ES3040729T3

ES3040729T3 - Method for diagnosing and monitoring sepsis

Info

Publication number: ES3040729T3
Application number: ES21839630T
Authority: ES
Inventors: David Sarphie; Rubina Mian
Original assignee: Seroxo Ltd
Current assignee: Seroxo Ltd
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2025-11-04
Anticipated expiration: 2041-12-21
Also published as: EP4244622A1; US20250172544A1; JP2023554149A; WO2022136850A1; EP4244622B1

Abstract

La presente invención proporciona métodos rápidos y sencillos de análisis de muestras de sangre completa para detectar la aparición de sepsis o shock séptico y evaluar su progresión y respuesta al tratamiento, basándose en la determinación de la funcionalidad de los leucocitos (predominantemente neutrófilos) para exhibir producción de anión superóxido inducida por un estímulo, con cuantificación mediante medición quimioluminiscente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de diagnóstico y control de la sepsis

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos rápidosin vitropara diagnosticar la sepsis y controlar la evolución de la sepsis y el tratamiento en individuos. Más particularmente, se proporcionan métodos que se basan en la determinación de la capacidad de respuesta de los leucocitos (predominantemente neutrófilos) para mostrar una producción de anión superóxido inducida por el desafío, es decir, producir un "estallido respiratorio" en respuesta a la activaciónin vitro.Si bien dicha activación de los leucocitos es conocida y a menudo se la denomina capacidad de afrontamiento de los leucocitos (LCC), la invención proporciona una nueva aplicación en el campo del diagnóstico de la sepsis, mediante la cual se puede lograr un diagnóstico indicativo simple y rápido de la sepsis usando muestras de sangre completa sin necesidad de fraccionamiento. Se ha demostrado que la invención diferencia a los pacientes con sepsis de los voluntarios sanos con una diferencia altamente significativa en la producción medida de aniones superóxido (también conocidos como "especies reactivas de oxígeno"). Por lo tanto, se prevé que la invención tenga aplicación general para proporcionar un diagnóstico indicativo rápido de sepsis, incluido el choque séptico.

La sepsis se define comúnmente como una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección (The International Sepsis Task Force, Singer et al. 2016). Actualmente, la evaluación clínica del inicio o aparición de la sepsis requiere la evaluación de una variedad de criterios clínicos, si bien es deseable un tratamiento rápido. La presente invención permite un diagnóstico indicativo rápido donde en el mejor de los casos se puede sospechar una infección pero se espera confirmación. Las muestras de sangre completa de pacientes con choque séptico muestran puntuaciones LCC mucho más altas que las de las muestras de sangre completa de voluntarios sanos; la diferencia es de una magnitud tan sorprendente que las puntuaciones LCC se consideran un medio inmediato para diferenciar a los pacientes con sepsis.

Esta metodología se puede aplicar en varias áreas de la práctica clínica, entre ellas: i.) en unidades de cuidados intensivos (UCI) de hospitales, para proporcionar un método rápido de cribado de sepsis y control de tratamientos, ii.) en unidades de accidentes y emergencias (A&E), iii.) en ambulancias donde el cribado rápido de sepsis es fundamental, y iv.) en consultorios de medicina general (GP) como un método potencial para diagnosticar septicemia, una infección bacteriana de la sangre que puede provocar sepsis.

Puede proporcionar una guía rápida y conveniente para moderar las intervenciones terapéuticas en la sepsis, por ejemplo, las dosificaciones y los intervalos de tiempo entre dosis, los cambios de fármaco o dosificación o el cambio de forma de tratamiento.

Antecedentes de la invención

La sepsis es una de las causas más comunes de muerte entre los pacientes hospitalizados en la unidad de cuidados intensivos (UCI). Es particularmente difícil de diagnosticar en este entorno debido a las múltiples comorbilidades y enfermedades subyacentes que presentan estos pacientes (Novosad et al. 2016; Vincent et al. 2009).

La sepsis es una emergencia médica que describe la respuesta inmunológica sistémica del cuerpo a un proceso infeccioso que puede conducir a una disfunción orgánica terminal y a la muerte (Gyawali et al. 2019). La sepsis sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes gravemente enfermos (Kaukonen et al. 2014).

La detección temprana de la sepsis es fundamental para iniciar, mantener y controlar un tratamiento eficaz. Kumar et al. (2006) demostraron una clara asociación entre un retraso en el inicio efectivo de antibióticos después del inicio de la hipotensión y la mortalidad hospitalaria. Cada hora de retraso se asoció con una disminución de la supervivencia de aproximadamente el 7 % en promedio. La administración de antibióticos dentro de la primera hora del reconocimiento de la sepsis o el choque séptico resultó en tasas de supervivencia de hasta 80 %.

