ES3053085T3 - Compounds with semiochemical properties and biosensors - Google Patents

Abstract

Se proporciona un compuesto de Fórmula I o Fórmula IA, una composición que comprende un compuesto de Fórmula I o Fórmula IA, usos de los compuestos y composiciones para modular el comportamiento de los insectos y métodos para modular dicho comportamiento. También se proporcionan biosensores para detectar un analito en una muestra, usos del biosensor y métodos para detectar un analito en una muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Compuestos con propiedades semioquímicas y biosensores

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] Campo de la invención

[0005] En el presente documento se proporcionan biosensores para detectar un analito en una muestra, usos de dicho biosensor y métodosin vitropara detectar un analito en una muestra.

[0006] Técnica relacionada

[0007] Un semioquímico es un compuesto que es secretado por organismos, que modifica el comportamiento y/o desarrollo de otro organismo. Los semioquímicos se clasifican en semioquímicos intraespecíficos,feromonas, un compuesto o grupo de compuestos que son liberados por un organismo e inducen una respuesta en un individuo de la misma especie, y semioquímicos interespecíficos,aleloquímicos, que estimulan organismos de diferentes especies. Las feromonas son fundamentales para la comunicación entre insectos de la misma especie; estas pueden incluir feromonas sexuales, feromonas de agregación y feromonas de alarma.

[0008] Las feromonas se pueden clasificar enliberadores, feromonas que inducen un cambio de comportamiento inmediato yprimarias, feromonas que inician un conjunto complejo de cambios fisiológicos o de desarrollo, pero pueden no dar como resultado un cambio de comportamiento inmediato.

[0009] Los semioquímicos se usan en la ubicación del huésped, el apareamiento y los sistemas de advertencia del enemigo. Aunque los semioquímicos son ampliamente empleados por los insectos para la comunicación, la química de la comunicación y los posibles semioquímicos se han identificado en muchos otros organismos, incluidos mamíferos, aves y peces.

[0010] Se ha demostrado que las especies de áfidos, incluido el áfido del guisante, Acyrthosiphon pisum, emplean feromonas sexuales (por ejemplo, (4aS,7S,7aR)-nepetalactona y (1R,4aS,7S,7aR)-nepetalactol) y una feromona de alarma, además de una gama de aleloquímica generalmente utilizada para la ubicación del huésped.

[0011] Los semioquímicos tienen el potencial de utilizarse en el control de plagas mediante la disrupción del apareamiento, trampas con feromonas, estrategias de atracción y reclutamiento y el reclutamiento de enemigos naturales. Se han utilizado componentes sintéticos de feromonas sexuales en el campo para capturar áfidos machos y reclutar avispas parásitas forrajeras,Aphidius erviHaliday yPraon barbatum. También se ha encontrado que los componentes de feromonas sexuales sintéticas atraen a otros depredadores naturales de áfidos, tales como las crisopas (Chrysopa cognata).

[0012] Se ha demostrado que la feromona de alarma (E) -β-farneseno (EBF) repele a los pulgones en estudios de comportamiento, mientras que es atractiva para los depredadores enemigos naturales y los parasitoides. Se ha modificado genéticamente una variedad comercial hexaploide de trigo,Triticum aestivumcv. Cadenza (Poaceae), para biosintetizar y liberar EBF. La evaluación en ensayos de campo mostró que la variedad de trigo transformada no fue significativamente diferente de las variedades no transformadas en el control de áfidos (evaluado mediante el número de áfidos y el número de áfidos parasitados), aunque los estudios en ambientes controlados habían demostrado su eficacia. Esto probablemente se deba a que la velocidad de liberación de la feromona de alarma de la planta es constante y constante, en contraste con una explosión rápida natural de feromona producida por los pulgones.

[0013] Los semioquímicos derivados de plantas también tienen aplicaciones prácticas; se ha encontrado que la (Z) -jasmona es eficaz para reducir el número de áfidos, atraer avispas parásitas e inducir la producción de volátiles repelentes en cultivos como el trigo, el algodón y los pimientos dulces. (S)-germacreno D ha sido identificado como un potente repelente para áfidos, pero tiene poco potencial de aplicación comercial en la protección de cultivos debido a su inestabilidad química y coste de producción. Se podría desarrollar el desarrollo de análogos más estables que tengan una actividad de comportamiento comparable, particularmente utilizando terpeno sintasas modificadas y sustratos no naturales.

[0014] Un mayor avance en el uso de semioquímicos en el control de plagas podría provenir de una comprensión más profunda de los procesos de reconocimiento molecular en los sistemas olfativos de las plagas. Esto puede conducir al diseño'ab initio'de ligandos, que pueden tener efectos de comportamiento similares a otros ligandos olfativos, pero mejores perspectivas de producibilidad comercial. Actualmente, la comprensión del sistema olfativo es limitada, aunque están involucrados dos grupos principales de proteínas: los receptores olfativos (OR) y las proteínas de unión al odorante (OBP), que podrían proporcionar posibles objetivos de control de plagas.

[0015] Dado el importante valor en la comprensión de los sistemas olfativos y semioquímicos en diversas industrias, como las industrias alimentaria, sanitaria y farmacéutica, existe la necesidad de desarrollar nuevos semioquímicos y sensores. La presente invención responde esta necesidad.

[0016] Sun et al. en "New Analogues of (E) -β-Farnesene with Insecticidal Activity and Binding Affinity to Aphid Odorant-Binding Proteins", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, vol. 59, no. 6, pp. 2456-2461, describen análogos de (E) -β-farneseno que se unen a proteínas de unión a odorantes del pulgón del guisanteAcyrthosiphon pisum.

[0017] de Biasio et al. en “Expression pattern analysis of odorant-binding proteins in the pea aphid Acyrthosiphon pisum”, Insect Science, 2015, vol.22, n .º 2, págs.220-234, describen las relaciones entre los patrones de expresión de la proteína de unión al odoranteAcyrthosiphon pisumy sus implicaciones funcionales.

[0018] Pelosi et al. en “Odorant-Binding Proteins as Sensing Elements for Odour Monitoring”, Sensors, 2018, vol.18, n .º 10, pp.1-19, revisan las proteínas de unión a odorantes y otras proteínas solubles como elementos detectores en biosensores de olores.

[0019] Pelosi et al. en “From radioactive ligands to biosensors: binding methods with olfactory proteins”, Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, vol.102, no.19, pp.8213-8227, revisan protocolos de unión para medir la afinidad de odorantes y feromonas a proteínas olfativas solubles, tales como proteínas de unión a odorantes, proteínas quimiosensoriales y proteínas de clase C2 de Niemann-Pick.

[0020] Sumario

[0021] La invención se refiere, en general, a biosensores para detectar un analito en una muestra.

[0022] En un aspecto de la invención, se proporciona un biosensor tal como se define en la Reivindicación 1, comprendiendo el biosensor:

[0023] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO: 6, o una variante de la misma, en donde la variante tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia general con SEQ ID NO: 6; y un generador de señales, en donde el generador de señales está configurado para emitir una señal cuando el analito está unido a la proteína.

[0024] Preferiblemente, el biosensor comprende además:

[0025] una trayectoria de flujo para mover la muestra;

[0026] un sustrato; y

[0027] una capa que contiene proteína inmovilizada en el sustrato y en contacto con la trayectoria de flujo, en donde la capa que contiene proteína comprende la proteína.

[0028] En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso del biosensor, en donde el biosensor se utiliza para identificar ligandos olfativos.

[0029] En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso del biosensor, en donde el biosensor se utiliza en el cribado de alto rendimiento.

[0030] En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso del biosensor, en donde el biosensor se utiliza para detectar poblaciones de campo de pulgones.

[0031] En otro aspecto de la invención, se proporciona un métodoin vitropara detectar un analito en una muestra tal como se define en la Reivindicación 4, comprendiendo el método:

[0032] a. proporcionar un biosensor tal como se definió anteriormente;

[0033] b. poner en contacto el biosensor con la muestra; y

[0034] c. comparar una magnitud de la señal generada por el biosensor cuando la muestra está presente con una magnitud de referencia de la señal generada por el biosensor cuando la muestra está ausente.

[0035] Preferiblemente, el biosensor se usa para identificar ligandos olfativos.

[0036] Preferiblemente, el biosensor se usa en cribado de alto rendimiento.

[0037] Preferiblemente, el biosensor se usa para detectar poblaciones de campo de áfidos.

[0038] Breve descripción de las figuras

[0039] La invención se describe adicionalmente por referencia a las siguientes figuras no limitativas.

[0040] La figura 1 muestra modelos de homología de proteínas de unión a odorantes de (OBP1-OBP11) deA. pisum. La figura 2 muestra: (i) una estructura predicha de OBP6 (verde) con posibles bolsillos de unión mostrados en púrpura; (ii) posible puente salino entre Lys144 y Asp174; (iii) estructura predicha de OBP6 con el mapa electrostático calculado mediante el solucionador adaptativo de Poisson-Boltzmann (APBS).

[0041] La figura 3 muestra los resultados del cribado de ligandos de Autodock. Se sometieron a prueba los componentes de la feromona sexual del áfido y los enantiómeros respectivos, junto con la feromona de alarma del áfido.

