a la escisión en X). Esta cadena puede eliminarse completamente de la superficie exponiendo el sitio de amplificación a condiciones adecuadas. En una realización, la eliminación es por desnaturalización. La desnaturalización puede realizarse térmica o isotérmicamente, por ejemplo, utilizando la desnaturalización química. El desnaturalizante químico puede ser urea, hidróxido o formamida u otro reactivo similar. En otra realización, la eliminación puede lograrse mediante el tratamiento con una exonucleasa con actividad 5'-3', tal como la exonucleasa lambda o T7. La eliminación de la cadena no unida da como resultado una cadena monocatenaria restante que puede actuar como un molde para una polimerasa.
[0177] Opcionalmente, se reparan los extremos 3' de los ácidos nucleicos en los sitios de amplificación. La exonucleasa puede eliminar algunos de los nucleótidos en los extremos 3' de los ácidos nucleicos después de la linealización. Sin pretender ser limitativo, es posible que los extremos 3' “respiren” ligeramente, lo que resulta en un pequeño número de nucleótidos se vuelvan monocatenarios y queden disponibles para la exonucleasa para digestión. La reparación puede lograrse exponiendo los nucleótidos a una ADN polimerasa, tal como la ADN polimerasa utilizada para la amplificación en puente.
[0178] La eliminación de la cadena no unida es opcional. En una realización, el grupo 3'-fosfato que queda después de la generación del sitio abásico se elimina para dejar un grupo 3'-hidroxilo en el extremo del ácido nucleico de captura escindido(figura 1B,ácido nucleico13"de captura acortado. Este ácido nucleico de captura puede utilizarse como un cebador para una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena. A medida que la polimerasa utiliza la cadena inmovilizada(figura 1B,cadena16)como un molde para sintetizar la cadena complementaria, desplaza la cadena no unida(figura 1B, cadena15').
[0179] Composiciones
[0180] Durante o después de un método de agrupamiento por amplificación descrito en la presente memoria, pueden producirse diferentes composiciones. En una realización, una composición incluye una glicosilasa, una endonucleasa y una exonucleasa. En una realización, la exonucleasa tiene una actividad exonucleasa de 3' a 5’ sobre ADN monocatenario, tal como exonucleasa I. En una realización, un tipo de glicosilasa que puede estar presente en la composición es uracil-ADN-glicosilasa, y la endonucleasa es DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII. En una realización, un tipo de glicosilasa que puede estar presente en la composición es la glicosilasa FPG, y la endonucleasa es DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII. En una realización, un tipo de glicosilasa que puede estar presente en la composición es la glicosilasa AlkA, y la endonucleasa DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII. La composición puede incluir un sustrato de ADN bicatenario que incluye un sitio de escisión de uracilo, un sitio de escisión de 8-oxo-guanina o un sitio de escisión de desoxiinosina. La composición puede incluir un sustrato de ADN bicatenario que incluye un sitio abásico. En algunas realizaciones, la composición del sustrato de ADN bicatenario puede incluir una región monocatenaria, donde el sitio de escisión de uracilo y el sitio abásico están presentes en la región bicatenaria. También se proporciona una matriz que incluye una pluralidad de sitios de amplificación, donde cada sitio de amplificación incluye una pluralidad de los sustratos de ADN bicatenario unidos a los sitios de amplificación.
[0181] Uso en secuenciación/métodos de secuenciación
[0182] Una matriz de la presente descripción, que se ha producido mediante un método expuesto en la presente memoria y que incluye amplicones amplificados y linealizados en sitios de amplificación, puede utilizarse para cualquiera de una diversidad de aplicaciones. Una aplicación particularmente útil es la secuenciación de ácidos nucleicos. Un ejemplo es la secuenciación por síntesis (SBS). En la SBS, para determinar la secuencia de nucleótidos en el molde, se monitoriza la extensión de un cebador de ácido nucleico a lo largo de un molde de ácido nucleico (p. ej., un ácido nucleico diana o amplicón del mismo). El procesamiento químico subyacente puede ser polimerización (p. ej., catalizada por una enzima polimerasa). En una realización particular de SBS basada en polimerasa, se añaden nucleótidos etiquetados con fluorescencia a un cebador (extendiéndose de ese modo el cebador) de una manera dependiente del molde, de modo que, para determinar la secuencia del molde, pueda utilizarse la detección del orden y tipo de nucleótidos añadidos al cebador. Una pluralidad de moldes diferentes en sitios diferentes de una matriz expuesta en la presente memoria puede someterse a una técnica de SBS en condiciones en que los acontecimientos que se producen para distintos moldes pueden distinguirse debido a su ubicación en la matriz.