Los inductores químicos tales como el acetato de miristato de forbol (PMA) son conocidos por activar los neutrófilos en muestras de sangre periférica, con lo que se puede cuantificar la capacidad retenida para la producción de especies reactivas de oxígeno por parte de los leucocitos (predominantemente neutrófilos) (Hu et al. Cell Signal (1999) 11, 335-360). Este uso con muestras de sangre completa con medición de la producción de especies reactivas de oxígeno mediante detección de quimioluminiscencia para obtener una puntuación LCC constituye la base de una prueba comercializada por Oxford MediStress Limited para cuantificar el estrés fisiológico en humanos y animales; véase European Patent no. 1558929 y patentes relacionadas derivadas de published International Application WO2004/042395. Sin embargo, los datos presentados en el presente documento proporcionan por primera vez evidencia de una utilidad muy diferente del mismo tipo de análisis de sangre para determinar el inicio y la aparición de sepsis o choque séptico y controlar el tratamiento del mismo; véase el ejemplo 2.

De esta manera, ahora se habilita un diagnósticoin vitro(IVD) de punto de atención (POC) que usa las propias células del cuerpo (leucocitos) en sangre completa para actuar como bioindicadores de sepsis (conocido como Leukocyte ImmunoTest™ o LIT™). Los leucocitos responden a mediadores pro- y anti-inflamatorios y captan señales de vías inmunológicas y no inmunológicas, cardiovasculares, autonómicas, neurológicas, hormonales, metabólicas y de la coagulación. Una de las actividades de los neutrófilosin vivoes la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Este es un paso esencial para matar las bacterias. Todos estos sistemas se ven afectados por la sepsis (Segal et al. 2005).

El documento Published International Application WO94/29728 divulga un métodoin vitropara diagnosticar sepsis que requiere el uso de anticuerpos específicos para un antígeno indicativo de infección bacteriana para activar la producción de ROS. Pascual et al. (1997) Intensive Care Med. 23, 743-748 titulado 'A controlled study of leucocyte activation in septic patients' divulga en parte la detección quimioluminiscente de la producción de superóxido inducida por PMA en muestras de sangre completa de pacientes sépticos que requieren el uso de una muestra de sangre arterial de 50 pl recolectada en un tubo EDTA-K convencional. Se enseña la incubación con el agente quimioluminiscente durante 65 minutos a 37 °C con medición de la luz máxima emitida durante este período. Sin embargo, ahora se enseña una prueba mucho más rápida que permite detectar la sepsis en 10 minutos y que se puede aplicar a una muestra de sangre completa de 10-20 pl obtenida por punción en el dedo.

Las técnicas actuales para diagnosticar la sepsis a menudo utilizan observaciones clínicas de los signos vitales del paciente (en particular, temperatura, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y presión arterial), así como del comportamiento (signos de confusión). Véase la tabla 1 a continuación, que establece las pautas de the UK National Institute of Clinical Excellence (NICE) para la estratificación del riesgo de sepsis.

The International Sepsis Task Force [Singer et al. (2016) JAMA, The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3)] ha proporcionado una herramienta de cribado alternativa para la sepsis en pacientes adultos con sospecha de infección que probablemente tendrán malos resultados y que reconoce la importancia de la necesidad de una evaluación secuencial de la insuficiencia orgánica (SOFA). Denominado ‘SOFA rápido' (qSOFA), proporciona una definición de sepsis usando una puntuación qSOFA para identificar a pacientes adultos con sospecha de infección y propensos a tener un mal pronóstico: frecuencia respiratoria > 22/min, alteración del estado mental (por ejemplo, escala de coma de Glasgow <15) y presión arterial sistólica <100 mm Hg.

El choque séptico (a veces denominado Sepsis-3) es una categoría de sepsis en la que anormalidades circulatorias, celulares y metabólicas particularmente profundas se asocian con un riesgo sustancialmente mayor de mortalidad. Se reconoce por la combinación de hipotensión (requerimiento de vasopresores para mantener una presión arterial media de 65 mm Hg o mayor) y aumento del lactato sérico >2 mM [véase nuevamente Singer et al.(2016) The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3)].

Sin embargo, el diagnóstico de sepsis en pacientes gravemente enfermos es un desafío porque puede complicarse por la presencia de inflamación como resultado de otros procesos patológicos subyacentes y el uso previo de antibióticos que hacen que los cultivos sean negativos. Además, el diagnóstico de la infección dependiente del cultivo es lento.

