ES3051634T3 - Removal of excess oligonucleotides from a reaction mixture - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos y composiciones para la eliminación de oligonucleótidos no deseados o en exceso de mezclas de reacción utilizando un ácido nucleico de doble horquilla que comprende una sola cadena de ácido nucleico que tiene: i. una primera horquilla en el extremo 5'; ii. una segunda horquilla en el extremo 3'; y iii. una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en donde la región monocatenaria comprende una secuencia capaz de hibridar con el oligonucleótido que se va a eliminar, por ejemplo, cebadores en exceso, subcódigos o moléculas adaptadoras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Retirada de oligonucleótidos en exceso de una mezcla de reacción

[0003] Campo de la invención

[0004] La invención se refiere al campo de los ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere al campo de las reaccionesin vitroque incluyen ácidos nucleicos.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Las reacciones que utilizan hebras cortas de ácido nucleico ("oligonucleótidos") a menudo finalizan con oligonucleótidos en exceso que quedan en la mezcla de reacción. Estos oligonucleótidos pueden impedir los procedimientos posteriores al interactuar entre sí o con ácidos nucleicos de muestra no diana. Dichas interacciones agotan los reactivos esenciales e impiden las reacciones deseadas.

[0007] Los oligonucleótidos en exceso incluyen cebadores, sondas y adaptadores. Por ejemplo, las reacciones de amplificación (incluyendo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y reacción en cadena de la ligasa (LCR)) utilizan cebadores y sondas de oligonucleótidos. Los cebadores y sondas en exceso no incorporados en los productos de amplificación se necesitan retirar antes del procesamiento posterior.

[0008] La secuenciación masiva en paralelo de moléculas individuales implica formar colecciones de ácidos nucleicos fijando adaptadores oligonucleotídicos con sitios de unión de cebado universal y otros rasgos característicos necesarios a los extremos de cada ácido nucleico en la colección. Después de que se forma la colección, los adaptadores en exceso no incorporados en los ácidos nucleicos de la colección se necesitan retirar.

[0009] En el campo del análisis de células individuales, la patente de EE. UU. 10.144.950 describe un novedoso procedimiento de análisis de células individuales llamado código de barras cuántico (QBC), donde cada célula se marca con un código de barras combinatorio exclusivo. El código de barras combinatorio se ensambla a partir de oligonucleótidos de subcódigo. Al final del procedimiento de ensamblaje de códigos, los subcódigos en exceso se necesitan retirar.

[0010] El documento CN 104342486 A se refiere a un procedimiento de detección de miARN que incluye la hibridación en una muestra que contiene miARN y una sonda de hibridación a ácido nucleico de doble horquilla para formar un primer compuesto; seguido de digestión con restricción y detección del miARN por medio de amplificación por PCR.

[0011] El documento US 2019/0194748 A1 se refiere a procedimientos y sondas para la detección de fragmentos diana de ácido nucleico. Se contemplan una serie de posibles diseños de la sonda. Por ejemplo, se pueden proporcionar los extremos 5' y 3' para su ligación al fragmento diana por secuencias de cabeza y cola en dos oligonucleótidos de cadena principal separados, o por secuencias de cabeza y cola en extremos respectivos de un oligonucleótido de cadena principal individual que forma un bucle para situar el fragmento diana entre los extremos 5' y 3'.

[0012] El documento WO 2006/044994 A2 se refiere a procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos y detección de productos amplificados y, entre otros, describe algunos procedimientos para evitar un cebado erróneo con cebadores "sobrantes".

[0013] El documento ES 2 421 459 A1 describe la retirada de cebadores en exceso antes de la amplificación y/o secuenciación a través de una etapa de captura por hibridación (es decir, una etapa de purificación). Para efectuar la captura de estos cebadores en exceso no deseados y prevenir su interferencia en cualquier etapa de detección posterior, el documento ES 2 421 459 A1 describe un procedimiento de purificación que utiliza cebadores directos e inversos, incluyendo cada uno una "secuencia de pesca".

[0014] El documento EP 2308997 A2 se dirige a un procedimiento de captura de híbridos específica de diana, y describe que se usan "sondas bloqueadoras", que incluyen oligonucleótidos complementarios a las sondas de secuencia de captura, para eliminar la[s] sonda[s] de secuencia de captura.

[0015] Típicamente, la retirada implica un procedimiento de múltiples etapas que incluye precipitación, centrifugación o captura de microesferas. Estas etapas consumen tiempo y reactivos y provocan la pérdida de ácidos nucleicos diana que se separan de los oligonucleótidos en exceso. Por lo tanto, existe una necesidad de obtener un procedimiento práctico y económico de retirada de oligonucleótidos en exceso de las mezclas de reacción.Sumario de la invención

[0016] La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas, y se refiere a un procedimiento de retirada de oligonucleótidos en exceso de una mezcla de reacción capturándolos y secuestrándolos con un ácido nucleico de doble horquilla como se define por las reivindicaciones. Los oligonucleótidos en exceso están ligados a la estructura de doble horquilla formando una hebra de ácido nucleico cerrada topológicamente circular que no interfiere en aplicaciones posteriores.

[0018] En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de retirada de oligonucleótidos no deseados de una mezcla de reacción, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que comprende una hebra de ácido nucleico individual que tiene: una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria comprende una secuencia que se puede hibridar al oligonucleótido que se va a retirar; hibridar el oligonucleótido que se va a retirar al ácido nucleico de doble horquilla; ligar el oligonucleótido que se va a retirar a los extremos del ácido nucleico de doble horquilla para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, el oligonucleótido no deseado de la mezcla de reacción. El procedimiento puede comprender además poner en contacto la mezcla de reacción con una ligasa. En otros modos de realización, la mezcla de reacción ya comprende una ligasa. En algunos modos de realización, la doble horquilla contiene un grupo 5'-fosfato.

[0020] En algunos modos de realización, la región monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla comprende dos regiones de complementariedad con el oligonucleótido que se va a retirar que flanquean una región central individual. La región central puede ser un espaciador no nucleotídico o una región que comprenda nucleótidos de inosina. En algunos modos de realización, el oligonucleótido que se va a retirar comprende una pluralidad de oligonucleótidos que tienen dos regiones constantes que flanquean una región de código de barras individual que varía entre la pluralidad de oligonucleótidos.