[0183] Las celdas de flujo proporcionan un formato conveniente para alojar una matriz que se produce por los métodos de la presente memoria y que se somete a una SBS u otra técnica de detección que implica el suministro repetido de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una celda de flujo que aloja una matriz de moldes de ácidos nucleicos. Pueden detectarse aquellos sitios de una serie en los que la extensión del cebador provoca que se incorpore un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, a un cebador se le puede añadir un análogo de nucleótido que tenga un resto terminador reversible, de tal modo que no se pueda producir la extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar el resto. Por lo tanto, para realizaciones que utilizan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre los diversos pasos de suministro. El ciclo puede repetirse a continuación n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando de esta manera una secuencia de longitud n. Los procedimientos de SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección ilustrativos que pueden adaptarse fácilmente para su uso con una matriz producida por los métodos de la presente memoria se describen, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), documento WO 04/018497; patente US-7.057.026; patente WO 91/06678; patente WO 07/123.744; patente US-7.329.492; patente US-7.211.414; patente US-7.315.019; patente US-7.405.281, y patente US-8.343.746.
[0185] Pueden utilizarse otros procedimientos de secuenciación que utilizan reacciones cíclicas, como la pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en una cadena de ácido nucleico incipiente (Ronaghi, y col., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi y col. Science 281(5375), 363 (1998); patente US-6.210.891; patente US-6.258.568 y patente US-6.274.320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado se puede detectar convirtiéndolo inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se puede detectar mediante fotones producidos por luciferasa. Por lo tanto, la reacción de secuenciación se puede controlar a través de un sistema de detección de luminiscencia. Las fuentes de radiación de excitación utilizadas para los sistemas de detección a base de fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Los sistemas fluídicos, detectores y procedimientos útiles que pueden utilizarse para la aplicación de la pirosecuenciación a matrices de la presente descripción se describen, por ejemplo, en la patente publicada WIPO de solicitud 2012/058096, documento US 2005/0191698 A1, patente US-7.595.883, y la patente US-7.244.559.
[0187] Las reacciones de secuenciación por ligación también son útiles, incluidas, por ejemplo, las descritas en Shendure y col. Science 309:1728-1732 (2005); patente US-5.599.675; y patente US- 5.750.341. Algunas realizaciones pueden incluir procedimientos de secuenciación por hibridación como se describe, por ejemplo, en Bains y col., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac y col., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor y col., Science 251(4995), 767-773 (1995); y la patente WO 1989/10977. Tanto en los procedimientos de secuenciación por ligamiento como en los de secuenciación por hibridación, los ácidos nucleicos molde (por ejemplo, un ácido nucleico diana o amplicones del mismo) que están presentes en los sitios de una matriz se someten a ciclos repetidos de administración y detección de oligonucleótidos. Los sistemas fluídicos para los métodos de SBS expuestos en la presente memoria o en las referencias citadas en la presente memoria se pueden adaptar fácilmente para el suministro de reactivos para procedimientos de secuenciación por ligadura o secuenciación por hibridación. Típicamente, los oligonucleótidos están marcados con fluorescencia y pueden detectarse usando detectores de fluorescencia similares a los descritos con respecto a los procedimientos de SBS en la presente memoria o en las referencias citadas en la presente memoria.
[0188] Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican la monitorización en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Por ejemplo, las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa portadora de fluoróforo y nucleótidos marcados con γ-fosfato o con guías de ondas de modo cero (ZMW). Se describen técnicas y reactivos de secuenciación basada en FRET, por ejemplo, en Levene y col. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist y col. Opt. Lett.33, 1026-1028 (2008); Korlach y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.105, 1176-1181 (2008).
[0190] Algunas realizaciones de SBS (secuenciación por síntesis) incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que son comercializadas por Ion Torrent (Guilford, Conn., una subsidiaria de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos US 2009/0026082 A1; US-2009/0127589 A1; US-2010/0137143 A1; o US-2010/0282617 A1. Los métodos expuestos en la presente memoria para amplificar ácidos nucleicos diana pueden aplicarse fácilmente a sustratos utilizados para detectar protones. Más específicamente, los métodos expuestos en la presente memoria pueden utilizarse para producir poblaciones clonales de amplicones en los sitios de las matrices que se utilizan para detectar protones.