Sumario de la invención

Como se indicó anteriormente, ahora se ha descubierto sorprendentemente que se puede usar una prueba simple de sangre completa para obtener una medida cuantitativa rápida del estado inmunológico como una evaluación indicativa de la probable presencia de sepsis o choque séptico en un paciente basándose en la determinación de la producción de superóxido inducida por el desafío por los leucocitos; véase el ejemplo 2. Dicho protocolo de prueba tiene la ventaja de que proporciona un resultado rápido (en diez minutos) y puede realizarse en la sala del hospital o en la UCI (cerca del paciente) para evaluar la función de los neutrófilos y proporcionar una advertencia de cambios en el estado inmunológico asociados con el desarrollo de sepsis o choque séptico.

El método de la invención tal como ahora se divulga no solo es rápido, sino que usa significativamente sangre completa sin centrifugaciones, de modo que la sensibilidad de las células permanece intacta y las células mantienen la capacidad de señalización entre sí, con los glóbulos rojos, las citocinas en la sangre y el plasma.

De especial interés es que dicha prueba se puede aplicar a muestras de sangre de pacientes que sufren sepsis, con lo que la puntuación LCC se puede correlacionar con el estado de la enfermedad. En lo que sigue, en el contexto clínico, dicha puntuación se denominará puntuación LIT. Por ejemplo, puede ser importante proporcionar un diagnóstico indicativo rápido del inicio o la aparición de un estado de sepsis de alto riesgo (según los criterios, por ejemplo, de las directrices NICE del Reino Unido para la estratificación del riesgo de sepsis sospechada, la puntuación qSOFA como se define más arriba, o criterios alternativos para la asignación equivalente del estado de sepsis) o choque séptico, o permitir la determinación de los mismos. Se considera que dicho método de clasificación o estratificación es útil para controlar la evolución o el tratamiento de la enfermedad.

Si bien la invención se basa en la evaluación de la capacidad del componente leucocitario total de la sangre completa para producir superóxido en respuesta a un desafío químicoin vitroapropiado (comúnmente denominado puntuación de capacidad de afrontamiento de leucocitos (LCC)), dado que esto estará determinado en gran medida por la capacidad de los neutrófilos para tal estimulación externa, alternativamente se puede hacer referencia al nivel de funcionalidad de los neutrófilos del individuo.

En su aspecto más amplio, la presente invención proporciona de esta manera un método para proporcionar un diagnóstico indicativo del inicio o aparición de sepsis o choque séptico, o determinar el inicio o la aparición de sepsis o choque séptico, en un sujeto que se sabe que tiene una infección con un agente capaz de dar lugar a sepsis o que se sospecha que tiene dicha infección, que comprende:

(a) poner en contacto directamente una muestra de sangre completa de prueba de 10-20 pl obtenida de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en los neutrófilos, siendo dicho inductor acetato de miristato de forbol (PMA) y teniendo dicho contacto una temperatura de 37-37.5° C en condiciones adecuadas para dicha estimulación;

(b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo predeterminado de 10 minutos para obtener un primer resultado de prueba, en el que la producción de superóxido se detecta mediante detección de quimioluminiscencia usando luminol y

(c) comparar dicho primer resultado de prueba con un segundo resultado de comparación que es un umbral obtenido mediante la aplicación de los pasos (a) y (b) a muestras de sangre completa de individuos sanos y usando el aumento de la quimioluminiscencia de dicho primer resultado de prueba por encima del aumento de la quimioluminiscencia de dicho segundo resultado de comparación,

por medio del cual se indica o determina el inicio, presencia o ausencia de sepsis o choque séptico en dicho sujeto.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método de clasificación o puntuación de un paciente con sepsis en función de la evolución de la sepsis o la presencia de choque séptico, que comprende:

(a) poner en contacto directamente una muestra de sangre completa de prueba de 10-20 pl obtenida de dicho paciente con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en los neutrófilos, siendo dicho inductor acetato de miristato de forbol (PMA) y teniendo dicho contacto una temperatura de 37-37.5 °C en condiciones adecuadas para dicha estimulación;

(b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo predeterminado de 10 minutos para obtener un primer resultado de prueba, en el que la producción de superóxido se detecta mediante detección de quimioluminiscencia usando luminol; y

(c) comparar dicho primer resultado de prueba con uno o más segundos resultados de comparación, cada uno de los cuales es un umbral predeterminado que se correlaciona con uno o más criterios de evolución de la sepsis o choque séptico, a fin de clasificar o puntuar la evolución de la sepsis o la presencia de choque séptico en el sujeto,

en el que el uno o más segundos resultados de comparación se derivan aplicando los pasos (a) y (b) a muestras de sangre completa de individuos sanos y usando el aumento de la quimioluminiscencia de dicho primer resultado de prueba por encima del aumento de la quimioluminiscencia de dicho segundo resultado de comparación.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la eficacia del tratamiento de la sepsis o del choque séptico en un sujeto, comprendiendo dicho método, después o durante el tratamiento de la sepsis o del choque séptico,

