ES3073780T3

ES3073780T3 - Sequential encoding methods and related kits

Info

Publication number: ES3073780T3
Application number: ES21858905T
Authority: ES
Inventors: Mark Chee
Original assignee: 2026 Df Peptide Acquisition LLC
Current assignee: 2026 Df Peptide Acquisition LLC
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2026-07-15
Anticipated expiration: 2041-08-16
Also published as: EP4759938A2; EP4196581A1; WO2022040098A1; JP2023538074A; EP4759938A3; US20230136966A1; EP4196581B1; US12668793B2; AU2021329812A1; EP4196581A4; AU2021329812B2; CA3176922A1; CN116685725A

Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos y kits para el análisis de macromoléculas. En algunas modalidades, se refiere a métodos de análisis de macromoléculas que emplean códigos de barras y codificación de ácidos nucleicos para identificar eventos de reconocimiento molecular. Asimismo, se proporciona un método y kits relacionados para la transferencia de información mediante diversas enzimas, incluyendo reacciones de ligación, extensión y escisión con moléculas de ácido nucleico asociadas a la macromolécula objeto de análisis. En algunas modalidades, la macromolécula objeto de análisis comprende un péptido, un polipéptido o una proteína. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos de codificación secuencial y kits relacionados

[0003] Solicitud relacionada

[0004] La presente invención reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 63/067.744, presentada el 19 de agosto de 2020.

[0005] Listado de secuencias en texto ASCII

[0006] Este archivo de solicitud o patente contiene un listado de secuencias presentado en formato de texto ASCII legible por ordenador (nombre de archivo: 4614-2002540_SeqList_ST25.txt, fecha registrada: 27 de julio de 2021, tamaño: 2.469 bytes).

[0007] Campo técnico

[0008] La presente divulgación se refiere a métodos y a kits para analizar una macromolécula. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a métodos de análisis de macromoléculas que emplean etiquetado con código de barras y codificación de ácido nucleico de eventos de reconocimiento molecular. En el presente documento también se proporcionan métodos y kits relacionados para transferir información usando una pluralidad de enzimas, incluyendo para realizar una reacción de ligamiento, extensión, y escisión con moléculas de ácido nucleico asociadas con la macromolécula para su análisis. En algunas realizaciones, la macromolécula para su análisis comprende un péptido, un polipéptido, o una proteína.

[0009] Antecedentes

[0010] La caracterización y el reconocimiento altamente paralelos de macromoléculas, tales como proteínas, sigue siendo un desafío. En proteómica, un objetivo es identificar y cuantificar numerosas proteínas en una muestra, que es una tarea formidable de lograr de una manera con alto rendimiento. Se han usado ensayos tales como inmunoensayos y métodos basados en espectrometría de masas, pero están limitados a nivel tanto de muestra como de analito, con sensibilidad e intervalo dinámico limitados, con potenciales problemas de reactividad cruzada y señales de fondo. La multiplexación de la lectura de una colección de agentes de afinidad con una colección de macromoléculas afines, por ejemplo, usando agentes de afinidad con marcadores detectables, sigue siendo un desafío. Sigue existiendo la necesidad de técnicas mejoradas relacionadas con el análisis de macromoléculas, con aplicaciones a la secuenciación y/o el análisis de proteínas, así como a productos, métodos y kits para lograr los mismos. Existe la necesidad de una tecnología proteómica para realizar análisis de macromoléculas que sea eficiente, altamente paralelizada, precisa, sensible, y de alto rendimiento. La presente divulgación satisface estas y otras necesidades relacionadas.

[0011] Estos y otros aspectos de la invención resultarán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada. Con este fin, en el presente documento se exponen diversas referencias que describen en más detalle cierta información, procedimientos, compuestos y/o composiciones de antecedentes.

[0012] Breve compendio

[0013] La presente invención se da a conocer en las reivindicaciones independientes 1, 12 y 15. Las reivindicaciones dependientes dan a conocer realizaciones preferidas.

[0014] Recientemente, se han propuesto métodos para la caracterización de macromoléculas de alto rendimiento. En un ejemplo, el documento WO 2019/089836 A1 da a conocer kits y métodos para analizar macromoléculas que emplean codificación de ácido nucleico y/o registro de ácido nucleico de eventos de reconocimiento molecular. En otro ejemplo, el documento WO 2019/089851 A1 da a conocer un ensayo de unión diana-ligando de alto rendimiento de un solo ciclo que emplea codificación de ácido nucleico y/o registro de ácido nucleico de eventos de reconocimiento molecular. En aún otro ejemplo, el documento WO 2019/089846 A1 da a conocer métodos para el análisis de alto rendimiento de polipéptidos, que comprenden funcionalizar aminoácidos N-terminales de polipéptidos con un reactivo químico y emplear agentes de unión codificados por ácido nucleico que reconocen los aminoácidos N-terminales funcionalizados, seguido por registrar los eventos de unión de una manera cíclica.

[0015] En un aspecto, en el presente documento se da a conocer un método para analizar una macromolécula, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte, en el que la etiqueta de registro comprende una región bicatenaria; (b) poner en contacto la macromolécula con un agente de unión capaz de unirse a la macromolécula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta de codificación con información identificativa sobre el agente de unión, para permitir la unión entre la macromolécula y el agente de unión; (c) unir covalentemente el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación mediante un reactivo de unión de ácido nucleico; (d) extender la etiqueta de registro usando la etiqueta de codificación como molde mediante una polimerasa, generando una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (e) escindir ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida bicatenaria con un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para generar una proyección 3’ en la etiqueta de registro extendida; mediante lo cual se transfiere información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro para generar la etiqueta de registro extendida.

[0016] En otro aspecto, en el presente documento se da a conocer un kit para el análisis de macromoléculas, que comprende: un primer agente de unión que comprende una primera etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el primer agente de unión; un segundo agente de unión que comprende una segunda etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el segundo agente de unión; y una mezcla que comprende: (i) un reactivo de unión de ácido nucleico que une covalentemente el extremo 5’ de una etiqueta de registro al extremo 3’ de la primera etiqueta de codificación o la segunda etiqueta de codificación; (ii) una polimerasa que extiende la etiqueta de registro y genera una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (iii) un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario que escinde ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida bicatenaria, en el que cada uno del primer agente de unión y el segundo agente de unión está configurado para unirse a una macromolécula asociada con una etiqueta de registro, el primer agente de unión y el segundo agente de unión se unen a restos diana diferentes dentro de la macromolécula, y tras la unión, la información identificativa de la primera etiqueta de codificación o la segunda etiqueta de codificación está configurada para transferirse a la etiqueta de registro asociada con la macromolécula.

[0017] En aún otro aspecto, en el presente documento se da a conocer una composición que comprende: (a) una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte; (b) una mezcla de agentes de unión, en el que la mezcla comprende un primer agente de unión que comprende una primera etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el primer agente de unión, y un segundo agente de unión que comprende una segunda etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el segundo agente de unión, en el que el primer agente de unión y el segundo agente de unión están configurados para unirse a restos diana diferentes, y en el que el primer agente de unión se une a la macromolécula; y (c) una mezcla que comprende: (i) un reactivo de unión de ácido nucleico que une covalentemente el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la primera etiqueta de codificación; (ii) una polimerasa que extiende la etiqueta de registro y genera una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (iii) un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario que escinde ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida bicatenaria.

[0018] Breve descripción de los dibujos

[0019] Se pretende que las figuras adjuntas respalden la invención; las figuras son esquemáticas y no se pretende que estén dibujadas a escala. Con propósitos ilustrativos, no todos los componentes están marcados en cada figura, ni todos los componentes de cada realización de la invención se muestran cuando la ilustración no es necesaria para permitir que los expertos habituales en la técnica comprendan la invención.

[0020] La figura 1A y la figura 1B representan un ensayo de análisis de macromoléculas a modo de ejemplo que implica transferencia de información usando los métodos proporcionados en el presente documento.

[0021] En la figura 1A, una macromolécula (por ejemplo, un péptido) que va a analizarse se une a una horquilla de etiqueta de registro inmovilizada sobre un soporte usando una reacción de ligamiento y la estructura se escinde durante etapas posteriores. El primer panel (más a la izquierda) de la figura 1A muestra una horquilla de ácido nucleico de captura con extremo 5’ fosforilado rebajado. El segundo panel de la figura 1A muestra que un péptido que va a analizarse se une a un ácido nucleico cebo que se hibrida con la horquilla de ácido nucleico de captura inmovilizada sobre un soporte (a través de un resto de acoplamiento reactivo). El ácido nucleico cebo se liga al ácido nucleico de captura. La etiqueta de registro se liga a la horquilla. El código de barras (BC) marcado en bloque indica cualquier código de barras opcional, por ejemplo, código de barras específico de muestra y/o UMI que puede unirse a la macromolécula e incorporarse a la etiqueta de registro. El sitio de reconocimiento (RS) de enzima de restricción marcado en bloque representa una secuencia incorporada para su reconocimiento y escisión por parte de una enzima de restricción de tipo IIS. El tercer panel de la figura 1A muestra la extensión por polimerasa para producir un constructo de ADN bicatenario (ADNbc) con el péptido unido. El cuarto panel de la figura 1A muestra el constructo de ADNbc tras la digestión con una RE de tipo IIS para producir una proyección 3’ (secuencia de 2 pares de bases) con un extremo 5’ fosforilado rebajado. De esta manera, se prepara la etiqueta de registro que contiene uno o más códigos de barras y está disponible para la transferencia de información desde una etiqueta de codificación.

[0022] La figura 1B muestra un ciclo de codificación con la estructura generada en la figura 1A. El panel izquierdo de la figura 1B muestra un agente de unión unido al péptido, poniendo una etiqueta de codificación unida al agente de unión en proximidad con la etiqueta de registro. En algunas realizaciones, el agente de unión puede unirse a la etiqueta de codificación en ubicaciones distintas de las representadas (por ejemplo, en la región de bucle de la etiqueta de codificación u otras). El agente de unión tal como se muestra se une a la etiqueta de codificación mediante un ligador. La etiqueta de codificación contiene un código de barras específico de agente de unión (BBC), un espaciador de 2 pb, y un sitio de enzima de restricción de tipo IIS (RS). El panel central de la figura 1B muestra el producto de las dos primeras reacciones enzimáticas. Tras el ligamiento del extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación, la polimerasa extiende el extremo 3’ (no ligado) de la etiqueta de registro para crear una molécula de ADNbc que contiene espaciadores de 2 pares de bases adyacentes a sus respectivos sitios de RE de tipo IIS. Tras la generación de doble cadena, se une la RE de tipo IIS y corta adyacente a su sitio de reconocimiento. El panel derecho de la figura 1B ilustra el producto final tras la totalidad de las 3 etapas enzimáticas, donde el ADNbc contiene ahora el código de barras específico de agente de unión y una proyección 3’ (OH) de 2 nt que sirve como secuencia de espaciador. En algunas realizaciones, tras un ciclo de transferencia de información, puede retirarse del polipéptido una porción del polipéptido para su análisis. El ciclo de las etapas mostrado en la figura 1B puede repetirse una o más veces con agentes de unión y etiquetas de codificación adicionales para extender adicionalmente la etiqueta de registro.

[0024] Figura 2. Resultados de codificación a modo de ejemplo generados mediante el método de codificación mostrado en la figura 1A y la figura 1B. Se unieron dos polipéptidos de prueba (péptido F; SEQ ID NO: 6 y péptido L; SEQ ID NO: 7) a etiquetas de registro de ácido nucleico unidas a perlas inmovilizadas. Se usaron dos agentes de unión (grupo de unión a F y grupo de unión a L) unidos a las etiquetas de codificación correspondientes para poner en contacto los polipéptidos de prueba. Para la etapa de ligamiento, se sometieron a prueba 3 concentraciones diferentes de ADN ligasa de T4. Tras el ligamiento, se añadió el fragmento Klenow para la etapa de extensión y se añadió la enzima BtsI-V2 para la etapa de escisión. Se evaluaron las fracciones de etiquetas de registro codificadas mediante secuenciación NGS y mostraron resultados de codificación específicos para ambos agentes de unión. Cada barra de error se construye usando 1 error estándar con respecto a la media.

[0026] Descripción detallada

[0028] En el presente documento se proporcionan métodos y kits para analizar una macromolécula. En algunas realizaciones, el análisis emplea etiquetado con código de barras y codificación de ácido nucleico de eventos de reconocimiento molecular. El método proporcionado comprende: (a) proporcionar una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte; (b) poner en contacto la macromolécula con un agente de unión capaz de unirse a la macromolécula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta de codificación con información identificativa sobre el agente de unión, para permitir la unión entre la macromolécula y el agente de unión; (c) unir el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación usando un reactivo de unión de ácido nucleico; (d) extender la etiqueta de registro usando la etiqueta de codificación como molde mediante una polimerasa, generando una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (e) escindir la etiqueta de registro extendida bicatenaria con un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para generar una proyección 3’ en la etiqueta de registro extendida. Realizando estas etapas, se transfiere información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro para generar una etiqueta de registro extendida. También se proporcionan kits que contienen componentes y/o reactivos para realizar los métodos proporcionados para la secuenciación y/o el análisis de macromoléculas. En algunas realizaciones, los kits también incluyen instrucciones para usar el kit para realizar cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento.

[0030] La caracterización y el reconocimiento altamente paralelos de macromoléculas, tales como proteínas, sigue siendo un desafío. En proteómica, un objetivo es identificar y cuantificar numerosas proteínas en una muestra, que es una tarea formidable de lograr de una manera con alto rendimiento. Se han usado ensayos tales como inmunoensayos y métodos basados en espectrometría de masas, pero están limitados a nivel tanto de muestra como de analito, sensibilidad e intervalo dinámico limitados, y reactividad cruzada y señales de fondo. La multiplexación de la lectura de una colección de agentes de afinidad con una colección de macromoléculas afines, por ejemplo, usando agentes de afinidad con marcadores detectables, sigue siendo un desafío. Sigue existiendo la necesidad de técnicas mejoradas relacionadas con el análisis de macromoléculas, con aplicaciones a la secuenciación y/o el análisis de proteínas, así como a productos, métodos y kits para lograr los mismos. Existe la necesidad de una tecnología proteómica para realizar análisis de macromoléculas que sea eficiente, altamente paralelizada, precisa, sensible, y de alto rendimiento. La presente divulgación satisface estas y otras necesidades relacionadas.

[0032] En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona, en parte, métodos para analizar una macromolécula que incluye transferencia de información, con aplicaciones directas a la caracterización, cuantificación, y/o secuenciación de proteínas y péptidos. En algunos ejemplos, la información transferida comprende información identificativa sobre un agente de unión que está configurado para unirse a la macromolécula. En algunas realizaciones, se analiza una pluralidad de macromoléculas obtenidas de una muestra. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, el método de secuenciación o análisis de macromoléculas incluye usar una pluralidad de agentes de unión asociados con etiquetas de codificación para detectar una pluralidad de macromoléculas que van a analizarse.

[0034] Los métodos de transferencia de información proporcionados en el presente documento utilizan una pluralidad de enzimas para realizar reacciones de ligamiento, extensión, y escisión con moléculas de ácido nucleico. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen oligonucleótidos que comprenden estructura de horquilla y un sitio de enzima de restricción (o una porción del mismo). En algunas realizaciones, los métodos incluyen el uso de un sistema de reacción en el que se proporcionan enzimas mixtas a la reacción. Por ejemplo, se proporcionan condiciones adecuadas para las actividades de la polimerasa, el reactivo de unión de ácido nucleico y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario, transfiriendo información desde una etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro para generar una etiqueta de registro extendida. En los métodos proporcionados, la etiqueta de registro usada comprende al menos una estructura de ADN parcialmente bicatenaria. Algunas ventajas de usar los métodos descritos incluyen elevado éxito de transferencia (codificación) de información, diseño sencillo para una reacción por etapas, opción de realización en una sola etapa/como reacción en un solo recipiente, reducción de la necesidad de espaciadores o reducción de la longitud de espaciador, y/o minimización de las interacciones ADN-ADN en el sistema.

[0035] En la siguiente descripción se exponen numerosos detalles específicos con el fin de proporcionar una comprensión exhaustiva de la presente divulgación. Estos detalles se proporcionan con propósitos de ejemplo y el objeto reivindicado puede ponerse en práctica según las reivindicaciones sin algunos o la totalidad de estos detalles específicos. Debe entenderse que pueden usarse otras realizaciones y pueden realizarse cambios estructurales sin apartarse del alcance del objeto reivindicado. Debe entenderse que las diversas características y la funcionalidad descritas en una o más de las realizaciones individuales no están limitadas en su aplicabilidad a la realización particular con la que se describen. En cambio, pueden aplicarse, solas o en alguna combinación, a una o más de otras realizaciones de la divulgación, se describan o no tales realizaciones, y se presenten o no tales características como parte de una realización descrita. Con propósitos de claridad, el material técnico que se conoce en los campos técnicos relacionados con el objeto reivindicado no se ha descrito en detalle de modo que el objeto reivindicado no se complique innecesariamente.

[0036] La cita de las publicaciones o los documentos no pretende ser una admisión de que cualquiera de ellos es técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o estos documentos.

[0037] Todos los títulos son por conveniencia del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al título, a menos que así se especifique.

[0038] DEFINICIONES

[0039] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Si una definición expuesta en esta sección es contraria a, o de otro modo inconsistente con, una definición expuesta en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones que se incorporan en el presente documento mediante referencia, la definición expuesta en esta sección prevalece sobre la definición que se incorpora en el presente documento mediante referencia.

[0040] Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un péptido” incluye uno o más péptidos, o mezclas de péptidos. Además, y a menos que se indique específicamente o resulte obvio a partir del contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “o” es inclusivo y cubre tanto “o” como “y”.

[0041] El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro por sí mismo. Por ejemplo, la descripción referente a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X”.

[0042] El término “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo (de unión a antígeno) funcionales, incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)<2>, fragmentos Fab’, fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpo de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas modificadas genéticamente y/o de otro modo de inmunoglobulinas, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados, y anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término “anticuerpo” abarca fragmentos de anticuerpo funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y subclases de la misma, IgM, IgE, IgA, e IgD.

[0043] Un “individuo” o “sujeto” incluye un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros, y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). Un “individuo” o “sujeto” puede incluir aves tales como pollos, vertebrados tales como peces y mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, gatos, perros, cerdos, vacas, bueyes, ovejas, cabras, caballos, monos y otros primates no humanos. En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.

[0044] Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a cualquier cosa que pueda contener un analito para el que se desea un ensayo de analito. Tal como se usa en el presente documento, una “muestra” puede ser una disolución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un líquido biológico o un tejido biológico. Los ejemplos de líquidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, líquido amniótico, o similares. Los tejidos biológicos son agregados de células, normalmente de un tipo particular junto con su sustancia intercelular que forman uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, vegetal, bacteriana, fúngica o viral, incluyendo tejidos conjuntivos, epiteliales, musculares y nerviosos. Los ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, ganglios linfáticos, arterias y célula(s) individual(es).

[0046] En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica. Una muestra biológica de la presente divulgación abarca una muestra en forma de una disolución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, una muestra acuosa, o una muestra no acuosa. Tal como se usa en el presente documento, una “muestra biológica” incluye cualquier muestra obtenida de una fuente viva o viral (o prión) u otra fuente de macromoléculas y biomoléculas, e incluye cualquier tipo celular o tejido de un sujeto del que puede obtenerse ácido nucleico, proteína y/u otra macromolécula. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados que se amplifican constituyen una muestra biológica. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, líquidos corporales, tales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos de animales y plantas y muestras procesadas derivadas de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra puede derivarse de un tejido o un líquido corporal, por ejemplo, un tejido conjuntivo, epitelial, muscular o nervioso; un tejido seleccionado del grupo que consiste en cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículo, ovario, útero, recto, sistema nervioso, glándula, y vasos sanguíneos internos; o un líquido corporal seleccionado del grupo que consiste en sangre, orina, saliva, médula ósea, esperma, un líquido ascítico, y subfracciones de los mismos, por ejemplo, suero o plasma.

[0048] Los términos “nivel” o “niveles” se usan para referirse a la presencia y/o cantidad de una diana, por ejemplo, una sustancia o un organismo que forma parte de la etiología de una enfermedad o un trastorno, y puede determinarse de manera cualitativa o cuantitativa. Un cambio “cualitativo” en el nivel diana se refiere a la aparición o desaparición de una diana que no es detectable o está presente en muestras obtenidas de controles normales. Un cambio “cuantitativo” en los niveles de una o más dianas se refiere a un aumento o una disminución medible en los niveles diana en comparación con un control sano.

[0050] Tal como se usa en el presente documento, el término “macromolécula” abarca moléculas grandes compuestas por subunidades más pequeñas. Los ejemplos de macromoléculas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos, macrociclos, o una combinación o un complejo de los mismos. Una macromolécula también incluye una macromolécula quimérica compuesta por una combinación de dos o más tipos de macromoléculas, ligadas covalentemente entre sí (por ejemplo, un péptido ligado a un ácido nucleico). Una macromolécula también puede incluir un “ensamblaje de macromoléculas”, que está compuesto por complejos no covalentes de dos o más macromoléculas. Un ensamblaje de macromoléculas puede estar compuesto por el mismo tipo de macromolécula (por ejemplo, proteína-proteína) o por dos o más tipos diferentes de macromoléculas (por ejemplo, proteína-ADN).

[0052] Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” abarca péptidos y proteínas, y se refiere a una molécula que comprende una cadena de dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. En algunas realizaciones, un polipéptido comprende de 2 a 50 aminoácidos, por ejemplo, que tiene más de 20-30 aminoácidos. En algunas realizaciones, un péptido no comprende una estructura secundaria, terciaria, o superior. En algunas realizaciones, el polipéptido es una proteína. En algunas realizaciones, una proteína comprende 30 o más aminoácidos, por ejemplo, que tiene más de 50 aminoácidos. En algunas realizaciones, además de una estructura primaria, una proteína comprende una estructura secundaria, terciaria, o superior. Los aminoácidos de los polipéptidos son lo más típicamente L-aminoácidos, pero también pueden ser D-aminoácidos, aminoácidos modificados, análogos de aminoácidos, miméticos de aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. Los polipéptidos pueden producirse de manera natural, producirse de manera sintética, o expresarse de manera recombinante. Los polipéptidos pueden producirse de manera sintética, aislarse, expresarse de manera recombinante, o producirse mediante una combinación de metodologías tal como se describió anteriormente. Los polipéptidos también pueden comprender grupos adicionales que modifican la cadena de aminoácidos, por ejemplo, grupos funcionales añadidos mediante modificación postraduccional. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. El término también abarca un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje.

[0054] Tal como se usa en el presente documento, el término “aminoácido” se refiere a un compuesto orgánico que comprende un grupo amina, un grupo ácido carboxílico, y una cadena lateral específica para cada aminoácido, que sirve como subunidad monomérica de un péptido. Un aminoácido incluye los 20 aminoácidos que se producen de manera natural o canónicos convencionales, así como aminoácidos no convencionales. Los aminoácidos que se producen de manera natural convencionales incluyen alanina (A o Ala), cisteína (C o Cys), ácido aspártico (D o Asp), ácido glutámico (E o Glu), fenilalanina (F o Phe), glicina (G o Gly), histidina (H o His), isoleucina (I o Ile), lisina (K o Lys), leucina (L o Leu), metionina (M o Met), asparagina (N o Asn), prolina (P o Pro), glutamina (Q o Gln), arginina (R o Arg), serina (S o Ser), treonina (T o Thr), valina (V o Val), triptófano (W o Trp), y tirosina (Y o Tyr). Un aminoácido puede ser un L-aminoácido o un D-aminoácido. Los aminoácidos no convencionales pueden ser aminoácidos modificados, análogos de aminoácidos, miméticos de aminoácidos, aminoácidos proteinogénicos no convencionales, o aminoácidos no proteinogénicos que se producen de manera natural o se sintetizan químicamente. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a, selenocisteína, pirrolisina, y N-formilmetionina, βaminoácidos, homo-aminoácidos, derivados de prolina y ácido pirúvico, derivados de alanina con sustitución en 3, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina con sustitución en el anillo, aminoácidos de núcleo lineal, N-metil-aminoácidos.

[0056] Tal como se usa en el presente documento, el término “modificación postraduccional” se refiere a modificaciones que se producen en un péptido tras completarse su traducción, por ejemplo, traducción por ribosomas. Una modificación postraduccional puede ser una modificación enzimática o modificación química covalente. Los ejemplos de modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, acilación, acetilación, alquilación (incluyendo metilación), biotinilación, butirilación, carbamilación, carbonilación, desamidación, desiminación, formación de diftamida, formación de puentes disulfuro, eliminilación, unión de flavina, formilación, gamma-carboxilación, glutamilación, glicilación, glicosilación, glipiación, unión de hemo C, hidroxilación, formación de hipusina, yodación, isoprenilación, lipidación, lipoilación, malonilación, metilación, miristoilación, oxidación, palmitoilación, pegilación, fosfopanteteinilación, fosforilación, prenilación, propionilación, formación de base de Schiff de retinilideno, S-glutationilación, S-nitrosilación, S-sulfenilación, selenación, succinilación, sulfinación, ubiquitinación, y amidación C-terminal. Una modificación postraduccional incluye modificaciones del extremo terminal amino y/o del extremo terminal carboxilo de un péptido. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de desamino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior, y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de amida, (alquil inferior)-amida, dialquilamida, y éster alquílico inferior (por ejemplo, en las que alquilo inferior es alquilo C<1>-C<4>). Una modificación postraduccional también incluye modificaciones tales como, pero sin limitarse a, las descritas anteriormente, de aminoácidos que se encuentran entre los extremos terminales amino y carboxilo. El término “modificación postraduccional” también puede incluir modificaciones peptídicas que incluyen uno o más marcadores detectables.

[0058] Tal como se usa en el presente documento, el término “agente de unión” se refiere a una molécula de ácido nucleico, un péptido, un polipéptido, una proteína, hidrato de carbono, o una molécula pequeña que se une a, se asocia con, forma una unión con, reconoce, o se combina con, una diana de unión, por ejemplo, un polipéptido o un componente o rasgo característico de un polipéptido. Un agente de unión puede formar una asociación covalente o asociación no covalente con el polipéptido o el componente o rasgo característico de un polipéptido. Un agente de unión también puede ser un agente de unión quimérico, compuesto por dos o más tipos de moléculas, tal como un agente de unión quimérico de molécula de ácido nucleico-péptido o un agente de unión quimérico de hidrato de carbono-péptido. Un agente de unión puede ser una molécula que se produce de manera natural, se produce de manera sintética, o se expresa de manera recombinante. Un agente de unión puede unirse a un único monómero o subunidad de un polipéptido (por ejemplo, un único aminoácido de un polipéptido) o unirse a una pluralidad de subunidades ligadas de un polipéptido (por ejemplo, un dipéptido, tripéptido, o péptido de orden superior de una molécula de péptido, polipéptido, o proteína más larga). Un agente de unión puede unirse a una molécula lineal o una molécula que tiene una estructura tridimensional (también denominada conformación). Por ejemplo, un agente de unión de anticuerpo puede unirse a un péptido, polipéptido, o proteína lineal, o unirse a un péptido, polipéptido, o proteína conformacional. Un agente de unión puede unirse a un péptido N-terminal, un péptido C-terminal, o un péptido intermedio de una molécula de péptido, polipéptido, o proteína. Un agente de unión puede unirse a un aminoácido N-terminal, un aminoácido C-terminal, o un aminoácido intermedio de una molécula de péptido. Un agente de unión puede unirse preferiblemente a un aminoácido modificado químicamente o marcado (por ejemplo, un aminoácido que se ha marcado mediante un reactivo químico) con respecto a un aminoácido no modificado o no marcado. Por ejemplo, un agente de unión puede unirse preferiblemente a un aminoácido que se ha marcado o modificado con respecto a un aminoácido que no está marcado o no está modificado. Un agente de unión puede unirse a una modificación postraduccional de una molécula de péptido. Un agente de unión puede mostrar una unión selectiva a un componente o rasgo característico de un polipéptido (por ejemplo, un agente de unión puede unirse selectivamente a uno de los 20 residuos de aminoácidos naturales posibles y no unirse o unirse con una afinidad muy baja a los otros 19 residuos de aminoácidos naturales). Un agente de unión puede mostrar una unión menos selectiva, donde el agente de unión es capaz de unirse o está configurado para unirse a una pluralidad de componentes o rasgos característicos de un polipéptido (por ejemplo, un agente de unión puede unirse con una afinidad similar a dos o más residuos de aminoácidos diferentes). Un agente de unión puede comprender una etiqueta de codificación, que puede unirse al agente de unión mediante un ligador.

[0060] Tal como se usa en el presente documento, el término “ligador” se refiere a uno o más de un nucleótido, un análogo de nucleótido, un aminoácido, un péptido, un polipéptido, un polímero, o un resto químico no nucleotídico que se usa para unir dos moléculas. Un ligador puede usarse para unir un agente de unión con una etiqueta de codificación, una etiqueta de registro con un polipéptido, un polipéptido con un soporte, una etiqueta de registro con un soporte sólido, etc. En determinadas realizaciones, un ligador une dos moléculas mediante reacción enzimática o reacción química (por ejemplo, química clic).

[0062] El término “ligando” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula o resto conectado a los compuestos descritos en el presente documento. “Ligando” puede referirse a uno o más ligandos unidos a un compuesto. En algunas realizaciones, el ligando es un grupo colgante o sitio de unión (por ejemplo, el sitio al que se une el agente de unión).

[0063] Tal como se usa en el presente documento, el término “proteoma” puede incluir todo el conjunto de proteínas, polipéptidos, o péptidos (incluyendo conjugados o complejos de los mismos) expresados por un genoma, célula, tejido, u organismo en un determinado momento, de cualquier organismo. En un aspecto, es el conjunto de proteínas expresadas en un tipo de célula u organismo dado, en un momento dado, en condiciones definidas. La proteómica es el estudio del proteoma. Por ejemplo, un “proteoma celular” puede incluir la colección de proteínas encontradas en un tipo celular particular en un conjunto particular de condiciones ambientales, tales como la exposición a estimulación hormonal. El proteoma completo de un organismo puede incluir el conjunto completo de proteínas de la totalidad de los diversos proteomas celulares. Un proteoma también puede incluir la colección de proteínas en determinados sistemas biológicos subcelulares. Por ejemplo, todas las proteínas en un virus pueden denominarse proteoma viral. Tal como se usa en el presente documento, el término “proteoma” incluye subconjuntos de un proteoma, incluyendo, pero sin limitarse a, un cinoma; un secretoma; un receptoma (por ejemplo, GPCRoma); un inmunoproteoma; un nutriproteoma; un subconjunto de proteomas definido por una modificación postraduccional (por ejemplo, fosforilación, ubiquitinación, metilación, acetilación, glicosilación, oxidación, lipidación, y/o nitrosilación), tal como un fosfoproteoma (por ejemplo, fosfotirosina-proteoma, tirosina-cinoma, y tirosina-fosfatoma), un glicoproteoma, etc.; un subconjunto de proteoma asociado con un tejido u órgano, una etapa del desarrollo, o una afección fisiológica o patológica; un subconjunto de proteoma asociado con un proceso celular, tal como ciclo celular, diferenciación (o desdiferenciación), muerte celular, senescencia, migración celular, transformación, o metástasis; o cualquier combinación de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el término “proteómica” se refiere al análisis cuantitativo del proteoma dentro de células, tejidos, y líquidos corporales, y la correspondiente distribución espacial del proteoma dentro de la célula y dentro de los tejidos. Adicionalmente, los estudios de proteómica incluyen el estado dinámico del proteoma, que cambia continuamente con el tiempo en función de la biología y los estímulos biológicos o químicos definidos.

[0065] El aminoácido terminal en un extremo de una cadena peptídica o polipeptídica que tiene un grupo amino libre se denomina en el presente documento “aminoácido N-terminal” (NTAA). El aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena que tiene un grupo carboxilo libre se denomina en el presente documento “aminoácido C-terminal” (CTAA). Los aminoácidos que constituyen un péptido pueden numerarse en orden, teniendo el péptido “n” aminoácidos de longitud. Tal como se usa en el presente documento, NTAA se considera elnésimoaminoácido (también denominado en el presente documento “nNTAA”). Usando esta nomenclatura, el siguiente aminoácido es eln-1aminoácido, después eln-2aminoácido, y así sucesivamente a lo largo de la longitud del péptido desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal. En determinadas realizaciones, un NTAA, un CTAA, o ambos pueden modificarse o marcarse con un resto o un resto químico.

