ES3060893T3 - Strand-specific detection of bisulfite-converted duplexes - Google Patents

Abstract

BiSeqS (sistema de secuenciación con bisulfito) es una tecnología que puede aumentar la especificidad de la secuenciación en al menos dos órdenes de magnitud con respecto a la obtenida con el código de barras molecular, y puede aplicarse a cualquier instrumento de secuenciación masivamente paralela. BiSeqS utiliza un tratamiento con bisulfito para distinguir las dos hebras de ADN con código de barras molecular. Su especificidad radica en la necesidad de identificar la misma mutación en ambas hebras. Al no requerir preparación de la biblioteca, la tecnología permite un uso muy eficiente del ADN molde y de las lecturas de secuencia, que se limitan casi en su totalidad a los amplicones de interés. Esta eficiencia es fundamental para muestras clínicas, como el plasma, en las que a menudo solo se dispone de cantidades ínfimas de ADN. BiSeqS puede aplicarse para evaluar transversiones, así como pequeñas inserciones o deleciones, y puede detectar de forma fiable una mutación entre más de 10 000 moléculas de tipo silvestre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Detección específica de cadena de dúplex convertidos con bisulfito

[0003] Campo técnico

[0004] Esta descripción se relaciona con el área de análisis de ácidos nucleicos. En particular, se refiere a análisis de secuencias de ácidos nucleicos que tienen una mayor sensibilidad y precisión.

[0005] Antecedentes

[0006] Ya se dispone de un amplio conocimiento de las alteraciones genéticas que subyacen al cáncer, abriendo nuevas oportunidades para el tratamiento de los pacientes (1-3). Algunas de las más importantes de estas oportunidades implican "biopsias líquidas", es decir, la evaluación de la sangre y otros fluidos corporales para moléculas molde de ADN mutante que se liberan de las células tumorales en estos fluidos. Aunque el valor potencial de las biopsias líquidas se reconoció hace más de dos décadas (4-6), los avances más recientes en la tecnología de secuenciación han hecho que este enfoque sea práctico. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las biopsias líquidas de sangre pueden detectar cantidades mínimas de enfermedad en pacientes con cánceres colorrectales en etapa temprana, proporcionando así evidencia que podría afectar sustancialmente su supervivencia (7). Otros estudios han demostrado que el ADN tumoral circulante (ADNct) se puede detectar en la sangre de pacientes con otras neoplasias malignas, así como en otros fluidos corporales tal como quistes pancreáticos, frotis de Papanicolaou y saliva (8-16).

[0007] La gran mayoría de las tecnologías actuales para detectar mutaciones raras emplean enfoques digitales, donde cada molécula molde se evalúa, una por una, para determinar si es de tipo salvaje o mutante (17). La digitalización se puede realizar en pocillos (17), en pequeñas gotas formadas por emulsificación o microfluidos (18, 19), o en grupos (20). El más poderoso de estos enfoques emplea secuenciación masivamente paralela para analizar simultáneamente las secuencias completas de cientos de millones de moléculas molde amplificadas individualmente (21). Sin embargo, todos los instrumentos de secuenciación disponibles actualmente tienen tasas de error relativamente altas, lo que limita la sensibilidad en muchas posiciones de nucleótidos a un mutante entre 100 moléculas molde de tipo salvaje (WT), incluso con moldes de ADN de calidad óptima (21). La calidad del ADN de las muestras clínicas a menudo es mucho menos que óptima, lo que agrava el problema. La sensibilidad se puede aumentar mediante el tratamiento previo del ADN para eliminar las bases dañadas antes de la secuenciación (22, 23) y mediante bioinformática y métodos estadísticos para mejorar las llamadas de bases después de la secuenciación (24, 25). Aunque es útil para una variedad de propósitos, la sensibilidad que se puede obtener con estas mejoras generalmente no es lo suficientemente alta para las aplicaciones más desafiantes, tal como biopsias líquidas, que pueden requerir la detección de una molécula mutante entre miles de moléculas WT (9).

[0008] Otra forma importante de mejorar la sensibilidad es con el uso de "códigos de barras moleculares", en los que cada molde está enlazado covalentemente a secuencias de identificación únicas (UID). Los códigos de barras moleculares se utilizaron originalmente para contar moléculas molde individuales (26), pero posteriormente se incorporaron en un enfoque poderoso, denominado SafeSeqS, para reducción de errores (27). Después de la incorporación de las UID, los pasos de amplificación posteriores producen múltiples copias de cada molde enlazado a UID. Cada una de las moléculas hijas producidas por amplificación contiene la misma UID, formando una familia de UID. Para que se considere una mutación auténtica, denominada supermutante, cada miembro de la familia UID debe tener la secuencia idéntica en cada posición consultada (27).

[0009] Hay dos formas generales de asignar códigos de barras moleculares a las moléculas de ADN molde. Uno se utiliza para amplificar por PCR loci específicos utilizando un conjunto de cebadores específicos de locus, y el otro se utiliza para ligar adaptadores antes de la amplificación de todo el genoma, creando una biblioteca. El método de PCR utiliza cebadores que contienen un tramo de bases aleatorias (N) para distinguir cada molécula molde individual (códigos de barras exógenos) (27, 28). La ventaja de este enfoque es que es aplicable a cantidades muy pequeñas de ADN y prácticamente las únicas secuencias amplificadas son las deseadas, lo que reduce la cantidad de secuenciación necesaria para evaluar una mutación específica. La desventaja es que los errores introducidos en una cadena durante los ciclos de incorporación de UID crearán supermutantes. Por lo tanto, este método aún eliminará los errores durante la secuenciación, pero no los errores cometidos durante los ciclos iniciales de PCR. El método de ligación emplea secuencias aleatorias en los adaptadores utilizados para la ligación (27-29) o utiliza los extremos del ADN molde cortado aleatoriamente al que se ligan los adaptadores como "UID endógenas" (27, 30). Aunque todavía se introducen errores durante los pasos de PCR con el enfoque de ligación, su ventaja es que ambas cadenas se pueden identificar a partir de los datos de secuenciación (secuenciación dúplex). La probabilidad de que la mutación idéntica y complementaria se introduzca en ambas cadenas es baja (el cuadrado de la probabilidad de que la mutación aparezca en una sola cadena). La desventaja de este enfoque es que requiere la preparación de la biblioteca y la captura de las secuencias que se van a consultar, ninguna de las cuales es altamente eficiente. WO2012/142213 divulga métodos para analizar secuencias de ácido nucleico que incluyen la asignación de un identificador único (UID) a cada molécula molde, amplificación para crear familias UID y secuenciación redundante de los productos de amplificación.

[0010] Existe una necesidad continua en la técnica de analizar de manera sensible y específica las variaciones de secuencia de una manera eficiente.

[0012] Sumario de la invención

[0014] La presente invención proporciona un método para la detección de una mutación en una población de moléculas de ADN, que comprende:

[0016] tratar una población de moléculas de ADN con bisulfito para convertir bases de citosina no metiladas en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando así una población de moléculas de ADN convertidas; unir códigos de barras moleculares a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando así una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde los cebadores de amplificación comprenden al menos cuatro cebadores, cada uno de los cuales es complementario a uno de los cuatro extremos de las moléculas de ADN convertidas; amplificar las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN;

[0017] someter una pluralidad de miembros de las familias a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos para ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias; y comparar secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia e identificar familias en las que los miembros contienen una mutación seleccionada, y comparar secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida e identificar la mutación seleccionada en dos cadenas complementarias.

