ES3037586T3 - Manp analogues - Google Patents

Abstract

Se describen en este documento análogos de una forma empalmada alternativamente del péptido natriurético auricular (MANP) que exhiben ganancia de función de pGC-A y pueden usarse para tratar enfermedades cardiorrenales y metabólicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos de MANP

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica los derechos de prioridad de la Solicitud Provisional de los EE. UU. con N.° de Serie 62/419.611, presentada el 9 de noviembre de 2016.

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN CON FONDOS FEDERALES

La presente invención se realizó con financiación del gobierno concedida por los Institutos de Salud de los EE. UU. mediante la beca HL76611. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Campo técnico

El presente documento se refiere a análogos de una forma de corte y empalme alternativa del péptido natriurético auricular (MANP, por sus siglas en inglés), y más en particular a análogos de MANP que tienen una o más variaciones en la porción N-terminal de MANP que pueden hacer que los análogos sean más potentes en su activación del receptor pGC-A (también denominado NPR-A). Además, el presente documento se refiere al uso de análogos de MANP en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, cardiorrenales y metabólicas.

Antecedentes

Los polipéptidos natriuréticos son polipéptidos que pueden provocar natriuresis, es decir, un aumento de la excreción de sodio en la orina. Los polipéptidos natriuréticos pueden ser producidos por el cerebro, el corazón, el riñón y/o el tejido vascular. La familia de los polipéptidos natriuréticos en seres humanos incluye las hormonas cardíacas péptido natriurético auricular (ANP, por sus siglas en inglés), péptido natriurético de tipo B (BNP, por sus siglas en inglés), péptido natriurético de tipo C (CNP, por sus siglas en inglés) y urodilatina (URO). Los polipéptidos natriuréticos actúan a través de dos receptores de guanilil ciclasa bien caracterizados (NPR-A para ANP, BNP y URO; y NPR-B para CNP) y el segundo mensajero guanosina monofosfato 3'5' cíclica (GMPc) (Kuhn (2003)Circ. Res.93: 700-709; Tawaragiet al.(1991)Biochem. Biophys. Res. Commun.175: 645-651; y Komatsuet al.(1991)Endocrinol.129: 1104-1106). El documento WO 2011/005939 A2 describe péptidos natriuréticos variantes que tienen una mutación que da como resultado un extremo carboxi extendido y métodos para usar los péptidos variantes para diagnosticar o determinar la predisposición a la fibrilación auricular.

El documento WO 2016/077143 A1 describe polipéptidos natriuréticos para reducir la generación de quistes renales, para reducir el número de quistes renales, para reducir el tamaño de los quistes renales y/o para reducir el peso de los riñones de un mamífero en mamíferos con poliquistosis renal.

Sumario

La presente invención se define por la reivindicación independiente 1. La reivindicación dependiente representa realizaciones adicionales de la invención.

En comparación con el ANP, el MANP es más potente en la reducción de la presión sanguínea (PA), induciendo la natriuresis e inhibiendo la aldosterona a través de pGC-A y su segundo mensajero, GMPc. El presente documento se basa, al menos en parte, en el desarrollo de péptidos de diseño basados en MANP que contienen modificaciones en sus secuencias N-terminales en comparación con MANP. Los polipéptidos proporcionados en el presente documento pueden mostrar una activación potenciada del receptor pGC-A en comparación con MANP, y en algunos casos, incluso pueden ser más eficaces para tratar la hipertensión (HTA) que el MANP.

En un aspecto, el presente documento presenta un polipéptido natriurético que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO. 4, 5, 6 o 15. El polipéptido puede ser un polipéptido sustancialmente puro.

En otro aspecto, el presente documento presenta un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido natriurético que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o 15.

En otro aspecto, el presente documento presenta un vector que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido natriurético que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o 15.

En otro aspecto, el presente documento presenta una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido natriurético que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o 15. La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariota

En otro aspecto más, el presente documento presenta una composición farmacéutica que contiene un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido natriurético que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 15.

En aún otro aspecto, el presente documento presenta una composición para su uso en un método para tratar un trastorno cardiovascular o metabólico en un mamífero que lo necesite. El método puede incluir administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que contenga un polipéptido natriurético que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 15. El trastorno cardiovascular puede ser hipertensión y la composición puede administrarse en una cantidad eficaz para reducir la presión sanguínea del mamífero. El mamífero puede ser un ser humano. La composición puede administrarse a una dosis de 0,01 ng/kg a 50 pg/kg. El método puede incluir administrar la composición por vía intravenosa.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos y las expresiones técnicas y científicas utilizadas en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Los métodos y materiales descritos en el presente documento pueden usarse para poner en práctica la invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. En caso de conflicto entre la presente memoria descriptiva y una referencia mencionada en el presente documento, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no tienen por objeto ser limitantes.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos detallada y de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

LaFIG. 1muestra la secuencia del péptido MANP (SEQ ID NO: 1). MANP incluye la secuencia de ANP de 28 aminoácidos en su extremo N-terminal, seguido de una cola de 12 aminoácidos, de corte y empalme alternativo, en el extremo C-terminal. Por lo tanto, MANP incluye una porción N-terminal de seis aminoácidos (los seis primeros aminoácidos de ANP), una porción de anillo de 17 aminoácidos (el anillo de 17 aminoácidos de ANP) y una porción C-terminal de 17 aminoácidos (los cinco aminoácidos C-terminales de ANP, seguida de la cola de 12 aminoácidos). LasFIG. 2A-2Eson una serie de gráficos que representan el efecto de MANP, administrado por vía intravenosa a las dosis indicadas, sobre la presión arterial media (FIG. 2A), los niveles de GMPc en plasma (FIG. 2B) y orina (FIG. 2C), la reabsorción de sodio en el túbulo distal (FIG. 2D) y la excreción urinaria de sodio (FIG. 2E) en ratas espontáneamente hipertensas.

LaFIG. 3es un gráfico que representa la generación de GMPcin vitroen células HEK293 que sobreexpresan pGC-A, después del tratamiento con MANP o las variantes de MANP indicadas. Las secuencias de los péptidos variantes sometidos a ensayo se muestran en la parte inferior de la figura. Estos incluyen el péptido MAN<p>de partida (SEQ ID NO: 1), MANP con cuatro aminoácidos adicionales de la urodilatina en el extremo N-terminal (UMANP; SEQ ID NO: 2), MANP con los dos restos arginina sustituidos por restos lisina en la porción N-terminal (MANP14; SEQ ID NO: 3), MANP con D-serina en la sexta posición (MANP18; SEQ ID NO: 4), MANP con D-arginina en la cuarta posición y la serina en la posición 5 eliminada (MANP20; SEQ ID NO: 5) y MANP con los tres restos serina sustituidos por restos treonina en la porción N-terminal (MANP21; SEQ ID NO: 6)

LaFIG. 4es un gráfico que representa los niveles de GMPc como medida de la activación del receptor pGC-A, expresados como cambio porcentual con respecto a MANP. Las células HEK293 que sobreexpresan pGC-A se estimularon con los análogos de MANP indicados; las secuencias de los péptidos sometidos a ensayo se muestran en la parte inferior de la figura.

LasFIG. 5A-5Gson gráficos que representan el efecto de MANP18 sobre la presión arterial media (PAM;FIG.

5A), la frecuencia cardíaca (FIG. 5B), la presión de enclavamiento capilar pulmonar (PECP;FIG. 5C), el gasto cardíaco (FIG. 5D), el flujo sanguíneo renal (FIG. 5E), la producción de orina (VU;FIG. 5F) y la excreción urinaria de sodio (VNaU;FIG. 5G) en un perro normal. Después de un aclaramiento basal (MB), se infundió MANP18 con solución salina durante un total de 45 minutos, lo que incluía un período de introducción de 15 minutos seguido de un aclaramiento de 30 minutos. Después de interrumpir la infusión de péptido, se realizaron cuatro, aclaramientos de 30 minutos [lavado (Lavado), recuperación 1 (Rec1), recuperación 2 (Rec2) y recuperación 3 (Rec3)].

LasFIG. 6A-6Gson gráficos que representan el efecto de MANP18 sobre los niveles plasmáticos de GMPc (FIG.

6A), la excreción urinaria de GMPc (FIG. 6B), los niveles plasmáticos de ANP (FIG. 6C), la excreción urinaria de ANP (FIG. 6D), los niveles plasmáticos de aldosterona (FIG. 6E), la actividad de la renina en plasma (ARP;FIG.

6F) y los niveles plasmáticos de angiotensina II (ANGII;FIG. 6G) en un perro normal. Los experimentos se realizaron como se describe para las FIG.5A-5G).

LasFIG. 7A y 7Bson gráficos que representan la generación de GMPcin vitroen células HEK293 que sobreexpresan pGC-A (FIG. 7A) o pGC-B (FIG. 7B) después del tratamiento con las cantidades indicadas de MANP o MANP2W (FIG. 7A), o las cantidades indicadas de CNP o MANP2W (FIG. 7B).

Descripción detallada

Esta divulgación proporciona métodos y materiales relacionados con los polipéptidos natriuréticos, y en particular con las variantes de MANP. Por ejemplo, el presente documento proporciona variantes sustancialmente puras de MANP que tienen una actividad de polipéptido natriurético, composiciones que contienen dichos polipéptidos, moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que tienen actividad de polipéptido natriurético y células hospedadoras que contienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos con actividad de polipéptido natriurético. Además, el presente documento proporciona métodos y materiales para tratar un trastorno cardiovascular o metabólico en un mamífero (por ejemplo, un roedor, cerdo, oveja, perro o ser humano).

En algunas realizaciones, los polipéptidos natriuréticos pueden ser eficaces para aumentar los niveles plasmáticos de GMPc, aumentar la excreción urinaria de GMPc, aumentar la generación renal neta de GMPc, aumentar el flujo de orina, aumentar la excreción urinaria de sodio, aumentar la excreción urinaria de potasio, aumentar el hematocrito, aumentar la inmunorreactividad plasmática del BNP, aumentar el flujo sanguíneo renal, aumentar la inmunorreactividad plasmática del ANP, disminuir la resistencia vascular renal, disminuir la reabsorción fraccional proximal y distal de sodio, disminuir la presión arterial media, disminuir la presión de enclavamiento capilar pulmonar, disminuir la presión de la aurícula derecha, disminuir la presión arterial pulmonar, disminuir la actividad de la renina en plasma, disminuir los niveles de angiotensina II en plasma, disminuir los niveles de aldosterona en plasma, disminuir la presión de perfusión renal y/o disminuir la resistencia vascular sistémica.

La secuencia de aminoácidos para el ANP maduro humano endógeno es SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO: 7). Como otros polipéptidos natriuréticos maduros, el ANP incluye una estructura de anillo de 17 aminoácidos con un enlace de cisteína entre los restos cisteína en las posiciones 1 y 17 (subrayados en la secuencia anterior) del anillo.

Las secuencias de BNP, CNP y urodilatina humanos maduros son las siguientes:

BNP: SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH (SEQ ID NO: 8)

CNP: GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 9)

URO: TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO: 10)

El péptido natriurético deDendroaspis(DNP), del veneno deDendroaspis angusticeps(serpiente mamba verde), presenta similitud estructural y de secuencia con ANP, BNP y CNP:

DNP: EVKYDPCFGHKIDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSA (SEQ ID NO: 11).

Los restos cisteína en los extremos de las estructuras de anillo formadas por las secuencias anteriores están subrayados.

Un polipéptido natriurético puede contener una o más secuencias presentes en un polipéptido que tenga actividad de polipéptido natriurético (por ejemplo, ANP, BNP, CNP, urodilatina y DNP), pero, en algunas realizaciones, un polipéptido con actividad de polipéptido natriurético también puede tener una secuencia no natural o puede incluir una secuencia presente en cualquier especie (por ejemplo, ser humano, caballo, cerdo, cabra, vaca, perro, gato, rata o ratón).