[0067] Tal como se usa en el presente documento, el término “código de barras” se refiere a una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 bases (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 bases) que proporciona una etiqueta identificadora única o información de origen para un polipéptido, un agente de unión, un conjunto de agentes de unión de un ciclo de unión, una muestra de polipéptidos, un conjunto de muestras, polipéptidos dentro de un compartimento (por ejemplo, gotita, perla, o ubicación separada), polipéptidos dentro de un conjunto de compartimentos, una fracción de polipéptidos, un conjunto de fracciones de polipéptidos, una región espacial o un conjunto de regiones espaciales, una biblioteca de polipéptidos, o una biblioteca de agentes de unión. Un código de barras puede ser una secuencia artificial o una secuencia que se produce de manera natural. En determinadas realizaciones, cada código de barras dentro de una población de códigos de barras es diferente. En otras realizaciones, una porción de los códigos de barras en una población de códigos de barras es diferente, por ejemplo, al menos aproximadamente el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, o el 99 % de los códigos de barras en una población de códigos de barras es diferente. Una población de códigos de barras puede generarse aleatoriamente o generarse no aleatoriamente. En determinadas realizaciones, una población de códigos de barras son códigos de barras con corrección de errores o tolerantes a errores. Los códigos de barras pueden usarse para deconvolucionar computacionalmente los datos de secuenciación multiplexados e identificar lecturas de secuencia derivadas de un polipéptido individual, una muestra, una biblioteca, etc. También puede usarse un código de barras para la deconvolución de una colección de polipéptidos que se han distribuido en pequeños compartimentos para un mapeo mejorado. Por ejemplo, en lugar de mapear un péptido de vuelta al proteoma, el péptido se mapea de vuelta a su molécula de proteína o complejo de proteína de origen.

[0069] Tal como se usa en el presente documento, el término “etiqueta de codificación” se refiere a un polinucleótido con cualquier longitud adecuada, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 2 bases a aproximadamente 100 bases, incluyendo cualquier número entero incluyendo 2 y 100 y entremedias, que comprende información identificativa para su agente de unión asociado. Una “etiqueta de codificación” también puede producirse a partir de un “polímero secuenciable” (véanse, por ejemplo, Niuet al., 2013, Nat. Chem.5:282-292; Royet al., 2015, Nat. Commun. 6:6:7237; Lutz, 2015, Macromolecules 48:4759-4767). Una etiqueta de codificación puede comprender una secuencia de codificador, que está flanqueada opcionalmente por un espaciador en un lado u opcionalmente flanqueada por un espaciador en cada lado. Una etiqueta de codificación también puede estar compuesta por un UMI opcional y/o un código de barras específico de ciclo de unión opcional. Una etiqueta de codificación puede ser monocatenaria o bicatenaria. Una etiqueta de codificación bicatenaria puede comprender extremos romos, extremos salientes, o ambos. Una etiqueta de codificación puede referirse a la etiqueta de codificación que está directamente unida a un agente de unión, a una secuencia complementaria hibridada con la etiqueta de codificación directamente unida a un agente de unión (por ejemplo, para etiquetas de codificación bicatenarias), o a información de etiqueta de codificación presente en una etiqueta de registro extendida. En determinadas realizaciones, una etiqueta de codificación puede comprender además un espaciador o código de barras específico de ciclo de unión, un identificador molecular único, un sitio de cebado universal, o cualquier combinación de los mismos.

[0071] Tal como se usa en el presente documento, el término “espaciador” (Sp) se refiere a una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 1 base a aproximadamente 20 bases (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 bases) de longitud que está presente en un extremo terminal de una etiqueta de registro o etiqueta de codificación. En determinadas realizaciones, una secuencia de espaciador flanquea una secuencia de codificador de una etiqueta de codificación en un extremo o ambos extremos. Tras la unión de un agente de unión a un polipéptido, la hibridación entre secuencias de espaciador complementarias en su etiqueta de codificación y etiqueta de registro asociadas, respectivamente, permite la transferencia de información de unión a través de una reacción de extensión de cebador o ligamiento a la etiqueta de registro, la etiqueta de codificación, o un constructo de dos etiquetas. Sp’ se refiere a la secuencia de espaciador complementaria a Sp. Preferiblemente, las secuencias de espaciador dentro de una biblioteca de agentes de unión poseen el mismo número de bases. Puede usarse un espaciador común (compartido o idéntico) en una biblioteca de agentes de unión. Una secuencia de espaciador puede tener una secuencia “específica de ciclo” para el seguimiento de los agentes de unión usados en un ciclo de unión particular. La secuencia de espaciador (Sp) puede ser constante a lo largo de todos los ciclos de unión, ser específica para una clase particular de polipéptidos, o ser específica del número de ciclos de unión. Los espaciadores específicos de clase de polipéptido permiten la hibridación de información de etiqueta de codificación de un agente de unión afín presente en una etiqueta de registro extendida desde un ciclo de unión/extensión completado hasta la etiqueta de codificación de otro agente de unión que reconoce la misma clase de polipéptidos en un ciclo de unión posterior a través de los espaciadores específicos de clase. Sólo la unión secuencial de pares afines correctos da como resultado elementos espaciadores que interactúan y extensión de cebador eficaz. Una secuencia de espaciador puede comprender un número suficiente de bases para hibridarse con una secuencia de espaciador complementaria en una etiqueta de registro para iniciar una reacción de extensión de cebador (también denominada extensión por polimerasa), o proporcionar una “férula” para una reacción de ligamiento, o mediar en una reacción de ligamiento de “extremos pegajosos”. Una secuencia de espaciador puede comprender un menor número de bases que la secuencia de codificador dentro de una etiqueta de codificación.

[0073] Tal como se usa en el presente documento, el término “etiqueta de registro” se refiere a un resto, por ejemplo, un resto de acoplamiento químico, una molécula de ácido nucleico, o una molécula polimérica secuenciable (véanse, por ejemplo, Niuet al., 2013, Nat. Chem. 5:282-292; Royet al., 2015, Nat. Commun. 6:6:7237; Lutz, 2015, Macromolecules 48:4759-4767) al que puede transferirse información identificativa de una etiqueta de codificación, o a partir del cual la información identificativa sobre la macromolécula (por ejemplo, información de UMI) asociada con la etiqueta de registro puede transferirse a la etiqueta de codificación. La información identificativa puede comprender cualquier información que caracterice una molécula, tal como información relativa a la muestra, fracción, partición, ubicación espacial, molécula(s) vecina(s) que interactúa(n), número de ciclo, etc. Adicionalmente, la presencia de información de UMI también puede clasificarse como información identificativa. En determinadas realizaciones, después de que un agente de unión se una a un polipéptido, la información de una etiqueta de codificación ligada a un agente de unión puede transferirse a la etiqueta de registro asociada con el polipéptido mientras el agente de unión está unido al polipéptido. En otras realizaciones, después de que un agente de unión se una a un polipéptido, la información de una etiqueta de registro asociada con el polipéptido puede transferirse a la etiqueta de codificación ligada al agente de unión mientras el agente de unión está unido al polipéptido. Una etiqueta de registro puede estar directamente ligada a un polipéptido, ligada a un polipéptido a través de un ligador multifuncional, o asociada con un polipéptido en virtud de su proximidad (o colocalización) en un soporte. Una etiqueta de registro puede estar ligada a través de su extremo 5’ o extremo 3’ o en un sitio interno, siempre que el enlace sea compatible con el método usado para transferir información de etiqueta de codificación a la etiqueta de registro o viceversa. Una etiqueta de registro puede comprender además otros componentes funcionales, por ejemplo, un sitio de cebado universal, un identificador molecular único, un código de barras (por ejemplo, un código de barras de muestra, un código de barras de fracción, un código de barras espacial, una etiqueta de compartimento, etc.), una secuencia de espaciador que es complementaria a una secuencia de espaciador de una etiqueta de codificación, o cualquier combinación de los mismos. La secuencia de espaciador de una etiqueta de registro está preferiblemente en el extremo 3’ de la etiqueta de registro en realizaciones donde se usa extensión por polimerasa para transferir información de etiqueta de codificación a la etiqueta de registro.

[0075] Tal como se usa en el presente documento, el término “extensión de cebador”, también denominada “extensión por polimerasa”, se refiere a una reacción catalizada por una polimerasa de ácido nucleico (por ejemplo, ADN polimerasa) mediante la cual una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, cebador de oligonucleótido, secuencia de espaciador) que se hibrida con una cadena complementaria se extiende por la polimerasa, usando la cadena complementaria como molde.

[0077] Tal como se usa en el presente documento, el término “identificador molecular único” o “UMI” se refiere a una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 bases (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 bases) de longitud que proporciona una etiqueta identificadora única para cada macromolécula, polipéptido o agente de unión al que se liga el UMI. Puede usarse un UMI de polipéptido para deconvolucionar computacionalmente los datos de secuenciación de una pluralidad de etiquetas de registro extendidas para identificar etiquetas de registro extendidas que se originaron a partir de un polipéptido individual. Puede usarse un UMI de polipéptido para contar con precisión moléculas de polipéptido de origen mediante el colapso de lecturas de NGS en UMI únicos. Puede usarse un UMI de agente de unión para identificar cada agente de unión molecular individual que se une a un polipéptido particular. Por ejemplo, puede usarse un UMI para identificar el número de eventos de unión individuales para un agente de unión específico para un único aminoácido que se produce para una molécula de péptido particular. Se entiende que, cuando el UMI y el código de barras se referencian ambos en el contexto de un agente de unión o polipéptido, el código de barras se refiere a información identificativa distinta del UMI para el agente de unión o polipéptido individual (por ejemplo, código de barras de muestra, código de barras de compartimento, código de barras de ciclo de unión).

[0079] Tal como se usa en el presente documento, el término “sitio de cebado universal” o “cebador universal” o “secuencia de cebado universal” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede usarse para la amplificación de bibliotecas y/o para reacciones de secuenciación. Un sitio de cebado universal puede incluir, pero no se limita a, un sitio de cebado (secuencia de cebador) para amplificación por PCR, secuencias adaptadoras de celdas de flujo que se hibridan con oligonucleótidos complementarios en superficies de celdas de flujo que permiten amplificación por puente en algunas plataformas de secuenciación de nueva generación, un sitio de cebado de secuenciación, o una combinación de los mismos. Los sitios de cebado universales pueden usarse para otros tipos de amplificación, incluyendo los usados comúnmente junto con secuenciación digital de nueva generación. Por ejemplo, pueden circularizarse las moléculas de etiqueta de registro extendida y puede usarse un sitio de cebado universal para la amplificación por círculo rodante para formar nanobolas de ADN que pueden usarse como moldes de secuenciación (Drmanacet al., 2009, Science 327:78-81). Alternativamente, las moléculas de etiqueta de registro pueden circularizarse y secuenciarse directamente mediante extensión por polimerasa a partir de sitios de cebado universales (Korlachet al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. 105:1176-1181). El término “directo” cuando se usa en contexto con un “sitio de cebado universal” o “cebador universal” también puede denominarse “5’“ o “sentido”. El término “inverso” cuando se usa en contexto con un “sitio de cebado universal” o “cebador universal” también puede denominarse “3’“ o “antisentido”.

[0081] Tal como se usa en el presente documento, el término “etiqueta de registro extendida” se refiere a una etiqueta de registro a la que se ha transferido información de al menos una etiqueta de codificación de agente de unión (o su secuencia complementaria) tras la unión del agente de unión a un polipéptido. La información de la etiqueta de codificación puede transferirse a la etiqueta de registro directamente (por ejemplo, ligamiento) o indirectamente (por ejemplo, extensión de cebador). La información de una etiqueta de codificación puede transferirse a la etiqueta de registro de manera enzimática o química. Una etiqueta de registro extendida puede comprender información de agente de unión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200 o más etiquetas de codificación. La secuencia de bases de una etiqueta de registro extendida puede reflejar el orden temporal y secuencial de unión de los agentes de unión identificados por sus etiquetas de codificación, puede reflejar un orden secuencial parcial de unión de los agentes de unión identificados por las etiquetas de codificación, o puede no reflejar ningún orden de unión de los agentes de unión identificados por las etiquetas de codificación. En determinadas realizaciones, la información de etiqueta de codificación presente en la etiqueta de registro extendida representa la secuencia de polipéptido que está analizándose con una identidad de al menos el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, o el 100 %. En determinadas realizaciones donde la etiqueta de registro extendida no representa la secuencia de polipéptido que está analizándose con una identidad del 100 %, los errores pueden deberse a la unión inespecífica por un agente de unión, o a un ciclo de unión “fallido” (por ejemplo, debido a que un agente de unión no se une a un polipéptido durante un ciclo de unión, debido a una reacción de extensión de cebador fallida), o ambos.

[0083] Tal como se usa en el presente documento, el término “soporte sólido”, “superficie sólida”, o “sustrato sólido”, o “sustrato de secuenciación”, o “sustrato” se refiere a cualquier material sólido, incluyendo materiales porosos y no porosos, al que un polipéptido puede asociarse de manera directa o indirecta, por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo interacciones covalentes y no covalentes, o cualquier combinación de las mismas. Un soporte sólido puede ser bidimensional (por ejemplo, superficie plana) o tridimensional (por ejemplo, perla o matriz de gel). Un soporte sólido puede ser cualquier superficie de soporte incluyendo, pero sin limitarse a, una perla, una microperla, una matriz, una superficie de vidrio, una superficie de silicio, una superficie de plástico, un filtro, una membrana, una membrana de PTFE, una membrana de PTFE, una membrana de nitrocelulosa, una superficie de polímero a base de nitrocelulosa, nailon, un chip de oblea de silicio, un chip de flujo continuo, una celda de flujo, un biochip que incluye electrónica de transducción de señales, un canal, un pocillo de microtitulación, una placa de ELISA, un disco de interferometría giratorio, una membrana de nitrocelulosa, una superficie de polímero a base de nitrocelulosa, una matriz de polímero, una nanopartícula, o una microesfera. Los materiales para un soporte sólido incluyen, pero no se limitan a, acrilamida, agarosa, celulosa, dextrano, nitrocelulosa, vidrio, oro, cuarzo, poliestireno, poli(etileno-acetato de vinilo), polipropileno, poliéster, polimetacrilato, poliacrilato, polietileno, poli(óxido de etileno), polisilicatos, policarbonatos, poli(alcohol vinílico) (PVA), Teflon, fluorocarbonos, nailon, caucho de silicio, polianhídridos, poli(ácido glicólico), poli(cloruro de vinilo), poli(ácido láctico), poliortoésteres, silano funcionalizado, poli(fumerato de propilo), colágeno, glicosaminoglicanos, poliaminoácidos, dextrano, o cualquier combinación de los mismos. Los soportes sólidos incluyen además película delgada, membrana, botellas, placas, fibras, fibras tejidas, polímeros conformados tales como tubos, partículas, perlas, microesferas, micropartículas, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, cuando la superficie sólida es una perla, la perla puede incluir, pero no se limita a, una perla cerámica, una perla de poliestireno, una perla de polímero, una perla de poliacrilato, una perla de metilestireno, una perla de agarosa, una perla de celulosa, una perla de dextrano, una perla de acrilamida, una perla de núcleo sólido, una perla porosa, una perla paramagnética, una perla de vidrio, una perla de poro controlado, una perla a base de sílice, o cualquier combinación de las mismas. Una perla puede ser esférica o tener una forma irregular. Una perla o un soporte puede ser poroso. El tamaño de una perla puede oscilar desde nanómetros, por ejemplo, 100 nm, hasta milímetros, por ejemplo, 1 mm. En determinadas realizaciones, las perlas oscilan en cuanto a tamaño desde aproximadamente 0,2 micrómetros hasta aproximadamente 200 micrómetros, o desde aproximadamente 0,5 micrómetros hasta aproximadamente 5 micrómetros. En algunas realizaciones, las perlas pueden tener aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 2,8, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 15, ó 20 µm de diámetro. En determinadas realizaciones, un soporte sólido de “perla” puede referirse a una perla individual o una pluralidad de perlas. En algunas realizaciones, la superficie sólida es una nanopartícula. En determinadas realizaciones, las nanopartículas oscilan en cuanto a tamaño desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 500 nm de diámetro, por ejemplo, entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 20 nm, entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 50 nm, entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 50 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 200 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 200 nm, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 200 nm, o entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 500 nm de diámetro. En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden tener aproximadamente 10 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 300 nm, o aproximadamente 500 nm de diámetro. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen menos de aproximadamente 200 nm de diámetro.

[0085] Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula de ácido nucleico” o “polinucleótido” se refiere a un polinucleótido monocatenario o bicatenario que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que están ligados por enlaces fosfodiéster 3’-5’, así como análogos de polinucleótidos. Una molécula de ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ADN, ARN, y ADNc. Un análogo de polinucleótido puede poseer una estructura principal distinta de un enlace fosfodiéster convencional encontrado en polinucleótidos naturales y, opcionalmente, un resto o restos de azúcar modificados distintos de ribosa o desoxirribosa. Los análogos de polinucleótidos contienen bases capaces de formar enlaces de hidrógeno mediante apareamiento de bases de Watson-Crick con bases de polinucleótidos convencionales, donde la estructura principal del análogo presenta las bases de una manera que permite tal formación de enlaces de hidrógeno de una manera específica de secuencia entre la molécula de análogo de oligonucleótido y las bases en un polinucleótido convencional. Los ejemplos de análogos de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ácido xenonucleico (XNA), ácido nucleico en puente (BNA), ácido nucleico glicólico (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), γPNA, polinucleótidos de morfolino, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácido nucleico de treosa (TNA), 2’-O-metil-polinucleótidos, polinucleótidos sustituidos con 2’-O-alquil-ribosilo, polinucleótidos de fosforotioato, y polinucleótidos de boronofosfato. Un análogo de polinucleótido puede poseer análogos de purina o pirimidina, incluyendo, por ejemplo, análogos de 7-desazapurina, análogos de 8-halopurina, análogos de 5-halopirimidina, o análogos de bases universales que pueden aparearse con cualquier base, incluyendo hipoxantina, nitroazoles, análogos de isocarboestirilo, azolcarboxamidas, y análogos de triazol aromáticos, o análogos de bases con funcionalidad adicional, tales como un resto de biotina para la unión por afinidad. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el oligonucleótido es un oligonucleótido modificado. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el oligonucleótido es un ADN con bases pseudocomplementarias, un ADN con bases protegidas, una molécula de ARN, una molécula de BNA, una molécula de XNA, una molécula de LNA, una molécula de PNA, una molécula de γPNA, o un ADN de morfolino, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el oligonucleótido está modificado en su estructura principal, modificado en su azúcar o modificado en sus bases nitrogenadas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el oligonucleótido tiene grupos protectores de bases nitrogenadas tales como Alloc, grupos protectores electrófilos tales como tiranos, grupos protectores de acetilo, grupos protectores de nitrobencilo, grupos protectores de sulfonato, o grupos protectores lábiles a bases tradicionales.

[0086] Tal como se usa en el presente documento, “secuenciación de ácidos nucleicos” significa la determinación del orden de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico o una muestra de moléculas de ácido nucleico.

[0088] Tal como se usa en el presente documento, “secuenciación de nueva generación” se refiere a métodos de secuenciación de alto rendimiento que permiten la secuenciación de millones a miles de millones de moléculas en paralelo. Los ejemplos de métodos de secuenciación de nueva generación incluyen secuenciación por síntesis, secuenciación por ligamiento, secuenciación por hibridación, secuenciación de polonias, secuenciación por semiconductores iónicos, y pirosecuenciación. Uniendo cebadores a un sustrato sólido y una secuencia complementaria a una molécula de ácido nucleico, puede hibridarse una molécula de ácido nucleico con el sustrato sólido a través del cebador y entonces pueden generarse múltiples copias en un área discreta en el sustrato sólido usando polimerasa para amplificar (estas agrupaciones se denominan a veces colonias de polimerasa o polonias). Por consiguiente, durante el procedimiento de secuenciación, un nucleótido en una posición particular puede secuenciarse múltiples veces (por ejemplo, cientos o miles de veces); esta profundidad de cobertura se denomina “secuenciación profunda”. Los ejemplos de tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos de alto rendimiento incluyen plataformas proporcionadas por Illumina, BGI, Qiagen, Thermo-Fisher, y Roche, incluyendo formatos tales como matrices de perlas paralelas, secuenciación por síntesis, secuenciación por ligamiento, electroforesis capilar, microchips electrónicos, “biochips”, micromatrices, microchips paralelos, y matrices de una sola molécula (véase, por ejemplo, Service, Science (2006) 311:1544-1546).

[0089] Tal como se usa en el presente documento, “secuenciación de una sola molécula” o “secuenciación de tercera generación” se refiere a métodos de secuenciación de nueva generación en los que se generan lecturas de instrumentos de secuenciación de una sola molécula mediante secuenciación de una única molécula de ADN. A diferencia de los métodos de secuenciación de nueva generación que se basan en la amplificación para clonar muchas moléculas de ADN en paralelo para la secuenciación en un enfoque en fase, la secuenciación de una sola molécula interroga a moléculas individuales de ADN y no requiere amplificación o sincronización. La secuenciación de una sola molécula incluye métodos que necesitan pausar la reacción de secuenciación después de cada incorporación de base (ciclo de “lavado y exploración”) y métodos que no necesitan detenerse entre etapas de lectura. Los ejemplos de métodos de secuenciación de una sola molécula incluyen secuenciación en tiempo real de una sola molécula (Pacific Biosciences), secuenciación basada en nanoporos (Oxford Nanopore), secuenciación de nanoporos interrumpida por dúplex, y obtención de imágenes directa de ADN usando microscopía avanzada.

[0090] Tal como se usa en el presente documento, “analizar” el polipéptido significa identificar, detectar, cuantificar, caracterizar, distinguir, o una combinación de los mismos, la totalidad o una porción de los componentes del polipéptido. Por ejemplo, analizar un péptido, polipéptido, o proteína incluye determinar la totalidad o una porción de la secuencia de aminoácidos (contigua o no continua) del péptido. El análisis de un polipéptido también incluye la identificación parcial de un componente del polipéptido. Por ejemplo, la identificación parcial de aminoácidos en la secuencia de proteína polipeptídica puede identificar que un aminoácido en la proteína pertenece a un subconjunto de posibles aminoácidos. El análisis comienza normalmente con el análisis delnNTAA, y luego procede al siguiente aminoácido del péptido (es decir,n-1,n-2,n-3, y así sucesivamente). Esto se consigue mediante la eliminación delnNTAA, convirtiendo de ese modo el aminoácidon-1del péptido en un aminoácido N-terminal (denominado en el presente documento “n-1NTAA”). El análisis del péptido también puede incluir determinar la presencia y la frecuencia de modificaciones postraduccionales en el péptido, que puede incluir o no incluir información con respecto al orden secuencial de las modificaciones postraduccionales en el péptido. El análisis del péptido también puede incluir determinar la presencia y la frecuencia de epítopos en el péptido, que puede incluir o no incluir información con respecto al orden secuencial o la ubicación de los epítopos dentro del péptido. El análisis del péptido puede incluir combinar diferentes tipos de análisis, por ejemplo, obtener información de epítopos, información de secuencias de aminoácidos, información de modificaciones postraduccionales, o cualquier combinación de las mismas.

[0091] Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en” los aspectos y las realizaciones.

[0092] A lo largo de esta divulgación, se presentan diversos aspectos de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha dado a conocer específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como desde 1 hasta 6 tiene subintervalos dados a conocer específicamente tales como desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 5, desde 2 hasta 4, desde 2 hasta 6, desde 3 hasta 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

[0093] Otros objetos, ventajas y características de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente memoria descriptiva tomada junto con los dibujos adjuntos.

[0094] I. CODIFICACIÓN SECUENCIAL

[0095] En el presente documento se proporcionan métodos y kits para el análisis de macromoléculas, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, y proteínas, que incluye una etapa de transferir información a una etiqueta de registro. El análisis emplea codificación de ácido nucleico de eventos de reconocimiento molecular. En algunos aspectos, la información transferida comprende información identificativa sobre un agente de unión que está configurado para unirse a la macromolécula. El método proporcionado para la transferencia de información incluye: (a) proporcionar una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte; (b) poner en contacto la macromolécula con un agente de unión capaz de unirse a la macromolécula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta de codificación con información identificativa sobre el agente de unión, para permitir la unión entre la macromolécula y el agente de unión; (c) unir el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación mediante un reactivo de unión de ácido nucleico; (d) extender la etiqueta de registro usando la etiqueta de codificación como molde mediante una polimerasa, generando una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (e) escindir la etiqueta de registro extendida bicatenaria con un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para generar una proyección 3’ en la etiqueta de registro extendida. Realizando estas etapas, se transfiere información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro para generar una etiqueta de registro extendida. En algunas realizaciones, la polimerasa, el reactivo de unión de ácido nucleico y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario se proporcionan en una mezcla o al mismo tiempo. En algunos aspectos, las etapas (c), (d), y (e) se realizan como reacción en un solo recipiente. En algunos otros aspectos, las etapas (c), (d), y (e) se realizan secuencialmente y por separado. En algunos casos, cada reactivo puede proporcionarse por separado o dos de los tres reactivos enzimáticos se proporcionan al mismo tiempo. En algunos casos, la etiqueta de registro y la etiqueta de codificación de los métodos proporcionados comprenden ácidos nucleicos.

[0097] Pueden repetirse uno o más ciclos de las etapas (b) a (e) para generar una etiqueta de registro extendida que incluye información transferida desde una pluralidad de etiquetas de codificación. Por ejemplo, las etapas (b), (c), (d) y (e) pueden repetirse secuencialmente una o más veces de manera cíclica. En algunas realizaciones, la etiqueta de registro extendida generada comprende una horquilla de ácido nucleico. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden incluir proporcionar una pluralidad de agentes de unión y una pluralidad de macromoléculas y permitir que interactúen los agentes de unión y las macromoléculas. En algunas realizaciones, se proporciona una pluralidad de agentes de unión en cada ciclo como mezcla. En algunas realizaciones, los presentes métodos comprenden poner en contacto una única macromolécula con un único agente de unión, poner en contacto una pluralidad de macromoléculas con un único agente de unión, o poner en contacto una pluralidad de macromoléculas con una pluralidad de agentes de unión.

[0099] En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona, en parte, métodos para analizar una macromolécula que incluye transferencia de información, con aplicaciones directas a la caracterización, cuantificación, y/o secuenciación de proteínas y péptidos. En algunas realizaciones particulares, la macromolécula para su análisis no es un ácido nucleico. En algunas realizaciones particulares, el agente de unión no es un ácido nucleico. En el presente documento se proporcionan métodos para transferir información desde una etiqueta de codificación asociada o unida a un agente de unión hasta una etiqueta de registro asociada con la macromolécula que va a analizarse (por ejemplo, polipéptido). La transferencia de información se realiza usando una reacción de tres partes que incluye ligamiento, extensión, y escisión mediante un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, una enzima de restricción). La información transferida desde la etiqueta de codificación incluye información identificativa sobre la identidad del agente de unión, proporcionando de ese modo información sobre la macromolécula o porción de la mismo unida por el agente de unión. Por ejemplo, si una macromolécula de proteína/polipéptido/péptido se une por el agente de unión, la información identificativa puede comprender información sobre la identidad del uno o más aminoácidos unidos por el agente de unión. En algunas realizaciones, la información sobre la identidad de la macromolécula (o porción de la misma) unida por el agente de unión es de la etiqueta de codificación asociada con dicho agente de unión, y se transfiere a la etiqueta de registro. El ensayo de análisis de macromoléculas puede incluir uno o más ciclos de transferir información identificativa de un agente de unión desde una etiqueta de codificación hasta una etiqueta de registro asociada con la macromolécula que va a analizarse. La etiqueta de registro extendida final asociada con la macromolécula para su análisis puede comprender información de una o más etiquetas de codificación. Si se realizan múltiples ciclos, la etiqueta de registro extendida resultante contiene entonces información acumulada a partir de una serie de eventos de unión y múltiples eventos de transferencia de información a partir de etiquetas de codificación. En general, las mejoras para la transferencia de información usando el método descrito que implica las actividades del reactivo de unión de ácido nucleico, la polimerasa, y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario pueden proporcionar determinados beneficios al ensayo de análisis de macromoléculas.

[0101] En algunos aspectos, el sistema de codificación secuencial usado en el método proporcionado para analizar macromoléculas proporciona determinadas ventajas al diseño global del ensayo. En particular, se proporcionan algunas ventajas mediante las etapas secuenciales llevadas a cabo mediante el reactivo de unión de ácido nucleico, la polimerasa, y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. En algunas realizaciones, los métodos incluyen o usan un sistema de reacción en el que se proporcionan enzimas mixtas a la reacción, de manera que se realiza en una etapa y/o las reacciones se llevan a cabo en una reacción en un solo recipiente. Mediante el diseño del sistema, el ligamiento, la extensión, y la escisión de las etapas (c), (d), y (e), respectivamente, se producen de una manera por etapas o secuencial. En algunas otras realizaciones, la naturaleza por etapas de las etapas podría introducirse con el uso de grupos bloqueantes o mediante la introducción de requisitos adicionales de manera que el ligamiento, la extensión, y/o la escisión se realizan de una manera que esté condicionada a la finalización de una etapa previa. Se proporcionan condiciones adecuadas para las actividades de la polimerasa, el reactivo de unión de ácido nucleico y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para transferir información desde una etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro para generar una etiqueta de registro extendida. Algunas ventajas de usar los métodos descritos incluyen elevado éxito de transferencia (codificación) de información, diseño sencillo para una reacción por etapas, opción de funcionar en una sola etapa/como reacción en un solo recipiente, reducción de la necesidad de espaciadores o la longitud de los espaciadores, minimización de las interacciones ADN-ADN en el sistema, y/o minimización de las interacciones ADN-proteína en el sistema. Por ejemplo, en comparación con una molécula de ácido nucleico monocatenaria que puede ser flexible y proporcionar bases expuestas para la interacción, la etiqueta de registro bicatenaria proporcionada en el presente documento puede presentar menos interacciones para que el ADN interactúe con otros componentes (por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, agentes de unión, etc.) en el sistema.

[0103] En algunas realizaciones, los métodos proporcionados para transferir información usando codificación secuencial permiten determinados beneficios relacionados con el formato de los componentes de ácido nucleico usados. Por ejemplo, en un método de transferencia de información basado en extensión que depende de un elemento espaciador para formar un sitio de cebado de polimerasa, puede requerirse que el tamaño del espaciador tenga una determinada longitud, tal como al menos 6 pares de bases. Los espaciadores más cortos pueden tener ventajas tales como evitar interacciones inespecíficas en el ensayo. En algunos casos, el enriquecimiento de secuencia sería más sencillo si se minimizaran o eliminaran los elementos repetitivos. En algunos casos, los métodos proporcionados evitan determinados problemas con la especificidad, el sesgo, la estabilidad, y la eficiencia en comparación con un método basado en extensión. En los métodos basados en ligamiento para la transferencia de información, la eficiencia con la unión de extremos adecuados de los ácidos nucleicos y la complejidad con otras etapas requeridas para transferir información pueden ser un problema. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados que emplean la polimerasa, el reactivo de unión de ácido nucleico y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario proporcionan beneficios con respecto a los sistemas que únicamente están basados en extensión o basados en ligamiento. Empleando la etapa de escisión que se produce tras la etapa de polimerasa, pueden evitarse problemas de generación de colas de A donde las polimerasas dejan una proyección “A”. El uso de ADN bicatenario minimiza las posibles interacciones ADN-ADN que pueden producirse en otros sistemas que utilizan componentes de ADN monocatenario. En algunos casos, puede reducirse la longitud de los espaciadores más cortos que pueden emplearse en los métodos proporcionados, tal como hasta espaciadores de 2 pb, y en algunos casos, puede eliminarse completamente el uso de espaciadores. En algunos aspectos, el método de codificación secuencial termina por sí mismo tras un ciclo de transferencia de información debido a proyecciones incompatibles.

[0105] En algunas realizaciones, tanto la etiqueta de registro como la etiqueta de codificación incluyen una secuencia de espaciador. Por ejemplo, el espaciador es una molécula de ácido nucleico de menos de o igual a 10 bases, menos de o igual a 9 bases, menos de o igual a 8 bases, menos de o igual a 7 bases, menos de o igual a 6 bases, menos de o igual a 5 bases, menos de o igual a 4 bases, menos de o igual a 3 bases, o menos de o igual a 2 bases. El espaciador puede ser un espaciador específico de ciclo o espaciador alternante de ciclo. Los diseños particulares del sistema para transferir información pueden utilizar un espaciador de manera que la información se transfiera sólo desde una segunda etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro extendida si el espaciador añadido por la etiqueta de codificación previa coincide con al menos una porción del espaciador de la segunda etiqueta de codificación. De esta manera, los eventos de codificación posteriores son dependientes de, y están condicionados a, los eventos de codificación previos. En algunas otras realizaciones, ni la etiqueta de registro ni la etiqueta de codificación incluye una secuencia de espaciador.

