ES3049217T3 - Simultaneous yeast propagation and saccharification - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método de propagación de levaduras, para su uso en la producción de un producto de fermentación a partir de biomasa lignocelulósica, que incluye las etapas que consisten en: a. proporcionar un reactor; b. poner en contacto en dicho reactor: una población de levaduras capaces de metabolizar pentosas y hexosas, con 0,2 a 2,0 g de sólidos de levadura por kg de medio completo preparado, orujo crudo procedente del pretratamiento de la biomasa lignocelulósica, con un contenido en sólidos (MS) del 8 % al 15 %, nutrientes, y celulasas, con 5 a 15 mg de proteínas por gramo de MS; y c. incubar la mezcla a una temperatura de 25 °C a 38 °C, preferiblemente de 28 °C a 33 °C, en microaerobiosis, en la que la sacarificación del orujo crudo y el crecimiento de la levadura se llevan a cabo simultáneamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Propagación y sacarificación simultáneas de levadura

[0003] La presente invención se refiere a campo de las levaduras utilizadas en la producción de biocombustibles y otros compuestos de química verde, producidos mediante un proceso de fermentación.

[0004] La disminución de las reservas de combustibles fósiles ha conducido a la industria a buscar soluciones alternativas, implementando materias primas renovables y procesos menos contaminantes siempre que sea posible. Mencionaremos de entre estas soluciones la producción de bioetanol a partir de biomasa vegetal, biomasa procedente de residuos vegetales o incluso desechos municipales. Para ser aceptadas, las versiones verdes de los compuestos químicos deben ser tan eficaces, o incluso más, que las versiones existentes, y sus métodos de producción deben ser económicamente competitivos.

[0005] Las aplicaciones son numerosas: combustibles de primera generación, biodiésel o etanol, resultantes de materias primas vegetales, tales como caña de azúcar, remolacha, trigo, maíz o aceite vegetal; combustibles de segunda generación, biodiésel, biokeroseno, etanol celulósico, resultantes de biomasa vegetal no alimentaria o residuos de cultivos, y otros productos químicos pesados o finos.

[0006] La materia prima debe ser pretratada. Dependiendo de su origen, el pretratamiento es mecánico (rallado, triturado, picado, molido, prensado), térmico o químico. El subproducto vegetal crudo obtenido se somete a una extracción y/o a una hidrólisis enzimática. Esto resulta en un sustrato fermentable al que se añade el microorganismo fermentador. Por último, el producto de la fermentación se puede utilizar para extraer productos de interés, por ejemplo, mediante destilación o extracción utilizando un disolvente. Diversas etapas de este proceso constituyen obstáculos tecnológicos y han sido objeto de estudios exhaustivos: el pretratamiento de la biomasa para hacerla accesible a las enzimas, la definición de mezclas enzimáticas para una hidrólisis eficiente de los polímeros de carbohidratos o incluso la fermentación alcohólica de los diferentes azúcares obtenidos (pentosas, hexosas).

[0007] La etapa de propagación alcohólica de la levadura, objeto de la presente invención, está poco descrita. Como tal, la presente invención se refiere a un método para propagar levaduras, para su uso en la producción de un producto de fermentación a partir de biomasa lignocelulósica, que comprende las etapas de:

[0008] a) proporcionar un reactor

[0009] b) poner en contacto en dicho reactor

[0010] - una población de levaduras capaces de metabolizar pentosas y hexosas, con 0,2 a 2,0 g de materia seca de levadura por kg de medio completo preparado, donde las levaduras de la población son levaduras de una cepa de levadura seleccionada de entre las cepas depositadas ante la CNCM con los siguientes números: I-4624, I-4625, I-4626, I-4627 e I-4783,

[0011] - subproducto vegetal crudo resultante del pretratamiento de la biomasa lignocelulósica sin etapas de hidrólisis o separación, con un contenido de materia seca (MS) entre el 8 % y el 15 %,

[0012] - nutrientes,

[0013] - celulasas, con 5 a 15 mg de proteína por gramo de MS,

[0014] c) incubar la mezcla a una temperatura de entre 25 °C y 38 0C, preferiblemente entre 28 0C y 33 0C, en microaerobiosis,

[0015] en donde se llevan a cabo simultáneamente la sacarificación del subproducto vegetal crudo y la proliferación de las levaduras.

[0016] Breve descripción de las figuras

[0017] La Figura 1 muestra un método de producción de bioetanol que comprende las etapas de pretratamiento, propagación de levadura y fermentación alcohólica, con detalles de los diferentes sustratos que se pueden generar mediante el método, sustratos que se pueden utilizar para las etapas de propagación de levadura y producción de etanol.

[0018] La composición de azúcares de los cinco sustratos es la siguiente:

[0019] (1) Celulosa (polímero de glucosa) y hemicelulosa solubilizada (monómeros y oligómeros de hexosas y pentosas). Sustrato sólido.

[0020] (2) Celulosa hidrolizada y hemicelulosa (monómeros y oligómeros de hexosas y pentosas). Sustrato líquido que contiene sólidos suspendidos.

[0021] (3) Celulosa (polímero de glucosa). Sustrato sólido.

[0022] (4) Hemicelulosa solubilizada (monómeros y oligómeros de hexosas y pentosas). Sustrato líquido.

[0023] (5) Celulosa hidrolizada (glucosa). Sustrato líquido que contiene sólidos suspendidos.

[0024] La Figura 2 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación en hidrolizado lignocelulósico (o SHF, por hidrólisis y fermentación separadas). La Figura 3 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación en jugo C5.

[0025] La Figura 4 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP (sacarificación y propagación simultáneas) según la invención, al 10 % de MS y 10 mg de proteína enzimática/g de MS.

[0026] La Figura 5 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP según la invención, al 12 % de MS y 10 mg de proteína enzimática/g de MS.

[0027] La Figura 6 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP según la invención, al 10 % de MS y 7 mg de proteína enzimática/g de MS.

[0028] La Figura 7 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP según la invención, a 32 0C.

[0029] La Figura 8 compara la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP según la invención, a 30 y 32 0C.

[0030] La Figura 9 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP según la invención, a un 10 % de MS y 7 mg de proteína enzimática/g de MS, con y sin adición de acetato.

[0031] La Figura 10 ilustra la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml), sustratos (azúcares C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la propagación SSP según la invención, a un 10 % de MS y 10 mg de proteína enzimática/g de MS, con y sin adición de acetato.

[0032] La Figura 11 compara la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml) durante la propagación en hidrolizado lignocelulósico (SHF) y la propagación SSP al 10 % de MS y 7 mg de proteína enzimática/g de MS con y sin adición de acetato.

[0033] La Figura 12 compara la evolución de las concentraciones de levaduras (en células/ml) durante la propagación en jugo C5 y la propagación SSP al 10 % de MS y 7 mg de proteína enzimática/g de MS con y sin adición de acetato.

[0034] La Figura 13 ilustra las concentraciones de azúcares (C5 y C6) y etanol (en g/kg) durante la fermentación SSCF en paja de trigo con adición de acetato (qs 4 g/kg) sembrada con levadura I-4783 propagada en SSP.

[0035] Según la Figura 1, la biomasa vegetal pretratada se puede utilizar como sustrato para la propagación de levaduras y/o la fermentación alcohólica en cinco formas diferentes:

[0036] - La solución más común consiste en hidrolizar todo el subproducto vegetal en presencia de celulasas, para obtener un hidrolizado lignocelulósico líquido (2) que comprende una mezcla de monómeros de hexosa (C6) y pentosa (C5), así como pequeñas cantidades de oligómeros.

[0037] - Otro sustrato común es el hidrolizado de hemicelulosa, también llamado “jugo C5” (4), que corresponde a la fracción soluble del sustrato a la salida del pretratamiento.

[0038] - Esta extracción del hidrolizado de hemicelulosa (4) a la salida del pretratamiento resulta en un subproducto vegetal celulósico rico en celulosa (3), que se puede hidrolizar gracias a las celulasas del mismo modo que el subproducto vegetal completo. En este caso, el hidrolizado de celulosa obtenido contiene principalmente monómeros de glucosa (5).