El término "aislado", como se usa en el presente documento con referencia a un polipéptido, significa que el polipéptido (1) no se asocia a proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente (por ejemplo, libre de proteínas humanas), (3) es expresado por una célula de una especie diferente o (4) no se encuentra en la naturaleza. Un polipéptido aislado puede estar codificado, por ejemplo, por ADN o ARN, incluyendo ADN o ARN sintéticos, o alguna combinación de los mismos.

La expresión "sustancialmente puro", como se usa en el presente documento con referencia a un polipéptido, significa que el polipéptido está sustancialmente libre de otros polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono y ácido nucleico a los que se asocia de forma natural. Un polipéptido sustancialmente puro puede ser cualquier polipéptido extraído de su entorno natural y con una pureza mínima del 60 por ciento. Un polipéptido sustancialmente puro puede tener una pureza de al menos el 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento, o del 65 al 75, del 75 al 80, del 80 al 85, del 85 al 90, del 90 al 95 o del 95 al 99 por ciento. Normalmente, un polipéptido sustancialmente puro producirá una única banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. En algunas realizaciones, un polipéptido sustancialmente puro puede ser un polipéptido sintetizado químicamente.

Puede usarse cualquier método para obtener un polipéptido sustancialmente puro. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de purificación de polipéptidos, tales como cromatografía de afinidad y HPLC, así como técnicas de síntesis de polipéptidos. Además, como fuente para obtener un polipéptido sustancialmente puro puede usarse cualquier material. Por ejemplo, como material de origen puede usarse tejido de animales de tipo silvestre o transgénicos. Además, para obtener un polipéptido sustancialmente puro, pueden usarse células de cultivo tisular modificadas por ingeniería genética para sobreexpresar un polipéptido particular. Adicionalmente, un polipéptido puede modificarse por ingeniería genética para que contenga una secuencia de aminoácidos que permita capturar el polipéptido en una matriz de afinidad. Por ejemplo, puede usarse un marcador tal como c-myc, hemaglutinina, polihistidina o FLAG™ (Kodak) para facilitar la purificación del polipéptido. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier lugar dentro del polipéptido, incluyendo en los extremos carboxilo o amino, o entre ambos. Otras fusiones que pueden usarse incluyen enzimas que ayudan a la detección del polipéptido, tales como fosfatasa alcalina.

Un polipéptido que tiene actividad natriurética puede ser una variante de un polipéptido MANP. MANP es un péptido basado en ANP que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de 28 aminoácidos del ANP humano maduro (SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY; SEQ ID<n>O: 7) con un extremo carboxi de 12 aminoácidos adicional (RITAREDKQGWA; SEQ ID NO: 12). La secuencia completa de MANP es SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA (SEQ ID NO: 1). La secuencia de ácido nucleico 5'-agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatg gacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtaccgaagataa-3' (SEQ ID NO: 13) es una secuencia representativa que codifica ANP humano, y la secuencia de ácido nucleico 5'-agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttcc ggtaccggataacagccagggaggacaagcagggctgggcctag-3' (SEQ ID NO: 14) es una secuencia representativa que codifica MANP.

MANP (SEQ ID NO: 1) tiene mayores efectos diuréticos y natriuréticos que ANP (SEQ ID NO: 7) en perros normales; una dosis baja de MANP también tiene un efecto mayor que una dosis baja de ANP sobre el flujo sanguíneo renal. Véanse, las Patentes de los EE. UU. N.° 7.803.901 y 8.063.191. No se observaron cambios en la tasa de filtración glomerular (TFG) ni en la presión arterial media (PAM) durante la infusión de una dosis baja de MANP o ANP, mientras que la infusión de una dosis alta de MANP aumentó la TFG y disminuyó la PAM en comparación con los efectos de una dosis alta de ANP.

Los polipéptidos proporcionados en el presente documento pueden contener toda la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, excepto por que la secuencia de aminoácidos puede contener de una a diez (por ejemplo, diez, de una a nueve, de dos a nueve, de una a ocho, de dos a ocho, de una a siete, de una a seis, de una a cinco, de una a cuatro, de una a tres, dos o una) adiciones, sustracciones y sustituciones, o modificaciones de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido puede contener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones, sustracciones o sustituciones de restos de aminoácidos individuales. Pueden ser particularmente útiles polipéptidos variantes que contengan adiciones, sustracciones y/o sustituciones dentro de la porción N-terminal de la SEQ ID NO: 1 (los primeros seis aminoácidos de la SEQ ID NO: 1). Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen, sin limitación, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 donde cuatro aminoácidos de urodilatina se añaden al extremo N (SEQ ID NO: 2), los restos arginina en las posiciones 3 y 4 se sustituyen por restos lisina (SEQ ID NO: 3), la isoforma D de serina se sustituye en la sexta posición (SEQ ID NO: 4), la isoforma D de arginina se sustituye en la cuarta posición y la serina en la quinta posición se elimina (SEQ ID NO: 5), las serinas en las posiciones 1, 5 y 6 se sustituyen por restos treonina (SEQ ID NO: 6), la leucina en la posición 2 se sustituye por un triptófano (SEQ ID NO: 15) o cualquier combinación de los mismos.

Puede sustraerse cualquier resto de aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 1 y puede añadirse o sustituirse cualquier resto de aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los 20 restos de aminoácidos convencionales o cualquier otro tipo de aminoácido tal como ornitina o citrulina) dentro de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. La mayoría de los aminoácidos naturales son aminoácidos L y los polipéptidos de origen natural se componen en gran parte de aminoácidos L. Los aminoácidos D son los enantiómeros de los aminoácidos L. En algunos casos, un polipéptido como se proporciona en el presente documento puede contener uno o más aminoácidos D (por ejemplo, D-serina o D-arginina como en las SEQ ID NO: 4 y 5, o en cualquier otra posición o posiciones dentro de la SEQ ID NO: 1). En algunos ejemplos, un polipéptido puede contener estructuras químicas tales como ácido £-aminohexanoico; aminoácidos hidroxilados tales como 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, (5R)-5-hidroxi-L-lisina, alohidroxilisina y 5-hidroxi-L-norvalina; o aminoácidos glicosilados, tales como los aminoácidos que contienen monosacáridos (por ejemplo, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, D-glucosamina y D-galactosamina) o combinaciones de monosacáridos.

Pueden prepararse y modificarse como se describe en el presente documento polipéptidos natriuréticos con una o más adiciones, sustracciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos de polipéptido natriurético nativo (también denominados en el presente documento polipéptidos natriuréticos "variantes"). En algunos casos, las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse seleccionando sustituciones que no difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o la hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Por ejemplo, los restos de origen natural pueden dividirse en grupos basándose en las propiedades de la cadena lateral: (1) aminoácidos hidrófobos (norleucina, metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina); (2) aminoácidos hidrófilos neutros (cisteína, serina y treonina); (3) aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); (4) aminoácidos básicos (asparagina, glutamina, histidina, lisina y arginina); (5) aminoácidos que influyen en la orientación de la cadena (glicina y prolina); y (6) aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina). Las sustituciones realizadas dentro de estos grupos pueden considerarse sustituciones conservadoras. Los ejemplos no limitantes de sustituciones conservadoras útiles pueden incluir, sin limitación, sustitución de alanina por valina, arginina por lisina, asparagina por glutamina, ácido aspártico por ácido glutámico, cisteína por serina, glutamina por asparagina, ácido glutámico por ácido aspártico, glicina por prolina, histidina por arginina, isoleucina por leucina, leucina por isoleucina, lisina por arginina, metionina por leucina, fenilalanina por leucina, prolina por glicina, serina por treonina, treonina por serina, triptófano por tirosina, tirosina por fenilalanina y/o valina por leucina.

En laTABLA 1.se exponen ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras que pueden realizarse en cualquier posición dentro de los polipéptidos proporcionados en el presente documento.

TABLA 1

E m l i i n min i n rv r

En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético puede incluir una o más sustituciones no conservadoras. Las sustituciones no conservadoras normalmente implican el intercambio de un miembro de una de las clases descritas anteriormente por un miembro de otra clase. Dicha producción puede ser deseable para proporcionar grandes cantidades o realizaciones alternativas de dichos compuestos. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido funcional sometiendo a ensayo la actividad específica de la variante de péptido usando, por ejemplo, métodos divulgados en el presente documento.

En algunas realizaciones, un polipéptido como se proporciona en el presente documento puede tener una longitud de, por ejemplo, 35 a 45 restos de aminoácidos (por ejemplo, de 35 a 40, de 40 a 45, de 35 a 37, de 36 a 38, de 37 a 39, de 38 a 40, de 39 a 41, de 40 a 42, de 41 a 43, de 42 a 44, de o 43 a 45 restos de aminoácidos).

En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético puede comprender una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 1, pero con un número particular de sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido natriurético puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, pero con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos. Los ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos incluyen, sin limitación, MANP con un aminoácido D que reemplaza uno o más aminoácidos L dentro de la región N-terminal del polipéptido (por ejemplo, con un resto D-serina en la posición 6, como se expone en la SEQ ID NO: 4, o con una D-arginina en la posición 4, como se expone en la SEQ ID NO: 5).

En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento puede incluir una secuencia de aminoácidos con al menos un 85 % (por ejemplo, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99,0 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9% o 100 %) de identidad de secuencia con una región de una secuencia de polipéptido natriurético de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones coincidentes en las secuencias de aminoácidos alineadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de aminoácidos alineados, y multiplicando por 100. Una posición coincidente es aquella en la que hay aminoácidos idénticos en la misma posición en las secuencias de aminoácidos alineadas. El porcentaje de identidad de secuencia también puede determinarse para cualquier secuencia de ácido nucleico.

El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia particular de ácido nucleico o aminoácido y una secuencia referenciada por un número de identificación de secuencia particular se determina de la siguiente manera. En primer lugar, una secuencia de ácido nucleico o aminoácido se compara con la secuencia expuesta en un número de identificación de secuencia particular usando el programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ puede obtenerse en línea en fr.com/blast o en ncbi.nlm.nih.gov. Pueden encontrarse instrucciones sobre cómo usar el programa Bl2seq en el archivo Léame que acompaña a BLASTZ. Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, las opciones se establecen de la siguiente manera: -i se establece como un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece como un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); - p se establece como blastn; -o se establece como cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se establece como -1; - r se fija como 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de Bl2seq se establecen de la siguiente manera: -i se establece como un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece como un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece como blastp; -o se establece como cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.

Una vez alineadas, el número de coincidencias se determina contando el número de posiciones donde se presenta un resto de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se determina dividiendo el número de coincidencias, ya sea entre la longitud de la secuencia expuesta en las secuencias identificadas (por ejemplo: SEQ ID NO: 1), o entre una longitud articulada (tal como 20 nucleótidos o restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia expuesta en una secuencia identificada), y después multiplicado el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene 37 coincidencias cuando se alinea con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 es un 92,5 por ciento idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 (es decir, 37 40 x 100 = 92,5). Cabe señalar que el valor del porcentaje de identidad de secuencia se redondea a la décima más próxima. Por ejemplo, 75,11,75,12, 75,13 y 75,14 se redondean a 75,1, mientras que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean a 75,2. También se observa que el valor de la longitud siempre será un número entero.

Los polipéptidos aislados pueden producirse usando cualquier método adecuado, incluyendo la síntesis en fase sólida, y pueden generarse usando técnicas manuales o técnicas automatizadas (por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied BioSystems (Foster City, CA) o un sintetizador de péptidos automático de Biosearch Inc. (San Rafael, CA)). Los enlaces disulfuro entre restos cisteína pueden introducirse mediante oxidación suave de los polipéptidos lineales usando KCN como se ha enseñado, por ejemplo, en la Patente de los EE. UU. N.° 4.757.048. Los polipéptidos natriuréticos también pueden producirse de forma recombinante u pueden obtenerse en el mercado.