[0019] Además, la presente invención proporciona un método para detectar la metilación en un dinucleótido CpG en cadenas positiva y negativa simultáneamente, que comprende:

[0021] tratar una población de moléculas de ADN con bisulfito para convertir bases de citosina no metiladas en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando una población de moléculas de ADN convertidas; unir códigos de barras moleculares a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas,

[0022] en donde los cebadores de amplificación comprenden al menos cuatro cebadores, cada uno de los cuales es complementario a uno de los cuatro extremos de las moléculas de ADN convertidas;

[0023] amplificar las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN;

[0024] someter una pluralidad de miembros de las familias a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos para ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias; y comparar secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia e identificar familias en las que los miembros contienen una C metilada en un dinucleótido CpG, y

[0025] comparar secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida e identificar el nucleótido G opuesto a C metilado del dinucleótido CpG.

[0027] De acuerdo con un aspecto de la descripción, se proporciona un método para la detección de mutaciones raras en una población de moléculas de ADN. Una población de moléculas de ADN se trata con bisulfito para convertir bases de citosina en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando una población de moléculas de ADN convertidas. Los códigos de barras moleculares se unen a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas. Las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas se amplifican en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN. Una pluralidad de miembros de las familias se somete a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos de ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias. Se comparan secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia y se identifican familias en las que >90% de los miembros contienen una mutación seleccionada. Se comparan secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida y la mutación seleccionada se identifica en dos cadenas complementarias.

[0028] De acuerdo con otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para detectar la metilación en un dinucleótido CpG en cadenas positiva y negativa simultáneamente. Una población de moléculas de ADN se trata con bisulfito para convertir bases de citosina en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando una población de moléculas de ADN convertidas. Los códigos de barras moleculares se unen a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas. Las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas se amplifican en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN. Una pluralidad de miembros de las familias se somete a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos de ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias. Se comparan secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia y se identifican familias en las que >90% de los miembros contienen una C metilada seleccionada en un dinucleótido CpG. Se comparan secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida y una C metilada en el dinucleótido CpG se identifica en dos cadenas complementarias.

[0029] En otro aspecto de la descripción, se proporciona un cebador de amplificación que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1-32.

[0030] Un aspecto adicional de la descripción proporciona un kit que comprende uno o más conjuntos de cuatro cebadores de amplificación. Cada uno de los cebadores en un conjunto es complementario a uno de los cuatro extremos de un fragmento dúplex de ADN convertido con bisulfito.

[0031] Otro aspecto de la descripción es un método para la detección de un polimorfismo en una población de moléculas de ADN. Una población de moléculas de ADN se trata con bisulfito para convertir bases de citosina en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando una población de moléculas de ADN convertidas. Los códigos de barras moleculares se unen a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas. Las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas se amplifican en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN. Una pluralidad de miembros de las familias se somete a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos de ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias. Se comparan secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia y se identifican familias en las que >90% de los miembros contienen un polimorfismo seleccionado. Se comparan secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida y el polimorfismo seleccionado se identifica en dos cadenas complementarias.

[0032] Estos y otros aspectos de la descripción, que serán evidentes para aquellos expertos en la técnica luego de leer la memoria descriptiva, proporcionan técnicas y herramientas para analizar de manera sensible y específica variaciones y modificaciones de ADN.

[0033] Breve descripción de los dibujos

[0034] Las figuras 1A a 1B. Visión general de la metodología BiSeqS. La conversión con bisulfito crea transiciones C > T en posiciones únicas en cada cadena. La amplificación de las cadenas (+) y (-) con cebadores que son específicos de amplicón y cadena permite la amplificación dirigida y la adición de códigos de barras moleculares. El análisis de ambas cadenas permite que los errores de PCR generados en el primer ciclo de PCR se reduzcan drásticamente, ya que es muy poco probable que se genere una mutación complementaria en la misma posición genómica en ambas cadenas. La conversión y amplificación de la secuencia de tipo salvaje se presenta en el panel A, en tanto que la conversión y amplificación de una transversión A>C se presenta en el panel B.

[0035] Las figuras 2A a 2C. BiSeqS reduce drásticamente la frecuencia de alelo mutante (MAF) de mutaciones de sustitución de una sola base en los loci amplificados. MAF de mutaciones por posición en todos los amplicones (figura 2A). MAF de supermutantes por posición en todos los amplicones (figura 2B). MAF de SDM por posición en todos los amplicones (figura 2C).

[0036] Figura 3. BiSeqS mantiene la sensibilidad inherente al etiquetado con código de barras molecular basado en PCR. El ADN mutante se añadió a ADN normal a una frecuencia de alelo mutante diana de 0,20% o 0,02% y los datos de secuenciación se evaluaron mediante NGS estándar, etiquetado con código de barras molecular y BiSeqS.

[0037] Figuras 4A a 4B. (Figura S1.) Esquema detallado de la plataforma BiSeqS en los loci no metilados (figura 4A) y metilados (figura 4B). Los C no metilados se convierten en T mediante conversión con bisulfito (Paso i), y el etiquetado con código de barras molecular basado en PCR específico de cadena agrega identificadores únicos a los extremos de las moléculas (Paso ii). El etiquetado con código de barras de muestra (Paso iii) amplifica el ADN con código de barras molecular, seguido de secuenciación y análisis de ADN (Paso iv), lo que permite que las secuencias se alineen con dos secuencias de referencia, una para la cadena (+) y otra para la cadena (-). Los cebadores de amplificación universales permiten la amplificación exponencial de todos los moldes con código de barras, independientemente de la secuencia UID. Las secuencias de injerto representan las secuencias P5 y P7 de longitud completa requeridas para todas las lecturas de extremos emparejados en las plataformas Illumina MiSeq.

[0038] Figura 5. (Figura S2.) Ejemplos representativos de amplicones BiSeqS preparados para ocho loci genómicos. Las diferencias en la longitud del cebador a menudo crean productos más largos en una cadena, lo que permite una fácil discriminación de la amplificación equimolar de ambas cadenas.

[0039] Figuras 6A a 6C. (Figura S3.) BiSeqS reduce drásticamente el número de mutaciones de sustitución de una sola base. Número de mutaciones por posición en todos los amplicones (figura 6A). Número de supermutantes por posición en todos los amplicones (figura 6B). Número de SDM por posición en todos los amplicones (figura 6C). Se señala que las escalas del eje y en los paneles A y C difieren por tres órdenes de magnitud.

[0040] Figuras 7A a 7C. (Figura S4.) BiSeqS reduce drásticamente el número de mutaciones indel en los loci amplificados. Número de mutaciones por posición en todos los amplicones (figura 7A). Número de supermutantes por posición en todos los amplicones (figura 7B). Número de SDM por posición en todos los amplicones (figura 7C).

[0041] Figuras 8A a 8C. (Figura S5.) BiSeqS reduce drásticamente la frecuencia de alelo mutante (MAF) de mutaciones indel en los loci amplificados. MAF de mutaciones por posición en todos los amplicones (figura 8A). MAF de supermutantes por posición en todos los amplicones (figura 8B). MAF de SDM por posición en todos los amplicones (figura 8C).

[0042] Figura 9. (Figura S6.) Sensibilidad de BiSeqS en todos los amplicones adicionales en fracciones de alelo mutante nominal (MAF) de 0,20% y 0,02%. BiSeqS mantiene la sensibilidad inherente al etiquetado con código de barras molecular basado en PCR mediante la detección de mutaciones a una frecuencia similar a la NGS y la secuenciación basada en código de barras molecular.

[0043] Figuras 10A a 10B. (Figura S7.) Las gráficas de señal a ruido muestran que BiSeqS permite la detección robusta de mutaciones de doble cadena. (Figura 10A) Una transversión C>A enNRASa un MAF de 0,20%. (Figura 10B) Una deleción T> enTP53a un MAF de 0,20%. Las mutaciones reales en las posiciones esperadas son detectables en gran exceso sobre el fondo en las otras posiciones utilizando el método BiSeqS.