[0039] - Este subproducto vegetal celulósico rico en celulosa (3), que se presenta en forma sólida, también se puede utilizar sin hidrólisis previa. En este caso, las celulasas se añaden durante la fermentación y la hidrólisis de la celulosa y el consumo de glucosa se llevan a cabo simultáneamente.

[0041] - Por último, el método más avanzado que consiste en utilizar el subproducto vegetal pretratado en bruto (1) como sustrato de fermentación sin ninguna etapa intermedia de hidrólisis o separación. En este caso, las celulasas se añaden durante la fermentación y la hidrólisis de la celulosa se lleva a cabo simultáneamente con el consumo de xilosa y hexosa. Esta última opción para la etapa de fermentación alcohólica se conoce como sacarificación y cofermentación simultáneas (SSCF) de xilosa y hexosas.

[0043] La propagación de las levaduras que se utilizarán para la etapa de fermentación plantea diferentes problemas, especialmente en lo que se refiere a la transferencia de oxígeno.

[0045] Usualmente, se realiza en jugo C5 (4). Por lo tanto, la solicitud de patente US2014/0065700 menciona una propagación realizada en jugo C5 y la solicitud WO2009/155633 indica que la etapa previa de hidrólisis de la celulosa es esencial.

[0046] La propagación ha recibido poca atención en la bibliografía científica, y nunca se ha descrito la propagación realizada simultáneamente con la hidrólisis. El sustrato utilizado es la fracción soluble obtenida tras el pretratamiento (o jugo C5) o un hidrolizado lignocelulósico obtenido mediante la hidrólisis previa de toda la planta pretratada. Después de la propagación, se utilizan levaduras para la fermentación (con (SSF) o sin sacarificación), o para producir proteínas de interés (Duarte y col., 2008; Applied Biochem Biotechnol, 148: 119-29; Meyer y col., (1992); Biotechnol Bioeng, 40 (3): 353-8; Holder y col., 1989; Biological Wastes, 28 (4): 239-46; Gonzalez-Valdes y Moo-Young, 1981; Biotechnology Letters, 3 (3): 143-8). Bellissimi y Richards (Bellissimi E, Richards C: Yeast propagation. En The alcohol textbook, a reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries, 5.a edición, editado por Ingledew WM, Kelsall DR, Austin GD, Kluhspies C. Nottingham: University Press; 2009:145-159) indican que el método de producción de levaduras industriales es una propagación aeróbica, en la que no se produce alcohol y se alcanza un recuentocelularmáximo. De hecho, en el caso de la levadura, la capacidad de proliferación durante un largo período y en condiciones estrictamente anaeróbicas es limitada.

[0048] Una de las desventajas del subproducto vegetal crudo pretratado antes de la licuefacción o hidrólisis es su viscosidad. Por esta razón, se presupone que la etapa de licuefacción/solubilización o hidrólisis es esencial. Ningún documento expone o sugiere un método para la sacarificación y la propagación simultáneas.

[0050] La solicitud de patente WO2011/56991 A1 expone un método para la sacarificación y fermentación simultáneas, opcionalmente con propagación aireada paralela, en el medio licuado rico en hexosa que se utilizará para la fermentación. La solicitud de patente WO 2010/014817 A2 expone un método para mejorar la calidad y/o la cantidad del organismo fermentador (levadura) durante la fase de fermentación. La solicitud de patente WO2014/72232 A1 expone un método para la propagación aeróbica en un hidrolizado lignocelulósico (utilizado como fuente de carbono), en donde el hidrolizado se añade en modo semicontinuo para alcanzar y mantener un pH determinado en el reactor. La solicitud de patente US2014/0273167 A1 expone un método aeróbico para propagar levaduras, bajo agitación y aireación, en un sustrato rico en hexosas resultante de una hidrólisis. La solicitud de patente US2014/0273166 A1 expone un método para propagar levaduras en un sustrato resultante de la transformación de biomasa vegetal, un sustrato preferiblemente rico en pentosas. Las levaduras sometidas a propagación, en este caso específico, son levaduras transformadas, capaces de metabolizar pentosas.

[0052] El método de propagación en jugo C5 requiere una compleja etapa de extracción de la fracción líquida del subproducto vegetal pretratado. El método de propagación en hidrolizado rico en C6 (o que comprende una mezcla de C5-C6) también requiere una etapa específica de hidrólisis. Tal etapa es costosa y lenta. Por lo tanto, sigue siendo deseable mejorar el método hacia una versión más integrada, manteniendo un rendimiento satisfactorio en términos de rendimiento, productividad y tasa de multiplicación.

[0054] La presente invención proporciona un método para la sacarificación y la propagación simultáneas. Contrariamente a la técnica anterior sobre la naturaleza esencial de una etapa de hidrólisis o extracción previa a la obtención de un sustrato adecuado para la propagación de levaduras, el Solicitante propone un método que utiliza el subproducto vegetal crudo pretratado como sustrato de propagación de levaduras, sin etapas previas de hidrólisis o separación. Dicho método combina la sacarificación del subproducto vegetal crudo por las celulasas y la proliferación de las levaduras a partir de los azúcares C5 disponibles y los azúcares C6 liberados por la hidrólisis enzimática.

[0056] El método para la sacarificación y propagación simultáneas según la invención de la presente memoria se abreviará a continuación en la memoria como SSP (Simultaneous Saccharification and Propagation).

[0058] Una ventaja de la propagación según la invención es la reducción de tiempo y coste gracias a la integración del método, al eliminar una etapa.

[0059] Otra ventaja de la invención es la limitación de los azúcares fermentables debido a la hidrólisis enzimática realizada simultáneamente, lo que permite alcanzar un alto rendimiento de producción de biomasa sin imponer un protocolo de alimentación por lotes (también denominado fermentación por lotes).

[0061] Otra ventaja de la invención es que el nivel de glucosa continuamente bajo promueve el consumo de xilosa, que usualmente se inhibe en presencia de glucosa.

[0063] Otra ventaja de la invención es que el alto contenido final de biomasa (del orden de 17,4 g/kg) permite limitar el tamaño de la unidad de propagación de levadura, así como la dilución del mosto de fermentación debido a la siembra, que representa solo el 3 % del volumen de la fermentación SSCF.

[0065] Otra ventaja de la invención es que el impacto de los inhibidores presentes en el subproducto vegetal pretratado sobre el rendimiento de la proliferación se reduce significativamente.

[0067] Por último, otra ventaja de la invención es que el consumo de glucosa a medida que se libera por la hidrólisis enzimática limita los riesgos de contaminación.

[0069] Descripción detallada de la invención

[0071] El método de sacarificación y propagación simultáneas según la invención se aplica a una biomasa pretratada. Dicha biomasa es un material lignocelulósico, es decir, un material que contiene lignocelulosa. El material lignocelulósico puede contener otros componentes, tales como material celulósico (celulosa, hemicelulosa), así como azúcares, fermentables o no, y pectinas. Generalmente, el material lignocelulósico proviene de material vegetal: tallos, hojas, cáscaras, vainas, hojas, ramitas o madera de árboles. El material lignocelulósico también puede resultar de material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos o efluentes de plantas papeleras.

[0073] La biomasa utilizada en el método puede resultar del miscanthus, el álamo o la paja de trigo.

[0075] El material lignocelulósico se debe pretratar para descomponer la lignina y la estructura cristalina de la celulosa. Esto facilita la solubilización de la hemicelulosa y la celulosa y su accesibilidad a las enzimas que se pueden utilizar en el tratamiento de la biomasa. Cualquier medio de pretratamiento, en particular la impregnación seguida del pretratamiento, conocido por los expertos en la técnica, puede ser adecuado. Esquemáticamente, el pretratamiento puede ser químico, mecánico o biológico. El pretratamiento químico comprende el tratamiento con un agente catalítico ácido básico, especialmente ácido sulfúrico, o con disolventes orgánicos, dióxido de azufre o dióxido de carbono. La oxidación en medio líquido y la hidrotérmolisis con control del pH también se consideran tratamientos químicos. El pretratamiento mecánico corresponde a uno cualquiera de los tratamientos mecánicos o físicos, tales como la trituración, la irradiación, la explosión a alta presión o alta temperatura (explosión de vapor). En algunas realizaciones, los tratamientos químicos y mecánicos se pueden combinar, secuencialmente o simultáneamente.