(a) poner en contacto directamente una muestra de sangre completa de prueba de 10-20 pl obtenida de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en los neutrófilos, siendo dicho inductor acetato de miristato de forbol (PMA) y teniendo dicho contacto una temperatura de 37-37.5 °C en condiciones adecuadas para dicha estimulación;

(c) comparar dicho primer resultado de prueba con un segundo resultado de comparación que es un umbral derivado de la aplicación de los pasos (a) y (b) a muestras de sangre completa de individuos sanos y usar el aumento de la quimioluminiscencia de dicho primer resultado de prueba por encima del aumento de la quimioluminiscencia de dicho segundo resultado de comparación; y

en el que el aumento de la quimioluminiscencia por encima del valor basal en dicha muestra de prueba se compara con el aumento de la quimioluminiscencia por encima del valor basal en una segunda muestra de comparación que se ha tomado del sujeto en un punto temporal anterior al inicio o durante el tratamiento,

por medio del cual la reducción en la quimioluminiscencia inducida en la muestra de prueba en comparación con dicha segunda muestra de comparación es indicativa del efecto depresor del tratamiento sobre la funcionalidad de los neutrófilos.

Generalmente, el sujeto tendrá una infección conocida con un agente capaz de dar lugar a una sepsis, tal como una infección bacteriana o viral, o al menos se sospecha que tiene dicha infección. Cuando un método de la invención proporciona al menos un diagnóstico indicativo del desarrollo o presencia de sepsis o choque séptico, esto puede usarse para impulsar una intervención médica apropiada con el objetivo de prevenir la sepsis o el choque séptico o el aumento de la gravedad de la sepsis o el choque séptico. Como se señaló anteriormente, el método de la invención es especialmente útil, por ejemplo, como una prueba de diagnóstico rápido para el inicio o la aparición de sepsis de alto riesgo o choque séptico; el aumento de la producción de superóxido determinado en muestras de sangre de tales individuos es de un orden de magnitud tal en comparación con el observado en muestras de sangre de individuos sanos que el inicio o la aparición de sepsis de alto riesgo o choque séptico se indica o diagnostica directamente.

Breve descripción de la figura

La figura 1 ilustra el uso de puntuaciones LIT de un ensayo clínico controlado en el que se compararon las puntuaciones LIT de pacientes con sepsis confirmada clínicamente con las de un grupo de control sano, como se analiza más adelante en la ejemplificación. Los resultados usados son medias obtenidas con muestras de sangre completa por triplicado. El diagrama de caja muestra la mediana y el intervalo intercuartil de las puntuaciones de ambos grupos. El diagrama de puntos muestra los valores de cada sujeto y, como puntos más oscuros, la media de ambos grupos.

Descripción detallada

En un método de la invención donde la producción de superóxido se determina después de un corto período de desafío a PMA mediante medición de quimioluminiscencia convencional empleando luminol y, por ejemplo, un luminómetro portátil, la quimioluminiscencia basal invariablemente será tan baja en las muestras que no requerirá consideración. De esta manera, en estas circunstancias, las unidades de luz relativas (RLU) medidas totales pueden equipararse a la producción de superóxido inducida y ser directamente proporcionales a la funcionalidad de los neutrófilos. Se ha establecido que esto se aplica, por ejemplo, cuando se usa el reactivo PMA/luminol liofilizado suministrado por Oxford MediStress para la puntuación LCC de muestras de sangre completa y se incuba la muestra durante 10 minutos a 37.5 °C de acuerdo con el protocolo estándar para el uso de ese reactivo. En otras palabras, "determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal" en la muestra de prueba puede equipararse a una simple cuantificación en un solo paso del superóxido presente al final del período de estimulación de neutrófilos (10 minutos después de la adición del inductor).

El paso (c) de comparación puede permitir diagnosticar directamente la sepsis o el choque séptico cuando la producción de superóxido por encima del valor basal determinada en el paso (b) para una muestra de prueba es mayor que un umbral obtenido al aplicar los pasos (a) y (b) a muestras equivalentes de individuos sanos, pero se apreciará que el segundo resultado de comparación puede ser cualquier resultado de comparación alternativo o umbral que permita el diagnóstico indicativo de sepsis o choque séptico o el control de la evolución o el tratamiento.

De esta manera, la determinación de la presencia de sepsis o choque séptico puede extenderse preferiblemente a proporcionar una indicación pronóstica de la probable gravedad de la enfermedad. De esta manera, el segundo resultado de comparación puede ser un umbral predeterminado reconocido para indicar la presencia o ausencia de sepsis y/o choque séptico.