[0042] La figura 4 muestra interacciones de unión predichas (mostradas como 1/Ki) de los componentes de feromona sexual de áfido con las OBP 6-9. Los enantiómeros naturales se indican con un asterisco.

[0043] La figura 5 muestra: (i) interacciones de OBP6 (verde) con los enantiómeros de la feromona sexual; interacción de (1R,4aS,7S,7aR) -nepetalactol (rosa) de origen natural con Tyr176 y Phe208 (rojo, discontinuo); (ii) interacción de (1S,4aR,7R,7aS) -nepetalactol (azul) de origen no natural con una interacción potencial con Lys169 (rojo, discontinuo). La distancia de las interacciones está en Å.

[0044] La figura 6 muestra: (i) los dominios transmembrana generales de los receptores odorantes de insectos; (ii) modelos de homología del receptor odorante deAcyrthosiphon pisum5 incrustado en una bicapa lipídica.

[0045] La figura 7 muestra la fluorescencia de triptófano de OBP6 a 2 µM con 1-NPN 2 µM titulada con diversos ligandos a concentraciones finales de 0-22 µM. La concentración más baja de cada ligando (0 µM) puede observarse en rojo y la concentración más alta (22 µM) en negro. Para cada ligando, solo se presenta un conjunto de datos para mayor claridad.

[0046] La figura 8 muestra: (i) curvas de unión de OBP6 con los componentes de feromona sexual de áfido (negro) y sus respectivos enantiómeros (rojo); (ii) curvas de unión de OBP6 con la feromona de alarma de áfido (azul) y linalol (púrpura); (iii) valores deKD

calculados de OBP6 con diversos ligandos.

[0047] La figura 9 muestra los valores deKD

calculados para OBP6 y diversos ligandos a partir de estudios de unión fluorescente frente a losKD

predichos a partir de pruebasin silico.

[0048] La figura 10 muestra los resultados del cribado de ligandos de Autodock. Se sometieron a prueba los componentes de la feromona sexual del áfido y los enantiómeros respectivos, junto con la feromona de alarma del áfido.

[0049] La figura 11 muestra los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de diferencia de transferencia de saturación (Std) de albúmina de suero bovino (BSA) con triptófano (7,00-8,00 ppm) y sacarosa (3,00-4,40 ppm). Se puede ver la<1>H inicial (espectro superior), además de la RMN de STD (espectro inferior), donde solo quedan los picos de triptófano.

[0050] La figura 12 muestra los espectros de RMN de STD de OBP6 deA. pisumcon (4aS,7S,7aR)-nepetalactona. Los espectros iniciales de<1>H (espectro superior), además de la RMN de STD (espectro inferior).

[0051] La figura 13 muestra: (i) asignaciones y cambios en la intensidad relativa de diferentes picos en el espectro de RMN de STD de OBP6 y (4aS,7S,7aR)-nepetalactona; (ii) valores absolutos de STD y cambios en la intensidad relativa de diferentes protones en el espectro de RMN de STD de OBP6 y (4aS,7S,7aR)-nepetalactona; (iii) la estructura de (4aS,7S,7aR)-nepetalactona anotada con los resultados de mapeo de epítopos.

[0052] Descripción detallada

[0053] Ahora se describirá adicionalmente la presente invención. En los siguientes pasajes, se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.

[0054] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de microbiología, cultivo de tejidos, biología molecular, química, bioquímica, tecnología de ADN recombinante y fabricación de biosensores, que se conocen generalmente en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía.

[0055] 3. Proteínas olfativas

[0056] Las proteínas olfativas son responsables de la detección de odorantes y, por lo tanto, pueden ser adecuadas para la detección de feromonas sexuales asociadas con insectos, por ejemplo, pulgones.

[0057] Las proteínas olfativas pueden incluir receptores odorantes (OR). Los Ejemplos no limitantes de receptores odorantes incluyen el receptor odorante 1/correceptor del receptor olfativo (OR1/ORCO), receptor odorante 2 (OR2), receptor odorante 4 (OR4), receptor odorante 5 (OR5), receptor odorante 10 (OR10), receptor odorante 17 (OR17), receptor odorante 20 (OR20), receptor odorante 22c (OR22c), receptor odorante 23 (OR23), receptor odorante 25 (OR25), receptor odorante 31 (OR31), receptor odorante 37 (OR37), receptor odorante 38 (OR38), receptor odorante 39 (OR39), receptor odorante 42 (OR42) y receptor odorante 43 (OR43).

[0058] Las proteínas olfativas pueden incluir proteínas de unión olfativas (OBP). Los Ejemplos no limitantes de proteínas de unión olfativas incluyen proteína de unión olfativa 1 (OBP1), proteína de unión olfativa 2 (OBP2), proteína de unión olfativa 3 (OBP3), proteína de unión olfativa 4 (OBP4), proteína de unión olfativa 5 (OBP5), proteína de unión olfativa 6 (OBP6), proteína de unión olfativa 7 (OBP7), proteína de unión olfativa 8 (OBP8), proteína de unión olfativa 9 (OBP9), proteína de unión olfativa 10 (OBP10) y proteína de unión olfativa 11 (OBP11).

[0059] 4. Biosensores

[0060] El biosensor comprende OBP6 deAcyrthosiphon pisum(que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO: 6), o una variante de la misma.

[0061] El término "variante" o "variante funcional" tal como se usa en el presente documento con referencia a cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento se refiere a una secuencia polipeptídica variante o parte de la secuencia polipeptídica que retiene la función biológica de la secuencia no variante completa. Una variante funcional también comprende una variante del polipéptido de interés, que tiene alteraciones de secuencia que no afectan a la función, por ejemplo en residuos no conservados. También se incluye una variante que es sustancialmente idéntica, es decir, tiene solo algunas variaciones de secuencia, por ejemplo, en residuos no conservados, en comparación con las secuencias de tipo salvaje como se muestra en el presente documento y es biológicamente activa. Las alteraciones en una secuencia polipeptídica que no afecta a las propiedades funcionales del polipéptido se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, puede estar sustituido con otro residuo menos hidrófobo, tal como glicina, o un residuo más hidrófobo, tal como valina, leucina o isoleucina. De manera similar, también se puede esperar que los cambios que dan como resultado la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, produzcan un producto funcionalmente equivalente. Cada una de las modificaciones propuestas se encuentra dentro de la experiencia habitual en la técnica, al igual que la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. Como se usa en cualquier aspecto descrito en el presente, documento una "variante" o una "variante funcional" tiene al menos un 80 % (por ejemplo, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o al menos un 99 %) de identidad de secuencia general con la secuencia de aminoácidos no variante.

[0062] Preferiblemente, una "variante" o una "variante funcional" tal como se describe en el presente documento tiene al menos un 80 % (por ejemplo al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de identidad de secuencia global con la secuencia de aminoácidos no variante.

[0063] Se prefiere particularmente que una "variante" o una "variante funcional" tal como se describe en el presente documento tenga al menos un 90 %, un 95 % o un 99 % de identidad de secuencia global con respecto a la secuencia de aminoácidos no variante.

[0064] Se dice que dos polipéptidos son "idénticos" si la secuencia de residuos de aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima tal como se describe a continuación. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, según se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Pueden usarse parámetros de programa predeterminados, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Los Ejemplos no limitantes de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0.

[0065] En una realización, el biosensor puede comprender además un generador de señal. Por ejemplo, el generador de señales puede ser un transductor.

[0066] El generador de señales puede estar configurado para emitir una señal cuando el analito se ha unido a la proteína olfativa.

[0067] El generador de señales puede estar configurado para emitir una señal diferente cuando el analito no está unido a la proteína olfativa.

[0068] El generador de señales puede estar configurado para emitir ninguna señal cuando el analito no se ha unido a la proteína olfativa.

[0069] Una persona experta también entendería que una situación en la que el analito no se ha unido a la proteína olfativa conduce a una salida de una señal, y en la que el analito se ha unido a la proteína olfativa conduce a una salida sin señal, estaría abarcada por la presente divulgación.

[0070] Una magnitud de la señal generada puede estar correlacionada o ser proporcional a la concentración de analito en la muestra. Por ejemplo, una mayor concentración de analito puede estar asociada con una señal más intensa en términos de magnitud; por el contrario, una menor concentración de analito puede estar asociada con una señal menos intensa en términos de magnitud.

[0071] La señal puede basarse en una señal eléctrica. Por ejemplo, la señal puede ser una diferencia de potencial, una corriente, una resistencia, una capacitancia o una impedancia asociada con la señal eléctrica.

[0072] La señal puede basarse en una señal óptica. Por ejemplo, la señal puede basarse en diversas propiedades de radiación electromagnética, tales como longitud de onda, intensidad, absorción, dispersión o fluorescencia. Por ejemplo, la radiación electromagnética puede ser luz ultravioleta, luz visible o luz infrarroja.

[0073] El biosensor puede funcionar basándose en medios electroquímicos. La unión de un analito puede provocar el consumo o la generación de electrones. Como alternativa, la unión de un analito no provoca un flujo de electrones directo, sino que provoca cambios en la superficie de un electrodo, por ejemplo, cambios en la carga, la hidratación o el pH.