[0022] En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de detección de una pluralidad de dianas en una pluralidad de células en una mezcla de reacción, comprendiendo el procedimiento: unir a las dianas en una pluralidad de células una pluralidad de agentes de unión exclusivos que sean cada uno específicos para una de las dianas; añadir múltiples oligonucleótidos de subcódigo a cada uno de los agentes unidos en la pluralidad de células de una manera ordenada durante tandas sucesivas de síntesis con división-agrupación en el que los oligonucleótidos de subcódigo en cada tanda se hibridan de forma contigua al oligonucleótido de subcódigo de una tanda previa por medio de una región de hibridación, y enlazar de forma covalente los oligonucleótidos de subcódigo hibridados de forma contigua entre sí para crear, en cada célula, un código de nucleótido originario de célula exclusivo; poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que comprende una hebra de ácido nucleico individual que tiene una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3' que se puede hibridar a los oligonucleótidos de subcódigo, y ligar los oligonucleótidos de subcódigo en exceso al ácido nucleico de doble horquilla correspondiente para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, los oligonucleótidos de subcódigo en exceso. El procedimiento en el presente documento puede comprender además poner en contacto la muestra con una polinucleótido cinasa. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos de subcódigo comprenden una región de código de barras flanqueada por dos regiones de hibridación y la región monocatenaria del ácido nucleico de doble horquilla comprende un espaciador de igual longitud a la región de código de barras flanqueada por dos secuencias que se pueden hibridar a las regiones de hibridación en los oligonucleótidos de subcódigo. El espaciador puede ser un conector de carbono o puede comprender nucleótidos que contengan inosina.

[0024] En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una solución de ácidos nucleicos diana amplificados libre de cebadores de amplificación en exceso, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una mezcla de reacción que contiene ácidos nucleicos diana con un cebador de amplificación directo y uno inverso y una ácido nucleico polimerasa termoestable en presencia de reactivos que soportan la síntesis de ácidos nucleicos; someter la mezcla de reacción a un perfil de termociclado adecuado para la hibridación y extensión de los cebadores directo e inverso; después de la completitud del perfil de termociclado, poner en contacto la mezcla de reacción con una ácido nucleico ligasa y un ácido nucleico de doble horquilla que consiste en una hebra de ácido nucleico individual que tiene: una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar al cebador directo o al cebador inverso; ligar los cebadores directo e inverso al ácido nucleico de doble horquilla correspondiente para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, los cebadores directo e inverso de la solución de ácidos nucleicos diana amplificados. El procedimiento puede comprender además poner en contacto la muestra con una polinucleótido cinasa.

[0026] En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una solución de ácidos nucleicos diana amplificados libre de sondas en exceso, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una mezcla de reacción que contiene ácidos nucleicos diana con una primera y segunda sonda que se pueden hibridar de forma contigua al ácido nucleico diana, y una ligasa termoestable en presencia de reactivos que soportan la ligación; someter la mezcla de reacción a un perfil de termociclado adecuado para la hibridación y ligación de las primera y segunda sondas entre sí; después de la completitud del perfil de termociclado, poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que consiste en una hebra de ácido nucleico individual que tiene: una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar a la primera sonda o a la segunda sonda; ligar las primera y segunda sondas al ácido nucleico de doble horquilla correspondiente para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, las primera y segunda sondas de la solución de ácidos nucleicos diana amplificados. El procedimiento puede comprender además poner en contacto la muestra con una polinucleótido cinasa.

[0027] En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de formación de una colección de ácidos nucleicos libre de moléculas de adaptador en exceso, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una mezcla de reacción que comprende ácidos nucleicos con moléculas de adaptador y una ligasa; ligar las moléculas de adaptador a los extremos de los ácidos nucleicos; poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que consiste en una hebra de ácido nucleico individual que tiene: una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar al adaptador; ligar el adaptador al ácido nucleico de doble horquilla para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, el adaptador de la solución de ácidos nucleicos diana amplificados. En algunos modos de realización, el adaptador consiste en dos oligonucleótidos que forman al menos una región bicatenaria. En algunos modos de realización, la mezcla de reacción se somete a una temperatura elevada suficiente para separar el adaptador en hebras individuales. En algunos modos de realización, el ácido nucleico de doble horquilla comprende una mezcla de dos ácidos nucleicos de doble horquilla, teniendo cada uno la región monocatenaria complementaria a una hebra del adaptador.

[0028] Breve descripción de los dibujos

[0029] La figura 1 es un diagrama de la estructura de doble horquilla y procedimiento de uso.

[0030] Descripción detallada de la invención

[0031] El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero nucleotídico y, a menos que se limite de otro modo, incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de manera similar (por ejemplo, hibridarse) a nucleótidos naturales.

[0032] Los términos "secuencia de nucleótidos" y "ácido nucleico" se usan de manera intercambiable. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o bien ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, ADN intergénico, locus (un locus) definidos a partir de análisis de enlaces, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN de interferencia corto (ARNic), ARN en horquilla corto (ARNhc), micro-ARN (miARN), ARN nucleolar pequeño, ribozimas, ADN complementario (ADNc), que es una representación de ADN de ARNm, normalmente, obtenido por retrotranscripción de ARN mensajero (ARNm) o por amplificación; moléculas de ADN producidas sintéticamente o por amplificación, ADN genómico, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos nucleotídicos. Si están presentes, se pueden conferir modificaciones a la estructura nucleotídica antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar además después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente de marcaje. Las secuencias de polinucleótido, cuando se proporcionan, se enumeran en la dirección de 5' a 3', a menos que se establezca de otro modo. El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico más corto, típicamente de no más de 100 nucleótidos de longitud, aunque los ácidos nucleicos más largos también se pueden llamar oligonucleótidos.

[0033] Una "sonda" de ácido nucleico es un oligonucleótido que se puede unir a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, en general, a través del emparejamiento de bases complementarias, normalmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno, formando, por tanto, una estructura de doble hélice. La sonda se une o se hibrida a un "sitio de unión a sonda". La sonda se puede marcar con un marcador detectable para permitir una fácil detección de la sonda, en particular, una vez que la sonda se haya hibridado a su diana complementaria. De forma alternativa, sin embargo, la sonda puede estar no marcada, pero puede ser detectable por unión específica con un ligando que esté marcado, directa o bien indirectamente.

[0034] El término "epítopo" y "molécula diana" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a la molécula de interés (proteína o ácido nucleico) que se detecta y/o cuantifica por los procedimientos descritos en el presente documento.

[0035] El término "oligonucleótido diana" se refiere a un oligonucleótido que se va a retirar o agotar de una mezcla de reacción por el novedoso procedimiento divulgado en el presente documento. El oligonucleótido diana puede compartir similitudes (por ejemplo, compartir alguna secuencia de ácido nucleico) con la molécula diana definida anteriormente, sin embargo, seleccionar como diana el oligonucleótido diana solo se refiere a retirar el oligonucleótido diana de la mezcla de reacción de acuerdo con el procedimiento divulgado en el presente documento. El oligonucleótido diana se denomina de manera intercambiable "oligonucleótido en exceso", "oligonucleótido no deseado", "oligonucleótido que se va a agotar" y "oligonucleótido que se va a retirar".

