ES3047779T3

ES3047779T3 - Probiotic bacterial communities for use in the treatment of a liver disease

Info

Publication number: ES3047779T3
Application number: ES22844182T
Authority: ES
Inventors: De Wiele Tom Van; Iris Pinheiro; Sam Possemiers; Selin Bolca; Joana Lopes; Suchita Panda
Original assignee: Mrm Health N V; Universiteit Gent
Current assignee: Mrm Health N V; Universiteit Gent
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2025-12-04
Anticipated expiration: 2042-12-26
Also published as: US20250302894A1; CA3242616A1; EP4456905B1; JP2025500546A; CN118647388A; WO2023126384A1; EP4456905A1; AU2022426633A1; IL313908A; EP4456905C0; KR20240130121A; EP4456905B8

Abstract

Se describe aquí una composición que comprende dos o más cepas bacterianas pertenecientes a al menos dos de los siguientes géneros: Faecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, Lactiplantibacillus o Anaerostipes. Los aspectos aquí descritos pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades o afecciones hepáticas, o de sus síntomas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Comunidades bacterianas probióticas para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática

[0003] Campo

[0004] Los aspectos y las formas de realización descritos en este documento se refieren al campo de las composiciones microbianas para la salud humana y animal.

[0005] Antecedentes

[0006] La enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) es la hepatopatía crónica más común y su prevalencia global se estima en torno al 25 %, donde Oriente Medio y Sudamérica registran la mayoría de los casos, mientras que África tiene presenta la prevalencia más baja.(l) Las EHGNA se considera la manifestación hepática del síndrome metabólico, y sus comorbilidades comunes incluyen obesidad, diabetes tipo 2, hiperlipidemia e hipertensión.(2) La prevalencia de la EHGNA y sus comorbilidades asociadas está aumentando (1,3), y, como resultado, la EHG<n>A se está convirtiendo rápidamente en una importante carga económica y social.(4) La EHGNA se puede clasificar, además, en hígado graso no alcohólico (HGNA), también conocido como esteatosis simple, y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), caracterizada por la presencia de inflamación hepática. La EHNA es una forma agresiva de la enfermedad que puede progresar a fibrosis hepática, cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular (CHC).(2) La desregulación metabólica es un sello distintivo de la EHGNA. La resistencia a la insulina, la hiperlipidemia o la dislipidemia son características comunes y, por lo tanto, los moduladores lipídicos, tales como las tiazolidinadionas (TZD), se han probado con éxito en ensayos clínicos humanos para el tratamiento de la EHGNA. Sin embargo, se han constatado efectos secundarios significativos, como aumento de peso, retención de líquidos y riesgo de infarto de miocardio.(6-8) Además, hasta el momento, la EHNA no cuenta con una farmacoterapia aprobada.

[0007] Se ha descrito la transferencia de materia fecal recogida de ratas delgadas a ratas con EHNA alimentadas con una dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa (HFGFD, por sus siglas en inglés) (9). Sin embargo, no se observaron cambios significativos en la histología. El hecho de que la transferencia fecal o el trasplante microbiano fecal (TMF) sea un procedimiento poco caracterizado conlleva riesgos de transmisión de enfermedades infecciosas y plantea dudas sobre su aplicabilidad en patologías menos agudas y potencialmente mortales. De hecho, es poco probable que el TMF se convierta en una opción terapéutica a largo plazo, especialmente considerando la naturaleza crónica y progresiva de esta enfermedad.

[0008] El documento WO2017/134240 describe un consorcio que consiste esencialmente enFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarumyAnaerostipes caccae,y su uso en trastornos gastrointestinales.

[0009] El documento US 2019/117709 A l se refiere a un método y sistema para reducir la probabilidad de desarrollar cáncer de hígado en una persona diagnosticada con enfermedad de hígado graso no alcohólico y menciona una composición bacteriana que incluyeF. PrausnitziiyAkkermansia muciniphila.

[0010] El documento EP 3690026 A2 describe los efectos de las cepas deRoseburiaen la enfermedad de hígado graso alcohólico.

[0011] Resumen

[0012] Cualquier referencia en esta descripción a métodos para tratar una enfermedad debe interpretarse como referencia a compuestos, agentes o composiciones (como se describe aquí) para su uso en esos métodos.

[0013] En vista de lo anterior, aún existe la necesidad de mejores medios y métodos que puedan usarse para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar patologías hepáticas o afecciones y síntomas asociados, y que no presenten todos los inconvenientes de las terapias existentes.

[0014] Se ha descubierto sorprendentemente que combinaciones específicas de bacterias tienen efectos beneficiosos particulares y sorprendentes en la salud de animales y seres humanos. En particular, como se explica en otras partes del presente documento y en la parte experimental, se ha descubierto que las composiciones descritas en este documento ejercen al menos los siguientes efectos beneficiosos: reducción del aumento de peso, reducción de los niveles de insulina, reducción de los niveles de glucosa, reducción de la resistencia a la insulina, reducción de la presión portal y la resistencia vascular intrahepática, contrarresto de la disfunción endotelial, reducción de la inflamación del hígado, reducción de la esteatosis, reducción de la balonización hepatocelular y reducción de la fibrosis, entre otros.

[0015] En consecuencia, los aspectos y las formas de realización descritos en este documento resuelven al menos algunos de los problemas y las necesidades analizados aquí.

[0016] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a una composición que comprende: al menos una cepa bacteriana deFaecalibacterium prausnitzii;

[0017] al menos una cepa bacteriana deButyricicocccus pullicaecorum;

[0018] al menos una cepa bacteriana deRoseburia inulinivorans;

[0019] al menos una cepa bacteriana deAkkermansia muciniphila;

[0020] al menos una cepa bacteriana deLactiplantibacillus plantarum;y

[0021] al menos una cepa bacteriana deAnaerostipes caccae,

[0022] para su uso en un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), la fibrosis hepática, la cirrosis hepática y/o el carcinoma hepatocelular (CHC).

[0023] La invención también se refiere a una composición que comprende cepas bacterianas pertenecientes a las especiesFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Phocaeicola vulgatus, Veillonella parvulayBlautia obeum.

[0024] DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

[0025] Los cultivos purificados de las cepas microbianas LMG P-29362, LMG P29360, LMG P-29365, LMG P-29361, LMG P-29366 y LMG P29359 descritas en la presente solicitud fueron depositados por Prodigest (Technologiepark 3, 9052 Zwijnaarde, Bélgica; dirección actual: Technologiepark 82, 9052 Zwijnaarde, Bélgica) en el BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent), K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica, reconocido como autoridad internacional de depósito por el Tratado de Budapest y la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual. Los depósitos originales se realizaron el 18 de enero de 2016.

[0026] Descripción

[0027] La divulgación técnica que se presenta a continuación puede exceder, en algunos aspectos, el alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.

[0028] Composiciones

[0029] En un aspecto útil para la comprensión de la invención, se proporciona una composición que comprende dos o más cepas bacterianas de al menos dos de los siguientes géneros:Faecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes.En otras palabras, esto significa que la composición comprende como mínimo dos cepas bacterianas, ambas de un género diferente seleccionado de entreFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes.Por lo tanto, por ejemplo, una composición que comprende tres cepas bacterianas puede comprender dos cepas de un género y una tercera cepa de un género diferente, o alternativamente, tres cepas de un género diferente. Preferiblemente, dicha composición se utiliza en un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado o un síntoma de la misma. Las enfermedades y afecciones del hígado, así como sus síntomas, se describen con más detalle en otra parte del presente documento (véase la sección "métodos y usos").

[0030] El géneroLactiplantibacillusse incluyó previamente en el géneroLactobacillus(Zheng et al. Int J Syst EvoI Microbiol 2020;70(4):2782-2858).

[0031] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, una composición, como se describe en este caso, puede comprender tres o más, preferiblemente cuatro o más o, más preferiblemente, cinco o más cepas bacterianas de al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco de los siguientes géneros:Faecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes.

[0032] Según la invención, se proporciona una composición que comprende seis o más cepas bacterianas de los siguientes géneros:Faecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes.Por lo tanto, dichas composiciones comprenden al menos una cepa bacteriana de cada uno de dichos seis géneros. En algunas formas de realización, una composición puede comprender o consistir esencialmente en una cepa de cada uno de dichos seis géneros.

[0033] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones proporcionadas en este documento son tales que comprenden al menos una cepa bacteriana perteneciente al géneroFaecalibacteriumy al menos una cepa bacteriana perteneciente al géneroAnaerostipes.

[0034] [0020] Una cepa bacteriana, como se utiliza en este documento, se puede entender como una variante genética o un subtipo de un microorganismo. Varias cepas diferentes pueden pertenecer a la misma especie bacteriana. A lo largo de esta divulgación, el término "cepa bacteriana" también puede sustituirse por el término "bacteria" o "miembro bacteriano". En cualquiera de las composiciones proporcionadas en este documento, las cepas bacterianas pueden aislarse o purificarse, por ejemplo, a partir de una fuente, como un cultivo o una muestra de microbiota (por ejemplo, materia fecal). Como se utiliza en este documento, los términos "aislado/a(s)" y "purificado/a(s)" se refieren a una bacteria, cepa bacteriana, miembro bacteriano o una composición de los mismos que se ha separado de una o más sustancias asociadas presentes en un material de origen o cualquier material asociado a las bacterias en cualquier proceso usado para producir la preparación, como otra bacteria o cepa bacteriana, uno o más componentes de un medio de cultivo y/o uno o más componentes de una muestra, como una muestra fecal. En algunas formas de realización, las bacterias están "sustancialmente aisladas" o "sustancialmente purificadas", por ejemplo, a partir de una fuente, de modo que no se detectan otros componentes de la fuente.

[0035] Como se ha descrito anteriormente, las composiciones descritas en este documento pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes.En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas se seleccionan de entre especies particulares dentro de dichos géneros. Según la invención, una especie deFaecalibacteriumesFaecalibacterium prausnitzii.Una especie deButyricicocccusesButyricicocccus pullicaecorum.Una especie deRoseburiaesRoseburia inulinivorans.Una especie deAkkermansiaesAkkermansia muciniphila.Una especie deLactiplantibacillusesLactiplantibacillus plantarum.Una especie deAnaerostipesesAnaerostipes caccae.

[0036] Las especies descritas anteriormente son bien conocidas por un experto en la materia. En particular, las especies bacterianasFaecalibacterium prausnitzii(Duncan et al. Int J Syst EvoI Microbiol. 2002;52: 2141-2146),Butyricicoccus pullicaecorum(Eeckhaut et al. Int J Syst EvoI Microbiol. 2008;58:2799-2802),Roseburia inulinivorans(Duncan et al. Int J Syst EvoI Microbiol. 2006;56:2437-2441),Akkermansia muciniphila(Derrien et al. Int J Syst EvoI Microbiol. 2004;54:1469-1476),Lactiplantibacillus plantarum(Walter. Appl Environ Microbiol 2008;74:4985-4996) yAnaerostipes caccae(Schwiertz et al. Syst Appl Microbiol 2002; 25:46-51) son especies bacterianas bien conocidas por un experto en la materia. La especieLactiplantibacillus plantarumse conocía anteriormente comoLactobacillus plantarum(Zheng et al. Int J Syst EvoI Microbiol 2020;70(4):2782-2858).

[0037] En consecuencia, en algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona una composición que comprende dos o más cepas bacterianas de al menos dos de las siguientes especies:Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarumyAnaerostipes caccae.

[0038] Como se ha indicado anteriormente, las composiciones descritas en este documento pueden comprender, en algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, al menos una cepa bacteriana perteneciente al géneroFaecalibacteriumy al menos una cepa bacteriana perteneciente al géneroAnaerostipes.En consecuencia, en algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones descritas en este documento comprenden al menos una cepa bacteriana perteneciente a la especieFaecalibacterium prausnitziiy al menos una cepa bacteriana perteneciente al géneroAnaerostipes caccae.

[0039] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, una composición, como se describe en este caso, puede comprender tres o más, preferiblemente cuatro o más o, más preferiblemente, cinco o más cepas bacterianas pertenecientes a al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco de las siguientes especies:Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarumyAnaerostipes caccae.

[0040] Según la invención, se proporciona una composición que comprende seis o más cepas bacterianas pertenecientes a las siguientes especies:Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarumyAnaerostipes caccae.

[0041] Por lo tanto, dichas composiciones comprenden al menos una cepa bacteriana de cada una de dichas seis especies. En algunas formas de realización, una composición puede comprender o consistir esencialmente en una cepa de cada una de dichas seis especies.

[0042] Como se ha descrito anteriormente, las composiciones descritas en este documento pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a las especiesFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarumyAnaerostipes caccae.En algunos aspectos, las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas se seleccionan de entre cepas particulares dentro de dichas especies.

[0043] Las cepas preferidas deFaecalibacterium prausnitziison LMG P-29362 deFaecalibacterium prausnitziiy DS<m>Z 17677 deFaecalibacterium prausnitzii,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de al menos una de dichas cepas, por ejemplo SEQ ID NO: 4.

[0044] Las cepas preferidas deButiricicoccus pullicaecorumson LMG P-29360 deButiricicoccus pullicaecorumy LMG24109 deButiricicoccus pullicaecorum,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de al menos una de dichas cepas, por ejemplo SEQ ID NO: 6.

[0045] Las cepas preferidas deRoseburia inulinivoransson LMG P-29365 deRoseburia inulinivoransy DSMZ 16841 deRoseburia inulinivorans,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de al menos una de dichas cepas, por ejemplo SEQ ID NO: 1.

[0046] Las cepas preferidas deAkkermansia muciniphilason LMG P-29361 deAkkermansia muciniphilay DSMZ 22959 deAkkermansia muciniphila,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de al menos una de dichas cepas, por ejemplo SEQ ID NO: 2.

[0047] Las cepas preferidas deLactiplantibacillus plantarumson LMG P-29366 deLactiplantibacillus plantarumy ZJ316 deLactiplantibacillus plantarum,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de al menos una de dichas cepas, por ejemplo SEQ ID NO: 5.

[0048] Las cepas preferidas deAnaerostipes caccaeson LMG P-29359 deAnaerostipes caccaey DSMZ 14662 deAnaerostipes caccae,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de al menos una de dichas cepas, por ejemplo SEQ ID NO: 3.

[0049] En algunas formas de realización, las cepas anteriormente mencionadas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con una secuencia de ARNr o ADNr 16S particular (como SEQ ID NO: 1-6) pueden mostrar un 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 % o 99,5 % de identidad de secuencia con dicho ARNr o ADNr 16S (como SEQ ID NO: 1-6).

[0050] Como se utiliza en este documento, el término "ARN ribosómico 16S" o "ARNr 16S" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que es un componente de la subunidad ribosómica pequeña procariota (30S). Se sabe que el ARNr 16S actúa como una estructura de base que define las posiciones de las proteínas ribosómicas. Los genes que codifican se denominan genes ARNr 16S o ADNr 16S y se utilizan comúnmente en estudios filogenéticos, ya que se sabe que son secuencias muy conservadas.

[0051] Es bien conocido por un experto en la materia que las secuencias de ARNr o ADNr 16S pueden depositarse en bases de datos de secuencias en línea, por ejemplo en GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.ggov/genbank/) y que pueden recuperarse, basándose en su número de acceso único, para su uso como secuencia de ARNr o ADNr 16S de referencia en la evaluación de la homología de secuencia, como describen, por ejemplo, Eeckhaut et al. Int J Syst Evol Microbiol 2008;58:2799-2802. A continuación, se mencionan los números de acceso de GenBank para las secuencias de ARNr 16S de algunas de las cepas bacterianas aquí presentadas. Estos números de registro se puede usar para recuperar las secuencias de ARNr 16S respectivas en http://www.ncbi.nlm.nih.qov/genbank/ para evaluar la homología de secuencias.

[0052] DSMZ 16841 deRoseburia inulinivorans:AJ270473.3 (SEQ ID NO: 1)

[0053] DSMZ 22959 deAkkermansia muciniphila:AY271254.1 (SEQ ID NO: 2)

[0054] DSMZ 14662 deAnaerostipes caccae:AJ270487.2 (S<e>Q ID NO: 3)

[0055] DSMZ 17677 deFaecalibacterium prausnitzii:AJ270469.2 (SEQ ID NO: 4)

[0056] ZJ316 deLactiplantibacillus plantarum:JN126052.1 (SEQ ID NO: 5)

[0057] LMG 24109 deButyricicoccus pullicaecorum:HH793440.1 (SEQ ID NO: 6)

[0058] Las cepas indicadas anteriormente que tienen los números de acceso LMG P-29362, LMG P29360, LMG-29365, L<m>G-29361, LMG-29366 y LMG P29359 se han depositado en el BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent), K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica.

[0059] Las cepas indicadas anteriormente que tienen los números de acceso DSMZ 17677, LMG24109, DSMZ 16841, DSMZ 22959, ZJ316 y DSMZ 14662 se han depositado en colecciones públicas, se han descrito extensamente y son fácilmente accesibles para expertos de todo el mundo.

[0060] Producción de butirato

[0061] [0040] En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende al menos una cepa bacteriana capaz de producir butirato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende al menos dos, al menos tres o al menos cuatro cepas bacterianas capaces de producir butirato.

[0062] En algunas formas de realización, cualquiera de las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, puede ser una cepa bacteriana capaz de producir butirato. En algunas formas de realización, al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas de los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, pueden ser una cepa bacteriana capaz de producir butirato En algunas formas de realización, todas las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, pueden ser una cepa bacteriana capaz de producir butirato.

[0063] Se sabe que las cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, RoseburiayAnaerostipesson capaces de producir butirato. En particular,Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivoransyAnaerostipes caccaeson especies capaces de producir butirato.

[0064] Se sabe queRoseburia inulinivoransproduce tanto butirato como propionato.

[0065] En algunas formas de realización, se proporcionan en el presente documento composiciones como las descritas anteriormente, donde se añaden cepas bacterianas adicionales capaces de producir butirato. En este contexto, se prefieren las bacterias intestinales comensales capaces de producir butirato.