Los polipéptidos natriuréticos proporcionados en el presente documento son normalmente cíclicos debido a los enlaces disulfuro entre los restos cisteína subrayados en las secuencias mostradas anteriormente. En algunas realizaciones, un grupo sulfhidrilo en un resto cisteína puede reemplazarse por un grupo alternativo (por ejemplo, -CH2CH2-). Para reemplazar un grupo sulfhidrilo por un grupo -CH2-, por ejemplo, un resto cisteína puede reemplazarse por ácido alfaaminobutírico. Dichos polipéptidos análogos cíclicos pueden generarse, por ejemplo, de acuerdo con la metodología de Lebl y Hruby ((1984)Tetrahedron Lett.25: 2067-2068) o empleando el procedimiento divulgado en la Patente de los EE. UU. N.° 4.161.521.

Además, pueden formarse puentes éster haciendo reaccionar el OH de la serina o treonina con el grupo carboxilo del ácido aspártico o ácido glutámico para producir un puente que tenga la estructura -CH2CO2CH2-. De forma similar, puede obtenerse una amida haciendo reaccionar la cadena lateral de la lisina con ácido aspártico o ácido glutámico para producir un puente que tenga la estructura -CH<2>C(O)NH(CH)<4>-. Se conocen en la técnica métodos para la síntesis de estos puentes (véanse, por ejemplo, Schilleret al.(1985)Biochem. Biophys. Res. Comm.127: 558 y Schilleret al.(1985)Int. J. Peptide Protein Res.25: 171). Por ejemplo, un método para preparar ésteres de los presentes polipéptidos, cuando se usa la técnica de síntesis de Merrifield, es escindir el polipéptido completado de la resina en presencia del alcohol deseado en condiciones básicas o ácidas, dependiendo de la resina. Después, el extremo C-terminal del polipéptido puede esterificarse directamente cuando se libera de la resina, sin aislamiento del ácido libre. Las amidas de polipéptidos también pueden prepararse usando técnicas (por ejemplo, las conocidas en la técnica) para convertir un grupo o precursor de ácido carboxílico en una amida. Un método para la formación de amidas en el grupo carboxilo C-terminal incluye escindir el polipéptido de un soporte sólido con una amina apropiada, o escindirlo en presencia de un alcohol, produciendo un éster, seguido de aminólisis con la amina deseada. Otros restos de aminoácidos formadores de puentes y reacciones se proporcionan en, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 4.935.492. También se conoce en la técnica la preparación de análogos peptídicos que incluyen enlaces no peptídicos para unir restos de aminoácidos. Véanse, por ejemplo, Spatolaet al.(1986)Life Sci.38: 1243; Spatola (1983)Vega Data1(3); Morley (1980)Trends Pharm. Sci.463-468; Hudsonet al.(1979)Int. J. Pept. Prot. Res.14: 177; Spatola, enChemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins,B. Weinstein, ed., Marcel Dekker, Nueva York, págs. 267 (1983); Hann (1982)J. Chem. Soc.Perkin Trans. 1: 307; Almquistet al.(1980)J. Med. Chem.

23: 1392; Jennings-Whiteet al.(1982)Tetrahedron Lett.23: 2533; Solicitud de Patente Europea EP 45665; Holladayet al.(1983)Tetrahedron Lett.24: 4401; y Hruby (1982)Life Sci.31: 189.

Pueden prepararse derivados N-acilo de un grupo amino de un polipéptido usando un N-acil aminoácido protegido para la condensación final, o mediante acilación de un péptido protegido o no protegido. Por ejemplo, pueden prepararse derivados de O-acilo, mediante acilación de un hidroxipéptido libre o de una resina peptídica. Cualquiera de las dos acilaciones puede realizarse usando reactivos de acilación convencionales, tales como halogenuros de acilo, anhídridos, acil imidazoles y similares. Tanto la N como la O-acilación pueden realizarse conjuntamente, si se desea.

En algunos casos, un polipéptido proporcionado en el presente documento puede pegilarse, acetilarse o ambas cosas. En algunos casos, un polipéptido proporcionado en el presente documento puede unirse covalentemente a oligómeros, tales como oligómeros cortos anfífilos que permiten la administración o mejoran el perfil farmacocinético o farmacodinámico del polipéptido conjugado. Los oligómeros pueden comprender polietilenglicol (PEG) soluble en agua y/o alquilos solubles en lípidos (polímeros de ácidos grasos de cadena corta, media o larga, tales como, sin limitación, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido cáprico o ácido estérico). La molécula de ácido graso puede unirse al extremo amino libre o a cualquier cadena lateral de lisina (un grupo amino épsilon), y puede colocarse un resto lisina para esta unión en el extremo C-terminal o N-terminal del péptido. La unión a PEG u otro polímero adecuado, o la fusión a albúmina u otro polipéptido adecuado puede dar como resultado un polipéptido natriurético modificado que tenga una semivida mayor en comparación con un polipéptido natriurético no modificado. Sin quedar ligados a mecanismo particular alguno, una semivida sérica mayor puede ser el resultado de la degradación proteolítica, el reconocimiento inmunitario o la eliminación celular reducidos del polipéptido natriurético modificado. Se conocen en la técnica métodos para modificar un polipéptido por unión a PEG (también denominada "PEGilación") u otros polímeros, e incluyen aquellos expuestos en la Patente de los EE. UU. N.° 6.884.780; la publicación del PCT N.° WO 2004/047871; Cataliottiet al.((2007)Trends Cardiovasc. Med.17: 10-14; Veronese y Mero (2008)BioDrugs22: 315 329; Milleret al.(2006)Bioconjugate Chem.17: 267-274; y Veronese y Pasut (2005)Drug Discov. Today10: 1451 1458. También se conocen en la técnica métodos para modificar un polipéptido mediante fusión con albúmina, e incluyen aquellos expuestos en la Publicación de Patente de los EE. UU. N.° 20040086976 y Wanget al.(2004)Pharm. Res.21: 2105-2111.

En algunos casos, un polipéptido proporcionado en el presente documento puede fusionarse con el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, una molécula de IgG1) de manera que el transporte activo del polipéptido de fusión a través de las barreras de las células epiteliales se produzca a través del receptor de Fc. En algunos casos, un polipéptido puede ser un polipéptido cíclico. Un polipéptido cíclico proporcionado en el presente documento puede obtenerse mediante el enlace de restos cisteína. Sin embargo, también se contempla el reemplazo de un grupo sulfhidrilo en el resto cisteína por un grupo alternativo (por ejemplo, -CH2-CH2-), por ejemplo, Para reemplazar los grupos sulfhidrilo por un grupo -CH2-, los restos cisteína pueden reemplazarse por el ácido alfa-aminobutírico análogo. Estos péptidos análogos cíclicos pueden formarse, por ejemplo, de acuerdo con la metodología de Lebl y Hruby (citado anteriormente), o empleando el procedimiento divulgado en la Patente de los EE. UU. N.° 4.161.521.

Pueden prepararse sales de los grupos carboxilo de los polipéptidos poniendo en contacto un polipéptido con uno o más equivalentes de una base deseada, tal como, por ejemplo, una base de hidróxido de metal (por ejemplo, hidróxido de sodio), una base de carbonato o bicarbonato de metal (por ejemplo, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio), o una base de amina (por ejemplo, trietilamina, trietanolamina y similares). Pueden prepararse sales de adición de ácido de polipéptidos poniendo en contacto el polipéptido con uno o más equivalentes de un ácido inorgánico u orgánico (por ejemplo, ácido clorhídrico).

Los polipéptidos natriuréticos proporcionados en el presente documento pueden actuar a través de uno o más de los receptores de guanilil ciclasa a través de los cuales actúan los polipéptidos natriuréticos nativos. Por ejemplo, los polipéptidos proporcionados en el presente documento se unen y actúan normalmente a través del receptor NPR-A a través del cual actúan ANP y BNP, aunque también pueden actúan a través del receptor NPR-B a través del cual actúa CNP. Adicionalmente, en algunos casos, un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento puede unirse y actuar a través de más de un receptor de guanilil ciclasa, incluyendo NPR-A y NPR-B, por ejemplo. Se conocen en la técnica métodos para evaluar qué receptor está implicado en la función de un polipéptido natriurético particular. Por ejemplo, pueden aislarse glomérulos, que contienen tanto NPR-A como NPR-B, (por ejemplo, de un animal de laboratorio tal como un perro) e incubarse con un polipéptido natriurético (por ejemplo, un polipéptido natriurético nativo o mutado), y pueden medirse los niveles de GMPc. Los glomérulos pueden pretratarse con antagonistas de NPR-A o NPR-B para determinar si puede atenuarse la producción de GMPc estimulada por un polipéptido natriurético a través de uno u otro receptor.

En algunos casos, puede usarse un polipéptido natriurético aislado y en el presente documento para tratar enfermedades cardiovasculares, metabólicas o cardiorrenales. Por ejemplo, los polipéptidos proporcionados en el presente documento pueden usarse para tratar la hipertensión o la insuficiencia cardíaca. La presencia o el grado de la enfermedad pueden evaluarse usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, un examen clínico general para evaluar la tensión arterial, la frecuencia cardíaca, el ritmo cardiaco, el oxígeno arterial y los niveles de hemoglobina; una ecocardiografía para medir la fracción de eyección, el diámetro del VI y de la aurícula izquierda (AI), el movimiento de la pared del VI, la presión de llenado del VI y la función diastólica mediante Doppler de pulso y tisular; un uso de un catéter Swan-Ganz para medir el gasto cardíaco, la presión de enclavamiento capilar pulmonar, la presión arterial pulmonar, la presión del ventrículo derecho, la presión de la aurícula derecha y la resistencia vascular sistémica y pulmonar; una evaluación de la función renal mediante la determinación de la tasa de filtración glomerular, la creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre; y una medición de biomarcadores tales como BNP, proBNP aminoterminal (NT-proBNP), troponina T, troponina I, proteína C reactiva (PCR) y creatina-cinasa, cistatina C en suero, albuminuria, lopocalina asociada a la gelatinización de neutrófilos (NGAL), N-acetil-beta-D-glucosaminidasa (NAG), molécula de lesión renal-1 (KIM-1), angiotensina-II, renina, aldosterona y citocinas inflamatorias (por ejemplo, interleucina (IL)-6, IL-18, etc.). En algunos casos, un polipéptido natriurético aislado como se proporciona en el presente documento puede reducir uno o más síntomas de IC aguda, incluyendo parámetros clínicos tales como edema, dificultad para respirar y fatiga, así como descarga cardíaca (es decir, reducción de la presión reducida en el corazón), aumento de la tasa de filtración glomerular (TFG), reducción de ARP, disminución de los niveles de angiotensina II, disminución de la proliferación de fibroblastos cardíacos, disminución de la hipertrofia ventricular izquierda (VI), disminución de la masa del VI (indicativa de una reducción de la fibrosis y la hipertrofia), disminución de la PECP (una medida indirecta de la presión auricular izquierda), disminución de la presión auricular derecha, disminución de la presión arterial media, disminución de los niveles de aldosterona (indicativo de un efecto antifibrótico), disminución de la fibrosis ventricular, aumento de la fracción de eyección y disminución del diámetro sistólico final del VI. Para determinar si un polipéptido natriurético es capaz de inhibir o reducir un síntoma de IC aguda, pueden evaluarse uno o más de estos parámetros (por ejemplo, antes y después del tratamiento con el polipéptido natriurético), usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo.

Los polipéptidos natriuréticos variantes que tienen sustituciones conservadoras y/o no conservadoras con respecto a la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, polipéptidos que comprenden cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-6 y 15), así como fragmentos de variantes de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, fragmentos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-6 y 15), pueden someterse a cribado de actividad biológica usando cualquiera de una serie de ensayos, incluyendo los descritos en el presente documento. Por ejemplo, la actividad de un polipéptido natriurético como se describe en el presente documento puede evaluarsein vitrosometiendo a ensayo su efecto sobre la producción de GMPc en células cultivadas (por ejemplo, fibroblastos cardíacos cultivados, células endoteliales aórticas o células glomerulares). Las células pueden exponerse a un polipéptido natriurético (por ejemplo, polipéptido natriurético de 10'10 a 10'4 M) y las muestras pueden someterse a ensayo para evaluar los efectos del polipéptido natriurético sobre la generación de GMPc. La generación de GMPc puede detectarse y medirse usando, por ejemplo, un kit de GMPc de RIA competitivo (Perkin-Elmer, Boston, MA).