Un método de la invención se puede aplicar después o durante el tratamiento de sepsis o choque séptico para determinar la eficacia del tratamiento o controlar el tratamiento. En este caso, en el paso (c), el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal en la muestra de prueba se puede comparar con el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal en una segunda muestra de comparación que se ha tomado del sujeto en un punto temporal anterior al inicio o durante el tratamiento. Las muestras tomadas de individuos para el propósito de la presente invención generalmente se tomarán de tal manera que se minimicen los efectos diferenciales del estrés psicológico entre la muestra de prueba y cualquier muestra de comparación.

De esta manera, en una realización, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia del tratamiento en un sujeto con sepsis o choque séptico que comprende los pasos de:

(i) poner en contacto directamente una muestra de sangre completa de 10-20 pl obtenida del paciente después de un período de tratamiento con un inductor de la producción de superóxido en los neutrófilos, siendo dicho inductor PMA y dicho contacto a una temperatura de 37-37.5 °C en condiciones adecuadas para estimular la producción de superóxido en los neutrófilos;

(ii) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo de 10 minutos mediante detección de quimioluminiscencia usando luminol para obtener un primer resultado, y

(iii) comparar dicho primer resultado con un segundo resultado de control derivado de una muestra de sangre completa tomada del paciente en un punto temporal anterior antes o durante el tratamiento, con lo que la reducción en el aumento inducido en la producción de superóxido en dicha muestra de prueba en comparación con el resultado de control es indicativa del efecto depresor del tratamiento sobre el nivel de funcionalidad de los neutrófilos.

Los pasos (i) a (iii) pueden repetirse, lo que proporciona un medio muy conveniente para el control a largo plazo ("longitudinal") del efecto del tratamiento de la sepsis en el estado fisiológico del paciente. Tal metodología se considera un medio conveniente, por ejemplo, para ayudar a los médicos a tomar decisiones al aplicar el tratamiento; por ejemplo, las dosificaciones y el intervalo de tiempo entre las dosificaciones, que se basarán en la función celular clínicamente relevante en lugar de simplemente contar células o mirar la estructura.

En una realización adicional de la invención, un método de la invención con los pasos (a) a (c) como se definieron anteriormente se puede aplicar a una pluralidad de muestras de pacientes que se espera que tengan diversos grados de sepsis y/o choque séptico, y la comparación de los resultados de la cuantificación de la producción de superóxido inducida (puntuación LCC) se usa para asignar a cada muestra un intervalo por correlación con uno o más criterios indicativos de la evolución de la enfermedad. Esta estratificación proporcionará umbrales predeterminados que pueden emplearse como un segundo resultado de comparación al aplicar un método de la invención a otras muestras de pacientes sospechosos o conocidos de tener sepsis o choque séptico para determinar la evolución de la enfermedad, controlar la efectividad del tratamiento o proporcionar un indicador pronóstico.

De esta manera, la invención se extiende a un método de clasificación o puntuación de un paciente con sepsis en función de la evolución de la sepsis o la presencia de un choque séptico, que comprende aplicar los pasos (a) a (c) de un método de la invención como se indicó anteriormente a una muestra de sangre completa del paciente, en el que en el paso (c) dicho primer resultado de prueba se compara con uno o más segundos resultados de comparación, cada uno de los cuales es un umbral predeterminado que se correlaciona con uno o más criterios para la evolución de la sepsis o el choque séptico. Por ejemplo, dicho primer resultado de prueba puede compararse con un umbral predeterminado para el inicio o la aparición de un choque séptico. El resultado de la prueba del paciente puede compararse con uno o más umbrales indicativos de la gravedad de la sepsis según una puntuación conocida de evolución de la sepsis, por ejemplo, evolución a riesgo moderado a alto y/o riesgo alto según los criterios de estratificación de riesgo NICE establecidos anteriormente. El segundo resultado de comparación puede ser un umbral predeterminado indicativo de los criterios qSOFA para el riesgo de un resultado malo como se indicó anteriormente.

Las muestras empleadas para un método de la invención serán muestras de sangre completa, en cuyo caso, como se indicó anteriormente, la producción de superóxido será estrictamente equivalente a la capacidad de los leucocitos para la producción de superóxido (o, alternativamente, la capacidad indicada para producir un estallido respiratorio). Esta metodología evita de manera importante la centrifugación, que se sabe que afecta la reactividad celular, y también la siembra de células en portaobjetos de vidrio, que también puede afectar la funcionalidad. Serán suficientes muestras de sangre de hasta 10-20 pl (preferiblemente 10 pl) obtenidas usando un dispositivo de punción de dedo convencional.

En algunos casos, si es necesario o se desea, la producción de superóxido medida por encima del valor basal para cada muestra se puede corregir haciendo referencia al número de leucocitos o neutrófilos en la muestra. Por ejemplo, se puede optar por determinar el aumento inducido por el desafío de la producción de superóxido por encima del valor basal por 109 neutrófilos/I, denominados puntuación LIT-N; véase el ejemplo 3.