[0077] Según una realización ventajosa, el pretratamiento de la materia prima comprende las siguientes etapas:

[0079] • impregnación en presencia de un agente catalítico químico ácido o básico, en particular un catalizador ácido, preferencialmente ácido sulfúrico, en proporciones de entre el 0,1 y el 2,0 % en peso, preferencialmente el 0,5 %. De forma ventajosa, dicha impregnación se implementa a una temperatura de entre aproximadamente 50 0C y aproximadamente 80 0C, en particular entre aproximadamente 60 0C y 70 0C, preferencialmente a aproximadamente 65 0C.

[0081] • inyección de vapor a una temperatura de entre aproximadamente 120 0C y aproximadamente 250 0C, en particular entre aproximadamente 170°Cy aproximadamente 190 0C, preferencialmente a aproximadamente 180 0C, a una presión de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 bar, en particular entre aproximadamente 8 y aproximadamente 10 bar, preferencialmente a aproximadamente 9 bar, y durante un tiempo de entre 1 y 10 minutos, preferencialmente 5 minutos.

[0083] La biomasa vegetal pretratada se puede utilizar entonces como sustrato para la propagación de levaduras y/o la fermentación alcohólica, según muestra la Figura 1 expuestaanteriormente.

[0085] La propagación también se conoce como multiplicación, proliferación o producción de biomasa. El objetivo es obtener la cantidad óptima de biomasa para la fermentación. El medio de propagación resultante de la biomasa pretratada puede ser rico en pentosa, rico en hexosa o una mezcla de pentosas y hexosas. Las pentosas son azúcares que tienen 5 átomos de carbono, también conocidos como azúcares C5 o, más simplemente, C5. Los principales representantes monoméricos naturales de las pentosas son la D-xilosa y la L-arabinosa. Por analogía, las hexosas son azúcares que tienen 6 átomos de carbono, también conocidos como azúcares C6 o, más simplemente, C6. Los principales representantes de las hexosas en forma monomérica son glucosa, fructosa, manosa y galactosa.

[0087] La propagación SSP (sacarificación y propagación simultáneas) según la presente invención se aplica a las levaduras, capaces de transformar tanto una o más pentosas como una o más hexosas.

[0088] La expresión “cepa de levadura” se refiere a una población homogénea de células de levadura. Una cepa de levadura se obtiene a partir del aislamiento de un clon. Un clon da lugar a una población celular obtenida a partir de una sola célula de levadura.

[0090] La expresión “cepa de levadura derivada” se refiere a una cepa de levadura derivada de uno o más cruces y/o por mutación y/o por transformación genética.

[0092] Una cepa de levadura derivada por cruce se puede obtener mediante cruce interespecífico o no. Una cepa de levadura derivada de una mutación puede ser una cepa de levadura que tiene al menos una mutación espontánea en su genoma o al menos una mutación inducida por mutagénesis. La mutación o mutaciones de una cepa derivada pueden afectar al fenotipo o no. La expresión “ mutagénesis” se refiere al proceso por el cual se produce una mutación. Convencionalmente, existen dos métodos posibles: la mutagénesis aleatoria y la mutagénesis insercional o dirigida. El primero consiste en la aplicación de un tratamiento físico (por ejemplo, radiación UV) o un tratamiento con agentes químicos mutagénicos, que inducirán mutaciones aleatorias en el genoma del organismo estudiado. El segundo utiliza métodos de biología molecular para provocar una modificación precisa (es decir, promotor, gen, terminador...), ya sea en cualquier región del genoma o en el locus mencionado anteriormente. Un locus se refiere a la ubicación física precisa e invariable de un gen en un cromosoma. Una cepa de levadura derivada de la transformación genética es una cepa de levadura en donde se ha introducido una secuencia de ADN, preferiblemente proporcionada por un plásmido o integrada directamente en el genoma.

[0094] Esquemáticamente, es posible distinguir cuatro fases durante la propagación de una cepa de levadura: la así denominada fase de “ latencia” , durante la cual no se detecta proliferación alguna y que se puede asimilar a un período de adaptación; a la que le sigue la “fase de proliferación” , durante la cual las células se multiplican a la máxima tasa de proliferación, y después la “fase estacionaria” , en la que entra el organismo fermentador cuando el período de proliferación máximo disminuye y después cesa. Y, por último, la fase de declive, durante la cual disminuirá el número de células viables. La propagación es generalmente un proceso aireado. La aerobiosis, o aireación del medio de propagación, garantiza un rendimiento de producción de biomasa mucho mayor que la anaerobiosis. Del mismo modo, también se pueden suministrar nutrientes al medio ambiente, tal como una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo o de minerales. Las vitaminas y compuestos orgánicos, tal como los aminoácidos o los ácidos nucleicos, rara vez se añaden a los medios industriales debido a su coste. Cuanto más rápida y corta sea la fase de proliferación, más se evitará la contaminación microbiana. Una contaminación excesiva de la propagación conducirá a pérdidas de rendimiento de producción durante la etapa de fermentación posterior. Para limitar las contaminaciones, se pueden utilizar antimicrobianos y antibióticos tales como la penicilina o tipo virginiamicina, o extractos ácidos de lúpulo.

[0095] La propagación SSP según la invención se debe realizar en microaerobiosis. Esto significa que el medio se airea, pero la cantidad de oxígeno suministrada es limitada. La presión de oxígeno disuelto es cero, a diferencia de la aerobiosis. El oxígeno disuelto en el medio de fermentación se mide con una sonda de oxígeno según un método conocido por los expertos en la técnica. La microaerobiosis en el método según la invención se obtiene mediante una aireación y agitación moderadas. Preferiblemente, la aireación es de 0,1 VVM (volumen de aire/volumen de medio/minuto, es decir, 60 ml para un reactor que contiene 600 ml de medio y por minuto) y la agitación se establece en alrededor de 500 rpm. En términos prácticos, la agitación depende de la escala a la que se aplique el método; es decir, el experto se adapta basándose en el material, el volumen de dicho material y el gasto energético aceptable. Cuanto mayor sea el volumen de trabajo, menor será la agitación.

[0097] La biomasa obtenida se puede investir entonces de un método de fermentación. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente a 32 0C, con una agitación moderada, por ejemplo, 90 rpm. La agitación es moderada para que no sea oxigenante. El pH del medio de fermentación se controla preferiblemente, por ejemplo, mediante la capacidad tamponadora de un par ácido/base. El pH teórico preferido del método según la invención es de 5,0. Cuando la fermentación tiene como objetivo producir etanol, la cantidad de etanol presente en el medio de fermentación se mide por cualquier medio adecuado conocido por el experto en la técnica. Esto puede ser una medición directa del etanol producido o una medición indirecta a través de un parámetro correlacionado con la producción de etanol, tal como la pérdida de masa. Por ejemplo, la producción de etanol se puede medir mediante cromatografía, especialmente mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), mediante un kit enzimático o mediante un ensayo de dicromato de potasio. La cantidad de xilosa y/o glucosa presente en el medio se mide por cualquier medio adecuado conocido por el experto en la técnica, preferiblemente por cromatografía, especialmente por HPLC.

[0099] El experto sabe cómo determinar las condiciones apropiadas para una fermentación alcohólica.

[0101] A modo de ejemplo, podemos remitirnos a las condiciones de fermentación alcohólica descritas en el libro de referencia “Yeast Technology” , 2.a edición, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.

[0103] El medio de fermentación comprende los siguientes elementos: al menos una fuente de carbono fermentable, al menos una fuente de nitrógeno, al menos una fuente de azufre, al menos una fuente de fósforo, al menos una fuente de vitaminas y/o al menos una fuente de minerales.