[0037] El término "horquilla" en relación con los ácidos nucleicos se refiere a una estructura secundaria formada por una hebra individual de un ácido nucleico que tiene al menos porciones complementarias entre sí y que se pueden hibridar entre sí. Una horquilla comprende una región intermedia corta entre las dos regiones complementarias de modo que, tras hibridarse, la hebra de ácido nucleico hace una curva pronunciada. Una horquilla con una región intermedia más larga no forma una curva pronunciada, sino que forma un bucle y la estructura se puede denominar estructura de "tallo-bucle". No existe ninguna delineación exacta entre una horquilla y un tallo-bucle. Una estructura de tallo-bucle con un bucle más pequeño a veces se denomina horquilla.

[0039] La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un procedimiento mejorado para retirar oligonucleótidos en exceso u oligonucleótidos no deseados de mezclas de reacción sin ninguna etapa de purificación como se define por las reivindicaciones. El procedimiento permite una fácil retirada o inactivación de los oligonucleótidos con poco o ningún tiempo de manipulación y sin ninguna pérdida de los productos deseados.

[0040] En las reacciones que implican mezclas de oligonucleótidos, es importante controlar y eliminar los subproductos y reactivos en exceso, ya que pueden servir como sustrato en reacciones secundarias problemáticas. Las reacciones secundarias, tales como las interacciones cebador-cebador o sonda-sonda, el cebado no diana y la unión a sonda no diana afectan la cinética de las reacciones pretendidas a través del secuestro de reactivos o consumo de componentes de reacción. La invención divulgada en el presente documento incluye procedimientos, como se define por las reivindicaciones, que hacen que las secuencias de oligonucleótidos específicas sean inertes a reacciones secundarias y emparejamiento de bases no diana.

[0042] La invención usa un oligonucleótido corto (ADN o ARN) denominado por la presente "doble horquilla" (figura 1). La doble horquilla se añade a la mezcla de reacción después de la completitud de la reacción que implica el oligonucleótido del que se va a retirar el exceso no usado. La secuencia de este oligonucleótido de doble horquilla está diseñada de modo que 1) forme horquillas en cada uno de sus extremos y 2) tenga una sección central entre las horquillas que se una a un oligonucleótido que se vaya a retirar o hacer inerte ("oligonucleótido diana"). Cuando se añade el oligonucleótido de doble horquilla a la mezcla que contiene el oligonucleótido diana, el oligonucleótido diana se hibridará a la sección central de la doble horquilla. Tras la hibridación, se usa una enzima ligasa para formar un enlace covalente entre tanto los extremos 5' como los 3' del oligonucleótido de doble horquilla y tanto los extremos 5' como los 3' del oligonucleótido diana, formando, por tanto, un producto inerte topológicamente circular.

[0044] El producto circularizado hace que el oligonucleótido diana sea inerte de varios modos. En primer lugar, la ligación bloquea que el extremo 3' del oligonucleótido diana sirva como cebador en cualquier reacción de extensión de cebador, incluyendo reacciones de amplificación exponencial. En segundo lugar, el emparejamiento de bases con el oligonucleótido de doble horquilla previene que el oligonucleótido diana se someta a emparejamiento de bases con otros ácidos nucleicos en la mezcla de reacción.

[0046] La presente invención implica un procedimiento como se reivindica de retirada de oligonucleótidos no deseados de una muestra. En algunos modos de realización, la muestra se deriva de un sujeto o de un paciente. En algunos modos de realización, la muestra puede comprender un fragmento de un tejido sólido o de un tumor sólido derivado del sujeto o del paciente, por ejemplo, por biopsia. La muestra también puede comprender líquidos corporales (por ejemplo, orina, esputo, suero, plasma o linfa, saliva, esputo, sudor, lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, líquido gástrico, líquido intestinal o muestras fecales) que puedan contener ácidos nucleicos. La muestra puede comprender sangre completa o fracciones sanguíneas donde pueden estar presentes ácidos nucleicos. En otros modos de realización, la muestra es una muestra cultivada, por ejemplo, un cultivo tisular que contenga células a partir de las que se puedan aislar ácidos nucleicos. En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos de interés en la muestra proceden de agentes infecciosos, tales como virus, bacterias, protozoos u hongos. En algunos modos de realización, las células de muestra se usan en el procedimiento que implica retirar un oligonucleótido diana. En otros modos de realización, se usan ácidos nucleicos aislados de la muestra.

[0048] En algunos modos de realización, se necesitan aislar ácidos nucleicos de una muestra. Los procedimientos de extracción de ADN son bien conocidos en la técnica. Véase J. Sambrooket al.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, N.Y.). Una variedad de kits están disponibles comercialmente para extraer ácidos nucleicos (ADN o ARN) de muestras biológicas (por ejemplo, BD Biosciences Clontech (Palo Alto, Cal.), Epicentre Technologies (Madison, Wisc.); Gentra Systems, INC. (Minneapolis, Minn.); y Qiagen, INC. (Valencia, Cal.), Ambion, Inc. (Austin, Tex.); BioRad Laboratories (Hercules, Cal.); y más.

[0050] En algunos modos de realización, la purificación es por unión por afinidad. En variaciones de este modo de realización, la afinidad es por la secuencia diana específica (secuencia de captura). En otros modos de realización, el cebador comprende una marca de afinidad. Se puede usar cualquier marca de afinidad conocida en la técnica, tal como biotina, un anticuerpo o un antígeno para el que exista un anticuerpo específico. El compañero de afinidad para la marca de afinidad puede estar presente en solución, por ejemplo, en un soporte sólido en fase de solución, tal como partículas o microesferas suspendidas, o unido a un soporte en fase sólida.

[0051] En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos se separan por tamaño y purifican usando cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis o epitacoforesis.

[0053] Los ácidos nucleicos, proteínas u otros marcadores de interés pueden estar presentes en las células o mezclas de reacción y pueden ser la diana de un procedimiento de detección o cuantificación. El procedimiento de detección o cuantificación se mejora como se divulga en el presente documento por la retirada de los oligonucleótidos en exceso.