La actividad de un polipéptido natriurético también puede evaluarsein vivomediante, por ejemplo, ensayos de sus efectos sobre factores tales como los niveles plasmáticos de GMPc, la excreción urinaria de GMPc, la generación renal neta de GMPc, la tasa de filtración glomerular, la presión sanguínea, la frecuencia cardíaca, la función hemodinámica tal como el gasto cardíaco, la presión de enclavamiento pulmonar, la resistencia vascular sistémica y la función renal, tal como el flujo sanguíneo renal, el volumen de orina y la tasa de excreción de sodio en un mamífero (por ejemplo, un roedor, cerdo, oveja, perro o ser humano). En algunos casos, dichos parámetros pueden evaluarse después de inducir insuficiencia cardíaca (por ejemplo, mediante estimulación rápida del ventrículo derecho) o hipertensión.

El presente documento también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, el presente documento proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos natriuréticos que son variantes del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos<expuesta en la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, cualquiera de las SEQ>I<d>N<o>S:<2-6 y 15, o variantes de las SEQ ID NOS:>2-6 y 15, u otras variantes de la SEQ ID NO: 1 (particularmente dentro de la porción N-terminal) que difieren de las SEQ ID NOS: 2-6 y 15. Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico como se proporciona en el presente documento puede codificar un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, excepto por que la secuencia de aminoácidos contiene de una a diez (por ejemplo, de una a nueve, de dos a nueve, de una a ocho, de dos a ocho, de una a siete, de una a seis, de una a cinco, de una a cuatro, de una a tres, dos o una) adiciones, sustracciones y sustituciones de aminoácidos como se describe en el presente documento, normalmente donde al menos una (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) de las adiciones, sustracciones o sustituciones de aminoácidos son con respecto a la porción N-terminal de la SEQ ID NO: 1.

La expresión "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, abarca tanto el ARN como el ADN, incluyendo el ADNc, el ADN genómico y el ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente). El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario. Cuando es monocatenario, el ácido nucleico puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal.

El término "aislado", como se usa en el presente documento con referencia a ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico que se produce de manera natural que no está inmediatamente contiguo a ambas secuencias con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que deriva. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, a condición de que esté ausente o se elimine una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontradas inmediatamente flanqueantes a dicha molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, un ADN recombinante que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias, así como el ADN recombinante que se incorpora a un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpes virus) o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que forme parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.

El término "aislado", como se usa en el presente documento con referencia a ácido nucleico también incluye cualquier ácido nucleico de origen no natural, puesto que no se encuentran secuencias de ácidos nucleicos no naturales en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma natural. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural, tal como un ácido nucleico manipulado, se considera un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico modificado por ingeniería genética puede fabricarse usando técnicas comunes de clonación molecular o de síntesis química de ácido nucleico. El ácido nucleico aislado de origen no natural puede ser independiente de otras secuencias o incorporarse en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpes virus) o el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico de origen no natural puede incluir una molécula de ácido nucleico que sea parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.

Será evidente para los expertos en la materia que un ácido nucleico existente entre cientos a millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o genómicas, o los cortes de gel que contengan una digestión de restricción de ADN genómico no se considerará un ácido nucleico aislado.

En algunos casos, una molécula aislada de ácido nucleico proporcionada en el presente documento puede tener al menos aproximadamente 12 bases de longitud (por ejemplo, al menos aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 120, 130, 140, 150, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 o 5000 bases de longitud) y se hibrida, en condiciones de hibridación, con la cadena sentido o antisentido de un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica una variante de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. Las condiciones de hibridación pueden ser condiciones de hibridación moderadamente o muy estrictas. En algunos casos, dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser moléculas que no se hibridan con la cadena sentido o antisentido de un ácido nucleico que consiste únicamente en la secuencia codificante de un péptido natriurético tal como ANP humano o MANP humano.

Para los fines del presente documento, las condiciones de hibridación moderadamente estrictas significan que la hibridación se realiza a aproximadamente 42 °C en una solución de hibridación que contiene KPO425 mM (pH 7,4), SSC 5X, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos desnaturalizado 50 pg/ml, formamida al 50 %, sulfato de dextrano al 10 % y sonda 1-15 ng/ml (aproximadamente 5*107 rpm/pg), mientras que los lavados se realizan a aproximadamente 50 °C con una solución de lavado que contiene SSC 2X y dodecil sulfato de sodio al 0,1 %. ;;Las condiciones de hibridación muy estrictas significan que la hibridación se realiza a aproximadamente 42 °C en una solución de hibridación que contiene KPO425 mM (pH 7,4), SSC 5X, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos desnaturalizado 50 pg/ml, formamida al 50 %, sulfato de dextrano al 10 % y sonda 1 15 ng/ml (aproximadamente 5*107 rpm/pg), mientras que los lavados se realizan a aproximadamente 65 °C con una solución de lavado que contiene SSC 0.2X y dodecil sulfato de sodio al 0,1 %.

Pueden producirse moléculas de ácido nucleico aislado usando técnicas convencionales, incluyendo, sin limitación, técnicas habituales de clonación molecular y síntesis química de ácido nucleico. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener un ácido nucleico aislado que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento. PCR se refiere a un procedimiento o técnica en el que los ácidos nucleicos diana se amplifican enzimáticamente. Normalmente se emplea la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá para diseñar cebadores de oligonucleótidos que son idénticos en secuencia a las cadenas opuestas del molde que ha de amplificarse. La PCR puede usarse para amplificar secuencias específicas de ADN, así como de ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o ARN celular total. Los cebadores normalmente tienen de 14 a 40 nucleótidos de longitud, pero pueden variar de 10 nucleótidos a cientos de nucleótidos de longitud. Se describen técnicas de PCR generales, por ejemplo, enPCR Primer: A Laboratory Manual,ed. de Dieffenbach y Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Cuando se usa ARN como fuente de molde, puede usarse transcriptasa inversa para sintetizar cadenas de ADN complementario (ADNc). También puede usarse reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena, replicación autosostenida de secuencias o amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos para obtener ácidos nucleicos aislados. Véanse, por ejemplo, Lewis (1992)Genetic Engineering News12: 1; Guatelliet al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87: 1874-1878; y Weiss (1991)Science254: 1292.

También pueden sintetizarse ácidos nucleicos aislados químicamente, ya sea como una molécula de ácido nucleico individual (por ejemplo, usando la síntesis automatizada de ADN en la dirección 3' a 5' usando la tecnología de fosforamidita) o como una serie de oligonucleótidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse uno o más pares de oligonucleótidos largos (por ejemplo, > 100 nucleótidos) que contengan la secuencia deseada, conteniendo cada par un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 15 nucleótidos) de manera que se forme un dúplex cuando se hibride el par de oligonucleótidos. Se usa ADN polimerasa para prolongar los oligonucleótidos, dando como resultado una única molécula de ácido nucleico bicatenaria por cada par de oligonucleótidos, que después puede ligarse en un vector.

Los ácidos nucleicos aislados (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos natriuréticos variantes) también pueden obtenerse mediante mutagénesis. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede mutarse mediante técnicas convencionales, incluyendo la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y la mutagénesis dirigida al sitio a través de PCR. Véase,Short Protocols in Molecular Biology,Capítulo 8, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, editado por Ausubelet al.,1992. En el presente documento se proporcionan ejemplos no limitantes de polipéptidos natriuréticos variantes.

También se proporcionan vectores que contienen ácidos nucleicos tales como los descritos en el presente documento. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN para lograr la replicación del segmento insertado. Un "vector de expresión" es un vector que incluye una o más secuencias de control de la expresión, y una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN.

En un vector de expresión, un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido natriurético) puede unirse operativamente a una o más secuencias de control de la expresión. Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" significa incorporado a una construcción genética de manera que las secuencias de control de la expresión controlen eficazmente la expresión de una secuencia codificante de interés. Los ejemplos de secuencias de control de la expresión incluyen promotores, potenciadores y regiones de terminación de la transcripción. Un promotor es una secuencia de control de la expresión compuesta por una región de una molécula de ADN, normalmente entre 100 y 500 nucleótidos en dirección 5' del punto de inicio de la transcripción (generalmente cerca del sitio de inicio de la ARN polimerasa II). Para poner una secuencia codificante bajo el control de un promotor, es necesario situar el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura de traducción del polipéptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en dirección 3' del promotor. Los potenciadores proporcionan especificidad de expresión en términos de tiempo, ubicación y nivel. A diferencia de los promotores, los potenciadores pueden actuar cuando están ubicados a diversas distancias del sitio de transcripción. Un potenciador también puede ubicarse en dirección 3' del sitio de inicio de la transcripción. Una secuencia codificante está "unida operativamente" y "bajo el control" de secuencias de control de la expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificante en ARNm, que después puede traducirse en la proteína codificada por la secuencia codificante. Por lo tanto, los vectores de expresión pueden ser útiles para producir anticuerpos, así como otras moléculas multivalentes.

Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores víricos derivados de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, virus del mosaico del tabaco, herpesvirus, citomegalovirus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y virus adenoasociados. Existen numerosos vectores y sistemas de expresión disponibles en el mercado de empresas tales como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

Un vector de expresión puede incluir una secuencia marcadora diseñada para facilitar la manipulación posterior de la secuencia de ácido nucleico expresada (por ejemplo, purificación o localización). Las secuencias marcadoras, tales como proteína verde fluorescente (GFP), glutatión S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina o marcador Flag™ (Kodak, New Haven, CT) se expresan normalmente en forma de una fusión con el polipéptido codificado. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo en uno cualquiera de los extremos carboxilo o amino.

También se proporcionan células hospedadoras que contienen vectores. La expresión "célula hospedadora" incluye células procariotas y eucariotas en las que puede introducirse un vector de expresión recombinante (por ejemplo, un vector que codifica un polipéptido que contiene una variante de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1). Como se usa en el presente documento, "transformado" y "transfectado" abarcan la introducción de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula mediante una de una serie de técnicas. Aunque no se limitan a una técnica particular, un número de estas técnicas están bien establecidas en la técnica. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras, por ejemplo, en Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2.a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989). Por ejemplo, puede usarse precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus para introducir ácido nucleico en las células. Además, puede suministrarse directamente ADN desnudo a las célulasin vivocomo se describe en otro lugar (Patentes de los<e>E. UU. N.° 5.580.859 y 5.589.466). Las células hospedadoras pueden expresar el polipéptido codificado, pero se señala que no se requiere que las células que contienen una molécula aislada de ácido nucleico proporcionada en el presente documento expresen un polipéptido. La molécula aislada de ácido nucleico transformada en una célula hospedadora puede integrarse en el genoma de la célula o mantenerse en estado episómico. Por lo tanto, las células hospedadoras pueden transfectarse de forma estable o transitoria con una construcción que contenga una molécula de ácido nucleico aislada proporcionada en el presente documento.

Puede usarse cualquier método adecuado para introducir una molécula de ácido nucleico aislada en una célulain vivooin vitro,usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, la electroporación, la choque térmico, la lipofección, la microinyección y la transferencia de ácido nucleico mediada por virus son métodos que pueden usarse para introducir una molécula de ácido nucleico aislada en una célula. Además, puede administrarse directamente ADN desnudo a las célulasin vivocomo se describe en otros lugares (por ejemplo, las Patentes de los EE. UU. N.° 5.580.859 y 5.589.466, y continuaciones de las mismas). Adicionalmente, pueden introducirse moléculas de ácido nucleico aisladas en las células generando animales transgénicos.