[0104] La fuente de carbono se suministra, por ejemplo, en forma de un azúcar que puede ser asimilado inmediatamente por la levadura, tal como xilosa, arabinosa, glucosa, fructosa o galactosa, un disacárido de tipo sacarosa y/o una mezcla de estos azúcares.

[0106] Estos azúcares se pueden suministrar en forma de jarabe, melaza, EP2 (drenaje pobre resultante de la segunda cristalización del azúcar), hidrolizados de la totalidad o parte de un material vegetal y/o una mezcla de los mismos.

[0107] La fuente de nitrógeno se suministra, por ejemplo, en forma de extractos de levadura, sulfato de amonio, hidróxido de amonio, fosfato diamónico, amoniaco, urea y/o una combinación de los mismos.

[0109] La fuente de azufre se suministra, por ejemplo, en forma de sulfato de amonio, sulfato de magnesio, ácido sulfúrico y/o una combinación de los mismos.

[0111] La fuente de fósforo se suministra, por ejemplo, en forma de ácido fosfórico, fosfato de potasio, fosfato diamónico, fosfato monoamónico y/o una combinación de los mismos.

[0113] La fuente de vitaminas se suministra, por ejemplo, en forma de solución de maíz macerado, melaza, hidrolizado de levadura, solución de vitaminas puras o una mezcla de vitaminas puras y/o una combinación de las mismas. La fuente de vitaminas proporciona a la levadura todas las vitaminas en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en las obras de referencia. Se pueden combinar varias fuentes de vitaminas.

[0115] La fuente de minerales se suministra, por ejemplo, en forma de melaza, una mezcla de sales minerales y/o una combinación de las mismas.

[0117] La fuente de minerales proporciona a la levadura la totalidad de los macroelementos y oligoelementos en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en las obras de referencia. Se pueden combinar varias fuentes de minerales.

[0119] Una misma sustancia puede proporcionar varios elementos diferentes.

[0121] La propagación según la invención está caracterizada por que la sacarificación y la propagación se realizan simultáneamente.

[0123] El subproducto vegetal crudo retratado se utiliza con un contenido de materia seca comprendido entre el 8 y el 15 %, preferencialmente entre el 10 y el 12 %, y de forma ventajosa el 10 %. Según una realización de la invención, el subproducto vegetal comprende alrededor de 1/3 de materia seca soluble (tipo “ jugo C5” ) y 2/3 de materia seca insoluble (tipo fibra lignocelulósica).

[0125] El subproducto vegetal crudo pretratado se pone en contacto con una población de levaduras capaces de metabolizar pentosas y hexosas. Las levaduras se añaden, preferencialmente en forma seca, a una tasa de 0,2 a 2 g/kg, es decir, a una tasa de 0,2 a 2 g de materia seca de levadura por kilogramo de medio completo preparado.

[0127] La mezcla de subproducto vegetal crudo pretratado y levaduras se complementa con una combinación de celulasas y hemicelulasas que permiten la sacarificación. La sacarificación corresponde a la hidrólisis de los polisacáridos en azúcares monoméricos solubles. Esto significa que la concentración de azúcares simples aumentaría en el medio si no fueran consumidos por las levaduras para su propagación, en paralelo a su liberación por las enzimas. Las celulasas permiten así la hidrólisis de la celulosa para obtener glucosa. Las exocelulasas o celobiohidrolasas actúan en los extremos de la celulosa para formar el disacárido celobiosa. Las endoglucanasas actúan mediante la escisión de los enlaces internos de la celulosa, formando oligosacáridos de celulosa. Las celobiasas o beta-glucosidasas hidrolizan los oligopolímeros celulósicos y la celobiosa por la liberación de celulosa en su extremo reductor.

[0129] Concretamente, el término celulasas agrupa una mezcla de proteínas enzimáticas. Preferiblemente, las enzimas se utilizan a una tasa de 5 a 15 mg de proteína (enzimas) por gramo de materia seca. De forma ventajosa, se utilizan a una tasa de 7 a 10 mg de proteínas (enzimas) por gramo de materia seca, preferencialmente 7 mg de proteínas enzimáticas por gramo de materia seca. Para permitir una comprensión correcta y una comparación entre las actividades de diferentes composiciones que tienen una actividad de tipo celulasa, se puede utilizar como referencia la actividad FPU (unidad de papel de filtro). La Comisión de Biotecnología de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) recomienda el siguiente procedimiento: La actividad FPU se mide en papel Whatman n.° 1 a una concentración inicial de 50 g.l-1. El objetivo es determinar mediante un ensayo colorimétrico (con ácido dinitrosalicílico, DNS) la cantidad de azúcares reducidos resultantes del papel Whatman n.° 1. A modo de ejemplo, se determina el muestreo de la solución enzimática que se va a analizar y que libera el equivalente a 2 g.l-1 de glucosa en 60 minutos. Las actividades específicas se obtienen dividiendo las actividades expresadas en Ul.ml-1 entre la concentración de proteína; se expresan en Ul.mg-1.

[0130] De forma ventajosa, la combinación de celulasas y hemicelulasas implementada en un método según la invención corresponde a una composición enzimática que tiene una o más actividades mejoradas con respecto a una composición que contiene proteínas producidas por el hongo nativo. Tales celulasas son conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, descritas por Durand y col., 1988 (Enzyme Microb. Technol., 10: 341-346). Según una realización preferida de la invención, las celulasas corresponden a una composición enzimática tal como se describe en la solicitud WO2010029259 A1, en particular, una composición enzimática producida por hongos filamentosos, preferiblementeTrichoderma reesei.

[0131] A continuación, la mezcla se incuba, en microaerobiosis, a una temperatura comprendida entre 25 0C y 38 0C, preferencialmente entre 28 0C y 33 0C, preferencialmente entre 30 0C y 32 0C.

[0132] De forma ventajosa, el pH de la solución es de aproximadamente 5,0.

[0133] La incubación se mantiene entre 24 y 50 horas, particularmente entre 28 y 50 horas, más preferencialmente entre 30 y 42 horas.

[0134] De forma ventajosa, la concentración de células objetivo (al final de la propagación) está entre 5,0 x 10<8>y 1,0 x 10<9>células por mililitro.

[0135] Las levaduras transformadas capaces de metabolizar tanto pentosas como hexosas se pueden obtener siguiendo los métodos descritos en las solicitudes de patente WO2010000464A1, WO2011128552A1 y WO2012072793A1. De forma ventajosa, dichas cepas también son resistentes al ácido acético, obtenidas según un método como se describe en la solicitud WO2013178915A1.

[0136] Según una realización de la invención, la cepa de levadura utilizada metaboliza preferencialmente xilosa y glucosa. En otras palabras, según una realización particular, la invención se refiere a un método para la fermentación de azúcares derivados de biomasa lignocelulósica, preferencialmente pentosas y hexosas, utilizando un microorganismo fermentador, caracterizado por que dicho microorganismo se ha producido directamente en subproducto vegetal crudo pretratado, según un método de sacarificación y propagación simultáneas.

[0137] En el contexto de la invención, la cepa de levadura sometida a propagación y sacarificación simultáneas según la invención es una de las cepas depositadas ante la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15) el 24 de mayo de 2012 con los números I-4624, I-4625, I-4626, I-4627 o la cepa depositada el 26 de junio de 2013 con el número I-4783.

[0138] Según una realización preferida de la invención, la propagación SSP precede a una etapa de fermentación.

[0139] La presente invención también se refiere a un método para producir al menos un producto de fermentación que comprende una etapa de fermentación, en condiciones anaeróbicas o semiaeróbicas, mediante una levadura propagada en subproducto vegetal crudo pretratado según un método en donde la sacarificación y la propagación se llevan a cabo simultáneamente.

[0140] El producto de fermentación se selecciona especialmente de entre etanol, un metabolito obtenido de entre etanol o un metabolito secundario.

[0141] Un producto de fermentación preferido según la invención es el etanol.