[0044] Descripción detallada de la invención

[0045] Los inventores han desarrollado un enfoque que incorpora ventajas de los enfoques basados tanto en PCR como en ligación descritos anteriormente. Este enfoque aprovecha el hecho de que el tratamiento con bisulfito puede convertir eficientemente las bases dC en ADN en bases U. Esta conversión hace que las dos cadenas de ADN sean distinguibles, y se utilizó previamente para distinguir los transcritos de ARN copiados de cada una de las dos posibles cadenas molde de ADN (31). La conversión con bisulfito también se ha utilizado ampliamente para distinguir los residuos C metilados, que no se convierten en bases T, de las bases C no metiladas, iluminando así los cambios epigenéticos (32). También se ha demostrado que las bases dC se pueden convertir parcialmente en bases T, de modo que cada molécula de ADN molde individual se puede distinguir de las demás por su patrón único de cambios de C a T, creando así un código de barras intrínseco similar a lo que se puede lograr con UID agregados externamente (33). El ADN en el que todas las bases C se han convertido completamente en bases T se puede utilizar como moldes de PCR con cebadores especialmente diseñados enlazados a códigos de barras exógenos. Esto permite evaluar mutaciones individuales en ambas cadenas (secuenciación dúplex) de una manera confiable, sin creación de bibliotecas y con un número relativamente pequeño de lecturas de secuenciación. La detección de mutaciones raras en muestras clínicas es esencial para el cribado, diagnóstico y tratamiento del cáncer. En tanto que la secuenciación de próxima generación ha mejorado en gran medida la sensibilidad de la detección de mutaciones, la tasa de error relativamente alta de estas plataformas limita su utilidad clínica general. La eliminación de los artefactos de secuenciación podría facilitar la detección de cánceres en etapa temprana y proporcionar recomendaciones de tratamiento mejoradas adaptadas al perfil genético de un tumor. BiSeqS, un enfoque de secuenciación basado en la conversión con bisulfito, permite la detección y cuantificación específica de la cadena de mutaciones raras. BiSeqS elimina casi todos los artefactos de secuenciación en tres tipos comunes de mutaciones y, por lo tanto, aumenta considerablemente la relación señal-ruido para los análisis de diagnóstico.

[0046] En BiSeqS se utilizan dos tipos de códigos de barras. Los códigos de barras moleculares sirven para identificar moléculas molde individuales en una muestra original antes del etiquetado con código de barras y la amplificación. Cada molécula molde individual tendrá un código de barras molecular único. Los códigos de barras de muestra sirven para identificar una muestra de reacción o alícuota de una muestra original; todas las moléculas molde en la muestra de reacción o alícuota comparten un código de barras que identifica la muestra de reacción o alícuota. Los códigos de barras pueden ser, por ejemplo, corridas de nucleótidos generadas aleatoriamente o corridas de nucleótidos elegidas intencionalmente. Para unir códigos de barras moleculares en particular, el número de códigos de barras moleculares individuales en una mezcla de reacción será superior al número de moléculas molde. En el listado de secuencias que forma parte de esta solicitud, los códigos de barras se representan como una cadena de Ns.

[0048] La conversión con bisulfito estará cerca de la conversión completa. Por lo tanto, el diseño de cebador para amplificar los oligonucleótidos dúplex convertidos con bisulfito utiliza la complementariedad con la secuencia convertida. Los cebadores se diseñan para usarse en conjuntos de al menos cuatro de modo que ambas cadenas del molde dúplex original se amplifiquen, secuencien e identifiquen.

[0050] La amplificación de secuencias con código de barras genera familias de moldes con código de barras similar. Cada familia comparte un código de barras molecular, lo que denota que deriva de una molécula molde individual. La secuenciación de la población de moldes amplificados, que incluyen múltiples miembros de una familia, permite la comparación de secuencias de nucleótidos de múltiples miembros de una sola familia y la evaluación de la fracción de miembros de una familia que contienen una mutación particular. Una fracción alta, tal como más del 50, 60, 70, 80, 90 o 95% de las familias con una mutación particular sugiere que la mutación estaba presente en la muestra original, antes de la amplificación. Sin embargo, algunas de las mutaciones identificadas aún pueden ser las que se han introducido durante el procesamiento debido a errores enzimáticosin vitro. La detección de mutaciones que se deben a estos errores se puede reducir adicionalmente comparando secuencias obtenidas de familias de dos cadenas complementarias. El requisito de que exista una mutación en las familias generadas a partir de dos cadenas reduce significativamente las mutaciones aparentes artefactuales.

[0052] Los fragmentos de ácidos nucleicos se pueden obtener opcionalmente usando una técnica de formación de fragmentos aleatorios tal como cizallamiento mecánico, sonicación o sometimiento de ácidos nucleicos a otras tensiones físicas o químicas. Los fragmentos pueden no ser estrictamente aleatorios, ya que algunos sitios pueden ser más susceptibles a tensiones que otros. Las endonucleasas que se fragmentan aleatoria o específicamente también se pueden usar para generar fragmentos. El tamaño de los fragmentos puede variar, pero deseablemente estará en intervalos entre 30 y 5000 pares de bases, entre 100 y 2000 pares de bases, entre 150 y 1000 pares de bases, o dentro de intervalos con diferentes combinaciones de estos puntos finales. Los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, ARN o ADN. También se pueden usar formas modificadas de ARN o ADN.

[0054] La unión de un código de barras molecular a un fragmento de ácidos nucleicos de analito se puede realizar por cualquier medio conocido en la técnica, que incluye enzimático, químico o biológico. Un medio emplea una reacción en cadena de la polimerasa. Otro medio emplea una enzima ligasa. Por ejemplo, la enzima puede ser de mamífero o bacteriana. Los extremos de los fragmentos se pueden reparar antes de unirse usando otras enzimas tal como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa T4. Otras enzimas que se pueden usar para la unión son otras enzimas polimerasa. Se puede añadir un código de barras molecular a uno o ambos extremos de los fragmentos, preferiblemente a ambos extremos. Un código de barras molecular puede estar contenido dentro de una molécula de ácido nucleico que contiene otras regiones para otra funcionalidad prevista. Por ejemplo, se puede agregar un sitio de cebado universal para permitir la amplificación posterior. Otro sitio adicional puede ser una región de complementariedad con una región o gen particular en los ácidos nucleicos analitos. Un código de barras molecular puede tener una longitud de 2 a 4000, de 100 a 1000, de 4 a 400, bases, a manera de ejemplo.

[0056] Los códigos de barras moleculares se pueden hacer usando adición aleatoria de nucleótidos para formar una secuencia corta que se utilizará como un identificador. En cada posición de adición, se puede usar una selección de uno de cuatro desoxirribonucleótidos. Alternativamente, se puede usar una selección de uno de tres, dos o un desoxirribonucleótido. Por lo tanto, los códigos de barras moleculares pueden ser completamente aleatorios, parcialmente aleatorios o no aleatorios en ciertas posiciones. Otra manera de hacer códigos de barras moleculares utiliza nucleótidos predeterminados ensamblados en un chip. De esta manera de hacer, la complejidad se logra de manera planificada.

[0058] Un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa para agregar códigos de barras moleculares exógenos se refiere a la desnaturalización térmica de una molécula bicatenaria, la hibridación de un primer cebador a una cadena simple resultante, la extensión del cebador para formar una nueva segunda cadena hibridada a la cadena simple original. Un segundo ciclo se refiere a la desnaturalización de la nueva segunda cadena de la cadena simple original, la hibridación de un segundo cebador a la nueva segunda cadena y la extensión del segundo cebador para formar una nueva tercera cadena, hibridada a la nueva segunda cadena. Se pueden requerir múltiples ciclos para aumentar la eficiencia, por ejemplo, cuando el analito está diluido o hay inhibidores presentes.