[0066] Como se utiliza en este documento, se puede entender que una cepa bacteriana capaz de producir butirato se refiere a una cepa bacteriana que posee al menos una de las vías de producción de butirato en su genoma. Existen cuatro vías de producción de butirato en bacterias (véase, por ejemplo, la figura 1 en Vital et al. mBio 2014,5(2):e00889-14). Estas vías utilizan uno de cuatro sustratos, es decir, piruvato, glutarato, 4-aminobutirato y lisina. Todas las vías convergen en un paso central de generación de energía, donde el crotonil-CoA se transforma en butiril-CoA, catalizado por el complejo flavoproteico de transferencia de electrones butiril-CoA deshidrogenasa (Bcd-EtfaP). La producción final de butirato es catalizada por la butiril-CoA:acetato-CoA transferasa (But) o la butirato quinasa (Buk).

[0067] El experto en la materia entiende que, en cualquier configuración experimental, una cepa bacteriana capaz de producir butirato, como se describe en este documento, puede producir butirato o no, dependiendo de las condiciones de prueba, incluido, por ejemplo, el medio de cultivo.

[0068] La presencia de estas vías en bacterias se puede evaluar mediante métodos genéticos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Reichardt et al. The ISME Journal 2014;8:1323-1335. Como ejemplo, la presencia de un gen marcador se puede detectar mediante PCR, métodos basados en secuenciación o usando herramientas filogenéticasin silico.Un gen marcador adecuado para la presencia de la vía de la butirato quinasa es la butirato quinasa (Buk). Un gen marcador adecuado para la presencia de la vía de la butiril-CoA:acetato-CoA-transferasa es la butiril-CoA:acetato-CoA-transferasa (bCoAT o But). Como alternativa, o adicionalmente, la producción de butirato se puede evaluar mediante análisis químico de muestrasin vitro, in vivooin situusando métodos conocidos por un experto en la materia, incluida la cromatografía de gases (CG), la cromatografía líquida (CL), la resonancia magnética nuclear (RMN) y la electroforesis capilar (EC).

[0069] Producción de propionato

[0070] Como se muestra en la parte experimental, se ha descubierto sorprendentemente que la adición de al menos una cepa bacteriana adicional capaz de producir propionato o un precursor de propionato a las composiciones anteriormente descritas en este documento presenta ventajas específicas.

[0071] En consecuencia, en algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende al menos una cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro o más preferiblemente al menos cinco cepas bacterianas capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

[0072] [0050] En algunas formas de realización, cualquiera de las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, puede ser una cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, pueden ser una cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, todas los dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, pueden ser una cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato.

[0073] Se sabe que las cepas bacterianas pertenecientes a los génerosRoseburiayAkkermansiason capaces de producir propionato. En particular,Roseburia inulinivoransyAkkermansia muciniphilason especies capaces de producir propionato.

[0074] Se sabe queRoseburia inulinivoransproduce tanto butirato como propionato.

[0075] En algunas formas de realización, una composición como la descrita en el presente documento es tal que comprende al menos una cepa bacteriana capaz de producir butirato y al menos una cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en el presente documento es tal que comprende al menos dos cepas bacterianas capaces de producir butirato y al menos dos cepas bacterianas capaces de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en el presente documento es tal que comprende al menos tres cepas bacterianas capaces de producir butirato y al menos tres cepas bacterianas capaces de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en el presente documento es tal que comprende al menos cuatro cepas bacterianas capaces de producir butirato y al menos cuatro cepas bacterianas capaces de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en el presente documento es tal que comprende al menos cuatro cepas bacterianas capaces de producir butirato y al menos cinco cepas bacterianas capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

[0076] Las composiciones preferidas comprenden al menos cuatro bacterias capaces de producir butirato y al menos dos bacterias capaces de producir propionato o un precursor de propionato. Composiciones más preferidas comprenden cuatro bacterias capaces de producir butirato y tres, preferiblemente cuatro, más preferiblemente cinco, bacterias capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

[0077] Se ha observado que, en general, la capacidad de producir propionato o butirato a partir de azúcares reside en diferentes especies; sin embargo, se conocen algunas excepciones. Las excepciones notables que son capaces de producir tanto butirato como propionato son, por ejemplo, las cepas bacterianas deRoseburia inulinivorans.

[0078] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, cualquier composición que comprende dos o más cepas bacterianas de al menos dos de los siguientes géneros:Faecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusoAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, comprende, además, al menos una cepa bacteriana adicional capaz de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende, además, al menos dos cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende, además, al menos tres cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato. En formas de realización preferidas, una composición como la descrita en este documento es tal que comprende, además, tres cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

[0079] En este contexto, se prefieren las bacterias intestinales comensales capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

[0080] En algunas formas de realización, la(s) cepa(s) bacteriana(s) adicional(es) capaz/capaces de producir propionato o un precursor de propionato pertenece(n) a la familiaVeillonellaceae, Akkermansiaceae, LachnospiraceaeoBacteroidetes,preferiblementeVeillonellaceae, LachnospiraceaeoBacteroidetes.

[0081] Un género preferido de la familiaVeillonellaceaeesVeillonella.Las especies preferidas sonVeillonella parvulayVeillonella atypica.

[0082] Un género preferido de la familiaAkkermansiaceaeesAkkermansia.Una especie preferida esAkkermansia muciniphila.

[0083] Los géneros preferidos de la familiaLachnospiraceaesonBlautiayRoseburia.Las especies preferidas dentro deBlautiasonBlautia obeum, Blautia wexlerae y Blautia luti.Una especie preferida dentro deRoseburiaButyricicoccus pullicaecorum esRoseburia inulinivorans.

[0084] Un género preferido de la familiaBacteroidetesesPhocaeicola.

[0085] Una especie preferida dentro dePhocaeicolaesPhocaeicola vulgatus.

[0086] En consecuencia, en algunas formas de realización, la(s) cepa(s) bacteriana(s) adicional(es) capaz/ces de producir propionato o un precursor de propionato, como se describe en este caso, es una cepa bacteriana del géneroVeillonella, Akkermansia, Blautia, RoseburiaoPhocaeicola.

[0087] En formas de realización preferidas, la(s) cepa(s) bacteriana(s) adicional(es) capaz/capaces de producir propionato o un precursor de propionato, como se describe en este caso, es una cepa bacteriana del géneroPhocaeicola, VeillonellaoBlautia.

[0088] En formas de realización preferidas, la(s) cepa(s) bacteriana(s) adicional(es) capaz/capaces de producir propionato o un precursor de propionato, como se describe en este caso, es una cepa bacteriana de las especiesPhocaeicola vulgatus, Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.

[0089] Se sabe que las cepasBlautia wexleraeyBlautia lutiproducen el precursor de propionato succinato.

[0090] En formas de realización más preferidas, una composición que comprende dos o más cepas bacterianas de al menos dos de los siguientes géneros:Faecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusoAnaerostipes,como se describe en otra parte del presente documento, comprende, además:

[0091] -Phocaeicola vulgatus;

[0092] - Veillonella parvulaoVeillonella atypica;y

[0093] -Blautia obeum, Blautia wexlerae

oBlautia luti.

[0094] En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este documento es una composición que comprende cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,preferiblemente pertenecientes a las especiesFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarumyAnaerostipes caccae,y que, además, comprende al menos dos cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato. Se entiende que dicha composición puede comprender un total de 8 cepas (en caso de incluir una cepa de cada género/especie) o puede comprender un total de más de 8 cepas (por ejemplo, si se incluyen más cepas de uno/a de los géneros/las especies).

[0095] En algunas formas de realización, las al menos dos cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato pueden ser tres cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

[0096] En algunas formas de realización, las dos o más cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato pueden pertenecer al géneroPhocaeicola, Veillonella o Blautia, preferiblemente a las especies Phocaeicola vulgatus, Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.

[0097] En algunas formas de realización, una composición como la descrita este caso es una composición que comprende cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, LactiplantibacillusyAnaerostipes,preferiblemente pertenecientes a las especiesFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarumyAnaerostipes caccae,donde la composición comprende, además:

[0098] -Phocaeicola vulgatus;

[0099] - Veillonella parvulaoVeillonella atypica; y

[0100] - Blautia obeum, Blautia wexlerae o Blautia luti.

[0101] En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este caso es una composición que comprende cepas bacterianas pertenecientes a los génerosFaecalibacterium, Butyricicocccus, Roseburia, Akkermansia, Lactiplantibacillus, AnaerostipesyPhocaeicola,y al menos una de las siguientes:VeillonellaoBlautia.Se prefiere una composición que comprende cepas bacterianas pertenecientes a las especiesFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarum, Anaerostipes caccaeyPhocaeicola vulgatus,y al menos una de las siguientes:Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluirVeillonella,preferiblementeVeillonella parvulaoVeillonella atypica.En otros casos, los miembros bacterianos pueden incluirBlautia,preferiblementeBlautia obeum,Blautia wexlerae oBlautia luti.En otros casos, los miembros bacterianos pueden incluir tantoVeillonellacomoBlautia,preferiblementeVeillonella parvulaoVeillonella atypica;yBlautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.

[0102] En algunas formas de realización, la(s) cepa(s) bacteriana(s) adicional(es) capaz/capaces de producir propionato o un precursor de propionato, como la(s) descrita(s) en este caso, se selecciona(n) de entre cepas particulares de las especies anteriormente mencionadas. Una cepa preferida dePhocaeicola vulgatuses LMG17767 dePhocaeicola vulgatus,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de dicha cepa (SEQ ID NO: 7).

[0103] Una cepa preferida deVeillonella parvulaes DSM 2007 deVeillonella parvula,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de dicha cepa (SEQ ID NO: 8)

[0104] Una cepa preferida deBlautia obeumes DSM 25238 deBlautia obeum,y cepas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ARNr o ADNr 16S de dicha cepa (SEQ ID NO: 9).

[0105] En algunas formas de realización, las cepas anteriormente mencionadas que tienen secuencias de ARNr o ADNr 16S que muestran al menos un 97 % de identidad de secuencia con una secuencia de ARNr o ADNr 16S específica (como la SEQ ID NO: 7-9) pueden mostrar un 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 % o 99,5 % de identidad de secuencia con dicho ARNr o ADNr l6S (como la SEQ ID NO: 7-9).

[0106] Las cepas indicadas anteriormente que tienen los números de acceso LMG17767, DSM 2007 y DSM 25238, se han depositado en colecciones públicas, se han descrito extensamente y son fácilmente accesibles para expertos de todo el mundo.

[0107] Como se utiliza en este documento, se puede entender que una cepa bacteriana capaz de producir propionato se refiere a una cepa bacteriana que presenta al menos una de las vías de producción de propionato en su genoma, como la vía del acrilato, la vía del propanodiol y la vía del succinato (véase la figura 1 en Reichardt et al. The ISME Journal 2014;8:1323-1335).

[0108] Como se utiliza en este documento, se puede entender que una cepa bacteriana capaz de producir precursor de propionato se refiere a una cepa bacteriana que presenta al menos una de las vías de producción de un precursor de propionato en su genoma. Un precursor de propionato puede ser cualquier precursor o intermediario metabólico en cualquiera de las diferentes vías de producción de propionato. En algunas formas de realización, un precursor de propionato, como se describe en este caso, se puede seleccionar del grupo que consiste en: acrilato, aspartato, fumarato, malato, 2-oxoglutarato, ácido oxalacético y succinato. En formas de realización preferidas, un precursor de propionato, como se describe en este documento, es succinato.

[0109] El experto en la materia entiende que, en cualquier configuración experimental determinada, una cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato, como se describe en este caso, puede producir propionato o el precursor de propionato, o no, dependiendo de las condiciones probadas, incluido, por ejemplo, el medio de cultivo. Esto podría deberse, por ejemplo, a que algunas de las vías de producción de propionato requieren sustratos específicos. Por ejemplo, algunas cepas deBlautia,comoBlautia obeum,producen propionato a partir de fucosa.

[0110] La presencia de vías de propionato en bacterias se puede evaluar mediante métodos genéticos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Reichardt et al. The ISME Journal 2014;8:1323-1335. Como ejemplo, la presencia de un gen marcador se puede detectar mediante PCR, métodos basados en secuenciación o usando herramientas filogenéticasin silico.Un gen marcador adecuado para la presencia de la vía del acrilato es la lactoil-CoA deshidratasa (IcdA). Un gen marcador adecuado para la presencia de la vía del succinato es la metilmalonil-CoA descarboxilasa (mmdA). Un gen marcador adecuado para la presencia de la vía del propanodiol es la propionaldehído deshidrogenasa o la propanol deshidrogenasa (pduP, pduQ).

[0111] Como alternativa, o adicionalmente, la producción de propionato (o precursor de propionato) se puede evaluar mediante análisis químico de muestrasin vitro, in vivooin situusando métodos conocidos por un experto en la materia, incluida la cromatografía de gases (CG), la cromatografía líquida (CL), la resonancia magnética nuclear (RMN) y la electroforesis capilar (EC).

[0112] En conjunto, cualquier cepa bacteriana capaz de producir butirato, como se describe en este caso, se puede seleccionar de entre los siguientes géneros:Butyricicocccus, Roseburia y Anaerostipes;y de las siguientes especies:Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivoransyAnaerostipes caccae.

[0113] De manera similar, cualquier cepa bacteriana capaz de producir propionato o un precursor de propionato, como se describe en este caso, se puede seleccionar de entre las siguientes familias:Veillonellaceae, Akkermansiaceae, LachnospiraceaeyBacteroidetes;los siguientes géneros:Roseburia, Akkermansia, Veillonella, BlautiayPhocaeicola;y las siguientes especies:Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Phocaeicola vulgatus, Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeyBlautia luti. Otros componentes

[0114] En otro aspecto, las composiciones descritas aquí pueden comprender, además, uno o más prebióticos. El término "prebiótico" se refiere a cualquier sustancia química que es capaz de inducir el crecimiento o la actividad de microorganismos (por ejemplo, bacterias) que contribuyen al bienestar de su huésped. Por lo tanto, los prebióticos pueden influir o alterar la composición de los organismos en la microbioma intestinal. Sin embargo, en principio, es un término más general que también puede referirse a otras áreas del cuerpo. Por lo general, pero no de manera limitante, los prebióticos son compuestos de fibra no digeribles que pasan, al menos parcialmente, sin digerir, a través de la parte superior del tracto gastrointestinal y estimulan el crecimiento o la actividad de bacterias beneficiosas que colonizan el intestino grueso actuando como sustrato para ellas.

[0115] En otro aspecto, las composiciones descritas en este documento pueden comprender, además, uno o más agentes terapéuticos. En algunas formas de realización, dicho agente terapéutico se selecciona de entre estatinas (por ejemplo, simvastatina), otras terapias hipolipemiantes, terapias no hipolipemiantes, agonistas del receptor de GLP-1 (por ejemplo, semaglutida, dulaglutida, liraglutida), inhibidores de SGLT1/2 (por ejemplo, licoglifozina), inhibidores de S<g>LT2, inhibidores de DPP-4 (por ejemplo, itagliptina, saxagliptina, linagliptina, alogliptina), agonistas de FXR (por ejemplo, OCA, tropifexor, cilofexor), inhibidores de la apoptosis (por ejemplo, selonsertib, emricasan), agentes antiinflamatorios (por ejemplo, pentoxifilina), fármacos antihipertensivos como bloqueadores del receptor de angiotensina, antagonistas de CCR2/5 (por ejemplo, cenicriviroc), inhibidores de ACC (por ejemplo, firsocostat), agentes de estrés antioxidante (por ejemplo, vitamina E, UDCA) y agonistas de PPAR, como las tiazolidinedionas (TZD) (por ejemplo, pioglitazona).

[0116] En formas de realización preferidas, dicho agente terapéutico se selecciona de entre estatinas (por ejemplo, simvastatina), agonistas del receptor de GLP-1 (por ejemplo, semaglutida, dulaglutida, liraglutida), inhibidores de SGLT2 y agonistas de PPAR, como las tiazolidinedionas, (por ejemplo, pioglitazona). Un ejemplo preferido de un agonista del receptor de GLP-1 es la liraglutida. En formas de realización preferidas, dicho agente terapéutico es un agonista de PPAR, como una tiazolidinediona (también conocida como glitazona) (por ejemplo, pioglitazona).

[0117] Composiciones específicas y productos derivados

[0118] En algunas formas de realización, las composiciones descritas en este documento pueden ser composiciones farmacéuticas, es decir, una composición que comprende, además, ingredientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico.

[0119] Como se utiliza en este documento, el término "ingredientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico" incluye sustancias de transporte, rellenos, conservantes, solubilizantes, vehículos, diluyentes y/o excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico. En consecuencia, el uno o más ingredientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico se puede(n) seleccionar del grupo que consiste en sustancias de transporte, rellenos, conservantes, solubilizantes, vehículos, diluyentes (por ejemplo, almidón, derivados de celulosa o derivados de azúcar) y/o excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Dicha/os sustancias de transporte, rellenos, conservantes, solubilizantes, vehículos, diluyentes y/o excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 23.a edición. Elsevier (2020).

[0120] Las composiciones descritas en este documento se pueden formular para proporcionar un efecto terapéutico rápido y eficiente. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este caso se puede formular para administración a los intestinos, por ejemplo, formulada como una composición para administración rectal o para administración oral, preferiblemente para administración oral.

[0121] En algunas formas de realización, las composiciones descritas en este documento se pueden formular como cápsula, microcápsula, comprimido, gránulo, polvo, trocisco, píldora, suplemento alimenticio, suspensión, supositorio o jarabe y similares, preferiblemente como polvo, suspensión, comprimido o suplemento alimenticio. En algunas formas de realización, las composiciones como las descritas en este caso pueden presentarse en una forma de dosificación de suspensión.

[0122] En algunas formas de realización, las composiciones (farmacéuticas) descritas en este documento se pueden formular como una composición para administración rectal. A este respecto, cualquiera de las composiciones descritas aquí puede presentarse como una forma de dosificación (farmacéutica) para administración rectal, como un supositorio.

[0123] En algunas formas de realización, las composiciones (farmacéuticas) descritas en este documento se pueden formular como una composición para administración oral, como una cápsula, microcápsula, un comprimido, gránulo, polvo, trocisco, una píldora, un suplemento alimenticio, una suspensión o un jarabe.

[0124] En algunas formas de realización, las composiciones descritas en este documento pueden comprender bacterias o bacterias liofilizadas proporcionadas en un formato de cultivo activo. En formas de realización preferidas, las bacterias pueden liofilizarse.