[0074] Los Ejemplos no limitativos de un biosensor de base electroquímica incluyen biosensores impedimétricos, amperométricos, potenciométricos, conductométricos y voltamétricos. Un biosensor de base electroquímica puede incluir transistores de efecto de campo de biosensor (BioFET), tales como transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFET).

[0075] El biosensor puede funcionar basándose en medios ópticos. Por ejemplo, el biosensor puede funcionar en un modo sin etiqueta, donde se genera una señal óptica directamente por la interacción del analito con un elemento de transducción. Alternativamente, el biosensor puede funcionar con una etiqueta y se genera una señal óptica mediante un método colorimétrico, fluorescente o luminiscente.

[0076] Los Ejemplos no limitantes de un biosensor basado en óptica incluyen biosensores de resonancia de plasmón superficial (SPR), fluorescencia de onda evanescente, interferometría de guía de onda óptica, elipsometría, espectroscopía de interferencia reflectométrica (RIfS) y dispersión Raman mejorada en superficie (SERS).

[0077] El biosensor puede funcionar basándose en medios piezoeléctricos. Por ejemplo, el biosensor puede incluir un cristal piezoeléctrico (por ejemplo, cuarzo) que vibra bajo la influencia de un campo eléctrico. La frecuencia resonante puede cambiar a medida que un analito se adsorbe o desorbe de la superficie del cristal piezoeléctrico. En una realización, el biosensor puede comprender además una trayectoria de flujo para mover una muestra, en donde la muestra puede contener un analito.

[0078] En una realización, el biosensor puede comprender además un sustrato.

[0079] Por ejemplo, el sustrato puede ser un sustrato de vidrio o un sustrato de polímero. El sustrato puede exhibir una excelente resistencia mecánica, estabilidad térmica, transparencia, suavidad superficial, facilidad de manipulación y resistencia al agua.

[0080] En una realización, el biosensor puede comprender además una capa que contiene proteína inmovilizada en el sustrato, en donde la capa que contiene proteína contiene la proteína olfativa. La capa que contiene proteínas puede estar en contacto con la trayectoria de flujo.

[0081] En la técnica se conocen bien medios para inmovilizar proteínas sobre un sustrato. Los métodos no limitantes de inmovilización de proteínas incluyen adsorción, reticulación, enlace covalente, polimerización electroquímica y fotopolimerización.

[0082] En una realización, el biosensor puede comprender además un electrodo de trabajo.

[0083] En una realización, el biosensor puede comprender además un contraelectrodo.

[0084] El electrodo de trabajo y/o el contraelectrodo pueden exponerse parcialmente en la trayectoria de flujo y utilizarse para aplicar un voltaje a una muestra.

[0085] El electrodo de trabajo y/o el electrodo de referencia pueden comprender un material eléctricamente conductor. Un material eléctricamente conductor es cualquier material que permite el flujo de carga (corriente eléctrica) en una o más direcciones. Los Ejemplos no limitantes de materiales eléctricamente conductores pueden incluir metales y aleaciones de metales, tales como oro, platino, cobre, plata, aluminio, paladio, acero, latón y bronce; materiales a base de carbono, tales como grafito, nanotubos de carbono de pared única (SWCNT), nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT), grafeno, óxido de grafeno; óxidos de metal, tales como óxido de indio y estaño (ITO), óxido de indio y cinc (IZO), óxido de estaño, óxido de cinc; y polímeros conductores orgánicos, tales como politiofeno, polianilina y polipirrol.

[0086] En una realización, el biosensor puede comprender además un electrodo de referencia.

[0087] El electrodo de referencia puede proporcionar una señal de referencia, por ejemplo, un potencial estable, con respecto a la muestra. Por ejemplo, un electrodo de referencia puede ser un electrodo de Ag/AgCl.

[0088] Los biosensores tal como se describen en el presente documento pueden tener alta afinidad de unión a las feromonas sexuales de insectos y por tanto pueden ser altamente sensibles a las feromonas sexuales de insectos. Por ejemplo, los biosensores tal como se describen en el presente documento pueden ser altamente sensibles a las feromonas sexuales de áfidos y, en particular,Acyrthosiphon pisum.

[0089] Los biosensores tal como se describen en el presente documento pueden ser altamente sensibles a la presencia de nepetalactoles o nepetalactonas.

[0090] Por ejemplo, los biosensores como se describen en la presente pueden ser altamente sensibles a la presencia de (1R,4aS,7S,7aR)-nepetalactol ((1R,4aS,7S,7aR)-4,7-dimetil-1,4a,5,6,7,7a-hexahidrociclopenta[c]piran-1-ol), (4aS,7S,7aR)-nepetalactona ((4aS,7S,7aR)-4,7-dimetil-5,6,7,7a-tetrahidrociclopenta[c]piran-1(4aH)-ona), (1S,4aR,7R,7aS)-nepetalactol ((1S,4aR,7R,7aS)-4,7-dimetil-1,4a,5,6,7,7a-hexahidrociclopenta[c]piran-1-ol) y/o (4aR,7R,7aS)-nepetalactona ((4aR,7R,7aS)-4,7-dimetil-5,6,7,7a-tetrahidrociclopenta[c]piran-1(4aH)-ona).

[0091] En particular, los biosensores tal como se describen en el presente documento pueden ser altamente sensibles a la presencia de nepetalactoles o nepetalactonas naturales, tales como (1R,4aS,7S,7aR)-nepetalactol y (4aS,7S,7aR)-nepetalactona.

[0092] Tal como se usa en el presente documento, el término “altamente sensible” puede referirse a un biosensor que comprende una proteína olfativa tal como se describe en el presente documento, o una variante de la misma, que tiene una energía de unión de -7,0 kcal mol<-1>, preferiblemente -7,1 kcal mol<-1>, más preferiblemente -7,2 kcal mol<-1>, uno más preferiblemente -7,3 kcal mol<-1>, todavía más preferiblemente -7,4 kcal mol<-1>, más preferiblemente -7,5 kcal mol<-1>,a un nepetalactol o nepetalactona tal como se describe en el presente documento.

[0093] 5. Usos de biosensores y métodos para detectar analitos

[0094] Los biosensores tal como se describen en el presente documento pueden usarse generalmente para la detección de analitos.

[0095] En una realización, los biosensores descritos en el presente documento pueden usarse para identificar nuevos ligandos olfativos.

[0096] Por ejemplo, los nuevos ligandos olfativos pueden estar asociados con áfidos y, en particular, conAcyrthosiphon pisum.

[0097] Por ejemplo, el biosensor puede usarse como una herramienta de cribado de laboratorio para identificar nuevos ligandos olfativos. Por ejemplo, el biosensor puede usarse para identificar atrayentes de áfidos distintos de los componentes de feromonas sexuales.

[0098] En una realización, los biosensores descritos en el presente documento pueden usarse en el cribado de alto rendimiento.

[0099] El cribado de alto rendimiento (HTS) generalmente utiliza ensayos automatizados para buscar una actividad deseada en grandes cantidades de compuestos. Los métodos de alto rendimiento permiten a los investigadores analizar miles de productos químicos diferentes contra cada molécula diana muy rápidamente utilizando sistemas de manipulación robótica y análisis automatizado de resultados.

[0100] Tal como se usa en el presente documento, “cribado de alto rendimiento” o “HTS” se refiere al cribadoin vitrorápido de grandes cantidades de compuestos (bibliotecas); generalmente de decenas a cientos de miles de compuestos, usando ensayos de cribado robóticos. El cribado de ultra alto rendimiento (uHTS) generalmente se refiere al cribado de alto rendimiento acelerado a más de 100.000 pruebas por día.

[0101] Para lograr un cribado de alto rendimiento, es ventajoso alojar muestras en un portador o plataforma multicontenedor. Un portador multicontenedor facilita la medición de reacciones de una pluralidad de compuestos candidatos simultáneamente. Pueden usarse microplacas de múltiples pocillos como portador. Tales microplacas de múltiples pocillos, y métodos para su uso en numerosos ensayos, tanto se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente.

[0102] En una realización, los biosensores descritos en el presente documento pueden usarse para detectar poblaciones de campo de áfidos.

[0103] Por ejemplo, el biosensor puede desplegarse como una herramienta de campo.

[0104] En una realización, se proporciona un métodoin vitropara detectar un analito en una muestra, que comprende: (a) proporcionar un biosensor como se describe en el presente documento; (b) poner en contacto el biosensor con la muestra; y (c) comparar una magnitud de la señal generada por el biosensor cuando la muestra está presente con una magnitud de referencia de la señal generada por el biosensor cuando la muestra está ausente.

[0105] Experimental

[0106] Los siguientes Ejemplos no limitativos se proporcionan para ilustración adicional.

[0107] Ejemplos 1 a 22 (referencia): Modelado y acoplamiento de ligandos y proteínas

[0108] Datos de secuencia y modelos de proteínas

[0109] Se accedió a todas las estructuras de proteínas publicadas previamente desde el Banco de Datos de Proteínas (PDB).

[0110] Tabla 1:Códigos de acceso NCBI para proteínas olfativas deAcyrthosiphon pisum.