[0107] En algunas realizaciones, algunas etapas en el ciclo pueden repetirse opcionalmente. Por ejemplo, tras un ciclo de proporcionar agentes de unión y transferir información desde las etiquetas de codificación, pueden retirarse los agentes de unión, y pueden proporcionarse agentes de unión de nuevo para permitir la reunión del agente de unión y permitir otra oportunidad para que se produzca la transferencia de información, por ejemplo, en el caso en el que no se produjera la primera transferencia de información. En algunos aspectos, los métodos proporcionados que usan espaciadores alternantes son adecuados para esta repetición para permitir una segunda oportunidad para la transferencia de información. Si el primer evento de unión y transferencia de información tuvo éxito, el espaciador transferido junto con la información de etiqueta de codificación exitosa no permitiría que se produjera un evento de transferencia de información repetido (ni siquiera si el agente de unión reconoce la macromolécula para su análisis). En cambio, si un primer evento de transferencia de información no tuvo éxito, la reunión incorporaría la etiqueta de codificación con un espaciador que coincidiría con el espaciador en la etiqueta de registro existente y la segunda unión permitiría que se produjera el evento de transferencia de información tras la etapa de reunión, proporcionando de ese modo un mecanismo para compensar el primer evento perdido.

[0109] Los métodos proporcionados emplean el uso de una polimerasa, un reactivo de unión de ácido nucleico y un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. Puede usarse cualquier enzima adecuada para la extensión, ligamiento, y escisión de ácidos nucleicos bicatenarios (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente n.<os>CN104212791B, CN101560538A, y CN100510069C).

[0111] En los métodos proporcionados, la transferencia de información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro comienza con una etapa de ligamiento. El extremo 5’ de la etiqueta de registro se une (por ejemplo, se liga) al extremo 3’ de la etiqueta de codificación mediante un reactivo de unión de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente de unión no permanece unido o no necesita permanecer unido a la macromolécula después de que la etiqueta de registro se una a la etiqueta de codificación mediante el reactivo de unión de ácido nucleico.

[0112] En algunos ejemplos, el reactivo de unión de ácido nucleico es un reactivo de ligamiento químico o un reactivo de ligamiento enzimático. La etapa de ligamiento puede realizarse mediante ligamiento químico o ligamiento enzimático (por ejemplo, un ligamiento de extremos pegajosos, un ligamiento monocatenario (mc) tal como un ligamiento de ADNmc, o cualquier combinación de los mismos). En algunos diseños, el ligamiento puede ser un ligamiento de extremos romos y/o ligamiento de extremos pegajosos. El método de codificación secuencial proporcionado está diseñado para generar una estructura bicatenaria que comprende información transferida desde la etiqueta de codificación, y puede aplicarse cualquiera método de unión que logre esté propósito. Los ejemplos de ligasas incluyen, pero no se limitan a, ADN ligasa de CV, CircLigase, CircLigase II, ADN ligasa de T4, ADN ligasa de T7, ADN ligasa de T3, ADN ligasa de Taq, ADN ligasa deE. coli, ADN ligasa de 9°N (véanse, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.º US 2014/0378315 A1 o la patente estadounidense n.º 10.494.671 B2). En algunas realizaciones preferidas, el reactivo de unión de ácido nucleico se refiere a una enzima (por ejemplo, ligasa) que une dos segmentos de ADN, tal como una ADN ligasa de T4.

[0114] A la etapa de unión o ligamiento le sigue una etapa de extensión, que puede incluir una reacción mediada por polimerasa (por ejemplo, extensión de cebador de ácido nucleico monocatenario o ácido nucleico bicatenario). La extensión del extremo 3’ de la etiqueta de registro (o etiqueta de registro ya extendida) se produce usando la etiqueta de codificación ligada como molde. Con la etapa de extensión, los sitios de enzima de restricción/endonucleasa introducidos y ligados a partir de la etiqueta de codificación se vuelven bicatenarios en la etiqueta de registro extendida. En algunas realizaciones, una ADN polimerasa que se usa para la extensión de cebador posee actividad de desplazamiento de cadena y tiene actividad exonucleasa 3’-5’ limitada o está desprovista de ella. Varios de muchos ejemplos de tales polimerasas incluyen Klenow exo- (fragmento Klenow de ADN polimerasa 1), ADN polimerasa de T4 exo-, ADN polimerasa de T7 exo- (Sequenase 2.0), Pfu exo-, Vent exo-, Deep Vent exo-, fragmento grande de ADN polimerasa de Bst exo-, polimerasa de Bca, polimerasa de 9°N, y polimerasa de Phi29 exo-. En una realización preferida, la ADN polimerasa es activa a temperatura ambiente y hasta 45 ºC. En otra realización, se emplea una versión de “inicio caliente” de una polimerasa termófila de manera que la polimerasa se activa y se usa a aproximadamente 40 ºC-50 ºC. Una polimerasa de inicio caliente a modo de ejemplo es la ADN polimerasa de inicio caliente de Bst 2.0 (New England Biolabs). También pueden proporcionarse condiciones adecuadas para la reacción de extensión, incluyendo cualquier aditivo y tampón para la reacción.

[0116] Tras la etapa de extensión, se genera una etiqueta de registro extendida bicatenaria que contiene una secuencia de reconocimiento capaz de reconocerse por un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. La escisión de la etiqueta de registro extendida bicatenaria genera una proyección 3’ en la etiqueta de registro. En algunos aspectos, la proyección 3’ de la etiqueta de registro extendida generada mediante el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario está disponible para hibridarse con una segunda etiqueta de codificación cuando se repite la etapa (b). En algunos aspectos, la escisión de la etiqueta de registro extendida bicatenaria desancla o desliga el agente de unión a partir de la etiqueta de registro extendida. En algunos casos específicos, la escisión de la etiqueta de registro bicatenaria libera el agente de unión de la etiqueta de registro extendida. En algunos casos, la escisión hace que el agente de unión pueda liberarse a partir de la macromolécula que está analizándose. El reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario puede ser una enzima de restricción o endonucleasa de restricción. En algunas realizaciones, la enzima de restricción es una enzima de restricción de tipo IIS. La ventaja de usar una enzima de restricción de tipo IIS incluye que puede generar menos nucleótidos monocatenarios que quedan tras la reacción de escisión en comparación con una enzima de restricción palindrómica clásica, tal como se muestra en la figura 1B y el ejemplo 2 (espaciador de tan sólo 2 nt). En algunas realizaciones preferidas, la secuencia tras la escisión mediante el reactivo de escisión deja una proyección 3’. Por ejemplo, el reactivo de escisión puede ser la enzima BtsI, Mva1269I, BsaI, BsmBI, y otras. La enzima de restricción de tipo IIS puede reconocer una secuencia de bases que comprende: 5’...GCAGTGNN...3’/3’...CGTCACNN...5’. En algunos casos particulares, la enzima de restricción es Nb.BtsI o BtsI-v2, o un derivado de las mismas.

[0118] En algunas otras realizaciones, el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario es una enzima de restricción de tipo IIP que tiene especificidad palindrómica y que se escinde dentro de su secuencia de reconocimiento. Para evitar la potencial recreación del sitio de corte de enzima de restricción en el sitio de ligamiento tras el ligamiento de la etiqueta de codificación a la etiqueta de registro (véase, por ejemplo, la figura 1B, primera etapa), la secuencia de etiqueta de codificación adyacente al sitio de ligamiento debe ser diferente del sitio de corte de enzima. En algunas realizaciones preferidas, una enzima de restricción de tipo IIP genera una proyección 3’ en la etiqueta de registro tras la escisión, tal como se muestra en la figura 1B. En algunas otras realizaciones, puede adoptarse una enzima de restricción de tipo IIP que genera un extremo romo para su uso en los métodos dados a conocer. En estas realizaciones, el extremo 3’ de la etiqueta de codificación debe ligarse al extremo romo de la etiqueta de registro generado tras la escisión por enzima de restricción, y la secuencia de etiqueta de codificación adyacente al sitio de ligamiento debe ser diferente del sitio de corte de enzima de restricción.

[0120] En algunas otras realizaciones, puede usarse una combinación de enzimas o endonucleasas para lograr el corte de ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida. Por ejemplo, si se usa una enzima o endonucleasa de mellado para cortar una primera cadena de la etiqueta de recodificación extendida, entonces pueden emplearse un mecanismo secundario para cortar la segunda cadena. En algunas realizaciones específicas, no se usa una enzima de mellado o una endonucleasa de mellado. Una enzima de restricción apropiada puede seleccionarse basándose en consideraciones para los sitios de corte preferidos, la distancia entre la posición de digestión y la posición de reconocimiento, la precisión de la posición de digestión, y la capacidad para generar el extremo de ácido nucleico necesario para otras etapas del método.

[0122] En algunas realizaciones, el reactivo de unión de ácido nucleico y la polimerasa se proporcionan simultáneamente. En algunas realizaciones, la polimerasa y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario se proporcionan simultáneamente.

[0123] En algunas de las realizaciones proporcionadas, las etapas (a), (b), (c), (d) y (e) se realizan secuencialmente. En determinadas realizaciones, la información de evento de unión del agente de unión a la macromolécula (por ejemplo, péptido) se transfiere desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro asociada con la macromolécula inmovilizada de manera cíclica. En algunas realizaciones, las etapas repetidas una o más veces incluyen: (b) poner en contacto la macromolécula con un agente de unión capaz de unirse a la macromolécula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta de codificación con información identificativa sobre el agente de unión, para permitir la unión entre la macromolécula y el agente de unión; (c) unir el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación mediante un reactivo de unión de ácido nucleico; (d) extender la etiqueta de registro usando la etiqueta de codificación como molde mediante una polimerasa, generando una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (e) escindir la etiqueta de registro extendida bicatenaria con un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para generar una proyección 3’ en la etiqueta de registro extendida.

[0124] En algunas realizaciones, el método incluye además retirar el agente de unión. Por ejemplo, el agente de unión puede retirarse tras transferir la información de la etiqueta de codificación a la etiqueta de registro. Una vez realizado un ciclo de codificación, el agente de unión puede retirarse antes de repetir la etapa (b). El agente de unión puede retirarse o liberarse proporcionando condiciones apropiadas (por ejemplo, reactivos y temperatura) durante un lavado.

[0125] En algunas realizaciones, el método incluye además retirar una porción de la macromolécula antes de repetir la etapa (b). Por ejemplo, si está analizándose un polipéptido, el método puede incluir retirar uno o más aminoácidos (por ejemplo, del extremo terminal) del polipéptido antes de repetir la etapa (b). En algunos casos, el aminoácido N-terminal (NTAA) se retira del polipéptido para exponer un nuevo NTAA del polipéptido antes de repetir la etapa (b). En algunas realizaciones, la porción retirada de la macromolécula se trata con, o se ha modificado mediante, un agente químico o un agente enzimático. En algunos casos, el polipéptido se trata con el reactivo para modificar un aminoácido terminal del polipéptido. La modificación del polipéptido, tal como el NTAA, puede realizarse antes de la etapa (b). En algunos casos, la modificación del polipéptido, tal como el NTAA, puede realizarse después de la etapa (e).

[0126] En algunos casos, el método incluye además una o más etapas de lavado antes de, entre, o después de una cualquiera o más de las etapas. Por ejemplo, tras proporcionar el agente de unión en la etapa (b), puede realizarse una etapa de lavado antes de introducir cualquiera de los reactivos enzimáticos (por ejemplo, reactivo de unión de ácido nucleico, polimerasa, reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario). Una etapa de lavado de este tipo puede retirar agentes de unión unidos de manera inespecífica. La rigurosidad de la etapa de lavado puede ajustarse dependiendo de la afinidad del agente de unión. En algunos casos, es preferible que no se requieran etapas de lavado entre las etapas (c), (d), y (e). En algunos otros aspectos, se realiza una etapa de lavado tras el ligamiento de la etapa (c). Tras el ligamiento y el lavado, las etapas posteriores que implican la polimerasa y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario pueden proporcionarse en una etapa. En algunos otros aspectos, se realiza una etapa de lavado tras la extensión de la etapa (d). En algunos casos, se realiza una etapa de lavado antes de la etapa (c), la etapa (d), y/o la etapa (e). Tras producirse el ligamiento y la extensión en una etapa, puede realizarse una etapa de lavado antes de proporcionar el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. En algunos casos, el método incluye además retirar el agente de unión después de que se transfiera información a la etiqueta de recodificación, tal como después de la etapa (e) y/o antes de que se repita la etapa (b) en un ciclo posterior.

[0127] En algunas realizaciones, se realiza un ciclo de transferencia de información final para proporcionar una secuencia de remate de extremos a la etiqueta de registro extendida, en el que, opcionalmente, la secuencia de remate de extremos comprende un sitio de cebado universal para la amplificación, la secuenciación, o ambas. La secuencia de remate de extremos puede proporcionarse a la etiqueta de registro extendida mediante un agente de unión que está configurado para unirse a un rasgo característico universal de las macromoléculas. De esta manera, el agente de unión para suministrar una secuencia de remate de extremos está configurado para unirse a un resto diana contenido por la totalidad o muchas de las macromoléculas en la muestra. En algunos ejemplos, el rasgo característico universal es una modificación química de los polipéptidos. La secuencia de remate de extremos puede incluir una secuencia útil para el análisis de la etiqueta de registro extendida, tal como un sitio de cebado inverso universal.

[0128] A. Etiqueta de registro

[0129] La macromolécula (por ejemplo, proteína o polipéptido) para su análisis puede marcarse con una etiqueta de registro que comprende una molécula de ácido nucleico o un oligonucleótido. En algunos aspectos, se proporciona una pluralidad de macromoléculas en la muestra con etiquetas de registro. Las etiquetas de registro pueden estar asociadas o unidas, de manera directa o indirecta, a las macromoléculas usando cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, una macromolécula puede estar asociada con una o más etiquetas de registro. En algunos aspectos, las etiquetas de registro pueden estar asociadas o unidas, de manera directa o indirecta, a las macromoléculas antes de ponerse en contacto con un agente de unión.

[0130] En algunas realizaciones, al menos una etiqueta de registro está asociada o colocalizada de manera directa o indirecta con la macromolécula (por ejemplo, polipéptido). Proporcionar una macromolécula y una etiqueta de registro asociada en la etapa (a) puede incluir tratar la etiqueta de registro y cualquier ácido nucleico asociado para unir, escindir, o preparar de otro modo la etiqueta de registro para el ensayo. En algunas realizaciones, la etapa (a) incluye usar ligamiento y/o extensión para proporcionar el código de barras y/o el UMI a la etiqueta de registro. En algunos aspectos, la etapa (a) incluye escindir la etiqueta de registro usando una enzima de restricción para generar una proyección 3’. Por ejemplo, la proyección 3’ de la etiqueta de registro se genera mediante extensión usando una polimerasa y/o escisión mediante un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. En la figura 1A se muestra un flujo de trabajo a modo de ejemplo para preparar y proporcionar la etiqueta de registro.

[0132] En una realización particular, se une una única etiqueta de registro a un polipéptido, tal como mediante la unión a un aminoácido N-terminal o C-terminal. En otra realización, se unen múltiples etiquetas de registro al polipéptido, tal como a los residuos de lisina o la estructural principal peptídica. En algunas realizaciones, un polipéptido marcado con múltiples etiquetas de registro se fragmenta o digiere para dar péptidos más pequeños, estando cada péptido marcado, en promedio, con una etiqueta de registro.

[0134] Una etiqueta de registro puede comprender ADN, ARN, o análogos de polinucleótidos incluyendo PNA, gPNA, GNA, HNA, BNA, XNA, TNA, o una combinación de los mismos. Una etiqueta de registro puede ser monocatenaria, o parcial o completamente bicatenaria. En algunas realizaciones particulares, determinadas ventajas acompañan a una etiqueta de registro que comprende una región bicatenaria. Por ejemplo, una ventaja puede ser interacciones ADN-ADN reducidas con otros componentes de ácido nucleico del sistema. En algunos casos, la etiqueta de registro incluye una horquilla de ácido nucleico. Una etiqueta de registro puede tener un extremo romo o un extremo saliente. En algunas realizaciones particulares, la etiqueta de registro asociada con la macromolécula se procesa o trata (por ejemplo, mediante digestión) de manera que tenga una proyección 3’. En determinadas realizaciones, la totalidad o una cantidad sustancial de las macromoléculas (por ejemplo, al menos el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, o el 100 %) dentro de una muestra se marca con una etiqueta de registro. En otras realizaciones, un subconjunto de macromoléculas dentro de una muestra se marca con etiquetas de registro. En una realización particular, un subconjunto de macromoléculas de una muestra se somete a marcaje dirigido (específico de analito) con etiquetas de registro. Por ejemplo, el marcaje de etiqueta de registro dirigido de proteínas puede lograrse usando agentes de unión específicos de proteína diana (por ejemplo, anticuerpos, aptámeros, etc.). En algunas realizaciones, las etiquetas de registro (o una porción de las mismas) se unen a las macromoléculas antes de proporcionar la muestra en un soporte. En algunas realizaciones, las etiquetas de registro se unen a las macromoléculas después de proporcionar la muestra en el soporte.

[0136] En algunas realizaciones, la etiqueta de registro puede comprender otros componentes de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la etiqueta de registro puede comprender un identificador molecular único, una etiqueta de compartimento, un código de barras de partición, un código de barras de muestra, un código de barras de fracción, una secuencia de espaciador, un sitio de cebado universal, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la etiqueta de registro puede comprender un grupo bloqueante, tal como en el extremo terminal 3’ de la etiqueta de registro. En algunos casos, se bloquea el extremo terminal 3’ de la etiqueta de registro para impedir la extensión de la etiqueta de registro mediante una polimerasa.

[0138] En algunas realizaciones, la etiqueta de registro puede incluir un código de barras identificativo de muestra. Un código de barras de muestra es útil en el análisis multiplexado de un conjunto de muestras en un único recipiente de reacción o inmovilizadas sobre un único sustrato sólido o una colección de sustratos sólidos (por ejemplo, un portaobjetos plano, una población de perlas contenidas en un único tubo o recipiente, etc.). Por ejemplo, las macromoléculas de muchas muestras diferentes pueden marcarse con etiquetas de registro con códigos de barras específicos de muestra, y entonces agruparse juntas la totalidad de las muestras antes de la inmovilización sobre un soporte, la unión cíclica del agente de unión, y el análisis de etiquetas de registro. Alternativamente, las muestras pueden mantenerse separadas hasta después de la creación de una biblioteca codificada por ADN, y los códigos de barras de muestra pueden unirse durante la amplificación por PCR de la biblioteca codificada por ADN, y entonces mezclarse juntos antes de secuenciación. Este enfoque podría ser útil cuando se someten a ensayo analitos (por ejemplo, proteínas) de diferentes clases de abundancia.

[0140] En determinadas realizaciones, una etiqueta de registro comprende un identificador molecular único (UMI) opcional, que proporciona una etiqueta de identificador único para cada macromolécula (por ejemplo, polipéptido) con la que está asociada el UMI. Un UMI puede tener de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 bases, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 bases, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 bases, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 bases, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 bases. En algunas realizaciones, un UMI tiene aproximadamente 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, 10 bases, 11 bases, 12 bases, 13 bases, 14 bases, 15 bases, 16 bases, 17 bases, 18 bases, 19 bases, 20 bases, 25 bases, 30 bases, 35 bases, o 40 bases de longitud. Un UMI puede usarse para deconvolucionar datos de secuenciación de una pluralidad de etiquetas de registro extendidas para identificar lecturas de secuencia de macromoléculas individuales. En algunas realizaciones, dentro de una biblioteca de macromoléculas, cada macromolécula está asociada con una única etiqueta de registro, comprendiendo cada etiqueta de registro un único UMI. En otras realizaciones, múltiples copias de una etiqueta de registro están asociadas con una única macromolécula, comprendiendo cada copia de la etiqueta de registro el mismo UMI. En algunas realizaciones, un UMI tiene una secuencia de bases diferente del espaciador o las etiquetas de codificación para facilitar la distinción de estos componentes durante el análisis de secuencia. En algunas realizaciones, el UMI puede proporcionar función como identificador de ubicación y también proporcionar información en el ensayo de análisis de macromoléculas. Por ejemplo, el UMI puede usarse para identificar moléculas que son idénticas por ascendencia, y, por tanto, se originan a partir de la misma molécula inicial. En algunos aspectos, puede usarse esta información para corregir las variaciones en la amplificación, y para detectar y corregir los errores de secuenciación durante el análisis.

[0142] En algunas realizaciones, la etiqueta de registro comprende un polímero espaciador. En determinadas realizaciones, una etiqueta de registro comprende un espaciador en su extremo terminal, por ejemplo, extremo 3’. Tal como se usa en el presente documento, la referencia a una secuencia de espaciador en el contexto de una etiqueta de registro incluye una secuencia de espaciador que es idéntica a la secuencia de espaciador asociada con su agente de unión afín, o una secuencia de espaciador que es complementaria a la secuencia de espaciador asociada con su agente de unión afín. El espaciador terminal, por ejemplo, 3’, en la etiqueta de registro permite la transferencia de información identificativa de un agente de unión afín desde una etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro durante el primer ciclo de unión (por ejemplo, mediante hibridación de secuencias de espaciador complementarias para la extensión de cebador o la ligamiento de extremos pegajosos). En una realización, la secuencia de espaciador tiene aproximadamente 1-20 bases de longitud, aproximadamente 2-12 bases de longitud, o 5-10 bases de longitud. En algunos casos, la secuencia de espaciador tiene aproximadamente 2-5 bases de longitud. La longitud del espaciador puede depender de factores tales como la temperatura y las condiciones de reacción para transferir información de etiqueta de codificación a la etiqueta de registro.

[0144] En algunas realizaciones que usan secuencias de espaciador, las etiquetas de registro asociadas con una biblioteca de polipéptidos comparten una secuencia de espaciador común. En otras realizaciones, las etiquetas de registro asociadas con una biblioteca de polipéptidos tienen secuencias de espaciador específicas de ciclo de unión que son complementarias a las secuencias de espaciador específicas de ciclo de unión de moléculas de adaptador. En algunos aspectos, la secuencia de espaciador en la etiqueta de registro está diseñada para tener una complementariedad mínima con otras regiones en la etiqueta de registro. En algunos casos, la secuencia de espaciador de las etiquetas de registro debe tener una complementariedad de secuencia mínimas con componentes tales como los identificadores moleculares únicos, los códigos de barras (por ejemplo, compartimento, partición, muestra, ubicación espacial), las secuencias de cebador universal, las secuencias de etiqueta de codificación, las secuencias específicas de ciclo, etc., presentes en las etiquetas de registro o codificación. En algunas realizaciones, el espaciador se diseña basándose en el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, enzima de restricción) seleccionado para su uso.

[0146] En determinadas realizaciones, una etiqueta de registro comprende un sitio de cebado universal, por ejemplo, un sitio de cebado universal directo o 5’. Un sitio de cebado universal es una secuencia de ácido nucleico que puede usarse para el cebado de una reacción de amplificación de biblioteca y/o para la secuenciación. Un sitio de cebado universal puede incluir, pero no se limita a, un sitio de cebado para la amplificación por PCR, secuencias de adaptador de celda de flujo que se hibridan con oligonucleótidos complementarios en las superficies de celda de flujo (por ejemplo, secuenciación de nueva generación de Illumina), un sitio de cebado de secuenciación, o una combinación de los mismos. Un sitio de cebado universal puede tener de aproximadamente 10 bases a aproximadamente 60 bases. En algunas realizaciones, un sitio de cebado universal comprende un cebador P5 de Illumina (AATGATACGGCGACCACCGA; SEQ ID NO: 1) o un cebador P7 de Illumina (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT; SEQ ID NO: 2).

[0148] En determinadas realizaciones, una etiqueta de registro comprende una etiqueta de compartimento. En algunas realizaciones, la etiqueta de compartimento es un componente dentro de una etiqueta de registro. En algunas realizaciones, la etiqueta de registro también puede incluir un código de barras que representa una etiqueta de compartimento en la que a un compartimento, tal como una gotita, un micropocillo, una región física en un soporte, etc., se le asigna un código de barras único. La asociación de un compartimento con un código de barras específico puede lograrse de varias maneras tales como encapsulando una única perla con código de barras en un compartimento, por ejemplo, fusionando o añadiendo directamente una gotita con código de barras a un compartimento, imprimiendo o inyectando directamente reactivos de código de barras en un compartimento, etc. Los reactivos de código de barras dentro de un compartimento se usan para añadir códigos de barras específico de compartimento a la macromolécula o a fragmentos de la misma dentro del compartimento. Aplicados a la partición de proteínas para dar compartimentos, los códigos de barras pueden usarse para mapear péptidos analizados de vuelta a sus moléculas de proteína de origen en el compartimento. Esto puede facilitar en gran medida la identificación de proteínas. También pueden usarse códigos de barras de compartimento para identificar complejos proteicos. En otras realizaciones, a múltiples compartimentos que representan un subconjunto de una población de compartimentos pueden asignárseles un código de barras único que represente el subconjunto. En algunas realizaciones, la etiqueta de registro comprende un código de barras de fracción que contiene información identificativa para las macromoléculas dentro de una fracción.

[0150] En algunas realizaciones, una o más de las etiquetas (por ejemplo, una etiqueta de compartimento, un código de barras de partición, un código de barras de muestra, un código de barras de fracción, etc.) comprenden además un resto funcional capaz de reaccionar con un aminoácido interno, la estructural principal peptídica, o el aminoácido N-terminal en la pluralidad de complejos proteicos, proteínas, o polipéptidos. En algunas realizaciones, el resto funcional es un resto de química clic, un aldehído, una azida/alquino, o una maleimida/tiol, o un epóxido/nucleófilo, un grupo de Diels-Alder de demanda inversa de electrones (iEDDA), o un resto para una reacción de Staudinger. En algunas realizaciones específicas, se forma una pluralidad de etiquetas de compartimento mediante impresión, disposición en forma de manchas, inyección con chorro de tinta de las etiquetas de compartimento en el compartimento, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la etiqueta se une a un polipéptido para ligar la etiqueta a la macromolécula a través de un enlace polipéptido-polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido unido a etiqueta comprende una secuencia de reconocimiento de proteína ligasa.

[0152] En determinadas realizaciones, una macromolécula de péptido o polipéptido puede inmovilizarse sobre un soporte mediante un reactivo de captura por afinidad (y opcionalmente reticularse covalentemente), en la que la etiqueta de registro está asociada con el reactivo de captura por afinidad directamente, o alternativamente, la macromolécula puede inmovilizarse directamente sobre el soporte con una etiqueta de registro.

[0154] En algunas realizaciones, la macromolécula se une a un ácido nucleico cebo para formar una quimera de ácido nucleico-macromolécula. Los métodos de inmovilización pueden comprender poner la quimera de ácido nucleicomacromolécula en proximidad con un soporte hibridando el ácido nucleico cebo con un ácido nucleico de captura unido al soporte, y acoplar covalentemente la quimera de ácido nucleico-macromolécula al soporte sólido. En algunos casos, la quimera de ácido nucleico-macromolécula se acopla indirectamente al soporte sólido, tal como mediante un ligador. En algunas realizaciones, una pluralidad de las quimeras de ácido nucleico-macromolécula se acoplan al soporte sólido y cualesquiera quimeras de ácido nucleico-macromolécula acopladas de manera adyacente están separadas entre sí una distancia promedio de aproximadamente 50 nm o superior. El ácido nucleico cebo incluye en algunos casos un sitio de cebado universal o una porción del mismo.

[0156] Tal como se muestra en un formato a modo de ejemplo en la figura 1A, un péptido que va a analizarse se une a un ácido nucleico cebo que se hibrida con una horquilla de ácido nucleico de captura inmovilizada sobre un soporte. El ácido nucleico cebo se liga al ácido nucleico de captura que comprende un resto de acoplamiento reactivo para unirse al soporte. En algunos ejemplos, el ácido nucleico cebo o de captura, o el ácido nucleico cebo y de captura unidos, pueden servir como etiqueta de registro a la que puede transferirse información sobre el polipéptido desde una etiqueta de codificación.

[0158] La figura 1A muestra etapas a modo de ejemplo para preparar la etiqueta de registro que usa un ácido nucleico de captura que comprende o es una horquilla de ácido nucleico con un extremo 5’ fosforilado rebajado. En el segundo panel de la figura 1A, el ácido nucleico cebo con el péptido unido se hibrida con, y se liga a, la horquilla de ácido nucleico de captura. El ácido nucleico cebo puede comprender uno o más códigos de barras tal como se muestra y también puede contener un sitio de enzima de restricción (o un sitio de enzima de restricción parcial). En el tercer panel de la figura 1A, se usa una reacción de polimerasa para extender el extremo 3’ de la horquilla de ácido nucleico de captura, generando un constructo de etiqueta de registro bicatenario con el péptido unido. Una vez que se produce la extensión usando el ácido nucleico cebo como molde, el sitio de digestión es bicatenario y puede reconocerse por una enzima de restricción de tipo IIS para su escisión, y la escisión produce una etiqueta de registro con una proyección 3’ (secuencia de 2 pares de bases) con un extremo 5’ fosforilado rebajado. Esta etiqueta de registro que contiene uno o más códigos de barras está disponible para la transferencia de información desde una etiqueta de codificación. En algunas realizaciones, la preparación de la macromolécula para su análisis con una etiqueta de registro y su inmovilización sobre un soporte pueden realizarse usando cualquiera de los métodos tal como se describen en la publicación de patente internacional WO 2020/223000 A1. La preparación y/o la inmovilización de las macromoléculas pueden realizarse antes de las etapas de transferencia de información y/o por separado de las etapas de transferencia de información.

[0160] En algunas realizaciones, se controla o titula la densidad o el número de macromoléculas dotadas de una etiqueta de registro. En algunos ejemplos, la separación, la densidad, y/o la cantidad deseadas de etiquetas de registro en la muestra pueden titularse proporcionando un número reducido o controlado de etiquetas de registro. En algunos ejemplos, la separación, la densidad, y/o la cantidad deseadas de etiquetas de registro pueden lograrse realizando adiciones conocidas de una molécula competidora o competidora “ficticia” cuando se proporcionan, asocian, y/o unen las etiquetas de registro. En algunos casos, la molécula competidora “ficticia” reacciona de la misma manera que una etiqueta de registro que está asociada o unida a una macromolécula en la muestra, pero la molécula competidora no funciona como una etiqueta de registro. En algunos ejemplos específicos, si una densidad deseada es de 1 etiqueta de registro funcional por 1.000 sitios disponibles para la unión en la muestra, entonces se usan adiciones conocidas en 1 etiqueta de registro funcional por cada 1.000 moléculas competidoras “ficticias” para lograr la separación deseada. En algunos ejemplos, la razón de etiquetas de registro funcionales se ajusta basándose en la velocidad de reacción de las etiquetas de registro funcionales en comparación con la velocidad de reacción de las moléculas competidoras.

[0162] En algunos ejemplos, el marcaje de la macromolécula con una etiqueta de registro se realiza usando químicas de acoplamiento de amina convencionales. Por ejemplo, el grupo ε-amino (por ejemplo, de residuos de lisina) y el grupo amino N-terminal pueden ser susceptibles de marcaje con agentes de acoplamientos reactivos con amina, dependiendo del pH de la reacción (Mendozaet al., Mass Spectrom Rev (2009) 28(5): 785-815). En una realización particular, la etiqueta de registro comprende un resto reactivo (por ejemplo, para su conjugación con una superficie sólida, un ligador multifuncional, o una macromolécula), un ligador, una secuencia de cebado universal, un código de barras (por ejemplo, una etiqueta de compartimento, un código de barras de partición, un código de barras de muestra, un código de barras de fracción, o cualquier combinación de los mismos), un UMI opcional, y una secuencia de espaciador (Sp) para facilitar la transferencia de información. En otra realización, la proteína puede marcarse en primer lugar con una etiqueta de ADN universal, y la secuencia de Sp-código de barras (que representa una muestra, un compartimento, una ubicación física en un portaobjetos, etc.) se une posteriormente a la proteína a través de una etapa de acoplamiento enzimático o químico. Una etiqueta de ADN universal comprende una secuencia corta de nucleótidos que se usan para marcar una macromolécula de proteína o polipéptido y puede usarse como punto de unión para un código de barras (por ejemplo, etiqueta de compartimento, etiqueta de registro, etc.). Por ejemplo, una etiqueta de registro puede comprender en su extremo terminal una secuencia complementaria a la etiqueta de ADN universal. En determinadas realizaciones, una etiqueta de ADN universal es una secuencia de cebado universal. Tras la hibridación de las etiquetas de ADN universales en la proteína marcada con la secuencia complementaria en las etiquetas de registro (por ejemplo, unida a perlas), la etiqueta de ADN universal hibridada puede extenderse mediante extensión de cebador, transfiriendo la información de etiqueta de registro a la proteína etiquetada con ADN. En una realización particular, la proteína se marca con una etiqueta de ADN universal antes de la digestión con proteinasa para dar péptidos. Las etiquetas de ADN universales en los péptidos marcados del producto digerido pueden convertirse entonces en una etiqueta de registro informativa y efectiva.