[0060] La amplificación de fragmentos que contienen un código de barras molecular se puede realizar de acuerdo con técnicas conocidas para generar familias de fragmentos. Se puede usar la reacción en cadena de la polimerasa. También se pueden usar otros métodos de amplificación, como sea conveniente. Se puede usar PCR inversa, al igual que la amplificación por círculo rodante. La amplificación de fragmentos típicamente se realiza usando cebadores que son complementarios a los sitios de cebado que se unen a los fragmentos al mismo tiempo que los códigos de barras moleculares. Los sitios de cebado son distales a los códigos de barras moleculares, de modo que la amplificación incluye los códigos de barras moleculares. La amplificación forma una familia de fragmentos, cada miembro de la familia comparte el mismo código de barras molecular. Debido a que la diversidad de códigos de barras moleculares es muy superior a la diversidad de los fragmentos, cada familia debe derivar de una sola molécula de fragmento en el analito. Los cebadores utilizados para la amplificación se pueden modificar químicamente para hacerlos más resistentes a las exonucleasas. Una de las modificaciones es el uso de enlaces fosforotioato entre uno o más nucleótidos 3'. Otro emplea boranofosfatos. Además, se pueden usar bases de LNA (ácido nucleico bloqueado) en los cebadores; estos pueden aumentar la T<m>de un oligonucleótido que los contiene.

[0061] Los miembros de la familia se secuencian y comparan para identificar cualquier divergencia dentro de una familia. La secuenciación se realiza preferentemente en una plataforma de secuenciación masivamente paralela, muchas de las cuales están disponibles comercialmente. Si la plataforma de secuenciación requiere una secuencia para el "injerto",es decir,la unión al dispositivo de secuenciación, esta secuencia se puede agregar durante la adición de códigos de barras moleculares o por separado. Una secuencia de injerto puede ser parte de un cebador molecular con código de barras, un cebador universal, un cebador específico de la diana génica, los cebadores de amplificación utilizados para hacer una familia, un cebador con código de barras de muestra o por separado. La secuenciación redundante se refiere a la secuenciación de una pluralidad de miembros de una sola familia.

[0062] Se puede establecer un umbral para identificar una mutación en un analito. Si la "mutación" aparece en todos los miembros de una familia, entonces se deriva del analito. Si aparece en menos de todos los miembros, entonces es posible que se haya introducido durante el análisis. Los umbrales para llamar a una mutación se pueden establecer, por ejemplo, en 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o 100%. Los umbrales se establecerán en función del número de miembros de una familia que se secuencian y el propósito y situación particulares.

[0064] Las mutaciones que se detectan, monitorean y/o analizan de acuerdo con los métodos divulgados en la presente pueden ser en genes conductores de cáncer o genes pasajeros de cáncer. Pueden estar en otros genes causantes de enfermedades o relacionados con la enfermedad. Pueden ser simplemente mutaciones somáticas o polimorfismos de línea germinal que no tienen consecuencias funcionales conocidas. Ejemplos de genes conductores que se pueden analizar incluyenNRAS, PIK3R1, PTEN, RNF43yTP53.Pero los métodos no se limitan de ninguna manera a estos genes. De manera similar, el método se puede usar para detectar metilación en ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico dúplex.

[0066] Las polimerasas que se pueden usar para los pasos de amplificación del método pueden ser cualquiera que tenga propiedades que sean deseables para una amplificación particular. Utilizamos la polimerasa ThermoFisher Phusion U Hot Start<™>en los ejemplos, pero también probamos otras polimerasas y combinaciones de enzimas. Estos incluyeron Enzo AMPIGENE HS TAQ<™>Polymerase; BioRad iTAQ Hot Start DNA Polymerase<™>; ThermoFisher Phusion HotStart II DNA<™>Polymerase; y Sigma Aldrich FastStart<™>DNA Polymerase y combinaciones de estas polimerasas mencionadas.

[0068] Los cebadores de amplificación se pueden empaquetar por separado o en combinaciones. Pueden estar en un líquido o secos. El paquete o kit puede contener opcionalmente información analítica sobre los cebadores y/o instrucciones para llevar a cabo métodos de acuerdo con la invención. Los kits pueden contener opcionalmente componentes adicionales, tal como enzimaspolimerasa, amortiguadores de amplificación, recipientes de reacción u otras herramientas para facilitar la práctica de los métodos.

[0070] Los resultados descritos en los ejemplos muestran que BiSeqS puede cuantificar con precisión mutaciones raras de una manera altamente sensible y específica. Se prevé que su uso principal será en la vigilancia de pacientes con cáncer cuyos tumores primarios han sido secuenciados. Ya se ha demostrado que las biopsias líquidas se pueden utilizar para este propósito y pueden identificar con precisión a los pacientes que están en remisión clínica pero están destinados a recidivar (7, 11, 44). Muchos de estos pacientes, particularmente cuando su carga residual de enfermedad es pequeña y, por lo tanto, es más probable que se curen con terapia adyuvante (45), tienen solo una o dos moléculas de ADN mutante en 10 mL de plasma. En estas situaciones, una técnica como BiSeqS, que puede usar de manera eficiente todas las moléculas molde en tanto que mantiene una alta especificidad, podría resultar particularmente útil.

[0072] Una desventaja de BiSeqS es que no se puede aplicar a la mayoría de las mutaciones de transición debido a las ambigüedades causadas por la conversión con bisulfito de C a U, imitando estas transiciones. Aunque una cadena sigue siendo susceptible a BiSeqS, el poder de la tecnología radica en su capacidad para detectar mutaciones en ambas cadenas, por lo que no presenta ventajas sobre el etiquetado con código de barras molecular para tales mutaciones. Por ejemplo, las sustituciones de una sola base en los codonesKRAS12, 13 y 61 se mutan comúnmente en adenocarcinomas de colon, recto y páncreas (46). BiSeqS se puede usar para cuantificar mutaciones deKRASen 38,7%, 43,4% y 47,6% de estos cánceres, respectivamente (47). En todos los cánceres y mutaciones catalogados en la base de datos IARCTP53, aproximadamente el 44% de todas las mutaciones (es decir, SBS e indeles) son susceptibles de análisis BiSeqS (Base de datos IARC TP53, R18).

[0073] Además, el tratamiento con bisulfito puede dar como resultado la conversión de bases C metiladas a U en casos raros, dependiendo del tiempo de incubación y la concentración de reactivo (48). El protocolo utilizado para BiSeqS emplea temperaturas de incubación reducidas que parecen minimizar esta posibilidad (48), pero la heterogeneidad de secuencia en los sitios CpG metilados puede aumentar el fondo y estos sitios no se prefieren para la evaluación de mutaciones.

[0074] Sin embargo, para las biopsias líquidas en vigilancia, las limitaciones inherentes a un solo gen no son un problema importante porque generalmente se observan varias mutaciones diferentes, incluidas transversiones e indeles, en la secuenciación de todo el genoma de los cánceres (1-3), y cualquier mutación identificada podría aplicarse en principio a este escenario clínico. Un estudio reciente de 3281 muestras de cáncer destacó que el 93% tenía al menos una mutación no sinónima en al menos un gen conductor (49). En tanto que el número promedio de mutaciones puntuales y pequeños indeles variaron entre los tipos de tumores, la mayoría de los cánceres tienen al menos una mutación del gen conductor que debería ser susceptible de análisis BiSeqS (49). También vale la pena señalar que las mutaciones del gen pasajero que son clonales también pueden ser útiles para la evaluación diagnóstica (50). Debido a que hay al menos 10 veces más mutaciones pasajeras que mutaciones del gen conductor en casi todos los cánceres, es probable que la gran mayoría de los cánceres tengan varias mutaciones somáticas que se podrían evaluar mediante BiSeqS. Por ejemplo, en un estudio de 1157 sustituciones de una sola base detectadas en cáncer de mama, calculamos que el 54,7% de las sustituciones serían susceptibles de análisis BiSeqS, además del 7,4% de los tumores que contienen mutaciones de inserción o deleción, para un total de 62,1% de tumores (51).