[0055] Cada diana de ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácido nucleico. Cada diana proteica se caracteriza por su secuencia de aminoácidos y sus epítopos reconocidos por anticuerpos específicos. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana contiene un locus de una variante genética, por ejemplo, un polimorfismo, incluyendo un polimorfismo o variante mononucleotídico/a (SNP o SNV), o un reordenamiento genético que da como resultado, por ejemplo, una fusión génica. En algunos modos de realización, un biomarcador proteico contiene un cambio aminoacídico que da como resultado la creación de un epítopo exclusivo. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana o proteína diana comprende un biomarcador, es decir, un gen o antígeno proteico en el que sus variantes se asocian con una enfermedad o afección. Por ejemplo, los ácidos nucleicos y proteínas diana se pueden seleccionar a partir de los paneles de marcadores pertinentes para enfermedades descritos en la solicitud de patente de<e>E. UU. con n.° de serie 14/774.518, presentada el 10 de septiembre de 2015. Dichos paneles están disponibles como kits de análisis AVENIO ctDNA (Roche Sequencing Solutions, Pleasanton, Cal.). En otros modos de realización, los ácidos nucleicos o proteínas diana son característicos de un organismo particular y ayudan en la identificación del organismo o de una característica del organismo patógeno, tal como sensibilidad a fármacos o resistencia a fármacos. Aún en otros modos de realización, el ácido nucleico o proteína diana es un rasgo característico exclusivo de un sujeto humano, por ejemplo, una combinación de secuencias de HLA o KIR que definen el genotipo de HLA o KIR exclusivo del sujeto. Aún en otros modos de realización, el ácido nucleico diana es una secuencia somática, tal como una secuencia inmunitaria reordenada que representa una inmunoglobulina (incluyendo inmunoglobulina IgG, IgM e IgA) o una secuencia de receptor de linfocitos T (TCR). Aún en otra aplicación, la diana es una secuencia fetal presente en la sangre materna, que incluye una secuencia fetal característica de una enfermedad o afección fetal o una afección materna relacionada con el embarazo. Por ejemplo, la diana podría ser uno o más de los trastornos autosómicos o ligados al cromosoma X descritos en Zhanget al.(2019)Non-invasive prenatal sequencing for múltiple Mendelian monogenic disorders using circulating cell-free fetal DNA,Nature Med.

[0056] 25(3):439.

[0058] En algunos modos de realización, la diana es un ácido nucleico (incluyendo ARNm, microARN, ARN vírico, ADN celular o ADN extracelular circulante (ADNec) incluyendo ADN tumoral circulante (ADNtc)).

[0060] En algunos modos de realización, la diana es una proteína expresada en la célula. Por ejemplo, la proteína diana puede ser una proteína de superficie celular. En algunos modos de realización, la proteína de superficie celular es una proteína de superficie de linfocitos seleccionada de receptores inhibidores (tales como Pdcd1, Havrcr2, Lag3, CD244, Entpd 1, CD38, CD101, Tigit, CTLA4), receptores de superficie celular (tales como TNFRSF9, TNFRSF4, Klrg1, CD28, Icos, IL2Rb, IL7R) o receptores de quimiocinas (tales como CX3CR1, CCL5, CCL4, CCL3, CSF1, CXCR5, CCR7, XCL1 y CXCL10). En algunos modos de realización, las proteínas se seleccionan de CD4, CD8, CD11, CD16, CD19, CD20, CD45, CD56 y CD279.

[0062] En referencia a la figura 1, la invención incluye procedimientos como se reivindica que comprenden el uso de un oligonucleótido de doble horquilla, también denominado ácido nucleico de doble horquilla, para capturar oligonucleótidos no deseados de una mezcla de reacción. El oligonucleótido comprende tres partes: una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre las horquillas de extremo 5' y las de extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar al oligonucleótido que se va a retirar ("oligonucleótido diana").

[0064] Cada una de las horquillas está formada por dos secuencias dentro del oligonucleótido que pueden formar un híbrido estable entre sí y formar una curva de ADN (o ARN) entre las secuencias hibridadas. En algunos modos de realización, una o ambas horquillas están formadas por regiones de complementariedad perfecta entre sí. En otros modos de realización, una o ambas horquillas están formadas por secuencias solo parcialmente complementarias, que, no obstante, forman una horquilla estable.

[0065] En algunos modos de realización, una o ambas de las regiones de horquilla del oligonucleótido de doble horquilla comprenden uno o más nucleótidos modificados que incrementan la estabilidad térmica (temperatura de fusión, Tf) de las estructuras de horquilla. Por ejemplo, una o ambas porciones de horquilla incluyen una o más de 5-metil citosina, 2,6-diaminopurina, 5-hidroxibutinil-2'-desoxiuridina, 8-aza-7-desazaguanosina, un ribonucleótido, un 2'O-metil ribonucleótido o un ácido nucleico bloqueado.

[0067] En algunos modos de realización, las secuencias formadoras de horquilla son secuencias de ácido nucleico artificiales, opcionalmente diseñadasin silico.En otros modos de realización, las secuencias formadoras de horquilla son secuencias formadoras de horquilla naturales revisadas en Bikardet al.,(2010)Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes,Microbiol. Mol. Biol. Review 74(4): 570-588; o en Brazdaet al.,(2011)Cruciform structures are a common DNA feature important for regulating biological process,BMC Mol. Biol. 12:33.

[0069] La porción monocatenaria de la horquilla está diseñada para formar un híbrido estable con el oligonucleótido diana para posibilitar la ligación del oligonucleótido diana con ambos extremos del oligonucleótido de doble horquilla. Un experto en la técnica apreciaría que un híbrido estable se puede formar por hebras de ácido nucleico que sean perfectamente complementarias, así como menos que perfectamente complementarias entre sí. En algunos modos de realización, la región monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla es parcialmente complementaria al oligonucleótido diana. En algunos modos de realización, la región monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla es perfectamente complementaria al oligonucleótido diana. En algunos modos de realización, una porción de la región monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla es perfectamente complementaria al oligonucleótido diana. En algunos modos de realización, la porción contigua al extremo 5' y la porción contigua al extremo 3' de la región monocatenaria son perfectamente complementarias a la porción contigua al extremo 3' y a la porción contigua al extremo 5' del oligonucleótido diana, mientras que la porción central de la región monocatenaria no es complementaria o solo parcialmente complementaria a la porción central del oligonucleótido diana.

[0071] En algunos modos de realización, el oligonucleótido de doble horquilla desplegado está entre aproximadamente 40 y aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. La secuencia formadora de horquilla está entre aproximadamente 9 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. Aunque no existe ninguna longitud prescrita para ninguna de las dos regiones de horquilla, se desea tener las regiones lo suficientemente largas como para garantizar la estabilidad de las horquillas en la mezcla de reacción. Un experto en la técnica tiene acceso a una variedad de herramientas para predecir la estabilidad de una doble hélice de ácido nucleico (temperatura de fusión, Tf) en diversas condiciones de temperatura y salinidad. La región monocatenaria está hecha a medida para acomodar el oligonucleótido diana. Los oligonucleótidos que incluyen cebadores, sondas y adaptadores típicamente varían de 10 a 100 nucleótidos de longitud, la mayoría encontrándose entre 20 y 50 nucleótidos de longitud. Por lo tanto, la región monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, lo más a menudo, entre 20 y 50 nucleótidos de longitud.