[0192] Una aplicación útil para una matriz de la presente memoria, que por ejemplo se ha producido mediante un método expuesto en la presente memoria, es el análisis de la expresión génica. La expresión génica se puede detectar o cuantificar usando técnicas de secuenciación de ARN, tales como las denominadas secuenciación de ARN digital. Las técnicas de secuenciación de ARN se pueden realizar usando metodologías de secuenciación conocidas en la técnica, tales como las expuestas anteriormente. La expresión génica también se puede detectar o cuantificar usando técnicas de hibridación llevadas a cabo mediante hibridación directa con una matriz o usando un ensayo múltiplex, cuyos productos se detectan en una matriz. Una matriz de la presente memoria, por ejemplo, que se haya producido mediante un método expuesto en la presente memoria, también se puede usar para determinar genotipos para una muestra de ADN genómico de uno o más individuos. Los métodos ilustrativos para el análisis de expresión y genotipado basados en matriz que pueden llevarse a cabo en una matriz de la presente memoria se describen en las patentes US-7.582.420; US-6.890.741; US-6.913.884 o US-6.355.431 o solicitud de patente US-2005/0.053.980 A1; 2009/0186349 A1 o US 2005/0181440 A1.
[0194] Otra aplicación útil para una matriz que se ha producido mediante un método expuesto en la presente memoria es la secuenciación de células individuales. Cuando se combina con métodos de indexación, la secuenciación de células individuales se puede utilizar en ensayos de accesibilidad a la cromatina para producir perfiles de elementos reguladores activos en miles de células individuales, y se pueden producir bibliotecas de genomas completos de células individuales. Los ejemplos de secuenciación de células individuales que pueden realizarse en una matriz de la presente descripción se describen en la solicitud de patente publicada US-2018/0023119 A1, y en las solicitudes provisionales estadounidenses con números de serie US-62/673.023 y US-62/680.259.
[0196] Una ventaja de los métodos expuestos en la presente memoria es que permiten la creación rápida y eficiente de matrices a partir de cualquiera de una diversidad de bibliotecas de ácidos nucleicos. En consecuencia, la presente descripción proporciona sistemas integrados capaces de fabricar una matriz utilizando uno o más de los métodos expuestos en la presente memoria y además capaces de detectar ácidos nucleicos en las matrices utilizando técnicas conocidas en la técnica tales como aquellas ilustradas en la presente memoria. Por lo tanto, un sistema integrado de la presente memoria puede incluir componentes fluídicos capaces de suministrar reactivos de amplificación a una matriz de sitios de amplificación, tales como bombas, válvulas, depósitos, líneas fluídicas y similares. Un componente fluídico particularmente útil es una celda de flujo. Puede configurarse y/o utilizarse una celda de flujo en un sistema integrado para crear una matriz de la presente descripción y para detectar la matriz. Se describen celdas de flujo ilustrativas, por ejemplo, en el documento US 2010/0111768 A1 y en la patente US-8.951.781. Como se ilustra en las celdas de flujo, puede utilizarse uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación y para un método de detección. Tomando como ejemplo una realización de secuenciación de ácidos nucleicos, puede utilizarse uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación expuesto en la presente memoria y para el suministro de reactivos de secuenciación en un método de secuenciación tales como los descritos en la presente memoria. Alternativamente, un sistema integrado puede incluir sistemas fluídicos distintos para llevar a cabo métodos de amplificación y para llevar a cabo métodos de detección. Los ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear matrices de ácidos nucleicos y también determinar la secuencia de ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, las plataformas de secuenciación MiSeq™, HiSeq™, NextSeq™<a>, MiniSeq™, NovaSeq™ e iSeq™ de Illumina, Inc., (San Diego, CA) y dispositivos descritos en la patente US-8.951.781. Tales dispositivos pueden modificarse para fabricar matrices según las enseñanzas expuestas en la presente memoria.
[0198] Un sistema capaz de llevar a cabo un método expuesto en la presente memoria no necesita estar integrado con un dispositivo de detección. Más bien, también es posible un sistema autónomo o integrado con otros dispositivos. En tales realizaciones se pueden usar componentes fluídicos similares a los ilustrados anteriormente en el contexto de un sistema integrado.