[0075] El poder de BiSeqS radica en su capacidad para reducir drásticamente los errores de fondo. Por lo tanto, BiSeqS también puede complementar el cribado de otras alteraciones genómicas, tal como variantes estructurales (SV), para la detección y monitoreo de alelos raros (52). Las variantes estructurales (SV) proporcionan marcadores exquisitamente específicos para el cáncer que se pueden usar para biopsias líquidas (9, 50). Los errores simples de polimerasa no producen variantes estructurales, lo que proporciona ventajas sobre las sustituciones de una sola base como dianas de diagnóstico. Por otro lado, hay desventajas en el uso de SV como marcadores de diagnóstico. En primer lugar, la detección de SV requiere la secuenciación de todo el genoma de los tumores, en lugar de la secuenciación dirigida de los tumores, para su detección inicial; este último es actualmente mucho menos costoso que el primero. En segundo lugar, y más importante, las variantes estructurales son "privadas", es decir,generalmente confinadas a uno o un pequeño número de pacientes. Para emplearse como marcador tumoral, los cebadores que amplifican específicamente la unión de translocación se deben diseñar y probar en el tumor del paciente para asegurar que la variante estructural sea somática y el amplicón es específico. Aunque este enfoque es factible en un entorno de investigación, no es fácilmente practicable en entornos a gran escala. Por el contrario, se observan sustituciones de una sola base e indeles en genes conductores en numerosos tumores independientes, y se puede usar un pequeño conjunto de cebadores "listos para usar" para evaluar a la mayoría de los pacientes. Por ejemplo, estimamos que >98% de los pacientes con cáncer colorrectal tienen mutaciones detectables a través de la amplificación con uno de los 130 pares de cebadores prediseñados.

[0076] En el futuro, es posible que los tratamientos químicos de ADN que convierten el par de bases A:T (en lugar de C:G) en otros pares de bases puedan sustituir al bisulfito cuando se deben analizar las mutaciones de transición. Otra vía para futuras investigaciones es la multiplexación, que permite evaluar mutaciones en una variedad de amplicones simultáneamente en escenarios de cribado. Esta multiplexación es más difícil de lo normal porque se deben diseñar dos amplicones para cada región de interés en tanto que se logra una eficiencia homogénea de cada amplicón en todas las regiones de interés.

[0077] La divulgación anterior describe generalmente la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa con referencia a los siguientes ejemplos específicos.

[0078] Ejemplo 1

[0079] Materiales y métodos

[0080] De forma breve, se extrajo ADN de secciones tumorales incrustadas en parafina fijadas en formalina macrodiseccionadas (FFPE) y se trató con bisulfito con un kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, Cat. # D5001). Se utilizaron cebadores personalizados que contenían un identificador único (UID) y una secuencia específica de amplicón para amplificar ambas cadenas de ADN, y los productos resultantes se secuenciaron en un instrumento Illumina MiSeq. Para caracterizar la especificidad de BiSeqS, el ADN aislado de un tejido normal se trató con bisulfito y se procesó a través de la canalización BiSeqS para buscar sustituciones de una sola base e indeles. Para caracterizar la sensibilidad de BiSeqS, se diluyeron muestras de tumores macrodisecados con MAF conocidos con el ADN de WBC normales para obtener contenidos finales de células neoplásicas que variaban de 0,02% a 0,20%, tratados con bisulfito y procesados a través de la canalización BiSeqS. Se proporcionan más detalles más adelante.

[0081] Tejidos humanos

[0082] Las secciones tumorales incrustadas en parafina fijadas en formalina (FFPE) se macro-diseccionaron bajo un microscopio de disección para garantizar una celularidad neoplásica de >30%. El ADN se purificó con un kit Qiagen FFPE (Qiagen, Cat. # 56494). Las muestras tumorales con MAF conocidos se diluyeron con el ADN de WBC normales para obtener contenidos finales de células neoplásicas que varían de 0,02% a 0,20%. Para cuantificar con precisión las concentraciones de ADN de las muestras de ADN tumoral y normal, se amplificaron varias mezclas de ADN tumoral y normal con cebadores que revelaron polimorfismos normales de un solo nucleótido dentro de los amplicones finales. Entonces se usó NGS para cuantificar la fracción de células neoplásicas dentro de cada una de las mezclas probadas, y luego se usaron las mismas mezclas como ADN molde para BiSeqS, como se describe más adelante. Todos los tejidos se obtuvieron de pacientes consentidos en el Hospital Johns Hopkins con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de Johns Hopkins.

[0083] Tratamiento con bisulfito y amplificación por PCR de ADN purificado para BiSeqS

[0084] Después de realizar pruebas exhaustivas de varios kits de conversión con bisulfito disponibles comercialmente, elegimos el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, Cat. # D5001) para tratar con bisulfito y desulfonar muestras de ADN purificadas siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. El ADN se eluyó en 10 µL de amortiguador de elución y se almacenó a -20 ºC. Los cebadores de PCR purificados por HPLC personalizados (IDT) se diseñaron para cada cadena convertida con bisulfito de la doble hélice de ADN en los loci amplificados (lista de secuencias). En comparación con los cebadores de PCR tradicionales, los cebadores personalizados fueron más largos para tener en cuenta la complejidad de secuencia reducida del ADN convertido con bisulfito. Cada cebador directo contenía la secuencia necesaria para la amplificación de código de barras de pocillo en el extremo 5', seguida de una cadena de 14 nucleótidos aleatorios que sirvió como identificador único (UID) y secuencias de cebadores específicos del amplicón en el extremo 3' (figura 4A y 4B). Cada cebador inverso contenía la secuencia necesaria para la amplificación de código de barras de pocillo en el extremo 5', seguido de secuencias de cebador específicas del amplicón. Para hibridar con ADN convertido con bisulfito, es importante reemplazar nucleótidos específicos en las diversas secuencias de cebadores específicos de amplicón de tipo salvaje. T reemplazó a C en el cebador directo de cadena positiva, en tanto que A reemplazó a G en el cebador inverso de cadena positiva. A reemplazó a G en el cebador directo de cadena negativa, y T reemplazó a C en el cebador inverso de cadena negativa.

[0085] Los ciclos de PCR con etiquetado con código de barras molecular incluyeron 12,5 µL de 2X Phusion U Hot Start PCR Master Mix (ThermoFisher, Cat. # F533S) en una reacción de 25 µL, y concentraciones optimizadas de cada cebador directo e inverso, que varían de 0,125 µM a 4 µM de cada cebador directo e inverso para un total de cuatro cebadores por pocillo. Se usaron las siguientes condiciones de ciclo: un ciclo de 95 °C durante 3 minutos, 20 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 63 °C durante 2 minutos y 72 °C durante 2 minutos.

[0086] AMPure XP (Beckman Coulter, Cat. # A63881) se utilizó para eliminar los cebadores para la asignación de UID. Se utilizó el 0,025% del producto de PCR generado a partir de los ciclos UID para los ciclos de etiquetado con código de barras de pocillo (WBC). Los cebadores utilizados para el paso de código de barras de pocillo fueron idénticos a los descritos anteriormente y se diagraman en la figura 4A y 4B (28). Los ciclos de WBC se realizaron en reacciones de 25 µL que contenían 11,8 µL de agua (ThermoFisher UltraPure, Cat. # 10977-023), 5 µL de amortiguador 5X Phusion HF (ThermoFisher, Cat. # F518L), 0,5 µL de dNTP 10 mM (NEB, Cat. # N0447L) y 0,25 µL de ADN polimerasa Phusion Hot Start II (ThermoFisher, Cat. # F549L). Se usaron las siguientes condiciones de ciclo: un ciclo de 98 °C durante 2 minutos, 24 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 2 minutos y 72 °C durante 2 minutos.