Como ya se señaló anteriormente, la producción de superóxido se mide fácilmente mediante la conocida y sencilla medición de quimioluminiscencia usando luminol. Se divulgan protocolos adecuados, por ejemplo, en European Patent no. 1558929 de Oxford MediStress. Se elegirá una temperatura de incubación de 37-37.5 °C y se continuará la incubación durante un tiempo predeterminado de 10 minutos. Como se mencionó anteriormente, la composición liofilizada que comprende PMA y sal de luminol suministrada por Oxford MediStress para pruebas de LCC permite obtener resultados de prueba adecuados a partir de una punción en el dedo de sangre completa en solo 10 minutos y se usó para las pruebas informadas en el ejemplo 2 como un reactivo preferido.

Si bien se puede emplear un luminómetro convencional para detectar la quimioluminiscencia, estos detectores de luz requieren tubos fotomultiplicadores costosos y frágiles. Por tanto, puede ser preferible usar un detector de fotones portátil alternativo. En particular, puede ser preferible, por ejemplo, un fotomultiplicador de silicio (Si-PM). Se considera que dicho detector de fotones es más robusto para este propósito y combina una mayor rentabilidad con una sensibilidad suficiente de detección de fotones. Oxford MediStress ha vuelto a ofrecer un luminómetro portátil adecuado como parte del kit de prueba CopingCapacity™, que también proporciona una composición de reactivo que contiene PMA/luminol liofilizado como se indicó anteriormente.

También puede suministrarse un detector de fotones adecuado como componente de un teléfono móvil. Un luminómetro móvil de este tipo para la detección de quimioluminiscencia se ha propuesto anteriormente como parte de una plataforma de química móvil (Roda et al. (2014) Anal. Chem. " Integrating Biochemiluminescence Detection on Smartphones; Mobile Chemistry Platform for Point-of-Need Analysis") y puede emplearse de manera similar para permitir la realización de métodos de la invención en lugares incluso alejados de cualquier cirugía u hospital, por ejemplo en una zona de conflicto donde la probabilidad de sepsis asociada con una lesión es alta.

Se apreciará que los métodos de la invención tienen aplicabilidad para su uso con pacientes infectados con una serie de patógenos contagiosos tales como bacterias, virus, hongos u otros agentes que se sabe que inducen sepsis en casos graves.

Si bien los métodos de la invención son de especial interés para diagnosticar la sepsis y controlar la evolución de la sepsis en pacientes humanos o para proporcionar un indicador clínico de la evolución o regresión de la sepsis después del tratamiento de tales pacientes, se apreciará que tales métodos también tienen aplicación al tratamiento en el campo veterinario, especialmente en relación con otros mamíferos.

De esta manera, se puede concebir que la metodología de la invención permita todo lo siguiente en relación con la gestión y el tratamiento de la sepsis y el choque séptico:

1. Prueba de leucocitos como predictor de sepsis y/o choque séptico.

2. Prueba de leucocitos como marcador objetivo de la efectividad de las terapias.

3. Uso de una prueba de leucocitos como punto final de las terapias.

4. Prueba de leucocitos para equilibrar y moderar las intervenciones terapéuticas (por ejemplo, los niveles de dosificación y el intervalo de tiempo entre dosificación) optimizando la función celular (en lugar de simplemente contar células o mirar la estructura).

5. Prueba de leucocitos como punto de control controlado durante las terapias.

6. Prueba de leucocitos para optimizar la intervención terapéutica.

7. Una alerta temprana de recurrencia

Un método de la invención es:

• Simple, fácil de usar - resultados obtenibles en 10 minutos, mínimamente invasivo.

• La unidad de protocolo puede ser portátil y no estar basada en laboratorio, lo que minimiza los costes. • Permite la integración de tratamientos basados en la evaluación objetiva de la funcionalidad de los neutrófilos clínicamente relevantes.

• Facilita una atención al paciente verdaderamente personalizada y objetiva.

De particular importancia para la conveniencia de uso como se señaló anteriormente es que no hay necesidad de fraccionar muestras de sangre para obtener una fracción aislada de leucocitos o neutrófilos. Las muestras de sangre para llevar a cabo un método de la invención se ponen en contacto directamente con acetato de miristato de forbol (PMA), más particularmente por ejemplo el producto microbiano 12-miristato 13-acetato de forbol obtenible de Sigma-Aldrich. El inductor químico puede almacenarse convenientemente en forma de una composición de reactivo liofilizado, por ejemplo como un gránulo, para su disolución en una solución reguladora adecuada, por ejemplo solución salina regulada con fosfato.