[0163] Las etiquetas de registro pueden comprender un resto reactivo para un resto reactivo afín presente en la macromolécula, por ejemplo, proteína (por ejemplo, marcaje por química clic, marcaje por fotoafinidad). Por ejemplo, las etiquetas de registro pueden comprender un resto de azida para interactuar con proteínas derivatizadas con alquino, o las etiquetas de registro pueden comprender una benzofenona para interactuar con proteínas nativas, etc. Tras la unión de la proteína diana mediante el agente de unión específico de proteína diana, la etiqueta de registro y la proteína diana se acoplan a través de sus restos reactivos correspondientes. Después de marcar la proteína diana con la etiqueta de registro, puede retirarse el agente de unión específico de proteína diana mediante digestión de la sonda de captura de ADN ligada al agente de unión específico de proteína diana. Por ejemplo, la sonda de captura de ADN puede diseñarse para contener bases de uracilo, que luego se seleccionan como diana para su digestión con un reactivo de escisión específico de uracilo (por ejemplo, USER<™>), y el agente de unión específico de proteína diana puede disociarse de la proteína diana. En algunas realizaciones, pueden usarse otros tipos de enlaces además de la hibridación para ligar la etiqueta de registro a una macromolécula. Puede unirse un ligador adecuado a diversas posiciones de la etiqueta de registro, tales como el extremo 3’, en una posición interna, o dentro del ligador unido al extremo 5’ de la etiqueta de registro.

[0164] La información de una o más etiquetas de codificación se transfiere a la etiqueta de registro para generar una etiqueta de registro extendida. En algunas realizaciones, una etiqueta de registro extendida comprende una secuencia de cebado directo (o 5’) universal, información transferida desde una o más etiquetas de codificación, y una secuencia de espaciador. En algunas realizaciones, una etiqueta de registro extendida comprende una secuencia de cebado directo (o 5’) universal, cualesquiera códigos de barras y/o UMI opcionales (por ejemplo, código de barras de muestra, código de barras de partición, código de barras de compartimento, o cualquier combinación de los mismos), información transferida desde una o más etiquetas de codificación, una secuencia de espaciador, y una secuencia de cebado inverso (o 3’) universal.

[0165] B. Agente de unión

[0166] Los métodos descritos en el presente documento usan un agente de unión configurado para interactuar con las macromoléculas que van a analizarse (por ejemplo, polipéptidos, péptidos, proteínas). El ensayo puede incluir poner en contacto una pluralidad de agentes de unión con una pluralidad de macromoléculas. En algunas realizaciones, los presentes métodos comprenden poner en contacto una única macromolécula con un único agente de unión, poner en contacto una pluralidad de macromoléculas con un único agente de unión, o poner en contacto una pluralidad de macromoléculas con una pluralidad de agentes de unión. En algunas realizaciones, la pluralidad de agentes de unión incluye una mezcla de agentes de unión configurados para unirse a restos diana diferentes.

[0167] Un agente de unión puede ser cualquier molécula (por ejemplo, péptido, polipéptido, proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, molécula pequeña, y similares) capaz de unirse a un componente o rasgo característico de un polipéptido. Un agente de unión puede ser una molécula producida de manera natural, producida de manera sintética, o expresada de manera recombinante. En algunas realizaciones, el armazón usado para modificar por ingeniería un agente de unión puede ser de cualquier especie, por ejemplo, humano, no humano, transgénico. Un agente de unión puede unirse a una porción de una macromolécula diana o un motivo. Un agente de unión puede unirse a un único monómero o una única subunidad de un polipéptido (por ejemplo, un único aminoácido) o unirse a múltiples subunidades ligadas de un polipéptido (por ejemplo, un dipéptido, tripéptido, o péptido de orden superior de una molécula de polipéptido más larga).

[0168] En algunos ejemplos, el agente de unión comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo sólo de cadena pesada recombinante (VHH), un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un dominio variable derivado de tiburón (vNAR), un Fv, un Fab, un Fab’, un F(ab’)2, un anticuerpo lineal, un diacuerpo, un aptámero, una molécula mimética de péptido, una proteína de fusión, una molécula pequeña reactiva o no reactiva, o una molécula sintética.

[0169] En determinadas realizaciones, un agente de unión puede diseñarse para unirse covalentemente. La unión covalente puede diseñarse para estar condicionada o favorecida tras la unión al resto correcto. Por ejemplo, una diana y su agente de unión afín pueden modificarse, cada uno, con un grupo reactivo de manera que, una vez que el agente de unión específico de diana se une a la diana, se lleva a cabo una reacción de acoplamiento para crear un enlace covalente entre los dos. La unión inespecífica del agente de unión a otras ubicaciones que carecen del grupo reactivo afín no daría como resultado una unión covalente. En algunas realizaciones, la diana comprende un ligando que es capaz de formar un enlace covalente con un agente de unión. En algunas realizaciones, la diana comprende un grupo de ligando que es capaz de unirse covalentemente a un agente de unión. La unión covalente entre un agente de unión y su diana puede permitir el uso de un lavado más riguroso para retirar los agentes de unión que se unen de manera inespecífica, aumentándose así la especificidad del ensayo. En algunas realizaciones, el método incluye una etapa de lavado tras poner en contacto el agente de unión con la macromolécula para retirar los agentes de unión unidos de manera inespecífica. La rigurosidad de la etapa de lavado puede ajustarse dependiendo de la afinidad del agente de unión por la diana y/o la resistencia y estabilidad del complejo formado.

[0171] En algunas realizaciones, los agentes de unión están configurados para proporcionar especificidad para la unión del agente de unión a la macromolécula. En determinadas realizaciones, un agente de unión puede ser un agente de unión selectivo. Tal como se usa en el presente documento, unión selectiva se refiere a la capacidad del agente de unión de unirse preferentemente a un ligando específico (por ejemplo, aminoácido o clase de aminoácidos) con respecto a la unión a un ligando diferente (por ejemplo, aminoácido o clase de aminoácidos). La selectividad se denomina comúnmente constante de equilibrio para la reacción de desplazamiento de un ligando por otro ligando en un complejo con un agente de unión. Normalmente, tal selectividad está asociada con la geometría espacial del ligando y/o la manera y el grado mediante los cuales el ligando se une a un agente de unión, tal como mediante formación de enlaces de hidrógeno, unión hidrófoba, y fuerzas de Van der Waals (interacciones no covalentes), o mediante unión covalente reversible o no reversible al agente de unión. También debe entenderse que la selectividad puede ser relativa, y en contraposición a absoluta, y que diferentes factores pueden afectar a la misma, incluyendo la concentración de ligando. Por tanto, en un ejemplo, un agente de unión se une selectivamente a uno de los veinte aminoácidos convencionales. En algunos ejemplos, un agente de unión se une a un residuo de aminoácido N-terminal, un residuo de aminoácido C-terminal, o un residuo de aminoácido interno.

[0173] En algunas realizaciones, el agente de unión es parcialmente específico o selectivo. En algunos aspectos, el agente de unión se une preferentemente a uno o más aminoácidos. En algunos ejemplos, un agente de unión puede unirse a, o es capaz de unirse a, dos o más de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, un agente de unión puede unirse preferentemente a los aminoácidos A, C, y G con respecto a otros aminoácidos. En algunos otros ejemplos, el agente de unión puede unirse de manera selectiva o específica a más de un aminoácido. En algunos aspectos, el agente de unión también puede tener una preferencia por uno o más aminoácidos en las posiciones segunda, tercera, cuarta, quinta, etc., desde el aminoácido terminal. En algunos casos, el agente de unión se une preferentemente a un aminoácido terminal específico y un penúltimo aminoácido. Por ejemplo, un agente de unión puede unirse preferentemente a AA, AC, y AG o un agente de unión puede unirse preferentemente a AA, CA, y GA. En algunas realizaciones, un agente de unión puede presentar flexibilidad y variabilidad en la preferencia de unión a diana en algunas o la totalidad de las posiciones de las dianas. En algunos ejemplos, un agente de unión puede tener una preferencia por uno o más aminoácidos terminales diana específicos y tener una preferencia flexible por una diana en la penúltima posición. En algunos otros ejemplos, un agente de unión puede tener una preferencia por uno o más aminoácidos diana específicos en la penúltima posición de aminoácido y tener una preferencia flexible por una diana en la posición de aminoácido terminal. En algunas realizaciones, un agente de unión es selectivo para una diana que comprende un aminoácido terminal y otros componentes de una macromolécula. En algunos ejemplos, un agente de unión es selectivo para una diana que comprende un aminoácido terminal y al menos una porción de la estructural principal peptídica. En algunos ejemplos particulares, un agente de unión es selectivo para una diana que comprende un aminoácido terminal y una estructural principal peptídica de amida. En algunos casos, la estructural principal peptídica comprende una estructural principal peptídica natural o una modificación postraduccional. En algunas realizaciones, el agente de unión muestra unión alostérica.

[0175] En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una mezcla de agentes de unión con una mezcla de macromoléculas y sólo se necesita que la selectividad sea relativa con respecto a los otros agentes de unión a los que se expone la diana. También debe entenderse que la selectividad de un agente de unión no necesita ser absoluta con respecto a una molécula específica, sino que podría ser con respecto a una porción de una molécula. En algunos ejemplos, la selectividad de un agente de unión no necesita ser absoluta con respecto a un aminoácido específico, sino que podría ser selectiva con respecto a una clase de aminoácidos, tal como aminoácidos con cadenas laterales polares o apolares, o con cadenas laterales cargadas eléctricamente (de manera positiva o negativa), o con cadenas laterales aromáticas, o alguna clase o tamaño específico de cadenas laterales, y similares. En algunas realizaciones, la capacidad de un agente de unión para unirse selectivamente a un rasgo característico o componente de una macromolécula se caracteriza comparando las capacidades de unión de los agentes de unión. Por ejemplo, la capacidad de unión de un agente de unión a la diana puede compararse con la capacidad de unión de un agente de unión que se une a una diana diferente, por ejemplo, comparando un agente de unión selectivo para una clase de aminoácidos con un agente de unión selectivo para una clase de aminoácidos diferente. En algunos ejemplos, un agente de unión selectivo para cadenas laterales apolares se compara con un agente de unión selectivo para cadenas laterales polares. En algunas realizaciones, un agente de unión selectivo para un rasgo característico, un componente de un péptido, o uno o más aminoácidos, muestra al menos 1X, al menos 2X, al menos 5X, al menos 10X, al menos 50X, al menos 100X, o al menos 500X más de unión en comparación con un agente de unión selectivo para un rasgo característico, un componente de un péptido, o uno o más aminoácidos diferentes.

[0177] En una realización particular, el agente de unión tiene una alta afinidad y una alta selectividad por la macromolécula, por ejemplo, el polipéptido, de interés. En particular, una alta afinidad de unión con una baja velocidad de disociación puede ser eficaz para la hibridación de la molécula de adaptador con la etiqueta de codificación. En determinadas realizaciones, un agente de unión tiene una Kd de aproximadamente <500 nM, <200 nM, <100 nM, <50 nM, <10 nM, <5 nM, <1 nM, <0,5 nM, o <0,1 nM. En una realización particular, el agente de unión se añade al polipéptido a una concentración >1X, >5X, >10X, >100X, o >1000X su Kd para llevar la unión a su finalización. Por ejemplo, se describe la cinética de unión de un anticuerpo a una única molécula de proteína en Changet al., J Immunol Methods (2012) 378(1-2): 102-115.

[0179] En determinadas realizaciones, un agente de unión puede unirse a un aminoácido terminal de un péptido, un aminoácido intermedio, un dipéptido (secuencia de dos aminoácidos), un tripéptido (secuencia de tres aminoácidos) o un péptido de orden superior de una molécula de péptido. En algunas realizaciones, cada agente de unión en una biblioteca de agentes de unión se une selectivamente a un aminoácido particular, por ejemplo, uno de los veinte aminoácidos que se producen de manera natural convencionales. Los aminoácidos que se producen de manera natural convencionales incluyen alanina (A o Ala), cisteína (C o Cys), ácido aspártico (D o Asp), ácido glutámico (E o Glu), fenilalanina (F o Phe), glicina (G o Gly), histidina (H o His), isoleucina (I o Ile), lisina (K o Lys), leucina (L o Leu), metionina (M o Met), asparagina (N o Asn), prolina (P o Pro), glutamina (Q o Gln), arginina (R o Arg), serina (S o Ser), treonina (T o Thr), valina (V o Val), triptófano (W o Trp), y tirosina (Y o Tyr). En algunas realizaciones, el agente de unión se une a un aminoácido no modificado o nativo (por ejemplo, natural). En algunos ejemplos, el agente de unión se une a un dipéptido (secuencia de dos aminoácidos), tripéptido (secuencia de tres aminoácidos), o péptido de orden superior no modificado o nativo de una molécula de péptido. Un agente de unión puede modificarse por ingeniería para tener una alta afinidad por un aminoácido N-terminal (NTAA) nativo o no modificado, una alta especificidad por un NTAA nativo o no modificado, o ambas. En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden desarrollarse a través de la evolución dirigida de armazones de afinidad prometedores usando presentación en fagos.

[0181] En determinadas realizaciones, un agente de unión puede unirse a una modificación postraduccional de un aminoácido. En algunas realizaciones, un péptido comprende una o más modificaciones postraduccionales, que pueden ser iguales o diferentes. El NTAA, el CTAA, un aminoácido intermedio, o una combinación de los mismos de un péptido puede modificarse de manera postraduccional. Las modificaciones postraduccionales a los aminoácidos incluyen acilación, acetilación, alquilación (incluyendo metilación), biotinilación, butirilación, carbamilación, carbonilación, desamidación, desiminación, formación de diftamida, formación de puentes disulfuro, eliminilación, unión de flavina, formilación, gamma-carboxilación, glutamilación, glicilación, glicosilación, glipiación, unión de hemo C, hidroxilación, formación de hipusina, yodación, isoprenilación, lipidación, lipoilación, malonilación, metilación, miristoilación, oxidación, palmitoilación, pegilación, fosfopanteteinilación, fosforilación, prenilación, propionilación, formación de base de Schiff de retinilideno, S-glutationilación, S-nitrosilación, S-sulfenilación, selenación, succinilación, sulfinación, ubiquitinación, y amidación C-terminal (véase también Seo y Lee, 2004, J. Biochem. Mol. Biol.37:35-44).

[0183] En determinadas realizaciones, se usa una lectina como agente de unión para detectar el estado de glicosilación de una proteína, un polipéptido, o un péptido. Las lectinas son proteínas de unión a hidratos de carbono que reconocen selectivamente epítopos de glicano de glicoproteínas o hidratos de carbono libres. Una lista de lectinas que reconocen diversos estados de glicosilación (por ejemplo, fucosa de núcleo, ácidos siálicos, N-acetil-D-lactosamina, manosa, N-acetil-glucosamina) incluye: A, AAA, AAL, ABA, ACA, ACG, ACL, AOL, ASA, BanLec, BC2L-A, BC2LCN, BPA, BPL, Calsepa, CGL2, CNL, Con, ConA, DBA, discoidina, DSA, ECA, EEL, F17AG, Gal1, Gal1-S, Gal2, Gal3, Gal3C-S, Gal7-S, Gal9, GNA, GRFT, GS-I, GS-II, GSL-I, GSL-II, HHL, HIHA, HPA, I, II, jacalina, LBA, LCA, LEA, LEL, Lentil, Lotus, LSL-N, LTL, MAA, MAH, MAL_I, malectina, MOA, MPA, MPL, NPA, Orysata, PA-IIL, PA-IL, PALa, PHA-E, PHA-L, PHA-P, PHAE, PHAL, PNA, PPL, PSA, PSL1a, PTL, PTL-I, PWM, RCA120, RS-Fuc, SAMB, SBA, SJA, SNA, SNA-I, SNA-II, SSA, STL, TJA-I, TJA-II, TxLCI, UDA, UEA-I, UEA-II, VFA, VVA, WFA, WGA (véase Zhanget al., 2016, MABS 8:524-535).

[0185] En algunas realizaciones, un agente de unión puede unirse a un aminoácido terminal nativo o no modificado o no marcado o nativo. En algunos ejemplos, el agente de unión se une a un dipéptido (secuencia de dos aminoácidos), tripéptido (secuencia de tres aminoácidos), o péptido de orden superior no modificado o nativo de una molécula de péptido. Un agente de unión puede modificarse por ingeniería para una alta afinidad por un NTAA modificado, una alta especificidad por un NTAA modificado, o ambas. En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden desarrollarse a través de la evolución dirigida de armazones de afinidad prometedores usando presentación en fagos.

[0187] Puede usarse evolución dirigida de armazones de proteína/enzima para generar agentes de unión de mayor afinidad y mayor especificidad que reconocen los aminoácidos N-terminales en el contexto de un marcador N-terminal. En un ejemplo, Havranaket al. (publicación de patente estadounidense n.º US 2014/0273004) describen la modificación por ingeniería de aminoacil-ARNt sintetasas (aaRS) como grupos de unión a NTAA específicos. El bolsillo de unión de aminoácidos de las aaRS tiene una capacidad intrínseca de unirse a aminoácidos afines, pero generalmente muestra una especificidad y una afinidad unión deficientes. Además, estos grupos de unión de aminoácidos naturales no reconocen marcadores N-terminales. Puede usarse evolución dirigida de armazones de aaRS para generar agentes de unión de mayor afinidad y mayor especificidad que reconocen los aminoácidos N-terminales en el contexto de un marcador N-terminal.

[0189] En determinadas realizaciones, un agente de unión puede unirse a un aminoácido terminal modificado o marcado (por ejemplo, un NTAA que se ha funcionalizado o modificado). En algunas realizaciones, un agente de unión puede unirse a un aminoácido terminal modificado de manera química o enzimática. Un NTAA modificado o marcado puede ser uno que está funcionalizado con fenilisotiocianato, PITC, 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (reactivo de Sanger, DNFB), cloruro de benciloxicarbonilo o cloruro de carbobenzoxilo (Cbz-Cl), N-(benciloxicarboniloxi)succinimida (Cbz-OSu o Cbz-O-NHS), cloruro de dansilo (DNS-Cl, o cloruro de 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo), 4-sulfonil-2-nitrofluorobenceno (SNFB), anhídrido N-acetil-isatoico, anhídrido isatoico, 2-piridin-carboxaldehído, ácido 2-formilfenilborónico, ácido 2-acetilfenilborónico, 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, anhídrido succínico, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, pentafluorofenilisotiocianato, 4-(trifluorometoxi)-fenilisotiocianato, 4-(trifluorometil)-fenilisotiocianato, 3-( ácido carboxílico)-fenilisotiocianato, 3-(trifluorometil)-fenilisotiocianato, 1-naftilisotiocianato, N-nitroimidazol-1-carboximidamida, N,N,Ä≤-bis(pivaloil)-1H-pirazol-1-carboxamidina, N,N,Ä≤-bis(benciloxicarbonil)-1H-pirazol-1-carboxamidina, un reactivo de acetilación, un reactivo de guanidinilación, un reactivo de tioacilación, un reactivo de tioacetilación, o un reactivo de tiobencilación, o un reactivo de metanimina diheterocíclica. En algunos ejemplos, el agente de unión se une a un aminoácido marcado poniéndose en contacto con un reactivo o usando un método tal como se describe en la publicación de patente internacional n.º WO 2019/089846. En algunos casos, el agente de unión se une a un aminoácido marcado mediante un reactivo de modificación de amina.

[0191] Un agente de unión puede unirse a un péptido N-terminal, un péptido C-terminal, o un péptido intermedio de una molécula de péptido, polipéptido, o proteína. Un agente de unión puede unirse a un aminoácido N-terminal, un aminoácido C-terminal, o un aminoácido intermedio de una molécula de péptido. Un agente de unión puede unirse a un resto de diaminoácido N-terminal o C-terminal. Un diaminoácido N-terminal está compuesto por el aminoácido N-terminal y el penúltimo aminoácido N-terminal. Un diaminoácido C-terminal se define de manera similar para el extremo C-terminal. En algunas realizaciones, el agente de unión se une a un residuo de aminoácido N-terminal modificado químicamente o un residuo de aminoácido C-terminal modificado químicamente. Para aumentar la afinidad de un agente de unión por aminoácidos N-terminal (NTAA) pequeños de péptidos, el NTAA puede modificarse con un hapteno “inmunogénico”, tal como dinitrofenol (DNP). Esto puede implementarse en un enfoque de secuenciación cíclica usando reactivo de Sanger, dinitrofluorobenceno (DNFB), que une un grupo DNP al grupo amina del NTAA. Los anticuerpos anti-DNP comerciales tienen afinidades en el intervalo bajo de nM (~8 nM, LO-DNP-2) (Bilgiceret al., J Am Chem Soc (2009) 131(26): 9361-9367); como tal, resulta obvio que debe ser posible modificar por ingeniería agentes de unión a NTAA de alta afinidad para varios NTAA modificados con DNP (mediante DNFB) y lograr simultáneamente una buena selectividad de unión para un NTAA particular. En otro ejemplo, un NTAA puede modificarse con sulfonil-nitrofenol (SNP) usando 4-sulfonil-2-nitrofluorobenceno (SNFB). También pueden lograrse mejoras de afinidad similares con modificadores de NTAA alternativos, tales como un grupo acetilo o un grupo amidinilo (guanidinilo).

[0193] En determinadas realizaciones, un agente de unión puede ser un aptámero (por ejemplo, aptámero de péptido, aptámero de ADN, o aptámero de ARN), un peptoide, un anticuerpo o un fragmento de unión específico del mismo, una proteína o enzima de unión a aminoácido, un fragmento de unión de anticuerpo, un mimético de anticuerpo, un péptido, un peptidomimético, una proteína, o un polinucleótido (por ejemplo, ADN, ARN, ácido nucleico peptídico (PNA), un gPNA, ácido nucleico en puente (BNA), ácido xenonucleico (XNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), o ácido nucleico de treosa (TNA), o una variante de los mismos).

[0195] Tal como se usa en el presente documento, los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” se usan en un sentido amplio, para incluir no sólo moléculas de anticuerpo intacto, por ejemplo, pero sin limitarse a, inmunoglobulina A, inmunoglobulina G, inmunoglobulina D, inmunoglobulina E, e inmunoglobulina M, sino también cualquier componente inmunorreactivo de una molécula de anticuerpo o porción de la misma que se une de manera inmunoespecífica a al menos un epítopo. Un anticuerpo puede producirse de manera natural, producirse de manera sintética, o expresarse de manera recombinante. Un anticuerpo puede ser una proteína de fusión. Un anticuerpo puede ser un mimético de anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)<2>, fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), minianticuerpos, nanocuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpo reticulados, Affibody<™>, nanocuerpos, anticuerpos de dominio único, moléculas de DVD-Ig, alfacuerpos, afímeros, afitinas, ciclotidas, moléculas, y similares. Los productos inmunorreactivos derivados usando técnicas de modificación por ingeniería de anticuerpos o modificación por ingeniería de proteínas también se encuentran expresamente dentro del significado del término “anticuerpos”. Pueden encontrarse descripciones detalladas de modificación por ingeniería de anticuerpos y/o proteínas, incluyendo protocolos relevantes, en J. Maynard y G. Georgiou, 2000, Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Antibody Engineering, R. Kontermann y S. Dubel, eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag (2001); patente estadounidense n.º 5.831.012; y S. Paul, Antibody Engineering Protocols, Humana Press (1995), entre otros.

[0197] Al igual que con los anticuerpos, pueden producirse aptámeros de ácido nucleico y péptido que reconocen específicamente una macromolécula, por ejemplo, un péptido o un polipéptido, usando métodos conocidos. Los aptámeros se unen a moléculas diana de manera altamente específica y dependiente de la conformación, normalmente con una afinidad muy alta, aunque, si se desea, pueden seleccionarse aptámeros con una menor afinidad de unión. Se ha mostrado que los aptámeros distinguen entre dianas basándose en diferencias estructurales muy pequeñas tales como la presencia o ausencia de un grupo metilo o hidroxilo y determinados aptámeros pueden distinguir entre D-enantiómeros y L-enantiómeros. Se han obtenido aptámeros que se unen a dianas moleculares pequeñas, incluyendo fármacos, iones metálicos, y colorantes orgánicos, péptidos, biotina, y proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, estreptavidina, VEGF, y proteínas virales. Se ha mostrado que los aptámeros conservan su actividad funcional tras la biotinilación, el marcaje con fluoresceína, y cuando se unen a microesferas y superficies de vidrio (véanse, por ejemplo, Jayasena, 1999, Clin Chem 45:1628-50; Kusser J., 2000, Biotechnol.74: 27-39; Colas, 2000, Curr Opin Chem Biol 4:54-9). También se han descrito aptámeros que se unen específicamente a arginina y AMP (véase Patel y Suri, 2000, J. Biotech. 74:39-60). Se han dado a conocer aptámeros de oligonucleótido que se unen a un aminoácido específico en Goldet al. (1995, Ann. Rev. Biochem.

[0198] 64:763-97). También se han descrito aptámeros de ARN que se unen a aminoácidos (Ames y Breaker, 2011, RNA Biol.8; 82-89; Mannironiet al., 2000, RNA 6:520-27; Famulok, 1994, J. Am. Chem. Soc.116:1698-1706).

[0200] Un agente de unión puede prepararse modificando proteínas que se producen de manera natural o producidas de manera sintética mediante ingeniería genética para introducir una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos para producir proteínas modificadas por ingeniería que se unen a un componente o rasgo característico específico de un polipéptido (por ejemplo, NTAA, CTAA, o aminoácido modificado de manera postraduccional o un péptido). Por ejemplo, pueden modificarse exopeptidasas (por ejemplo, aminopeptidasas, carboxipeptidasas, dipeptidil-peptidasa, dipeptidil-aminopeptidasa), exoproteasas, exoproteasas mutadas, anticalinas mutadas, ClpS mutadas, anticuerpos, o ARNt sintetasas para crear un agente de unión que se une selectivamente a un NTAA particular. En otro ejemplo, pueden modificarse carboxipeptidasas para crear un agente de unión que se une selectivamente a un CTAA particular. Un agente de unión también puede diseñarse o modificarse, y utilizarse, para unirse específicamente a un NTAA modificado o CTAA modificado, por ejemplo, uno que tiene una modificación postraduccional (por ejemplo, NTAA fosforilado o CTAA fosforilado) o uno que se ha modificado con un marcador (por ejemplo, PTC, 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (usando reactivo de Sanger, DNFB), cloruro de dansilo (usando DNS-Cl, o cloruro de 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo), o usando un reactivo de tioacilación, un reactivo de tioacetilación, un reactivo de acetilación, un reactivo de amidinación (guanidinilación), o un reactivo de tiobencilación). En la técnica se conocen estrategias para la evolución dirigida de proteínas (por ejemplo, Yuanet al., 2005, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69:373-392), e incluyen presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación en ARNm, presentación en CIS, presentación en CAD, emulsiones, método de presentación en superficies celulares, presentación en superficies de levaduras, presentación en superficies bacterianas, etc.

[0202] En otro ejemplo, en la bibliografía también se han descrito ClpS modificadas por ingeniería altamente selectivas. Emiliet al. describen la evolución dirigida de una proteína ClpS deE. coli.mediante presentación en fagos, que da como resultado cuatro variantes diferentes con la capacidad de unirse selectivamente a NTAA para residuos de ácido aspártico, arginina, triptófano, y leucina (patente estadounidense n.º 9.566.335). En una realización, el resto de unión del agente de unión comprende un miembro de la familia ClpS evolutivamente conservada de proteínas adaptadoras implicadas en el reconocimiento y la unión de proteínas N-terminales naturales o una variante de las mismas (véanse, por ejemplo, Schuenemannet al., (2009) EMBO Reports 10(5); Roman-Hernandezet al., (2009) PNAS 106(22):8888-93; Guoet al., (2002) JBC 277(48): 46753-62; Wanget al., (2008) Molecular Cell 32: 406-414). En algunas realizaciones, con el fin de generar un resto de unión con la selectividad deseada, se modifican los residuos de aminoácido correspondientes al bolsillo de unión hidrófobo de ClpS identificados en Schuenemannet al.

[0203] En una realización, el resto de unión comprende un miembro de la familia de secuencias de reconocimiento de cajas UBR, o una variante de la familia de secuencias de reconocimiento de cajas UBR. Las cajas de reconocimiento de UBR se describen en Tasakiet al., (2009), JBC 284(3): 1884-95. Por ejemplo, el resto de unión puede comprender UBR1, UBR2, o un mutante, una variante, o un homólogo de los mismos.

[0205] En determinadas realizaciones, el agente de unión comprende además uno o más marcadores detectables tales como marcadores fluorescentes, además del resto de unión. En algunas realizaciones, el agente de unión no comprende un polinucleótido tal como una etiqueta de codificación. Opcionalmente, el agente de unión comprende un anticuerpo sintético o natural. En algunas realizaciones, el agente de unión comprende un aptámero. En una realización, el agente de unión comprende un polipéptido, tal como un miembro modificado de la familia ClpS de proteínas adaptadoras, tales como una variante de un polipéptido de unión a ClpS deE. coli, y un marcador detectable. En una realización, el marcador detectable es detectable ópticamente. En algunas realizaciones, el marcador detectable comprende un resto fluorescente, una nanopartícula codificada por color, un punto cuántico, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el marcador comprende un colorante de poliestireno que abarca una molécula de colorante principal tal como FluoSphere<™>, rojo Nilo, fluoresceína, rodamina, colorantes de rodamina derivatizados, tales como TAMRA, fósforo, colorante de polimetadina, fosforamidita fluorescente, rojo Texas, proteína fluorescente verde, acridina, cianina, colorante 5 de cianina, colorante 3 de cianina, ácido 5-(2’-aminoetil)-aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS), BODIPY, ALEXA 120, o un derivado o una modificación de cualquiera de los anteriores. En una realización, el marcador detectable es resistente al fotoblanqueo mientras produce una gran cantidad de señal (tal como fotones) a una longitud de onda única y fácilmente detectable, con una alta relación señal-ruido.

[0206] En una realización particular, las anticalinas se modifican por ingeniería para tener tanto una alta afinidad como una alta especificidad por NTAA marcados (por ejemplo, PTC, PTC modificado, Cbz, DNP, SNP, acetilo, guanidinilo, amino-guanidinilo, metanimina heterocíclica, etc.). Determinadas variedades de armazones de anticalina tienen una forma adecuada para la unión de aminoácidos individuales, en virtud de su estructura de barril beta. Un aminoácido N-terminal (o bien con o bien sin modificación) pueden encajar y reconocerse potencialmente en este cubo de “barril beta”. Se han descrito anticalinas de alta afinidad con novedosas actividades de unión modificadas por ingeniería (revisado por Skerra, 2008, FEBS J.275: 2677-2683). Por ejemplo, se han modificado por ingeniería anticalinas con una unión de alta afinidad (bajo nM) a fluoresceína y digoxigenina (Gebaueret al., 2012, Methods Enzymol 503: 157-188). Bantaet al. (2013, Annu. Rev. Biomed. Eng.15:93-113) también han revisado la modificación por ingeniería de armazones alternativos para nuevas funciones de unión.

[0208] En algunas realizaciones, el agente de unión se liga, de manera directa o indirecta, a un dominio de multimerización. Por tanto, en el presente documento se proporcionan polipéptidos monoméricos, diméricos, y multiméricos de orden superior (por ejemplo, 3, 4, 5, o más) que comprenden uno o más agentes de unión. En algunas realizaciones específicas, el agente de unión es dimérico. En algunos ejemplos, dos polipéptidos de la invención pueden unirse de manera covalente o no covalente entre sí para formar un dímero.

[0210] En algunas realizaciones, el agente de unión se deriva de una fuente biológica, que se produce de manera natural, que se produce de manera no natural, o sintética. En algunos ejemplos, el agente de unión se deriva del diseño de proteínasde novo(Huanget al., (2016) 537(7620):320-327). En algunos ejemplos, el agente de unión tiene una estructura, una secuencia, y/o una actividad diseñadas desde los primeros principios.