[0072] En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento como se reivindica de retirada de oligonucleótidos en exceso u oligonucleótidos no deseados ("oligonucleótidos diana") de una mezcla de reacción. El procedimiento comprende poner en contacto la mezcla de reacción que contiene los oligonucleótidos diana con un ácido nucleico de doble horquilla que comprende una hebra de ácido nucleico individual que tiene: una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3'; y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3'. La región monocatenaria comprende una secuencia que se puede hibridar a los oligonucleótidos diana.

[0074] El oligonucleótido de doble horquilla se añade a una concentración calculada para superar la concentración del oligonucleótido diana que se va a retirar para garantizar una cinética de hibridación favorable. Un experto en la técnica apreciará que, en algunos casos, la concentración molar óptima de oligonucleótido de doble horquilla se puede calcular de antemano, mientras que, en otros casos, la concentración molar óptima de oligonucleótido de doble horquilla se determina experimentalmente a través de valoración del oligonucleótido de doble horquilla. Una clara ventaja de la invención es que el oligonucleótido de doble horquilla está diseñado para interactuar con el oligonucleótido diana y no interactuar con ningún otro ácido nucleico en la mezcla de reacción.

[0076] En algunos modos de realización, la mezcla de reacción se incuba a una temperatura óptima para la formación del híbrido entre el oligonucleótido diana y el oligonucleótido de doble horquilla. En algunos modos de realización, la temperatura de hibridación está en el intervalo de 40-72 °C. En algunos modos de realización, una o ambas de la etapa de hibridación y de la etapa de ligación se producen a temperatura ambiente.

[0078] En algunos modos de realización, la reacción se deja incubar durante el tiempo necesario para la formación del híbrido entre el oligonucleótido diana y el oligonucleótido de doble horquilla. En algunos modos de realización, el tiempo es de 5-15 minutos.

[0080] En algunos modos de realización, se va a retirar un oligonucleótido diana individual y se añade un oligonucleótido de doble horquilla individual. En otros modos de realización, se van a retirar múltiples oligonucleótidos diana y se añade una mezcla de múltiples oligonucleótidos de doble horquilla.

[0081] Después de que el oligonucleótido diana se hibride a la región monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla, la mezcla de reacción se pone en contacto con una ligasa. Existen enzimas ligasa para ligar tanto ADN como ARN y acomodarán tanto el oligonucleótido de doble horquilla de ADN como de ARN y el oligonucleótido diana. Se usa una ligasa apropiada para el tipo de ácido nucleico en el oligonucleótido de doble horquilla y el oligonucleótido diana. Ambos extremos del oligonucleótido diana se ligan al oligonucleótido de doble horquilla (figura 1).

[0082] En algunos modos de realización, la ligasa y los cofactores y sustratos de ligasa (por ejemplo, ATP) ya están presentes en la mezcla de reacción debido a que ha tenido lugar el procedimiento anterior. En dichos modos de realización, no se añaden ligasa o cofactores de ligasa adicionales para retirar el oligonucleótido diana. En otros modos de realización, se añaden la ligasa y cofactores de ligasa.

[0083] En algunos modos de realización, tanto el oligonucleótido diana como el oligonucleótido de doble horquilla contienen grupos 5'-fosfato. En otros modos de realización, uno o ambos del oligonucleótido diana y del oligonucleótido de doble horquilla carecen de grupos 5'-fosfato. En dichos modos de realización, la mezcla de reacción se pone en contacto con una polinucleótido cinasa (PNK) y cualquier cofactor necesario, por ejemplo, ATP, y los extremos 5' se fosforilan para posibilitar que tenga lugar la ligación.

[0084] En algunos modos de realización, las enzimas (por ejemplo, ligasa y polinucleótido cinasa) se retiran o inactivan (por ejemplo, se inactivan por calor) antes de las etapas posteriores que implican la mezcla de reacción agotada de oligonucleótidos diana.

[0085] Un experto en la técnica apreciaría que el término "retirada" en referencia al oligonucleótido diana incluye todas las formas de inactivación del oligonucleótido diana. Si el oligonucleótido diana ya no se puede hibridar a ningún ácido nucleico en la mezcla de reacción y ya no puede cebar la síntesis de ácidos nucleicos, el oligonucleótido se retira eficazmente de la mezcla de reacción. Por lo tanto, el secuestro del oligonucleótido diana dentro de un ácido nucleico topológicamente circular cerrado de forma covalente bicatenario formado por el oligonucleótido de doble horquilla y el oligonucleótido diana (figura 1, parte inferior) constituye la retirada del oligonucleótido diana de la mezcla de reacción.

[0086] En algunos modos de realización, el procedimiento como se reivindica se usa en un procedimiento mejorado de realización de amplificación de ácidos nucleicos por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se describe en detalle en la patente de EE. UU. n.° 4.683.195, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica poner en contacto una solución de muestra que comprenda ácidos nucleicos con un cebador directo, un cebador inverso, una ácido nucleico polimerasa, preferentemente una polimerasa termoestable, y precursores de ácido nucleico, tales como dNTP o análogos de dNTP que se puedan incorporar por la ácido nucleico polimerasa. La mezcla de reacción se somete a un perfil de termociclado que incluye múltiples ciclos que incluyen una etapa de desnaturalización de ADN (90 °C o mayor), una etapa de hibridación de cebador opcional (45-72 °C) y una etapa de extensión con polimerasa (65-72 °C). En algunos modos de realización, la PCR es PCR ultrarrápida que incluye una sonda de detección marcada de forma fluorescente como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5.804.375. En los protocolos del estado de la técnica, después de que se haya completado la reacción de amplificación, la mezcla de reacción se somete a una etapa de purificación, tal como limpieza con microesferas de SPRI, para retirar los cebadores en exceso. La presente invención, como se reivindica, prescinde de la etapa de purificación.