[0125] En algunas formas de realización, las composiciones descritas aquí se pueden incorporar en un producto alimenticio, una bebida, un suplemento dietético o nutracéutico. Por lo tanto, los aspectos de la presente descripción también proporcionan productos alimenticios, bebidas, suplementos dietéticos y nutracéuticos que comprenden cualquiera de las composiciones descritas en este documento. También se incluyen dentro del alcance de la presente descripción los productos alimenticios, las bebidas, los suplementos dietéticos y nutracéuticos que comprenden cualquiera (o combinaciones) de las cepas bacterianas descritas en este documento. Un "producto alimenticio" es típicamente un material comestible compuesto principalmente por uno o más macronutrientes: proteínas, carbohidratos y grasas. Un alimento también puede contener uno o más micronutrientes, tales como vitaminas o minerales. Los ejemplos de alimentos en los que se puede incorporar la composición incluyen barritas, cereales, bollos, magdalenas, galletas, tortas, pasteles, verduras procesadas, dulces, formulaciones probióticas, incluidos yogures, bebidas, líquidos a base de aceites vegetales, líquidos a base de grasas animales, dulces congelados y quesos. Los alimentos preferidos incluyen yogures, quesos y otros productos lácteos.

[0126] Entre los ejemplos de bebidas se incluyen refrescos, jarabes, jugos concentrados para diluir, mezclas de bebidas secas y bebidas nutricionales.

[0127] Un nutracéutico es un ingrediente alimentario, un suplemento alimenticio o un producto alimenticio que se considera que proporciona un beneficio médico o para la salud, incluidos la prevención y el tratamiento de enfermedades. Los nutracéuticos también se denominan a veces "alimentos funcionales", es decir, alimentos que se comercializan generalmente por ofrecer beneficios para la salud que van más allá de la nutrición pura.

[0128] La divulgación también proporciona un probiótico que comprende una composición descrita en este documento. Un probiótico es normalmente un suplemento vivo que puede mejorar la microbiota intestinal. Dichos probióticos pueden administrarse particularmente a seres humanos, pero también a animales de granja y domésticos, así como a organismos acuáticos. El probiótico puede comprender, además, uno o más excipientes o saborizantes aceptables, que sean adecuados para la ingestión por un ser humano o animal.

[0129] En algunas formas de realización, las composiciones como las descritas en este caso comprenden al menos 10^2, preferiblemente al menos 10^3, más preferiblemente al menos 10^4, incluso más preferiblemente al menos 10A5 UfC de bacterias. En algunas formas de realización, las composiciones como las descritas en este caso comprenden entre 10A2 y 10^14, preferiblemente entre 10A3 y 10^13, más preferiblemente entre 10A4 y 10^12, incluso más preferiblemente entre 10A5 y 10^11 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias. En algunas formas de realización, las composiciones como las descritas en este caso comprenden al menos 10A5 unidades formadoras de colonias de bacterias, por ejemplo entre 10A5 y 10^11 unidades formadoras de colonias de bacterias.

[0130] Se entiende que, con respecto a cualquiera de las composiciones proporcionadas a lo largo de esta divulgación, el término "que comprende(n)" puede ser reemplazado por el término "que consiste(n) esencialmente en" o "que consiste(n)". En otras palabras, en algunas formas de realización, las composiciones proporcionadas en este documento consisten esencialmente en las cepas bacterianas proporcionadas, o consisten en las cepas bacterianas proporcionadas.

[0131] Además de las composiciones como las descritas en este caso, un aspecto preferido de esta divulgación también se refiere a las mismas composiciones para su uso en cualquiera de los métodos descritos más adelante (véase la sección "métodos y usos”).

[0132] Métodos para obtener composiciones: y composiciones obtenidas mediante ellos

[0133] En algunas formas de realización, las composiciones como las proporcionadas aquí se pueden obtener mediante los métodos descritos en esta sección. En algunas formas de realización, las composiciones como las proporcionadas aquí se pueden obtener mediante los métodos descritos en esta sección. En otras palabras: en algunas formas de realización, las cepas bacterianas comprendidas en las composiciones proporcionadas aquí se someten previamente a los métodos descritos en esta sección. En este contexto, también se puede decir que las cepas bacterianas están "preadaptadas" o "acondicionadas" mediante cualquiera de los métodos descritos en esta sección.

[0134] Los métodos proporcionados en esta sección confieren ciertas características ventajosas a las composiciones de esta divulgación. En particular, el inicio del efecto de la composición en un huésped será más rápido y/o la efectividad puede ser mayor, es decir, proporcionan un efecto terapéutico rápido y eficiente.

[0135] Más específicamente, las composiciones "preadaptadas" o "acondicionadas" pueden reducir significativamente el tiempo de inicio del efecto bioterapéutico, lo que significa que, al estar preadaptadas, el conjunto de microorganismos puede ejercer su funcionalidad al menos un 5 % más rápido (a escala temporal), preferiblemente al menos un 10 % más rápido, más preferiblemente al menos un 20 % más rápido y, de la manera más preferible, al menos un 30 % más rápido, en comparación con un conjunto de las mismas cepas poco ensamblado. Las composiciones "preadaptadas" o "acondicionadas" también pueden aumentar significativamente el efecto del tratamiento, lo que significa que, al estar preadaptadas, el conjunto de microorganismos puede ejercer su funcionalidad con al menos un 5 % más de efectividad, preferiblemente al menos un 10 % más de efectividad, más preferiblemente al menos un 20 % y, de la manera más preferible, al menos un 30 % más de efectividad. La efectividad depende del criterio de valoración para el que se ha diseñado el conjunto de microorganismos. Las posibles funcionalidades incluyen, pero de forma no limitativa, la reducción del aumento de peso, la mejora de los niveles de insulina, la reducción de los niveles de glucosa, la reducción de la resistencia a la insulina, la reducción de la presión portal y la resistencia vascular intrahepática, la lucha contra la disfunción endotelial, la reducción de la inflamación del hígado, la reducción de la esteatosis, la reducción de la balonización hepatocelular y la reducción de la fibrosis, entre otras.

[0136] En un aspecto, se proporciona un método para obtener una composición como la descrita en este caso, que comprende el cultivo conjunto de cepas bacterianas en un reactor.

[0137] En algunas formas de realización, dicho reactor se encuentra en condiciones estandarizadas representativas del tracto gastrointestinal.

[0138] Los parámetros que caracterizan las condiciones estandarizadas incluyen, pero de forma no limitativa: pH (rango entre 1,5 y 8); disponibilidad de fuentes de carbono (carbohidratos, proteínas o una combinación de ambos); tiempo de retención en un reactor específico (rango entre 10 min y 200 h); disponibilidad de oxígeno (rango entre 0 y 8 g/L); disponibilidad de micronutrientes; presencia/ausencia de antibióticos; concentración de sales biliares (rango entre 0 y 20 mM); presencia de metales pesados; presencia de factores del huésped como moléculas inmunitarias. En una forma de realización preferida, los parámetros que caracterizan las condiciones estandarizadas comprenden pH, tiempo de retención en un reactor específico y concentración de sales biliales, tal y como se definió anteriormente en este documento. Dependiendo de la complejidad del consorcio, un periodo de 1 a 15 días puede ser adecuado para obtener un consorcio funcionalmente estable. En promedio, para desarrollar un consorcio compuesto por entre 7 y 14 miembros, se requiere un tiempo adecuado de entre 3 y 10 días para obtener un consorcio funcionalmente estable (dependiendo de las condiciones ambientales). Por lo tanto, una composición, tal y como se define aquí, se puede obtener tras su entrenamiento o cultivo durante un periodo de entre 3 y 10 días en condiciones en las que el pH, el tiempo de retención en un reactor específico y la concentración de sales biliares se han establecido según lo definido en este documento. Dicho proceso permite la producción de una composición o un consorcio que es funcionalmente estable.

[0139] Como se utiliza en este documento, "un consorcio funcionalmente estable" puede ser una composición como la descrita en este caso, que aún comprende el número inicial diferente de especies bacterianas después de al menos 3, 5 o 10 días de cultivo.

[0140] En otro aspecto, se proporciona un reactor que opera en condiciones estandarizadas representativas del tracto Gl, que comprende: rango de pH entre 1,5 y 8; disponibilidad de fuentes de carbono; tiempo de retención entre 10 min y 200 h; disponibilidad de oxígeno entre 0 y 8 g/L; disponibilidad de micronutrientes; presencia/ausencia de antibióticos; concentración de sales biliares entre 0 y 20 mM; presencia de metales pesados; presencia de factores del huésped como moléculas inmunitarias. En una forma de realización, dicho reactor es tal que los parámetros que caracterizan las condiciones estandarizadas comprenden pH, tiempo de retención en un reactor específico y concentración de sales biliares, según se define en el párrafo anterior. En una forma de realización, dicho reactor comprende una composición de entre 5 y 20 miembros de bacterias diferentes, o de 6 a 14 miembros de bacterias diferentes o de 5 a 15 miembros de bacterias diferentes. En una forma de realización preferida, dicha composición permanece un tiempo de entre 3 y 14 días o entre 3 y 10 días en dicho reactor para obtener un consorcio funcionalmente estable.

[0141] Por lo tanto, dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos como los descritos en este caso, el tratamiento puede dar como resultado un inicio bioterapéutico más rápido y/o una mayor eficacia, es decir, un efecto terapéutico rápido y eficiente, como se describe en este caso.

[0142] Métodos y usos

[0143] Como se explicó en la parte experimental, se ha descubierto sorprendentemente que las composiciones descritas con anterioridad ejercen diversos efectos beneficiosos directos e indirectos sobre el hígado.

[0144] Específicamente, las composiciones como las descritas en este documento ejercen al menos los siguientes efectos beneficiosos: reducción del aumento de peso, mejora de los niveles de insulina, reducción de los niveles de glucosa, reducción de la resistencia a la insulina, reducción de la presión portal y la resistencia vascular intrahepática, contrarresto de la disfunción endotelial, reducción de la inflamación del hígado, reducción de la esteatosis, reducción de la balonización hepatocelular y reducción de la fibrosis, entre otros. Por lo tanto, de lo anterior se deduce que las composiciones proporcionadas aquí tienen una amplia aplicabilidad en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de diversas enfermedades y afecciones del hígado, así como de sus síntomas, enfermedades o afecciones subyacentes y manifestaciones extrahepáticas.

[0146] En consecuencia, en otro aspecto útil para la comprensión de la invención, las composiciones como las descritas en este caso se proporcionan para su uso en medicina. Preferiblemente, las composiciones como la descritas en este caso se utilizan en un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado. También se abarca en el presente documento tratar los síntomas de una enfermedad o afección del hígado, enfermedades o afecciones subyacentes a la enfermedad o afección del hígado, así como manifestaciones extrahepáticas de la enfermedad o afección del hígado, cada uno de estos aspectos se describe con más detalle en otra parte del presente documento. En consecuencia, en algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones como las descritas en este caso se han previsto para su uso en un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado o un síntoma de la misma. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones como las descritas en este caso se han previsto para su uso en un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado o un síntoma de la misma, una enfermedad o afección subyacente o una manifestación extrahepática.

[0148] En otro aspecto útil para la comprensión de la invención, se proporciona un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado, que comprende la administración de una composición, como se describe en el presente documento. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado o síntoma de la misma, que comprende la administración de una composición como se describe en el presente documento. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado, un síntoma de la misma, una enfermedad o afección subyacente o una manifestación extrahepática, que comprende la administración de una composición como se describe en el presente documento. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, administrar una composición significa administrar dicha composición a un sujeto, como un sujeto que la necesita. En una forma de realización preferida, se administra una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición.

[0150] En otro aspecto útil para la comprensión de la invención, se proporciona un uso de una composición como la descrita en este caso, para la fabricación de un medicamento para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona un uso de una composición, como la descrita en este caso, para la fabricación de un medicamento para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado o un síntoma de la misma. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona un uso de una composición, como la descrita en este caso, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento, retraso, a la mejora, prevención o curación de una enfermedad o afección del hígado, un síntoma de la misma, una enfermedad o afección subyacente o una manifestación extrahepática.

[0152] En otro aspecto útil para la comprensión de la invención, se proporciona un uso de una composición, como la descrita en este caso, para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona un uso de una composición, como la descrita en este caso, para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado o un síntoma de la misma. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, se proporciona un uso de una composición, como la descrita en este caso, para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado, un síntoma de la misma, una enfermedad o afección subyacente o una manifestación extrahepática.

[0154] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados en este documento, se puede administrar una cantidad eficaz o terapéuticamente eficaz de la composición, tal como se describe en este documento.

[0156] [0118] Como se utiliza en este documento, una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para obtener resultados beneficiosos o deseados. En consecuencia, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que, cuando se administra a un sujeto que la necesita, es suficiente para ejercer algún efecto terapéutico o profiláctico, como se describe en este documento, como, entre otros, la reducción del aumento de peso, la mejora de los niveles de insulina, la reducción de los niveles de glucosa, la reducción de la resistencia a la insulina, la reducción de la presión portal y la resistencia vascular intrahepática, la prevención de la disfunción endotelial, la reducción de la inflamación del hígado, la reducción de la esteatosis, la reducción de la balonización hepatocelular y la reducción de la fibrosis, en comparación con un sujeto no tratado. Una cantidad que sea "terapéuticamente eficaz" puede variar de sujeto a otro sujeto, por ejemplo, dependiendo de la edad, la progresión de la enfermedad o el estado general del individuo. El experto en la materia puede determinar una cantidad "terapéuticamente eficaz" adecuada en cada caso individual mediante experimentación rutinaria, como los métodos descritos más adelante en este documento y/o los métodos de la parte experimental del presente documento. Se entiende que "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a la cantidad total combinada de cepas bacterianas en la composición. Dependiendo de la aplicación final, la cantidad total combinada puede ser el resultado de cantidades iguales de cada una de las cepas bacterianas o cantidades desiguales de cada una de las cepas bacterianas, en la que cada cepa individual tiene una abundancia mínima del 0,0001 % de la cantidad total combinada, preferiblemente una abundancia mínima del 0,001 % de la cantidad total combinada y, más preferiblemente, una abundancia mínima del 0,01 % de la cantidad total combinada.

[0157] Dependiendo de la aplicación final, dicha cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz (que se entiende como la cantidad total combinada de bacterias) puede ser de al menos 10^2, preferiblemente de al menos 10^3, más preferiblemente de al menos 10^4, incluso más preferiblemente de al menos 10^5 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias. En algunas formas de realización, dicha cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz (que se entiende como la cantidad total combinada de bacterias) puede estar comprendida entre 10^2 y 10^14, preferiblemente entre 10^3 y 10^13, más preferiblemente entre 10^4 y 10^12, incluso más preferiblemente entre 10^5 y 10^11 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias. En algunas formas de realización, dicha cantidad es una cantidad diaria, es decir, una cantidad que se administra diariamente.

[0158] Una composición como la descrita en este caso se puede administrar según cualquier régimen. En algunas formas de realización, la composición se puede administrar en una sola dosis. En formas de realización preferidas, la composición puede administrarse al sujeto de forma rutinaria o periódica, por ejemplo, la composición se puede administrar al sujeto una vez cada 12 horas, 24 horas, o 48 horas; es decir, dos veces al día, diariamente o una vez cada dos días. En formas de realización preferidas, la composición se puede administrar diariamente. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este caso se administra durante un periodo de al menos 1 semana, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, un año o más. En algunas formas de realización, una composición como la descrita en este caso se administra de por vida.

[0159] Un "sujeto" o "sujeto que la necesita", como se utiliza en este documento, puede ser un ser humano (preferiblemente) o un animal no humano. En algunas formas de realización, el sujeto (que la necesita) puede ser un sujeto sano, especialmente en el contexto de la prevención de una enfermedad o afección del hígado o un síntoma de la misma, como se describe en este caso. En algunas formas de realización, el sujeto (que la necesita) también puede padecer o estar en riesgo de desarrollar cualquiera de las enfermedades y afecciones descritas en este documento. En algunas formas de realización, el sujeto (que la necesita) puede ser un sujeto afectado por EHNA.

[0160] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados en este documento, la composición se puede administrar a un sujeto que la necesita, como la descrita en este caso.

[0161] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados en este documento, una composición se puede administrar mediante modos de administración diferentes. En algunas formas de realización, un modo de administración puede ser rectal u oral. Se prefiere la administración oral.

[0162] Una composición como la proporcionada aquí puede administrarse directa o indirectamente usando medios adecuados conocidos en la técnica. Se prevé mejoras en los medios para proporcionar a un individuo una composición como la descrita en este caso, considerando el progreso alcanzado hasta la fecha. Por supuesto, dichas mejoras futuras pueden incorporarse para lograr los efectos deseados, como se describe en este documento.

[0163] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados en este documento, una composición como la descrita en este caso se puede usar en combinación con uno o más agentes terapéuticos. En algunas formas de realización, dicho agente terapéutico se selecciona de entre estatinas (por ejemplo, simvastatina), otras terapias hipolipemiantes, terapias no hipolipemiantes, agonistas del receptor de GLP-1 (por ejemplo, semaglutida, dulaglutida, liraglutida), inhibidores de SGLT1/2 (por ejemplo, licoglifozina), inhibidores de SGLT2, inhibidores de DPP-4 (por ejemplo, itagliptina, saxagliptina, linagliptina, alogliptina), agonistas de FXR (por ejemplo, OCA, tropifexor, cilofexor), inhibidores de la apoptosis (por ejemplo, selonsertib, emricasan), agentes antiinflamatorios (por ejemplo, pentoxifilina), fármacos antihipertensivos como bloqueadores del receptor de angiotensina, antagonistas de CCR2/5 (por ejemplo, cenicriviroc), inhibidores de ACC (por ejemplo, firsocostat), agentes de estrés antioxidante (por ejemplo, vitamina E, UDCA) y agonistas de PPAR, como las tiazolidinedionas (TZD) (por ejemplo, pioglitazona).

[0164] En formas de realización preferidas, dicho agente terapéutico se selecciona de entre estatinas (por ejemplo, simvastatina), agonistas del receptor de GLP-1 (por ejemplo, semaglutida, dulaglutida, liraglutida), inhibidores de SGLT2 y agonistas de PPAR, como las tiazolidinedionas (por ejemplo, pioglitazona). Un ejemplo preferido de agonista del receptor de GLP-1 es la liraglutida. En formas de realización preferidas, dicho agente terapéutico es agonista de PPAR, como una tiazolidinediona (también conocida como glitazona) (por ejemplo, pioglitazona).

[0165] Las composiciones proporcionadas en este documento y el uno o más agentes terapéuticos pueden administrarse en una sola composición o por separado.

[0166] Enfermedades y afecciones del hígado

[0167] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, la enfermedad o afección del hígado puede ser una enfermedad hepática o afección asociada con disbiosis.