[0212] En algunas realizaciones, puede utilizarse un agente de unión que se une selectivamente a un aminoácido C-terminal (CTAA) modificado. Las carboxipeptidasas son proteasas que escinden/eliminan aminoácidos terminales que contienen un grupo carboxilo libre. Varias carboxipeptidasas muestran preferencias de aminoácido, por ejemplo, la carboxipeptidasa B escinde preferentemente en aminoácidos básicos, tales como arginina y lisina. Una carboxipeptidasa puede modificarse para crear un agente de unión que se une selectivamente a un aminoácido particular. En algunas realizaciones, la carboxipeptidasa puede modificarse por ingeniería para unirse selectivamente tanto al resto de modificación como al grupo R del carbono alfa del CTAA. Por tanto, las carboxipeptidasas modificadas por ingeniería pueden reconocer específicamente 20 CTAA diferentes que representan los aminoácidos convencionales en el contexto de un marcador C-terminal. El control de la degradación por etapas desde el extremo C-terminal del péptido se logra usando carboxipeptidasas modificadas por ingeniería que sólo son activas (por ejemplo, actividad de unión o actividad catalítica) en presencia del marcador. En un ejemplo, el CTAA puede modificarse mediante un grupo para-nitroanilida o 7-amino-4-metilcumarinilo.

[0214] Otros posibles armazones que pueden modificarse por ingeniería para generar agentes de unión para su uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen: una anticalina, una lipocalina, una aminoácido-ARNt sintetasa (aaRS), ClpS, Affilin<®>, Adnectin<™>, un receptor de células T, una proteína de dedos de zinc, una tiorredoxina, GST A1-1, DARPin, un afímero, una afitina, un alfacuerpo, un avímero, un monocuerpo, un anticuerpo, un anticuerpo de dominio único, un nanocuerpo, EETI-II, HPSTI, intracuerpo, dedo de PHD, V(NAR) LDTI, evicuerpo, Ig(NAR), knottina, maxicuerpo, microcuerpo, neocarzinostatina, pVIII, tendamistat, VLR, armazón de proteína A, MTI-II, ecotina, GCN4, Im9, dominio Kunitz, PBP, trans-cuerpo, tetranectina, dominio WW, CBM4-2, DX-88, GFP, iMab, dominio A de receptor de Ldl, Min-23, dominio PDZ, polipéptido pancreático aviar, caribdotoxina/10Fn3, anticuerpo de dominio (Dab), repetición de anquirina a2p8, péptido A de defensa contra insectos, proteína AR diseñada, dominio de lectina de tipo C, nucleasa estafilocócica, dominio 3 de homología de Src (SH3), o dominio 2 de homología de Src (SH2). Véanse, por ejemplo, El-Gebaliet al., (2019) Nucleic Acids Research 47:D427-D432 y Finnet al., (2013) Nucleic Acids Res.42(publicación de base de datos):D222-D230. En algunas realizaciones, un agente de unión se deriva de una enzima que se une a uno o más aminoácidos (por ejemplo, una aminopeptidasa). En determinadas realizaciones, un agente de unión puede derivarse de una anticalina o una proteína adaptadora de proteasa Clp (ClpS).

[0216] En algunos casos, un agente de unión puede unirse a un aminoácido modificado de manera postraduccional. En algunas realizaciones, la detección de aminoácidos modificados de manera postraduccional internos (por ejemplo, fosforilación, glicosilación, succinilación, ubiquitinación, S-nitrosilación, metilación, N-acetilación, lipidación, etc.) se logra antes de la detección y la eliminación de aminoácidos terminales (por ejemplo, NTAA o CTAA). En un ejemplo, un péptido se pone en contacto con agentes de unión para las modificaciones PTM, y se transfiere información desde una etiqueta de codificación correspondiente hasta la etiqueta de registro asociada con el péptido inmovilizado. Una vez completadas la detección y la transferencia de información referente a las modificaciones de aminoácidos, los grupos de modificación de PTM pueden retirarse antes de la detección y la transferencia de información de etiqueta de codificación para la secuencia de aminoácidos primaria usando métodos de degradación N-terminal o C-terminal. Por tanto, los ácidos nucleicos extendidos resultantes indican la presencia de modificaciones postraduccionales en una secuencia de péptido, aunque no el orden secuencial, junto con información de secuencia de aminoácidos primaria.

[0218] En algunas realizaciones, la detección de aminoácidos modificados de manera postraduccional internos puede producirse de manera concurrente con la detección de la secuencia de aminoácidos primaria. En un ejemplo, un NTAA (o CTAA) se pone en contacto con un agente de unión específico para un aminoácido modificado de manera postraduccional, o bien solo o bien como parte de una biblioteca de agentes de unión (por ejemplo, biblioteca compuesta por agentes de unión para los 20 aminoácidos convencionales y aminoácidos modificados de manera postraduccional seleccionados). Le siguen ciclos sucesivos de eliminación de aminoácido terminal y contacto con un agente de unión (o una biblioteca de agentes de unión). Por tanto, los ácidos nucleicos extendidos resultantes en la etiqueta de registro asociada con el péptido inmovilizado indican la presencia y el orden de las modificaciones postraduccionales en el contexto de una secuencia de aminoácidos primaria.

[0220] En determinadas realizaciones, una macromolécula, por ejemplo, un polipéptido, también se pone en contacto con un agente de unión no afín. Tal como se usa en el presente documento, un agente de unión no afín se refiere a un agente de unión que es selectivo para una diana diferente (por ejemplo, rasgo característico o componente del polipéptido) a la diana particular que está considerándose. Por ejemplo, si elnNTAA es fenilalanina, y el péptido se pone en contacto con tres agentes de unión selectivos para fenilalanina, tirosina, y asparagina, respectivamente, el agente de unión selectivo para fenilalanina sería el primer agente de unión capaz de unirse selectivamente alnésimoNTAA (es decir, fenilalanina), mientras que los otros dos agentes de unión serían agentes de unión no afines para ese péptido (dado que son selectivos para NTAA distintos de fenilalanina). Sin embargo, los agentes de unión a tirosina y asparagina pueden ser agentes de unión afines para otros péptidos en la muestra. Si entonces se escindía elnNTAA (fenilalanina) a partir del péptido, convirtiendo de ese modo eln-1aminoácido del péptido en eln-1NTAA (por ejemplo, tirosina), y entonces se ponía en contacto el péptido con los mismos tres agentes de unión, el agente de unión selectivo para tirosina sería el segundo agente de unión capaz de unirse selectivamente aln-1NTAA (es decir, tirosina), mientras que los otros dos agentes de unión serían agentes de unión no afines (dado que son selectivos para NTAA distintos de tirosina).

[0222] Por tanto, debe entenderse que si un agente es un agente de unión o un agente de unión no afín dependerá de la naturaleza del rasgo característico o componente del polipéptido particular disponible actualmente para la unión. Además, si se analizan múltiples polipéptidos en una reacción multiplexada, un agente de unión para un polipéptido puede ser un agente de unión no afín para otro, y viceversa. Por consiguiente, debe entenderse que la siguiente descripción sobre agentes de unión es aplicable a cualquier tipo de agente de unión descrito en el presente documento (es decir, agentes de unión tanto afines como no afines).

[0224] En determinadas realizaciones, se controla la concentración de los agentes de unión en una disolución para reducir el fondo y/o los resultados de falsos positivos del ensayo. En algunas realizaciones, la concentración de un agente de unión puede estar a cualquier concentración adecuada, por ejemplo, a aproximadamente 0,0001 nM, aproximadamente 0,001 nM, aproximadamente 0,01 nM, aproximadamente 0,1 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 500 nM, o aproximadamente 1.000 nM. En otras realizaciones, la concentración de un conjugado soluble usado en el ensayo es de entre aproximadamente 0,0001 nM y aproximadamente 0,001 nM, entre aproximadamente 0,001 nM y aproximadamente 0,01 nM, entre aproximadamente 0,01 nM y aproximadamente 0,1 nM, entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 1 nM, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 2 nM, entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 5 nM, entre aproximadamente 5 nM y aproximadamente 10 nM, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 20 nM, entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 50 nM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 200 nM, entre aproximadamente 200 nM y aproximadamente 500 nM, entre aproximadamente 500 nM y aproximadamente 1.000 nM, o más de aproximadamente 1.000 nM.

[0226] En algunas realizaciones, la razón entre las moléculas de agente de unión solubles y la macromolécula inmovilizada, por ejemplo, polipéptidos, puede estar a cualquier intervalo adecuado, por ejemplo, a aproximadamente 0,00001:1, aproximadamente 0,0001:1, aproximadamente 0,001:1, aproximadamente 0,01:1, aproximadamente 0,1:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 35:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 45:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 55:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 65:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 75:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 85:1, aproximadamente 90:1, aproximadamente 95:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 10<4>:1, aproximadamente 10<5>:1, aproximadamente 10<6>:1, o superior, o cualquier razón entre las razones enumeradas anteriormente. Pueden usarse mayores razones entre las moléculas de agente de unión solubles y el/los polipéptido(s) inmovilizado(s) y/o los ácidos nucleicos para llevar la unión y/o la transferencia de información de etiqueta de codificación a su finalización. Esto puede ser particularmente útil para detectar y/o analizar polipéptidos de baja abundancia en una muestra.

[0228] C. Etiqueta de codificación

[0230] El agente de unión descrito comprende o está asociado con una etiqueta de codificación que contiene información identificativa sobre (por ejemplo, que representa o se correlaciona con) el agente de unión. En algunas realizaciones, la información identificativa de la etiqueta de codificación comprende información sobre la identidad de la diana unida por el agente de unión. En algunas realizaciones, la información identificativa de la etiqueta de codificación comprende o está asociada con información sobre la identidad del uno o más aminoácidos en el péptido unido por el agente de unión. En algunos casos, la etiqueta de codificación incluye una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción parcial usada para la etapa de escisión. Por ejemplo, la etiqueta de codificación puede incluir una secuencia (o porción de la misma) que puede reconocerse por un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, una enzima de restricción). En algunos casos, la etiqueta de codificación puede incluir una secuencia monocatenaria que puede reconocerse por el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, una enzima de restricción) una vez que es bicatenaria.

[0232] La etiqueta de codificación asociada con el agente de unión es o comprende un polinucleótido de cualquier longitud adecuada, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 2 bases a aproximadamente 100 bases, incluyendo cualquier número entero incluyendo 2 y 100 y entremedias, que comprende información identificativa para su agente de unión asociado. Una “etiqueta de codificación” también puede prepararse a partir de un “polímero secuenciable” (véanse, por ejemplo, Niuet al., 2013, Nat. Chem. 5:282-292; Royet al., 2015, Nat. Commun.6:7237; Lutz, 2015, Macromolecules 48:4759-4767). Una etiqueta de codificación puede comprender una secuencia de codificador o una secuencia con información identificativa, que está opcionalmente flanqueada por un espaciador en un lado u opcionalmente flanqueada por un espaciador en cada lado. Una etiqueta de codificación también puede estar compuesta por un UMI opcional y/o un código de barras específico de ciclo de unión opcional. Una etiqueta de codificación puede referirse a la etiqueta de codificación que está unida directamente a un agente de unión, a una secuencia complementaria hibridada con la etiqueta de codificación unida directamente a un agente de unión (por ejemplo, para etiquetas de codificación bicatenarias), o a la información de etiqueta de codificación presente en un ácido nucleico extendido en la etiqueta de registro. En determinadas realizaciones, una etiqueta de codificación puede comprender además un espaciador o código de barras específico de ciclo de unión, un identificador molecular único, un sitio de cebado universal, o cualquier combinación de los mismos.

[0234] Una etiqueta de codificación puede ser una molécula monocatenaria, una molécula bicatenaria, o una molécula parcialmente bicatenaria. Una etiqueta de codificación puede comprender extremos romos, extremos salientes, o uno de cada uno. En algunas realizaciones, una etiqueta de codificación es parcialmente bicatenaria, lo que impide la hibridación de la etiqueta de codificación con secuencias de codificador y espaciador internas en una etiqueta de registro extendida en crecimiento. En algunas realizaciones, la etiqueta de codificación puede comprender una horquilla. En determinadas realizaciones, la horquilla comprende regiones de ácido nucleico mutuamente complementarias que están conectadas a través de una cadena de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la horquilla de ácido nucleico también puede comprender además regiones monocatenarias 3’ y/o 5’ que se extienden desde el segmento de tallo bicatenario. En algunos ejemplos, la horquilla comprende una única cadena de ácido nucleico.

[0236] En algunas realizaciones, un agente de unión descrito comprende una etiqueta de codificación que contiene información identificativa sobre el agente de unión. En algunas realizaciones, la información identificativa de la etiqueta de codificación comprende información sobre la identidad de la diana unida por el agente de unión. En algunas realizaciones, la información identificativa de la etiqueta de codificación comprende información sobre la identidad del uno o más aminoácidos en el péptido unido por el agente de unión.

[0238] Una etiqueta de codificación es una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 100 bases que proporciona información identificativa única para su agente de unión asociado. Una etiqueta de codificación puede comprender de aproximadamente 3 a aproximadamente 90 bases, de aproximadamente 3 a aproximadamente 80 bases, de aproximadamente 3 a aproximadamente 70 bases, de aproximadamente 3 a aproximadamente 60 bases, de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 50 bases, de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 40 bases, de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 30 bases, de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 20 bases, de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 10 bases, o de aproximadamente 3 bases a aproximadamente 8 bases. En algunas realizaciones, una etiqueta de codificación tiene aproximadamente 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, 10 bases, 11 bases, 12 bases, 13 bases, 14 bases, 15 bases, 16 bases, 17 bases, 18 bases, 19 bases, 20 bases, 25 bases, 30 bases, 35 bases, 40 bases, 55 bases, 60 bases, 65 bases, 70 bases, 75 bases, 80 bases, 85 bases, 90 bases, 95 bases, o 100 bases de longitud. Una etiqueta de codificación puede estar compuesta por ADN, ARN, análogos de polinucleótidos, o una combinación de los mismos. Los análogos de polinucleótidos incluyen PNA, gPNA, BNA, GNA, TNA, LNA, polinucleótidos de morfolino, 2’-O-metil-polinucleótidos, polinucleótidos sustituidos con alquilribosilo, polinucleótidos de fosforotioato, y análogos de 7-desazapurina.

[0240] El agente de unión puede unirse a la etiqueta de codificación de cualquier manera y posición adecuadas, de manera que no interrumpa las reacciones enzimáticas (por ejemplo, función del reactivo de unión de ácido nucleico, la polimerasa y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario) de los métodos proporcionados. Por ejemplo, el agente de unión puede unirse a la etiqueta de codificación de cualquier manera adecuada siempre que la etiqueta de codificación se una de manera que la etiqueta de codificación tenga un extremo 3’ disponible. En algunas realizaciones particulares, la etiqueta de codificación tiene un espaciador que es una proyección 3’. En algunas realizaciones, el agente de unión se une a la etiqueta de codificación en el extremo 5’ de la etiqueta de codificación. En algunas realizaciones, el agente de unión se une a la etiqueta de codificación en la región de bucle. En algunas realizaciones, el agente de unión se une a la etiqueta de codificación en una ubicación que está cerca del bucle al extremo 5’ de la etiqueta de recodificación. Una etiqueta de codificación puede unirse a un agente de unión de manera directa o indirecta (por ejemplo, mediante un ligador), mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo interacciones covalentes y no covalentes. En algunas realizaciones, una etiqueta de codificación puede unirse a un agente de unión de manera enzimática o química. En algunas realizaciones, una etiqueta de codificación puede unirse a un agente de unión mediante ligamiento. En otras realizaciones, una etiqueta de codificación se une a un agente de unión mediante pares de unión por afinidad (por ejemplo, biotina y estreptavidina). En algunos casos, una etiqueta de codificación puede unirse a un agente de unión a un aminoácido no natural, tal como mediante una interacción covalente con un aminoácido no natural.

[0241] En algunas realizaciones, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación mediante una interacción SpyCatcher-SpyTag. El péptido SpyTag forma un enlace covalente irreversible con la proteína SpyCatcher a través de un enlace isopeptídico espontáneo, ofreciendo de ese modo una manera codificada genéticamente de crear interacciones peptídicas que resisten la fuerza y las condiciones rigurosas (Zakeriet al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci.

[0242] 109:E690-697; Liet al., 2014, J. Mol. Biol.426:309-317). Un agente de unión puede expresarse como una proteína de fusión que comprende la proteína SpyCatcher. En algunas realizaciones, la proteína SpyCatcher está unida en el extremo N-terminal o extremo C-terminal del agente de unión. El péptido SpyTag puede acoplarse a la etiqueta de codificación usando químicas de conjugación convencionales (Hermanson, Bioconjugate Techniques, (2013) Academic Press).

[0243] En algunas realizaciones, se usa una estrategia basada en enzimas para unir el agente de unión a una etiqueta de codificación. Por ejemplo, el agente de unión puede unirse a una etiqueta de codificación usando una enzima de generación de formilglicina (FGly) (FGE). En un ejemplo, se usa una proteína, por ejemplo, SpyLigase, para unir el agente de unión a la etiqueta de codificación (Fiereret al., Proc Natl Acad Sci USA.2014; 111(13): E1176-E1181). En otras realizaciones, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación mediante una interacción péptidoproteína SnoopTag-SnoopCatcher. El péptido SnoopTag forma un enlace isopeptídico con la proteína SnoopCatcher (Veggianiet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2016, 113:1202-1207). Un agente de unión puede expresarse como una proteína de fusión que comprende la proteína SnoopCatcher. En algunas realizaciones, la proteína SnoopCatcher está unida en el extremo N-terminal o extremo C-terminal del agente de unión. El péptido SnoopTag puede acoplarse a la etiqueta de codificación usando químicas de conjugación convencionales.

[0244] En aún otras realizaciones, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación mediante la etiqueta de fusión de proteínas HaloTag<®>y su ligando químico. HaloTag es una haloalcano deshalogenasa modificada diseñada para unirse covalentemente a ligandos sintéticos (ligandos HaloTag) (Loset al., 2008, ACS Chem. Biol. 3:373-382). Los ligandos sintéticos comprenden un ligador de cloroalcano unido a una variedad de moléculas útiles. Se forma un enlace covalente entre HaloTag y el ligador de cloroalcano que es altamente específico, se produce rápidamente en condiciones fisiológicas, y es esencialmente irreversible.

[0245] En algunos casos, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación mediante unión (conjugación) usando una enzima, tal como marcaje mediado por sortasa (véanse, por ejemplo, Antoset al., Curr Protoc Protein Sci. (2009) CAPÍTULO 15: Unidad 15.3; la publicación de patente internacional n.º WO2013003555). La enzima sortasa cataliza una reacción de transpeptidación (véase, por ejemplo, Falcket al., Antibodies (2018) 7(4):1-19). En algunos aspectos, el agente de unión se modifica con, o se une a, uno o más residuos N-terminales o C-terminales de glicina.

[0246] En algunas realizaciones, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación usando un método de bioconjugación de cisteína. En algunas realizaciones, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación usando bioconjugación de cisteína mediada por pinza π (véase, por ejemplo, Zhanget al., Nat Chem. (2016) 8(2):120-128). En algunos casos, un agente de unión se une a una etiqueta de codificación usando generación de etiquetas mediada por 3-arilpropiolonitrilo (APN) (por ejemplo, Konievet al., Bioconjug Chem.2014; 25(2):202-206). En algunas realizaciones, un conjunto de etiquetas de codificación usadas en un ciclo de unión y transferencia de información puede incluir información de ciclo, tal como usar secuencias específicas de ciclo. En una realización, las etiquetas de codificación comprenden secuencias específicas de ciclo de unión. En algunas realizaciones, las etiquetas de codificación dentro de una colección de agentes de unión comparten una secuencia de espaciador común usada en un ensayo (por ejemplo, la biblioteca completa de agentes de unión usada en un método de ciclo de unión múltiple posee un espaciador común en sus etiquetas de codificación). En otra realización, las etiquetas de codificación están compuestas por etiquetas de ciclo de unión, que identifican un ciclo de unión particular. En otras realizaciones, las etiquetas de codificación dentro de una biblioteca de agentes de unión tienen una secuencia de espaciador específica de ciclo de unión. En algunas realizaciones, una etiqueta de codificación comprende una secuencia de espaciador específica de ciclo de unión. Por ejemplo, una etiqueta de codificación para los agentes de unión usados en el primer ciclo de unión comprende una secuencia de espaciador específica del “ciclo 1”, una etiqueta de codificación para los agentes de unión usados en el segundo ciclo de unión comprende una secuencia de espaciador específica del “ciclo 2”, y así sucesivamente hasta “n” ciclos de unión. En realizaciones adicionales, las etiquetas de codificación para los agentes de unión usados en el primer ciclo de unión comprenden una secuencia de espaciador específica del “ciclo 1” y una secuencia de espaciador específica del “ciclo 2”, las etiquetas de codificación para los agentes de unión usados en el segundo ciclo de unión comprenden una secuencia de espaciador específica del “ciclo 2” y una secuencia de espaciador específica del “ciclo 3”, y así sucesivamente hasta “n” ciclos de unión. Esta realización es útil para el posterior ensamblaje por PCR de etiquetas de registro extendidas no concatenadas tras completarse los ciclos de unión. En algunas realizaciones, una secuencia de espaciador comprende un número suficiente de bases para hibridarse con una secuencia de espaciador complementaria en una etiqueta de registro o etiqueta de registro extendida para iniciar una reacción de extensión de cebador o reacción de ligamiento de extremos pegajosos.

[0248] Una secuencia de espaciador específica de ciclo también puede diseñarse de manera que la transferencia de información se produzca de manera condicional. En un ejemplo, el primer ciclo de unión transfiere información desde la etiqueta de codificación hasta una etiqueta de registro, y los ciclos de unión posteriores pueden hacerlo de una manera dependiente de las secuencias de espaciador añadidas previamente. Más específicamente, las etiquetas de codificación para los agentes de unión usados en el primer ciclo de unión comprenden una secuencia de espaciador específica del “ciclo 1” y una secuencia de espaciador específica del “ciclo 2”, las etiquetas de codificación para los agentes de unión usados en el segundo ciclo de unión comprenden una secuencia de espaciador específica del “ciclo 2” y una secuencia de espaciador específica del “ciclo 3”, y así sucesivamente hasta “n” ciclos de unión. Las etiquetas de codificación de los agentes de unión del primer ciclo de unión son capaces de hibridarse con las etiquetas de registro mediante secuencias de espaciador específicas del ciclo 1 complementarias. Tras la transferencia de la información de etiqueta de codificación a la etiqueta de registro, la secuencia de espaciador específica del ciclo 2 se posiciona en el extremo terminal 3’ de la etiqueta de registro extendida al final de ciclo 1 de unión. Las etiquetas de codificación de los agentes de unión del segundo ciclo de unión son capaces de hibridarse con las etiquetas de registro extendidas mediante secuencias de espaciador específicas del ciclo 2 complementarias. Tras la transferencia de la información de etiqueta de codificación a la etiqueta de registro extendida, la secuencia de espaciador específica del ciclo 3 se posiciona en el extremo terminal 3’ de la etiqueta de registro extendida al final del ciclo 2 de unión, y así sucesivamente a lo largo de “n” ciclos de unión. Esta realización proporciona que la transferencia de información de unión en un ciclo de unión particular entre los múltiples ciclos de unión se producirá sólo en etiquetas de registro (extendidas) que han experimentado los ciclos de unión previos. En algunos casos, se transfiere información desde una segunda etiqueta de codificación (u orden superior) hasta la etiqueta de registro extendida si el espaciador añadido por la etiqueta de codificación previa coincide con al menos una porción del espaciador de la segunda etiqueta de codificación.

[0250] En algunas realizaciones, un agente de unión puede no unirse a una macromolécula afín. Pueden usarse oligonucleótidos que comprenden espaciadores específicos de ciclo de unión después de cada ciclo de unión como etapa de “persecución” para mantener los ciclos de unión sincronizados incluso si falla el evento de un ciclo de unión. Por ejemplo, si un agente de unión afín no se une a una macromolécula durante el ciclo 1 de unión, se añade una etapa de persecución tras el ciclo 1 de unión usando oligonucleótidos que comprenden un espaciador específico del ciclo 1, un espaciador específico del ciclo 2, y una secuencia de codificador “nula”. La secuencia de codificador “nula” puede ser la ausencia de una secuencia de codificador o, preferiblemente, un código de barras específico que identifica positivamente un ciclo de unión “nulo”. El oligonucleótido “nulo” es capaz de hibridarse con la etiqueta de registro a través del espaciador específico del ciclo 1, y el espaciador específico del ciclo 2 se transfiere a la etiqueta de registro. Por tanto, los agentes de unión del ciclo 2 de unión son capaces de hibridarse con la etiqueta de registro extendida a través del espaciador específico del ciclo 2 a pesar de haber fallado el evento del ciclo 1 de unión. El oligonucleótido “nulo” marca el ciclo 1 de unión como evento de unión fallido dentro de la etiqueta de registro extendida.

[0252] En una realización preferida, se usan secuencias de codificador específicas de ciclo de unión en las etiquetas de codificación. Las secuencias de codificador específicas de ciclo de unión pueden lograrse o bien mediante el uso de códigos de barras de codificador de ciclo de unión a analito (por ejemplo, NTAA) completamente únicos o bien mediante un uso combinado de una secuencia de codificador de analito (por ejemplo, NTAA) unida a un código de barras específico de ciclo. La ventaja de usar un enfoque combinado es que es necesario diseñar menos códigos de barras totales. Para un conjunto de 20 agentes de unión a analito usados a lo largo de 10 ciclos, sólo necesitan diseñarse 20 códigos de barras de secuencia de codificador de analito y 10 códigos de barras específicos de ciclo de unión. En cambio, si el ciclo de unión se incorpora directamente en la secuencia de codificador de agente de unión, entonces puede ser necesario diseñar un total de 200 códigos de barras de codificador independientes. Una ventaja de incorporar información de ciclo de unión directamente en la secuencia de codificador es que puede minimizarse la longitud total de la etiqueta de codificación cuando se emplean códigos de barras de corrección de errores en una lectura de nanoporos. El uso de códigos de barras tolerantes a errores permite una identificación altamente precisa de códigos de barras usando enfoques y plataformas de secuenciación que son más propensos a errores, pero tienen otras ventajas tales como una rápida velocidad de análisis, un menor coste, y/o una instrumentación más portátil. Un ejemplo de este tipo es una lectura de secuenciación basada en nanoporos.

[0254] II. ENSAYO DE ANÁLISIS DE MACROMOLÉCULAS

[0256] Los métodos proporcionados para el análisis de macromoléculas, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, y proteínas, que incluyen una etapa de transferir información a una etiqueta de registro usando los métodos de codificación secuencial descritos, pueden incluir etapas, tratamientos, y reacciones adicionales. En algunas realizaciones, la macromolécula es un polipéptido y se realiza un ensayo de análisis de polipéptidos. En algunas realizaciones, se determinan la secuencia (o una porción de la secuencia de la misma) y/o la identidad de una proteína usando un ensayo de análisis de polipéptidos. En algunos ejemplos, el ensayo de análisis de polipéptidos incluye evaluar al menos una identidad o secuencia parcial del polipéptido usando técnicas o procedimientos adecuados. Por ejemplo, puede evaluarse al menos una secuencia parcial del polipéptido mediante análisis de aminoácidos N-terminales o análisis de aminoácidos C-terminales. En algunas realizaciones, puede evaluarse al menos una secuencia parcial del polipéptido usando un ensayo ProteoCode. En algunos ejemplos, puede evaluarse al menos una secuencia parcial del polipéptido aplicando algunas de las técnicas o procedimientos dados a conocer y/o reivindicados en las publicaciones de patente estadounidense n.<os>US 20190145982 A1, US 20200348308 A1, US 20200348307 A1, US 20210208150 A1.

[0258] En realizaciones referentes a métodos de análisis de péptidos o polipéptidos, el método incluye generalmente poner en contacto un agente de unión con al menos un aminoácido terminal (por ejemplo, NTAA o CTAA) de un polipéptido, una proteína o un péptido, y tras la puesta en contacto, transferir la información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro asociada con el polipéptido, la proteína o el péptido, generando de ese modo una etiqueta de registro extendida de primer orden (un ciclo de codificación). En la figura 1B se muestra un ciclo de codificación a modo de ejemplo según los métodos descritos en el presente documento. El agente de unión tal como se muestra en la figura 1B se une a la etiqueta de codificación que comprende información identificativa sobre el agente de unión (el código de barras de agente de unión, BBC) mediante un ligador. En algunas realizaciones, el agente de unión puede unirse a la etiqueta de codificación en ubicaciones distintas de las representadas (por ejemplo, en la región de bucle de la etiqueta de codificación u otras). Para transferir la información de BBC, se proporcionan una polimerasa, un reactivo de unión de ácido nucleico (tal como una ADN ligasa) y un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario (tal como una enzima de restricción). Estos reactivos pueden añadirse o bien de manera subsiguiente (una enzima cada vez, o dos enzimas (polimerasa y ADN ligasa) seguidas por la enzima de restricción), o bien como mezcla de tres enzimas. Tras el ligamiento del extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación, la polimerasa extiende el extremo 3’ (no ligado) de la etiqueta de registro para crear una molécula de ADNbc que contiene espaciadores de 2 pares de bases adyacentes a sus sitios de enzima de restricción respectivos. Tras la generación de doble cadena, la enzima de restricción se une y corte de manera adyacente a su sitio de reconocimiento. Tras la escisión, el ADNbc en la etiqueta de registro contiene ahora el código de barras específico de agente de unión (BBC) y una proyección 3’ de 2 nt, que sirve como secuencia de espaciador en las siguientes rondas de codificación. En algunas realizaciones, tras un ciclo de transferencia (codificación) de información, puede retirarse del polipéptido (tal como el aminoácido terminal o un dipéptido terminal) una porción del polipéptido para su análisis. El ciclo de etapas mostrado en la figura 1B puede repetirse una o más veces con agentes de unión adicionales y etiquetas de codificación correspondientes para extender adicionalmente la etiqueta de registro.

[0260] En alguna realización adicional, el método comprende marcar o modificar la macromolécula (por ejemplo, péptido) antes o después de poner en contacto la macromolécula con el agente de unión. Por ejemplo, el aminoácido terminal del polipéptido, la proteína o el péptido unido por el agente de unión puede ser un aminoácido terminal marcado o modificado químicamente. En algunas realizaciones adicionales, el método incluye además retirar o eliminar el aminoácido terminal (por ejemplo, NTAA o CTAA) del polipéptido, la proteína o el péptido tras la etapa de transferencia de información. El aminoácido terminal eliminado puede ser un aminoácido terminal marcado o modificado químicamente. La retirada del NTAA mediante su puesta en contacto con una enzima o reactivos químicos convierte el penúltimo aminoácido del polipéptido, la proteína o el péptido en un aminoácido terminal. El análisis de polipéptidos puede incluir uno o más ciclos de unión con agentes de unión adicionales al aminoácido terminal, y transferencia de información desde las etiquetas de codificación hasta el ácido nucleico extendido, generando de ese modo una etiqueta de registro extendida de orden superior que contiene información sobre dos o más agentes de unión, y eliminación del aminoácido terminal de manera cíclica. Pueden producirse unión, transferencia de información, y retirada adicionales tal como se describen hastanaminoácidos para generar un ácido nucleico extendido denésimoorden, que representan colectivamente el polipéptido, la proteína o el péptido. La etiqueta de registro se usa para registrar información recopilada a partir de uno o más eventos de unión entre uno o más agentes de unión y la macromolécula que va a analizarse.

[0262] En algunas de cualesquiera realizaciones proporcionadas, pueden realizarse etapas que incluyen el NTAA en el enfoque a modo de ejemplo descrito en lugar de con un aminoácido C-terminal (CTAA).

[0264] En algunas realizaciones, el orden de las etapas en el procedimiento para un ensayo de secuenciación de péptidos o polipéptidos basado en degradación puede invertirse o las etapas pueden realizarse en diversos órdenes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el marcaje de aminoácido terminal puede realizarse antes y/o después de unir el polipéptido al agente de unión.

[0266] En el presente documento se proporciona un método para analizar una macromolécula que comprende las etapas de: (a) proporcionar una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte; (b) poner en contacto la macromolécula con un agente de unión capaz de unirse a la macromolécula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta de codificación con información identificativa sobre el agente de unión, para permitir la unión entre la macromolécula y el agente de unión; (c) unir el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación mediante un reactivo de unión de ácido nucleico; (d) extender la etiqueta de registro usando la etiqueta de codificación como molde mediante una polimerasa, generando una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y (e) escindir la etiqueta de registro extendida bicatenaria con un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para generar una proyección 3’ en la etiqueta de registro extendida. En algunos casos, el agente de unión se retira después de la etapa (e). En algunas realizaciones, el método incluye además analizar la etiqueta de recodificación extendida. En algunos aspectos, el método incluye además añadir un sitio de cebado universal a la etiqueta de registro extendida, antes de analizar la etiqueta de registro extendida.