[0087] Secuenciación

[0088] La secuenciación de todos los amplicones descritos anteriormente se realizó usando un instrumento Illumina MiSeq. La longitud total de las lecturas utilizadas para cada instrumento varió de 79 a 130 bases. Se utilizaron lecturas que pasaron los filtros de castidad de Illumina CASAVA para el análisis posterior.

[0089] Canalización BiSeqS

[0090] Se procesaron lecturas de alta calidad con la canalización SafeSeqS (28) para generar datos alineados que luego se organizaron en tablas para cada análisis BiSeqS. Cada una de las tablas contiene: (i) información de cadena, (ii) código de barras de pocillo y secuencias de UID, (iii) información que enumera todas las diferencias del amplicón de referencia, y (iv) prevalencia de cada familia de UID correspondiente a un cambio con respecto a todas las familias de UID por amplicón. Para determinar si una combinación de cambios de cadena positiva y negativa constituye un mutante de cadena doble, las diversas mutaciones detectadas en un locus genómico específico se comparan con respecto a: (i) identidad de muestra, (ii) cromosoma, (iii) posición genómica y (iv) tipo de mutación. Los cambios se denominaron mutaciones verdaderas cuando: (i) el cambio apareció en las cadenas más y menos, y (ii) cuando los MAF correspondientes a las cadenas positiva y negativa difirieron en menos de 10 veces.

[0092] Caracterización de especificidad de BiSeqS

[0094] Para caracterizar la especificidad de BiSeqS, el ADN aislado de un tejido normal se trató con bisulfito y se procesó a través de la canalización BiSeqS para buscar sustituciones de una sola base e indeles. El análisis usando NGS a través de 8 amplicones y 608 bases para indeles produjo 907 mutaciones únicas identificadas en la cadena positiva y 958 mutaciones únicas identificadas en la cadena negativa que finalmente fueron susceptibles de análisis por BiSeqS. Para cada cadena de cada amplicón, calculamos la frecuencia de alelo mutante (MAF) dividiendo el número de lecturas o el número de UID que contienen > 2 lecturas mutantes por UID (recuento de familias de UID > 2) por el número de lecturas totales o el número de UID totales, respectivamente. El uso de códigos de barras moleculares para agrupar lecturas en familias disminuyó el número de mutaciones únicas a 92 en la cadena positiva y 71 en la cadena negativa (datos no mostrados). Después de emparejar los amplicones de cadena positiva y negativa e imponer un filtro de menos de 10 para la relación de mutaciones observadas en la cadena más a la relación de mutaciones observadas en la cadena menos (y viceversa), se identificaron cuatro mutaciones (se muestran los datos ahora). Se tomó el número de SDM como el mínimo del número de supermutantes en la cadena más o menos que correspondía a una mutación, ya que este es el número limitante de moléculas supermutantes bicatenarias detectables. El número total de moléculas bicatenarias se tomó de manera similar como el mínimo del número de UID totales en la cadena más o menos, ya que este es el número limitante de moléculas molde bicatenarias detectadas. El NGS estándar detectó 197 y 167 indeles en las cadenas más y menos, respectivamente. El uso de códigos de barras moleculares redujo el número de indeles detectados a 6 y 5 para la cadena más y menos, respectivamente, en tanto que el análisis de doble cadena BiSeqS redujo el número de indeles a cero.

[0096] Ejemplo 2

[0098] Flujo de Trabajo BiSeqS

[0100] La característica principal de BiSeqS es la detección simultánea de una mutación en las cadenas más y menos de los moldes de ADN que fueron tratados con bisulfito y con código de barras molecular. Se hace referencia a la secuencia de referencia tal como se define por UCSC como la cadena más (+), y su complemento inverso como la cadena menos (-). Se pueden emplear tres pasos experimentales simples (conversión con bisulfito, etiquetado con código de barras molecular y etiquetado con código de barras de muestra) antes de un análisis bioinformático especializado de los datos de secuenciación, como se describe a continuación (figura 1 y figura 4A a B).

[0102] Paso i: Conversión con bisulfito.La incubación de ADN con bisulfito de sodio a temperaturas elevadas y pH bajo desamina la citosina para formar 5,6-dihidrocitosina-6-sulfonato (34). La posterior desaminación hidrolítica a pH alto elimina el sulfonato, dando como resultado uracilo (35). Se han descrito muchas modificaciones de esta reacción básica y se han utilizado en gran medida para diferenciar entre citosina y 5-metilcitosina (5-mC), la última de las cuales no es susceptible a la conversión por bisulfito. Además de convertir C en U, el tratamiento con bisulfito desnaturaliza el ADN y puede degradarlo. Aunque esta degradación no es limitante para las aplicaciones estándar de tratamiento con bisulfito, es crítica para las aplicaciones que implican la detección de mutaciones en muestras clínicas que ya están degradadas antes de la conversión (36-38). En el estudio actual, evaluamos muchas formas de convertir el ADN y purificar las cadenas convertidas. Los mejores resultados se obtuvieron con los reactivos, condiciones y tiempos de incubación descritos en los Materiales y Métodos. Como se muestra en la figura 5, el tratamiento en estas condiciones no inhibió la amplificación de productos de PCR de hasta 285 pb de tamaño. La secuenciación de estos productos reveló que, en promedio, > 99,8% de las bases C se convirtieron en bases T en ambas cadenas (excluyendo las bases C en los sitios 5'-CpG, que pueden ser resistentes a la conversión con bisulfito porque están metiladas o hidroximetiladas).

[0104] Paso ii. Etiquetado con código de barras molecular.El objetivo del tratamiento con bisulfito es crear un código para distinguir las dos cadenas de ADN. Esto duplica el número de moldes que se necesitan con código de barras molecular, utilizando pasos especializados en comparación con el utilizado para la amplificación estándar de ADN. En primer lugar, se deben diseñar cuatro cebadores para amplificar cada región de interés, dos cebadores para cada cadena. En segundo lugar, los cebadores deben ser complementarios a la forma convertida del ADN, lo que acentúa la importancia de la conversión completa; de lo contrario, algunas moléculas molde no se amplificarán porque no serán perfectamente complementarias a los cebadores. En tercer lugar, el tratamiento con bisulfito en las condiciones que empleamos convierte prácticamente todos los residuos C no modificados en T, reduciendo la temperatura de fusión tanto de los sitios de hibridación del cebador como del amplicón en general. Debido a que ambas cadenas se deben amplificar de manera equivalente y en la misma reacción, los cebadores deben elegirse de modo que se puedan usar las mismas condiciones de ciclo de PCR para amplificar ambas cadenas de una manera altamente específica. Para regiones en las que ya hay un bajo contenido de pares de bases C:G, los cebadores deben ser lo suficientemente largos como para permitir la amplificación específica en condiciones de hibridación a temperatura relativamente alta. Esto resultó difícil sin producir grandes cantidades de dímeros de cebador, y para superar estos desafíos, se evaluaron varios diseños de cebador. Finalmente, las variaciones en la longitud, posición, composición y contenido de C:G del cebador permitieron la amplificación específica y robusta de ambas cadenas de cada región diana intentada.

[0106] Otro problema que enfrenta la amplificación de ADN convertido con bisulfito es que muchas polimerasas no copiarán de manera eficiente el ADN que contiene bases de uracilo. Se probaron siete polimerasas disponibles comercialmente y diversas condiciones de reacción para optimizar la eficiencia del uso de molde y la uniformidad de la amplificación de ambas cadenas cuando se usaron cuatro cebadores (Tabla 1). En tanto que una combinación de AMPIGene Hot Start Taq Polymerase e iTAQ Polymerase amplificó la mayor cantidad de moléculas molde, su falta de actividad de exonucleasa 3'→5' demostró ser limitante para la especificidad en el sentido de que el número de errores durante la PCR fue inaceptablemente alto. En última instancia, elegimos Phusion U Hot Start Polymerase, una polimerasa que exhibe actividad de exonucleasa 3'→5', como la enzima para amplificar los moldes que contienen uracilo con la mayor especificidad en tanto que se mantiene la sensibilidad.