[0168] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, la enfermedad o afección del hígado puede ser enfermedad hepática relacionada con el alcohol (EHA), enfermedad hepática colestásica, enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), fibrosis hepática, cirrosis hepática y/o una neoplasia hepática o un síntoma de las mismas. La enfermedad hepática relacionada con el alcohol (EHA) abarca la enfermedad de hígado graso alcohólico, la hepatitis alcohólica y la cirrosis (relacionada con el alcohol). Los ejemplos no limitativos de enfermedad hepática colestásica son la colangitis biliar primaria (CBP) y la colangitis esclerosante primaria (CEP).

[0169] Según la invención, dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, la enfermedad o afección del hígado puede ser enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), fibrosis hepática, cirrosis hepática y/o una neoplasia de hígado o un síntoma de las mismas.

[0170] La EHGNA se reconoce actualmente como la manifestación hepática del síndrome metabólico. En consecuencia, el término "EHGNA", tal y como se utiliza en esta divulgación, puede sustituirse por términos como "componente hepático del síndrome metabólico", "manifestación hepática del síndrome metabólico" o "enfermedad de hígado graso asociada a (disfunción) metabólica" (EHGAD) (como se propone en Eslam M et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: an international expert consensus statement. J Hepatol. 2020; 73:202-209).

[0171] La EHGNA se considera un término general para un espectro de enfermedades hepáticas que pueden clasificarse como hígado graso no alcohólico (HGNA) y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) (véase Lackner C. (2018) Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Practical Hepatic Pathology: a Diagnostic Approach, 167-187). Por lo tanto, en algunas formas de realización dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, la enfermedad o afección del hígado puede ser hígado graso no alcohólico (HGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis hepática, cirrosis hepática y/o una neoplasia hepática, un síntoma de las mismas o una enfermedad o afección subyacente.

[0172] El término "neoplasia hepática", tal y como se utiliza en el presente documento, puede entenderse como que se refiere tanto a las neoplasias hepáticas como a las neoplasias de las vías biliares intrahepáticas. En consecuencia, en algunas formas de realización, el término "neoplasia hepática" o similar puede sustituirse por el término "neoplasia hepática o de la vía biliar intrahepática" o similar.

[0173] Según la invención, una neoplasia hepática, como se describe en el presente documento, es un cáncer de hígado. Según la invención, un cáncer de hígado es un carcinoma hepatocelular (CHC).

[0174] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados en este documento, un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad o afección del hígado puede ser un método para retrasar o prevenir la progresión de la HGNA, preferiblemente retrasar la progresión de HGNA a EHNA, de EHNA a fibrosis hepática, de fibrosis hepática a cirrosis hepática y/o de cirrosis hepática a CHC, más preferiblemente retrasar HGNA a EHNA o de EHNA a fibrosis hepática.

[0175] [0136] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, "tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar", como se utilizan en este documento, se pueden entender como tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad, afección o síntoma en comparación con dicha enfermedad, afección o síntoma antes de administrar la composición. En algunas formas de realización, "tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar", como se utilizan en este documento, se pueden entender como tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar una enfermedad, afección o síntoma en comparación con dicha enfermedad, afección o síntoma en un sujeto con la misma enfermedad, afección o síntoma que recibe un placebo. De manera similar, la aparición de cualquiera de los efectos descritos en otras partes del presente documento puede compararse de la misma manera.

[0176] Síntomas

[0177] En algunas formas de realización, un síntoma de una enfermedad o afección hepática, como se describe en este documento, comprende aumento de peso, resistencia a la insulina, inflamación del hígado, esteatosis, balonización hepatocelular, resistencia vascular intrahepática (RVIH), hipertensión portal, disfunción endotelial y/o fibrosis.

[0178] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, una composición y/o un medicamento, como se describe en este caso, muestra preferiblemente al menos uno, al menos dos, al menos tres, o todos los siguientes efectos:

[0179] • reducir el aumento de peso;

[0180] • mejorar los niveles de insulina;

[0181] • reducir los niveles de glucosa;

[0182] • reducir la resistencia a la insulina;

[0183] • reducir la presión portal;

[0184] • reducir la resistencia vascular intrahepática;

[0185] • contrarrestar la disfunción endotelial;

[0186] • reducir la inflamación del hígado

[0187] • reducir la esteatosis;

[0188] • reducir la balonización; y

[0189] • reducir la fibrosis.

[0190] Los medios y métodos para medir estos síntomas y efectos son bien conocidos en la técnica. En la sección experimental se proporcionan ejemplos no limitativos de métodos para medir estos síntomas y efectos.

[0191] En este contexto, "reducir" (respectivamente "mejorar") y similares significa al menos una disminución detectable (o, respectivamente, una mejora detectable) mediante un ensayo conocido por un experto en la materia, como los ensayos realizados en la fase experimental. La reducción puede ser una reducción de al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 %. En algunas formas de realización, la administración de una composición como la descrita en este caso puede dar como resultado una reducción del aumento de peso corporal, una mejora de la hipertensión portal o una mejor sensibilidad a la insulina, opcionalmente en comparación con un sujeto con una enfermedad o afección del hígado comparable al que se le administra un placebo. En algunas formas de realización, la administración de una composición como la descrita en este documento puede dar como resultado una reducción de aproximadamente el 40 % en los niveles de insulina en sangre en ayunas dentro de las dos semanas posteriores al tratamiento, opcionalmente en comparación con un sujeto al que se le administra un placebo. En algunas formas de realización, la administración de una composición como se describe en este documento puede dar como resultado una reducción de aproximadamente el 80 % en la resistencia vascular intrahepática (RVIH) dentro de las 10 semanas de tratamiento, opcionalmente en comparación con un sujeto al que se le administra un placebo.

[0192] El comité de patología de la red de investigación clínica de la EHNA de EE. UU.(Pathology Committee of the NASH Clinical Research Network)

ha definido la puntuación de actividad de la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) (ÑAS, por sus siglas en inglés) como la suma no ponderada de los valores de puntuación para la esteatosis (de 0 a 3), la inflamación lobular (de 0 a 3) y la balonización (de 0 a 2), lo que proporciona una puntuación ÑAS de 0 a 8. (Véase Kleinen et al., Design and Validation of a Histological Scoring System for Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Hepatology, VoI.41, No.6, 2005, pp. 1313-1321. Véase, en particular, la tabla 1 de la misma). Kleinen et al. también definen una puntuación de fibrosis de 0 a 4; véase, en particular, la tabla 1.

[0193] Dentro del contexto de las composiciones para su uso, los métodos y usos proporcionados aquí, una composición y/o un medicamento, como se describe(n) aquí, puede conducir a una reducción en la puntuación de actividad de la EHGñA (ÑAS), la puntuación de esteatosis, la puntuación de inflamación lobular, la puntuación de balonización o la puntuación de fibrosis, preferiblemente la puntuación ÑAS, la puntuación de esteatosis, la puntuación de balonización o la puntuación de fibrosis, más preferiblemente la puntuación de fibrosis. Una reducción es preferiblemente una reducción de al menos un nivel de puntuación, o alternativamente de al menos dos o tres niveles.

[0194] [0143] En algunas formas de realización, cualquiera de los efectos descritos se observa después de al menos 1 semana, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, un año o más de tratamiento, donde dicho tratamiento implica opcionalmente una cantidad y un régimen de administración como se describe en otra parte del presente documento.

[0195] Enfermedades y afecciones subyacentes

[0196] Las enfermedades y afecciones del hígado o sus síntomas, como se describen en este documento, pueden presentarse en un gran número de enfermedades y afecciones que pueden denominarse enfermedades y afecciones subyacentes. Por lo tanto, debería entenderse que los aspectos de esta divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan que las composiciones proporcionadas aquí pueden usarse para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar cualquier enfermedad o afección subyacente.

[0197] Por ejemplo, la EHGNA se presenta en un gran número de enfermedades y afecciones que pueden denominarse enfermedades y afecciones subyacentes, como se resume en la tabla 1.

[0198] Tabla 1: Causas afecciones enfermedades sub acentes de la EHGNA

[0200]

[0202] Además, la hipertensión portal puede causar trastornos gastrointestinales, incluidas la colangitis esclerosante primaria (C<e>P) y la pancreatitis crónica.

[0203] Por lo tanto, debería entenderse que los aspectos de esta divulgación útiles para comprender la invención también abarcan que las composiciones proporcionadas aquí pueden usarse para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar cualquiera de las enfermedades o afecciones mencionadas en la tabla 1. En consecuencia, los aspectos de la divulgación útiles para comprender la invención abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de la obesidad, una enfermedad genética o metabólica, una afección inducida por fármacos o toxinas, una afección extrahepática, un trastorno nutricional, una infección viral, isquemia hepática o senescencia.

[0204] [0148] En consecuencia, los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de trastornos metabólicos de resistencia a la insulina (como el síndrome metabólico, el síndrome X, el síndrome de resistencia a la insulina, la diabetes mellitus tipo 2, el síndrome de Alstrom, el síndrome de Bardet-Biedl, los síndromes de lipodistrofia, las mutaciones de PPAR<y>), la deficiencia o resistencia a la leptina, la obesidad hipotalámica o el síndrome de Prader-Willi. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de la enfermedad de Wilson, la enfermedad de Weber-Christian, la enfermedad de Wolman, la enfermedad por almacenamiento de ésteres de colesterol, la abetalipoproteinemia, la hipobetalipoproteinemia familiar, el síndrome de Dorman-Chanarin, la adrenoleucodistrofia pseudoneonatal, la galactosemia, la tirosinemia, la intolerancia hereditaria a la fructosa, la cistinuria, la enfermedad de Sandhoff, la disfunción hipofisaria o el hipotiroidismo. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de la toxicidad o sobredosis asociadas con corticosteroides, estrógenos, AINE, antagonistas del calcio, amiodarona, tamoxifeno, tetraciclina, cloroquina, maleato de perhexilina, antirretrovirales, disolvente industrial dimetilformamida, diluyentes y disolventes de pintura, exposición a productos petroquímicos, cocción de colza o cocaína. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de la insuficiencia cardíaca, la enfermedad inflamatoria intestinal y otras enfermedades intestinales, el síndrome de sobrecrecimiento bacteriano intestinal, la fibrosis quística, el craneofaringioma o las afecciones hepáticas relacionadas con el embarazo. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de afecciones hepáticas, como baipás yeyunoileal, baipás gástrico, gastroplastia, baipás biliopancreático, resección de intestino delgado, nutrición parenteral total, inanición prolongada, pérdida rápida de peso, desnutrición proteica, dieta alta en carbohidratos o síndrome de Shwachman. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de las infecciones por los virus de la hepatitis C, B o D. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de la isquemia hepática o la senescencia. Los aspectos de la divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan cualquiera de las composiciones proporcionadas aquí para su uso en el tratamiento, el retraso, la mejora, la prevención o la curación de trastornos gastrointestinales, incluidas la colangitis esclerosante primaria (CEP) y la pancreatitis crónica.

[0206] En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones proporcionadas en este documento se utilizan en un método para el manejo de los síntomas hepáticos en cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente en la tabla 1. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones aquí presentadas se utilizan para mejorar la función hepática en cualquiera de las afecciones mencionadas en la tabla 1. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las composiciones aquí presentadas se utilizan para retrasar el deterioro hepático en cualquiera de las afecciones mencionadas en la tabla 1.

[0208] Manifestaciones extrahepáticas

[0210] Las manifestaciones extrahepáticas se pueden entender como trastornos y/o síntomas extrahepáticos que son un resultado de las enfermedades o afecciones del hígado, como se describe en el presente documento. Por lo tanto, se debería entender que los aspectos de esta divulgación útiles para la comprensión de la invención también abarcan que las composiciones proporcionadas aquí se pueden usar para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar cualquier manifestación extrahepática de una enfermedad o afección del hígado, como se describe en este documento.

[0212] Las manifestaciones extrahepáticas pueden deberse a efectos en órganos, tejidos o células distintos del hígado. Las manifestaciones extrahepáticas pueden deberse, por ejemplo, a efectos en el cerebro, la vasculatura o efectos extravasculares. En algunos aspectos útiles para la comprensión de la invención, las manifestaciones extrahepáticas como la descritas en este caso pueden ser encefalopatía hepática, várices o ascitis, preferiblemente encefalopatía hepática.

[0214] Sin ánimo de limitarnos a ninguna teoría en particular, se cree que las composiciones descritas anteriormente y sus usos y métodos pueden basarse en los siguientes mecanismos:

[0216] a) estimular el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias beneficiosas en el tracto intestinal,

[0217] b) inhibir el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias patógenas en el tracto intestinal,

[0218] <c>) aumentar relativamente la adhesión de bacterias no patógenas a la mucosa de la superficie gastrointestinal,

[0219] d) reducir la absorción incontrolada de antígenos, proinflamatorios, bacterias o productos bacterianos por el intestino,

[0220] e) proporcionar actividad antiinflamatoria en la superficie intestinal,

[0221] f) aumentar la función de la barrera intestinal,

[0222] g) producir metabolitos bacterianos,

[0223] h) reducir la producción de metabolitos intestinales perjudiciales,

[0224] i) inducir la reparación de heridas, o

[0225] j) cualquier combinación de a) a i).

[0226] Sin ánimo de limitarse a ninguna teoría en partícula, de manera adicional o alternativa, las composiciones descritas anteriormente y sus usos y métodos pueden basarse en los siguientes mecanismos hepáticos: a) restaurar la señalización hepática de insulina,

[0227] b) reducir los marcadores profibróticos hepáticos,

[0228] c) reducir la acumulación de lípidos hepáticos, o

[0229] d) cualquier combinación de a) a<c>).

[0230] A continuación se exponen algunos aspectos y formas de realización particulares de la divulgación.

[0231] En un aspecto, esta divulgación proporciona una composición que comprende miembros bacterianos que están purificados, donde los miembros bacterianos comprendenFaecalibacterium prausnitzii, Butyricococcus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarum, Anaerostipes caccaeyPhocaeicola vulgatus,y al menos una de las siguientes:Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluirVeillonella parvulaoVeillonella atypica.En otros casos, los miembros bacterianos pueden incluirBlautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.En otros casos, los miembros bacterianos pueden incluir:

[0232] -Veillonella parvula

oVeillonella atypica;

[0233] - Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.

[0234] Ventajosamente, la composición de miembros bacterianos puede ser útil para tratar o prevenir determinadas afecciones del hígado no deseadas, por ejemplo, la inflamación del hígado.

[0235] En algunas formas de realización, las composiciones pueden incluir ciertas cepas de miembros bacterianos. Por ejemplo, en algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG P-29362 deFaecalibacterium prausnitzii.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG P-29360 deButyricococcus pullicaecorum.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG P-29365 deRoseburia inulinivorans.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG P-29361 deAkkermansia muciniphila.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG P-29366 deLactiplantibacillus plantarum.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG P-29359 deAnaerostipes caccae.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa LMG17767 dePhocaeicola vulgatus.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa DSM 2007 deVeillonella parvula.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluir la cepa DSM 25238 deBlautia obeum.

[0236] La composición se puede formular para proporcionar un efecto terapéutico rápido y eficiente. En algunos casos, la composición se puede formular para administración intestinal. Por ejemplo, la composición se puede formular en polvo, suspensión, comprimido, suplemento alimenticio y similares. En algunos casos, por ejemplo, los miembros bacterianos se pueden liofilizar. Por ejemplo, los miembros bacterianos se pueden liofilizar. En algunos casos, la composición de miembros bacterianos se puede proporcionar en forma de dosificación de suspensión. La composición puede incluir al menos 10^5 unidades formadoras de colonias de bacterias, por ejemplo, la composición puede incluir entre 10^5 y 10^11 unidades formadoras de colonias de bacterias. Como se describe en este caso, las bacterias se pueden liofilizar o proporcionar en un formato de cultivo activo.

[0237] En un aspecto diferente, esta divulgación proporciona un método para mejorar una afección del hígado, donde el método incluye administrar una composición que incluye miembros bacterianos a un sujeto que la necesita, donde los miembros bacterianos incluyenFaecalibacterium prausnitzii, Butyricococcus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarum, Anaerostipes caccaeyPhocaeicola vulgatus,y al menos una de las siguientes:Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti,donde la administración de la composición mejora el estado del hígado, opcionalmente en comparación con el estado previo a la administración de la composición. En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluirVeillonella parvulaoVeillonella atypica.En algunos casos, los miembros bacterianos pueden incluirBlautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.En otros casos, los miembros bacterianos pueden incluir:

[0238] -Veillonella parvula

oVeillonella atypica;y

[0239] -Blautia obeum, Blautia wexlerae

oBlautia luti.

[0240] [0160] El método puede ser útil para el tratamiento de afecciones del hígado. En aspectos útiles para la comprensión de la invención, la afección puede ser, por ejemplo, inflamación del hígado, obesidad, una enfermedad genética o metabólica, una afección inducida por fármacos o toxinas, una afección extrahepática, un trastorno nutricional, una infección viral, isquemia hepática o senescencia. Por ejemplo, en algunos casos, la afección puede incluir inflamación del hígado, y la administración de la composición puede mejorar la inflamación del hígado, como lo demuestra una reducción en la puntuación de actividad de la EHGNA (ÑAS) del sujeto. ÑAS es una metodología para la puntuación basada en características de las lesiones histológicas de la EHGNA, aceptada tanto en entornos clínicos como experimentales. En algunos casos, por ejemplo, la ÑAS del sujeto puede reducirse en un valor numérico de aproximadamente 1,0 en las 9 semanas posteriores a la administración de la composición, opcionalmente en comparación con un sujeto que recibe un placebo. En algunos casos, la afección puede incluir EHNA. Por ejemplo, la composición puede administrarse a un sujeto que tiene EHNA y, por lo tanto, retrasar la progresión de EHNA, opcionalmente en comparación con un sujeto con EHNA al que se le administra un placebo en lugar de la composición.