[0267] En algunos ejemplos, la etapa (a) se realiza antes de las etapas (b), (c), (d) y (e). Las etapas (c), (d) y (e) pueden realizarse de una manera por etapas por la naturaleza del diseño, pero los reactivos pueden proporcionarse en una mezcla. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza antes de la etapa (c) y la etapa (d), por ejemplo, proporcionando en primer lugar un reactivo de unión de ácido nucleico, luego proporcionando conjuntamente la polimerasa y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. En algunos casos, las etapas se producen en el orden (c), (d), y (e). En algunas realizaciones particulares, las etapas se realizan en el orden: (a), (b), (c), (d), y (e), opcionalmente repitiendo las etapas (b), (c), (d) y (e) una o más veces.

[0268] En algunas realizaciones, el método incluye además una etapa de retirar una porción del polipéptido, tal como el aminoácido terminal (por ejemplo, aminoácido N-terminal (NTAA)) del polipéptido, la proteína o el péptido para exponer un nuevo aminoácido terminal del polipéptido, la proteína o el péptido. En algunos casos, se repite un segundo ciclo de las etapas (b), (c), (d), (e) tras retirar al menos una porción del polipéptido tras el primer ciclo de las etapas (b), (c), (d), (e).

[0269] En algunas realizaciones, el método incluye tratar el polipéptido, la proteína o el péptido diana con un reactivo para modificar un aminoácido terminal del polipéptido, la proteína o el péptido. En algunos aspectos, el reactivo para modificar un aminoácido terminal de un polipéptido comprende un agente químico o un agente enzimático. En algunas realizaciones, el polipéptido, la proteína o el péptido diana se pone en contacto con el reactivo para modificar un aminoácido terminal antes de la etapa (b). En algunas realizaciones, el polipéptido, la proteína o el péptido diana se pone en contacto con el reactivo para modificar un aminoácido terminal antes de retirar el aminoácido terminal.

[0270] En algunas realizaciones, el método incluye además retirar el agente de unión después de transferir información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro. En algunos aspectos, el agente de unión se retira después de la etapa (e). En algunos aspectos, el agente de unión se retira antes de repetir la etapa (b). En algunos aspectos, la retirada del agente de unión se realiza después de transferir información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro asociada con la macromolécula para su análisis.

[0271] A. Muestra y macromolécula

[0272] En algunas realizaciones, el ensayo de análisis se realiza en una o más macromoléculas de identidad desconocida que se obtienen de una muestra. En algunos casos, las macromoléculas proceden de una mezcla de moléculas obtenidas de una muestra. Una macromolécula puede ser una molécula grande compuesta por subunidades más pequeñas. En determinadas realizaciones, una macromolécula es una proteína, un complejo proteico, un polipéptido, un péptido, una molécula de ácido nucleico, un hidrato de carbono, un lípido, un macrociclo, o una macromolécula quimérica. Una macromolécula (por ejemplo, proteína, polipéptido, péptido) en los métodos dados a conocer en el presente documento puede obtenerse de cualquier fuente o muestra adecuada.

[0273] Los métodos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para el análisis, incluyendo detección, identificación, cuantificación y/o secuenciación, de una pluralidad de macromoléculas simultáneamente (multiplexación). La multiplexación tal como se usa en el presente documento se refiere al análisis de una pluralidad de macromoléculas (por ejemplo, polipéptidos) en el mismo ensayo. La pluralidad de macromoléculas puede derivarse de la misma muestra o de muestras diferentes. La pluralidad de macromoléculas puede derivarse del mismo sujeto o de sujetos diferentes. La pluralidad de macromoléculas que se analizan puede ser macromoléculas diferentes, o la misma macromolécula derivada de muestras diferentes. Una pluralidad de macromoléculas incluye 2 o más macromoléculas, 5 o más macromoléculas, 10 o más macromoléculas, 50 o más macromoléculas, 100 o más macromoléculas, 500 o más macromoléculas, 1.000 o más macromoléculas, 5.000 o más macromoléculas, 10.000 o más macromoléculas, 50.000 o más macromoléculas, 100.000 o más macromoléculas, 500.000 o más macromoléculas, o 1.000.000 o más macromoléculas.

[0274] En algunas realizaciones, las macromoléculas (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, o péptidos) se obtienen de una muestra que es una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra comprende, pero no se limita a, células mamíferas o humanas, células de levadura, y/o células bacterianas. En algunas realizaciones, la muestra contiene células que proceden de una muestra obtenida de un organismo multicelular. Por ejemplo, la muestra puede aislarse de un individuo. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender un único tipo celular o múltiples tipos celulares. En algunas realizaciones, la muestra puede obtenerse de un organismo mamífero o un ser humano, por ejemplo, mediante punción, u otros procedimientos de recogida o muestreo. En algunas realizaciones, la muestra comprende dos o más células.

[0275] En algunas realizaciones, la muestra biológica puede contener células completas y/o células vivas y/o restos celulares. En algunos ejemplos, una fuente o muestra adecuada puede incluir, pero no se limita a: muestras biológicas, tales como muestras de biopsia, cultivos celulares, células (tanto células primarias como líneas celulares cultivadas), una muestra que comprende orgánulos o vesículas celulares, tejidos y extractos de tejidos; de prácticamente cualquier organismo. Por ejemplo, una fuente o muestra adecuada puede incluir, pero no se limita a: biopsia; materia fecal; líquidos corporales (tales como sangre, sangre completa, suero, plasma, orina, linfa, bilis, humor acuoso, leche materna, cerumen (cera del oído), quilo, quimo, endolinfa, perilinfa, exudados, líquido cefalorraquídeo, líquido intersticial, humor acuoso o vítreo, calostro, esputo, líquido amniótico, saliva, secreciones anales y vaginales, ácido gástrico, jugo gástrico, linfa, moco (incluyendo drenaje nasal y flema), líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, pus, legañas, saliva, sebo (aceite de piel), esputo, líquido sinovial, sudor y semen, un trasudado, vómitos, y mezclas de uno o más de los mismos, un exudado (por ejemplo, líquido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infección o inflamación) o líquido obtenido de una articulación (articulación normal o una articulación afectada por enfermedad tal como artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artritis séptica) de prácticamente cualquier organismo, prefiriéndose muestras derivadas de mamíferos, incluyendo muestras que contienen microbioma, y prefiriéndose particularmente muestras derivadas de seres humanos, incluyendo muestras que contienen microbioma; muestras ambientales (tales como muestras de aire, agricultura, agua y suelo); muestras microbianas incluyendo muestras derivadas de biopelículas y/o comunidades microbianas, así como esporas microbianas; muestras de tejidos incluyendo cortes de tejidos, muestras de investigación incluyendo líquidos extracelulares, sobrenadantes extracelulares de cultivos celulares, cuerpos de inclusión en bacterias, componentes celulares incluyendo mitocondrias y periplasma celular. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende un líquido corporal o se deriva de un líquido corporal, en la que el líquido corporal se obtiene de un mamífero o un ser humano. En algunas realizaciones, la muestra incluye líquidos corporales, o cultivos celulares de líquidos corporales.

[0277] En algunas realizaciones, las macromoléculas (por ejemplo, polipéptidos y proteínas) pueden obtenerse y prepararse a partir de un único tipo celular o múltiples tipos celulares. En algunas realizaciones, la muestra comprende una población de células. En algunas realizaciones, las macromoléculas (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, o péptidos) proceden de un componente celular o subcelular, una vesícula extracelular, un orgánulo, o un subcomponente organizado de los mismos. Las macromoléculas (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, o péptidos) pueden proceder de orgánulos, por ejemplo, mitocondrias, núcleos, o vesículas celulares. En una realización, pueden aislarse uno o más tipos específicos de células individuales o subtipos de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra puede incluir, pero no se limita a, orgánulos celulares (por ejemplo, núcleo, aparato de Golgi, ribosomas, mitocondrias, retículo endoplásmico, cloroplasto, membrana celular, vesículas, etc.).

[0278] En determinadas realizaciones, la macromolécula es o comprende una proteína, un complejo proteico, un polipéptido, o un péptido. La información de secuencia de aminoácidos y las modificaciones postraduccionales de un péptido, un polipéptido, o una proteína se transducen en una biblioteca codificada por ácido nucleico que puede analizarse mediante métodos de secuenciación de nueva generación. Un péptido puede comprender L-aminoácidos, D-aminoácidos, o ambos. Un péptido, un polipéptido, una proteína, o un complejo proteico puede comprender un aminoácido que se produce de manera natural convencional, un aminoácido modificado (por ejemplo, modificación postraduccional), un análogo de aminoácido, un mimético de aminoácido, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un péptido, un polipéptido, o una proteína se produce de manera natural, se produce de manera sintética, o se expresa de manera recombinante. En cualquiera de las realizaciones de péptido mencionadas anteriormente, un péptido, un polipéptido, una proteína, o un complejo proteico puede comprender además una modificación postraduccional. Los aminoácidos que se producen de manera natural convencionales incluyen alanina (A o Ala), cisteína (C o Cys), ácido aspártico (D o Asp), ácido glutámico (E o Glu), fenilalanina (F o Phe), glicina (G o Gly), histidina (H o His), isoleucina (I o Ile), lisina (K o Lys), leucina (L o Leu), metionina (M o Met), asparagina (N o Asn), prolina (P o Pro), glutamina (Q o Gln), arginina (R o Arg), serina (S o Ser), treonina (T o Thr), valina (V o Val), triptófano (W o Trp), y tirosina (Y o Tyr). Los aminoácidos no convencionales incluyen selenocisteína, pirrolisina, y N-formil-metionina, β-aminoácidos, homo-aminoácidos, derivados de prolina y ácido pirúvico, derivados de alanina con sustitución en 3, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina con sustitución en el anillo, aminoácidos de núcleo lineal, y N-metil-aminoácidos.

[0280] Una modificación postraduccional (PTM) de un péptido, un polipéptido, o una proteína puede ser una modificación covalente o modificación enzimática. Los ejemplos de modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, acilación, acetilación, alquilación (incluyendo metilación), biotinilación, butirilación, carbamilación, carbonilación, desamidación, desiminiación, formación de diftamida, formación de puentes disulfuro, eliminilación, unión de flavina, formilación, gamma-carboxilación, glutamilación, glicilación, glicosilación (por ejemplo, ligada a N, ligada a O, ligada a C, fosfoglicosilación), glipiación, unión de hemo C, hidroxilación, formación de hipusina, yodación, isoprenilación, lipidación, lipoilación, malonilación, metilación, miristoilación, oxidación, palmitoilación, pegilación, fosfopanteteinilación, fosforilación, prenilación, propionilación, formación de base de Schiff de retinilideno, S-glutationilación, S-nitrosilación, S-sulfenilación, selenación, succinilación, sulfinación, ubiquitinación, y amidación C-terminal. Una modificación postraduccional incluye modificaciones del extremo terminal amino y/o del extremo terminal carboxilo de un péptido, un polipéptido, o una proteína. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de desamino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior, y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de amida, (alquil inferior)-amida, dialquilamida, y éster alquílico inferior (por ejemplo, en las que alquilo inferior es alquilo C<1>-C<4>). Una modificación postraduccional también incluye modificaciones tales como, pero sin limitarse a, las descritas anteriormente, de aminoácidos que se encuentran entre los extremos terminales amino y carboxilo de un péptido, un polipéptido, o una proteína. La modificación postraduccional puede regular la “biología” de una proteína dentro de una célula, por ejemplo, su actividad, estructura, estabilidad, o localización. Por ejemplo, la fosforilación desempeña un papel importante en la regulación de proteínas, particularmente en la señalización celular (Prabakaranet al., 2012, Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 4: 565-583). En otro ejemplo, se ha mostrado que la adición de azúcares a proteínas, tal como glicosilación, fomenta el plegamiento de proteínas, mejora la estabilidad, y modifica la función reguladora, y la unión de lípidos a proteínas permite direccionamiento hacia la membrana celular. Una modificación postraduccional también puede incluir modificaciones de péptidos, polipéptidos, o proteínas para incluir uno o más marcadores detectables.

[0282] En determinadas realizaciones, un péptido, un polipéptido, o una proteína puede fragmentarse. Los péptidos, polipéptidos, o proteínas pueden fragmentarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo fragmentación por una proteasa o endopeptidasa. En algunas realizaciones, la fragmentación de un péptido, un polipéptido, o una proteína está dirigida mediante el uso de una proteasa o endopeptidasa específica. Una proteasa o endopeptidasa específica se une a y realiza escisión en una secuencia de consenso específica (por ejemplo, proteasa de TEV). En otras realizaciones, la fragmentación de un péptido, un polipéptido, o una proteína no está dirigida o es aleatoria mediante el uso de una proteasa o endopeptidasa inespecífica. Una proteasa inespecífica puede unirse a y realizar escisión en un residuo de aminoácido específico en lugar de una secuencia de consenso (por ejemplo, la proteinasa K es una serina proteasa inespecífica). En algunas realizaciones, las proteinasas y endopeptidasas, tales como las conocidas en la técnica, pueden usarse para escindir una proteína o un polipéptido en fragmentos peptídicos más pequeños, que incluyen proteinasa K, tripsina, quimotripsina, pepsina, termolisina, trombina, factor Xa, furina, endopeptidasa, papaína, pepsina, subtilisina, elastasa, enterocinasa, Genenase<™>I, endoproteinasa LysC, endoproteinasa AspN, endoproteinasa GluC, etc. (Granvoglet al., 2007, Anal Bioanal Chem 389: 991-1002). En determinadas realizaciones, un péptido, un polipéptido, o una proteína se fragmenta mediante proteinasa K, u opcionalmente, una versión termolábil de proteinasa K para permitir una rápida inactivación. En algunos casos, la proteinasa K es estable en reactivos desnaturalizantes, tales como urea y SDS, y permite la digestión de proteínas completamente desnaturalizadas. La fragmentación de proteínas y polipéptidos para dar péptidos puede realizarse antes o después de la unión de una etiqueta de ADN o etiqueta de registro de ADN.

[0283] También pueden usarse reactivos químicos para digerir proteínas para dar fragmentos peptídicos. Un reactivo químico puede realizar escisión en un residuo de aminoácido específico (por ejemplo, el bromuro de cianógeno hidroliza los enlaces peptídicos en el extremo C-terminal de los residuos de metionina). Los reactivos químicos para fragmentar polipéptidos o proteínas para dar péptidos más pequeños incluyen bromuro de cianógeno (CNBr), hidroxilamina, hidrazina, ácido fórmico, BNPS-escatol [2-(2-nitrofenilsulfenil)-3-metilindol], ácido yodosobenzoico, •NTCB Ni (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico), etc.

[0285] En determinadas realizaciones, tras la escisión enzimática o química, los fragmentos peptídicos resultantes tienen aproximadamente la misma longitud deseada, por ejemplo, desde aproximadamente 10 aminoácidos hasta aproximadamente 70 aminoácidos, desde aproximadamente 10 aminoácidos hasta aproximadamente 60 aminoácidos, desde aproximadamente 10 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40 aminoácidos, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 aminoácidos, desde aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 70 aminoácidos, desde aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 60 aminoácidos, desde aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 aminoácidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 aminoácidos, desde aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 70 aminoácidos, desde aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 60 aminoácidos, desde aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, o desde aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 40 aminoácidos. Una reacción de escisión puede monitorizarse, preferiblemente en tiempo real, realizando adiciones conocidas a la muestra de proteína o polipéptido de un péptido de FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) de prueba corto que comprende una secuencia de péptido que contiene un sitio de escisión de proteinasa o endopeptidasa. En el péptido de FRET intacto, se unen un grupo fluorescente y un grupo extintor a cualquier extremo de la secuencia de péptido que contiene el sitio de escisión, y la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre el extintor y el fluoróforo conduce a una baja fluorescencia. Tras la escisión del péptido de prueba mediante una proteasa o endopeptidasa, se separan el extintor y el fluoróforo proporcionan un gran aumento en la fluorescencia. Una reacción de escisión puede detenerse cuando se logra una determinada intensidad de fluorescencia, lo que permite que se logre un punto final de escisión reproducible.

[0287] En algunos aspectos, una muestra de macromoléculas (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, o proteínas) puede someterse a métodos de fraccionamiento de proteínas donde las proteínas o los péptidos se separan por una o más propiedades tales como ubicación celular, peso molecular, hidrofobia, punto isoeléctrico, o métodos de enriquecimiento de proteínas. En algunas realizaciones, se fracciona un subconjunto de macromoléculas (por ejemplo, proteínas) dentro de una muestra de manera que un subconjunto de las macromoléculas se clasifica del resto de la muestra. Por ejemplo, la muestra puede someterse a métodos de fraccionamiento antes de la unión a un soporte. Alternativamente, o adicionalmente, pueden usarse métodos de enriquecimiento de proteínas para seleccionar una proteína o un péptido específico (véase, por ejemplo, Whiteakeret al., 2007, Anal. Biochem.362:44-54) o para seleccionar una modificación postraduccional particular (véase, por ejemplo, Huanget al., 2014. J. Chromatogr. A 1372:1-17). Alternativamente, una clase o clases particulares de proteínas tales como inmunoglobulinas, o isotipos de inmunoglobulina (Ig) tales como IgG, pueden enriquecerse por afinidad o seleccionarse para su análisis. En el caso de moléculas de inmunoglobulina, el análisis de la secuencia y la abundancia o frecuencia de secuencias hipervariables implicadas en la unión por afinidad son de particular interés, particularmente ya que varían en cuanto a respuesta a la progresión de la enfermedad o se correlacionan con fenotipos sanos, inmunitarios, y/o patológicos. Las proteínas excesivamente abundantes también pueden eliminarse de la muestra usando métodos de inmunoafinidad convencionales. El agotamiento de proteínas abundantes puede ser útil para muestras de plasma donde más del 80 % del constituyente proteico es albúmina e inmunoglobulinas. Hay disponibles varios productos comerciales para el agotamiento de proteínas excesivamente abundantes de las muestras de plasma, incluyendo columnas de centrifugación de agotamiento que retiran las 2-20 proteínas plasmáticas principales (Pierce, Agilent), o PROTIA y PROT20 (Sigma-Aldrich).

[0289] En determinadas realizaciones, un intervalo dinámico de muestra de proteína puede modularse fraccionando la muestra de proteína usando métodos de fraccionamiento convencionales, incluyendo electroforesis y cromatografía de líquidos (Zhouet al., 2012, Anal Chem 84(2): 720-734), o sometiendo a partición las fracciones en compartimentos (por ejemplo, gotitas) cargadas con perlas/resinas de unión a proteína de capacidad limitada (por ejemplo, partículas de sílice hidroxilada) (McCormick, 1989, Anal Biochem 181(1): 66-74) y eluyendo la proteína unida. El exceso de proteína en cada fracción compartimentada se retira por lavado. Los ejemplos de métodos electroforéticos incluyen electroforesis capilar (CE), isoelectroenfoque capilar (CIEF), isotacoforesis capilar (CITP), electroforesis de flujo libre, electroforesis de atrapamiento de fracción líquida eluida con gel (GELFrEE). Los ejemplos de métodos de separación de proteínas por cromatografía de líquidos incluyen fase inversa (RP), intercambio iónico (IE), exclusión molecular (SE), interacción hidrófila, etc. Los ejemplos de particiones de compartimento incluyen emulsiones, gotitas, micropocillos, regiones separadas físicamente sobre un sustrato plano, etc. Las perlas/resinas de unión a proteínas a modo de ejemplo incluyen nanopartículas de sílice derivatizadas con grupos fenol o grupos hidroxilo (por ejemplo, resina StrataClean de Agilent Technologies, RapidClean de LabTech, etc.). Limitando la capacidad de unión de las perlas/resinas, las proteínas altamente abundantes que eluyen en una fracción dada sólo se unirán parcialmente a las perlas, y se retirarán las proteínas en exceso.

[0291] En algunas realizaciones, se usa un código de barras de partición que comprende la asignación de un código de barras único a un submuestreo de macromoléculas a partir de una población de macromoléculas dentro de una muestra. Este código de barras de partición puede estar compuesto por códigos de barras idénticos que surgen de la partición de macromoléculas dentro de compartimentos marcadas con el mismo código de barras (por ejemplo, una población de perlas con código de barras en la que múltiples perlas comparten el mismo código de barras). El uso de compartimentos físicos submuestrea eficazmente la muestra original para proporcionar la asignación de códigos de barras de partición. Por ejemplo, se proporciona un conjunto de perlas marcadas con 10.000 códigos de barras de compartimento diferentes. Además, supóngase que, en un ensayo dado, se usa una población de 1 millón de perlas en el ensayo. En promedio, hay 100 perlas por código de barras de compartimento (distribución de Poisson). Supóngase además que las perlas capturan un agregado de 10 millones de macromoléculas. En promedio, hay 10 macromoléculas por perla, con 100 compartimentos por código de barras de compartimento, hay efectivamente 1.000 macromoléculas por código de barras de partición (compuesto por 100 códigos de barras de compartimento para 100 compartimentos físicos distintos).

[0293] En otra realización, se logran la partición de moléculas individuales y el etiquetado con código de barras de partición de los polipéptidos marcando los polipéptidos (de manera química o enzimática) con una etiqueta de UMI de ADN amplificable (por ejemplo, etiqueta de registro) en el extremo N-terminal o C-terminal, o ambos. Las etiquetas de ADN se unen al cuerpo del polipéptido (aminoácidos internos) mediante fotomarcaje inespecífico o unión química específica a aminoácidos reactivos tales como lisinas. Se transfiere la información desde la etiqueta de registro unida al extremo terminal del péptido hasta las etiquetas de ADN mediante una etapa de PCR en emulsión enzimática (Williamset al., Nat Methods, (2006) 3(7):545-550; Schutzeet al., Anal Biochem. (2011) 410(1):155-157) o transcripciónin vitro/transcripción inversa (IVT/RT) en emulsión. En la realización preferida, se emplea una nanoemulsión de manera que, en promedio, hay menos de un único polipéptido por gotita de emulsión con un tamaño de desde 50 nm hasta 1000 nm (Nishikawaet al., J Nucleic Acids. (2012) 2012: 923214; Guptaet al., Soft Matter. (2016) 12(11):2826-41; Soleet al., Langmuir (2006, 22(20):8326-8332). Adicionalmente, todos los componentes de PCR se incluyen en la mezcla de emulsión acuosa incluyendo cebadores, dNTP, Mg<2+>, polimerasa, y tampón de PCR. Si se usa IVT/RT, entonces la etiqueta de registro se diseña con una secuencia de promotor de ARN polimerasa de T7/SP6 para generar transcritos que se hibridan con las etiquetas de ADN unidas al cuerpo del polipéptido (Ryckelyncket al., RNA. (2015) 21(3):458-469). Una transcriptasa inversa (RT) copia la información desde la molécula de ARN hibridada hasta la etiqueta de ADN. De esta manera, puede usarse PCR o IVT/RT en emulsión para transferir eficazmente la información desde la etiqueta de registro de extremo terminal hasta las múltiples etiquetas de ADN unidas al cuerpo del polipéptido.

[0295] En algunas realizaciones, una muestra de dianas de macromolécula (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, o proteínas) puede procesarse en un área o volumen físico, por ejemplo, en un compartimento. Pueden realizarse diversas etapas de procesamiento y/o marcaje en la muestra. En algunas realizaciones, el compartimento separa o aísla un subconjunto de macromoléculas a partir de una muestra de macromoléculas. En algunos ejemplos, el compartimento puede ser un compartimento acuoso (por ejemplo, gotita microfluídica), un compartimento sólido (por ejemplo, pocillo de picotitulación o pocillo de microtitulación en una placa, tubo, vial, perlas), o una región separada sobre una superficie. En algunos casos, un compartimento puede comprender una o más perlas sobre las que pueden inmovilizarse las macromoléculas. En algunas realizaciones, las macromoléculas en un compartimento se marcan con una etiqueta de compartimento que incluye un código de barras. Por ejemplo, las macromoléculas en un compartimento pueden marcarse con el mismo código de barras o las macromoléculas en múltiples compartimentos pueden marcarse con el mismo código de barras. Véase, por ejemplo, Valihrachet al., Int J Mol Sci.11 de marzo de 2018;19(3). pii: E807. La encapsulación del contenido celular mediante gelificación en perlas es un enfoque útil para el análisis de células individuales (Tamminenet al., Front Microbiol (2015) 6: 195; Spenceret al., ISME J (2016) 10(2): 427-436). El etiquetado con código de barras de gotitas celulares individuales permite que la totalidad de los componentes de una célula individual se marquen con el mismo identificador (Kleinet al., Cell (2015) 161(5): 1187-1201; Zilioniset al., Nat Protoc (2017) 12(1): 44-73; publicación de patente internacional n.º WO 2016/130704). El etiquetado con código de barras de compartimentos puede lograrse de varias maneras, incluyendo la incorporación directa de códigos de barras únicos en cada gotita mediante unión de gotitas (Bio-Rad Laboratories), la introducción de perlas con código de barras en gotitas (10X Genomics), o el etiquetado con código de barras combinatorio de los componentes de la gotita tras la encapsulación y la gelificación usando un etiquetado con código de barras combinatorio de división-agrupación tal como describen Gundersonet al. (publicación de patente internacional n.º WO 2016/130704). También puede aplicarse un esquema de marcaje combinatorio similar a los núcleos (Vitaket al., Nat Methods (2017) 14(3):302-308).

[0297] En algunas realizaciones, la macromolécula se une a un soporte antes de ponerse en contacto con un agente de unión. En algunos casos, es deseable usar un soporte con una gran capacidad portante para inmovilizar un gran número de macromoléculas en una muestra. En algunas realizaciones, se prefiere inmovilizar las macromoléculas usando un soporte tridimensional (por ejemplo, una matriz porosa o una perla). En algunos ejemplos, la preparación incluye unir la macromolécula a una molécula de ácido nucleico o un oligonucleótido antes o después de inmovilizar la macromolécula. En algunas realizaciones, se une una pluralidad de macromoléculas a un soporte antes de ponerse en contacto con un agente de unión.

[0299] Un soporte puede ser cualquier soporte sólido o poroso incluyendo, pero sin limitarse a, una perla, una microperla, una matriz, una superficie de vidrio, una superficie de silicio, una superficie de plástico, un filtro, una membrana, una membrana de PTFE, nailon, un pocillo de microtitulación, una placa de ELISA, un disco de interferometría giratorio, una membrana de nitrocelulosa, una superficie de polímero a base de nitrocelulosa, una nanopartícula, o una microesfera. Los materiales para un soporte incluyen, pero no se limitan a, acrilamida, agarosa, celulosa, dextrano, nitrocelulosa, vidrio, oro, cuarzo, poliestireno, poli(etileno-acetato de vinilo), polipropileno, poliéster, polimetacrilato, poliacrilato, polietileno, poli(óxido de etileno), polisilicatos, policarbonatos, poli(alcohol vinílico) (PVA), Teflon, fluorocarbonos, nailon, caucho de silicio, sílice, polianhídridos, poli(ácido glicólico), poli(cloruro de vinilo), poli(ácido láctico), poliortoésteres, silano funcionalizado, poli(fumerato de propilo), colágeno, glicosaminoglicanos, poliaminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, un soporte es una perla, por ejemplo, una perla de poliestireno, una perla de polímero, una perla de poliacrilato, una perla de agarosa, una perla de celulosa, una perla de dextrano, una perla de acrilamida, una perla de núcleo sólido, una perla porosa, una perla paramagnética, una perla de vidrio, una perla a base de sílice, o una perla de poro controlado, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones específicas, el soporte es una perla de agarosa porosa.

[0300] En algunas realizaciones, el soporte puede comprender cualquier material sólido adecuado, incluyendo materiales porosos y no porosos, al que una macromolécula, por ejemplo, un polipéptido, puede asociarse de manera directa o indirecta, por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo interacciones covalentes y no covalentes, o cualquier combinación de las mismas. Un soporte puede ser bidimensional (por ejemplo, superficie plana) o tridimensional (por ejemplo, perla o matriz de gel). Un soporte puede ser cualquier superficie de soporte incluyendo, pero sin limitarse a, una perla, una microperla, una matriz, una superficie de vidrio, una superficie de silicio, una superficie de plástico, un filtro, una membrana, una membrana de PTFE, una membrana de PTFE, una membrana de nitrocelulosa, una superficie de polímero a base de nitrocelulosa, nailon, un pocillo de microtitulación, una placa de ELISA, un disco de interferometría giratorio, una matriz de polímero, una nanopartícula, o una microesfera. Los materiales para un soporte incluyen, pero no se limitan a, acrilamida, agarosa, celulosa, dextrano, nitrocelulosa, vidrio, oro, cuarzo, poliestireno, poli(etileno-acetato de vinilo), polipropileno, poliéster, polimetacrilato, poliacrilato, polietileno, poli(óxido de etileno), polisilicatos, policarbonatos, poli(alcohol vinílico) (PVA), Teflon, fluorocarbonos, nailon, caucho de silicio, polianhídridos, poli(ácido glicólico), poli(cloruro de vinilo), poli(ácido láctico), poliortoésteres, silano funcionalizado, poli(fumerato de propilo), colágeno, glicosaminoglicanos, poliaminoácidos, dextrano, o cualquier combinación de los mismos. Los soportes incluyen además película delgada, membrana, botellas, placas, fibras, fibras tejidas, polímeros conformados tales como tubos, partículas, perlas, microesferas, micropartículas, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, cuando la superficie sólida es una perla, la perla puede incluir, pero no se limita a, una perla cerámica, una perla de poliestireno, una perla de polímero, una perla de poliacrilato, una perla de metilestireno, una perla de agarosa, una perla de celulosa, una perla de dextrano, una perla de acrilamida, una perla de núcleo sólido, una perla porosa, una perla paramagnética, una perla de vidrio, o una perla de poro controlado, una perla a base de sílice, o cualquier combinación de las mismas. Una perla puede ser esférica o tener una forma irregular. Una perla o un soporte puede ser poroso. El tamaño de una perla puede oscilar desde nanómetros, por ejemplo, 100 nm, hasta milímetros, por ejemplo, 1 mm. En determinadas realizaciones, las perlas oscilan en cuanto a tamaño desde aproximadamente 0,2 micrómetros hasta aproximadamente 200 micrómetros, o desde aproximadamente 0,5 micrómetros hasta aproximadamente 5 micrómetros. En algunas realizaciones, las perlas pueden tener aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 2,8, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 15, ó 20 µm de diámetro. En determinadas realizaciones, un soporte sólido de “una perla” puede referirse a una perla individual o una pluralidad de perlas. En algunas realizaciones, la superficie sólida es una nanopartícula. En determinadas realizaciones, las nanopartículas oscilan en cuanto a tamaño desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 500 nm de diámetro, por ejemplo, entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 20 nm, entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 50 nm, entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 50 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 200 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 150, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 200 nm, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 200 nm, o entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 500 nm de diámetro. En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden tener aproximadamente 10 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 300 nm, o aproximadamente 500 nm de diámetro. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen menos de aproximadamente 200 nm de diámetro.

[0302] Pueden usarse diversas reacciones para unir las macromoléculas a un soporte (por ejemplo, un sólido o un soporte poroso). Las macromoléculas pueden unirse de manera directa o indirecta al soporte. En algunos casos, las macromoléculas se unen al soporte a través de un ácido nucleico. Las reacciones a modo de ejemplo incluyen la reacción catalizada con cobre de una azida y un alquino para formar un triazol (cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen), cicloadición de azida-alquino fomentada por deformación (SPAAC), reacción de un dieno y un dienófilo (Diels-Alder), cicloadición de alquino-nitrona fomentada por deformación, reacción de un alqueno deformado con una azida, una tetrazina o un tetrazol, cicloadición [3+2] de alqueno y azida, reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa de alqueno y tetrazina (IEDDA) (por ejemplo, m-tetrazina (mTet) o fenil-tetrazina (pTet) y trans-cicloocteno (TCO); o pTet y un alqueno), fotorreacción de alqueno y tetrazol, ligamiento de Staudinger de azidas y fosfinas, y diversas reacciones de desplazamiento, tales como desplazamiento de un grupo saliente mediante ataque nucleófilo en un átomo electrófilo (Horisawa 2014, Knall, Hollaufet al.2014). Las reacciones de desplazamiento a modo de ejemplo incluyen reacción de una amina con: un éster activado; un éster de N-hidroxisuccinimida; un isocianato; un isotioscianato, un aldehído, un epóxido, o similares. En algunas realizaciones, se usa química clic de iEDDA para inmovilizar macromoléculas (por ejemplo, polipéptidos) sobre un soporte dado que es rápida y produce altos rendimientos a bajas concentraciones de entrada. En otra realización, se usa m-tetrazina en lugar de tetrazina en una reacción de química clic de iEDDA, ya que la m-tetrazina tiene una estabilidad de enlace mejorada. En otra realización, se usa fenil-tetrazina (pTet) en una reacción de química clic de iEDDA. En un caso, un polipéptido se marca con un reactivo de química clic bifuncional, tal como un reactivo de éster de alquino-NHS (éster de acetileno-PEG-NHS), o alquino-benzofenona para generar un polipéptido marcado con alquino. En algunas realizaciones, un alquino también puede ser un alquino deformado, tal como ciclooctinos incluyendo dibenzociclooctilo (DBCO), etc.