[0087] En algunos modos de realización, después de la completitud de la reacción de amplificación, la mezcla de reacción se pone en contacto con los novedosos oligonucleótidos de doble horquilla descritos en el presente documento, de acuerdo con el procedimiento como se reivindica. En algunos modos de realización, el oligonucleótido diana es una mezcla de los cebadores directo e inverso. En algunos modos de realización, la mezcla de oligonucleótidos diana también incluye la sonda de detección. El oligonucleótido de doble horquilla es una combinación de dos o tres oligonucleótidos. El primer oligonucleótido de doble horquilla incluye una región central complementaria al cebador de amplificación directo. El segundo oligonucleótido de doble horquilla incluye una región central complementaria al cebador de amplificación inverso. También puede estar presente un tercer oligonucleótido de doble horquilla que seleccione como diana la sonda de detección. El tercer oligonucleótido de doble horquilla incluye una región central complementaria a la sonda de detección. Los cebadores en exceso y, si está presente, la sonda, se ligan a los oligonucleótidos de doble horquilla correspondientes para formar estructuras circulares cerradas.

[0088] En algunos modos de realización, antes de la ligación, la mezcla de reacción se pone en contacto con una polinucleótido cinasa (PNK) y cualquier cofactor y sustrato necesarios, por ejemplo, ATP, para fosforilar los extremos 5' de los cebadores directo e inverso, y si está presente, la sonda, para posibilitar que tenga lugar la ligación.

[0089] En algunos modos de realización, se usan oligonucleótidos de doble horquilla para los tres oligonucleótidos diana: el cebador directo, el cebador inverso y la sonda. En otros modos de realización, se usan oligonucleótidos de doble horquilla para solo uno o dos de los tres oligonucleótidos diana.

[0090] Tras el secuestro de los cebadores en exceso y, si está presente, la sonda en exceso en las estructuras circulares cerradas, se puede proceder de inmediato a las etapas posteriores.

[0091] En algunos modos de realización, el procedimiento como se reivindica se usa en un procedimiento mejorado de realización de amplificación de ácidos nucleicos por medio de reacción en cadena de la ligasa (LCR). Como se describe en detalle en la patente de EE. UU. n.° 6.312.892, la reacción en cadena de la ligasa (LCR) implica poner en contacto una solución de muestra que comprenda ácidos nucleicos con un conjunto de sondas que comprenda la primera y segunda sonda oligonucleotídica, pudiendo hibridarse de forma contigua las sondas al molde de ácido nucleico, y una ligasa, preferentemente una ligasa termoestable. La mezcla de reacción se somete a un perfil de termociclado que incluye múltiples ciclos que incluyen una etapa de desnaturalización de ADN (90 °C o mayor), una etapa de hibridación de sonda opcional (45-65 °C) y una etapa de ligación (65 °C o menor). En los protocolos del estado de la técnica, después de que se haya completado la reacción de amplificación, la mezcla de reacción se somete a una etapa de purificación, tal como limpieza con microesferas de SPRI, para retirar las sondas en exceso. La presente invención, como se reivindica, prescinde de la etapa de purificación.

[0092] En algunos modos de realización, después de la completitud de la reacción de amplificación, la mezcla de reacción se pone en contacto con los novedosos oligonucleótidos de doble horquilla descritos en el presente documento, de acuerdo con el procedimiento como se reivindica. En algunos modos de realización, el oligonucleótido diana es una mezcla de las primera y segunda sondas. El oligonucleótido de doble horquilla es una combinación de dos oligonucleótidos. El primer oligonucleótido de doble horquilla incluye una región central complementaria a la primera sonda. El segundo oligonucleótido de doble horquilla incluye una región central complementaria a la segunda sonda. De forma conveniente, la ligasa y todos los cofactores necesarios ya están presentes en la mezcla de reacción. Las sondas en exceso se ligan a los oligonucleótidos de doble horquilla correspondientes para formar estructuras circulares cerradas.

[0093] En algunos modos de realización, antes de la ligación, la mezcla de reacción se pone en contacto con una polinucleótido cinasa (PNK) y cualquier cofactor y sustrato necesario, por ejemplo, ATP, para fosforilar los extremos 5' de las sondas para posibilitar que tenga lugar la ligación.

[0094] En algunos modos de realización, se usan oligonucleótidos de doble horquilla para ambas sondas. En otros modos de realización, se usan oligonucleótidos de doble horquilla para solo una de las dos sondas.

[0095] Tras el secuestro de los cebadores en exceso y, si está presente, la sonda en las estructuras circulares cerradas, se puede proceder de inmediato a las etapas posteriores.

[0096] En algunos modos de realización, el procedimiento como se reivindica se usa en un procedimiento mejorado de realización de un código de barras cuántico (QBC), un procedimiento de detección de múltiples dianas en una pluralidad de células individuales (patente de EE. UU. 10.144.950). El procedimiento comprende preparar una suspensión celular. Luego, las células se ponen en contacto con un agente de unión exclusivo, por ejemplo, sonda de ADN o sonda de ARN (incluyendo un aptámero) o un anticuerpo. La sonda o anticuerpo comprende al menos una parte o elemento que interactúa específicamente con una diana y un elemento que permite el ensamblaje de un código de barras de ácido nucleico combinatorio. En algunos modos de realización, el ensayo es un ensayo múltiple, con lo que se detecta una pluralidad de moléculas diana en una pluralidad de células en una mezcla de reacción individual usando una pluralidad de agentes de unión diferentes del mismo o diferente tipo (por ejemplo, una pluralidad de sondas de ácido nucleico diferentes, o una pluralidad de anticuerpos diferentes, o una combinación de sondas de ácido nucleico y anticuerpos). Si el agente de unión exclusivo es un anticuerpo, el anticuerpo puede comprender un oligonucleótido conector que facilite el ensamblaje de un código de barras. Son conocidos procedimientos para fijar ácidos nucleicos a anticuerpos, por ejemplo, Gullberget al.,PNAS 101 (22): páginas 228420-8424 (2004); Boozeret al.,Analytical Chemistry, 76(23): páginas 6967-6972 (2004) o Kozlovet al.,Biopolymers 5: 73 (5): páginas 621-630 (2004). Si el agente de unión exclusivo es una sonda de ácido nucleico, se puede fijar un código de barras directamente a la sonda.

[0097] Después de que el agente de unión exclusivo se haya unido a su diana, las células con sondas o anticuerpos unidos se someten a un ensamblaje de códigos de barras con división-agrupación descrito con más detalle en la patente de EE. UU. 10.144.950. Se ensambla un código originario de célula exclusivo en cada célula donde se ha unido un agente de unión exclusivo. El código de barras celular exclusivo es una estructura modular ensamblada a partir de subunidades por adición en etapas de subunidades. Cada subunidad comprende un código de barras y regiones de fijación que sirven para fijar la subunidad al código de barras celular exclusivo en crecimiento. Las subunidades se fijan entre sí o a una cadena principal común por medio de regiones de fijación, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico complementarias. La fijación puede comprender una o ambas de hibridación a la cadena principal o a la subunidad contigua y ligación a la subunidad contigua. Después de que se hayan ensamblado los códigos de barras celulares exclusivos, se aíslan de las células y se detectan. Por ejemplo, los códigos de barras celulares exclusivos se amplifican y secuencian.