[0111] Proteína A. Pisum Residuos Código de acceso de NCBI

[0112] OBP1 159 aa NP_001153526.1

[0113] OBP2 243 aa NP_001153528.1

[0114] OBP3 141 aa NP_001153529.1

[0115] OBP4 193 aa NP_001153530.1

[0116] OBP5 221 aa NP_001153531.1

[0117] OBP6 160 aa NP_001153532.1

[0118] OBP7 155 aa NP_001153533.1

[0119] OBP8 162 aa NP_001153534.1

[0120] OBP9 165 aa NP_001153535.1

[0121] OBP10 143 aa NP_001153525.1

[0122] OBP11 141 aa XP_008178459.1

[0123] OR1 (ORCO) 463 aa AQS60741.1

[0124] OR2 403 aa AQS60742.1

[0125] OR4 368 aa ARJ54248.1

[0126] OR5 367 aa KX890157.1

[0127] OR10 369 aa AQS60745.1

[0128] OR17 430 aa AQS60746.1

[0129] OR20 420 aa AQS60747.1

[0130] OR22c 403 aa XP_003245950.2

[0131] OR39 426 aa AQS60753.1

[0132] Alineación de secuencias y predicción de dominios transmembrana

[0133] Se realizaron alineaciones de secuencias usando Cluster Omega y el servidor de PRALINE. Se realizó un mapeo de conservación usando ConSurf. Se realizaron predicciones del dominio transmembrana de las proteínas receptoras utilizando un enfoque de consenso y cuatro servicios diferentes: HMMTOP, TMpred, PHOBIUS y TMHMM. Las alineaciones y los mapas de conservación se analizaron en GeneDoc, y los árboles filogenéticos se generaron en FigTree v1.4.3.

[0134] Para las proteínas de unión a odorantes, las estructuras de las proteínas se predijeron inicialmente utilizando la base de datos iTASSER, que adopta un enfoque jerárquico mediante la identificación de plantillas estructurales del banco de datos de proteínas. Todas las estructuras de proteínas predichas se minimizaron utilizando el servidor de minimización de Yasara.

[0135] Para los receptores odorantes, se realizó un modelado basado en homología usando el correceptor del receptor olfativo, ORCO deApocrypta bakericomo plantilla. La estructura de AbakORCO se obtuvo a partir del banco de datos de proteínas (PDB ID 6C70; resolución 3.5 Å). Se realizó un alineamiento de secuencias por pares usando PRALINE y los dominios transmembrana predichos se alinearon y anotaron manualmente. La estructura ORCO disponible comparte una identidad de secuencia generalmente baja con los receptores odorantes deA. pisum, sin embargo, la estructura general de siete transmembranas debe conservarse. La alineación por pares sirvió como plantilla para el modelado de homología utilizando el MODELLER 9.3 con refinamiento de bucle. La estructura secundaria de los bucles extracelulares largos 2 y 3 (el2 y el3) se predijo individualmente utilizando el servidor iTASSER. Se generaron aproximadamente 25 modelos para cada proteína, y estos se evaluaron posteriormente utilizando energía de proteína optimizada discreta (DOPE) de MODELLER, además de Ramachandran y análisis de puntuación Z, realizados en PROCHECK y ProSA respectivamente.

[0136] Todas las estructuras proteicas se visualizaron en PyMol 2.3.4.

[0137] Cribado de ligandos

[0138] Los ligandos se prepararon en Chem3D 16.0 y AutoDock 4.2 (Python Molecule Viewer), luego se analizaron frente a modelos generados por ordenador utilizando AutoDock4.2 y la herramienta de detección virtual Racoon. Se seleccionó un algoritmo genético lamarckiano para la simulación.

[0139] Las OBP y los OR se examinaron frente a una amplia gama de ligandos. Se calculó la energía de unión del complejo y la posterior K<i>.

[0140] Dinámica molecular

[0141] Las simulaciones de dinámica molecular se realizaron usando GROMACS 2019. Para las proteínas de unión a odorantes, se utilizó el campo de fuerza OLPS, y para los receptores de odorantes, se utilizó un campo de fuerza Gromas 53a6 modificado.

[0142] Para las proteínas de unión a odorantes, los modelos se solvataron y neutralizaron con iones (para Cl<->negativo, para Na<+>positivo) antes de realizar los cálculos de minimización y equilibrado de energía (temperatura y presión). Para cada proteína, se realizó una simulación de 1 ns. A continuación, se evaluó la estabilidad de la proteína observando la estabilización de temperatura y presión de los modelos simulados.

[0143] Se realizaron simulaciones de dinámica molecular usando el paquete GROMACS 9.3. Se utilizó el campo de fuerza para las OBP y OLPS, mientras que para los receptores odorantes, se utilizó el campo de fuerza Gromos53a6, con modificaciones realizadas en los parámetros del campo de fuerza Gromos53a6 para incluir lípidos y topología lipídica. La topología y la estructura de la bicapa lipídica se obtuvieron de http://wcm.ucalgary.ca/tieleman/downloads. Los modelos de receptores se incrustaron en una bicapa lipídica de 128 moléculas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Todos los modelos se solvataron con agua de solvente explícito (SPC) y se neutralizaron con iones Cl<->o Na<+>. Se usaron métodos de descenso más pronunciado para minimizar la energía de cada sistema, a una temperatura de referencia de 300 K. Todos los enlaces se restringieron con LINCS y la electrostática de largo alcance se manejó utilizando PME.

[0145] Tabla 2:Los componentes y análogos de feromonas sexuales de áfidos se examinaron frente a OBP6 deAcyrthosiphon pisumde tipo silvestre.

[0147] Ejemplo Compuesto Energía de unión (kcal mol-1) Ki (µM)Ejemplo 1 (referencia) 1 -8,76 0,38 Ejemplo 2 (referencia) 2 -7,75 2,08 Ejemplo 3 (referencia) 3 -7,77 2,01 Ejemplo 4 (referencia) 7 -7,87 1,69 Ejemplo 5 (referencia) 8 -8,15 1,06 Ejemplo 6 (referencia) 10 -7,78 1,99 Ejemplo 7 (referencia) 12 -8,05 1,26 Ejemplo 8 (referencia) 13 -8,29 0,83 Ejemplo 9 (referencia) 16 -8,45 0,64 Ejemplo 10 (referencia) 17 -8,04 1,27 Ejemplo 11 (referencia) 19 -8,39 0,71 Ejemplo 12 (referencia) 24 -8,24 0,91 Ejemplo 13 (referencia) 26 -7,84 1,79 Ejemplo 14 (referencia) 27 -7,88 1,65 Ejemplo 15 (referencia) 28 -8,02 1,31 Ejemplo 16 (referencia) 29 -8,24 0,91 Ejemplo 17 (referencia) 30 -7,86 1,71 Ejemplo 18 (referencia) 31 -8,10 1,14 Ejemplo 19 (referencia) 32 -8,12 1,10 Ejemplo 20 (referencia) 33 -7,77 2,01 Ejemplo 21 (referencia) 34 -7,91 1,57 Ejemplo 22 (referencia) 35 -8,14 1,07 Ejemplo comparativo 1 A -7,67 2,37 Ejemplo comparativo 2 B -7,52 3,07 Ejemplo comparativo 3 C -7,69 2,30 Ejemplo comparativo 4 D -7,60 2,69 Ejemplo comparativo 5 E -7,00 7,38

[0149] Las estructuras de los compuestos 1, 2, 3, 7, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 24 y 26-35, el Compuesto A ((1R,4aS,7S,7aR) -nepetalactol), el Compuesto B ((4aS,7S,7aR) -nepetalactona), el Compuesto C ((1S,4aR,7R,7aS) -nepetalactol), el Compuesto D ((4aR,7R,7aS) -nepetalactona) y el Compuesto E ((1R,2S,5S) -dolicodial) se proporcionan a continuación.

[0151] Estructuras de los compuestos 1, 2, 3, 7, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 24 y 26-35 y compuestos A-E:

[0154]

[0155]

[0158] Con referencia a la Tabla 2, los compuestos de los Ejemplos 1 a 22 (referencia) tienen una fuerte afinidad de unión a OBP6 deAcyrthosiphon pisumde tipo silvestre. Los compuestos de los Ejemplos 1 a 22 también tienen alta afinidad de unión en comparación con los compuestos de los Ejemplos Comparativos 1 a 5.

[0159] La figura 5(i) muestra que el par solitario en el átomo de oxígeno dentro del anillo de seis miembros de nepetalactona natural se mantiene cerca de otro par solitario de oxígeno en Tyr176. Sin querer limitarse a la teoría, se postula que un cambio de un átomo de oxígeno a un átomo de carbono, nitrógeno o azufre (por ejemplo, Ejemplos 1-11 y 13-20 (referencia)) ayuda a aumentar la afinidad de unión ya que hay menos repulsión electrostática (en el caso de carbono y nitrógeno, se elimina el par solitario; en el caso de azufre, el par solitario es más difuso con un átomo de azufre menos electronegativo). También se postula que, en el caso del azufre, el mayor tamaño del átomo de azufre conduce al arrugamiento del sistema de anillos lejos del par solitario de oxígeno en Tyr176, potenciando adicionalmente la afinidad de unión. Otros cambios estructurales (por ejemplo, en los Ejemplos 12, 21 y 22) también ayudan a aumentar la afinidad de unión.