Puede usarse cualquier método adecuado, incluyendo métodos conocidos en la técnica, para identificar células que contienen una molécula de ácido nucleico aislada proporcionada en el presente documento. Dichos métodos incluyen, sin limitación, PCR y técnicas de hibridación de ácido nucleico tales como análisis Northern y Southern. En algunos casos, pueden usarse técnicas inmunohistoquímicas y bioquímicas para determinar si una célula contiene una molécula de ácido nucleico aislada en particular mediante la detección de la expresión de un polipéptido codificado por esa molécula de ácido nucleico.

Los polipéptidos natriuréticos descritos en el presente documento (por ejemplo, variantes de MANP), o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos natriuréticos descritos en el presente documento, pueden incorporarse en composiciones para su administración a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que padezca o corra el riesgo de padecer hipertensión y/o enfermedad cardiorrenal). Los expertos en la materia conocen bien métodos para formular y posteriormente administrar composiciones terapéuticas. Las dosis normalmente dependen de la capacidad de respuesta del sujeto al compuesto, durando el curso del tratamiento de varios días a varios meses, o hasta que se consigue una respuesta adecuada. Las personas con conocimientos habituales en la materia pueden determinar rutinariamente las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de un anticuerpo, y generalmente pueden estimarse basándose en la CE50 que se ha encontrado eficaz en modelos animalesin vitroy/oin vivo.Las composiciones que contienen los compuestos (por ejemplo, polipéptidos natriuréticos) y ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento pueden administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o incluso con menor frecuencia, o pueden administrarse de forma continua durante un período de tiempo (por ejemplo, horas, días o semanas). Por ejemplo, un polipéptido natriurético o una composición que contiene un polipéptido natriurético puede administrarse a un paciente a una dosis de al menos 0,01 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 100 mg de polipéptido natriurético/kg de masa corporal en el momento de la reperfusión o en torno al mismo, o puede administrarse de forma continua como infusión comenzando en el momento de la reperfusión o en torno a al mismo y continuando durante uno a siete días (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 0,01 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto a aproximadamente 0,5 |jg de polipéptido natriurético/kg/minuto).

Los polipéptidos natriuréticos y los ácidos nucleicos pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos tales como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores o células, u otras formulaciones orales, tópicas o de otro tipo para facilitar la captación, distribución y/o absorción.

En algunas realizaciones, una composición puede contener un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, disolventes farmacéuticamente aceptables, agentes de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar anticuerpos a un sujeto. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos o sólidos, y pueden seleccionarse teniendo en cuenta la forma de administración prevista para proporcionar el volumen deseado, la consistencia y otras propiedades químicas y de transporte pertinentes, cuando se combinan con uno o más compuestos terapéuticos y cualquier otro componente de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, sin limitación: agua; solución salina; agentes aglutinantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa o dextrosa y otros azúcares, gelatina o sulfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, almidón, polietilenglicol o acetato de sodio); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio).

Las composiciones farmacéuticas que contienen las moléculas descritas en el presente documento pueden administrarse por diversos métodos, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico. La administración puede ser, por ejemplo, parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intratecal, intraventricular, intramuscular o intraperitoneal, o por goteo intravenoso (i.v.)); oral; tópica (por ejemplo, transdérmica, sublingual, oftálmico o intranasal); o pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles), o puede producirse por una combinación de dichos métodos. La administración puede ser rápida (por ejemplo, mediante inyección) o puede producirse a lo largo de un período de tiempo (por ejemplo, mediante infusión lenta o administración de formulaciones de liberación lenta).

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular incluyen soluciones acuosas estériles (por ejemplo, solución salina fisiológica estéril), que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados (por ejemplo, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores farmacéuticamente aceptables).

Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen, por ejemplo, polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobrecitos o comprimidos. Dichas composiciones también pueden incorporar espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes.

Las formulaciones para la administración tópica incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes, o soluciones en bases oleosas líquidas o sólidas. Dichas soluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Pueden ser útiles portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. En algunas realizaciones, el suministro transdérmico de polipéptidos natriuréticos como se proporcionan en el presente documento puede ser particularmente útil. Los métodos y composiciones para el suministro transdérmico incluyen aquellos descritos en la técnica (por ejemplo, en Wermelinget al.(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA105:2058-2063; Goebel y Neubert (2008)Skin Pharmacol. Physiol.21: 3-9; Banga (2007)Pharm. Res.24: 1357-1359; Maliket al.(2007)Curr. Drug Deliv.4: 141-151; y Prausnitz (2006)Nat. Biotechnol.24: 416-417).

Las preparaciones nasales pueden presentarse en forma líquida o en forma de producto seco. Las suspensiones o soluciones acuosas nebulizadas pueden incluir portadores o excipientes para ajustar el pH y/o la tonicidad.

Las composiciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, suspensiones acuosas y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de diversos componentes que incluyen, por ejemplo, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Las formulaciones en emulsión son particularmente útiles para el suministro oral de composiciones terapéuticas debido a su facilidad de formulación y eficacia de solubilización, absorción y biodisponibilidad. Los liposomas pueden ser especialmente útiles por su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista del suministro de fármacos.

Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden contener cualesquier sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de dichos ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un sujeto, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo para el compuesto pertinente (por ejemplo, el polipéptido natriurético). En consecuencia, por ejemplo, el presente documento proporciona sales farmacéuticamente aceptables de polipéptidos natriuréticos, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos, y otros bioequivalentes. Un profármaco es un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva y se convierte en una forma activa (es decir, fármaco) dentro del organismo o de las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas y/o condiciones. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los polipéptidos natriuréticos útiles en los métodos proporcionados en el presente documento (es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada de los polipéptidos natriuréticos parentales sin transmitir efectos toxicológicos no deseados). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, sales formadas con cationes (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, o poliaminas tales como espermina); sales de adición de ácidos formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido nítrico); sales formadas con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido palmítico o ácido fumárico); y sales formadas con aniones elementales (por ejemplo, bromo, yodo o cloro).

Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas. Por lo tanto, las composiciones también pueden incluir materiales compatibles y farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, agentes antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas farmacéuticas de las composiciones, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Además, la composición puede mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes, potenciadores de la penetración y sustancias aromáticas.

Cuando se añaden, sin embargo, dichos materiales no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los demás componentes de las composiciones.

En algunos casos, un polipéptido proporcionado en el presente documento puede formularse como una forma farmacéutica de liberación sostenida. Por ejemplo, un polipéptido natriurético puede formularse en una formulación de liberación controlada. En algunos casos, pueden formularse recubrimientos, envolturas o matrices protectoras para contener uno o más de los polipéptidos proporcionados en el presente documento. Dichos recubrimientos, envolturas y matrices protectoras pueden usarse para recubrir dispositivos permanentes tales comostents,catéteres y tubos de diálisis peritoneal. En algunos casos, un polipéptido proporcionado en el presente documento puede incorporarse a sustancias poliméricas, liposomas, microemulsiones, micropartículas, nanopartículas o ceras.

Las formulaciones farmacéuticas como se divulgan en el presente documento, que pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria, pueden prepararse de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos (es decir, los anticuerpos) con el portador o portadores farmacéuticos deseados. Normalmente, las formulaciones pueden prepararse asociando de manera uniforme e íntima los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, conformando el producto. Las formulaciones pueden esterilizarse si se desea, a condición de que el método de esterilización no interfiera con la eficacia de la molécula o moléculas contenidas en la formulación.

En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético proporcionado en el presente documento puede formularse para su suministro subcutáneo a través de polímeros de depósito, parche farmacológico, inyección, bomba o micropartícula/nano partícula. En la técnica se conocen ejemplos de dichos métodos de suministro.

A modo de ejemplo y no de limitación, la Publicación PCT N.° WO 2008/061355 divulga materiales y métodos para formular un polipéptido para su suministro en un tubo de hidrogel. El polipéptido puede mezclarse con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el polipéptido en cantidades adecuadas para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un polipéptido puede combinarse con uno o más excipientes tales como, sin limitación, celulosa microcristalina, dióxido de silicio coloidal, lactosa, almidón, sorbitol, ciclodextrina y combinaciones de los mismos. El excipiente puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúa como vehículo, portador o medio para el polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido puede comprimirse, compactarse o extruirse con uno o más excipientes antes de introducirlo en un tubo de hidrogel. Dichas formulaciones pueden dar como resultado una composición farmacéutica con propiedades de liberación deseables, estabilidad mejorada y/u otras propiedades deseables.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir agentes auxiliares o excipientes, tales como agentes de deslizamiento, agentes de disolución, tensioactivos, diluyentes, aglutinantes, disgregantes y/o lubricantes. Por ejemplo, los agentes de disolución pueden aumentar la velocidad de disolución del polipéptido a partir de la formulación de dosificación, y pueden incluir, por ejemplo, ácidos orgánicos y/o sales de ácidos orgánicos (por ejemplo, citrato de sodio con ácido cítrico). Otros ejemplos de excipientes útiles en dichas formulaciones incluyen polímeros sintéticos, semisintéticos, modificados y naturales (por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, PEG, ciclodextrina, ciclodextrinas modificadas con alcoxi, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, albúmina, dextrano, maltitol, xilitol, caolín y metilcelulosa). El polipéptido también puede mezclarse con un agente lubricante (por ejemplo, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico o aceite mineral, estearato de calcio, aceites vegetales hidrogenados, benzoato de sodio, cloruro de sodio, leucina carbowax, lauril sulfato de magnesio o monoestearato de glicerilo), un agente humectante, un agente emulsionante y de suspensión, o un agente conservante (por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo o de propilo).

Otros agentes que pueden añadirse a una composición farmacéutica pueden alterar el pH del microentorno en la disolución y el establecimiento de un perfil de concentración plasmática terapéuticamente eficaz del polipéptido. Dichos agentes incluyen sales de ácidos inorgánicos e hidróxido de magnesio. Otros agentes que pueden usarse incluyen tensioactivos y otros materiales solubilizantes.

Los diluyentes útiles incluyen, por ejemplo, cargas inertes farmacéuticamente aceptables tales como celulosa microcristalina, lactosa, sacarosa, fructosa, glucosa dextrosa u otros azúcares, fosfato de calcio dibásico, sulfato de calcio, celulosa, etilcelulosa, derivados de celulosa, caolín, manitol, lactitol, maltitol, xilitol, sorbitol u otros alcoholes de azúcar, almidón seco, sacáridos, dextrina, maltodextrina u otros polisacáridos, inositol o combinaciones de los mismos. Los diluyentes solubles en agua pueden ser especialmente útiles.

Los agentes de deslizamiento pueden usarse para mejorar el flujo y la compresibilidad de los ingredientes de la composición durante el procesamiento. Los agentes de deslizamiento útiles incluyen, por ejemplo, dióxido de silicio coloidal (también denominado sílice coloidal, sílice pirógena, ácido silícico anhidro ligero, anhídrido silícico y dióxido de silicio pirógeno).

Los tensioactivos que son adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento incluyen, sin limitación, laurilsulfato de sodio, estearatos de polietileno, ésteres de ácido graso de polietilen sorbitán, derivados de aceite de ricino de polioxietileno, polioxietilen alquil éteres, benzoato de bencilo, cetrimida, alcohol cetílico, docusato de sodio, monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerilo, lecitina, triglicéridos de cadena media, monoetanolamina, ácido oleico, poloxámeros, alcohol polivinílico y ésteres de ácidos grasos de sorbitán.

Los disgregantes adecuados incluyen, por ejemplo, almidones, glicolato de almidón de sodio, crospovidona, croscarmelosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución, pectinas, copolímero de metacrilato de potasio-divinilbenceno, alcohol polivinílico), tilamida, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, derivados de almidón, dextrina, beta ciclodextrina, derivados de dextrina, óxido de magnesio, arcillas, bentonita y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético puede incorporarse a un sistema de suministro de hidrogel. Por ejemplo, un polipéptido puede formularse para su suministro subcutáneo a un paciente a través de un sistema de xerogel-hidrogel que puede liberar el polipéptido de forma continua y sostenida durante un período de tiempo prolongado. Véanse, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 5.226.325 y la Publicación PCT WO 2004/071736.