[0099] En un modo de realización de la presente invención, antes de la etapa de amplificación, la mezcla de reacción que contiene los códigos de barras exclusivos se pone en contacto con los novedosos oligonucleótidos de doble horquilla descritos en el presente documento, de acuerdo con el procedimiento como se reivindica. El oligonucleótido diana es una mezcla de la pluralidad de subunidades de código de barras. El oligonucleótido de doble horquilla está diseñado para unirse a una o más, incluyendo todas las, subunidades de código de barras en la mezcla. En algunos modos de realización, la porción monocatenaria del oligonucleótido de doble horquilla comprende dos regiones que se pueden hibridar a las regiones de hibridación de las subunidades de código de barras, que flanquean una región central individual que tiene la longitud del subcódigo contenido en las subunidades de código de barras. Debido a que los subcódigos varían entre las subunidades de código de barras, la región central del oligonucleótido de doble horquilla está diseñada para acomodar esta diversidad. En algunos modos de realización, la región central del oligonucleótido de doble horquilla es un espaciador no nucleotídico de longitud correspondiente a la longitud del subcódigo o un ácido nucleico que contiene inosina con el número de nucleótidos de inosina correspondiente al número de nucleótidos en el subcódigo.

[0101] En algunos modos de realización, los oligonucleótidos de subunidad de código de barras se pueden ligar en códigos de barras exclusivos, es decir, ya comprenden de forma conveniente un 5'-fosfato. Además, en dichos modos de realización, una ligasa activa ya está presente de forma conveniente en la mezcla de reacción. En dichos modos de realización, la mezcla de reacción se pone en contacto solo con los oligonucleótidos de doble horquilla.

[0103] En otros modos de realización, las subunidades de código de barras se añaden al código de barras exclusivo por un procedimiento distinto de ligación (véase, por ejemplo, un modo de realización donde los códigos de barras se copian por una polimerasa, véase la solicitud de EE. UU. con n.° de serie 16/250.974, presentada el 19 de enero de 2019). En dichos modos de realización, la mezcla de reacción se pone en contacto con los oligonucleótidos de doble horquilla y se pone en contacto además con una ligasa. Si las subunidades de código de barras carecen del 5'-fosfato, la mezcla de reacción se pone en contacto además con una polinucleótido cinasa (PNK). En algunos modos de realización, la mezcla de reacción se pone en contacto con ATP, los cofactores necesarios para la cinasa y la ligasa.

[0105] Las subunidades de código de barras en exceso se ligan a los oligonucleótidos de doble horquilla para formar una estructura circular cerrada. Tras el secuestro de los oligonucleótidos de subunidad de código de barras en exceso en la estructura circular cerrada, se puede proceder de inmediato a la amplificación. Los oligonucleótidos de código de barras ya no pueden interferir en la amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, al servir como cebadores de amplificación.

[0107] Es especialmente ventajoso que con la presente invención no se necesiten etapas de purificación antes de la amplificación. El código de barras cuántico (QBC) es un procedimiento de análisis de células individuales donde cada código de barras celular exclusivo representa una célula individual. Por lo tanto, una pérdida de una molécula de código de barras celular exclusivo individual representa una pérdida de puntos de datos valiosos. Con el procedimiento descrito en el presente documento, después de la retirada de las subunidades de código de barras en exceso, se puede proceder de inmediato a las etapas de análisis posteriores.

[0109] En algunos modos de realización, el procedimiento como se reivindica se usa en un procedimiento mejorado de formación de una colección para secuenciación de ácidos nucleicos. En este modo de realización, los ácidos nucleicos en una muestra se ligan a adaptadores y los adaptadores en exceso se retiran antes del procesamiento posterior de las colecciones.

[0111] En algunos modos de realización, el procedimiento incluye tratar ácidos nucleicos en la muestra antes de ligar los adaptadores. Los ácidos nucleicos de muestra ya pueden ser de extremos romos o se pueden hacer de extremos romos por tratamiento enzimático (por ejemplo, "reparación de extremos"). En otros modos de realización, el ADN de extremos romos experimenta una adición de colas de A donde se añade un nucleótido A individual al extremo 3' de uno o ambos extremos romos. Los adaptadores pueden ser ácidos nucleicos cortos bicatenarios o parcialmente bicatenarios que tengan un extremo romo con un nucleótido T individual que se extienda desde el extremo romo para facilitar la ligación entre el ácido nucleico de muestra y el adaptador. Los kits disponibles comercialmente para realizar la reparación de extremos, la adición de colas de A y la ligación de adaptador incluyen el kit AVENIO ctDNA Library Prep o los kits KAPA HyperPrep y HyperPlus (Roche Sequencing Solutions, Pleasanton, Cal.).

[0113] En algunos modos de realización, la presente invención incluye una novedosa etapa de retirada de adaptadores en exceso a partir de una reacción de formación de colecciones secuestrándolos dentro de una estructura circular cerrada formada por ligación a un oligonucleótido de doble horquilla descrito en el presente documento, de acuerdo con el procedimiento como se reivindica. El oligonucleótido diana incluye ambas hebras del adaptador. La doble horquilla es una combinación de dos oligonucleótidos de doble horquilla. El primer oligonucleótido de doble horquilla comprende una región central complementaria a la primera hebra del adaptador, mientras que el segundo oligonucleótido de doble horquilla comprende una región central complementaria a la segunda hebra del adaptador.

[0114] En algunos modos de realización, el procedimiento incluye además una etapa de incubación de la mezcla de reacción que comprende la colección y los adaptadores en exceso a una temperatura elevada suficiente para separar las hebras de los adaptadores, pero no las hebras de los ácidos nucleicos de la colección o las estructuras de horquilla en el oligonucleótido de doble horquilla. Para facilitar esta etapa del procedimiento, el oligonucleótido de doble horquilla puede comprender nucleótidos modificados que incrementen la temperatura de fusión (Tf) de la horquilla. Por ejemplo, una o ambas porciones de horquilla incluyen una o más de 5-metil citosina, 2,6-diaminopurina, 5-hidroxibutinil-2'-desoxiuridina, 8-aza-7-desazaguanosina, un ribonucleótido, un 2'O-metil ribonucleótido o un ácido nucleico bloqueado.

[0115] En algunos modos de realización, la mezcla de reacción también se pone en contacto con una polinucleótido cinasa para fosforilar los extremos 5' de los adaptadores.