[0160] Ejemplo 23: Acoplamiento de feromonas sexuales de áfidos con OBP y OR de Acyrthosiphon pisum de tipo silvestre

[0161] Tabla 3:Los componentes de la feromona sexual de los áfidos se examinaron frente a OBP deAcyrthosiphon pisumde tipo silvestre.

[0162] Energía de unión (kcal mol-1) de OBP

[0163] Ligando

[0165] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

[0166] A-5,85 8,79 -6,14 -5,94 -4,28 -7,67 -5,99 -5,89 -5,31 1,26 -5,92

[0167] B-6,60 2,33 NA -5,86 -5,00 -7,52 -6,03 -6,15 -5,79 2,60 -6,44

[0168] C-6,05 10,78 NA -6,45 -4,24 -7,69 -6,00 -6,38 -5,47 10,06 -5,94

[0169] D-6,53 10,1 NA -6,17 -5,07 -7,60 -5,98 -6,33 -5,71 NA -6,39

[0170] (NA = no se encontraron conformaciones de acoplamiento favorables en el cribado)

[0171] Tabla 4:Los componentes de la feromona sexual de los áfidos se examinaron frente a los OR deAcyrthosiphon pisumde tipo salvaje.

[0172] Energía de unión (kcal mol-1) de los OR

[0173] Ligando

[0174] 2 10 17 20 22c 39

[0175] A-6,8 -6,31 -7,19 -7,25 -6,82 -6,32

[0177] B-6,8 -7,02 -7,2 -7,28 -6,85 -6,72

[0179] C-6,83 -6,68 -7,38 -7,19 -6,52 -6,66

[0181] D-6,84 -6,75 -7,26 -7,39 -6,81 -6,68

[0183] Con referencia a la Tabla 3, las OBP6 puede tener una fuerte afinidad de unión a los componentes de feromona sexual de áfido, tanto para los enantiómeros biológicamente activos como para los enantiómeros inactivos.Ejemplo 24: Expresión y purificación de OBP

[0184] Recetas de medios

[0185] Los medios para su uso en experimentos de biología molecular se prepararon como en la Tabla 5.

[0186] Tabla 5:Recetas de medios para agar LB, 2xYT y LB.

[0187] Medios Componentes (+ 1L H2O)

[0188] medio líquido LB 8 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl medios líquidos 2xYT 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl Agar LB 30 g de mezcla de agar LB (sin NaCl), 5 g de NaCl

[0190] El medio se esterilizó en autoclave a 120 °C, luego se enfrió antes de añadir un antibiótico apropiado a una concentración de trabajo (Tabla 6). El agar se mantuvo a 60 °C hasta que se vertió en placas y se dejó fraguar.

[0191] Tabla 6:Concentraciones de trabajo de antibióticos añadidos al medio.

[0192] Antibiótico Concentración de trabajo / µg ml-1

[0193] Ampicilina 100

[0194] Kanamicina 50

[0195] Transformación de células competentes de E. coli BL21(DE3) con plásmidos de OBP de A. pisumTodos los genes se clonaron previamente en un plásmido vectorial, pET45b o pET15b, que contenía un casete de resistencia a la ampicilina, o pNIC28-Bsa4, que contenía un casete de resistencia a la kanamicina. Cada plásmido contenía una etiqueta de hexa-histidina (His<6>) codificada en el extremoNde la proteína, para permitir la purificación por afinidad de níquel.

[0196] Para transformar las células, se añadieron 5 µl de plásmido a células deE. colicompetentes BL21(DE3) y se enfriaron a 0 °C. La mezcla se dejó reposar durante 30 minutos, después de lo cual se sometió a choque térmico a 42 °C durante 70 s y se enfrió a 0 °C durante 5 minutos más. Se añadió medio líquido LB (800 µl) a la muestra, seguido de incubación (250 rpm; 37 °C) durante 45 minutos. La muestra se centrifugó (4000 rpm) durante 2 minutos y el sedimento se resuspendió en medio LB (100 µl). La resuspensión se extendió sobre una placa de agar LB que contenía el antibiótico apropiado y se incubó (37 °C) durante 12 horas. Se preparó un molde de células clonales para PCR a partir del cultivo durante la noche diluyendo un raspado de una pequeña colonia individual en H<2>O (10 µl).

[0197] Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

[0198] Se preparó una mezcla para PCR combinando el molde celular (1 µl), cebadores directos e inversos apropiados (1 µl de cada uno), H<2>O (7 µl) y una mezcla de polimerasa Taq (10 µl) que contenía dNTP, polimerasa Taq y tampón de PCR (Tris-HCl 100 mM, KCl 500 mM, MgCl<2>15 mM, pH 8,3). Se calentó la mezcla a 94 °C durante 5 minutos, seguido de 25 ciclos de calentamiento a 94 °C durante 30 segundos, hasta 50 °C durante 30 segundos, entonces 72 °C. Finalmente, la mezcla se llevó a 72 °C durante 30 minutos y se almacenó a 4 °C. Se usó electroforesis en gel con un gel de agarosa al 1 % para comprobar el producto de PCR y determinar si la transformación fue satisfactoria.

[0199] Cultivo iniciador recombinante de E. coli BL21(DE3)

[0200] Se añadió un raspado de cultivo clonal o muestra madre de glicerol (500 µl) a medio líquido 2xYT (10 ml) y se incubó durante la noche (37 °C; 250 rpm) para generar un cultivo iniciador deE. coliBL21(DE3).

[0201] Prueba de expresión de proteína recombinante de E. coli BL21(DE3)

[0202] Se añadió cultivo iniciador recombinante de células deE. coliBL21(DE3) (500 µl) a medio líquido 2xYT que contenía el antibiótico apropiado (10 ml) y se incubó (37 °C; 250 rpm) hasta que los valores de DO<600>alcanzaron 0,5-0,6. Se añadió isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; 10 µl; 1M) para inducir la expresión, y la mezcla se incubó durante 3-4 horas adicionales (37 °C; 250 rpm).

[0203] Se retiró una muestra del cultivo (2 ml) y se centrifugó (12000 rpm; TA) durante 2 min, y el sedimento celular se resuspendió en tampón de carga de SDS-PAGE (600 µl). Después, las muestras se desnaturalizaron a 95 °C durante 10 minutos, antes de cargarlas en un gel de SDS-PAGE.

[0204] Expresión y replegamiento a gran escala de OBP

[0205] Se inoculó medio líquido 2xYT (600 ml) con cultivo iniciador (3 ml) y se incubó (37 °C, 250 rpm) hasta que se alcanzó una DO<600>de 0,7-0,8. Se añadió IPTG (300 µl; 1 M) para inducir la expresión y la mezcla se incubó durante 3-4 horas adicionales (37 °C, 250 rpm). Las células se recolectaron mediante centrifugación durante 15 minutos (3500 rpm).

[0206] El sedimento celular se resuspendió en tampón TBS enfriado con hielo (10 ml; Tris 25 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0) y se incubó en hielo durante 10 minutos. La mezcla se sonicó durante 4 minutos en hielo, luego se centrifugó durante 30 minutos (35000 rpm, 4 °C). El sedimento se resuspendió en TBS Triton X-100 al 0,2 % (10 ml). Se repitieron las etapas de sonicación y centrifugación, y el sedimento se resuspendió en urea 8 M (1,5 ml) y 1,4-ditiotreitol 10 mM en Tris 100 mM (1,5 ml; pH 8). La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se diluyó rápidamente con 27 ml de TBS+5: GSH:GSSG 0,5 mM. La mezcla diluida se incubó durante la noche a TA.

[0207] La mezcla durante la noche se centrifugó durante 10 minutos (3500 rpm) y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 µm.

[0208] Purificación de OBP

[0209] Las OBP se purificaron usando columnas Histrap<®>, preacondicionadas con tampón de imidazol 25 mM. El filtrado de la etapa de replegamiento (Capítulo 3; 3.2.5) se pasó a través de la columna, dejando la proteína marcada con histidina unida al níquel. Se usó un tampón de imidazol (500 mM) para desplazar la proteína y las fracciones se recogieron y analizaron usando SDS-PAGE.

[0210] Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE)

[0211] El gel de resolución (1,0 mm de ancho; 5 ml) se preparó como en la Tabla 7. Se añadió aproximadamente 1,5 ml de 2-isopropanol para eliminar las burbujas y el gel se dejó fraguar. Después de 20 minutos, se retiró el isopropanol y se añadió el gel de apilamiento. Se usó un peine para formar pocillos antes de dejar que el gel se endureciera durante 20 minutos más.

[0212] Tabla 7:Composición de geles de resolución y apilamiento para SDS-PAGE.