[0200] Un sistema capaz de llevar a cabo un método expuesto en la presente memoria, ya sea integrado con capacidades de detección o no, puede incluir un controlador de sistema que sea capaz de realizar un conjunto de instrucciones para realizar uno o más pasos de un método, técnica o proceso expuesto en la presente memoria. Por ejemplo, las instrucciones pueden dirigir la realización de pasos para crear una matriz en condiciones de amplificación en puente. Opcionalmente, las instrucciones pueden dirigir adicionalmente la realización de los pasos para detectar ácidos nucleicos usando métodos expuestos anteriormente en la presente memoria. Un controlador del sistema útil puede incluir cualquier sistema basado en procesador o microprocesador, incluidos sistemas que utilicen microcontroladores, ordenadores de conjunto de instrucciones reducidas (RISC), circuitos integrados de aplicación específica (ASIC), matrices de puertas programables en campo (FPGA), circuitos lógicos y cualquier otro circuito o procesador capaz de realizar las funciones descritas en la presente memoria. Un conjunto de instrucciones para un controlador de sistema puede tener la forma de un programa de informático. Como se utilizan en la presente memoria, los términos “software” y “firmware” son intercambiables, e incluyen cualquier programa informático almacenado en la memoria para su ejecución por un ordenador, incluyendo memoria RAM, memoria ROM, memoria EPROM, memoria EEPROM y memoria RAM no volátil (NVRAM). El software puede adoptar diversas formas, tal como un software de sistema o un software de aplicación. Además, el software puede adoptar la forma de una colección de programas independientes, o un módulo de programa dentro de un programa más amplio o una porción de un módulo de programa. El software también puede incluir programación modular en forma de programación orientada a objetos.
[0202] Se entenderá que una matriz de la presente memoria, por ejemplo, que se haya producido mediante un método expuesto en el presente documento, no necesita utilizarse para un método de detección. Más bien, la matriz se puede utilizar para almacenar una biblioteca de ácidos nucleicos. En consecuencia, la matriz se puede almacenar en un estado que conserve los ácidos nucleicos que contiene. Por ejemplo, una matriz se puede almacenar en estado desecado, congelado (p. ej., en nitrógeno líquido) o en una solución que proteja los ácidos nucleicos. Alternativamente, o de forma adicional, la matriz se puede utilizar para replicar una biblioteca de ácidos nucleicos. Por ejemplo, se puede usar una matriz para crear amplicones replicados de uno o más de los sitios en la matriz.
[0203] Haciendo referencia ahora ala figura 1A,se muestra un esquema de un sitio10de amplificación con un elemento de una pluralidad de amplicones bicatenarios11.El amplicón bicatenario11representado incluye una primera cadena15y una segunda cadena16. También se muestran dos poblaciones de ácidos nucleicos de captura. Se muestra una primera población ya sea unida13en un extremo de la primera cadena15o unida13'a la superficie del sitio10de amplificación. También se muestra una segunda población de ácidos nucleicos de captura ya sea unidos14en un extremo de la segunda cadena16,o unidos14'a la superficie del sitio10de amplificación. También se muestra en lafigura 1Ael sitio de escisión (marcado con una X en el ácido nucleico13de captura). En una realización, un ácido nucleico13de captura puede incluir un ácido nucleico de captura P5 y el otro ácido nucleico14de captura puede incluir un ácido nucleico de captura P7.
[0204] La figura 1Bmuestra la escisión del sitio de escisión X en el ácido nucleico13de captura unido a la primera cadena. La escisión del ácido nucleico13de captura da como resultado (i) una cadena15'acortada y (ii) un ácido nucleico13"de captura acortado. La cadena acortada15'ya no está unida al sitio10de amplificación. El ácido nucleico13"de captura acortado puede terminar con un fosfato 3'. En la realización representada, los nucleótidos presentes en el extremo 3' de la cadena16permanecen hibridados con los nucleótidos presentes en el extremo 3' del ácido nucleico13"de captura adecuado. Los ácidos nucleicos13'y14’de captura no unidos ya no están presentes en el sitio10de amplificación debido a la acción de una exonucleasa, tal como la exonucleasa I.
[0205] La figura 1Cmuestra el resultado de exponer el amplicón de lafigura 1Ba condiciones desnaturalizantes. La cadena acortada15'que no está unida al sitio10de amplificación se elimina de la cadena16,y los nucleótidos del extremo 3' de la cadena16no se hibridan con los nucleótidos presentes en el extremo 3' del ácido nucleico13"de captura acortado.
[0206] La figura 1Dmuestra el resultado de la rehibridación. La cadena unida16se rehibrida con el ácido nucleico13"de captura acortado.
[0207] Ejemplos
[0208] La presente invención se define mediante los siguientes ejemplos. Debe entenderse que los ejemplos, materiales, cantidades y procedimientos particulares deben interpretarse ampliamente según el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.