[0116] El procedimiento de la presente invención comprende luego una etapa de ligar las hebras de adaptador a los oligonucleótidos de doble horquilla. El procedimiento puede comprender además amplificar la colección o someter a la colección a una etapa de captura de dianas. No son necesarias etapas de purificación antes de las etapas posteriores de amplificación o captura de dianas.

[0117] El procedimiento de retirada de oligonucleótidos en exceso de la invención no está limitado a las aplicaciones ejemplares específicamente abordadas anteriormente, sino que se puede usar en cualquier procedimiento de diagnóstico, de pronóstico, terapéutico, de estratificación de pacientes, de desarrollo de fármacos, de selección del tratamiento y de cribado que implique el uso de oligonucleótidos donde se desee la retirada de oligonucleótidos en exceso.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

I. Un procedimiento de retirada de oligonucleótidos no deseados de una mezcla de reacción, comprendiendo el procedimiento:

a. poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que comprende una hebra de ácido nucleico individual que tiene:

1. una primera horquilla en el extremo 5';

ii. una segunda horquilla en el extremo 3'; y

iii. una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria comprende una secuencia que se puede hibridar al oligonucleótido que se va a retirar;

b. hibridar el oligonucleótido que se va a retirar al ácido nucleico de doble horquilla;

c. ligar el oligonucleótido que se va a retirar a los extremos del ácido nucleico de doble horquilla para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, el oligonucleótido no deseado de la mezcla de reacción.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto la mezcla de reacción con una ligasa antes de la etapa c.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción comprende una ligasa antes de la etapa a.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la doble horquilla contiene un grupo 5'-fosfato.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la región monocatenaria comprende dos regiones de complementariedad con el oligonucleótido que se va a retirar que flanquean una región central individual.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la región central es un espaciador no nucleotídico.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la región central comprende nucleótidos de inosina.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido que se va a retirar comprende una pluralidad de oligonucleótidos que tienen dos regiones constantes que flanquean una región de código de barras individual que varía entre la pluralidad de oligonucleótidos.

9. Un procedimiento de detección de una pluralidad de dianas en una pluralidad de células en una mezcla de reacción, comprendiendo el procedimiento:

a. unir a las dianas en una pluralidad de células una pluralidad de agentes de unión exclusivos que sean cada uno específicos para una de las dianas;

b. añadir múltiples oligonucleótidos de subcódigo a cada uno de los agentes unidos en la pluralidad de células de una manera ordenada durante tandas sucesivas de síntesis con división-agrupación, en el que los oligonucleótidos de subcódigo en cada tanda se hibridan de forma contigua al oligonucleótido de subcódigo de una tanda previa por medio de una región de hibridación, y enlazar de forma covalente los oligonucleótidos de subcódigo hibridados de forma contigua entre sí para crear, en cada célula, un código de nucleótido originario de célula exclusivo;

c. poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que comprende una hebra de ácido nucleico individual que tiene una primera horquilla en el extremo 5'; una segunda horquilla en el extremo 3', y una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3' que se puede hibridar a los oligonucleótidos de subcódigo, y ligar los oligonucleótidos de subcódigo en exceso al ácido nucleico de doble horquilla correspondiente para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, los oligonucleótidos de subcódigo en exceso.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que los oligonucleótidos de subcódigo comprenden una región de código de barras flanqueada por dos regiones de hibridación y la región monocatenaria del ácido nucleico de doble horquilla comprende un espaciador de igual longitud a la región de código de barras flanqueada por dos secuencias que se pueden hibridar a las regiones de hibridación en los oligonucleótidos de subcódigo.

I I . Un procedimiento de preparación de una solución de ácidos nucleicos diana amplificados libre de cebadores de amplificación en exceso, comprendiendo el procedimiento:

a. poner en contacto una mezcla de reacción que contiene ácidos nucleicos diana con un cebador de amplificación directo y uno inverso y una ácido nucleico polimerasa termoestable en presencia de reactivos que soportan la síntesis de ácidos nucleicos;

b. someter la mezcla de reacción a un perfil de termociclado adecuado para la hibridación y extensión de los cebadores directo e inverso;

c. después de la completitud del perfil de termociclado, poner en contacto la mezcla de reacción con una ácido nucleico ligasa y un ácido nucleico de doble horquilla que consiste en una hebra de ácido nucleico individual que tiene:

i. una primera horquilla en el extremo 5';

ii. una segunda horquilla en el extremo 3'; y

iii. una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar al cebador directo o al cebador inverso;

d. ligar los cebadores directo e inverso al ácido nucleico de doble horquilla correspondiente para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, los cebadores directo e inverso de la solución de ácidos nucleicos diana amplificados.

12. Un procedimiento de preparación de una solución de ácidos nucleicos diana amplificados libre de sondas en exceso, comprendiendo el procedimiento:

a. poner en contacto una mezcla de reacción que contiene ácidos nucleicos diana con una primera y segunda sonda que se pueden hibridar de forma contigua al ácido nucleico diana, y una ligasa termoestable en presencia de reactivos que soportan la ligación;

b. someter la mezcla de reacción a un perfil de termociclado adecuado para la hibridación y ligación de las primera y segunda sondas entre sí;

c. después de la completitud del perfil de termociclado, poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que consiste en una hebra de ácido nucleico individual que tiene:

i. una primera horquilla en el extremo 5';

ii. una segunda horquilla en el extremo 3'; y

iii. una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar a la primera sonda o a la segunda sonda;

d. ligar las primera y segunda sondas al ácido nucleico de doble horquilla correspondiente para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, las primera y segunda sondas de la solución de ácidos nucleicos diana amplificados.

13. Un procedimiento de formación de una colección de ácidos nucleicos libre de moléculas de adaptador en exceso, comprendiendo el procedimiento:

a. poner en contacto una mezcla de reacción que comprende ácidos nucleicos con moléculas de adaptador y una ligasa;

b. ligar las moléculas de adaptador a los extremos de los ácidos nucleicos para formar una colección de ácidos nucleicos;

c. poner en contacto la mezcla de reacción con un ácido nucleico de doble horquilla que consiste en una hebra de ácido nucleico individual que tiene:

i. una primera horquilla en el extremo 5';

ii. una segunda horquilla en el extremo 3'; y

iii. una región monocatenaria entre el extremo 5' y el extremo 3', en el que la región monocatenaria se puede hibridar al adaptador;

d. ligar el adaptador al ácido nucleico de doble horquilla para formar un producto circular inerte, retirando, de este modo, el adaptador de la solución que contiene la colección de ácidos nucleicos.