[0241] En algunos casos, la administración de la composición al sujeto puede dar como resultado un aumento de peso corporal, una mejora de la hipertensión portal o una mejor sensibilidad a la insulina, opcionalmente en comparación con un sujeto con una afección hepática comparable al que se le administra un placebo. En algunos casos, la administración de la composición puede dar como resultado una reducción de aproximadamente el 40 % en los niveles de insulina en ayunas dentro de las dos semanas posteriores al tratamiento, opcionalmente en comparación con un sujeto que recibe un placebo. En casos adicionales, la administración de la composición puede dar como resultado una reducción de aproximadamente el 80 % de la resistencia vascular intrahepática (RVIH) en un plazo de 10 semanas de tratamiento, opcionalmente en comparación con un sujeto al que se le administró un placebo. La composición se puede administrar según cualquier régimen, por ejemplo, la composición se puede administrar en una única dosis, o la composición se puede administrar al sujeto de forma rutinaria o periódica, por ejemplo, la composición se puede administrarse al sujeto una vez cada 12 horas, 24 horas o 48 horas durante al menos 7 días, 8 días, 9 días, 10 días o más. En algunos casos, la composición está formulada para administración intestinal. En algunos casos, los miembros bacterianos se pueden liofilizar. En algunos casos, la composición se puede proporcionar en forma de dosificación de suspensión. En algunos casos, la composición comprende la cepa LMG P-29362 deFaecalibacterium prausnitzii,la cepa LMG P-29360 deButyricococcus pullicaecorum,la cepa LMG P-29365 deRoseburia inulinivorans,la cepa Lm G P-29361 deAkkermansia muciniphila,la cepa L<m>G P-29366 deLactiplantibacillus plantarum,la cepa LMG P-29359 deAnaerostipes caccae,la cepa LMG17767 dePhocaeicola vulgatus,la cepa DSM 2007 deVeillonella parvulay la cepa DSM 25238 deBlautia obeum.La composición puede incluir entre 10^5 y 10^11 unidades formadoras de colonias de bacterias.

[0242] Información general

[0243] Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el que habitualmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención, y que se interpretan en vista de esta divulgación.

[0244] Identidad de secuencia

[0245] En el contexto de esta divulgación, una molécula de ácido nucleico, como una molécula de ácido nucleico que codifica un gen ARÑr 16S está representada por una secuencia de ácido nucleico o nucleótido que codifica un gen ARÑr 16s.

[0246] Se entiende que cada molécula de ácido nucleico, fragmento proteico, polipéptido, péptido, péptido derivado o construcción, identificado en el presente documento mediante un número de identidad de secuencia (SEQ ID<ñ>O), no se limita a la secuencia específica descrita. Cada secuencia codificante, como se identifica en el presente documento, codifica un fragmento de proteína, polipéptido, péptido, péptido derivado o construcción, o es en sí misma un fragmento de proteína, polipéptido, construcción, péptido o péptido derivado.

[0247] A lo largo de esta aplicación, cada vez que se haga referencia a una secuencia de nucleótidos específica SEQ ID ÑO (por ejemplo, SEQ ID<ñ>O: X) que codifica un fragmento de proteína, polipéptido, péptido, péptido derivado o ARÑr, se podrá sustituir por:

[0248] i. una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID<ñ>O: X;

[0249] ii. una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) debido a la degeneración del código genético; o

[0250] iii. una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad o similitud de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID ñO: X.

[0251] Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 70 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 80 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 90 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 95 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 99 %.

[0252] En el contexto de los genes ARNr 16S, debido a su alto grado de conservación, los niveles de identidad de secuencia preferidos son generalmente más altos. Por lo tanto, los niveles preferidos de identidad de secuencia para los genes ARNr 16S son 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 % o 99,5 %.

[0254] A Io largo de esta solicitud, cada vez que se haga referencia a una secuencia de aminoácidos específica SEQ ID NO (por ejemplo, SEQ ID NO: y ), se podrá sustituir por: un polipéptido representado por una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:<y>. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 70 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 80 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 90 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 95 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es del 99 %.

[0256] Cada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos descrita en este documento en virtud de su porcentaje de identidad o similitud con una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos dada respectivamente tiene en otra forma de realización preferida una identidad o una similitud de al menos un 60 %, al menos un 61 %, al menos un 62 %, al menos un 63 %, al menos un 64 %, al menos un 65 %, al menos un 66 %, al menos un 67 %, al menos un 68 %, al menos un 69 %, al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % con la secuencia de nucleótidos o aminoácidos dada, respectivamente.

[0258] Cada secuencia de nucleótidos no codificante (es decir, de un promotor o de otra región reguladora) podría ser reemplazada por una secuencia de nucleótidos que comprenda al menos un 60 % de identidad o similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos específica SEQ ID NO (tome como ejemplo SEQ ID NO: a ). Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60 %, al menos un 61 %, al menos un 62 %, al menos un 63 %, al menos un 64 %, al menos un 65 %, al menos un 66 %, al menos un 67 %, al menos un 68 %, al menos un 69 %, al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con SEQ ID N.0:<a>. En una forma de realización preferida, dicha secuencia de nucleótidos no codificante, como un promotor, exhibe o ejerce al menos una actividad de dicha secuencia de nucleótidos no codificante, como una actividad de un promotor, tal y como la conoce una persona experta en la técnica.

[0260] Los términos "homología", "identidad de secuencia" y similares se utilizan indistintamente en el presente documento. La identidad de secuencia se describe aquí como la relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), determinada mediante la comparación de las secuencias. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se calcula basándose en la longitud completa de dos SEQ ID NO dadas o en una parte de ellas. Parte de la misma significa preferiblemente al menos un 5o %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100% de ambas SEQ ID NO. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de parentesco entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según lo determinado por la coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en Bioinformatics and the Cell: Modern Computational Approaches in Genomics, Proteomics and transcriptomics, Xia X., Springer International Publishing, New York, 20l8; and Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Mount D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2004.

[0262] La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" pueden determinarse mediante el alineamiento de dos secuencias de péptidos o nucleótidos mediante algoritmos de alineamiento global o local, dependiendo de su longitud. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento global (por ejemplo, de Needleman-Wunsch), que las alinea de forma óptima en toda su longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente mediante un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo, de Smith-Waterman). Las secuencias pueden entonces considerarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando (al alinearse óptimamente, por ejemplo, con el programa EMBOSS needle o EMBOSS water utilizando parámetros predeterminados) comparten al menos un porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se describe a continuación).

[0264] [0173] Un alineamiento global es adecuado para determinar la identidad de secuencia cuando dos secuencias tienen longitudes similares. Cuando las secuencias tienen una longitud total sustancialmente diferente, se prefieren los alineamientos locales, como los que utilizan el algoritmo de Smith-Waterman. EMBOSS needle utiliza el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. EMBOSS water utiliza el algoritmo de alineamiento local de Smith-Waterman. Generalmente, se utilizan los parámetros predeterminados de EMBOSS needle y EMBOSS water, con una penalización por apertura de espacio de 10 (secuencias de nucleótidos) / 10 (proteínas) y una penalización por extensión de espacio de 0,5 (secuencias de nucleótidos) / 0,5 (proteínas). Para las secuencias de nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada es DNAfull y para las proteínas es Blosum62 (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS 89, 95-919).

[0265] Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad se puede determinar mediante búsquedas en bases de datos públicas usando algoritmos, tales como FASTA, BLAST, etc. Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de algunas formas de realización de la presente divulgación pueden utilizarse, además, como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas y, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse con los programas BLASTn y BLAST<x>(versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. MoI. BIoI. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST (puntuación = 100, longitud de palabra = 12) para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la oxidorreductasa de la divulgación. Las búsquedas de proteínas de BLAST pueden realizarse con el programa BLASTx, con una puntuación de 50 y una longitud de palabra de 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteicas de la divulgación. Para obtener alineamientos separados con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST, como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

[0266] 25(17): 3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de cada programa (por ejemplo, BLAST<x>y BLASTn). Consulte la página de inicio del Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE. UU. accesible en la red mundial en www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0267] Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede considerar las denominadas sustituciones conservativas de aminoácidos. Como se utiliza en este documento, las sustituciones de aminoácidos "conservadoras" se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. En las siguientes tablas se presentan ejemplos de clases de residuos de aminoácidos para sustituciones conservativas.

[0270]

[0272] Clases alternativas de sustitución de residuos de aminoácidos conservativos:

[0275]

[0277] Clasificaciones físicas y funcionales alternativas de los residuos de aminoácidos:

[0280]

[0281]

[0284] Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es la serina y la treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es la asparagina y la glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es la lisina, la arginina y la histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. Los grupos de sustitución conservativos de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita en este documento son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo de las secuencias descritas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservativo. Las sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos naturales son las siguientes: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o Hís; Asp por GIu; Cys por Ser o Ala; Gln por Asn; GIu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; lie por Leu o Val; Leu por lie o Val; Lys por Arg; Gln o GIu; Met por Leu o lie; Phe por Met, Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; y Val por lie o Leu.

[0285] Gen o secuencia codificante

[0287] El término "gen" se refiere a un fragmento de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, enlazada operativamente a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Un gen comprenderá normalmente varios fragmentos operativamente enlazados, como un promotor, una secuencia líder 5', una región codificante y una secuencia 3' no traducida (extremo 3'), por ejemplo, que comprende un sitio de terminación de la poliadenilación y/o la transcripción. Un gen quimérico o recombinante es un gen que no se encuentra normalmente en la naturaleza, como un gen cuyo promotor, por ejemplo, no está asociado con parte o la totalidad de la región de ADN transcrita. La "expresión de un gen" se refiere al proceso mediante el cual una región de ADN, operativamente enlazada a regiones reguladoras apropiadas, en particular un promotor, se transcribe en un ARN biológicamente activo, es decir, capaz de traducirse en una proteína o péptido biológicamente activo.

[0289] Proteínas y aminoácidos

[0291] Los términos "proteína", "polipéptido" o "secuencia de aminoácidos" se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción, tamaño, estructura tridimensional ni origen específicos. En las secuencias de aminoácidos, como las descritas en este documento, los aminoácidos o "residuos" se representan mediante símbolos de tres letras. Estos símbolos de tres letras, así como los símbolos correspondientes de una letra, son bien conocidos por un experto en la materia y tienen el siguiente significado: A (Ala) es alanina, C (Cys) es cisteína, D (Asp) es ácido aspártico, E (GIu) es ácido glutámico, F (Phe) es fenilalanina, G (Gly) es glicina, H (Hís) es histidina, l (lie) es isoleucina, K (Lys) es lisina, L (Leu) es leucina, M (Met) es metionina, N (Asn) es asparagina, P (Pro) es prolina, Q (Gln) es glutamina, R (Arg) es arginina, S (Ser) es serina, T (Thr) es treonina, V (Val) es valina, W (Trp) es triptófano Y (Tyr) es tirosina. Un residuo puede ser cualquier aminoácido proteinogénico, pero también cualquier aminoácido no proteinogénico, como los D-amínoácidos y los aminoácidos modificados formados por modificaciones postraduccionales, y también cualquier aminoácido no natural.

[0293] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utilizan en sentido no limitativo para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos no mencionados específicamente. Además, el verbo "consistir" puede sustituirse por "consistir esencialmente en", lo que significa que una composición como la descrita en este documento puede comprender uno o más componentes adicionales a los identificados específicamente, sin que dichos componentes adicionales alteren la característica única de esta divulgación. Además, el verbo "consistir" puede sustituirse por "consistir esencialmente en", lo que significa que un método como el descrito en este documento puede comprender pasos adicionales a los identificados específicamente, sin que dichos pasos adicionales alteren la singularidad de esta divulgación.

[0295] La referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto exija claramente que solo haya uno de los elementos. Por lo tanto, el artículo indefinido "un" o "una" significa normalmente "al menos un(a)".

[0297] Como se utiliza en este documento, "al menos" se refiere a un valor particular o a uno superior. Por ejemplo, "al menos 2" se entiende que es lo mismo que "2 o más", es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ..., etc.

[0298] Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos usados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las formas de realización descritas en este documento pueden funcionar en secuencias diferentes a las descritas o ilustradas en este documento.

[0299] La palabra "alrededor de" o "aproximadamente", cuando se usa en asociación con un valor numérico (por ejemplo, alrededor de 10) significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado (de 10) más o menos 1 % del valor.

[0300] Como se utiliza en este documento, el término "y/o" indica que uno o más de los casos indicados pueden ocurrir, solos o en combinación con al menos uno de los casos indicados, o incluso con todos los casos indicados.

[0301] Se describen diversas formas de realización en el presente documento. Cada forma de realización, tal y como se identifica en el presente documento, puede combinarse entre sí a menos que se indique lo contrario. Los títulos, subtítulos, encabezados y similares se utilizan aquí únicamente para facilitar la lectura y no pretenden limitar ni restringir la divulgación de ninguna manera.

[0302] Un experto en la técnica reconocerá numerosos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que podrían utilizarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos. También se entiende que la presente divulgación abarca la generalización de aspectos de los siguientes ejemplos a la divulgación anterior.

[0303] La presente invención se describe con más detalle mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como una limitación del alcance de la invención, definido en las reivindicaciones adjuntas.

[0304] Descripción de las figuras

[0305]

[0306] Figura 1. Diseño experimental. HFGFD-V: grupo de ratas que recibieron alimentación forzada simulada (vehículo); HFGFD-C: grupo de ratas que recibieron el consorcio bacteriano diariamente; HFGFD-Tr: grupo de ratas que recibieron microbiota intestinal (MI) obtenida de ratas delgadas de control (1 trasplante seguido de alimentación forzada simulada). Abreviaturas: HFGFD, dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa. Figura 2. Aumento de peso corporal y evaluación de la resistencia a la insulina. (A) Aumento de peso corporal tras 2 semanas de intervención. (B) Niveles de insulina en ayunas medidos en sangre tras 2 semanas de intervención. (C) Evaluación del modelo homeostático calculada para el índice de resistencia a la insulina. Abreviaturas: HFGfD, dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa.

[0307] Figura 3. Expresión relativa de ARNm de (A)a-SMAy (B)COL1A1mediante RT-PCR cuantitativa, expresada como cociente log2. Se utilizó beta-actina como control endógeno y los resultados se normalizaron con respecto al grupo HFGFD-V. Abreviaturas: o-SMA, actina de músculo liso alfa; COL1A1, cadena alfa 1 del colágeno tipo I; HFGFD, dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa.

[0308] Figura 4. Parámetros hemodinámicos hepáticos y marcadores intrahepáticos de disfunción endotelial. (A) Presión portal (PP). (B) Resistencia vascular intrahepática (RVIH). (C-E) Análisis de Western blot de marcadores intrahepáticos de disfunción endotelial. Los diagramas de barras muestran la cuantificación de (P)-Akt fosforilada, P-eNOS y KLF2 utilizando gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga y normalizada con respecto al grupo HFGFD-V. Abreviaturas: Akt, proteína quinasa B; eNOS, óxido nítrico sintasa endotelial; HFGFD, dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa; KLF2, factor tipo Kruppel 2. Figura 5. Índice de diversidad de Simpson inverso. Los números indican los valores p de la prueba t, calculados sin el valor atípico R72.

[0309] Figura 6. Escalamiento multidimensional (EMD). El EMD se basa en las distancias de Bray-Curtis.

[0310] Figura 7. Clasificación sPLS-DA. (A) BER por contraste. (B) Los 10 taxones más discriminantes. (C) Diagrama de Euler de taxones específicos de contraste. Taxones discriminantes: los identificadores de cepas se corresponden con los resultados documentados por el análisis de composición taxonómica de WMS realizado por CosmosID y reflejan la composición de la base de datos utilizada para el análisis. Estos deberían considerarse indicadores de las cepas realmente presentes en cada uno de los grupos de tratamiento. Diagrama de Euler: los números deberían interpretarse de la siguiente manera: para HFGFD-C, 47 taxones inducidos fueron discriminantes para la distinción contra HFGFD-V o HFGFD-Tr, o ambos. 13 taxones inducidos fueron discriminantes contra HFGFD-V en los contrastes V-Tr y V-C. 12 taxones asociados a HFGFD-V y HFGFD-Tr fueron suprimidos por HFGFD-C. 91 taxones asociados a HFGFD-V fueron suprimidos por HFGFD-C o HFGFD-Tr, o ambos.

[0311] Figura 8. Efectos de los consorcios de 6 y 9 cepas sobre (A) los niveles de insulina en ayunas, (B) el índice HOMA-IR y (C-D) la hemodinámica hepática. HFGFD-V: grupo de ratas que recibieron alimentación forzada simulada (vehículo); HFGFD-C1: grupo de ratas que recibieron diariamente el consorcio de 6 cepas; HFGFD-C2: grupo de ratas que recibieron diariamente el consorcio de 9 cepas; HFGFD-Tr: grupo de ratas que recibieron microbiota intestinal (MI) obtenida de ratas control (1 trasplante seguido de alimentación forzada simulada).

[0312] Figura 9. Efectos de los consorcios de 6 y 9 cepas sobre los marcadores de disfunción endotelial.(A) Fosforilación hepática de AKT, (B) fosforilación de eNOS y (C) KLF2.HFGFD-V: grupo de ratas que recibieron alimentación forzada simulada (vehículo); HFGFD-C1: grupo de ratas que recibieron diariamente el consorcio de 6 cepas; HFGFD-C2: grupo de ratas que recibieron diariamente el consorcio de 9 cepas; HFGFD-Tr: grupo de ratas que recibieron microbiota intestinal (MI) obtenida de ratas control (1 trasplante seguido de alimentación forzada simulada). Leyenda: AKT, serina/treonina quinasa AKT; eNOS, óxido nítrico sintasa endotelial; KLF2, factor tipo Kruppel 2.

[0313] Figura 10. Diseño del estudio STAM™.A ratones macho C57BL/6J se les inyectó por vía subcutánea 200 |jg de STZ, una toxina de células p, dos días después del nacimiento. A las 4 semanas de edad, los animales recibieron una dieta rica en grasas (HFD) o una dieta control regular (CD). A las 5 semanas de edad, se inició el tratamiento: los animales con dieta control y los ratones STAM recibieron alimentación forzada simulada (CD+VEH y STAM+VEH, respectivamente) durante un total de 4 semanas. En los dos grupos de prueba, los animales STAM recibieron el consorcio de 9 cepas (109 UFC/día) (STAM+CON) o Telmisartán (10 mg/kg/día) (STAM+TLM), también durante un total de 4 semanas. A las 9 semanas de edad, los animales fueron sacrificados (eutanasia 1). Dos grupos de animales STAM, pertenecientes al grupo control con vehículo o al grupo con consorcio, fueron monitoreados durante tres semanas adicionales hasta su sacrificio a las 12 semanas de edad (eutanasia 2).