[0209] Ejemplo 1
[0210] Métodos y condiciones generales de ensayo
[0211] Salvo que se indique lo contrario, se describen las condiciones generales de ensayo utilizadas en los Ejemplos descritos en la presente memoria.
[0212] Los experimentos se ejecutaron utilizando celdas de flujo HiSeqX v2.5 (ILMN) en un cBot (ILMN). Para la figura 2, la celda de flujo se utilizó sin amplificación de clústeres, utilizando los cebadores de superficie P5 y P7 como un sustrato para probar la actividad enzimática. Durante el experimento, se bombearon diversas mezclas de enzimas a la celda de flujo y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Tanto la exonucleasa I como las enzimas USER fueron suministradas por New England Biolabs. Después de la incubación, los carriles de las celdas de flujo se lavaron con tampón de lavado HT2 (Illumina) y, a continuación, se determinó la presencia o ausencia de cebadores de superficie mediante la hibridación de oligos P5' y P7' marcados con fluoróforo TET, en el tampón de hibridación HT1 (Illumina). La señal fluorescente se detectó escaneando en un generador de imágenes plano Typhoon (GE Healthcare Life Sciences).
[0213] Para la figura 3, la siembra y amplificación de clústeres se logró mezclando moldes de ADN desnaturalizados (biblioteca humana TruSeq Nano) hasta una concentración final de 300 pM en la mezcla ExAmP, y esta se bombeó a la celda de flujo y se incubó durante 1 hora a 37 °C. A continuación, se procesaron diferentes carriles de la celda de flujo con diferentes combinaciones de enzimas y tratamientos, como se detalla en el gráfico. La “reparación” se refiere a los 3 ciclos de amplificación en puente que normalmente se realizan para rellenar los extremos de las cadenas que pueden recortarse durante el paso de exonucleasa. “USERExo” se refiere a la mezcla combinada de USUARIO y ExoI. Después de estos pasos, los clústeres se hibridaron con un cebador de secuenciación y se secuenciaron en un HiSeqx utilizando métodos y reactivos estándar (ILMN).
[0214] Ejemplo 2
[0215] Las reacciones de exonucleasa y linealización pueden combinarse
[0216] Los métodos estándar para generar clústeres que pueden utilizarse para la secuenciación genómica incluyen la hibridación de los ácidos nucleicos diana con un clúster, amplificación de los ácidos nucleicos diana y, a continuación, el tratamiento de un clúster con exonucleasa I para eliminar el exceso de cebadores de superficie libres. En un paso separado, las cadenas inmovilizadas se linealizan, a continuación, generando un espacio de un solo nucleótido en una región específica del ADN bicatenario (ADNbc) para producir moldes para la secuenciación. Probamos si los pasos de exonucleasa y linealización podían combinarse. Los carriles de una celda de flujo con sitios de amplificación que tenían cebadores de superficie unidos se trataron con exonucleasa 1, las enzimas que generan un espacio de un solo nucleótido en una región específica del ADNbc (una combinación de uracil-ADN-glicosilasa y endonucleasa VIII ADN glicosilasa - liasa), o la combinación de ambos.
[0217] Lafigura 2muestra que ningún tratamiento (carriles 1 y 8) o el tratamiento con uracil-ADN-glicosilasa y DN-glicosilasaliasa endonucleasa VIII (carril 2) no dio como resultado la pérdida de cebadores de superficie, mientras que el tratamiento con exonucleasa I (carril 5) dio como resultado la pérdida de prácticamente todos los cebadores de superficie. El tratamiento con uracil-ADN-glicosilasa y DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII seguido de exonucleasa I (carril 3) y el tratamiento con una mezcla de exonucleasa combinada con uracil-ADN-glicosilasa y DN-glicosilasaliasa endonucleasa VIII (carril 4) dieron como resultado la pérdida de prácticamente todos los cebadores de superficie. Esto fue inesperado y sorprendente, porque el tratamiento del ADNbc con una combinación de uracil-ADN-glicosilasa y DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII da como resultado fosfatos 3', y se sabe que la presencia de fosfato 3' inhibe la actividad de la exonucleasa I (Lehman y Nussbaum, 1964, J. Biol. Chem., 239: 2628-2636).