[0213] Volumen / µl

[0214] Gel resolutorio (15 %; 5 ml) Gel apilable (3 %; 2 ml)

[0215] H<2>O 1770 1185

[0216] 40 % de acril 1875 150

[0217] Tampón Tris 1,5

1250

0

[0218] Ta

[0220] pers

[0222]

[0224] (*añadido en último lugar para catalizar la polimerización)

[0226] Las muestras para el gel (20 µl) se prepararon combinando muestras de proteína (10 µl) con tampón de muestra (10 µl; preparado como en la Tabla 8). Las muestras se procesaron junto con un marcador apropiado (11-245 kDa). El gel se hizo funcionar a 200 V durante 90-120 minutos y se añadió tinción azul GelCode<™>(Thermo-Fisher Scientific) durante aproximadamente 1 hora para resolver las bandas de proteína.

[0227] Tabla 8: Composición del tampón de muestra de proteína SDS-PAGE

[0228] Reactivo Concentración

[0229] Tris 80 mM

[0231] SDS 2,0 %

[0232] Glicerol 10 %

[0233] Azul de bromofenol 0,0006 %

[0235] TDT 0,1 M

[0236] Escisión de la etiqueta de histidina de la proteína purificada

[0237] Para eliminar la etiqueta de hexa-histidina de las proteínas purificadas, se usó una enzima de escisión apropiada (Tabla 9). La selección de la enzima dependió del sitio de escisión codificado en el plásmido vector original. La proteína se intercambió con tampón en CaCl<2>en tampón TBS (2 mM CaCl<2>, 25 mM Tris; 500 mM NaCl) y se añadió enzima. La escisión se controló observando un cambio en la masa usando espectrometría de masas. Después de la finalización, el exceso de proteína marcada se eliminó pasando la mezcla a través de una columna Histrap<®>y recogiendo el eluyente.

[0238] Tabla 9:Plásmidos vectoriales utilizados para la transformación y sus sitios de escisión con etiqueta His y enzimas.

[0240] Plásmido Secuencia de etiqueta His FASTA Sitio de escisión Enzima de escisiónpET45b<MAHHHHHHVG TGSNDDDDKS PDP (SEQ ID>DDDDK/S (SEQ ID

[0241] <NO: 30) NO: 33)>Enterocinasa pNIC28- MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQS (SEQ ID NO: ENLYFQ/S (SEQ ID TEV (virus del Bsa4 31) NO: 34) grabado del tabaco) pET 15b<MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH (SEQ ID NO:>GLVPR/GS (SEQ ID

[0242] <32) NO: 35)>Trombina

[0243] Extracción, purificación y secuenciación de plásmidos

[0244] Los plásmidos se extrajeron utilizando un kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo-Fisher Scientific) y se secuenciaron en los laboratorios del Queen's Medical Center, la Universidad de Nottingham o Eurofins (Reino Unido).

[0245] Intercambio y concentración de tampones de proteínas

[0246] Todas las proteínas se intercambiaron con tampón y se desalaron usando una columna de desalación PD-10 y se concentraron usando un Vivaspin 20 (MWCO de 10 kDa).

[0247] Mutagénesis dirigida al sitio

[0248] Se realizó mutagénesis dirigida al sitio (SDM) de OBP6-His<6>para insertar una etiqueta de trombina. Se usó un kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs) para realizar la mutagénesis. Los cebadores (Tabla 10) se obtuvieron de Sigma-Aldrich.

[0249] Tabla 10:Cebadores directos e inversos para la mutagénesis dirigida al sitio (inserción en el sitio de escisión de trombina) de OBP6-His<6>

[0250] Cebadores para la inserción del sitio de escisión de trombina

[0251] Directo cgcggcagcGCTGGGTACGATAGAACATG

[0252] Inverso cggcaccagCGGATCCGGACTCTTGTC

[0254] Las muestras para PCR se prepararon combinando plásmido que contenía el gen de interés (1 µl), cebadores directos e inversos (1 µl de cada uno), H<2>O (9 µl) y mezcla maestra de inicio en caliente Q5 (12,5 µl). La mezcla se calentó a 98 °C durante 30 segundos, seguido de 25 ciclos de calentamiento a 98 °C durante 10 segundos, a 64 °C durante 20 segundos, luego a 72 °C durante 2 minutos. Finalmente, la mezcla se llevó a 72 °C durante 2 minutos y se almacenó a 4 °C.

[0255] El producto de PCR (1 µl) se mezcló con tampón de reacción KLD (5 µl), mezcla de enzimas KLD (1 µl) y H<2>O (3 µl) y se dejó a TA durante 5 minutos. Finalmente, la mezcla (5 µl) se usó para transformar células deE. colicompetentes NEB 5-alfa como se describe en "Transformation of E. coli BL21(DE3) Competent Cells with A. pisum OBP Plasmids". Los resultados se validaron mediante secuencias como se describe en "Plasmid Extraction, Purification and Sequencing".

[0256] Cromatografía de líquidos de proteínas rápidas

[0257] Para purificar las proteínas, se realizó una filtración en gelmediantecromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) usando una FPLC Akta. La FPLC se ajustó con una columna de exclusión por tamaño Superdex, y las muestras se intercambiaron en un tampón de TBS (Tris 15 mM, NaCl 250 mM; Tabla 11). Se recogieron muestras de proteínas usando un automuestreador y posteriormente se concentraron como se describe en "Protein Buffer Exchange and Concentration".

[0258] Tabla 11:Ejecutar las condiciones para la cromatografía líquida de proteínas rápidas de exclusión por tamaño (FPLC).

[0259] Etapa Tiempo Caudal Tampones

[0260] Lavado 20 min 3,0 ml min<-1>1:120 % EtOH:H<2>O Lavado 20 min 3,0 ml min<-1>1:1 TBS:H<2>O

[0261] Equilibrado 40 min 1,5 ml min<-1>TBS

[0262] Inyección de la muestra

[0263] Ejecución 60-180 min 1,5 ml min<-1>TBS

[0264] Lavado y almacenamiento 40 min 3,0 ml min<-1>EtOH al 20 %

[0265] Análisis de espectrometría de masas

[0266] Para confirmar la escisión eficaz de la etiqueta His y la determinación de la estructura, se realizó una espectrometría de masas desnaturalizada de las proteínas recombinantes usando un espectrómetro Waters QTof2. Las muestras se prepararon usando un ZipTip<®>antes de inyectarse en el espectrómetro de masas.Espectrometría de masas general

[0267] Toda la espectrometría de masas se realizó utilizando ionización por electropulverización y se realizó en el QTof2 o QTof3 en condiciones desnaturalizantes (80 % CH<3>CN, 0,1 % ácido fórmico) y los ajustes se detallan en la Tabla 12, a menos que se indique lo contrario.

[0268] Se analizaron los espectros de masas usando el software MassLynx 3.0.

[0269] Tabla 12:Ajustes de espectrometría de masas desnaturalizada para el QTof 3.0

[0271] AjusteValor

[0272] Voltaje del capilar 2,80 kV

[0273] Voltaje del cono 35 V

[0274] Temperatura de desolvatación 80 °C

[0275] Temperatura de la fuente 50 °C

[0276] Lente de RF 1,0

[0277] Preparación de muestra usando ZipTip®

[0278] Las muestras para espectrometría de masas se prepararon mediante ZipTip<®>. El ZipTip<®>se acondicionó lavando con amortiguador de elución (80 % CH<3>CN, 0,1 % ácido fórmico; 5x10 µl), seguido de equilibrado con tampón de lavado (5 % MeOH, 0,1 % ácido trifluoroacético; 7x10 µl). Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) a la muestra a una concentración de 0,1 %, que se adsorbió en la columna (20 aspiraciones). Luego, la muestra se lavó con tampón de lavado (20x10 µl) y se eluyó en tampón de elución (10 µl, 20 aspiraciones).

[0279] Ejemplo 25: Ensayos basados en fluorescencia de proteínas de unión a odorantes de A. pisum e interacciones con ligandos

[0280] Medidas de fluorescencia

[0281] Todas las mediciones de fluorescencia se realizaron usando un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS50B, usando una cubeta de cuarzo de 2 ml y los ajustes descritos a continuación en la Tabla 13, a menos que se indique lo contrario. Los espectros se registraron utilizando el software FL WinLab.

[0282] Tabla 13:Ajustes para mediciones de fluorescencia utilizando el espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS50B

[0283] Ajuste Fluorescencia intrínseca (triptófano) Fluorescencia de la sonda (1-NPN)Excitación 280 nm 337 nm

[0284] Longitud de onda

[0285] Emisión 290 - 400 nm 350 - 600 nm Longitudes de

[0286] onda

[0287] Hendidura de

[0288] <excitación>5,0 nm 5,0 nm

[0289] Hendidura de

[0290] <emisión>5,0 nm 5,0 nm

[0291] Curvas de unión y saturación de ligandos

[0292] La saturación de OBP con sonda fluorescente y 1-NPN (Sigma-Aldrich) se midió inicialmente titulando una muestra de proteína 2 µM (2 ml en Tris-HCl 25 mM) con alícuotas de ligando 1 mM (Sigma-Aldrich) en metanol a concentraciones finales de 1-16 µM. Se registró la intensidad de fluorescencia a 330 nm.