[0142] La invención se puede entender mejor a la luz de los siguientes ejemplos, que no son en modo alguno limitativos. Ejemplo 1: Condiciones de pretratamiento y análisis de la composición de sustrato

[0143] El sustrato utilizado para estos ensayos es subproducto vegetal de paja de trigo crudo resultante de un pretratamiento según el siguiente método: la paja triturada se impregna en agua ácida entre 0,1 y 2,0 % en peso de H<2>SO<4>, se pretrata después mediante explosión continua de vapor a aproximadamente el 50 % de la materia seca durante 1 a 10 min entre 170 0C y 190 0C, preferiblemente a 180 0C.

[0144] Este subproducto vegetal de paja crudo se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y los contenidos de azúcar e inhibidores se muestran en la Tabla 1.

[0145] Tabla 1: Composición del subproducto vegetal de paja utilizado en el presente estudio. Concentraciones en g/kgConcentraciones de subproducto vegetal crudo en g/kg Contenido de MS (%)46,02 %

[0146] Azúcares

[0147] Celulosa 170

[0148] Concentraciones de subproducto vegetal crudo en g/kgCelobiosa 4

[0149] Glucosa 9,7

[0150] Xilosa 93,8

[0151] Galactosa NC

[0152] Arabinosa 10,9

[0153] Manosa 2,1

[0154] Compuestos inhibidores

[0155] Ácido láctico 0,7

[0156] Ácido acético 3,6

[0157] Ácido fórmico 0,6

[0158] 5-HMF 0,4

[0159] Furfural 0,2

[0161] NC significa “ no cuantificado” , es decir, que no se ha medido.

[0163] El análisis del sustrato mostró contenidos clásicos de ácido acético y furfural. El contenido en materia seca del subproducto vegetal de paja crudo es igual al 46,0 %. En la mayoría de los ensayos de propagación realizados posteriormente, este sustrato se utilizó al 10 % de materia seca, lo que corresponde a una dilución en un factor de 4,6 de las concentraciones indicadas anteriormente durante la implementación en el reactor, mientras que los otros dos sustratos presentados en la tabla, a saber, el hidrolizado y el jugo C5, se utilizaron sin dilución adicional.

[0165] Los siguientes experimentos se llevaron a cabo con la levaduraSaccharomyces cerevisiaedepositada ante la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15) el 26 de junio de 2013, con el número I-4783. Los métodos utilizados se describen a continuación en la memoria. A modo de comparación, otra cepa de levadura capaz de metabolizar pentosas y hexosas arrojaría resultados similares.

[0167] Los métodos de referencia utilizan sustratos líquidos, a saber hidrolizado lignocelulósico, que requiere una etapa de hidrólisis del subproducto vegetal pretratado antes de la propagación, o jugo C5 (también denominado hidrolizado hemicelulósico), que requiere una etapa de separación de los azúcares solubles del subproducto vegetal en la salida del pretratamiento.

[0169] Por el contrario,el protocolo de sacarificación y propagación simultáneas (SSP) según la invención utiliza el sustrato sólido de subproducto vegetal crudo pretratado.

[0171] Ejemplo 2: Métodos de referencia

[0173] 2.1. Protocolos

[0175] Se añadieron agentes antibacterianos y nutrientes al jugo C5 y al hidrolizado lignocelulósico, respectivamente, en cantidades adaptadas a la levadura depositada ante la CNCM con el número I-4783 utilizada en estos ensayos, a saber:

[0177] NH<4>OH 25 %

[0179] Urea

[0181] H<3>PO<4>85 %

[0183] Mezcla de minerales

[0185] Agentes antibacterianos

[0187] La composición de la mezcla de minerales se muestra en la Tabla 2. El experto en la técnica sabrá cómo adaptar las proporciones para una eficiencia óptima.

[0189] Tabla 2: Composición de la mezcla de minerales

[0191] Componente

[0192] MgSO4.7H2O

[0193] Componente

[0195] CUSO<4>.2H<2>Ó"

[0196] MnCÍ<2>.4H<2>O

[0197] ZnSÓ<4>.7H<2>Ó

[0198] Los reactores se inocuÍaron a una tasa de 0,4 g/kg de levadura seca y se mantuvieron a una temperatura de 30 0C. EÍ pH se mantuvo en 5,0 añadiendo KOH y H<2>SO<4>.

[0199] Para Ías condiciones de microaerobiosis, se estableció un caudal de aire de 0,1 VVM (volumen de aire/voÍumen de medio/minuto) y una agitación de 500 rpm.

[0200] A modo orientativo, un caudal de aire de 0,1 VVM equivale a 60 ml/min para un reactor que contenga 600 ml de medio.

[0201] 2.2. Resultados

[0202] 2.2.1. Propagación en hidrolizado lignocelulósico (SHF)

[0203] La cinética de la proliferación de la levadura, el consumo de sustrato y la producción de etanol durante la propagación de la levadura en condiciones microaeróbicas (0,1 VVM) en el hidrolizado lignocelulósico se presenta en la Figura 2. Este ensayo de propagación duró 46,1 h, pero la Figura 2 muestra que la proliferación de la levadura fue completa después de aproximadamente 27 h de cultivo. EÍ contenido final de biomasa producida se estima en 3,9-10<8>células/ml. La glucosa se consumió preferencialmente a la xilosa, tal cual suele ocurrir cuando hay exceso de glucosa. Se produjeron 18 g/kg de etanol. Nota: La viabilidad de la levadura durante la propagación no se representa en la figura para facilitar la lectura. Después de Ías primeras horas de cultivo, es superior al 95 % en todos los ensayos presentados en estos ejemplos.

[0204] 2.2.2. Propagación en jugo C5

[0205] La cinética de la proliferación de la levadura, el consumo de sustrato y la producción de etanol durante la propagación de la levadura en condiciones microaeróbicas (0,1 VVM) en jugo C5 se presenta en la Figura 3.

[0206] Este ensayo de propagación en jugo C5 muestra una fase de Íatencia más larga (que la del ensayo en hidrolizado lignocelulósico); después, la biomasa aumenta rápidamente hasta alcanzar 7,5 10<8>células/ml tras 41 h de cultivo. Se produjeron 10 g/kg de etanol.

[0207] Ya se ha observado la diferencia en el contenido final de biomasa. Generalmente, los rendimientos de producción de levadura son superiores durante la propagación en jugo C5 que durante la propagación en hidrolizado lignocelulósico, que se compone principalmente de azúcar C6 (glucosa).

[0208] Ejemplo 3: Sacarificación y propagación simultáneas (SSP)

[0209] 3.1. Método SSP según la invención

[0210] EÍ método de sacarificación y propagación simultáneas también se aplica en un reactor que comprende:

[0211] Agua, subproducto vegetal celulósico crudo pretratado (sustrato sólido) implementado al 10 % o al 12 % de materia seca (MS) respectivamente en la mayoría de los ensayos, y nutrientes como se ha indicadoanteriormentepara los métodos de referencia.

[0212] La propagación se inició mediante la adición simultánea de celulasas (a 7 y 10 mg de proteína por gramo de MS, respectivamente) y levadura seca a 0,4 g/kg. Las enzimas utilizadas en los presentes ejemplos se pueden sustituir por enzimas comerciales en cantidades equivalentes. A modo de comparación, la actividad específica de la FPasa (véase la unidad de papel de filtromás arriba)de Ías celulasas utilizadas en los ejemplos está entre 0,8 y 1,5 Ul.mg<-1>. Pueden sustituirse por enzimas comerciales en Ías mismas cantidades (en lU.mg<-1>.

[0213] La temperatura se mantuvo a 30 0C o 32 0C, respectivamente.

[0214] El pH se mantuvo en 5,0 añadiendo KOH y H<2>SO<4>.

[0215] Para Ías condiciones de microaerobiosis, se estableció un caudal de aire de 0,1 VVM (volumen de aire/voÍumen de medio/minuto) y una agitación de 500 rpm.

[0216] Se tomaron muestras durante los diversos ensayos de propagación, para recontar las levaduras y cuantificar los azúcares y los productos de fermentación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

[0217] Se llevaron a cabo hidrolisis enzimáticas totales en las muestras finales para determinar el contenido de celulosa no hidrolizada al final de la propagación.