[0303] En determinadas realizaciones donde se inmovilizan múltiples macromoléculas sobre el mismo soporte, las macromoléculas pueden separarse apropiadamente para adaptarse a las etapas de análisis que van a usarse para evaluar la diana. Por ejemplo, puede ser ventajoso separar las macromoléculas que permitan óptimamente que se realice un método basado en ácidos nucleicos para evaluar y secuenciar las proteínas. En algunos casos, la separación de las macromoléculas sobre el soporte se determina basándose en la consideración de que la transferencia de información desde una molécula de adaptador hibridada con la etiqueta de codificación de un agente de unión unido a una macromolécula inmovilizada puede alcanzar una macromolécula vecina.

[0305] En algunas realizaciones, la superficie del soporte está pasivada (bloqueada). Una superficie “pasivada” se refiere a una superficie que se ha tratado con una capa exterior de material. Los métodos de pasivación de superficies incluyen métodos convencionales de la bibliografía de análisis de moléculas individuales fluorescentes, incluyendo pasivación de superficies con polímeros tales como polietilenglicol (PEG) (Panet al., 2015, Phys. Biol. 12:045006), polisiloxano (por ejemplo, Pluronic F-127), polímeros en estrella (por ejemplo, PEG en estrella) (Grollet al., 2010, Methods Enzymol. 472:1-18), diclorodimetilsilano (DDS) hidrófobo Tween-20 autoensamblado (Huaet al., 2014, Nat. Methods 11:1233-1236), carbono de tipo diamante (DLC), DLC PEG (Staviset al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:983-988), y resto zwitteriónico (por ejemplo, publicación de solicitud de patente estadounidense US 2006/0183863). Además de modificaciones covalentes de la superficie, también pueden emplearse varios agentes de pasivación, incluyendo tensioactivos tales como Tween-20, polisiloxano en disolución (serie Pluronic), poli(alcohol vinílico) (PVA), y proteínas tales como BSA y caseína. Alternativamente, puede titularse la densidad de macromoléculas (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, o péptidos) sobre la superficie o dentro del volumen de un sustrato sólido realizando adiciones conocidas de una molécula reactiva competidora o “ficticia” cuando se inmovilizan las proteínas, los polipéptidos o los péptidos sobre el sustrato sólido.

[0307] Para controlar la separación de las dianas inmovilizadas sobre el soporte, puede titularse la densidad de grupos de acoplamiento funcionales para unir la diana (por ejemplo, TCO o grupos carboxilo (COOH)) sobre la superficie del sustrato. En algunas realizaciones, múltiples moléculas (por ejemplo, macromoléculas) diana están separadas sobre la superficie o dentro del volumen (por ejemplo, soportes porosos) de un soporte de manera que las moléculas adyacentes están separadas una distancia de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 400 nm, o de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 300 nm, o de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm, o de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, múltiples moléculas están separadas sobre la superficie de un soporte con una distancia promedio de al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, al menos 150 nm, al menos 200 nm, al menos 250 nm, al menos 300 nm, al menos 350 nm, al menos 400 nm, al menos 450 nm, o al menos 500 nm. En algunas realizaciones, múltiples moléculas están separadas sobre la superficie de un soporte con una distancia promedio de al menos 50 nm. En algunas realizaciones, las moléculas están separadas sobre la superficie o dentro del volumen de un soporte de manera que, empíricamente, la frecuencia relativa de eventos intermoleculares con respecto a intramoleculares (por ejemplo, transferencia de información) es <1:10; <1:100; <1:1.000; o <1:10.000.

[0309] En algunas realizaciones, la pluralidad de macromoléculas se acopla al soporte separadas una distancia promedio entre dos moléculas adyacentes que oscila desde aproximadamente 50 hasta 100 nm, desde aproximadamente 50 hasta 250 nm, desde aproximadamente 50 hasta 500 nm, desde aproximadamente 50 hasta 750 nm, desde aproximadamente 50 hasta 1.000 nm, desde aproximadamente 50 hasta 1.500 nm, desde aproximadamente 50 hasta 2.000 nm, desde aproximadamente 100 hasta 250 nm, desde aproximadamente 100 hasta 500 nm, desde aproximadamente 200 hasta 500 nm, desde aproximadamente 300 hasta 500 nm, desde aproximadamente 100 hasta 1.000 nm, desde aproximadamente 500 hasta 600 nm, desde aproximadamente 500 hasta 700 nm, desde aproximadamente 500 hasta 800 nm, desde aproximadamente 500 hasta 900 nm, desde aproximadamente 500 hasta 1.000 nm, desde aproximadamente 500 hasta 2.000 nm, desde aproximadamente 500 hasta 5.000 nm, desde aproximadamente 1.000 hasta 5.000 nm, o desde aproximadamente 3.000 hasta 5.000 nm.

[0311] En algunas realizaciones, se logra una separación apropiada de las macromoléculas sobre el soporte titulando la razón de moléculas de unión disponibles sobre la superficie del sustrato. En algunos ejemplos, la superficie del sustrato (por ejemplo, superficie de perla) está funcionalizada con un grupo carboxilo (COOH) que se trata con un agente de activación (por ejemplo, el agente de activación es EDC y sulfo-NHS). En algunos ejemplos, la superficie del sustrato (por ejemplo, superficie de perla) comprende restos de NHS. En algunas realizaciones, se añade una mezcla de mPEGn-NH<2>y NH<2>-PEGn-mTet a las perlas activadas (en los quenes cualquier número, tal como 1-100). Se titula la razón entre mPEG<3>-NH<2>(no disponible para el acoplamiento) y NH<2>-PEG<24>-mTet (disponible para el acoplamiento) para generar una densidad apropiada de restos funcionales disponibles para unir los polipéptidos a la superficie del sustrato. En determinadas realizaciones, la separación media entre restos de acoplamiento (por ejemplo, NH<2>-PEG<4>-mTet) sobre la superficie sólida es de al menos 50 nm, al menos 100 nm, al menos 250 nm, o al menos 500 nm. En algunas realizaciones específicas, la razón de NH<2>-PEGn-mTet con respecto a mPEG<3>-NH<2>es de aproximadamente 1:1.000 o superior, aproximadamente 1:10.000 o superior, aproximadamente 1:100.000 o superior, o aproximadamente 1:1.000.000 o superior. En algunas realizaciones adicionales, la etiqueta de registro se une a NH<2>-PEGn-mTet. En algunas realizaciones, la separación de las macromoléculas sobre el soporte se logra controlando la concentración y/o el número de grupos funcionales COOH u otros disponibles sobre el soporte.

[0313] B. Escisión

[0315] En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen además retirar una porción de la macromolécula tras la transferencia de información. La retirada de una porción de la macromolécula expone una nueva porción de la macromolécula para su análisis, por ejemplo, disponible para su unión mediante un agente de unión proporcionado en el siguiente ciclo de análisis. Si está analizándose un polipéptido, los métodos pueden incluir la retirada de una porción del polipéptido que incluye uno o más aminoácidos (por ejemplo, aminoácido terminal). En realizaciones referentes a métodos de análisis de péptidos o polipéptidos usando un enfoque basado en degradación, tras la puesta en contacto y la unión de un primer agente de unión a unnNTAA de un péptido denaminoácidos, y la transferencia de la información de etiqueta de codificación a un ácido nucleico asociado con el péptido generando de ese modo un ácido nucleico extendido de primer orden (por ejemplo, en la etiqueta de registro), se elimina elnNTAA. La retirada delnNTAA marcado poniéndose en contacto con una enzima o reactivos químicos convierte eln-1aminoácido del péptido en un aminoácido N-terminal, que se denomina en el presente documenton-1NTAA. Un segundo agente de unión se pone en contacto con el péptido o los polipéptidos y se une aln-1NTAA, y se transfiere información del segundo agente de unión desde la etiqueta de codificación hasta el ácido nucleico extendido de primer orden generando de ese modo un ácido nucleico extendido de segundo orden (por ejemplo, para generar un ácido nucleico extendido denésimoorden concatenado que representa el péptido). La eliminación deln-1NTAA marcado convierte eln-2aminoácido del péptido o los polipéptidos en un aminoácido N-terminal, que se denomina en el presente documenton-2NTAA. Pueden producirse unión, transferencia de información, y retirada adicionales tal como se describió anteriormente hastanaminoácidos para generar un ácido nucleico extendido denésimoorden onácidos nucleicos extendido independientes, que representan colectivamente el péptido o los polipéptidos. Tal como se usa en el presente documento, un “orden”ncuando se usa en referencia a un agente de unión, una etiqueta de codificación, o un ácido nucleico extendido se refiere al ciclonde unión, en el que se usa el agente de unión y su etiqueta de codificación asociada o se crea el ciclonde unión donde el ácido nucleico extendido (por ejemplo, en la etiqueta de registro). En algunas realizaciones, pueden realizarse etapas que incluyen el NTAA en el enfoque a modo de ejemplo descrito en lugar de con un aminoácido C-terminal (CTAA).

[0317] En determinadas realizaciones referentes a analizar péptidos o polipéptidos, el aminoácido terminal se retira o escinde del péptido o los polipéptidos para exponer un nuevo aminoácido terminal. Una porción del polipéptido para su retirada puede ser una porción marcada (por ejemplo, marcada o modificada químicamente) del polipéptido. En algunas realizaciones, el aminoácido terminal es un NTAA. En otras realizaciones, el aminoácido terminal es un CTAA. La escisión de un aminoácido terminal puede lograrse mediante varias técnicas conocidas, incluyendo escisión química y escisión enzimática. En algunas realizaciones, se usa una enzima modificada por ingeniería que cataliza o un reactivo que fomenta la retirada de un aminoácido N-terminal marcado (por ejemplo, marcado o modificado químicamente). En algunas realizaciones, el aminoácido terminal se retira o elimina usando cualquiera de los métodos tal como se describen en las publicaciones de patente internacional n.<os>WO 2019/089846 A1, WO 2020/223133 A1 y WO 2020/198264 A1.

[0319] En algunas realizaciones, el reactivo para retirar un aminoácido terminal incluye una carboxipeptidasa o una aminopeptidasa o una variante, un mutante, o una proteína modificada de las mismas; una hidrolasa o una variante, un mutante, o una proteína modificada de la misma; un reactivo de degradación de Edman suave; una enzima Edmanasa; TFA anhidro, una base; o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la degradación de Edman suave usa un dicloro-ácido o monocloro-ácido; la degradación de Edman suave usa TFA, TCA, o DCA; o la degradación de Edman suave usa trietilamina, trietanolamina, o acetato de trietilamonio (Et<3>NHOAc).

[0321] En algunos casos, el reactivo para retirar el aminoácido comprende una base. En algunas realizaciones, la base es un hidróxido, una amina alquilada, una amina cíclica, un tampón de carbonato, tampón de fosfato de trisodio, o una sal de metal. En algunos ejemplos, el hidróxido es hidróxido de sodio; la amina alquilada se selecciona de metilamina, etilamina, propilamina, dimetilamina, dietilamina, dipropilamina, trimetilamina, trietilamina, tripropilamina, ciclohexilamina, bencilamina, anilina, difenilamina, N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), y diisopropilamida de litio (LDA); la amina cíclica se selecciona de piridina, pirimidina, imidazol, pirrol, indol, piperidina, prolidina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), y 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN); el tampón de carbonato comprende carbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio, o bicarbonato de calcio; la sal de metal comprende plata; o la sal de metal es AgClO<4>.

[0323] En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen la escisión de un aminoácido N-terminal si está modificado mediante un grupo tal como PTC, PTC modificado, Cbz, DNP, SNP, acetilo, guanidinilo, metanimina diheterocíclica, etc. La escisión enzimática de un NTAA puede lograrse mediante una aminopeptidasa u otras peptidasas. Las aminopeptidasas se producen de manera natural como enzimas monoméricas y multiméricas, y pueden ser dependientes de metal o ATP. Las aminopeptidasas naturales tienen una especificidad muy limitada, y escinden genéricamente aminoácidos N-terminales de una manera procesiva, escindiendo un aminoácido tras otro. Para los métodos descritos en este caso, las aminopeptidasas (por ejemplo, aminopeptidasas metaloenzimáticas) pueden modificarse por ingeniería para poseer actividad catalítica o unión específica al NTAA sólo cuando se modifican con un marcador N-terminal. De esta manera, la aminopeptidasa escinde sólo un único aminoácido cada vez a partir del extremo N-terminal, y permite el control del ciclo de degradación. En algunas realizaciones, la aminopeptidasa modificada no es selectiva en cuanto a la identidad de residuo de aminoácido, mientras que es selectiva para el marcador N-terminal. En otras realizaciones, la aminopeptidasa modificada es selectiva tanto para la identidad de residuo de aminoácido como para el marcador N-terminal. Se han descrito mutantes de aminopeptidasa modificados por ingeniería que se unen a, y escinden, grupos individuales o pequeños de NTAA marcados (biotinilados) (véase la publicación PCT n.º WO2010/065322).

[0325] Se han descrito mutantes de aminopeptidasa modificados por ingeniería que se unen a, y escinden, grupos individuales o pequeños de NTAA marcados (biotinilados)(véase la publicación PCT n.º WO2010/065322). Las aminopeptidasas son enzimas que escinden aminoácidos a partir del extremo N-terminal de proteínas o péptidos. Las aminopeptidasas naturales tienen una especificidad muy limitada, y eliminan genéricamente aminoácidos N-terminales de una manera procesiva, escindiendo un aminoácido tras otro (Kishoret al., 2015, Anal. Biochem.488:6-8). Sin embargo, se han identificado aminopeptidasas específicas de residuo (Eriquezet al., J. Clin. Microbiol.1980, 12:667-71; Wilceet al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3472-3477; Liaoet al., 2004, Prot. Sci.13:1802-10). El control de la degradación por etapas del extremo N-terminal del péptido puede lograrse usando aminopeptidasas modificadas por ingeniería que sólo son activas (por ejemplo, actividad de unión o actividad catalítica) en presencia del marcador. En determinadas realizaciones, la aminopeptidasa puede modificarse por ingeniería para ser inespecífica, de manera que no reconoce selectivamente un aminoácido particular con respecto a otro, sin que más bien sólo reconoce el extremo N-terminal marcado. En aún otra realización, se logra escisión cíclica usando una acilpéptido hidrolasa (APH) modificada por ingeniería para escindir un NTAA acetilado. En aún otra realización, se emplea amidinación (guanidinilación) del NTAA para permitir una escisión suave del NTAA marcado usando NaOH (Hamada, (2016) Bioorg Med Chem Lett 26(7): 1690-1695).

[0327] En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto el polipéptido con una prolina aminopeptidasa en condiciones adecuadas para escindir una prolina N-terminal antes de la etapa (b). En algunos ejemplos, una prolina aminopeptidasa (PAP) es una enzima que es capaz de escindir específicamente una prolina N-terminal a partir de un polipéptido. Las enzimas PAP que escinden prolinas N-terminales también se denominan prolina iminopeptidasas (PIP). Las PAP monoméricas conocidas incluyen miembros de familia deB. coagulans, L. delbrueckii, N. gonorrhoeae, F. meningosepticum, S. marcescens, T. acidophilum, L. plantarum(MEROPS S33.001) Nakajimaet al., J Bacteriol. (2006) 188(4):1599-606; Kitazonoet al., Bacteriol (1992) 174(24):7919-7925). Las PAP multiméricos conocidas incluyenD. hansenii(Bolumaret al., (2003) 86(1-2):141-151) y homólogos similares de otras especies (Bastenet al., Mol Genet Genomics (2005) 272(6):673-679). Pueden emplearse variantes/mutantes o bien nativos o bien modificados por ingeniería de las PAP.

[0329] Para las realizaciones referentes a agentes de unión a CTAA, también se conocen en la técnica métodos de escisión de CTAA a partir de péptidos o polipéptidos. Por ejemplo, la patente estadounidense 6.046.053 da a conocer un método de hacer reaccionar el péptido o la proteína con un anhídrido de ácido alquílico para convertir el carboxilo terminal en oxazolona, liberando el aminoácido C-terminal mediante reacción con ácido y alcohol o con éster. La escisión enzimática de un CTAA también puede lograrse mediante una carboxipeptidasa. Varias carboxipeptidasas muestras preferencias de aminoácido, por ejemplo, la carboxipeptidasa B escinde preferentemente en aminoácidos básicos, tales como arginina y lisina. Tal como se describió anteriormente, las carboxipeptidasas también pueden modificarse de la misma manera que las aminopeptidasas para modificar por ingeniería las carboxipeptidasas que se unen específicamente a los CTAA que tienen un marcador C-terminal. De esta manera, la carboxipeptidasa sólo escinde un único aminoácido cada vez a partir del extremo C-terminal, y permite el control del ciclo de degradación. En algunas realizaciones, la carboxipeptidasa modificada no es selectiva en cuanto a la identidad de residuo de aminoácido, mientras que es selectiva para el marcador C-terminal. En otras realizaciones, la carboxipeptidasa modificada es selectiva tanto para la identidad de residuo de aminoácido como para el marcador C-terminal.

[0330] C. Análisis

[0331] En algunas realizaciones, la etiqueta de registro extendida generada a partir de la realización de los métodos proporcionados comprende información transferida desde una o más etiquetas de codificación. En algunas realizaciones, las etiquetas de registro extendidas comprenden una serie de información transferida desde una pluralidad de etiquetas de codificación indicativa del orden de unión mediante los agentes de unión. Esta etiqueta de registro extendida puede analizarse mediante cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, las etiquetas de registro extendidas (o una porción de las mismas) se amplifican antes de determinar al menos la secuencia de la(s) etiqueta(s) de codificación en la etiqueta de registro extendida. En algunas realizaciones, las etiquetas de registro extendidas (o una porción de las mismas) se liberan antes de determinar al menos la secuencia de la(s) etiqueta(s) de codificación en la etiqueta de registro extendida.

[0332] La longitud de la etiqueta de registro extendida final generada mediante los métodos descritos en el presente documento depende de múltiples factores, incluyendo la longitud de la(s) etiqueta(s) de codificación (por ejemplo, código de barras y espaciador), la longitud de los ácidos nucleicos (por ejemplo, opcionalmente incluyendo cualquier identificador molecular único, espaciador, sitio de cebado universal, código de barras, o combinaciones de los mismos). Tras la transferencia de la información de etiqueta final al ácido nucleico extendido (por ejemplo, desde cualquier etiqueta de codificación), la etiqueta puede someterse a remate de extremos mediante la adición de un sitio de cebado inverso universal a través de ligamiento, extensión de cebador u otros métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el sitio de cebado directo universal en el ácido nucleico (por ejemplo, en la etiqueta de registro) es compatible con el sitio de cebado inverso universal que está unido al ácido nucleico extendido final. En algunas realizaciones, un sitio de cebado inverso universal es un cebador P7 de Illumina o un cebador P5 de Illumina. Puede unirse P7 sentido o antisentido, dependiendo del sentido de cadena del ácido nucleico al que se transfiere la información identificativa de la etiqueta de codificación. Una biblioteca de ácidos nucleicos extendidos puede escindirse o amplificarse directamente a partir del soporte (por ejemplo, perlas) y usarse en protocolos y ensayos de secuenciación de nueva generación tradicionales.

[0333] En algunas realizaciones, se realiza una reacción de extensión de cebador en una biblioteca de ácidos nucleicos extendidos monocatenarios (por ejemplo, extendidos en la etiqueta de registro) para copiar cadenas complementarias de los mismos. En algunas realizaciones, el ensayo de secuenciación de péptidos (por ejemplo, ensayo ProteoCode) comprende varias etapas químicas y enzimáticas en una progresión cíclica.

[0334] Las etiquetas de registro de ácidos nucleicos extendidos pueden procesarse y analizarse usando una variedad de métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, se procesan y analizan etiquetas de registro extendidas que contienen la información de una o más etiquetas de codificación y cualesquiera otros componentes de ácido nucleico. En algunas realizaciones, puede concatenarse la colección de etiquetas de registro extendidas. En algunas realizaciones, la etiqueta de registro extendida puede amplificarse antes de determinar la secuencia.

[0335] Los ejemplos de métodos de secuenciación incluyen, pero no se limitan a, secuenciación por terminación de cadena (secuenciación de Sanger); métodos de secuenciación de nueva generación, tales como secuenciación por síntesis, secuenciación por ligamiento, secuenciación por hibridación, secuenciación de polonias, secuenciación por semiconductores iónicos, y pirosecuenciación; y métodos de secuenciación de tercera generación, tales como secuenciación en tiempo real de una sola molécula, secuenciación basada en nanoporos, secuenciación interrumpida por dúplex, y obtención de imágenes directa de ADN usando microscopía avanzada.

[0336] Los métodos de secuenciación adecuados para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, secuenciación por hibridación, tecnología de secuenciación por síntesis (por ejemplo, HiSeq<™>y Solexa<™>, Illumina), tecnología SMRT<™>(en tiempo real de una sola molécula) (Pacific Biosciences), secuenciación de molécula única verdadera (por ejemplo, HeliScope<™>, Helicos Biosciences), secuenciación de nueva generación masivamente paralela (por ejemplo, SOLiD<™>, Applied Biosciences; Solexa y HiSeq<™>, Illumina), secuenciación por semiconductores masivamente paralela (por ejemplo, Ion Torrent), tecnología de pirosecuenciación (por ejemplo, GS FLX y GS Junior Systems, Roche/454), secuencia de nanoporos (por ejemplo, Oxford Nanopore Technologies).

[0337] Una biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) puede amplificarse de diversas maneras. Una biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, etiquetas de registro que comprenden información de una o más etiquetas de codificación) se somete a amplificación exponencial, por ejemplo, mediante PCR o PCR en emulsión. Se sabe que la PCR en emulsión produce una amplificación más uniforme (Hori, Fukanoet al., Biochem Biophys Res Commun (2007) 352(2): 323-328). Alternativamente, una biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) puede someterse a amplificación lineal, por ejemplo, mediante transcripciónin vitrode ADN molde usando ARN polimerasa de T7. La biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) puede amplificarse usando cebadores compatibles con el sitio de cebado directo universal y el sitio de cebado inverso universal contenidos en los mismos. Una biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, la etiqueta de registro) también puede amplificarse usando cebadores personalizados para añadir secuencia o bien al extremo 5’, o bien al extremo 3’, o bien a ambos extremos de los ácidos nucleicos extendidos. Las secuencias que pueden añadirse a los extremos terminales de los ácidos nucleicos extendidos incluyen secuencias de índice específicas de biblioteca para permitir la multiplexación de múltiples bibliotecas en una única ejecución de secuenciación, secuencias adaptadoras, secuencias de cebador de lectura, o cualesquiera otras secuencias para hacer que la biblioteca de ácidos nucleicos extendidos sea compatible para una plataforma de secuenciación. Un ejemplo de una amplificación de biblioteca en preparación para la secuenciación de nueva generación es tal como sigue: se establece un volumen de reacción PCR de 20 µl usando una biblioteca de ácidos nucleicos extendidos eluida a partir de ~1 mg de perlas (~10 ng), dNTP 200 µM, 1 µM de cada cebador de amplificación directo e inverso, 0,5 µl (1 U) de la enzima de inicio caliente Phusion (New England Biolabs) y se somete a las siguientes condiciones de ciclado: 98 ºC durante 30 s seguido por 20 ciclos de 98 ºC durante 10 s, 60 ºC durante 30 s, 72 ºC durante 30 s, seguido por 72 ºC durante 7 min, luego mantener a 4 ºC.

[0339] En determinadas realizaciones, o bien antes, o bien durante, o bien después de la amplificación, la biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) puede someterse a enriquecimiento de diana. En algunas realizaciones, el enriquecimiento de diana puede usarse para capturar o amplificar selectivamente ácidos nucleicos extendidos que representan macromoléculas (por ejemplo, polipéptidos) de interés a partir de una biblioteca de ácidos nucleicos extendidos antes de la secuenciación. En algunos aspectos, el enriquecimiento de diana para la secuenciación de proteínas es un desafío debido al alto coste y a la dificultad de producir agentes de unión altamente específicos para las proteínas diana. En algunos casos, los anticuerpos son notoriamente inespecíficos y difíciles de producir a escala en miles de proteínas. En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación evitan este problema convirtiendo el código de proteína en un código de ácido nucleico que puede hacer uso entonces de una amplia gama de estrategias de enriquecimiento dirigido de ADN disponibles para bibliotecas de ADN. En algunos casos, los péptidos de interés pueden enriquecerse en una muestra enriqueciendo sus ácidos nucleicos extendidos correspondientes. Los métodos de enriquecimiento dirigido se conocen en la técnica, e incluyen ensayos de captura híbrida, ensayos basados en PCR tales como amplicón personalizado TruSeq (Illumina), sondas candado (también denominadas sondas de inversión molecular), y similares (véanse, Mamanovaet al., (2010) Nature Methods 7: 111-118; Bodiet al., J. Biomol. Tech. (2013) 24:73-86; Ballesteret al., (2016) Expert Review of Molecular Diagnostics 357-372; Merteset al., (2011) Brief Funct. Genomics 10:374-386; Nilssonet al., (1994) Science 265:2085-8).

[0341] En una realización, una biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, etiquetas de registro extendidas) se enriquece mediante un ensayo basado en captura híbrida. En un ensayo basado en captura híbrida, la biblioteca de ácidos nucleicos extendidos se hibrida con oligonucleótidos específicos de diana que se marcan con una etiqueta de afinidad (por ejemplo, biotina). Los ácidos nucleicos extendidos hibridados con los oligonucleótidos específicos de diana se someten a “coinmunoprecipitación” a través de sus etiquetas de afinidad usando un ligando de afinidad (por ejemplo, perlas recubiertas de estreptavidina), y se retiran por lavado los ácidos nucleicos extendidos de fondo (inespecíficos). Los ácidos nucleicos extendidos enriquecidos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) se obtienen entonces para su enriquecimiento positivo (por ejemplo, eluidos a partir de perlas). En algunas realizaciones, pueden usarse oligonucleótidos complementarios a las representaciones de biblioteca de ácidos nucleicos extendidos correspondientes de los péptidos de interés en un ensayo de captura híbrida. En algunas realizaciones, también pueden llevarse a cabo enriquecimiento o rondas secuenciales, con los mismos conjuntos de cebos o diferentes.

[0342] En otra realización, puede usarse enriquecimiento por amplificación mediado por ligamiento y extensión de cebador (AmpliSeq, PCR, TruSeq TSCA, etc.) para seleccionar y modular la fracción enriquecida de los elementos de biblioteca que representan un subconjunto de polipéptidos. También pueden emplearse oligonucleótidos de competición para ajustar el grado de extensión, ligamiento, o amplificación de cebador. En la implementación más sencilla, esto puede lograrse teniendo una mezcla de cebadores específicos de diana que comprenden una cola de cebador universal y cebadores de competición que carecen de una cola de cebador universal 5’. Tras una extensión de cebador inicial, sólo pueden amplificarse los cebadores con la secuencia de cebador universal 5’. La razón de cebador con y sin la secuencia de cebador universal controla la fracción de diana amplificada. En otras realizaciones, puede usarse la inclusión de cebadores de hibridación, pero no de extensión, para modular la fracción de elementos de biblioteca que se someten a extensión, ligamiento, o amplificación de cebador.

[0344] También pueden usarse métodos de enriquecimiento dirigido en un modo de selección negativa para retirar selectivamente ácidos nucleicos extendidos a partir de una biblioteca antes de la secuenciación. Ejemplos de ácidos nucleicos extendidos indeseables que pueden retirarse son aquellos que representan especies de polipéptidos excesivamente abundantes, por ejemplo, para proteínas, albúmina, inmunoglobulinas, etc.

[0346] También puede usarse un cebo de oligonucleótido competidor, que se hibrida con la diana pero carece de un resto de biotina, en la etapa de captura híbrida para modular la fracción de cualquier locus particular enriquecido. El cebo de oligonucleótido competidor compite por la hibridación con la diana con el cebo biotinilado convencional que modula eficazmente la fracción de diana sometida a coinmunoprecipitación durante el enriquecimiento. El intervalo dinámico de diez órdenes de expresión de proteínas puede comprimirse en varios órdenes usando este enfoque de supresión competitiva, especialmente para las especies excesivamente abundantes tales como la albúmina. Por tanto, la fracción de elementos de biblioteca capturados para un locus dado con respecto a la captura híbrida convencional puede modularse desde el 100 % hasta el 0 % de enriquecimiento.

[0347] Adicionalmente, pueden usarse técnicas de normalización de biblioteca para retirar especies excesivamente abundantes a partir de la biblioteca de ácidos nucleicos extendidos. Este enfoque funciona mejor para bibliotecas de longitud definida que se originan a partir de péptidos generados por digestión con proteasas específicas de sitio tales como tripsina, LysC, GluC, etc. En un ejemplo, la normalización puede lograrse desnaturalizando una biblioteca bicatenaria y permitiendo que los elementos de biblioteca vuelvan a hibridarse. Los elementos de biblioteca abundantes vuelven a hibridarse más rápidamente que los elementos menos abundantes debido a la constante de velocidad de segundo orden de la cinética de hibridación bimolecular (Bochman, Paeschkeet al., 2012). Los elementos de biblioteca de ADNmc pueden separarse de los elementos de biblioteca de ADNbc abundantes usando métodos conocidos en la técnica, tales como cromatografía en columnas de hidroxiapatita (VanderNoot,et al., 2012, Biotechniques 53:373-380) o tratamiento de la biblioteca con una nucleasa específica de dúplex (DSN) de cangrejo Kamchatka (Shaginet al., (2002) Genome Res.12:1935-42) que destruye los elementos de biblioteca de ADNbc. Cualquier combinación de métodos de fraccionamiento, enriquecimiento, y sustracción de los polipéptidos antes de la unión al soporte y/o de la biblioteca de ácidos nucleicos extendidos resultante puede economizar las lecturas de secuenciación y mejorar la medición de especies de baja abundancia.

[0348] En algunas realizaciones, una biblioteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) se concatena mediante PCR con complementariedad de extremos o ligamiento para crear una molécula de ADN larga que comprende múltiples etiquetas de registro extendidas, etiquetas de codificación extendidas, o dietiquetas diferentes, respectivamente (Duet al., (2003) BioTechniques 35:66-72; Mueckeet al., (2008) Structure 16:837-841; patente estadounidense n.º 5.834.252).). Esta realización es preferible para la secuenciación de nanoporos en la que se analizan cadenas largas de ADN mediante el dispositivo de secuenciación de nanoporos.

[0349] En algunas realizaciones, se realiza un análisis directo de molécula única en los ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) (véase, por ejemplo, Harriset al., (2008) Science 320:106-109). Los ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos extendidos) pueden analizarse directamente sobre el soporte, tal como una celda de flujo o perlas que son compatibles para su carga en una superficie de celda de flujo (opcionalmente microcelda con patrón), en donde la celda de flujo o las perlas pueden integrarse con un secuenciador de molécula única o un instrumento de decodificación de molécula única. Para la decodificación de molécula única, puede usarse hibridación de varias rondas de oligonucleótidos de decodificación marcados de manera fluorescente agrupados (Gundersonet al., (2004) Genome Res.14:970-7) para determinar tanto la identidad como el orden de las etiquetas de codificación dentro de los ácidos nucleicos extendidos (por ejemplo, en la etiqueta de registro). En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden marcarse con etiquetas de codificación específicas de ciclo tal como se describió anteriormente (véase también Gundersonet al., (2004) Genome Res.14:970-7).