[0314] Figura 11. El consorcio de 9 cepas mejora la ganancia de peso corporal en etapas tardías de la enfermedad en ratones STAM™. La ganancia de peso corporal se muestra en relación con el peso registrado a las 5 semanas de edad, cuando se inició el tratamiento con el consorcio de 9 cepas y Telmisartán (TLM) (es decir, una semana después del inicio de HFD). Los animales fueron divididos en varios grupos y se sacrificaron en diferentes momentos (es decir, a las 7, 9 y 12 semanas de edad, para tratar la esteatosis/esteatohepatitis, la fibrosis en fase temprana y la fibrosis en fase tardía, respectivamente). El tratamiento con TLM o el consorcio de 9 cepas se inició a las 5 semanas de edad y se administró durante 2 semanas (hasta la eutanasia 1) o 4 semanas (hasta la eutanasia 2). Algunos animales de los grupos tratados con el consorcio de 9 cepas y con vehículo fueron monitoreados hasta las 12 semanas de edad (eutanasia 3). Leyenda: CD, grupo de dieta control; Euth, eutanasia; TLM, Telmisartán; VEH, vehículo; CON, consorcio de 9 cepas.

[0315] Figura 12. El consorcio de 9 cepas mejora la HbA1c en sangre total. HbA1c (%) en sangre total medida en el estudio STAM™.Se extrajo sangre completa a las 9 y 12 semanas de edad (eutanasia 1 y 2, respectivamente) en tubos heparinizados y se utilizó para el análisis de hemoglobina glucosilada, un marcador que indica la presencia de un exceso de glucosa en sangre. Leyenda: CD, grupo de dieta control; TLM, Telmisartán; VEH, Vehículo; CON, consorcio de 9 cepas.

[0316] Figura 13. Imágenes representativas de secciones de hígado teñidas con H&E (hematoxilina y eosina) obtenidas del estudio STAM™.Se recogieron secciones de hígado a las 9 y 12 semanas de edad (eutanasia 1 y 2, respectivamente).

[0317] Figura 14. Puntuación de actividad de la EHGNA (NAS) en el estudio STAM™.Se evaluó la histopatología en secciones de hígado teñidas con H&E, y la puntuación NAS se calculó según los criterios de Kleiner.(22) Los componentes (A) inflamación, (B) esteatosis, (C) balonización y (D) la puntuación compuesta se evaluaron a las 9 y 12 semanas de edad (eutanasia 1 y 2, respectivamente).<n>D: no determinado para los grupos CD+VEH y STAM+TLM a las 12 semanas.

[0318] Figura 15. Imágenes representativas de secciones de hígado (A) teñidas con rojo picrosirio y (B) inmunoteñidas con F4/80, obtenidas del estudio STAM™. Las secciones de hígado se obtuvieron a las 9 y 12 semanas de edad (eutanasia 1 y 2, respectivamente).

[0319] Figura 16. Área de fibrosis hepática, área positiva para F4/80 y niveles séricos de CK-18 en el estudio STAM™.(A) Fibrosis evaluada en secciones de hígado teñidas con rojo sirio. (B) Inmunohistoquímica de macrófagos evaluada en secciones inmunoteñidas con F4/80. (C) Niveles séricos de CK-18, un marcador de hepatocitos apoptóticos. Todos los marcadores se evaluaron a las 9 y 12 semanas de edad (eutanasia 1 y 2, respectivamente). ND: no determinado para los grupos CD+VEH y STAM+TLM a las 12 semanas.

[0320] Figura 17. Perfiles de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en medio HV5.(A) Cepas deVeillonella parvulayVeillonella atypica.(B) Cepas dePhocaeicola vulgatus.(C) Cepas deBlautia obeum, Blautia wexleraeyBlautia luti.

[0322] Ejemplos

[0324] En el ejemplo 1, se evaluó la eficacia de un consorcio bacteriano compuesto por nueve cepas comensales intestinales humanas en un modelo animalin vivorelevante, es decir, el modelo de hipertensión portal (HTP) en ratas con EHNA. Los resultados se compararon con los de animales que recibieron un único trasplante fecal de ratas delgadas. Se demostró que el consorcio bacteriano mejoró el aumento de peso corporal y la hipertensión portal; además, los marcadores de disfunción endotelial también mejoraron gracias a la restauración de la sensibilidad a la insulina. Además, la transcriptómica hepática identificó numerosas vías profibróticas moduladas favorablemente.

[0325] En el ejemplo 2, se comparó el consorcio de 9 cepas del ejemplo 1 con un consorcio de 6 cepas en el modelo en ratas con EHNA. El consorcio de 9 cepas incluye las 6 cepas del consorcio de 6 cepas, además de 3 especies adicionales que se incluyeron para aumentar la producción de propionato. Ambos consorcios resultaron eficaces: el consorcio de 9 cepas mostró resultados consistentes en los múltiples criterios de valoración, y el consorcio de 6 cepas indujo efectos protectores en varios criterios de valoración, como los niveles de insulina en ayunas, el índice Ho MA-|R y la hemodinámica hepática (PP, RVIH).

[0326] En el ejemplo 3, se evaluó adicionalmente la eficacia del consorcio de 9 cepas en otro modelo animalin vivorelevante, el modelo de ratón STAM™ de EHNA. La administración del consorcio de 9 cepas confirmó sus efectos antifibróticos a las 12 semanas de edad. Además, la inmunohistoquímica con F4/80 fue concomitante con una reducción de la inflamación hepática y los niveles séricos de citoqueratina-18 (CK-18), un marcador sanguíneo de hepatocitos apoptóticos que se correlaciona con la gravedad de la enfermedad, se redujo significativamente 5 semanas después del tratamiento.

[0327] En conjunto, estos resultados demuestran que los enfoques microbianos pueden utilizarse para el tratamiento de afecciones hepáticas, como la EHGNA, y que los consorcios de comensales intestinales ofrecen a los pacientes una solución segura, práctica y a largo plazo para retrasar la progresión de la enfermedad.

[0328] El consorcio de 6 cepas probado comprende las siguientes especies bacterianas:

[0329] •Faecalibacterium prausnitzii

(cepa LMG P-29362)

[0330] •Butiricococcus pullicaecorum

(cepa LMG P-29360)

[0331] •Roseburia inulinivorans

(cepa LMG P-29365)

[0332] •Akkermansia muciniphila

(cepa LMG P-29361)

[0333] •Lactiplantibacillus plantarum

(cepa LMG P-29366)

[0334] •Anaerostipes caccae

(cepa LMG P-29359)

[0335] El consorcio de 9 cepas probado comprende las siguientes especies bacterianas:

[0336] •Faecalibacterium prausnitzii

(cepa LMG p-29362)

[0337] •Butiricococcus pullicaecorum

(cepa LMG p-29360)

[0338] •Roseburia inulinivorans

(cepa LMG-29365)

[0339] •Akkermansia muciniphila

(cepa LMG p-29361)

[0340] •Lactiplantibacillus plantarum

(cepa LMG-29366)

[0341] •Anaerostipes caccae

(cepa LMG-29359)

[0342] •Phocaeicola vulgatus

(cepa LMG17767)

[0343] •Veillonella parvula

(cepa DSM 2007)

[0344] •Blautia obeum

(cepa Ds M 25238)

[0345] También se describe un consorcio de 6 cepas en el documento WO2017/134240. En el documento WO20l7/134/240 se demostró la robustez del consorcio, independientemente de la cepa exacta incluida para cada especie. Por lo tanto, un experto en la materia entiende que los resultados aquí presentados pueden obtenerse utilizando cepas distintas a las ejemplificadas.

[0346] Ejemplo 1: Evaluación de un consorcio de 6 cepas en el modelo de hipertensión portal (HTP) en ratas con EHNA Materiales y métodos

[0347] Diseño experimental

[0348] Para el desarrollo del modelo, se alimentó a ratas Sprague-Dawley con HFGFD (dieta rica en grasas y jarabe alto en glucosa/fructosa) durante 8 semanas (figura 1). Después de eso, se aleatorizaron en tres grupos: HFGFD-vehículo (HFGFD-V, n = 13), HFGFD-consorcio de nueve cepas bacterianas comensales humanas (HFGFD-C, n = 11) y HFGFD-trasplantado con materia fecal de ratas delgadas (HFGFD-Tr, n = 11). Los individuos de HFGFD-V recibieron un vehículo de sondaje oral (PBS estéril), mientras que los individuos de los grupos HFGFD-C y HFGFD-Tr se sometieron a diferentes tratamientos basados en la microbiota, que consistieron en la administración oral de bacterias comensales y el trasplante de microbiota intestinal (M), respectivamente. Cada tratamiento se describe detalladamente en la siguiente sección. El periodo de tratamiento duró dos semanas, durante las cuales los animales se mantuvieron con la dieta original (figura 1). En la semana 10, se realizaron hemodinámica y bioquímica sanguínea hepáticas, y se recogieron muestras de tejido hepático para análisis histológicos y moleculares. Además, se recogió el contenido del intestino ciego para la secuenciación shotgun de microbios intestinales.

[0349] Modelo animal y dieta

[0350] Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley OFA (Charles River Laboratories, L'Arbresle, Francia), con un peso de 200-220 g al inicio de los experimentos, para el modelo de EHNA inducida por la dieta, como se describió previamente en (9). Las ratas se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad de l2 horas a temperatura constante (24 ± 10C) y humedad relativa (55 ± 10 %). Los animales tuvieron accesoad libituma una dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa (HFGFD), compuesta por un 30 % de grasa (mantequilla, aceite de coco, aceite de palma, sebo de res) con ácidos grasos saturados (5,73 kcal/g; Ssniff Spezialdiaten GmbH, Soest, Alemania), suplementada con colesterol (1 g/kg) y una bebida con alto contenido de glucosa/fructosa (42 g/l, 45 % de glucosa y 55 % de fructosa), que aporta 157,7 kcal/l. Se monitorizó el peso corporal y el consumo de alimento y bebida una vez por semana.

[0351] Todos los procedimientos se llevaron de acuerdo con las Directrices de la Unión Europea para el cuidado ético de los animales de experimentación (Directiva CE 86/609/CEE para experimentos con animales), aprobadas por el Comité de Ética de Experimentación Animal del Instituto Valí d'Hebron de Recerca (Barcelona, España), y se llevaron a cabo en las instalaciones de dicho laboratorio.

[0352] Tratamiento con consorcio bacteriano

[0353] El tratamiento con consorcio comenzó tras 8 semanas de intervención dietética. Los viales liofilizados que contenían las nueve cepas bacterianas se resuspendieron en condiciones anaeróbicas (N2:C02 :H2: 80:10:1o). Tras la descontaminación de la cámara anaeróbica y la tapa de los viales, las cepas concentradas se resuspendieron cuidadosamente en 20 mí de DPBS anaeróbica previamente filtrada (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio, Sigma Aldrich). El contenido del vial se dividió en tubos falcon estériles de 50 mí mediante vertido y se extrajo de la cámara anaeróbica. Los tubos falcon de 50 mí se centrifugaron a 5340 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los tubos falcon se devolvieron a la cámara anaeróbica y el sobrenadante se descartó mediante vertido. Cada sedimento se resuspendió en 3 mí de DPBS anaeróbica y, posteriormente, se añadieron 3,5 mí de DPBS a cada tubo para obtener un volumen final de 6,5 mí por vial. Finalmente, toda la muestra se transfirió a un vial de vidrio estéril cerrado con atmósfera anaeróbica. Una vez reconstituido el consorcio, se administró inmediatamente 1 mí de suspensión por individuo (correspondiente a una dosis diaria de 2 x 109 UFC), utilizando una sonda oral desechable (Biochrom Ltd, Cambridge, Reino Unido) y repitiendo el procedimiento cada 24 horas durante 10 días consecutivos. En el caso de los individuos del grupo con vehículo, se siguió el mismo procedimiento, pero se administró DPBS estéril. Las ratas que recibieron el consorcio bacteriano se alojaron individualmente durante todo el tratamiento para evitar la contaminación cruzada.

[0354] Trasplante de microbiota intestinal (MI)

[0355] El trasplante de MI se realizó tras 8 semanas de intervención dietética. Para lograr una mayor homogeneidad en el procedimiento de trasplante, se combinaron las heces de tres ratas donantes control (delgadas) para su uso en el trasplante intramuscular. Con el objetivo de reducir la acidez gástrica y, por lo tanto, aumentar la supervivencia de los microorganismos, se administró omeprazol por vía oral en una dosis de 50 kg/día durante los 3 días previos a la descontaminación intestinal. Para proceder al vaciado intestinal, las ratas se mantuvieron aisladas en rejillas para ayuno y se les administraron dos dosis orales de CitraFleet (picosulfato de sodio, 0,16 mg/ml y óxido de magnesio, 51,2 mg/ml) de 1 mí y 2 mí 24 y 12 horas, respectivamente, antes del trasplante. Estas administraciones se acompañaron de 2 mí de agua cada una. La recolonización se realizó mediante una única sonda oral, para lo cual se disolvieron 100 mg del reservorio fecal en 2 mí de DPBS estéril.Bioquímica sanguínea

[0356] Se recogieron muestras de sangre de la vena cava en el momento del sacrificio. La glucosa, la bilirrubina, la alanina aminotransferasa (ALT), la aspartato aminotransferasa (AST), el colesterol, las Íipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés), las Iipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés), los triglicéridos y la albúmina se midieron con métodos estándar (véase Garcia-Lezana, T et al. Restoration of a Healthy Intestinal Microbiota Normalizes Portal Hypertension in a Rat Model of Nonalcoholic Steatohepatitis. HEPATo LOGY 2018;67(4)). La insulina se midió con un kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (EMD Millipore, Billerica, MA, Estados Unidos). La resistencia a la insulina se estimó mediante el modelo homeostático del índice de resistencia a la insulina (HOMA-IR, por sus siglas en inglés): (insulina en ayunas [ng/mL] x glucosa en ayunas [mg/dL])/405.

[0357] Análisis histológico

[0358] Para los análisis histológicos, se extrajeron muestras de hígado, se fijaron en formalina al 4 %, se incluyeron en parafina líquida a 65 °C y se seccionaron en portaobjetos de 4 |_im de grosor. Las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar el parénquima hepático y con rojo sirio para detectar fibras de colágeno. Todas las muestras de hígado teñidas fueron examinadas por un hepatólogo experto, que desconocía las intervenciones realizadas en los animales.

[0359] El diagnóstico de EHNA se basó se estableció con base en la presencia de los tres patrones característicos de la enfermedad, que incluyen la coexistencia de esteatosis, la inflamación lobular y la balonización hepatocelular. Se utilizó la puntuación de actividad de la red de investigación clínica de e HnA (NASH-CRN, por sus siglas en inglés) (<n>AS) para cuantificar la actividad de EHNA. ÑAS comprende la suma no ponderada de los componentes histológicos: esteatosis (0-3), inflamación lobular (0-3) y balonización hepatocelular (0-2). La fibrosis también se clasificó en cinco estadios según el sistema NASH-CRN, que van desde F0 (sin fibrosis) hasta F4 (cirrosis).

[0360] Hemodinámica hepática

[0361] Las mediciones hemodinámicas se realizaron en ratas en ayunas bajo anestesia intraperitoneal con ketamina (100 mg/kg) y midazolam (5 mg/kg) y con una temperatura corporal mantenida a 37 0C. La presión arterial media (PAM) se midió mediante cateterización de la arteria femoral y la presión portal (PP) se evaluó mediante cateterización de la vena ileocólica utilizando transductores de presión de alta sensibilidad (Harvard Equipment, Holliston, MA, EE. UU.). El flujo sanguíneo de la arteria mesentérica superior (AMS) (FSAMS, mL/[min*100 g]) y el flujo sanguíneo portal (Fs P, mL/[min*100 g]) se midieron con una sonda de flujo de tiempo de tránsito ultrasónico perivascular (1 mm de diámetro, Transonic Systems Inc., Ithaca, ÑY, EE. UU.). La resistencia a la AMS (RAMS) y la resistencia vascular intrahepática (RVIH, mmHg/mL*min*100 g) se calcularon como ([PAM-PP]/FAMS) y (PP/FSP), respectivamente.

[0362] Transferencia Western

[0363] Los hígados se perfundieron con solución salina para su desangrado y las muestras se congelaron directamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °c hasta su uso posterior. A continuación, las muestras de hígado se trituraron en frío, lo que evitó la descongelación, hasta convertirlas manualmente en polvo. Posteriormente, se homogeneizaron en tampón de lisis Tritón, se sonicaron y se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 min a 4 °C. La concentración de proteína total en el sobrenadante se cuantificó mediante el kit de ensayó de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se analizaron cuarenta (40) jg de proteína en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % (SDS-PAGE). Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las membranas se lavaron con TTBS 1x varias veces y se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con PhosphoBLOCKER™ al 5 % (Cell Biolabs, San Diego, CA, EE. UU.) para detectar las proteínas fosforiladas P-Akt (1/5o0, Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.) y P-eÑOS (Ser1177, 1/250) o con leche desnatada para detectar el factor tipo Kruppel 2 (KLF2) (1/200, Santa Cruz Biótechnology, Dallas, TX, EE. UU.). Se utilizó el anticuerpo GAPDH (1/500o, Ambion, Austin, TX, EE. UU.) como control de carga. Las membranas se desarrollaron con el kit ECL (Ge Healthcare; Little Chalfont, Reinó Unido) y la expresión proteica se determinó finalmente mediante bandas de análisis de densitometría usando Image Studio Lite (Lincoln, ÑE, EE. UU.).

[0364] PCR en tiempo real

[0365] Las muestras de hígado e íleon se mantuvieron al menos 24 h en RÑAlater (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y posteriormente se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis. El ARÑ total se extrajo con el kit RÑeasy mini (QIAGEN, Venlo, Países Bajos) y se retrotranscribió a ADÑ complementario (transcripción inversa de ADNc de alta capacidad, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se añadieron veinte (20) ng de ADNc a la mezcla maestra universal de PCR Taqman, juntó con las sondas Taqman específicas para o-S<m>A (actina de músculo liso alfa) y COL1A1 (cadena alfa 1 del colágeno tipo I) (Life Technologies Ltd, Renfrew, Reinó Unido), y se cargaron en placas de 384 pocilios (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) con el sistema de PCR en tiempo real 7900HT Fast (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La expresión génica relativa se normalizó con beta-actina. Los datos se analizaron usando la aplicación de cuantificación relativa qPCR de Thermofisher Cloud.