[0293] Se midió la unión competitiva de ligandos observando la fluorescencia intrínseca de triptófano. Las titulaciones se realizaron con alícuotas de ligando 1 mM en metanol hasta concentraciones finales de 1-20 µM, ya sea después de la adición de sonda fluorescente hasta una concentración final de 1 µM o en ausencia de sonda fluorescente.

[0294] Tabla 14:Los valores deKDcalculados para OBP6 y diversos ligandos de diferentes ensayos de unión.

[0295] OBP6 OBP9 Ligando Ensayo 1-NPN KD Ensayo sin sonda fluorescente Ensayo 1-NPN KD / µM KD/ µM / µM(1R,4aS,7S,7aR)-<nepetalactol>2,62 ± 0,63 12,74 ± 2,31 5,74 ± 1,71 (4aS,7S,7aR)-nepetalactona 1,30 ± 0,60 1,90 ± 0,35 6,49 ± 1,58 (1S,4aR,7R,7aS)-<nepetalactol>2,65 ± 0,80 8,46 ± 1,62 6,29 ± 1,99 (4aR,7R,7aS)-nepetalactona 4,37 ± 0,81 12,01 ± 4,24 9,68 ± 4,57 (E)-β-farneseno 10,12 ± 2,88 34,47 ± 10,85 8,32 ± 2,67 (R/S)-linalol 8,95 ± 3,71 NA NA

[0296] (NA = No disponible o no medido)

[0297] Análisis de datos de fluorescencia

[0298] Para generar valores deKD, la intensidad de fluorescencia relativa se representó frente a la concentración de ligando como una curva de unión. Los valores deKDse generaron en GraphPad Prism 7 utilizando una regresión no lineal y la ecuación incorporada:

[0299]

[0301] Cada valorKDcalculado tenía un error asociado de la regresión no lineal. Para tener en cuenta estos errores en el análisis estadístico, los valores se ponderaron en proporción directa a su error: cuanto mayor sea el error, menor será la ponderación de los valores. El factor de “ponderación” se calculó utilizando la siguiente ecuación:

[0304]

[0306] Se realizó un análisis estadístico de los datos de fluorescencia usando R 3.4.4. Se realizó un ANOVA ponderado unidireccional entre ligandos para cada proteína, y se realizó un ANOVA ponderado bidireccional para investigar las interacciones entre proteínas y ligandos. Se usó una prueba de Tukey para el análisis post-hoc (Tabla 15).Tabla 15:Resultados de análisis estadístico para un análisis ponderado de varianza (ANOVA) de la diferencia de afinidades de unión (KD) entre diferentes ligandos y OBP6.

[0307] Ensayo Interacción valor de Ligando A Ligando B p(1R,4aS,7S,7aR)-Nepetalactol 0,0021 1-NPN (E)-β-Farneseno (4aS,7S,7aR)-Nepetalactona 0,00017 (1S,4aR,7R,7aS)-Nepetalactol 0,010

[0308] (4aR,7R,7aS)-Nepetalactona 0,015

[0309] (1R,4aS,7S,7aR)-Nepetalactol 0,023

[0310] (±)-Linalool

[0311] (4aS,7S,7aR)-Nepetalactona 0,0014

[0312] La interacción entre (4aS,7S,7aR)-nepetalactona y (4aR,7R,7aS)-nepetalactona no dio una diferencia significativa, con un valor depde 0,11 en el ensayo de 1-NPN y un valor depde 0,055 en el ensayo sin sonda fluorescente. Posteriormente se realizó una prueba t ponderada, dando una diferencia significativa con un valorpde 2,27 x 10<-4>.

[0313] Ejemplo 26: Experimentos de diferencia de transferencia de saturación de RMN

[0314] Espectroscopia general de RMN

[0315] Las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de resonancia magnética nuclear AVANCE BRUKER DRX-500 MHz con una sonda BBO BB-1H de 5 mm y se ajustaron a 500 MHz para espectros<1>H y 125 MHz para espectros<13>C. El análisis de los datos de Bruker se realizó utilizando Topspin 4.0.7, y el análisis de los datos de Varien se realizó con CCPNMR V2 y NMRPipe. Se utilizaron tubos de RMN estándar con un volumen de muestra de 600 µl a menos que se indique lo contrario. El cloroformo deuterado (CDCl<3>), el metanol (CD<3>OD) y el dimetilsulfóxido (d-DMSO) se almacenaron en tamices moleculares de 4 Å y se utilizaron como disolventes de muestra y estándares internos. Para la asignación de moléculas pequeñas, se realizaron experimentos adicionales de espectroscopía de RMN-2D.

[0316] Preparación de la muestra estándar

[0317] Las muestras de proteína para RMN se desalaron y se intercambiaron con tampón en 9:1 H<2>O:D<2>O a menos que se indique lo contrario (como en "Intercambio y concentración de tampón de proteína"). Las muestras de ligando no fueron solubles en D<2>O y las muestras se prepararon en d-DMSO. Esto dio como resultado un disolvente de RMN final que incluye H<2>O, D<2>O yd-DMSO.

[0318] RMN de diferencia de transferencia de saturación (STD)

[0319] Se preparó un ensayo de prueba inicial que contenía proteína de albúmina de suero bovino (BSA) con triptófano y sacarosa para RMN de STD. Las muestras se ejecutaron para 192 escaneos y se generaron los espectros de diferencia de transferencia de saturación (STD).

[0320] Tabla 18:Composición de los ensayos finales de STD, tanto el ensayo de prueba de BSA como el ensayo de OBP6.

[0321] Componente Ensayo de prueba Ensayo de OBP6

[0322] Proteína (sin etiquetar) BSA; 100 µM OBP6; 30 uM

[0323] Compuesto presunto de unión Triptófano; 10 mM (4aS,7S,7aR)-nepetalactona); 3 mM Compuesto presunto no unido Sacarosa; 10 mM No incluido

[0325] Los valores absolutos de STD se calcularon observando el cambio en las proporciones entre el espectro fuera de resonancia y el espectro final de STD usando la siguiente ecuación:

[0328]

[0330] en donde el término (I<0>- I<STD>) representa la relación de la intensidad de pico en el espectro STD, e I<0>la relación de la intensidad en el espectro fuera de resonancia. Se calculó un segundo valor que representaba el cambio proporcional utilizando la siguiente ecuación:

[0333]

[0336] Finalmente, el mapeo de epítopos se realizó calculando la integración de picos relativa en el espectro de STD frente al espectro fuera de resonancia de un pico como un porcentaje.

[0337] Ejemplos de síntesis 1-4 (referencia)

[0338] Se pueden sintetizar nepetalactona y derivados usando reacciones de Diels-Alder (demanda inversa de electrones) como se describe en Dawson et al. (Bioorganic Med. Chem.1996, 4 (3), 351-361) y Schreiber et al. (J. Am. Chem. Soc.1986, 108, 8274-8277). Algunas modificaciones adicionales se ilustran a continuación.

[0339] Ejemplo de síntesis 1 (referencia): (4aS,7S,7aR)-4,7-dimetil-2,4a,5,6,7,7a-hexahidro-1H-ciclopenta[c]piridin-1-ona (Compuesto 3)

[0342]

[0345] Se burbujeó amoníaco gaseoso suavemente a través de una disolución de nepetalactona (1,02 g, 6,12 mmol) en DCM (70 ml) durante 1 hora. A continuación, el matraz de reacción se cerró herméticamente y se agitó durante otras 16 horas. La mezcla de reacción bruta se concentró al vacío y se purificó mediante destilación (Kugelrohr, 46 mbar, 162 °C) para proporcionar el producto. δ<H>(500MHz, CDCl<3>) 6,73 (1 H, s), 5,62 - 5.70 (1 H, m), 2,71 (1 H, q, J = 8,4 Hz), 2,27 - 2,37 (2 H, m), 1,98 - 2,08 (1 H, m), 1,78 - 1,87 (2 H, m), 1,64 (3 H, s), 1,45 - 1,54 (1 H, m), 1,21 (3 H, d, J = 6,6 Hz).

[0346] Ejemplo de síntesis 2 (referencia): (4aS,7S,7aR)-4,7-dimetil-5,6,7,7a-tetrahidrociclopenta[c]tiopiran-1(4aH)-ona (Compuesto 23)

[0349]

[0352] En orden, se añadieron triflato de indio (0,17g, 0,30 mmol), tolueno (7,5 ml), nepetalactona (1,00 g, 6,02 mmol), azufre (0,21 g, 6,62 mmol) y fenil silano (0,43 g, 4,01 mmol), en N<2>, a un matraz con tapa de rosca, se selló y se calentó a 120 °C durante 24 horas. La mezcla de reacción se enfrió y la presión se liberó cuidadosamente. La mezcla de reacción se filtró a través de celite antes de purificarse en gel de sílice (EtOAc al 2 % en hexanos) para proporcionar el producto (0,12 g, 12 % de rendimiento) como un aceite amarillo/marrón. δ<H>(500 MHz, CDCl<3>) 5,72 (1H, s), 2,84 - 2,94 (1 H, m), 2,55 (1 H, hept, J = 7,0 Hz), 2,38 (1 H, t, J = 7,5 Hz), 1,89 - 2,00 (2 H, m), 1,87 (3 H, s), 1,69 - 1,79 (1 H, m), 1,17 - 1,32 (1 H, m), 1,01 (3 H, d, J = 6,8 Hz).