[0218] 3.2. Pares de contenido de materia seca (MS)/dosis de enzimas

[0219] Se ensayaron diversos pares de dosis de enzimas y MS en SSP. Los requisitos previos eran: (i) una concentración de azúcares fermentables que permitiera alcanzar un contenido de biomasa de 15 g/kg al final de la propagación; (ii) una cinética de hidrólisis de la celulosa que debe limitar la cantidad de glucosa, tal como (1) el flujo de carbono se dirija hacia la producción de biomasa en lugar de hacia la producción de etanol, que podría tener lugar, incluso en presencia de oxígeno, si la concentración de azúcar es demasiado alta, y (2) se favorezca el uso de xilosa sin penalizar la productividad; y (3) la viscosidad de la mezcla, que debe permitir una agitación moderada y una microaireación del medio.

[0220] Los contenidos de MS y las dosis de enzimas ensayadas se muestran en la Tabla 3.

[0221] Tabla 3: Contenido de MS y dosis de enzimas ensayadas en SSP

[0222] Ensayo % de contenido de MS Dosis de enzimas mg prot./g MS

[0223] 1 10 10

[0224] 2 12 10

[0225] 3 10 7

[0226] Recordatorio: al igual que con los métodos de referencia(arriba),estos ensayos de propagación se sembraron con 0,4 g/kg de levadura seca, y después se llevaron a cabo a un pH de 5,0, 30 °C, con agitación moderada a 500 rpm y microaireación de 0,1 VVM.

[0227] 3.2.1. Propagación en SSP al 10 % de MS y 10 mg de proteína enzimática/g de MS

[0228] Se sometió la levadura I-4783 a propagación en condiciones microaeróbicas (0,1 VVM) en subproducto vegetal de paja crudo (al 10 % de MS), en presencia de celulasas (10 mg de proteínas/g de MS) que permiten llevar a cabo simultáneamente la hidrólisis de la celulosa. La cinética de la proliferación de la levadura y la producción de etanol, así como la evolución de las concentraciones de glucosa y xilosa durante la propagación de la levadura, se representan en la Figura 4.

[0229] Resultado: este ensayo de propagación duró 41 h, al final de las cuales se obtuvieron 5,6-108 células/ml. Se produjeron 11 g/kg de etanol, que se consumieron después parcialmente durante esta propagación en SSP en subproducto vegetal de paja crudo. Adicionalmente, el contenido de MS utilizado permitió añadir la totalidad del sustrato a la base inicial del tanque, manteniendo una baja viscosidad que permitió una agitación moderada y una microaireación del medio de cultivo. El experimento se repitió prolongando la proliferación más allá de las 41 h. Los resultados (no se muestran) fueron los siguientes: se obtuvieron 6,5-108 células/ml después de 48 h de cultivo y la cinética de proliferación se superpuso a la obtenida previamente en las mismas condiciones de operación.

[0230] 3.2.2. Propagación en SSP al 12 % de MS y 10 mg de proteína enzimática/g de MS

[0231] Se sometió la levadura I-4783 a propagación en condiciones microaeróbicas (0,1 VVM) en subproducto vegetal de paja crudo (al 12 % de MS), en presencia de celulasas (10 mg de proteínas/g de MS) que permiten llevar a cabo simultáneamente la hidrólisis de la celulosa. La cinética de la proliferación de la levadura y la producción de etanol, así como la evolución de las concentraciones de glucosa y xilosa durante la propagación de la levadura, se representan en la Figura 5.

[0232] Resultado: este ensayo de propagación duró 46,3 h, al final de las cuales se obtuvieron 5,8-108 células/ml. Se produjeron 15 g/kg de etanol, que se consumieron después parcialmente durante esta propagación en SSP en subproducto vegetal de paja crudo.

[0233] El aumento del contenido de MS del 10 % al 12 % no provocó un aumento significativo de la viscosidad que pudiera perturbar la agitación moderada y la microaireación del medio de cultivo.

[0234] 3.2.3. Propagación en SSP al 10 % de MS y 7 mg de proteína enzimática/g de MS

[0235] Se sometió la levadura I-4783 a propagación en condiciones microaeróbicas (0,1 VVM) en subproducto vegetal de paja crudo (al 10 % de MS), en presencia de celulasas (7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS) que permiten llevar a cabo simultáneamente la hidrólisis de la celulosa. La cinética de la proliferación de la levadura y la producción de etanol, así como la evolución de las concentraciones de glucosa y xilosa durante la propagación de la levadura, se representan en la Figura 6.

[0236] Resultado: este ensayo de propagación duró 43,9 h, al final de las cuales se obtuvieron 8,3-108 células/ml. Se produjeron 9,3 g/kg de etanol, que se consumieron después totalmente durante esta propagación en SSP en subproducto vegetal de paja crudo.

[0237] Explicación

[0238] La comparación de los rendimientos obtenidos en los ensayos de SSP realizados con diferentes contenidos de MS y dosis de enzimas muestra que:

[0239] - El aumento del contenido de MS del 10 al 12 % en los ensayos realizados con 10 mg de proteína/kg de MS conduce a un aumento de la producción de etanol, pero no tiene un impacto positivo en la proliferación de la levadura.

[0240] - La reducción de la dosis de enzima de 10 a 7 mg de proteína enzimática/g de MS para los ensayos realizados al 10 % de MS conduce a una limitación superior de la glucosa, lo que se traduce en un consumo más rápido de xilosa y un flujo de carbono más orientado hacia la producción de biomasa. La diferencia en el rendimiento de la hidrólisis debido a la reducción de la dosis de enzima es menor del 2 % al final de la propagación.

[0241] 3.3. Efecto de la temperatura

[0242] Para observar el efecto de la temperatura en la eficiencia de la propagación en SSP, se propagó la levadura I-4783 a 32 0C en condiciones microaeróbicas (0,1 VVM) en subproducto vegetal de paja crudo (al 10 % de MS) en presencia de celulasas (a 10 mg de proteína/g de MS). La cinética de la proliferación de la levadura y la producción de etanol, así como la evolución de las concentraciones de glucosa y xilosa durante este ensayo de propagación, se representan en la Figura 7.

[0243] Resultado: este ensayo de propagación duró 42,6 h. Se observó una ralentización de la proliferación al final del cultivo. Se produjeron 12 g/kg de etanol, que después se consumieron parcialmente. La biomasa final se estimó en 5,7-108 células/ml.

[0244] La Figura 8 compara la evolución de la población de levadura, así como la de las concentraciones de xilosa y etanol, para los ensayos SSP realizados a 30 0C y 32 0C respectivamente, al 10 % de MS y 10 mg de proteínas/g de MS. No se observó ningún efecto positivo sobre la proliferación de la levadura.

[0245] Al parecer, el aumento de la temperatura puede promover la absorción de xilosa, lo que se traduce en una cinética más rápida de la producción de etanol.

[0246] El aumento de la temperatura mejora la hidrólisis enzimática y aumenta la cantidad de azúcares fermentables (en este caso, en un 12 %). Si el mosto de propagación se transfiere íntegramente para iniciar las fermentaciones alcohólicas, los azúcares residuales, cualquiera que sea su forma, representan una pequeña proporción y se utilizarán durante la fermentación alcohólica.

[0247] 3.4. Ensayo de robustez del proceso: Ensayos del SSP en presencia de una alta concentración de acetato Con el fin de evaluar la robustez del proceso SSP, se realizaron ensayos con la adición de acetato al medio (QS (cantidad suficiente para) 3 g/kg) para simular una toxicidad superior del subproducto vegetal pretratado. Estos ensayos se realizaron a un pH de 5,0, 30 0C, con un 10 % de MS y unas relaciones de enzima/sustrato iguales a 7 mg de proteína/g de MS y 10 mg de proteína/g de MS. El aumento del contenido de acetato en el medio de cultivo de 0,7 g/kg a 3 g/kg corresponde a un aumento del contenido de ácido acético del subproducto vegetal pretratado de 3,6 g/kg a 13,8 g/kg.