[0108] Paso iii: Ejemplo de etiquetado con código de barras.Parte del poder de los instrumentos de secuenciación masiva en paralelo es que se pueden usar para analizar muchas muestras a la vez. Para permitir esta capacidad para BiSeqS, incorporamos un ciclo de PCR de código de barras de muestra después de la purificación de los productos de PCR con código de barras molecular (figura 4, paso iii). Además, el ADN de muestra convertido se dividió en dos a seis pocillos de la placa de PCR antes del paso de etiquetado con código de barras molecular. Entonces, a cada pocillo se le asignó un código de barras de muestra diferente. Esta distribución sirvió para dos propósitos. En primer lugar, con moldes de ADN concentrado, podría proporcionar la replicación independiente de mutaciones con fracciones de alelos mutantes pequeños. En segundo lugar, con moldes de ADN diluido, como a menudo están presentes en muestras clínicas tal como plasma (9), orina (39) y LCR (12), brinda la oportunidad de probar más moléculas molde, lo que aumenta la posibilidad de identificar moldes mutantes.

[0110] Ejemplo 3

[0112] Canalización de procesamiento de datos BiSeqS

[0114] Las llamadas de base de alta calidad se alinearon con la secuencia de referencia convertida con bisulfito, y los datos alineados se organizaron en tablas para cada muestra, donde cada mutación observada en cada cadena de cada pocillo se enumeró en una fila separada. Las columnas de esta tabla incluyeron el número de lecturas, UID y supermutantes para cada mutación (datos no mostrados). Los supermutantes se definieron como mutaciones en una familia UID en la que > 90% de los miembros de la familia contenían esa mutación. Por ejemplo, si los tres miembros de una familia UID contenían la misma mutación, se consideraba un supermutante. La fracción de alelos supermutantes se definió como la cantidad de supermutantes dividida por la cantidad de UID en un pocillo individual.

[0116] Se compararon mutaciones individuales en las cadenas más y menos para determinar si se encontró el supermutante idéntico en ambas cadenas. Si la mutación se encontró en ambas cadenas, se compararon las fracciones de alelos supermutantes en cada cadena. Las fracciones de alelos supermutantes en cada cadena proporcionan un nivel adicional de especificidad porque se espera que estas fracciones sean similares si existía un par de bases mutante en el ADN molde antes de la conversión y amplificación. Dado que las mutaciones que surgen durante la PCR son relativamente raras, sería aún más raro que la misma mutación surja en la misma posición en ambas cadenas. Esto es especialmente cierto después de la conversión, cuando las dos cadenas contienen contextos de nucleótidos marcadamente diferentes. Si las fracciones de alelo supermutante en cada cadena diferían < 10 veces, entonces la mutación se consideró unsuper-dupermutante (SDM, por sus siglas en inglés). La fracción alélica de SDM se definió como el número de SDM dividido por el número de UID en la cadena que contenía la menor cantidad de UID. Por ejemplo, si el número de SDM fue 10, y el número de UID en las cadenas más y menos fue 10.000 y 20.000, respectivamente, entonces la fracción alélica de SDM sería 0,1% (es decir, 10 de 10.000).

[0118] Las características especiales del análisis de mutaciones en el ADN convertido incluyen lo siguiente. Una transición de C >T observada en la secuenciación podría haber resultado de una mutación de sustitución de base única que cambió un par de bases C:G a un par de bases T:A o de la conversión con bisulfito de un C a un T en una cadena. A la luz de esta ambigüedad, las mutaciones de C a T no se pueden considerar supermutantes en la cadena que contiene la C, aunque un supermutante aún sería evidente en esa posición en la cadena que contiene la G. Hay un total de seis posibles sustituciones de una sola base en el ADN dúplex: Un par de bases C:G se puede mutar a cualquiera de un par de bases A:T, G:C o T:A, y un par de bases A:T se puede mutar a C:G: G:C o T:A. De estas seis sustituciones de un solo par de bases, todas dan como resultado supermutantes en al menos una cadena y cuatro dan como resultado supermutantes en ambas cadenas (es decir,SDM). Además, las transiciones que crean un dinucleótido CpG en el que la C está metilada se pueden evaluar en ambas cadenas. Todas las inserciones o deleciones dentro de las secuencias amplificadas pueden formar SDM. La metilación también introduce complejidad, ya que las bases C metiladas o hidroximetiladas no se convierten en bases U mediante el tratamiento con bisulfito. La canalización BiSeqS tiene esto en cuenta cuando analiza los datos al no asumir que cualquier C en particular está metilado o no metilado (o que cada C no metilado se convierte en T mediante tratamiento con bisulfito). En cambio, considera los posibles efectos de la conversión y metilación y solo etiqueta una mutación como supermutante o SDM si no hay ambigüedad. Una lista de todas las posibles sustituciones de una sola base en cualquiera de las cadenas, dentro de un contexto de triplete y con la base mutada en el medio, se proporciona en la Tabla 1, más adelante.

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0126] Para cada sustitución de base individual, la capacidad de BiSeqS para identificar SDM también se proporciona en esta tabla. En términos generales, todas las transversiones, todas las inserciones y deleciones, y un pequeño subconjunto de transiciones se pueden puntuar inequívocamente como SDM (Tabla 1). Debido a que el poder de BiSeqS radica en los SDM, solo las mutaciones que son interpretables en ambas cadenas se consideran a continuación.

[0127] Ejemplo 4

[0128] BiSeqS aumenta la especificidad de la identificación de mutaciones

[0129] Seleccionamos ocho amplicones dentro de genes conductores de cáncer prototípicos para evaluar el rendimiento de BiSeqS. Para cada uno de los ocho amplicones, se sintetizaron dos cebadores directos y dos cebadores inversos para cada cadena y se probaron utilizando los principios descritos anteriormente y en la sección de Materiales y Métodos. Para todos los amplicones, se encontró que al menos un par de cebadores para cada cadena era capaz de amplificar específicamente la cadena deseada con alta eficiencia, según lo juzgado por el análisis en gel de poliacrilamida (figura 5). Las secuencias de estos cebadores se enumeran en el listado de secuencias. Para cada uno de los ocho amplicones, comparamos la especificidad de BiSeqS con la de la secuenciación convencional de próxima generación (NGS) y la secuenciación asistida por código de barras molecular (es decir,SafeSeqS). Se consideraron solo aquellas mutaciones potenciales que se pudieron discernir en ambas cadenas, como se describió anteriormente. Hubo un total de 608 pb dentro de estos amplicones, produciendo un total de 1550 sustituciones de una sola base posibles. De estos 1550 SBS potenciales, 1252 (80,8%) fueron calificables como SDM; el resto fueron transiciones que no fueron calificables por las razones mencionadas anteriormente. También hubo muchos indeles posibles en cada posición que podrían haberse observado en los datos de secuenciación, todos puntuables como SDM.

[0130] En el experimento real, pudimos distinguir la cadena utilizada como molde en el instrumento de secuenciación debido a la conversión con bisulfito. Teniendo en cuenta esto, en realidad hubo 2504 mutaciones (2 x el número de pares de bases) que se pudieron puntuar tanto para la secuenciación convencional como para la asistida por código de barras molecular. De estos 2504 SBS potenciales, 1865 (74,5% del total de mutaciones posibles) se observaron realmente en la secuenciación convencional (25), destacando el número relativamente grande de errores observados a menos que se aplique corrección de errores mediante SafeSeqS o BiSeqS (datos no mostrados). No hubo diferencia discernible entre las dos cadenas con respecto al número de mutaciones observadas, con 907 y 958 mutaciones observadas en las cadenas más y menos, respectivamente. También hubo 298 pequeñas inserciones o deleciones observadas por NGS convencional.