Para mayor comodidad junto con una alta sensibilidad, como se indicó anteriormente, el luminol puede suministrarse convenientemente con el inductor químico en una única composición de reactivo para agregarlo a las muestras, como lo ejemplifica la composición liofilizada disponible comercialmente que comprende PMA y luminol mencionada anteriormente.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un sistema configurado específicamente para llevar a cabo un método de la invención como se discutió anteriormente, comprendiendo el sistema un detector de fotones tal como un luminómetro portátil o Si-PM para la detección cuantitativa de quimioluminiscencia y un sistema para analizar los resultados y configurado para proporcionar una alerta para un nivel de funcionalidad de neutrófilos asociado con el riesgo o la aparición de sepsis, o un estado de sepsis particular que incluye choque séptico. El mismo sistema también puede emplearse para controlar el tratamiento de la sepsis o del choque séptico como se mencionó anteriormente y proporcionar adicionalmente una alerta que favorezca la conveniencia de cambiar o suspender el tratamiento.

siguientes ejemplos no limitativos ilustran la invención.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Ejemplo de protocolo para el uso de la prueba de desafío con PMA para evaluar el nivel de funcionalidad de los neutrófilos en muestras de sangre completa

Para medir el nivel de quimioluminiscencia sanguínea de fondo, se transfieren 10 |jl de sangre completa a un tubo antirreflectante de silicona. Se agregan 90 j l de 10-4 M luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4 ftalazinediona; Sigma-Aldrich) diluido en solución reguladora de fosfato. A continuación se agita suavemente el tubo. Para medir la quimioluminiscencia producida en respuesta al desafío con PMA, se agregan 20 j l de PMA (Sigma-Aldrich) a una concentración de 10'3 M. Para cada tubo, se puede medir la quimioluminiscencia durante 30 segundos cada 5 minutos en un luminómetro, por un total de 30 minutos. Cuando no están en el luminómetro, los tubos se incuban a 37.5 °C, por ejemplo, en un calentador de bloque seco.

Puede resultar conveniente y más preferible realizar una única lectura después de la incubación a 37.5 °C durante 10 minutos.

Se apreciará que la misma prueba de desafío se puede llevar a cabo con cualquier detector de fotones suficientemente sensible, por ejemplo, se puede emplear un Si-PM.

Ejemplo 2: Comparación de las puntuaciones LIT de pacientes con sepsis en comparación con controles sanos

El estudio fue aprobado por un comité de ética local y se llevó a cabo en un hospital docente NHS en Birmingham, Reino Unido. Se reclutaron para el estudio l2 pacientes de la unidad de cuidados intensivos (UCI) local que sufrían sepsis y 20 voluntarios sanos del personal del hospital. Después de dar su consentimiento para el estudio, se obtuvieron muestras de sangre por punción digital (10 j l ) de cada paciente por triplicado y se analizaron para determinar el nivel de funcionalidad de los neutrófilos usando una composición de reactivo PMA/luminol liofilizado disponible comercialmente en Oxford MediStress para la puntuación LCC. Esto implicó mezclar la sangre con una solución tamponada (100 j l) de reactivos que contenían la mezcla de PMA/luminol liofilizada. Después de la incubación en un calentador de bloque seco durante 10 minutos a 37.5 °C, se evaluó la muestra para determinar la producción de especies reactivas de oxígeno, medidas usando un luminómetro portátil (3M Clean-Trace®). Se obtuvo un conjunto de muestras (por triplicado) de cada sujeto de prueba. Los resultados de la prueba se analizaron agrupando a los sujetos de prueba en dos cohortes (sepsis o voluntarios sanos). Todos los pacientes con sepsis fueron calificados como pacientes con sepsis según la puntuación qSOFA (frecuencia respiratoria >22/min, alteración del estado mental y presión arterial sistólica <100 mm Hg). Todos los pacientes con sepsis también mostraban hipotensión que requería vasopresores y tenían un lactato sérico superior a 2 mM.

Se promediaron los puntajes LCC para el nivel de funcionalidad de los neutrófilos para cada paciente en estas categorías (puntaje LlT medio) y estos promedios se graficaron como se muestra en la figura 1.

Resultados:

- Los datos muestran fuertes diferencias significativas en la puntuación LIT entre las dos cohortes, teniendo el grupo con sepsis una puntuación LIT promedio superior a 10x, en comparación con la cohorte de voluntarios sanos.

- La puntuación LIT promedio (media ± SD) para el grupo de sepsis fue 2526 ± 1616 Mientras que la puntuación media ± SD del LIT para la cohorte de "voluntarios sanos" fue_167±99_.

- Se demostró una diferencia estadísticamente significativa (mediante la prueba t) en las puntuaciones LIT entre las dos cohortes.