[0366] Shotgun del metagenoma completo del ciego

[0367] Se extrajo ADÑ genómico de aproximadamente 0,2 g del ciego de cada rata utilizando el kit ZymobioMics DNA Miniprep (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cuantificó con el fluorómetro Qubit™ Flex (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) y se utilizó para la secuenciación shotgun del metagenoma completo. La preparación y secuenciación de la biblioteca se realizó mediante CosmosID (Rockville, MD, EE. UU.) para generar dos lecturas de lllumina de 150 pb. Las lecturas de secuenciación no ensambladas (profundidad de lectura >12 M) se analizaron utilizando la plataforma bioinformática CosmosID para la elaboración de perfiles taxonómicos y funcionales.

[0368] [0210] La secuenciación shotgun completa (WMS, por sus siglas en inglés) del metagenoma, así como el perfil taxonómico y de vías, se realizaron con CosmosID (Rockville, MD, EE. UU.). Se mapearon dos lecturas de lllumina de 150 pb a una base de datos propia de genoma microbiano para el perfil taxonómico (Thoendel M et al. Journal of Clinical Microbiology 2020;58(3):<e>00981-19) y a UniRef90 y MetaCyc para el perfil de vías (Franzosa EA et al. Species-Ievel functional profiling of metagenomes and metatranscriptomes. Nature Methods 2018;15(11):962-8). La modulación de la composición microbiana inducida por el tratamiento se evaluó mediante análisis no supervisado (escalamiento multidimensional mediante distancias UniFrac) y análisis supervisado (análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales dispersos, sPLS-DA), utilizando los paquetes R phyloseq (McMurdie PJ, Holmes S. PLoS ONE 2013;8(4):e61217) y mixOmics (Rohart F. PLOS Computational Biology 2017;13(11):<e>1005752), respectivamente. El rendimiento del clasificador para este último se evaluó a través de la tasa de error equilibrada (TEE).

[0371] FP FN

[0372] BER= 0.5 x (;TN FP + -TP FN)

[0374] Transcriptómica hepática

[0376] La extracción de ARN, la preparación de la biblioteca de ARN y las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en GENEWIZ, LLC (South Plainfield, NJ, EE. UU.) de la siguiente manera: se extrajo el ARN total de muestras de tejido hepático fresco congelado utilizando el minikit Qiagen RNeasy Plus Universal siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). Las muestras de ARN se cuantificaron con el fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y la integridad del ARN se midió con la cinta de cribado de ARN de Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.). Las bibliotecas de secuenciación de ARN se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARNm TruSeq Stranded, siguiendo el protocolo del fabricante (lllumina, n.° de cat. RS-122-2101). En primer lugar, los ARNm se enriquecieron con microesferas Oligo d(T). Los ARNm enriquecidos se fragmentaron durante 8 minutos a 940C. Posteriormente, se sintetizaron las cadenas de ADN<c>primera y segunda. La segunda cadena de ADN<c>se marcó mediante la incorporación de dUTP durante la síntesis. Los fragmentos de ADN<c>se adenilaron en los extremos 3' y los adaptadores indexados se ligaron a los fragmentos de ADN<c>. Se utilizó PCR de ciclo limitado para el enriquecimiento de la biblioteca. Los dUTP incorporados en la segunda cadena de ADNc extinguieron la amplificación, lo que preservó la especificidad de la cadena. Las bibliotecas de secuenciación se validaron utilizando la cinta de análisis de ADN en la TapeStation Agilent 2200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) y se cuantificaron mediante el fluorómetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA), así como mediante PCR cuantitativa (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, EE. UU.). Las bibliotecas agrupadas se agruparon en 7 carriles de una celda de flujo. Tras la agrupación, la celda de flujo se cargó en el instrumento lllumina HiSeq (4000 o equivalente) según las instrucciones del fabricante y se secuenció utilizando una configuración de extremos emparejados (PE) de 2<x>150 pb. El análisis de imágenes y la identificación de bases se realizaron con elsoftwarede control HiSeq (HCS). Los datos de secuencia sin procesar (archivos .bel) generados por lllumina HiSeq se convirtieron a archivos fastq y se demultiplexaron con elsoftwarebeI2fastq 2.17 de lllumina. Se permitió una discordancia para la identificación de la secuencia índice.

[0378] El perfil de expresión géniea específico de cada hebra se obtuvo mediante el mapeo de lecturas de lllumina de 2x150 pb al transeriptomaEnsembl Rattus norvegicusRnor_6.0 y el procesamiento de las alineaciones con featureCounts del paquete de sublecturas (Liao Y et al. Bioinformaties 2014;30(7):923-30). Los identifieadores de genes Ensembl de rata se mapearon a sus equivalentes en genes Ensembl humanos y a los símbolos del Comité de Nomenclatura Géniea HUGO (HGNC) a través de Ensembl Biomart. Los recuentos de fragmentos de mapeo único resultantes se incorporaron al análisis de expresión géniea diferencial con el paquete R DESeq2 (Anders S, Huber W. Genome Biology 2010;11(10):R106) para obtener genes expresados diferencialmente con valores p ajustados según la tasa de falsos descubrimientos (FDR, por sus siglas en inglés) de Benjamini y Hoehberg. Se realizó un análisis de valores atípicos mediante un análisis de mínimos cuadrados parciales ortogonales con el paquete R ropls (Thévenot EA. Journal of Proteome Research 2015;14(8):3322-35). Simultáneamente, se realizó sPLS-DA para estimar la importancia de la variable (VlP). Los genes hepáticos discriminantes para los contrastes de tratamiento frente a vehículo se mantuvieron con un VlP > 1 y un valor p ajustado < 0,05. El análisis de sobrerrepresentaeión funcional (ORA, por sus siglas en inglés) en estos genes se realizó con el paquete R elusterProfiler (Wu T et al. The Innovation 2021;2(3):100141), utilizando la base de datos de anotación funcional WikiPathways (Martens M et al. Nucleic Aeids Research 202;49(D1):D613-21). Se utilizó el paquete R ReisTarget (Aibar S et al. SCENIC: Single-eell regulatory network inferenee and elustering. Nature Methods 2017;14(11):1083-6) para predecir los motivos de transcripción enriquecidos en genes subexpresados o sobreexpresados. Se conservaron los factores de transcripción de alta confiabilidad asociados a estos motivos.

[0380] Análisis de parámetros biológicos

[0382] Las variables continuas se documentaron como media ± error estándar de la media (EEM). Los análisis estadísticos se realizaron con elsoftwareGraphPad Prism (GraphPadSoftware,San Diego, CA). Los parámetros biológicos de los grupos de tratamiento se compararon mediante la prueba t de Student o un ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

[0383] Resultados

[0384] El tratamiento con consorcio mejoró significativamente el peso corporal

[0385] Durante el período de tratamiento de 2 semanas, los animales del grupo HFGFD-V aumentaron considerablemente su peso corporal (22,08 ± 3,18 g), como se observa en la figura 2A. Sin embargo, el grupo HFGFD-C solo aumentó un promedio de 2,91 ± 3,55 g, mientras que el grupo HFGFD-Tr perdió un promedio de 5 ± 3,47 g. En comparación con el grupo HFGFD-V, ambos grupos que recibieron tratamientos basados en la microbiota aumentaron significativamente menos peso durante el período de tratamiento de 2 semanas (figura 2A).

[0386] El tratamiento con consorcio mejoró significativamente el perfil metabólico

[0387] Como se ha visto en las figuras 2B y C y la tabla 2, ambos tratamientos basados en la microbiota mostraron reducciones importantes en los niveles de insulina sanguínea en ayunas y en el índice HOMA-IR con respecto al grupo HFGFD-V.

[0388] Tabla 2: Características bioquímicas tras 2 semanas de intervención.

[0389] HFGFD-V HFGFD-C HFGFD-TrN=13 N=11 N=11 Peso corporal antes del tratamiento (g)531,7 ± 10,3 543,6 ± 10,29 515,1 ± 13,48Aumento de peso corporal con tratamiento (g)22,08 ± 3,182,91 ± 3,55* -5 ± 3,47* Peso cor oral des ués del tratamiento55233 ± 1177 5466 ± 1153507 ± 1239*

[0392]

[0394] *P < 0,05 frente a HFGFD-V. Abreviaturas: ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa; HDL, lipoproteína de alta densidad; HFGFD, dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa; HOMA-IR, índice de resistencia a la insulina del modelo de homeostasis; LDL, lipoproteína de baja densidad; TG, triglicéridos.Expresión reducida de genes marcadores hepáticos profibróticos

[0395] Al momento del sacrificio de los animales (10 semanas con HFGFD), las vías profibróticas ya estaban activadas, y la expresión génica de los marcadores hepáticos profibróticos o-SMA y COL1A1 se redujo significativamente en el grupo tratado con el consorcio en comparación con el grupo con vehículo (figura 3). Estos resultados se corroboran aún más con los resultados del análisis de ARN-Seq de todo el genoma, que se analizan a continuación.

[0396] El tratamiento con consorcio redujo significativamente la presión portal y mejoró la hemodinámica hepática[0217] En consonancia con los descubrimientos previos (9) y, a pesar de la ausencia de fibrosis histológica, los animales sometidos a una intervención de HFGFd de 10 semanas mostraron un aumento de la presión portal (PP) con valores promedio de 10,32 mmHg (tabla 3 y figura 4A). Cabe destacar que tanto el tratamiento con consorcio bacteriano como el trasplante de MI redujeron significativamente la PP en comparación con el grupo tratado con vehículo, incluso manteniendo la HFG<f>D durante el período de tratamiento de 2 semanas (tabla 3 y figura 4A). Esta disminución de la PP observada en el grupo HFGFD-C fue secundaria a una disminución significativa (reducción del 80 %) de la resistencia vascular intrahepática (RVIH) en comparación con el grupo HFGFD-V, en un grado similar al observado en el grupo Ml-Tr (reducción del 104 %) (figura 4B). Con respecto a la hemodinámica sistémica, no se observaron cambios relevantes entre los grupos (tabla 3).

[0397] Tabla 3: Mediciones hemodinámicas tras 2 semanas de intervención.

[0398] HFGFD-V HFGFD-C HFGFD-TR N=13 N=11 N=11 PAM (mmHg)113,05 ± 4,53 119,95 ± 4,21 117,34 ± 5,14PP (mmHg)10,32 ± 0,229,58 ± 0,19* 9,21 ± 0,12* FSAMS (mL/[min * 100 g])2,73 ± 0,24 2,71 ± 0,21 2,82 ± 0,17RAMS (mmHg/mL * min * 100 g)40,78 ± 3,25 40,79 ± 4,36 39,35 ± 2,36RVIH (mmHg/mL*min*100 g)7,58 ± 1,274,20 ± 0,35* 3,71 ± 0,21**P < 0,05 frente a HFGFD-V. Abreviaturas: HFGFD, dieta rica en grasas y rica en glucosa/fructosa; RVIH, resistencia vascular intrahepática; PAM, presión arterial media; PP, presión portal; FSAMS, flujo sanguíneo de la arteria mesentérica superior; RAMS, resistencia de la arteria mesentérica superior.

[0399] Las características de la disfunción endotelial (DE) mejoraron en los animales después de recibir el tratamiento con consorcio.

[0400] Se evaluaron las características moleculares de la DE para caracterizar con mayor precisión los cambios observados en la RVIH y la PP inducidos por los tratamientos basados en la microbiota con respecto al grupo tratado con vehículo. Para este propósito, analizamos la proteína quinasa fosforilada B (P-Akt) y la óxido nítrico sintasa endotelial (P-eNOS). Además, para evaluar los posibles mecanismos de regulación transcripcional de la e-NOS, se evaluó KLF2, ya que se considera esencial para mantener el fenotipo endotelial funcional. Como se observa en la figura 4C-E, los tratamientos basados en la microbiota indujeron un aumento significativo de P-Akt. La P-eNOS mostró una tendencia al aumento tanto de HFGFD-C como de HFGFD-Tr en comparación con HFGFD-V. Curiosamente, HFGFD-C fue la única que mostró un aumento significativo de KLF2.

[0401] Los tratamientos basados en la microbiota mejoran la diversidad de especies cecales e impulsan cambios importantes en la composición del microbioma cecal.

[0402] Como lo muestra el índice de Simpson inverso del paquete phyloseq (figura 5), los tratamientos basados en la microbiota mejoran la diversidad de especies cecales. Se identificó un valor atípico en el grupo de tratamiento con consorcio microbiano, la rata R72 del segundo lote.

[0403] La diversidad beta apreciada a través del escalamiento multidimensional aplicado sin el grupo CD muestra una buena separación de los grupos HGHFD-V, HGFD-C y HGFD-Tr (figura 6).

[0404] El rendimiento del clasificador, tal y como se aprecia a través de la BER para el contraste HFGFD-C (o,03), se compara favorablemente con el contraste HFGFD-Tr (0,34) (figura 7A). Por lo tanto, se puede argumentar que HFGFD-C induce un cambio más definido que HFGFD-Tr, pero esto puede estar dominado o incluso limitado por la adición de cepas producto. Sin embargo, la selección de características correspondiente (VIP > 1, n = 123) muestra que el tratamiento con consorcio bacteriano indujo la supresión de 72 taxones asociados al vehículo (58,5 % del cambio observable) y promovió la emergencia de 48 taxones asociados al tratamiento sin producto (41,5 %), mientras que el trasplante de microbiota según la selección de características (n = 178) indujo la supresión de 135 taxones (75,8 %) y su reemplazo por 43 taxones (24,2 %). Por lo tanto, ambos tratamientos generaron un reemplazo importante de la comunidad microbiana asociada a HGHFD-V, pero el consorcio bacteriano logró un reemplazo más definido y rico que el trasplante, mientras que el trasplante tuvo un efecto más supresor, posiblemente debido al procedimiento de vaciado intestinal realizado en este grupo antes del trasplante para mejorar el injerto. La figura 7B proporciona los 10 taxones más discriminantes según la importancia de la variable estimada (ViP) del clasificador y sus asociaciones, mientras que la figura 7C combina los tres contrastes V-C, V-Tr y C-Tr en un único diagrama de Euler proporcional al número de características seleccionadas para cada contraste.

[0405] El tratamiento con consorcio bacteriano induce la expresión diferencial de genes hepáticos y regula negativamente los genes asociados a la fibrosis

[0406] La expresión de 32,552 genes hepáticos se documentó mediante análisis de ARN-Seq. De estos, 732 (2,2 %) resultaron discriminantes (VIP > 1, valor p de FDR < 0,05) para los contrastes HFHGD-C (n = 252) o HFhGd-Tr (n = 632), o ambos. En el caso de la HGHFD-C, se observó una tendencia hacia la regulación positiva de los genes asociados al tratamiento (n = 157, 62,3 %), mientras que en el caso de la HGHFD-Tr, se observó un equilibrio entre la regulación positiva de los genes asociados al tratamiento (n = 315, 49,8 %) y la regulación negativa de los genes asociados al vehículo (n = 317, 50,4 %).

[0407] [0223] Realizamos un análisis de sobrerrepresentación (ORA) en genes regulados positivamente en HFHGD-C o HFHGD-Tr, o en ambos, el cual no detectó ninguna sobrerrepresentación significativa de las vías en comparación con la base de datos de anotaciones WikiPathways. El mismo análisis realizado en genes regulados negativamente detectó varias vías asociadas con la fibrosis.

[0408] Ejemplo 2: comparación de un consorcio de 6 cepas y un consorcio de 9 cepas en el modelo de hipertensión portal (HTP) en ratas con EHNA

[0409] El ejemplo 2 se realizó utilizando los mismos materiales y métodos descritos para el ejemplo 1. El consorcio de 9 cepas mostró resultados consistentes en los diferentes criterios de valoración. El consorcio de 6 cepas también indujo efectos protectores significativos, particularmente en los niveles de insulina en ayunas, el índice HOMA-IR y la hemodinámica hepática (PP, RVIH) (figura 8).

[0410] En el grupo tratado con el consorcio de 6 cepas, la (p)-AKT fosforilada y la p-eNOS no se modificaron significativamente en respuesta al tratamiento (figuras 9A y B), lo que sugiere que otros mecanismos podrían estar involucrados en la mejora de la resistencia a la insulina y, por consiguiente, la hipertensión portal; además, el aumento en la expresión de KLF2 parece ser específico del consorcio de 9 cepas (figura 9C).

[0411] Por lo tanto, a pesar de su composición similar, los efectos de estos dos consorcios no fueron totalmente comparables. En particular, la adición de (más) cepas capaces de producir propionato parece ser ventajosa y podría activar mecanismos beneficiosos adicionales.

[0412] Ejemplo 3: modelo de ratón STAM™ de EHNA

[0413] Materiales y métodos

[0414] Diseño experimental

[0415] El estudio STAM™ fue realizado por SMC Laboratories en Japón. Brevemente, se indujo EHNA en ratones macho C57BL/6J mediante una única inyección subcutánea de 20o jg de solución de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, EE. UU.) 2 días después del nacimiento y mediante la introducción de una dieta rica en grasas (HFD, 57 kcal % grasa, Cat# HFD32, CLEA Japan, Inc., Japón) a las 4 semanas de edad.

[0416] El modelo de ratón STAM presenta la importante ventaja de que el desarrollo de CHC a partir de EHNA es idéntico a la progresión conocida en pacientes humanos, pero con un proceso completo que se completa en un período relativamente corto (Fujii, M. et al. Med. Mol. Morphol. 2013;46:141-152). En este modelo, a ratones macho C57BL/6 de dos días de edad se les administra una dosis única de estreptozotocina (STZ) para reducir la capacidad secretora de insulina. A las 4 semanas de edad, comienzan una dieta rica en grasas (h Fd ). El modelo se puede resumir de la siguiente manera (tabla 4):

[0417] Tabla 4: Pro resión de la enfermedad en el modelo de ratón STAM™ de EHNA

[0419]

[0420]

[0423] Dos días después del nacimiento, se inyecta STZ, una toxina de células beta, a ratones C57BL/6J. Esto prepara a los animales, de modo que, cuando se inicia el segundo tratamiento a las 4 semanas de edad, es decir, el inicio de una dieta rica en grasas (HFD), la enfermedad progresa rápidamente. A las 5 semanas de edad, se observa acumulación de lípidos hepáticos (esteatosis) y, a las 6 semanas, los animales presentan un mayor índice de actividad de la EHGNA (nAS) en la histología y niveles elevados de ALT. Entre las 7 y las 8 semanas de edad, la inflamación hepática es evidente, y entre las 9 y las 12 semanas, la fibrosis es evidente. El CHC se puede observar aproximadamente a las 16 semanas de edad. Este modelo concuerda con la diabetes tipo 2 tardía, que progresa a hígado graso, EHNA, fibrosis y, en consecuencia, cáncer de hígado (CHC). En comparación con otros modelos de EHNA-CHC, la enfermedad progresa en un período relativamente corto, y el cáncer de hígado se desarrolla en todos los animales a las 20 semanas de edad. Una ventaja de este modelo es la rápida aparición y progresión de la enfermedad, así como la completa penetración del fenotipo. Según la fase de progresión de la enfermedad, los animales se sacrifican en etapas tempranas o tardías. El modelo muestra signos notables de fibrosis en la histopatología.