[0248] Esta última concentración deja un margen significativo para el aumento del contenido de compuestos volátiles de los sustratos pretratados cuando se avanza a la escala industrial.

[0249] La cinética de proliferación de la levadura, así como el cambio en las concentraciones de xilosa y etanol durante los ensayos de propagación realizados con y sin la adición de acetato al 10 % de MS y 7 mg de proteína/g de MS, se ilustran en la Figura 9.

[0250] La comparación de la cinética del SSP realizada en presencia de 0,7 g/kg o 3,0 g/kg de ácido acético, respectivamente, muestra que el aumento de la concentración de acetato ralentiza el uso de xilosa y resulta en un retardo visible de la proliferación hasta las 25 h de cultivo. El flujo de carbono se desvía levemente hacia la producción de etanol. Sin embargo, la diferencia en la concentración de biomasa desaparece al final del cultivo: se obtuvieron 8,0-108 células/ml en 42,5 h para el ensayo con 3,0 g/kg de acetato, mientras que se obtuvieron 8,3-108 células/ml en 43,9 h para el ensayo con 0,7 g/kg de acetato.

[0251] La cinética de proliferación de la levadura, así como el cambio en las concentraciones de xilosa y etanol durante los ensayos de propagación realizados con y sin la adición de acetato al 10 % de MS y 10 mg de proteína/g de MS, se ilustran en la Figura 10.

[0252] La comparación de la cinética del SSP realizada en presencia de 0,7 g/kg o 3,0 g/kg de ácido acético, respectivamente, muestra que el aumento de la concentración de acetato resulta en un retraso visible de la proliferación hasta las 30 h de cultivo y que e] flujo de carbono se desvía levemente hacia la producción de etanol. Al final de la propagación, el contenido de biomasa producido en presencia de 3 g/kg de acetato supera la referencia: se obtuvieron 6.9- 108 células/ml en 46,7 h frente a 6,5-108 células/ml en 48,1 h para el ensayo sin adición de acetato. Estos resultados muestran que el aumento significativo de la cantidad de ácido acético en el subproducto vegetal de paja pretratado no degrada significativamente los rendimientos del proceso de propagación SSP. No se puede esperar tal robustez del proceso de propagación de levadura en jugo C5, ya que la fermentación de xilosa se ve mucho más afectada que la fermentación de glucosa por la toxicidad del medio de cultivo.

[0253] Una vez más, se ensayaron dos relaciones enzima/sustrato. Los resultados son coherentes con los obtenidos anteriormente(arriba),a saber, la reducción de la dosis de enzima mejora el rendimiento del proceso SSP.

[0254] Ejemplo 4: Comparación del rendimiento de proliferación del SSP según la invención con el obtenido con los métodos de referencia

[0255] Se compara la evolución de la población de levadura con la obtenida con los métodos de referencia, en condiciones idénticas de temperatura, pH, microaireación, agitación moderada y tasa de siembra. Las cantidades de azúcares fermentables son del mismo orden de magnitud.

[0256] 4.1. Comparación con la propagación en hidrolizado lignocelulósico (SHF)

[0257] La evolución de la población de levaduras durante la propagación en hidrolizado lignocelulósico y los ensayos SSP, con y sin adición de acetato, al 10 % de MS y 7 mg de proteína/g de MS se representa en la Figura 11.

[0258] Resultado y explicación

[0259] Los sustratos respectivos para el ensayo de propagación en hidrolizado lignocelulósico y el ensayo de propagación en SSP sin adición de acetato son idénticos, con una diferencia: uno se ha hidrolizado previamente. La proliferación es más lenta en el hidrolizado, y desde el inicio mismo de la propagación, lo que se puede explicar por un contenido de acetato levemente superior debido a la hidrólisis más completa del sustrato al inicio del cultivo (1,0 g/kg frente a 0,7 g/kg en SSP); la presión osmótica debida a los azúcares también es superior. Además de su mejor cinética, la propagación en SSP permite obtener una cantidad de biomasa mucho mayor (8,3-108 células/ml frente a 3.9- 108 células/ml).

[0260] De forma adicional, es sorprendente observar que el ensayo de propagación en SSP realizado en presencia de 3 g/kg de acetato también fue mejor que el ensayo de referencia.

[0261] 4.2. Comparación con la propagación en jugo C5

[0262] La evolución de la población de levaduras durante los ensayos de propagación en jugo C5 y SSP, con y sin adición de acetato, al 10 % de MS y 7 mg de proteína enzimática/g de MS se muestran en la Figura 12.

[0263] Resultado y explicación

[0264] La propagación realizada en jugo C5 tiene una cinética de proliferación significativamente más lenta que los ensayos de propagación SSP en subproducto vegetal crudo; sin embargo, el aumento de la velocidad de proliferación al final de la propagación le permite alcanzar un contenido final de biomasa equivalente al de las propagaciones SSP. No obstante, si se redujera el tiempo de propagación con respecto al ensayo presentado, aumentaría la ventaja de la propagación SSP sobre la propagación en jugo C5.

[0265] El jugo C5 utilizado para este ensayo de propagación resultó en el mismo subproducto vegetal de paja de trigo celulósico que el utilizado para los ensayos de propagación SSP. Se obtuvo mediante la suspensión del subproducto vegetal celulósico en agua y, a continuación, la separación sólido/líquido. Este método para obtener jugo C5 extrae todos los elementos solubles del subproducto vegetal pretratado; por lo tanto se puede considerar y se ha verificado que el contenido de inhibidores es proporcional a la concentración de xilosa, lo que convierte al jugo C5 en el sustrato más concentrado en términos de inhibidores. Es más, el hecho de que la absorción de xilosa se vea más afectada por la toxicidad del medio que el consumo de glucosa y que el aumento de la toxicidad del subproducto vegetal pretratado conduzca a un aumento más rápido del contenido de inhibidores en el jugo C5 (ya que es proporcional al contenido de xilosa) significa que la ventaja del método SSP aumentará con la toxicidad del subproducto vegetal pretratado. Por lo tanto, el aumento del contenido de acetato de 0,7 g/kg a 3,0 g/kg en la base del tanque de SSP, lo que degrada levemente la cinética de proliferación en SSP, corresponde a un aumento del contenido de acetato de 1,6 g/kg a aproximadamente el 7 g/kg en el jugo C5, lo que penaliza fuertemente la proliferación de la levadura.

[0266] 4.3. Resumen y comparación de los resultados de propagación

[0267] La Tabla 4 proporciona para cada ensayo de propagación realizado:

[0268] - la concentración de azúcar implementada en el medio de cultivo (cantidad total y cantidad fermentable para ensayar en SSP),

[0269] - la concentración final de biomasa obtenida (en células/ml),

[0270] - el rendimiento de la producción de biomasa (referido al contenido de azúcar fermentable y referido al contenido de MS),

[0271] - una estimación del rendimiento de producción de levadura en g de levadura/g de azúcares fermentables.

[0272] Tabla 4: Cantidades de azúcares implementadas, concentraciones de biomasa obtenidas y rendimientos de producción de biomasa para los diferentes ensayos de propagación (cél. significa células, masa ini. y masa fin. significan masa inicial y masa final, respectivamente)

[0274]

[0276] Observaciones:

[0277] - El potencial de azúcar se calcula suponiendo un rendimiento de hidrólisis de la celulosa igual al 100 %.

[0278] - La cantidad de azúcares fermentables se calcula en función de la estimación de la cantidad de celulosa residual mediante hidrólisis enzimática total en una muestra tomada al final del cultivo.

[0279] - Para la estimación del rendimiento de la producción de biomasa en g de levadura/g de azúcares fermentables, la conversión se realiza considerando que 1 g de levadura contiene 4,8-1010 células (medidas al final de la propagación en jugo C5).

[0281] - La masa final medida es anormalmente baja para los ensayos de propagación realizados al 10 % de MS con 10 mg de proteína a 30 °C, lo que las penaliza durante el cálculo del rendimiento.