[0218] Ejemplo 3
[0219] El tratamiento simultáneo con exonucleasa y la linealización dan como resultado plantillas que son útiles para la secuenciación
[0220] Para determinar si el uso simultáneo de glicosilasas de ADN y exonucleasa tenía algún efecto perjudicial en las métricas de secuenciación, se realizaron ejecuciones de secuenciación en celdas de flujo que contenían clústeres generados utilizando diferentes combinaciones de glicosilasas de ADN y exonucleasa. La puntuación de calidad de cada ejecución se determinó por cuadruplicado y se muestra en lafigura 3. Como era de esperar, el carril estándar (sin exonucleasa y sin reparación) que incluía la reacción de secuencia con un tapiz de cebadores P5 tenía valores de Q30 a mediados de los 50 (véase la flecha,figura 3). Todos los demás carriles eran aproximadamente equivalentes, y aquellas reacciones en las que se utilizaron las glicosilasas de ADN y la exonucleasa en un solo paso dieron como resultado las mejores lecturas de R2 con un Q30 de aproximadamente el 93 %.
[0221] Se proporcionan como referencia todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones y el material disponible electrónicamente (incluidas, por ejemplo, las presentaciones de secuencias de nucleótidos en, p. ej., GenBank y RefSeq, y las presentaciones de secuencias de aminoácidos en, p. ej., SwissProt, PIR, PRF, PDB y las traducciones de regiones codificantes anotadas en GenBank y RefSeq) y los materiales complementarios a los que se hace referencia en las publicaciones (tales como tablas complementarias, figuras complementarias, materiales y métodos complementarios y/o datos experimentales complementarios). En el caso de que exista alguna incoherencia entre la descripción de la presente solicitud y la(s) descripción(es) de cualquier documento mencionado en la presente memoria, regirá la descripción de la presente solicitud. La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han facilitado únicamente para facilitar la comprensión. De ello no se desprende ninguna limitación innecesaria. La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, ya que las variaciones evidentes para un experto en la técnica se incluirán dentro de la invención definida por las reivindicaciones.
[0222] Salvo que se indique lo contrario, se debe entender que todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, etc. utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones están modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. En consecuencia, salvo que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe considerarse al menos a la luz del número de dígitos significativos informados y aplicando técnicas de redondeo comunes.
[0223] A pesar de que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se informan con la mayor precisión posible. Sin embargo, todos los valores numéricos contienen inherentemente un intervalo que es el resultado necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
[0224] Todos los encabezados son por comodidad de uso del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, salvo que así se especifique.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende:
uracil-ADN-glicosilasa,
una endonucleasa, y
una exonucleasa que comprende una actividad de exonucleasa de ADN monocatenario de 3' a 5'.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la exonucleasa es exonucleasa I.
3. La composición de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la endonucleasa es DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además:
i) un sustrato de ADN bicatenario que comprende un sitio de escisión de uracilo; y/o
ii) un sustrato de ADN bicatenario que comprende un sitio abásico;
opcionalmente, en donde el sustrato de ADN bicatenario comprende una región monocatenaria, y en donde el sitio de escisión de uracilo y el sitio abásico están presentes en la región bicatenaria.
5. La composición de la reivindicación 4, que comprende además una matriz que comprende una pluralidad de sitios de amplificación, en donde cada sitio de amplificación comprende una pluralidad de sustratos de ADN bicatenario unidos a los sitios de amplificación.
6. Un método para preparar ácidos nucleicos para una reacción de secuenciación, comprendiendo el método: (a) proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de sitios de amplificación, en donde los sitios de amplificación comprenden
(i) una pluralidad de ácidos nucleicos de captura unidos a los sitios de amplificación,
en donde una primera población de la pluralidad de ácidos nucleicos de captura comprende un sitio de escisión, y
(ii) una pluralidad de ácidos nucleicos diana modificados bicatenarios clonales,
en donde ambas cadenas de cada ácido nucleico diana bicatenario están unidas en sus extremos 5' a un ácido nucleico de captura,
en donde una cadena está unida a un ácido nucleico de captura que comprende el sitio de escisión, y en donde el sitio de escisión está colocado en una región bicatenaria de cada molécula bicatenaria;
(b) poner en contacto la matriz con una composición que comprende al menos una enzima para producir un sitio abásico en el sitio de escisión y una exonucleasa que comprende una actividad exonucleasa de 3' a 5’ sobre ADN monocatenario,
en donde la escisión ocurre en el sitio de escisión,
en donde la escisión convierte una cadena de ácidos nucleicos diana bicatenarios en una primera cadena unida al sitio de amplificación y una segunda cadena que no está unida al sitio de amplificación; y en donde los ácidos nucleicos de captura monocatenarios que comprenden un extremo 3' libre se reducen en longitud por la exonucleasa.