Los materiales polimerizables líquidos útiles en la preparación de tubos de hidrogel incluyen una amplia diversidad de compuestos polimerizables hidrófilos y etilénicamente insaturados. Véanse, por ejemplo, los compuestos enumerados en la Publicación PCT N.° WO 2008/061355. En la reacción de polimerización normalmente se usan mezclas de dichos monómeros hidrófilos. El tipo y la proporción de monómeros se seleccionan para obtener un polímero (por ejemplo, un polímero reticulado homogéneo) que al hidratarse posea las características deseadas (por ejemplo, valor de contenido de agua en equilibrio (EWC, por sus siglas en inglés) y/o tamaño de poro) para la aplicación o el uso contemplados.

En algunos casos, la polimerización de mezclas monoméricas hidrófilas puede dar como resultado copolímeros hidrófilos homogéneos que se disuelven, en mayor o menor medida, en un medio acuoso. En dichos casos, puede incluirse en la mezcla monomérica una pequeña cantidad (por ejemplo, hasta aproximadamente el 3 por ciento) de un agente reticulante polietilénicamente insaturado copolimerizable para obtener copolímeros reticulados homogéneos que sean insolubles en agua, así como hinchables en agua. Un homopolímero ligeramente reticulado de (hidroxietil)metacrilato (HEMA) tiene un valor de EWC de aproximadamente el 38 %. Los copolímeros reticulados de HEMA y N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) tienen valores de EWC inferiores al 38 %, mientras que los copolímeros reticulados de HEMA y acrilamida presentan valores de EWC superiores al 38 % p/v. Por lo tanto, dependiendo de la velocidad de elución útil o eficaz del polipéptido, los hidrogeles de copolímero pueden personalizarse para eluir el polipéptido a la velocidad deseada. Normalmente, los copolímeros contienen de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 70 % en peso de unidades HEMA y de aproximadamente el 85 % al 30 % en peso de un segundo monómero etilénico, y por lo tanto poseen valores de EWC en el intervalo de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 75 %. En algunas realizaciones, una mezcla de copolímeros puede contener además una pequeña cantidad de un agente reticulante polietilénicamente insaturado [por ejemplo, dimetacrilato de etilenglicol ("EDMA") o trimetacrilato de trimetilolpropano ("TMPTMA")].

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica para el suministro de liberación controlada de un polipéptido en un sujeto puede incluir (a) un complejo del polipéptido (donde el polipéptido tiene al menos un grupo funcional básico) y un polianión derivado de hexahidroxiciclohexano (donde el polianión tiene al menos dos grupos funcionales con carga negativa); y (b) un portador farmacéuticamente aceptable que contiene un polímero biodegradable e insoluble en agua. Dichas composiciones se describen en, por ejemplo, la Publicación PCT N.° WO 2006/017852, y pueden prepararse en forma de soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, gotas, aerosoles, cremas, semisólidos, pastas, cápsulas, comprimidos, implantes sólidos o micropartículas, por ejemplo. La expresión "suministro de liberación controlada", como se usa en el presente documento, se refiere al suministro continuo de un agente farmacéuticoin vivodurante un período de tiempo (por ejemplo, de varios días a semanas o meses) después de su administración. El suministro de liberación controlada y sostenida de un polipéptido de MANP puede demostrarse mediante, por ejemplo, efectos terapéuticos continuados del polipéptido a lo largo del tiempo (por ejemplo, reducciones continuadas de los síntomas a lo largo del tiempo). El suministro sostenido del polipéptido también puede demostrarse detectando la presencia del polipéptidoin vivoa lo largo del tiempo. Las composiciones pueden proporcionar un suministro de estallido inicial bajo, seguido de una liberación estable y controlada del polipéptidoin vivodurante períodos prolongados (por ejemplo, de días a meses).

En dichas realizaciones, puede formarse un complejo física y químicamente estable tras la combinación adecuada de un polipéptido y un polianión. El complejo puede adoptar la forma de un precipitado que se produce tras combinar una preparación acuosa del polipéptido y el polianión. Opcionalmente, pueden incorporarse uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables al complejo. Dichos excipientes pueden actuar como estabilizantes del polipéptido y/o del complejo. Los ejemplos no limitantes de excipientes adecuados incluyen bisulfito de sodio, ácido p-aminobenzoico, tiourea, glicina, metionina, manitol, sacarosa y PEG.

Un complejo estable entre un polipéptido y un polianión pueden incorporarse en un portador farmacéuticamente aceptable que contenga un polímero biodegradable insoluble en agua, opcionalmente con uno o más excipientes. La expresión "polímero insoluble en agua biodegradable" se refiere a polímeros sintéticos y naturales biocompatibles y/o biodegradables que pueden usarsein vivo.La expresión también tiene por objeto incluir polímeros que son insolubles o se vuelven insolubles en agua o fluido biológico a 37 °C. Los polímeros pueden purificarse (por ejemplo, para retirar monómeros y oligómeros) usando técnicas conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 4.728.721. Los ejemplos de polímeros útiles incluyen, sin limitación, polilactidas, poliglicolidas, poli(lactida-coglicólida)s, policaprolactonas, polidioxanonas, policarbonatos, polihidroxibutiratos, oxalatos de polialquileno, polianhídridos, poliamidas, poliesteramidas, poliuretanos, poliacetales, poliortocarbonatos, polifosfacenos, polihidroxivaleratos, succinatos de polialquileno y poliortoésteres, y copolímeros, copolímeros de bloque, copolímeros ramificados, terpolímeros y combinaciones de los mismos.

Los polímeros biodegradables insolubles en agua también pueden incluir polímeros con protección terminal, sin protección terminal o mezclas de polímeros con protección terminal y sin protección terminal. Un polímero con protección terminal se define generalmente como aquel que tiene grupos terminales carboxilo con protección terminal, mientras que un polímero sin protección terminal tiene grupos terminales carboxilo libres.

Los factores que han de tenerse en cuenta al determinar los pesos moleculares adecuados para el polímero puede incluir la velocidad de degradación del polímero, la resistencia mecánica y la velocidad de disolución del polímero en el disolvente deseadas. Los pesos moleculares útiles de los polímeros pueden ser de aproximadamente 2.000 Dalton a aproximadamente 150.000 Dalton, por ejemplo, con una polidispersidad de 1,1 a 2,8, dependiendo del polímero que se seleccione para su uso.

El portador farmacéuticamente aceptable puede ser un portador con propiedades de respuesta al entorno (por ejemplo, termosensible, sensible al pH o sensible a la electricidad), en forma de una solución o suspensión inyectable, partícula, película, microgránulo, cilindro, disco, microcápsula, microesfera, nanoesfera, micropartícula, oblea, micela, liposoma o cualquier otra configuración polimérica útil para el suministro de fármacos.

Los métodos de formación de diversos portadores poliméricos farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EE. UU. N.° 6.410.044; 5.698.213; 6.312.679; 5.410.016; 5.529,914; 5.501.863; 4.938.763; 5.278.201; y 5.278.202; y la Publicación PCT N.° WO 93/16687.

Las composiciones pueden producirse cuando un complejo polipéptido/polianión se dispersa en una matriz polimérica para formar un implante sólido, que puede inyectarse o implantarse en un sujeto. Dichos implantes pueden prepararse usando técnicas de procesamiento por fusión de polímeros convencionales, tales como extrusión, moldeo por compresión y moldeo por inyección, por ejemplo. La preparación de dichos implantes puede realizarse en condiciones asépticas o, como alternativa, mediante esterilización terminal por irradiación (por ejemplo, usando irradiación gamma o esterilización por haz de electrones).

En algunas realizaciones, las composiciones en forma de microesferas pueden producirse encapsulando un complejo polipéptido/polianión en un portador polimérico, usando diversos polímeros biocompatibles y/o biodegradables que tengan propiedades adecuadas para su suministro en diferentes entornos biológicos o para efectuar funciones específicas. La velocidad de disolución y, por lo tanto, el suministro de polipéptido, se determina por factores tales como la técnica de encapsulación, la composición polimérica, la reticulación polimérica, el espesor del polímero, la solubilidad del polímero, y el tamaño y la solubilidad del complejo polipéptido/polianión.

Para preparar dichas microesferas, un complejo polipéptido/polianión que ha de encapsularse puede suspenderse en una solución polimérica en un disolvente orgánico, de manera que la solución polimérica recubra totalmente el complejo polipéptido/polianión. Después, la suspensión puede someterse a una técnica de microencapsulación, tal como el secado por pulverización, la congelación por pulverización, la emulsión o la emulsión por evaporación de disolvente. Por ejemplo, los complejos o micropartículas suspendidos junto con el polímero en un disolvente orgánico pueden transferirse a un volumen mayor de una solución acuosa que contenga un emulsionante, de manera que el disolvente orgánico se evapore o difunda fuera del polímero y el polímero solidificado encapsule el complejo polipéptido/polianión.

Los emulsionantes útiles para preparar complejos encapsulados de polipéptido/polianión incluyen los poloxámeros y el alcohol polivinílico, por ejemplo. Los disolventes orgánicos útiles en dichos métodos incluyen ácido acético, acetona, cloruro de metileno, acetato de etilo, cloroformo y otros disolventes no tóxicos que dependerán de las propiedades del polímero. Normalmente se eligen disolventes que solubilicen el polímero y que, en última instancia, sean atóxicos.

En algunas realizaciones, un polipéptido puede formularse en un depósito, que puede proporcionar niveles de exposición constantemente altos y puede alcanzar niveles de exposición altos rápidamente (con una fase de retraso corta o nula). Véase, por ejemplo, la Publicación de los EE. UU. N.° 2010/0266704. Las formulaciones de depósito pueden incluir un polipéptido de MANP o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (por ejemplo, una sal de adición de ácido con un ácido inorgánico, ácido polimérico o ácido orgánico). Las sales de adición de ácido pueden existir como sales mono o divalentes, dependiendo de si se añaden uno o dos equivalentes de ácido.

Como se describe en la Publicación de los EE. UU. N.° 2010/0266704, las formulaciones de depósito pueden contener dos polímeros de poli(ácido láctico-co-glicólica) lineales (PLGA) diferentes que tengan una relación molar de comonómero de lactida:glicolida (L:G) de 85:15 a 65:35, donde al menos uno de los polímeros tiene una viscosidad inherente baja. Dichas formulaciones pueden proporcionar niveles plasmáticos altos sostenidos del polipéptido durante períodos de tiempo largos. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen los polímeros de poli(D,L-lactida) y poli(D,L-lactida-co-glicolida) lineales comercializados con los nombres comerciales<r>E<s>OMER®,<l>A<c>TEL® y MED<i>SO<r>B® de Boehringer Ingelheim Pharma GmBH & Co. KG (Ingelheim, Alemania), Absorbable Polymers International (Pelham, AL), y Alkermes, Inc. (Cambridge, MA), respectivamente.

Las formulaciones de depósito de alta exposición para la administración subcutánea pueden mostrar una acción inmediata o, al menos, muy rápida, de manera que se alcancen concentraciones plasmáticas terapéuticas en poco tiempo (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete días después de la inyección subcutánea), y pueden mostrar niveles de exposición constantemente altos durante un mes o más.

En algunas realizaciones, las formulaciones de depósito proporcionadas en el presente documento pueden contener dos polímeros de PLGA diferentes mezclados o combinados en una relación de % de peso de 95:5 a 50:50 (por ejemplo, de 85:15 a 50:50, de 80:20 a 60:40, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45 o 50:50 % en peso). En algunas realizaciones, el polímero con la viscosidad inherente más alta puede tener un % en peso más alto que el polímero con la viscosidad inherente más baja. En algunas realizaciones, el polímero con la viscosidad inherente más alta puede tener un grupo terminal éster. Las formulaciones de depósito pueden contener polímeros adicionales, incluyendo otros polímeros de PLGA lineales o en forma de estrella, o polímeros de poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG) o ácido poliláctico (PLA), a condición de que se conserven las propiedades PK favorables.