[0425] Los animales se asignaron aleatoriamente a tres grupos de tratamiento según su peso corporal el día anterior a la alimentación HFD. La aleatorización se realizó mediante un muestreo aleatorio estratificado por peso corporal utilizando el programa Excel. A las 5 semanas de edad (tras una semana de dieta rica en grasas), los animales recibieron alimentación forzada simulada (STAM+VEH, n = 16), el consorcio bacteriano de 9 cepas (STAM+CON, n = 18) o Telmisartán (STAM+TLM, n = 8). En este estudio también se incluyó un grupo control alimentado con dieta regular y con alimentación forzada simulada (CD+VEH, n = 8) (figura 10). Los animales se mantuvieron en instalaciones SPF bajo condiciones controladas de temperatura (23 ± 30C), humedad (50 ± 20 %), iluminación (ciclos de luz artificial y oscuridad de 12 horas; luz de 8:00 a 20:00) y renovación del aire. Este experimento con animales se llevó a cabo de acuerdo con las siguientes directrices:Act on Welfare and Management of Animals(Ley de Bienestar y Manejo de Animales) (Ministerio de Medio Ambiente, Ley n.° 105 del 1 de octubre de 1973, Japón;Standards Relating to the Care and Management of Laboratory Animals and Relief of Pain(Normas relativas al cuidado y manejo de animales de laboratorio y al alivio del dolor)(Notice No. 88 of the Ministry of the Environment,28 de abril de 2006, Japón) (Aviso n.° 88 del Ministerio de Medio Ambiente, 28 de abril de 2006, Japón) yGuidelines for Proper Conduct of Animal Experiments(Directrices para la Conducta Adecuada de Experimentos con Animales) (Consejo Científico de Japón, 1 de junio de 2006).

[0427] Administración del tratamiento

[0429] El vehículo (PBS estéril) y el consorcio bacteriano se administraron por vía oral en un volumen de 200 ql/ratón; el consorcio se administró a una dosis de 109 UFC/día durante un total de 4 semanas. Las suspensiones del producto se prepararon como se describió anteriormente. Se utilizó Telmisartán como referencia y se administró por vía oral a una dosis diaria de 10 mg/kg en un volumen de 10 ml/kg durante 4 semanas. Para ello, se transfirió una tableta de Telmisartán a un mortero y se trituró con agua pura hasta obtener una suspensión homogénea de 1 mg/ml. Todos los tratamientos se prepararon en el momento antes de su administración. El peso corporal se registró diariamente durante el período experimental.

[0431] Sacrificio y toma de muestras

[0433] [0232] Los animales pertenecientes a los grupos control (CD+VEH) y STAM (STAM+VEH, STAM+CON y STAM+TLM) fueron sacrificados tras 4 semanas de tratamiento, es decir, a las 9 semanas de edad, lo que corresponde a una etapa de esteatohepatitis/fibrosis temprana. Además, dos grupos de animales STAM, pertenecientes a los grupos con vehículo y consorcio, fueron monitoreados durante tres semanas adicionales y sacrificados a las 12 semanas de edad, lo que corresponde a una etapa de fibrosis tardía. Esto se realizó para investigar el potencial del consorcio bacteriano para retrasar la progresión de la enfermedad tras la interrupción del tratamiento (figura 10). Los animales fueron sacrificados por exanguinación mediante punción cardíaca directa bajo anestesia con isoflurano (Pfizer Inc.). Se extrajo sangre de la vena facial en tubos de polipropileno con anticoagulante (Novo-heparina, Mochida Pharmaceutical, Japón). Se utilizaron cincuenta (50) qL de sangre recogida para el análisis de hemoglobina glucosilada (HbAlc). También se recogió sangre sin ayuno para la preparación del suero en tubos separados sin anticoagulante. Estas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se centrifugaron a 3500 xg durante 5 minutos a 4 °C. El suero restante se recogió y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior para la cuantificación de los niveles séricos de CK-18 y la bioquímica. Se recogió el hígado completo y se lavó con solución salina fría. Las muestras de hígado se almacenaron a -80 °C, incluidas en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT, por sus siglas en inglés, Sakura Finetek Japan, Japón) para inmunohistoquímica, o fijadas en solución de Bouin (Sigma-Aldrich Japón) durante 24 horas. Tras la fijación, estas muestras se incluyeron en parafina para tinción con H&E y rojo sirio. Las muestras incluidas en la o Ct se utilizaron para la inmunohistoquímica F4/80 (véase más adelante).

[0435] Bioquímica sanguínea

[0437] La HbAlc en sangre completa se cuantificó con el equipo DCN2000+ (Siemens Healthcare Diagnostics, EE. UU.). Los niveles séricos de CK-18 se midieron usando el kit ELISA de citoqueratina de ratón 18-M30 (Cusabio Biotech Co., Ltd, China). Los niveles séricos de alanina aminotransferasa (ALT) y triglicéridos se midieron mediante FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm Corporation). Los niveles séricos de colesterol total, colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) y colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) se cuantificaron mediante HPLC en Skylight Biotech Inc. (japón).

[0439] Análisis histológicos

[0441] Se cortaron secciones de bloques de parafina de tejido hepático utilizando un micrótomo rotatorio (Leica Microsystems). Tras el seccionamiento, cada portaobjetos se codificó con un número para su evaluación a ciegas. Cada número se generó mediante la función RAND delsoftwareExcel, se ordenó de forma ascendente y se asignó a los portaobjetos. Los portaobjetos de tejido se utilizaron para las siguientes tinciones y fueron evaluados por un experimentador: para la tinción con H&E, se cortaron secciones de bloques de parafina de tejido hepático prefijados en solución de Bouin y se tiñeron con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japón) y solución de eosina (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Japón). La puntuación de actividad de la EhGNA (ÑAS) se calculó según los criterios de Kleiner.(22) Para la puntuación de ÑAS, se obtuvo una imagen de campo claro de secciones teñidas con H&E con una cámara digital (DFC295; Leica, Alemania) con un aumento de 50 y 200 veces. Se calculó la puntuación de esteatosis en una sección/ratón (un campo representativo con un aumento de 50 veces), la puntuación de inflamación en una sección/ratón (un campo representativo alrededor de la vena central con un aumento de 200 veces) y la puntuación de balonización en una sección/ratón (un campo representativo alrededor de la vena central con un aumento de 200 veces). Para visualizar la deposición de colágeno, se tiñeron secciones de hígado fijadas con Bouin con solución de rojo picrosirio (Waldeck, Alemania). Brevemente, las secciones se desparafinaron e hidrofilizaron con xileno, una solución de alcohol al 100-70 % y agua de ósmosis inversa, y posteriormente se trataron con una solución de rojo picrosirio al 0,03 % (n.0 de cat.: 1A-280) durante 60 minutos. Tras lavar con una solución de ácido acético al 0,5 % y agua de ósmosis inversa, las secciones teñidas se deshidrataron y se aclararon con alcohol al 70-100 % y xileno. Posteriormente, se sellaron con Entellan™ (Merck, Alemania) y se utilizaron para la observación. Para el análisis cuantitativo del área de fibrosis, se capturaron imágenes de campo brillante de la sección teñida con rojo sirio alrededor de la vena central usando una cámara digital (DFC295; Leica, Alemania) con un aumento de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron usando elsoftwareImageJ(National Institute of Health)

(Instituto Nacional de Salud, EE. UU.).

[0443] Para la inmunohistoquímica, se realizaron cortes de tejido hepático congelado, incluidos en el compuesto Tissue-Tek O.C.T. y fijados en acetona. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 0,03 % durante 5 minutos, seguido de una incubación con Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Japón) durante 10 minutos. Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-F4/80 durante la noche (Anticuerpo Monoclonal, T-2006, BMA Biomedicals) a 4 °C. Tras la incubación con anticuerpo secundario (VECTASTAIN ABC KIT, PK-4004, Vector Laboratories), se realizaron reacciones enzima-sustrato con una solución de 3,3'-diaminobencidina/H202 (Ñichirei Bioscience Inc., Japón). Se capturaron imágenes de campo claro de secciones inmunoteñidas con F4/80 alrededor de la vena central con una cámara digital (DFC295; Leica, Alemania) con un aumento de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron con elsoftwareImageJ (Instituto Nacional de Salud, EE. Uu .).

[0445] Resultados

[0447] [0236] Dado que la transcriptómica hepática realizada en ratas con EHNA sugirió que el consorcio bacteriano probado podría modular favorablemente las vías profibrogénicas, nos propusimos probar el mismo consorcio en un modelo de roedor que presenta signos notables de fibrosis en la histopatología. Para ello, se utilizó el modelo de ratón STAM™. En este modelo, se inyectó STZ, una toxina de células p que induce una leve inflamación y destrucción de los islotes, a ratones macho poco después del nacimiento. Además, los ratones sensibilizados con STZ iniciaron una HDF continua a las 4 semanas de edad. Esto induce cambios histológicos secuenciales desde hígado graso hasta EHNA, fibrosis y, finalmente, protrusión tumoral. La enfermedad progresa rápidamente, con una penetrancia cercana al 100 %. Esto permite estudiar los efectos protectores de los fármacos en momentos bien definidos, dependiendo de la etapa de la enfermedad en cuestión. Para un estudio dirigido a la fibrosis, los animales pueden sacrificarse entre las 8 y las 12 semanas de edad. Por lo tanto, se evaluaron los efectos del consorcio de 9 cepas al final del tratamiento de 4 semanas, es decir, en la etapa de esteatohepatitis/fibrosis temprana (9 semanas de edad), y también a las 12 semanas de edad, que es concomitante con la fibrosis tardía. Los resultados se compararon con el fármaco de referencia Telmisartán, un antagonista del receptor de angiotensina II que disminuye la acumulación de grasa hepática e inhibe la activación de las células estrelladas hepáticas, lo que suprime la fibrogénesis hepática. Los efectos se evaluaron a nivel histopatológico y se recogió sangre para análisis bioquímico.

[0448] Se observó una tendencia a mejorar la ganancia de peso corporal al final del estudio, es decir, entre las 9 y las 12 semanas de edad, en el grupo tratado con el consorcio (figura 11). Sin embargo, el modelo STAM™ no es el más adecuado para el seguimiento de la obesidad, ya que los animales STAM son delgados, lo que contrasta con otros modelos de EHNA inducida por la dieta. Al igual que en las ratas con EHNA, no se observaron alteraciones significativas en los parámetros sanguíneos, concretamente en los niveles de ALT y colesterol (tabla 5).

[0449] También se observó una reducción en los niveles sanguíneos totales de HbAlcv (hemoglobina glucosilada) al final del estudio, lo que indica un efecto beneficioso sobre la diabetes (figura 12 ).

[0450] Tabla 5: Características bioquímicas tras 4 semanas de intervención en el estudio con ratones STAM.

[0452]

[0453] <,>, ,

[0454] TG (MG/DL)79,63* ±

500,9 ± 679,9 ± 465,6 926,4 ±

[0455] <10,46>152,5 91,35 ± 107,6<251,6>1017 ± 248,8COLESTEROL76 ,92***

125,7 124,8 132,7 187,3 186,9TOTAL*

± 8,11 ± 4,32 ± 2,71 ± 41,99 ± 38,81(MG/DL)± 3,51

[0456] COLESTEROL57,84** 83,69 75,55 97,21 72,24 70,21HDL (MG/DL)± 2,75 ± 7,13 ± 3,31 ± 4,73 ± 7,46 ± 6,84COLESTEROL13,1 14,68 13,64 18,78* 24,35 23,76LDL (MG/DL)± 0,66 ± 1,20 ± 0,74 ± 1 , 10 ± 6,12 ± 5,16 * ** *** y **** p <o o5 , <0,01 , <0,001 y <0,0001, respectivamente, frente a STAM+VEH. Abreviaturas: ALT, alanina aminotransferasa; HDL, lipoproteína de alta densidad; LDL, lipoproteína de baja densidad; TG, triglicéridos.

[0457] El consorcio de 9 comensales intestinales mejoró el NAS en la histopatología a las 9 semanas de edad[0239] Se recogieron secciones de hígado para evaluar las características distintivas de la EHGNA, es decir, inflamación hepática, esteatosis y balonización. En la figura 13 se muestran imágenes representativas de secciones de hígado teñidas con H&E; las puntuaciones calculadas se muestran en la figura 14. Como era de esperar, las secciones de hígado del grupo STAM tratado con vehículo mostraron deposición de grasa microvesicular y macrovesicular, balonización hepatocelular e infiltración de células inflamatorias. Los ratones STAM tratados con el consorcio bacteriano mostraron puntuaciones NAS significativamente reducidas en comparación con el grupo con enfermedad a las 9 semanas de edad (figura 14D). Esto se debió a la reducción de los índices de esteatosis y balonización (figuras 14B y C). A las 12 semanas de edad, esto ya no se observó.El consorcio de 9 comensales intestinales mejoró la fibrosis y mostró una expresión hepática reducida de F4/80 y de los niveles séricos de CK-18

[0458] Para evaluar la deposición de colágeno, se tiñeron secciones de hígado con rojo picrosirio. Las imágenes representativas se muestran en la figura 15A. Las áreas calculadas se muestran en la figura 16A. Como era de esperar, las secciones de hígado del grupo STAM tratado con vehículo mostraron un mayor depósito de colágeno en la región pericentral del lóbulo hepático en comparación con el grupo con dieta control. El grupo tratado con el consorcio bacteriano mostró una disminución significativa del área de fibrosis (positivo para rojo sirio) en comparación con el grupo con enfermedad a las 12 semanas de edad, pero no a las 9 semanas. Para evaluar mejor la inflamación, se utilizó la inmunotinción con macrófagos F4/80 en secciones de hígado. A pesar de que no se observó una reducción significativa de la inflamación general en las secciones teñidas con H&E (figura 14A y figura 13), las secciones teñidas con F4/80 mostraron una reducción significativa de la infiltración inflamatoria de macrófagos en el grupo tratado con el consorcio a las 9 semanas de edad, y una tendencia a disminuir a las 12 semanas de edad (figura 16B y figura 15b ). Finalmente, los niveles séricos de CK-18 también se redujeron significativamente en el grupo tratado con el consorcio a las 9 semanas de edad, y se observó una tendencia a la disminución a las 12 semanas de edad (figura 16C), un resultado que se correlaciona adecuadamente con la actividad histológica.

[0459] Estos resultados confirman que, efectivamente, el consorcio de 9 cepas puede prevenir la progresión de la enfermedad EHNA a fibrosis.

[0460] Ejemplo 4

[0461] La producción de AGCC dePhocaeicola vulgatus(cepa LMG17767),Veillonella parvula(cepa DSM 2007) yBlautia obeum(cepa DSM 25238) se midió y se comparó con cepas alternativas de la misma especie o especies relacionadas:

[0463]

[0465] Todas las cepas probadas son bacterias intestinales comensales aisladas de material fecal de donantes humanos sanos. Los niveles de AGCC se cuantificaron mediante cromatografía de gases (CG).

[0466] Todas las cepas probadas muestran un perfil de AGCC muy similar (figura 17), lo que indica que los resultados del consorcio descritos anteriormente también pueden obtenerse sustituyendoPhocaeicola vulgatus(cepa LMG17767),Veillonella parvula(cepa DSM 2007) oBlautia obeum(cepa DSM 25238) por cepas alternativas de la misma especie o de especies relacionadas.

[0467] Referencias

[0468]

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[0478] Secuencias

[0480]

[0483]

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende:

al menos una cepa bacteriana deFaecalibacterium prausnitzii;

al menos una cepa bacteriana deButyricicocccus pullicaecorum;

al menos una cepa bacteriana deRoseburia inulinivorans;

al menos una cepa bacteriana deAkkermansia muciniphila;

al menos una cepa bacteriana deLactiplantibacillus plantarum;y

al menos una cepa bacteriana deAnaerostipes caccae,

para su uso en un método para tratar, retrasar, mejorar, prevenir o curar la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), la fibrosis hepática, la cirrosis hepática y/o el carcinoma hepatocelular (CHC).

2. Composición para su uso según la reivindicación 1, donde la composición comprende, además, al menos una cepa bacteriana adicional capaz de producir propionato o un precursor de propionato.

3. Composición para su uso según la reivindicación 1, donde la composición comprende, además, al menos dos cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

4. Composición para su uso según la reivindicación 1, donde la composición comprende, además, tres cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato.

5. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la una o más cepas bacterianas adicionales capaces de producir propionato o un precursor de propionato pertenecen al géneroPhocaeicola, VeillonellaoBlautia,preferiblemente a las especiesPhocaeicola vulgatus, Veillonella parvula, Veillonella atypica, Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.

6. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde la composición comprende, además:

-Phocaeicola vulgatus;

-Veillonella parvulaoVeillonella atypica;y

-Blautia obeum, Blautia wexleraeoBlautia luti.

7. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , donde el método da como resultado una reducción del aumento de peso, la resistencia a la insulina, la inflamación del hígado, la esteatosis, la balonización hepatocelular, la resistencia vascular intrahepática (RVIH), la hipertensión portal, la disfunción endotelial y/o la fibrosis.

8. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición se utiliza en un método para retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad de HGNA, preferiblemente retrasar la progresión de HGNA a EHNA, de EHNA a fibrosis hepática, de fibrosis hepática a cirrosis hepática y/o de cirrosis hepática a c h c .

9. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la composición se administra por vía oral.

10. Composición para su uso según la reivindicación 9, donde la composición está formulada como cápsula, microcápsula, comprimido, gránulo, polvo, trocisco, píldora, suplemento alimenticio, suspensión o jarabe.

11. Composición que comprende cepas bacterianas pertenecientes a las especiesFaecalibacterium prausnitzii, Butyricicocccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactiplantibacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Phocaeicola vulgatus, Veillonella parvulayBlautia obeum.