7. El método de la reivindicación 6, en donde:
i) la al menos una enzima para producir un sitio abásico en el sitio de escisión comprende uracil-ADN-glicosilasa y una endonucleasa; y/o
ii) la endonucleasa es DN-glicosilasa-liasa endonucleasa VIII.
8. El método de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que comprende además la eliminación de la al menos una enzima para producir un sitio abásico en el sitio de escisión y la exonucleasa de la matriz.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, que comprende además someter los ácidos nucleicos diana bicatenarios escindidos a condiciones que eliminen la segunda cadena que no está unida al sitio de amplificación;
opcionalmente, en donde las condiciones que eliminan la segunda cadena comprenden un desnaturalizante, en donde el desnaturalizante da como resultado ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados que comprenden un ácido nucleico diana unido covalentemente a una segunda población de ácidos nucleicos de captura, en donde la segunda población de ácidos nucleicos de captura se une a los sitios de amplificación, opcionalmente en donde el desnaturalizante comprende formamida.
10. El método de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que comprende además rehibridar el ácido nucleico monocatenario inmovilizado con un elemento de la primera población de ácidos nucleicos de captura para generar un ácido nucleico parcialmente monocatenario inmovilizado.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde:
i) el sitio de escisión está colocado en la región de ácido nucleico de captura de la región bicatenaria de cada ácido nucleico diana bicatenario; y/o
ii) el sitio de escisión comprende un uracilo, en donde un sitio abásico es generado por uracil-ADN-glicosilasa, y en donde el sitio abásico es escindido por la endonucleasa.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en donde la exonucleasa es exonucleasa I.
13. El método de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que comprende además hibridar un cebador de secuenciación con los ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados de la reivindicación 9 o una región monocatenaria de los ácidos nucleicos parcialmente monocatenarios inmovilizados de la reivindicación 10, preparando de este modo los ácidos nucleicos monocatenarios para una reacción de secuenciación; opcionalmente, en donde el método comprende además realizar una reacción de secuenciación para determinar la secuencia de al menos una región de los ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados o los ácidos nucleicos parcialmente monocatenarios inmovilizados.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la reacción de secuenciación comprende secuenciación por síntesis.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en donde la matriz se produce amplificando una pluralidad de ácidos nucleicos diana utilizando los ácidos nucleicos de captura como cebadores de amplificación; opcionalmente en donde la amplificación comprende la amplificación por exclusión.
ES19813785T 2018-12-05 2019-11-29 Métodos y composiciones para la generación de clústeres mediante amplificación en puente Active ES3074791T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862775679P 2018-12-05 2018-12-05
PCT/EP2019/083173 WO2020114918A1 (en) 2018-12-05 2019-11-29 Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3074791T3 true ES3074791T3 (es) 2026-07-23

Family

ID=68771646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19813785T Active ES3074791T3 (es) 2018-12-05 2019-11-29 Métodos y composiciones para la generación de clústeres mediante amplificación en puente

Country Status (10)

Country Link
US (2) US11667953B2 (es)
EP (1) EP3891305B1 (es)
JP (1) JP7569690B2 (es)
KR (1) KR102872251B1 (es)
CN (1) CN112654718B (es)
AU (1) AU2019391274B2 (es)
CA (1) CA3103736A1 (es)
ES (1) ES3074791T3 (es)
SG (1) SG11202012762WA (es)
WO (1) WO2020114918A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019391274B2 (en) 2018-12-05 2025-10-30 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification
CN112739830A (zh) 2018-12-18 2021-04-30 伊卢米纳剑桥有限公司 使用单一表面引物进行配对末端测序的方法和组合物
BR112022019541A2 (pt) 2020-03-30 2022-11-16 Illumina Inc Métodos e composições para preparação de bibliotecas de ácido nucleico
CN114457146B (zh) * 2022-01-28 2024-11-19 赛纳生物科技(北京)有限公司 一种固相介质表面双端扩增测序的方法
US20240401129A1 (en) * 2023-05-31 2024-12-05 Illumina, Inc. Methods for double-stranded sequencing by synthesis

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
EP2327797B1 (en) 1997-04-01 2015-11-25 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
DE19812103A1 (de) * 1998-03-19 1999-09-23 Bernauer Annette Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuremolekülen
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US20050244870A1 (en) 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
DE60040741D1 (de) 1999-04-20 2008-12-18 Illumina Inc Detektion von nukleinsäurereaktionen auf kügelchen-arrays
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