[0131] La aplicación del enfoque de etiquetado con código de barras molecular a estos datos redujo considerablemente el número de mutaciones, como es evidente por comparación de las figuras 6A y 6B (nótese que la escala del eje y se redujo en dos órdenes de magnitud en la figura 6B). La medida más relevante de esta reducción es la comparación de las frecuencias de alelos mutantes (MAF) antes y después de que se aplicó el etiquetado con código de barras molecular. Antes de aplicar el etiquetado con código de barras molecular, la mediana de las frecuencias de alelos mutantes (MAF) de la SBS en la cadena positiva fue de 0,0233% (promedio de 0,0720%, IC del 95% de 0,0627% a 0,0813%; figura 2A a 2C). Fue similar en la cadena negativa: mediana de 0,0185%, promedio de 0,0751%, 95% CI 0,0643% a 0,0859%. Como se muestra en la figura 2B, después del etiquetado con código de barras molecular, el MAF en la cadena positiva se redujo en 8 veces, a una mediana de 0,0000%, promedio de 0,0091% (IC 95% de 0,0062% a 0,0119%; p <10-12, prueba t de Student de dos colas emparejada). Se señala que el MAF después del etiquetado con código de barras molecular es una medición de la frecuencia del alelo supermutante (SMAF), pero se etiqueta MAF en la figura 2B para mayor simplicidad. El MAF de la cadena menos se redujo en 9 veces mediante etiquetado con código de barras molecular (mediana de 0,0000%, promedio de 0,0080%, IC 95% de 0,0047% a 0,0113%; p <10-12, prueba t de Student de dos colas emparejada). La magnitud de las reducciones logradas por SafeSeqS estuvo de acuerdo con las expectativas de los experimentos en ADN nativo que no se había tratado con bisulfito (27).

[0132] La aplicación de BiSeqS a estos datos dio como resultado una reducción aún más sorprendente de los errores. Solo se observaron cuatro SDM en los ocho amplicones secuenciados, a diferencia de 1865 y 163 mutaciones sin y con etiquetado con código de barras molecular, respectivamente (figura 6; nótese que el eje y de la figura 6C se ha reducido en otro orden de magnitud en comparación con la figura 6B). Esto se reflejó en los MAF, como se muestra en la figura 2C, que se redujeron en 1217 veces a través de BiSeqS en comparación con NGS y 141 veces en comparación con el etiquetado con código de barras molecular (mediana de 0,0000%, promedio de 0,0001%, IC del 95% de 0,0000% a 0,0001%; p <10-12, prueba t de Student de dos colas emparejada).

[0133] BiSeqS también redujo los errores en indeles; hubo 364 mutantes, 11 supermutantes y cero SDM observados en los ocho amplicones (figura 7 y 8). Por lo tanto, los MAF se redujeron de un promedio de 0,0041% con NGS a 0,0011% con etiquetado con código de barras molecular a 0,0000% con BiSeqS (p < 1,2 x 10<-6>para NGS en comparación con el etiquetado con código de barras molecular para la cadena positiva, p < 7,5 x 10<-4>para NGS en comparación con el etiquetado con código de barras molecular para la cadena negativa, p < 1,3 x 10<-2>para el etiquetado con código de barras molecular en comparación con BiSeqS).

[0134] Ejemplo 5

[0135] Sensibilidad de BiSeqS

[0136] La secuenciación paralela masiva permite evaluar miles de millones de amplicones simultáneamente, lo que da como resultado sensibilidades teóricas de 1 mutación entre > 1 mil millones de moldes WT para cualquier base

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección de una mutación en una población de moléculas de ADN, que comprende:

tratar una población de moléculas de ADN con bisulfito para convertir bases de citosina no metiladas en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando así una población de moléculas de ADN convertidas; unir códigos de barras moleculares a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando así una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas,

en donde los cebadores de amplificación comprenden al menos cuatro cebadores, cada uno de los cuales es complementario a uno de los cuatro extremos de las moléculas de ADN convertidas;

amplificar las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN;

someter una pluralidad de miembros de las familias a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos para ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias; y comparar secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia e identificar familias en las que los miembros contienen una mutación seleccionada, y comparar secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida e identificar la mutación seleccionada en dos cadenas complementarias.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la mutación está en un gen conductor de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: NRAS, PIK3RI, PTEN, RNF43 o TP53.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el paso de unión emplea polimerasa Phusion U Hot Start.

4. El método de la reivindicación 2, en donde el paso de unión emplea un cebador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-31 y 32, opcionalmente en donde al menos cuatro cebadores se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-31 y 32.

5. El método de la reivindicación 2, en donde el paso de amplificación crea un amplicón seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33-47 y 48.

6. El método de la reivindicación 1, en donde los cebadores de amplificación específicos de diana comprenden bases de ácido nucleico modificadas o enlaces internucleotídicos modificados.

7. El método de la reivindicación 1, en donde:

(i) el paso de amplificación agrega un código de barras de muestra a los productos de amplificación en la reacción de amplificación, en donde el código de barras de muestra identifica la reacción de amplificación; o

(ii) antes del paso de amplificación, la población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas se distribuye en una pluralidad de subpoblaciones.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la mutación seleccionada es una transversión, una inserción o una deleción.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la mutación es una mutación rara o un polimorfismo.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el paso de comparar secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia comprende identificar familias en las que >50% de los miembros contienen una mutación seleccionada, por ejemplo, más de 60%, 70%, 80% o 90% de los miembros contienen una mutación seleccionada.

11. El método de la reivindicación 1, en donde la población de moléculas de ADN es de una muestra de paciente diluida y la mutación seleccionada se ha identificado previamente en una muestra de paciente más concentrada.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el método detecta una mutación en un cáncer en etapa temprana.

13. Un método para detectar la metilación en un dinucleótido CpG en cadenas positiva y negativa simultáneamente, que comprende:

tratar una población de moléculas de ADN con bisulfito para convertir bases de citosina no metiladas en las moléculas de ADN en bases de uracilo, formando una población de moléculas de ADN convertidas; unir códigos de barras moleculares a ambas cadenas de la población de moléculas de ADN convertidas usando un exceso de cebadores de amplificación específicos de diana unidos a códigos de barras moleculares, formando una población de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas,

en donde los cebadores de amplificación comprenden al menos cuatro cebadores, cada uno de los cuales es complementario a uno de los cuatro extremos de las moléculas de ADN convertidas; amplificar las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas en una reacción de amplificación para formar familias de moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas, en donde las moléculas de ADN amplificadas, con código de barras, convertidas que comparten el mismo código de barras molecular forman una familia de moléculas de ADN;

someter una pluralidad de miembros de las familias a reacciones de secuenciación para obtener secuencias de nucleótidos para ambas cadenas de la pluralidad de miembros de las familias; y comparar secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia e identificar familias en las que los miembros contienen una C metilada en un dinucleótido CpG, y

comparar secuencias de nucleótidos de dos cadenas complementarias de una molécula de ADN amplificada, con código de barras, convertida e identificar el nucleótido G opuesto a C metilado del dinucleótido CpG.

14. El método de la reivindicación 13, en donde:

(i) el paso de amplificación agrega un código de barras de muestra a los productos de amplificación en la reacción de amplificación, en donde el código de barras de muestra identifica la reacción de amplificación; o

(ii) el paso de comparar secuencias de nucleótidos de una pluralidad de miembros de una familia comprende identificar familias en las que >50% de los miembros contienen una mutación seleccionada, por ejemplo, más de 60%, 70%, 80% o 90% de los miembros contienen una mutación seleccionada.