[0283] Resultados y explicación

[0285] La Tabla 4 muestra que la mayor concentración final de biomasa se obtuvo con el método SSP aplicado al 10 % de MS y 7 mg de proteína/g de MS. El contenido final de biomasa obtenido en el jugo C5 es similar al obtenido con el método SSP en las mejores condiciones, mientras que la propagación en hidrolizado lignocelulósico conduce a un contenido final de biomasa significativamente inferior al de todos los demás ensayos.

[0287] El cálculo del rendimiento de la producción de levadura es igual a 1,6-1010 células/g de azúcares fermentables para el ensayo con mejor rendimiento realizado en SSP con un 10 % de MS y 7 mg de proteína/g de MS a 30 °C (y 1,5-1010 células/g de azúcares fermentables para el ensayo realizado con una concentración de ácido acético mayor). El rendimiento de propagación en jugo C5 es levemente inferior: se obtuvieron 1,4-1010 células/g de azúcares fermentables. Las demás condiciones de SSP ensayadas muestran rendimientos de producción de levadura cercanos a 1,0-1010 células/g de azúcares fermentables, mientras que el ensayo de referencia realizada con hidrolizado lignocelulósico muestra un rendimiento de 5,9-109 células/g de azúcares fermentables, es decir, a aproximadamente 3 veces menor que el ensayo de SSP que mostró los mejores resultados.

[0289] Para comparar con referencias conocidas, el rendimiento de biomasa se estima en g de levadura/g de azúcar fermentable basándose en un número de conversión de células/g de MS obtenido al final de la propagación alcohólica en jugo C5. Según los datos conocidos por los expertos en la técnica, la propagación de referencia en hidrolizado lignocelulósico tiene un rendimiento del orden de 0,12 g/g.

[0291] La mejor condición de SSP permitió obtener 0,33 g de levadura/g de azúcares fermentables. La tasa de multiplicación de la levadura propagada es entonces superior a 40 (concentración final estimada de 17,4 g/kg de levadura).

[0293] En términos de productividad, el método de propagación SSP es también el más eficiente, de hecho:

[0295] - La productividad volumétrica promedio se estima en 0,38 g de levadura/kg de mosto/h para el método SSP, frente a 0,37 g/kg/h y 0,17 g/kg/h respectivamente para las propagaciones en jugo C5 y en hidrolizado lignocelulósico.

[0297] - La productividad volumétrica promedio durante las primeras 30 horas de cultivo se estima en 0,33 g de levadura/kg de mosto/h para el método SSP, frente a 0,26 g/kg/h para las propagaciones en jugo C5 y en hidrolizado lignocelulósico.

[0299] Ejemplo 5: Validación del método de propagación SSP: rendimiento de la levadura propagada en fermentación SSCF

[0300] La presente invención es un eslabón intermedio esencial en un proceso industrial de fermentación alcohólica en su conjunto. El objetivo del presente ejemplo es validar que la levadura obtenida a partir de una propagación según la invención resulta eficiente en la fermentación alcohólica en sustrato lignocelulósico.

[0302] Se utilizó la levadura I-4783 propagada en SSP para sembrar una fermentación SSCF (sacarificación y cofermentación simultáneas); ambos cultivos se llevaron a cabo en subproducto vegetal de paja crudo. La SSCF se llevó a cabo al 24 % de MS con 10 mg de proteína/g de MS, añadiendo acetato al medio (QS 4 g/kg). El reactor se sembró con 2,4-107 células/ml (es decir, a aproximadamente el 0,5 g/kg de levadura) y el medio se mantuvo a un pH de 5,5 y 33 °C durante 142,5 h. La evolución de las concentraciones de glucosa, xilosa y etanol durante esta fermentación se ilustra en la Figura 13.

[0304] Esta fermentación SSCF presenta una cinética coherente con la que se obtiene usualmente. La levadura consume muy rápidamente la glucosa liberada por las enzimas, de modo que la concentración de glucosa es cero dentro de las primeras horas de fermentación. La xilosa liberada se consume mayoritariamente en el transcurso de 72 h; la cinética de la producción de etanol se ve entonces limitada por la hidrólisis enzimática. El contenido final de etanol es igual a 67,4 g/kg, lo que corresponde a una diferencia menor del 5 % con la concentración obtenida como resultado de las SSCF realizadas sin adición de acetato con levadura I-4783 propagada en jugo C5. Basándose en este resultado, se puede concluir que el método de propagación según la invención no degrada el rendimiento de la levadura producida con respecto a un método de propagación en jugo C5 utilizado usualmente.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

i. Un método para propagar levadura, para su uso en la producción de un producto de fermentación a partir de biomasa lignocelulósica, que comprende las etapas de:

a. proporcionar un reactor,

b. poner en contacto en dicho reactor:

- una población de levaduras capaces de metabolizar pentosas y hexosas, con 0,2 a 2,0 g de materia seca de levadura por kg de medio completo preparado, donde las levaduras de la población son levaduras de una cepa de levadura seleccionada de entre las cepas depositadas ante la CNCM con los siguientes números: I-4624, I-4625, I-4626, I-4627 e I-4783,

- subproducto vegetal crudo procedente del pretratamiento de la biomasa lignocelulósica sin etapas de hidrólisis o separación, con un contenido de materia seca (MS) entre el 8 % y el 15 %,

- nutrientes, y

- celulasas, con 5 a 15 mg de proteína por gramo de MS,

c. incubar la mezcla a una temperatura de entre 25 °C y 38 °C, preferiblemente entre 28 °C y 33 °C, en microaerobiosis,

en donde se llevan a cabo simultáneamente la sacarificación del subproducto vegetal crudo y la proliferación de las levaduras.

2. El método de propagación según la reivindicación 1, en donde las pentosas son xilosa y/o arabinosa.

3. El método de propagación según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la hexosa es glucosa.

4. El método de propagación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se mantiene la incubación en la etapa c. hasta obtener una concentración de células de entre 5,0 x 108 y 1,0 x 109 células por mililitro.

5. El método de propagación según la reivindicación 1, en donde las levaduras se siembran a una tasa de 0,3 a 0,6 g/kg en forma de levaduras secas, el subproducto vegetal crudo se utiliza a una tasa del 10 % de MS y las celulasas a una tasa de 7 mg de proteínas por gramo de MS, la tasa de aireación se fija en 0,1 volumen de aire/volumen de medio/minuto (VVM), la temperatura se fija en 30 0C y el pH del medio se fija en pH 5,0.

6. Un método para producir un producto de fermentación a partir de una biomasa lignocelulósica, que comprende secuencialmente las etapas de:

a. pretratar la biomasa lignocelulósica sin ninguna etapa de hidrólisis o separación para obtener un subproducto vegetal crudo,

b. poner en contacto una fracción del subproducto vegetal crudo pretratado, con un 10 % a un 12 % de materia seca (MS), con (i) una población de levaduras capaces de metabolizar pentosas y hexosas, donde las levaduras de la población son levaduras de una cepa de levadura seleccionada de entre las cepas depositadas ante la CNCM con los siguientes números: I-4624, I-4625, I-4626, I-4627 e I-4783, (ii) celulasas con 5 a 15 mg de proteína por gramo de MS, y (iii) opcionalmente, nutrientes,

c. incubar la mezcla a una temperatura de entre 25 °C y 38 °C, preferiblemente entre 28 °C y 33 °C, en microaerobiosis, de modo que se obtenga una sacarificación y propagación simultáneas, hasta obtener una concentración de células de entre 5,0 x 108 y 1,0 x 109 células por mililitro, d. transferir la totalidad o parte de las levaduras propagadas para que entren en contacto con el mosto de fermentación que comprende una fuente de pentosas y una fuente de hexosas, e. llevar a cabo la fermentación, en condiciones anaeróbicas o semiaeróbicas, y f. obtener el producto de la fermentación.

7. El método según la reivindicación 6, en donde la biomasa lignocelulósica es una biomasa de origen vegetal.

8. El método según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el producto de fermentación obtenido es etanol.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde las levaduras de la población implementada son levaduras de la cepa depositada ante la CNCM con el número I-4783.