JP2003521252A (ja) 2000-02-07 2003-07-15 イルミナ インコーポレイテッド ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
EP2100971A3 (en) 2000-07-07 2009-11-25 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
AU2003232086A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-11 Incyte Corporation Nucleic acid-associated proteins
AU2003259350A1 (en) 2002-08-23 2004-03-11 Solexa Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
DE20214753U1 (de) * 2002-09-24 2002-12-12 Hando Handels Ges. M.B.H., Graz Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention einer Lichtdermatose
AU2004253882B2 (en) 2003-06-20 2010-06-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
EP1685380A2 (en) * 2003-09-18 2006-08-02 Parallele Bioscience, Inc. System and methods for enhancing signal-to-noise ratios of microarray-based measurements
EP2789383B1 (en) 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
US7315019B2 (en) 2004-09-17 2008-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of optical confinements and uses thereof
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
GB0514936D0 (en) * 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
EP1987159B2 (en) 2006-02-08 2020-08-12 Illumina Cambridge Limited Method for sequencing a polynucleotide template
SG170802A1 (en) 2006-03-31 2011-05-30 Solexa Inc Systems and devices for sequence by synthesis analysis
EP2029782B1 (en) 2006-05-04 2014-11-26 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
EP2089517A4 (en) 2006-10-23 2010-10-20 Pacific Biosciences California POLYMERASEENZYME AND REAGENTS FOR ADVANCED NUCKIC ACID SEQUENCING
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
EP2677309B9 (en) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20080293589A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Affymetrix, Inc. Multiplex locus specific amplification
US8198023B2 (en) * 2008-08-05 2012-06-12 Pacific Biosciences Of California, Inc. Prevention and alleviation of steric hindrance during single molecule nucleic acid synthesis by a polymerase
US8586310B2 (en) * 2008-09-05 2013-11-19 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20120156728A1 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Life Technologies Corporation Clonal amplification of nucleic acid on solid surface with template walking
WO2011085075A2 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
US9096899B2 (en) 2010-10-27 2015-08-04 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
CA2817697C (en) * 2010-11-12 2021-11-16 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
US8778848B2 (en) 2011-06-09 2014-07-15 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
WO2013019361A1 (en) * 2011-07-07 2013-02-07 Life Technologies Corporation Sequencing methods
US9453258B2 (en) 2011-09-23 2016-09-27 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
JP2015526092A (ja) 2012-08-24 2015-09-10 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 核酸ペアエンド配列決定のための方法、組成物、システム、装置、およびキット
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
CN105917002A (zh) * 2013-11-18 2016-08-31 鲁比康基因组学公司 用于减少背景的可降解适体
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
PL3218511T3 (pl) 2014-11-11 2020-10-19 Illumina Cambridge Limited Sposoby i macierze do wytwarzania i sekwencjonowania monoklonalnych klastrów kwasu nukleinowego
ES3062422T3 (en) 2015-02-10 2026-04-10 Illumina Inc Compositions for analyzing cellular components
ES2984193T3 (es) * 2015-03-31 2024-10-29 Illumina Cambridge Ltd Concatemerización de moldes en la superficie
EP3303614B1 (en) * 2015-05-29 2020-03-11 Illumina Cambridge Limited Enhanced utilization of surface primers in clusters
CA3000762A1 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (circle-seq)
WO2018018008A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Oregon Health & Science University Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
EP3842545B1 (en) 2017-04-23 2022-11-30 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
CN111094584B (zh) 2017-04-23 2024-11-26 伊鲁米那股份有限公司 用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法
WO2018197945A1 (en) 2017-04-23 2018-11-01 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
WO2018197950A1 (en) 2017-04-23 2018-11-01 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
AU2019391274B2 (en) 2018-12-05 2025-10-30 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification
CN112739830A (zh) 2018-12-18 2021-04-30 伊卢米纳剑桥有限公司 使用单一表面引物进行配对末端测序的方法和组合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP3891305B1 (en) 2026-06-03
KR102872251B1 (ko) 2025-10-16
US11667953B2 (en) 2023-06-06
WO2020114918A1 (en) 2020-06-11
US20200181686A1 (en) 2020-06-11
AU2019391274A1 (en) 2021-01-07
KR20210098842A (ko) 2021-08-11
JP2022511207A (ja) 2022-01-31
EP3891305A1 (en) 2021-10-13
AU2019391274B2 (en) 2025-10-30
CN112654718A (zh) 2021-04-13
CN112654718B (zh) 2025-07-22
CA3103736A1 (en) 2020-06-11
JP7569690B2 (ja) 2024-10-18
EP3891305C0 (en) 2026-06-03
SG11202012762WA (en) 2021-01-28
US20230295687A1 (en) 2023-09-21