Valores medios (SD) y medianas (IQR) para los grupos con sepsis y sanos

Estos resultados demostraron por primera vez que el nivel de funcionalidad de los neutrófilos evaluado mediante la puntuación LIT medida con el sistema Oxford MediStress se puede usar como una medida indicativa del inicio de sepsis, especialmente, por ejemplo, sepsis de alto riesgo que puede justificar una observación estrecha y un tratamiento en una UCI, y como una herramienta para controlar la evolución de la sepsis, las intervenciones y la recuperación.

Ejemplo 3: Uso de la puntuación LIT en relación con el recuento de neutrófilos

La puntuación LIT también se graficó en función del recuento de neutrófilos en las muestras de sangre de la cohorte de pacientes con sepsis, y el recuento de neutrófilos se expresó como neutrófilos x 109/l. Se tomó el gradiente de esta línea para determinar el valor de LIT-N que representaba el aumento de LIT por cada aumento de 1 x 109/l en el recuento de neutrófilos en sangre. El valor de la mediana de LIT-N para los pacientes con sepsis fue 115.

También se analizó la puntuación LIT-N en relación con la mortalidad a los 28 días de los pacientes en la UCI. La puntuación LIT-N de un paciente con sepsis no-covid que murió en el período relevante estaba marcadamente elevada antes de la muerte, en 419.

Referencias:

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para proporcionar un diagnóstico indicativo del inicio o la aparición de sepsis o choque séptico, o para determinar el inicio o la aparición de sepsis o choque séptico, en un sujeto que se sabe que tiene una infección con un agente capaz de dar lugar a sepsis o que se sospecha que tiene dicha infección, que comprende:

(a) poner en contacto directamente una muestra de sangre completa de prueba de 10-20 j l obtenida de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en los neutrófilos, siendo dicho inductor acetato de miristato de forbol (PMA) y teniendo dicho contacto una temperatura de 37-37.5 °C en condiciones adecuadas para dicha estimulación;

(c) comparar dicho primer resultado de prueba con un segundo resultado de comparación que es un umbral derivado de la aplicación de los pasos (a) y (b) a muestras de sangre completa de individuos sanos y usar el aumento de la quimioluminiscencia de dicho primer resultado de prueba por encima del aumento de la quimioluminiscencia de dicho segundo resultado de comparación;

2. Un método según la reivindicación 1 para determinar el inicio o la aparición de sepsis de alto riesgo o choque séptico, en el que la sepsis de alto riesgo concuerda con los criterios de las directrices NICE del Reino Unido para dicha estratificación de riesgo, la puntuación qSOFA para dicho estado de sepsis según el Grupo de Trabajo Internacional sobre Sepsis o criterios alternativos para la asignación equivalente del estado de sepsis.

3. Un método de clasificación o puntuación de un paciente con sepsis en función de la evolución de la sepsis o la presencia de choque séptico, que comprende:

(a) poner en contacto directamente una muestra de sangre completa de prueba de 10-20 j l obtenida de dicho paciente con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en los neutrófilos, siendo dicho inductor acetato de miristato de forbol (PMA) y teniendo dicho contacto una temperatura de 37-37.5 °C en condiciones adecuadas para dicha estimulación;

4. Un método según la reivindicación 3, en el que dicho primer resultado de prueba se compara con un umbral predeterminado para el inicio o la aparición de sepsis de alto riesgo o choque séptico.

5. Un método para determinar la eficacia del tratamiento de la sepsis o del choque séptico en un sujeto, comprendiendo dicho método, después o durante el tratamiento de la sepsis o del choque séptico,

en el que el aumento de la quimioluminiscencia por encima del valor basal en dicha muestra de prueba se compara con el aumento de la quimioluminiscencia por encima del valor basal en una segunda muestra de comparación que se ha tomado del sujeto en un punto temporal anterior al inicio o durante el tratamiento, por medio del cual la reducción en la quimioluminiscencia inducida en la muestra de prueba en comparación con dicha segunda muestra de comparación es indicativa del efecto depresor del tratamiento sobre la funcionalidad de los neutrófilos.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en el paso (b) el aumento de la producción de superóxido por encima del valor basal se determina por 109 neutrófilos/I para obtener una puntuación LIT-N.

7. Un sistema configurado específicamente para llevar a cabo un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho sistema un detector de fotones para la detección cuantitativa de quimioluminiscencia y un sistema para analizar los resultados y configurado para proporcionar una alerta para un nivel de funcionalidad de neutrófilos asociado con el riesgo o la aparición de sepsis o un estado de sepsis particular que incluye choque séptico.

8. Un sistema según la reivindicación 7, en el que dicho detector de fotones es un luminómetro portátil o se proporciona como un componente de un teléfono móvil.