[0350] Tras la secuenciación de las bibliotecas de ácidos nucleicos (por ejemplo, de ácidos nucleicos extendidos), las secuencias resultantes pueden ser colapsadas por sus UMI si se usan y luego asociarse con sus polipéptidos correspondientes y alinearse con la totalidad del proteoma. Las secuencias resultantes también pueden colapsarse por sus etiquetas de compartimento y asociarse con su proteoma compartimental correspondiente, que en una realización particular contiene sólo un número único o muy limitado de moléculas de proteína. Tanto la identificación como la cuantificación de proteínas pueden derivarse fácilmente a partir de esta información digital del péptido. Los métodos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para el análisis, incluyendo detección, cuantificación y/o secuenciación, de una pluralidad de macromoléculas simultáneamente (multiplexación). La multiplexación tal como se usa en el presente documento se refiere al análisis de una pluralidad de macromoléculas (por ejemplo, polipéptidos) en el mismo ensayo. La pluralidad de macromoléculas puede derivarse de la misma muestra o de muestras diferentes. La pluralidad de macromoléculas puede derivarse del mismo sujeto o de sujetos diferentes. La pluralidad de macromoléculas que se analizan puede ser macromoléculas diferentes, o la misma macromolécula derivada de muestras diferentes. Una pluralidad de macromoléculas incluye 2 o más macromoléculas, 5 o más macromoléculas, 10 o más macromoléculas, 50 o más macromoléculas, 100 o más macromoléculas, 500 o más macromoléculas, 1.000 o más macromoléculas, 5.000 o más macromoléculas, 10.000 o más macromoléculas, 50.000 o más macromoléculas, 100.000 o más macromoléculas, 500.000 o más macromoléculas, o 1.000.000 o más macromoléculas.

[0351] III. KITS Y ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN

[0352] En el presente documento se proporcionan kits y artículos de fabricación que comprenden componentes para realizar un ensayo de análisis de macromoléculas. En algunas realizaciones, el kit incluye un agente de unión que comprende una etiqueta de codificación que comprende información identificativa sobre el agente de unión. En algunos aspectos, el kit incluye una pluralidad o un conjunto de agentes de unión que comprenden, cada uno, una etiqueta de codificación. En alguna realización, el agente de unión está configurado para unirse a una macromolécula asociada con una etiqueta de registro y también se proporcionan reactivos para transferir información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro. En los kits también se proporcionan un reactivo de unión de ácido nucleico, una polimerasa, y un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario. En algunos aspectos, el reactivo de unión de ácido nucleico, la polimerasa, y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario se proporcionan como mezcla. Por ejemplo, el reactivo de unión de ácido nucleico es un reactivo de ligamiento químico o enzimático. En algunos casos, el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario es una enzima de restricción.

[0354] En algunas realizaciones, los kits contienen además otros reactivos para tratar y analizar las macromoléculas diana (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, o péptidos). Los kits y artículos de fabricación pueden incluir uno cualquiera o más de los reactivos y componentes usados en los métodos descritos en las secciones I y II. En algunas realizaciones, el kit comprende reactivos para preparar muestras, tal como para preparar macromoléculas a partir de una muestra y unirse a un soporte. En algunas realizaciones, los kits incluyen opcionalmente instrucciones para realizar el ensayo de análisis de macromoléculas. En algunas realizaciones, los kits comprenden uno o más de los siguientes componentes: agente(s) de unión, reactivo(s) de unión de ácido nucleico, polimerasa(s), reactivo(s) de escisión de ácido nucleico bicatenario, soporte(s) sólido(s), etiqueta(s) de registro, reactivo(s) para transferir información, reactivo(s) de secuenciación, y/o cualquier tampón necesario, etc. Las etiquetas de registro, los agentes de unión, y las etiquetas de codificación pueden tener una estructura y unas características particulares tal como se describe en las secciones IA, IB, y IC, respectivamente.

[0356] En un aspecto, en el presente documento se proporcionan componentes usados para preparar una mezcla de reacción. En algunas realizaciones preferidas, la mezcla de reacción es una disolución. En realizaciones preferidas, la mezcla de reacción incluye uno o más de los siguientes: agente(s) de unión y etiqueta(s) de codificación asociada(s), soporte(s) sólido(s), etiqueta(s) de registro, reactivo(s) para transferir información incluyendo reactivo(s) de unión de ácido nucleico, polimerasa(s), reactivo(s) de escisión de ácido nucleico bicatenario, reactivo(s) de secuenciación, tampón/tampones y/u otro(s) aditivo(s).

[0358] En otro aspecto, en el presente documento se da a conocer un kit para realizar un ensayo de análisis de macromoléculas que comprende una biblioteca de agentes de unión, en el que cada agente de unión comprende o está asociado con una etiqueta de codificación. En algunos aspectos, la etiqueta de codificación comprende información identificativa sobre el resto de unión del agente de unión. En algunos ejemplos, el resto de unión es capaz de unirse a uno o más aminoácidos N-terminales, internos, o C-terminales del péptido o polipéptido diana, o capaz de unirse al uno o más aminoácidos N-terminales, internos, o C-terminales de un péptido modificado mediante un reactivo de funcionalización/modificación.

[0360] En algunas realizaciones, los kits y artículos de fabricación comprenden además una pluralidad de moléculas de ácido nucleico u oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los kits incluyen una pluralidad de códigos de barras. El/los código(s) de barras puede(n) incluir un código de barras de compartimento, un código de barras de partición, un código de barras de muestra, un código de barras de fracción, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el código de barras comprende un identificador molecular único (UMI). En algunos ejemplos, el código de barras comprende una molécula de ADN, ADN con bases pseudocomplementarias, una molécula de ARN, una molécula de BNA, una molécula de XNA, una molécula de LNA, una molécula de PNA, una molécula de γPNA, un polímero secuenciable con ácidos no nucleicos, por ejemplo, un polisacárido, un polipéptido, un péptido, o una poliamida, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los códigos de barras están configurados para unir las macromoléculas para su análisis, por ejemplo, las proteínas, en la muestra o para unirse a componentes nucleicos asociados con las macromoléculas.

[0362] En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para tratar las macromoléculas, por ejemplo, las proteínas. Puede realizarse cualquier combinación de métodos de fraccionamiento, enriquecimiento, y sustracción de las proteínas. Por ejemplo, el reactivo puede usarse para fragmentar o digerir las proteínas. En algunos casos, el kit comprende reactivos y componentes para fraccionar, aislar, sustraer, enriquecer proteínas. En algunos ejemplos, los kits comprenden además una proteasa tal como tripsina, LysN, o LysC. En algunas realizaciones, el kit comprende un soporte para inmovilizar la una o más dianas y reactivos para inmovilizar la diana sobre un soporte. En algunas realizaciones, el kit incluye además un reactivo para retirar el aminoácido N-terminal (NTAA) del polipéptido, tal como un agente químico o un agente enzimático. En algunas realizaciones, el kit incluye además un reactivo para modificar el aminoácido terminal del polipéptido, tal como un agente químico o un agente enzimático.

[0363] En algunas realizaciones, el kit también comprende uno o más tampones o líquidos de reacción necesarios para realizar cualquiera de las etapas del ensayo de análisis de macromoléculas. Los tampones, incluyendo tampones de lavado, tampones de reacción, y tampones de unión, tampones de elución, y similares, son conocidos por los expertos habituales en la técnica. En algunas realizaciones, los kits incluyen además tampones y otros componentes para acompañar a otros reactivos descritos en el presente documento. Los reactivos, los tampones, y otros componentes pueden proporcionarse en viales (tales como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar selladas), y similares. Cualquiera de los componentes de los kits puede esterilizarse y/o sellarse.

[0364] En algunas realizaciones, el kit incluye uno o más reactivos para el análisis de secuencias de ácido nucleico. En algunos ejemplos, el reactivo para el análisis de secuencia es para su uso en secuenciación por síntesis, secuenciación por ligamiento, secuenciación de una sola molécula, secuenciación por fluorescencia de una sola molécula, secuenciación por hibridación, secuenciación de polonias, secuenciación por semiconductores iónicos, pirosecuenciación, secuenciación en tiempo real de una sola molécula, secuenciación basada en nanoporos, u obtención de imágenes directa de ADN usando microscopía avanzada, o cualquier combinación de las mismas. Además de los componentes mencionados anteriormente, los kits objeto pueden incluir además instrucciones para usar los componentes del kit para poner en práctica los métodos objeto, es decir, instrucciones para la preparación, el tratamiento y/o el análisis de muestras. Los kits descritos en el presente documento también pueden incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, jeringas, y prospectos con instrucciones para realizar cualquier método descrito en el presente documento.

[0365] Cualquiera de los componentes del kit mencionados anteriormente, y cualquier molécula, conjugado o complejo molecular, reactivo (por ejemplo, reactivos químicos o biológicos), agente, estructura (por ejemplo, soporte, superficie, partícula, o perla), producto intermedio de reacción, producto de reacción, complejo de unión, o cualquier otro artículo de fabricación dado a conocer y/o usado en los kits y métodos a modo de ejemplo, puede proporcionarse por separado o en cualquier combinación adecuada con el fin de formar un kit.

[0366] IV. EJEMPLOS

[0367] Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, los métodos, las composiciones, y los usos proporcionados en el presente documento. En las publicaciones anteriores US 2019/0145982 A1, US 2020/0348308 A1, US 2020/0348307 A1, US 2021/0208150 A1, WO 2020/223000 se dieron a conocer determinados aspectos de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, realizaciones para el ensayo de secuenciación de polipéptidos ProteoCode<™>, transferencia de información entre etiquetas de codificación y etiquetas de registro, métodos de preparación de conjugados de nucleótido-polipéptido, métodos para la unión de conjugados de nucleótido-polipéptido a un soporte, métodos de generación de códigos de barras, métodos de generación de grupos de unión específicos que reconocen un aminoácido N-terminal de un polipéptido, reactivos y métodos para modificar y/o retirar un aminoácido N-terminal a partir de un polipéptido, métodos para analizar etiquetas de registro extendidas.

[0368] Ejemplo 1. Evaluación de la inmovilización de analitos usando hibridación de ácidos nucleicos y unión a un soporte sólido.

[0369] Este ejemplo describe métodos a modo de ejemplo para unir (inmovilizar) conjugados de ácido nucleico-polipéptido a un soporte sólido.

[0370] En un método de inmovilización basado en hibridación, los conjugados de ácido nucleico-polipéptido se hibridaron y ligaron a ADN de captura en horquilla que se inmovilizaron químicamente en perlas magnéticas. Los ácidos nucleicos de captura se conjugaron con las perlas usando química clic basada en trans-cicloocteno (TCO) y metiltetrazina (mTet). Los ácidos nucleicos de captura en horquilla corta modificados con TCO (tallo de 16 pares de bases, bucle de 5 bases, proyección 5’ de 24 bases) se hicieron reaccionar con perlas magnéticas recubiertas de mTet. Los conjugados de ácido nucleico-polipéptido fosforilados (10 nM) se hibridaron con los ADN en horquilla unidos a perlas en 5x SSC, SDS al 0,02 %, y se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC. Las perlas se lavaron una vez con PBST y se resuspendieron en 1x disolución de ligamiento rápido (New England Biolabs, EE. UU.) con ADN ligasa de T4. Después de una incubación de 30 minutos a 25 ºC, las perlas se lavaron dos veces con PBST y se resuspendieron en 50 µl de PBST. Los conjugados de ácido nucleico-polipéptido inmovilizados totales que incluyen péptidos amino FA-terminales (FAGVAMPGAEDDVVGSGSK; SEQ ID NO: 3), péptidos amino AFA-terminales (AFAGVAMPGAEDDVVGSGSK; SEQ ID NO: 4), y péptidos amino AA-terminales (AAGVAMPGAEDDVVGSGSK; SEQ ID NO: 5) se cuantificaron mediante qPCR usando conjuntos de cebadores específicos. Como comparación, los péptidos se inmovilizaron sobre perlas usando un método no basado en hibridación que no implicaba ninguna etapa de ligamiento. El método no basado en hibridación se realizó incubando péptidos etiquetados con ADN modificados con TCO 30 µM, incluyendo péptidos amino FA-terminales, péptidos amino AFA-terminales, y péptidos amino AA-terminales, con perlas magnéticas recubiertas de mTet durante la noche a 25 ºC.

[0371] Tal como se muestra en la tabla 1, se observaron valores de Ct similares en el método de preparación no basado en hibridación con una densidad de injerto de 1:100.000 y el método de preparación basado en hibridación con una densidad de injerto de 1:10.000. La cantidad de carga de péptidos etiquetados con ADN para el método de preparación basado en hibridación fue 1/3.000 en comparación con la del método de preparación no basado en hibridación. En general, se observó que se necesitaba menos material de partida para el método de inmovilización basado en hibridación.

[0374]

[0375]

[0378] Ejemplo 2. Ensayo de codificación secuencial a modo de ejemplo.

[0380] En este ejemplo se usaron dos agentes de unión a modo de ejemplo para unirse específicamente a conjugados de ácido nucleico-polipéptido inmovilizados sobre un soporte sólido. Un agente de unión se une a residuos de fenilalanina N-terminal de los polipéptidos (grupo de unión a F; 31-F), y el otro agente de unión se une a residuos de leucina N-terminales de los polipéptidos (grupo de unión a L; 44-L). Ambos agentes de unión se modificaron por ingeniería a partir de armazones de lipocalina mediante evolución dirigida, específicamente tal como se describe en el ejemplo 1 del documento US 2021/0208150 A1. Los agentes de unión se conjugaron con etiquetas de codificación de ácido nucleico correspondientes que comprendían códigos de barras con información identificativa sobre el agente de unión. Las etiquetas de codificación específicas para cada agente de unión se unieron a SpyTag mediante un ligador de PEG, y las fusiones resultantes se hicieron reaccionar con la proteína de fusión agente de unión-SpyCatcher mediante interacción SpyTag-SpyCatcher, esencialmente tal como se describe en el documento US 2021/0208150 A1.

[0382] Para el ensayo de codificación, se unieron dos macromoléculas de prueba (FSGVARGDVRGGK(azida); a continuación en el presente documento péptido F; SEQ ID NO: 6 y LAESAFSGVARGDVRGGK(azida); a continuación en el presente documento péptido L; SEQ ID NO: 7) a ADN de captura unido a perlas inmovilizado (SEQ ID NO: 8) mediante una reacción de alquino-azida (esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1). Los conjugados de ADN-polipéptido (20 nM) se hibridaron con los ADN de captura unidos a perlas en 5x SSC, SDS al 0,02 %, y se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC. Las perlas se lavaron una vez con PBST y se resuspendieron en 1x disolución de ligamiento rápido (New England Biolabs, EE. UU.) con ADN de ligasa T4. Después de una incubación de 30 minutos a 25 ºC, las perlas se lavaron con PBST, dos veces con NaOH 0,1 M Tween 20 al 0,1 % y dos veces con PBST. Las etiquetas de registro en los conjugados contienen un código de barras para la macromolécula, una región complementaria de proyección de 2 nt, una región de unión de enzima de restricción de tipo II, y una región flanqueante. Tras la hibridación y el ligamiento, las muestras se incubaron con fragmento Klenow (3’->5’ exo-) (MCLAB, EE. UU.), BtsI-V2 (0,5 U/ul, New England Biolabs, EE. UU.), dNTP (cada uno a 125 uM), y tampón CutSmart (acetato de potasio 50 mM, acetato de Tris 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, BSA 100 µg/ml, pH 7,9, New England Biolabs, EE. UU.) a 25 ºC durante 30 min y se lavaron con PBST, dos veces con NaOH 0,1 M Tween 20 al 0,1 % y dos veces con PBST. Como resultado, se generó una proyección de 2 nt en 3’ (véase la figura 1A).

[0384] Las perlas se trataron con reactivo PMI 18 mM (pirazol-metanimina, 4-trifluorometil-1H-pirazol) en mezcla de DMA y MOPS (60 % de DMA y 40 % de MOPS, pH 7,6) a 25 ºC durante 30 min para modificar el extremo N-terminal de los péptidos inmovilizados y se lavaron 3 veces con PBST. Las etiquetas de codificación unidas al grupo de unión a F y al grupo de unión a L forman, cada una, un bucle con dúplex de 8 pb y proyección de 2 nt en 3’, que es complementaria a la proyección 3’ de la etiqueta de registro en las perlas. Las etiquetas de codificación contienen códigos de barras únicos para la identificación de los grupos de unión, y también tienen la secuencia de unión de BtsI-V2 y la región complementaria de proyección de 2 nt para el siguiente ciclo de unión. Los dos agentes de unión (100 nM cada uno) se incubaron con las perlas en presencia de 0,125 U/ul de fragmento Klenow (3’->5’ exo-) (MCLAB, EE. UU.), mezcla de dNTP (125 uM de cada uno), 0,5 U/ul de BtsI-V2, así como diferentes concentraciones de ADN ligasa de T4 ((New England Biolabs, EE. UU.) en el tampón de ligasa rápida (HCl de Tris 66 mM, MgCl<2>10 mM, dtiotreitol 1 mM, ATP 1 mM, polietilenglicol (PEG6000) al 7,5 %, pH 7,6) a 25 ºC durante 15 min, seguido por lavados, 1 vez con PBST, dos veces con NaOH 0,1 M Tween 20 al 0,1 %, y dos veces con PBST. Durante la unión, se ha producido la extensión de etiquetas de registro, que dio como resultado la transferencia de información de código de barras desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro, formando etiquetas de registro extendidas (véase la figura 1B).

[0386] Tras el ciclo de unión, se realizó remate de extremos para introducir un sitio de cebador para la posterior PCR que amplificará las etiquetas de registro extendidas para su análisis. Se introdujeron oligos de remate de extremos que contenían un ADN en bucle con proyección 3’ de 2 nt complementaria a la proyección 3’ de las etiquetas de registro extendidas o no extendidas. En lugar de realizar una etapa de remate de extremos independiente, puede introducirse un sitio de cebador para la posterior PCR durante la reacción de extensión usando etiquetas de codificación más largas que contengan una secuencia de cebador complementaria. Se incubaron 400 nM de oligos de remate de extremos con las perlas en presencia de 12,5 U/ul de ADN ligasa de T4 en el tampón de ligasa rápida (HCl de Tris 66 mM, MgCl<2>10 mM, dtiotreitol 1 mM, ATP 1 mM, polietilenglicol (PEG6000) al 7,5 %, pH 7,6) a 25 ºC durante 15 min. La muestra se lavó 1 vez con PBST, dos veces con NaOH 0,1 M Tween 20 al 0,1 %, y dos veces con PBST. Las etiquetas de registro extendidas del ensayo se sometieron a amplificación por PCR y se analizaron mediante secuenciación de nueva generación (NGS), revelando información de código de barras sobre los agentes de unión que interactuaron con las macromoléculas.

[0387] Los resultados de codificación a modo de ejemplo generados mediante el método de codificación descrito se muestran en la figura 2. Para la etapa de ligamiento, se sometieron a prueba 3 concentraciones diferentes de ADN ligasa de T4 (0,125, 1,25, 12,5 unidades/ul). Tras el ligamiento, se añadió fragmento Klenow para la etapa de extensión y se añadió enzima BtsI-V2 para la etapa de escisión. Las fracciones de etiquetas de registro codificadas (porcentaje de etiquetas de registro extendidas con respecto a la cantidad total de etiquetas de registro en las perlas (extendidas y no extendidas)) se evaluaron mediante secuenciación NGS y mostraron resultados de codificación específicos para ambos agentes de unión.

[0388] Ejemplo 3. Ensayo de codificación para otros tipos de macromoléculas.

[0389] Los datos mostrados en la figura 2 representan el análisis de las etiquetas de registro extendidas y confirman la exitosa transferencia de información de código de barras desde las etiquetas de codificación hasta las etiquetas de registro tras la unión del grupo de unión a F o grupo de unión a L a las macromoléculas de péptido. Las técnicas descritas pueden adoptarse para otros tipos de macromoléculas, tales como lípido, hidrato de carbono o macrociclo. Para realizar el ensayo de codificación, es necesario inmovilizar tales macromoléculas sobre un soporte sólido (tal como perlas) y asociarlas con una etiqueta de registro de ácido nucleico. Las etapas de codificación siguen siendo las mismas independientemente del tipo de la macromolécula inmovilizada. La asociación con la etiqueta de registro puede ser directa (tal como unión covalente) o indirecta (tal como asociación a través de un soporte sólido). En este último caso, la etiqueta de registro debe colocalizarse o estar en estrecha proximidad con la macromolécula durante el ensayo de codificación. Pueden elegirse agentes de unión para unirse específicamente a un componente de la macromolécula. Es necesario conjugar cada agente de unión a la etiqueta de codificación de ácido nucleico correspondiente que contiene un código de barras con información identificativa sobre el agente de unión. Durante la codificación, la información de código de barras se transfiere a la etiqueta de registro asociada con la macromolécula, generando la etiqueta de registro extendida, de modo que se registra el historial de unión de la macromolécula en la etiqueta de registro extendida. El ciclo de unión puede repetirse múltiples veces usando diferentes agentes de unión que interactúan con la macromolécula, o bien por separado, o bien en una mezcla. A continuación se dan a conocer métodos representativos conocidos en la técnica que pueden utilizarse para la adaptación del ensayo de codificación dado a conocer para macromoléculas de diferentes tipos, tales como un hidrato de carbono, un lípido o un macrociclo.

[0390] En primer lugar, se conocen agentes de unión a modo de ejemplo que pueden unirse específicamente a componentes de un hidrato de carbono, un lípido o un macrociclo. Por ejemplo, las lectinas son proteínas de unión a hidrato de carbono que pueden reconocer selectivamente epítopos de glicano de glicoproteínas o hidratos de carbono libres, y pueden utilizarse como agentes de unión específicos para macromoléculas que contienen hidratos de carbono. De manera importante, hay lectinas conocidas que reconocen diferentes componentes de los hidratos de carbono, tales como lectinas de unión a manosa, lectinas de unión a galactosa/N-acetil-glucosamina, lectinas de unión a ácido siálico/N-acetil-glucosamina, lectinas de unión a fucosa (dadas a conocer, por ejemplo, en el documento WO 2012/049285 A1). Además, las proteínas de unión a lípidos son bien conocidas y pueden utilizarse como agentes de unión (véase, por ejemplo, Bernlohr DA,et al., Intracellular lipid-binding proteins and their genes. Annu Rev Nutr. 1997;17:277-303). Los anticuerpos de unión a lípidos son comúnmente conocidos y pueden utilizarse como agentes de unión para macromoléculas que contienen lípidos (véase, por ejemplo, Alving CR. Antibodies to lipids and liposomes: immunology and safety. J Liposome Res. 2006;16(3):157-66). Además, también se conocen proteínas que se unen específicamente a macrociclos (véanse, por ejemplo, Villar EA,et al., How proteins bind macrocycles. Nat Chem Biol. Septiembre de 2014;10(9):723-31; Hunter TM,et al., Protein recognition of macrocycles: binding of anti-HIV metallocyclams to lysozyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 15 de febrero de 2005;102(7):2288-92).

[0391] En segundo lugar, puede realizarse un ensayo de codificación de detección de hidratos de carbono a modo de ejemplo tal como sigue, utilizando métodos conocidos en la técnica.

[0392] Enfoque I. Aminación reductora (basándose en Yang SJ, Zhang H. Glycan analysis by reversible reaction to hydrazide beads and mass spectrometry. Anal Chem.2012; 84(5):2232-2238).

[0393] (a) Generar un conjugado de hidrato de carbono unido a etiqueta de registro inmovilizada. Oxidar los hidratos de carbono con peryodato de sodio para generar un aldehído. Conjugar etiqueta de registro de ADN terminada con amina y reducir la imina resultante usando cianoborohidruro de sodio para generar un conjugado de hidrato de carbono-etiqueta de registro. Preferiblemente, puede emplearse hidrazida, alcoxiamina, o ADN con una reactividad similar para generar productos de reacción más estables (por ejemplo, hidrazonas) que no requieren agentes reductores. Inmovilizar el hidrato de carbono acoplado a ADN sobre un soporte sólido mediante la etiqueta de registro de ADN tal como se describe en el ejemplo 2.

[0394] (b) Generar conjugados de lectina-etiqueta de codificación de ADN (agente de unión-etiqueta de codificación) utilizando la fusión SpyCatcher-concanavalina A (ConA) tal como se describió anteriormente. La etiqueta de codificación contiene un código de barras con información identificativa sobre ConA.

[0395] (c) Transferir información de código de barras desde la etiqueta de codificación asociada a lectina hasta la etiqueta de registro tal como se describe en el ejemplo 2, analizando así si el hidrato de carbono contiene un componente que se une a ConA.

[0396] Enfoque II. Acoplamiento diazoico (basándose en Matsuura K,et al., Facile synthesis of stable and lectinrecognizable DNA-carbohydrate conjugates via diazo coupling. Bioconjug Chem. Marzo-abril de 2000; 11(2):202-11). En el enfoque II, la etapa (a) (inmovilización del conjugado de hidrato de carbono unido a etiqueta de registro) puede realizarse tal como sigue: 1) aminar el hidrato de carbono con hidrogenocarbonato de amonio en agua para generar β-glicosilaminas; 2) convertir la amina en amida con derivados de carboxilato que portan una funcionalidad de nitrofenilo. Hidrogenar los grupos nitro sobre catalizador de paladio y tratar con NaNO<2>y HCl para proporcionar los compuestos diazoicos.

[0397] Las etapas (b) y (c) son las mismas que en el enfoque I.

[0398] En tercer lugar, puede realizarse un ensayo de codificación de detección de lípidos a modo de ejemplo tal como sigue, utilizando métodos conocidos en la técnica.

[0399] Enfoque I. Ácidos grasos (basándose en Hiroshi Miwa, High-performance liquid chromatographic determination of free fatty acids and esterified fatty acids in biological samples as their 2-nitrophenylhydrazides, Analytica Chimica Acta, volumen 465, números 1-2, 2002, páginas 237-255, ISSN 0003-2670).

[0400] (a) Extraer ácidos grasos a partir de una fuente biológica y activar el ácido carboxílico con química de EDC/CDI. Acoplar etiqueta de registro de ADN terminada con amina o hidrazida para generar un conjugado de lípido unido a etiqueta de registro. Inmovilizar el lípido acoplado a ADN sobre un soporte sólido mediante la etiqueta de registro de ADN tal como se describe en el ejemplo 2.

[0401] Enfoque II. Lípidos reactivos (basándose en X. Wei y H. Yin (2015) Covalent modification of DNA by α,β-unsaturated aldehydes derived from lipid peroxidation: Recent progress and challenges, Free Radical Research, 49:7, 905-917). (a) Obtener un sustrato lipídico reactivo tal como malondialdehído (MDA) o 4-hidroxinonenal (HNE); acoplar la etiqueta de registro de ADN terminada con hidrazida a las especies lipídicas reactivas. Alternativamente, acoplar la etiqueta de registro de ADN terminada con amina al aldehído en el lípido reactivo y reducir la imina resultante con cianoborohidruro de sodio.

[0402] En la siguiente etapa para ambos enfoques, generar un conjugado de agente de unión-etiqueta de codificación de ADN utilizando la fusión SpyCatcher-agente de unión tal como se describió anteriormente. La etiqueta de codificación contiene un código de barras con información identificativa sobre el agente de unión. Pueden usarse proteína de unión a ácidos grasos (FABP), otras proteínas de unión a lípidos o anticuerpos de unión a lípidos como agente de unión. Finalmente, transferir información de código de barras desde la etiqueta de codificación asociada a agente de unión hasta la etiqueta de registro tal como se describe en el ejemplo 2 de la presente divulgación, analizando así si el lípido contiene un componente que se une al agente de unión.

[0403] En cuarto lugar, puede realizarse un ensayo de codificación de detección de macrociclos (microcistinas) a modo de ejemplo tal como sigue, utilizando métodos conocidos en la técnica, basándose en McElhiney J,et al., Rapid isolation of a single-chain antibody against the cyanobacterial toxin microcystin-LR by phage display and its use in the immunoaffinity concentration of microcystins from water. Appl Environ Microbiol. Noviembre de 2002;68(11):5288-95.

[0404] (a) Generar microcistina acoplada a etiqueta de registro de ADN haciendo reaccionar deshidroalanina de microcistina con 2-mercaptoetilamina para generar una amina primaria, seguido por acoplar la etiqueta de registro de ADN a la amina primaria usando una etiqueta de registro de ADN reactiva con amina (por ejemplo, derivado de NHS-ADN).

[0405] (b) Generar agente de unión a SpyCatcher-anticuerpo de cadena sencilla que reconoce la microcistina. La producción de anticuerpos de cadena sencilla se describe en McElhiney J,et al., 2002. Acoplar la etiqueta de codificación de ADN a SpyTag (la etiqueta de codificación contiene un código de barras con información identificativa sobre el anticuerpo de cadena sencilla), seguido por hacer reaccionar con SpyCatcher para generar el conjugado de agente de unión-etiqueta de codificación tal como se describió anteriormente.

[0406] (c) Transferir información de código de barras desde anticuerpo de cadena sencilla-etiqueta de codificación asociada hasta la etiqueta de registro tal como se describe en el ejemplo 2, analizando así si la macromolécula contiene microcistina.

[0407] TABLA DE SECUENCIAS

[0410]

[0411]

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para analizar una macromolécula, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte, en el que la etiqueta de registro comprende una región bicatenaria;

(b) poner en contacto la macromolécula con un agente de unión capaz de unirse a la macromolécula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta de codificación con información identificativa sobre el agente de unión, para permitir la unión entre la macromolécula y el agente de unión;

(c) unir covalentemente el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación mediante un reactivo de unión de ácido nucleico;

(d) extender la etiqueta de registro usando la etiqueta de codificación como molde mediante una polimerasa, generando una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y

(e) escindir ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida bicatenaria con un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario para generar una proyección 3’ en la etiqueta de registro extendida; mediante lo cual se transfiere información desde la etiqueta de codificación hasta la etiqueta de registro para generar la etiqueta de registro extendida.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la escisión en la etapa (e) libera el agente de unión a partir de la macromolécula.

3. El método según la reivindicación 1, en el que las etapas (b), (c), (d) y (e) se repiten secuencialmente una o más veces de manera cíclica.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la macromolécula es un polipéptido.

5. El método según la reivindicación 3, que comprende, además, retirar una porción de la macromolécula antes de repetir la etapa (b).

6. El método según la reivindicación 5, en el que la macromolécula es un polipéptido, y la porción de la macromolécula retirada antes de repetir la etapa (b) comprende el aminoácido N-terminal (NTAA) del polipéptido.

7. El método según la reivindicación 3, en el que la proyección 3’ de la etiqueta de registro extendida generada mediante el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario en la etapa (e) está disponible para hibridarse con una segunda etiqueta de codificación cuando se repite la etapa (b).

8. El método según la reivindicación 4, que comprende, además, tratar el polipéptido con un reactivo para modificar un aminoácido terminal del polipéptido antes de la etapa (b).

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el reactivo de unión de ácido nucleico de la etapa (c), la polimerasa de la etapa (d) y el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario de la etapa (e) se proporcionan simultáneamente en la etapa (c).

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario es una enzima de restricción de tipo IIS.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende, además, analizar una o más de las etiquetas de registro extendidas, en el que analizar la(s) etiqueta(s) de registro extendida(s) comprende un método de secuenciación de ácido nucleico.

12. Un kit para el análisis de macromoléculas, que comprende:

un primer agente de unión que comprende una primera etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el primer agente de unión; un segundo agente de unión que comprende una segunda etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el segundo agente de unión; y una mezcla que comprende

(i) un reactivo de unión de ácido nucleico que une covalentemente el extremo 5’ de una etiqueta de registro al extremo 3’ de la primera etiqueta de codificación o la segunda etiqueta de codificación;

(ii) una polimerasa que extiende la etiqueta de registro y genera una etiqueta de registro extendida bicatenaria; y

(iii) un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario que escinde ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida bicatenaria,

en el que cada uno del primer agente de unión y el segundo agente de unión está configurado para unirse a una macromolécula de una pluralidad de macromoléculas, cada una de ellas asociada con una etiqueta de registro, el primer agente de unión y el segundo agente de unión se unen a restos diana diferentes dentro de la pluralidad de macromoléculas, y tras la unión, la información identificativa de la primera etiqueta de codificación o la segunda etiqueta de codificación está configurada para transferirse a la etiqueta de registro asociada con la macromolécula.

13. El kit según la reivindicación 12, en el que la macromolécula es un polipéptido.

14. El kit según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que comprende, además, un reactivo para retirar el aminoácido N-terminal (NTAA) del polipéptido.

15. Una composición que comprende:

(a) una macromolécula y una etiqueta de registro asociada unidas a un soporte;

(b) un agente de unión que comprende una etiqueta de codificación, que comprende información identificativa sobre el agente de unión; y

(c) una mezcla que comprende:

(i) un reactivo de unión de ácido nucleico que une covalentemente el extremo 5’ de la etiqueta de registro al extremo 3’ de la etiqueta de codificación;

(iii) un reactivo de escisión de ácido nucleico bicatenario que escinde ambas cadenas de la etiqueta de registro extendida bicatenaria.