[0353] Ejemplo de síntesis 3 (referencia): (4aS,7S,7aR)-4,7-dimetil-5,6,7,7a-tetrahidrociclopenta[c]piran-1(4aH)-tiona - nepetationolactona (Compuesto 24)

[0356]

[0359] A una disolución de nepetalactona (2,00 g, 12,03 mmol) en acetonitrilo (30 ml) se le añadió pentasulfuro de fósforo (2,68 g, 6,02 mmol) seguido de hexametildisiloxano (4,92 g, 30,30 mmol) y se calentó a 82 °C durante 16 horas. El disolvente se retiró al vacío y el producto en bruto se purificó en gel de sílice (EtOAc al 2 % en éter de petróleo) para proporcionar el producto (0,42 g, 37 % de rendimiento) como un aceite amarillo. δ<H>(500 MHz, CDCl<3>) 6,37 (1 H, s), 2,95 (1 H, t, J = 8,5 Hz), 2,70 - 2,77 (1 H, m), 2,28 (1 H, hept, J = 7,4 Hz), 1,81 - 1,92 (2H, m), 1,72 - 1,81 (1 H, m), 1,62 (3 H, s), 1,28 - 1,33 (1 H, m), 1,19 (3 H, d, J = 6,7 Hz).

[0360] Ejemplo de síntesis 4 (referencia): (4aS,7S,7aR)-4,7-dimetil-1,4a,5,6,7,7a-hexahidrociclopenta[c]piran-1-tiol (Compuesto 25)

[0363]

[0366] A una disolución de nepetationolactona (Compuesto 24) (0,35 g, 1,90 mmol) en alcohol isopropílico (45 ml) se le añadió borohidruro de sodio (0,10 g, 2,66 mmol) y la mezcla se agitó durante 2 horas. La reacción se inactivó con 12 ml de HCl 2 M y se añadió salmuera saturada. La fase acuosa se extrajo con éter dietílico. La fase orgánica combinada se secó (MgSO4<)>y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó en gel de sílice (Et<2>O al 15 % en éter de petróleo) para proporcionar el producto (0,21 g, 60 % de rendimiento) como un aceite amarillo pálido. δ<H>(500 MHz, CDCl<3>) 6,00 (1 H, s), 4,23 (1 H, d, J = 4,3 Hz), 2,75 (1 H, q, J = 7,7 Hz), 1,80 - 2,32 (4 H, m), 1,43 -1,57 (1 H, m), 1,79 (3 H, s), 1,29 - 1,38 (1 H, m), 0,91 (3 H, d, J = 6,7 Hz).

[0367] Ejemplo de Fabricación 1: Biosensor que comprende ApisOBP6

[0368] Se funcionalizó una superficie de detección (un resonador de onda acústica a granel de película - FBAR - fabricado por Sorex Sensors) mediante el método APTES-glutaraldehído. La superficie de detección a funcionalizar se expuso a una corriente de ozono durante 15 minutos, antes de dejarla reposar en aire durante 30 minutos y lavarla con agua destilada. A la superficie de detección recién oxidada, se le añadió una disolución de APTES (2 % en etanol) y se aseguró de que toda la superficie de detección se cubriera y se dejara reposar durante 10 minutos. El exceso de reactivo se retiró con etanol limpio, antes de secarse en una corriente de nitrógeno y curarse en un horno (110 °C) durante 60 minutos. Después de enfriar a TA, se añadió una disolución al 1 % de glutaraldehído a la superficie durante 60 min adicionales. Se añadió una disolución de la OBP deseada (ApisOBP6, 1 µM) a la superficie durante 1 hora. La superficie de detección funcionalizada se lavó con agua destilada y se almacenó hasta que se requirió.

[0369] Si bien la divulgación anterior proporciona una divulgación general de la materia abarcada dentro del alcance de la presente invención, incluyendo métodos, así como el mejor modo de los mismos, de hacer y usar esta invención, los siguientes ejemplos se proporcionan para permitir además a los expertos en la técnica poner en práctica esta invención y proporcionar una descripción escrita completa de la misma. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que los detalles de estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la invención, cuyo alcance debe entenderse a partir de las reivindicaciones y equivalentes de las mismas adjuntas a esta divulgación. Varios aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación.

[0370] Cuando se usa en el presente documento “y/o”, debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, tal como si cada uno se estableciera individualmente en el presente documento.

[0371] A menos que el contexto dicte lo contrario, las descripciones y definiciones de las características expuestas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención y se aplican por igual a todos los aspectos y realizaciones que se describen.

[0372] Lista de secuencias

[0373] SEQ ID NO: 1(OBP1 deAcyrthosiphon pisum)

[0376]

[0378] SEQ ID NO: 2(OBP2 deAcyrthosiphon pisum)

[0381]

[0383] SEQ ID NO: 3(OBP3 deAcyrthosiphon pisum)

[0386]

[0388] SEQ ID NO: 4(OBP4 deAcyrthosiphon pisum)

[0391]

[0393] SEQ ID NO: 5(OBP5 deAcyrthosiphon pisum)

[0396]

[0398] SEQ ID NO: 6(OBP6 deAcyrthosiphon pisum)

[0401]

[0403] SEQ ID NO: 7(OBP7 deAcyrthosiphon pisum)

[0406]

[0408] SEQ ID NO: 8(OBP8 deAcyrthosiphon pisum)

[0409]

[0411] SEQ ID NO: 9(OBP9 deAcyrthosiphon pisum)

[0414]

[0416] SEQ ID NO: 10(OBP10 deAcyrthosiphon pisum)

[0419]

[0421] SEQ ID NO: 11(OBP 11 deAcyrthosiphon pisum)

[0424]

[0426] SEQ ID NO: 12(ORCO deAcyrthosiphon pisum)

[0429]

[0431] SEQ ID NO: 13(OR2 deAcyrthosiphon pisum)

[0434]

[0436] SEQ ID NO: 14(OR4 deAcyrthosiphon pisum)

[0439]

[0440] SEQ ID NO: 15(OR5 deAcyrthosiphon pisum)

[0443]

[0445] SEQ ID NO: 16(OR10 deAcyrthosiphon pisum)

[0448]

[0450] SEQ ID NO: 17(OR17 deAcyrthosiphon pisum)

[0453]

[0455] SEQ ID NO: 18(OR20 deAcyrthosiphon pisum)

[0458]

[0460] SEQ ID NO: 19(OR22c deAcyrthosiphon pisum)

[0463]

[0465] SEQ ID NO: 20(OR23 deAcyrthosiphon pisum)

[0466]

[0468] SEQ ID NO: 21(OR25 deAcyrthosiphon pisum)

[0471]

[0473] SEQ ID NO: 22(OR31 deAcyrthosiphon pisum)

[0476]

[0478] SEQ ID NO: 23(OR37 deAcyrthosiphon pisum)

[0481]

[0483] SEQ ID NO: 24(OR38 deAcyrthosiphon pisum)

[0486]

[0488] SEQ ID NO: 25(OR39 deAcyrthosiphon pisum)

[0489]

[0491] SEQ ID NO: 26(OR42 deAcyrthosiphon pisum)

[0494]

[0496] SEQ ID NO: 27(OR43 deAcyrthosiphon pisum)

[0499]

[0501] SEQ ID NO: 28(Cebador directo para mutagénesis dirigida al sitio (inserción en el sitio de escisión de trombina) de OBP6-His6)

[0502] cgcggcagcGCTGGGTACGATAGAACATG

[0503] SEQ ID NO: 29(Cebador inverso para mutagénesis dirigida al sitio (inserción en el sitio de escisión de trombina) de OBP6-His6)

[0504] cggcaccagCGGATCCGGACTCTTGTC

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

1. Biosensor para detectar un analito en una muestra, el biosensor comprende:

una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO: 6, o una variante de la misma, en donde la variante tiene al menos 80 % de identidad de secuencia general con SEQ ID NO: 6; y

un generador de señales, en donde el generador de señales está configurado para emitir una señal cuando el analito está unido a la proteína.

2. Biosensores de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aparato comprende además:

una trayectoria de flujo para mover la muestra;

un sustrato; y

una capa que contiene proteína inmovilizada en el sustrato y en contacto con la trayectoria de flujo, en donde la capa que contiene proteína comprende la proteína.

3. Uso de un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el biosensor se usa para identificar ligandos olfativos; o en donde el biosensor se usa en cribado de alto rendimiento; o en donde el biosensor se usa para detectar poblaciones de campo de áfidos.

4. Métodoin vitropara detectar un analito en una muestra que comprende:

a. proporcionar un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2;

b. poner en contacto el biosensor con la muestra; y

c. comparar una magnitud de la señal generada por el biosensor cuando la muestra está presente con una magnitud de referencia de la señal generada por el biosensor cuando la muestra está ausente.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el biosensor se usa para identificar ligandos olfativos;

o en donde el biosensor se usa en cribado de alto rendimiento; o en donde el biosensor se usa para detectar poblaciones de campo de áfidos.