El contenido de polipéptidos de la formulación de depósito (la carga) puede estar en un intervalo del 1 % al 30 % (por ejemplo, del 10 % al 25 %, más preferentemente del 15 % al 20 %. La carga se define como la relación en peso del polipéptido con respecto a la masa total de la formulación de PLGA.

Las composiciones de depósito pueden fabricarse de forma aséptica o pueden fabricarse de forma no aséptica y esterilizarse terminalmente (por ejemplo, usando irradiación gamma). La esterilización terminal puede dar como resultado un producto con la mayor garantía de esterilidad posible.

Las composiciones de depósito también pueden contener uno o más excipientes farmacéuticos que pueden modular el comportamiento de liberación del polipéptido. Dichos excipientes pueden estar presentes en la composición en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 50 %. Los excipientes adecuados incluyen, sin limitación, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa de sodio, dextrina, PEG, tensioactivos tales como poloxámeros (también conocidos como poli(oxietileno-bloque-oxipropileno), ésteres de ácidos grasos de poli(oxietilen)-sorbitán disponibles en el mercado con el nombre comercial TWEEN®, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, lecitinas, sales inorgánicas tales como carbonato de calcio, hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio, protamina y polímeros naturales o sintéticos que portan restos amina, tales como polilisina.

Las composiciones de depósito pueden contener una mezcla o combinación de diferentes polímeros en términos de composiciones, peso molecular y/o arquitecturas poliméricas. Una combinación de polímeros se define en el presente documento como una solución sólida o suspensión de dos polímeros lineales diferentes en un implante o micropartícula. Una mezcla de depósitos se define en el presente documento como una mezcla de dos implantes de tipo depósito o micropartículas o formulaciones semisólidas de diferente composición con uno o más PLGA en cada depósito. Las composiciones de depósito farmacéuticas en las que hay presentes dos PLGA en forma de una combinación de polímeros pueden ser particularmente útiles.

Las composiciones de depósito farmacéuticas pueden estar en forma de implantes, semisólidos (geles), soluciones líquidas, micropartículas o suspensiones que se solidificanin situuna vez inyectadas. Los siguientes párrafos se centran en las micropartículas poliméricas, aunque las descripciones también son aplicables a implantes, semisólidos y líquidos.

Las micropartículas pueden tener un diámetro de unos pocos submicrómetros a unos pocos milímetros (por ejemplo, de aproximadamente 0,01 micrómetro a aproximadamente 2 mm, de aproximadamente 0,1 micrómetro a aproximadamente 500 micrómetros, de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 micrómetros, de aproximadamente 10 a aproximadamente 130 micrómetros, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 micrómetros).

En algunas realizaciones, las micropartículas pueden mezclarse o recubrirse con un agente antiaglomerante. Los agentes antiaglomerantes adecuados incluyen, por ejemplo, manitol, glucosa, dextrosa, sacarosa, cloruro de sodio y polímeros solubles en agua tales como alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y PEG.

Las micropartículas pueden fabricarse mediante procesos conocidos en la técnica, tales como coacervación o separación de fases, secado por pulverización o métodos de emulsión/suspensión de agua en aceite (W/O), agua en aceite en agua (W/O/W) o sólidos en aceite en agua (S/O/W), seguidos de extracción con disolvente o evaporación de disolvente. Los métodos de emulsión/suspensión pueden ser particularmente útiles y pueden incluir las siguientes etapas:

(i) preparar una fase orgánica interna, que comprende

(a) disolver un polímero o polímeros en un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, acetato de etilo, acetona, THF, acetonitrilo o un hidrocarburo halogenado tal como cloruro de metileno, cloroformo o hexafluoroisopropanol) o mezcla de disolventes, y opcionalmente disolver/dispersar aditivos adecuados; (b) disolver/suspender/emulsionar un polipéptido en la solución polimérica obtenida en la etapa (a);

(ii) preparar una fase acuosa externa que contiene uno o más estabilizantes (por ejemplo, poli(alcohol vinílico), hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, poli(vinil pirrolidona) o gelatina) y opcionalmente una sal tampón;

(iii) mezclar la fase orgánica interna con la fase acuosa externa para formar una emulsión; y

(iv) endurecer las micropartículas mediante evaporación de disolventes o extracción con disolvente, lavar las micropartículas (por ejemplo, con agua), recoger y secar las micropartículas (por ejemplo, mediante liofilización o secado al vacío) y tamizar las micropartículas (por ejemplo, a través de 140 pm).

Una composición de micropartículas seca puede esterilizarse de forma terminal mediante irradiación gamma, ya sea a granel o después de dosificarla en el recipiente final. En algunas realizaciones, las micropartículas esterilizadas a granel pueden resuspenderse en un vehículo adecuado y dispensarse en un dispositivo adecuado, tal como una jeringa de doble cámara, con posterior liofilización.

En algunas realizaciones, las composiciones de depósito de micropartículas pueden incluir un vehículo para facilitar la reconstitución. Además, antes de la administración, las micropartículas pueden suspenderse en un vehículo adecuado para inyección (por ejemplo, un vehículo de base acuosa que contenga uno o más excipientes farmacéuticos tales como manitol, cloruro de sodio, glucosa, dextrosa, sacarosa o glicerina, y/o uno o más tensioactivos no iónicos tales como un poloxámero, éster de ácido graso de poli(oxietilen)-sorbitán, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, poli(vinilpirrolidona) o monoestearato de aluminio).

En el presente documento también se proporcionan artículos de fabricación que contienen uno o más polipéptidos natriuréticos o composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación de depósito que contiene un polipéptido de MANP variante) en un vial, jeringa u otro recipiente. El artículo de fabricación también puede incluir un conjunto de transferencia y/o un vehículo de base acuosa en un recipiente separado, o el polipéptido/composición y el vehículo pueden separarse en una jeringa de doble cámara.

La presente divulgación también proporciona métodos para tratar trastornos cardiovasculares (por ejemplo, hipertensión, hipertensión resistente e infarto de miocardio), enfermedad cardiorrenal y trastornos metabólicos (por ejemplo, diabetes de tipo II y obesidad) en un mamífero mediante la administración (por ejemplo, administración subcutánea) de un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento. Los términos "tratar" y "tratamiento" como se usan en el presente documento se refieren a prescribir, administrar o proporcionar un medicamento para afectar beneficiosamente o aliviar uno o más síntomas asociados a una enfermedad o trastorno, o una o más causas subyacentes de una enfermedad o trastorno.

Antes de administrar a un mamífero un polipéptido o una composición proporcionados en el presente documento, el mamífero puede evaluarse para determinar si necesita o no tratamiento de un trastorno cardiovascular, cardiorrenal o metabólico. Después de identificar a un mamífero como que necesita dicho tratamiento, el mamífero puede ser tratado con una composición proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, una composición que contiene un polipéptido natriurético puede administrarse a un mamífero en cualquier cantidad, a cualquier frecuencia y durante cualquier duración eficaz para conseguir un resultado deseado (por ejemplo, para reducir uno o más síntomas de una enfermedad cardiovascular, cardiorrenal o metabólica, o para prevenir o retrasar el empeoramiento de uno o más de dichos síntomas).

En algunos ejemplos, un polipéptido natriurético o una composición que contiene un polipéptido natriurético puede administrarse a una dosis de al menos aproximadamente 0,01 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 100 mg de polipéptido natriurético/kg de masa corporal (por ejemplo, aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 50 mg de polipéptido natriurético/kg, de aproximadamente 20 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 10 mg de polipéptido natriurético/kg, de aproximadamente 0,1 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 20 ng de polipéptido natriurético/kg, de aproximadamente 3 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg o de aproximadamente 50 ng de polipéptido natriurético/kg a aproximadamente 100 pg/kg) de masa corporal, aunque otras dosis también pueden proporcionar resultados beneficiosos. Una composición puede administrarse a una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto a aproximadamente 500 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto (por ejemplo, aproximadamente 0,5 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 1 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 2 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 3 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 5 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 7,5 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 12,5 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 15 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 20 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 25 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 30 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 50 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, aproximadamente 100 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto o aproximadamente 300 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto).

Un polipéptido puede administrarse una vez (por ejemplo, mediante implantación o inyección de una composición de depósito), o más de una vez (por ejemplo, mediante inyecciones repetidas, o mediante el uso de una serie de parches farmacológicos transdérmicos). Cuando se administra más de una vez, la frecuencia de administración puede variar de aproximadamente cuatro veces al día a aproximadamente una vez cada dos meses (por ejemplo, dos veces al día, una vez al día, de tres a cinco veces por semana, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces al mes, aproximadamente una vez al mes o aproximadamente una vez cada dos meses). Además, la frecuencia de administración puede permanecer constante o ser variable durante la duración del tratamiento. Diversos factores pueden influir en la frecuencia real de administración utilizada para una aplicación particular. Por ejemplo, la cantidad eficaz, la duración del tratamiento, la vía de administración y la gravedad de la afección pueden requerir un aumento o una disminución de la frecuencia de administración.

En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético o una composición que contiene un polipéptido natriurético puede administrarse a través de una primera vía (por ejemplo, por vía intravenosa) durante un primer período de tiempo, y después puede administrarse a través de otra vía (por ejemplo, por vía tópica o por vía subcutánea) durante un segundo período de tiempo. Por ejemplo, una composición que contiene un polipéptido natriurético puede administrarse por vía intravenosa a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) a una dosis de aproximadamente 0,1 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto a aproximadamente 300 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto (por ejemplo, de aproximadamente 1 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto a aproximadamente 15 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, de aproximadamente 3 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto a aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto, o de aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto a aproximadamente 30 ng de polipéptido natriurético/kg/minuto) durante uno a siete días (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete días), y posteriormente puede administrarse por vía subcutánea al mamífero a una dosis de aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg/día a aproximadamente 100 ng de polipéptido natriurético/kg/día (por ejemplo, aproximadamente 10 ng de polipéptido natriurético/kg/día, aproximadamente 20 ng de polipéptido natriurético/kg/día, aproximadamente 25 ng de polipéptido natriurético/kg/día, aproximadamente 30 ng de polipéptido natriurético/kg/día, aproximadamente 50 ng de polipéptido natriurético/kg/día o aproximadamente 100 ng de polipéptido natriurético/kg/día) durante cinco a 30 días (por ejemplo, siete, 10, 14, 18, 21, 24 o 27 días).

Los métodos proporcionados en el presente documento pueden incluir administrar a un mamífero una cantidad eficaz de un polipéptido natriurético (por ejemplo, una variante de MANP) o un ácido nucleico que codifica un polipéptido natriurético de este tipo, o una cantidad eficaz de una composición que contiene un polipéptido natriurético de este tipo. Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" es una cantidad de una molécula o composición que es suficiente para alterar un parámetro seleccionado en al menos un 10 %. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" de un polipéptido natriurético puede ser una cantidad del polipéptido natriurético suficiente para aumentar la natriuresis y/o la diuresis (o para aumentar o disminuir una característica de la natriuresis y/o la diuresis, como los niveles de GMPc en plasma, la excreción urinaria de GMPc, la generación renal neta de GMPc, el flujo de orina, la excreción urinaria de sodio, la excreción urinaria de potasio, el hematocrito, la inmunorreactividad plasmática del BNP, el flujo sanguíneo renal, la inmunorreactividad plasmática del ANP, la resistencia vascular renal, la reabsorción fraccional proximal y distal de sodio, la presión arterial media, la presión de enclavamiento capilar pulmonar, la presión auricular derecha, la presión arterial pulmonar, la actividad de la renina en plasma, los niveles plasmáticos de angiotensina II, los niveles plasmáticos de aldosterona, la presión de perfusión renal y la resistencia vascular sistémica) en al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99% o el 100 %), en comparación con el nivel del mismo parámetro antes del tratamiento, o en comparación con el nivel del parámetro en un mamífero de control, no tratado. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" de un polipéptido natriurético puede ser una cantidad que aumente la excreción de sodio en un mamífero tratado en al menos el 10 % en comparación con el nivel de excreción de sodio en el mamífero antes de la administración del polipéptido natriurético, o en comparación con el nivel de excreción de sodio en un mamífero de control, no tratado.

En algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" de un polipéptido natriurético puede ser una cantidad del polipéptido natriurético que es suficiente para reducir la aparición de un síntoma de enfermedad cardiovascular, metabólica o cardiorrenal en al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 %). En algunos casos, por ejemplo, una "cantidad eficaz" de un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento puede ser una cantidad que reduzca un síntoma de enfermedad cardiovascular, metabólica o cardiorrenal en un mamífero tratado en al menos el 10 % en comparación con el nivel del síntoma en el mamífero antes de la administración del polipéptido natriurético o sin la administración del polipéptido natriurético, o en comparación con el nivel del síntoma en un mamífero de control, no tratado. La presencia o el grado de dichos síntomas pueden evaluarse usando métodos tales como los conocidos en la técnica. En algunos casos, una "cantidad eficaz" de un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento puede ser una cantidad que reduce la presión sanguínea en un mamífero identificado como que tiene hipertensión en al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 % o al menos el 50 %) en comparación con la presión sanguínea en el mamífero antes de la administración del polipéptido natriurético o sin la administración del polipéptido natriurético, o en comparación con el nivel del síntoma en un mamífero de control, no tratado.

En algunas realizaciones, la cantidad y la frecuencia de polipéptido natriurético administrado a un mamífero pueden titularse con el fin de, por ejemplo, identificar la dosis que es más eficaz para tratar la hipertensión y/o la enfermedad cardiovascular, metabólica o cardiorrenal teniendo al mismo tiempo el menor número de efectos adversos. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una composición puede ser cualquier cantidad que reduzca la fibrilación en un mamífero sin tener una toxicidad significativa en el mamífero. Si un mamífero particular no responde a una cantidad particular, entonces la cantidad puede aumentarse, por ejemplo, dos veces, tres veces, cinco veces o diez veces. Después de recibir esta concentración más alta, el mamífero puede controlarse tanto para determinar la respuesta al tratamiento como para determinar los síntomas de toxicidad, y pueden realizarse ajustes de la dosis en consecuencia. La cantidad eficaz puede permanecer constante o ajustarse como una escala móvil o dosis variable en función de la respuesta del mamífero al tratamiento.

La frecuencia de administración puede ser cualquier frecuencia que reduzca un síntoma de enfermedad cardiovascular, metabólica o cardiorrenal en un mamífero sin producir toxicidad significativa en el mamífero. Por ejemplo, la frecuencia de administración puede ser de aproximadamente cuatro veces al día a aproximadamente una vez cada dos meses, o de aproximadamente una vez al día a aproximadamente una vez al mes, o de aproximadamente una vez cada dos días a aproximadamente una vez a la semana. Además, la frecuencia de administración puede permanecer constante o ser variable durante la duración del tratamiento. Al igual que con la cantidad eficaz, diversos factores pueden influir en la frecuencia real de administración utilizada para una aplicación particular. Por ejemplo, la cantidad eficaz, la duración del tratamiento, la vía de administración y la gravedad de la afección renal pueden requerir un aumento o una disminución de la frecuencia de administración.

Una duración eficaz de la administración puede ser cualquier duración que reduzca la hipertensión o un síntoma de enfermedad cardiorrenal en un mamífero sin producir toxicidad significativa en el mamífero. La duración eficaz puede variar de uno a varios días, a varias semanas, meses o años. En general, la duración eficaz puede variar en duración de varios días a varios meses. Por ejemplo, una duración eficaz puede variar de aproximadamente una a dos semanas a aproximadamente 36 meses. Los tratamientos profilácticos normalmente pueden ser más largos en duración y pueden durar toda la vida del mamífero. Múltiples factores pueden influir en la duración eficaz real utilizada para un tratamiento o pauta de prevención particular. Por ejemplo, la duración eficaz puede variar con la frecuencia de administración, la cantidad administrada, la vía de administración y la gravedad de una afección renal.

Después de administrar a un mamífero un polipéptido o una composición como se proporciona en el presente documento, el mamífero puede controlarse para determinar si el trastorno cardiovascular, cardiorrenal o metabólico ha mejorado o no. Por ejemplo, un mamífero puede evaluarse después del tratamiento para determinar si uno o más síntomas del trastorno han disminuido o no. Puede usarse cualquier método adecuado para evaluar las mejoras en la función. Si un mamífero no responde a una dosis particular, entonces la cantidad puede aumentarse, por ejemplo, dos veces, tres veces, cinco veces o diez veces. Después de recibir esta concentración más alta, el mamífero puede controlarse tanto para determinar la respuesta al tratamiento como para determinar los síntomas de toxicidad, y se realizan ajustes en consecuencia. La cantidad eficaz puede permanecer constante o ajustarse como una escala móvil o dosis variable en función de la respuesta del mamífero al tratamiento.

Los métodos proporcionados en el presente documento pueden incluir además controlar la concentración del polipéptido en suero o plasma extraído del paciente. La sangre puede extraerse a intervalos regulares (por ejemplo, cada 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 10 horas, 12 horas, 20 horas, 22 horas, cada día, cada quince días, cada semana o cada mes. Como alternativa, puede extraerse sangre a intervalos aleatorios. En aún otro aspecto, una etapa adicional puede incluir crear un bucle de retroalimentación aumentando o disminuyendo la cantidad de polipéptido administrado después de medir su concentración.

Puede usarse cualquier método adecuado para medir los niveles séricos de un polipéptido proporcionado en el presente documento, incluyendo, sin limitación, espectrometría de masas y métodos inmunológicos tales como ELISA. Un anticuerpo utilizado en un ensayo inmunológico puede ser, sin limitación, un anticuerpo policlonal, monoclonal, humano, humanizado, quimérico o bicatenario, o un fragmento de anticuerpo que tenga actividad de unión, tal como un fragmento Fab, fragmento F(ab'), fragmento Fd, fragmento producido mediante una biblioteca de expresión de Fab, fragmento que comprende un dominio VL o VH, o fragmento de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo, (por ejemplo, IgG, IgM, IgD, IgA o IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG4 o IgA2) o subclase. Además, un anticuerpo puede proceder de cualquier animal, incluyendo aves y mamíferos. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, de conejo, de oveja o de cabra. Un anticuerpo de este tipo puede ser capaz de unirse específicamente a un polipéptido proporcionado en el presente documento.

Los anticuerpos pueden generarse y purificarse usando cualquier método adecuado, incluidos aquellos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando tecnología de hibridoma, recombinante o de presentación en fagos, o una combinación de dichas técnicas. En algunos casos, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse de forma sintética o recombinante a partir de un gen que codifique la secuencia parcial del anticuerpo. En algunos casos, un fragmento de anticuerpo puede producirse de forma enzimática o química mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto. Un anticuerpo dirigido contra un polipéptido proporcionado en el presente documento normalmente puede unirse al polipéptido con una afinidad de al menos 104 mol-1 (por ejemplo, al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, o 1012 mol-1).

La invención se describirá adicionalmente en el siguiente ejemplo, que no limita el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLO

Se inyectó a las ratas espontáneamente hipertensas (SHR, por sus siglas en inglés) MANP intravenoso (IV) o vehículo, y se determinaron la PS, el GMPc plasmático y urinario y los efectos natriuréticos. Estos estudios revelaron que en las SHR, la administración IV aguda de MANP redujo la PS (FIG. 2A), aumentó la generación plasmática y urinaria de GMPc (FIG.2B y 2C) e indujo natriuresis (FIG. 2D y 2E), demostrando la eficacia del uso de MANP para tratar la HTA.

Para los estudiosin vitro,se generaron cinco variantes MANP que contenían sustituciones dentro de la región N-terminal. Se estimularon células HEK293 que sobreexpresaban pGC-A con MANP o las cinco variantes (10-8 M) y se midió la generación intracelular de GMPc. Mutaciones clave del extremo N dieron lugar a pérdida de función (TABLA 2yFIG. 3), identificando la importancia de la dependencia péptido-receptor. LaFIG. 4muestra la generación de GMPc para cada análogo como porcentaje de la generación de GMPc para MANP.

Estos estudios demostraron por primera vez en un modelo genético de HTA que MANP reduce la PS, activa pGC-A/GMPc sistémico y renal, e induce la natriuresis. Adicionalmente, la activación aumentada o reducida de pGC-A con mutaciones de AA dirigidas en la secuencia N-terminal de MANP proporcionó conocimientos clave sobre la estructurafunción de MANP, útiles para la próxima generación de péptidos terapéuticos de MANP.

TABLA 2

SEQ ID NO: 1: SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA

SEQ ID NO: 2:

TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA SEQ ID NO: 3: SLKKSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA

SEQ ID NO: 4: SLRRSSformapCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA

SEQ ID NO: 5: SLRRformaüSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA

SEQ ID NO: 6: TLRRTTCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA

Se realizaron estudios de infusiónin vivousando MANP18 en un cánido normal. La noche anterior al estudio, el perro se mantuvo en ayunas. El día del experimento, se anestesió al perro con pentobarbital de sodio (15 mg/kg IV), se intubó y se ventiló mecánicamente con oxígeno suplementario (Harvard Respirator; Amersham, MA) a 12 ciclos/minuto. Se canuló la arteria femoral para el control de la PAM y la toma de muestras de sangre, y se canuló la vena femoral para la infusión de solución salina. A través de una incisión en el flanco lateral izquierdo, se expuso el riñón izquierdo y se canuló el uréter para la toma de muestras de orina. Se administraron dosis suplementarias no hipotensoras de pentobarbital según fuera necesario durante el estudio. Después de 60 minutos de equilibrio, se realizó un aclaramiento basal. Todos los aclaramientos consistieron en la recogida de orina durante 30 minutos. Se tomaron muestras de sangre arterial y se realizaron mediciones hemodinámicas a mitad de cada aclaramiento. Después del aclaramiento basal, se infundió MANP18 con solución salina a una dosis de 33 pmol de péptido/kg/min. El péptido se infundió durante un total de 45 minutos, lo que incluía un período de introducción de 15 minutos seguido de un aclaramiento de 30 minutos. Después, se interrumpió la infusión de péptido y se realizaron cuatro aclaramientos de 30 minutos (lavado, recuperación 1, recuperación 2 y recuperación 3). Como se muestra en lasFIG. 5A-5G, MANP18 produjo una reducción de la presión sanguínea, potenciación del gasto cardíaco y acciones natriuréticas. Además, MANP18 activó el GMPc (FIG. 6A y 6B), aumentó temporalmente los niveles de ANP (FIG. 6C y 6D) y deprimió temporalmente los niveles de aldosterona (FIG. 6E), ARP (FIG. 6F) y ANGII (FIG. 6G).

Se realizaron experimentosin vitroadicionales usando una variante de MANP que tenía una sustitución de leucina por triptófano en la posición 2 de MANP (SWLRRSSCFGGRMDRI GAQSGLGCNSFRYRITA REDKQGWA; SEQ ID NO: 15). Se adquirieron clones de ADNc pGC-A y pGC-B humanos en Origene (Rockville, MD). Se transfectaron de forma estable células HEK293 con ADNc de pGC-A o pGC-B usando LIPOFECTAMINE® (Invitrogen; Grand Island, NY). Las células transfectadas se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 U/ml y G418250 ug/ml, y se sembraron en placas de 6 pocillos. Las células transfectadas con pGC-A se trataron con MANP o MANP2W, mientras que las células transfectadas con pGC-B se trataron con CNP o MANP2W. Las células se incubaron en solución salina equilibrada de Hank (Invitrogen; Carlsbad, CA) que contenía N-[2-hidroxietil]piperazina-N'[ácido 2-etanosulfónico] 20 mmol/l, albúmina sérica bovina al 0,1 % y 3-isobutil-1-metilzantina 0,5 mmol/l (Sigma; St. Louis, MO). Las células tratadas recibieron 10'6 M, 10'8 M o 10 10 M de péptido de MANP, CNP o MANP2W durante 10 minutos. Después del tratamiento, las células se lisaron en 300 ul de TCA al 6 % helado y se sometieron a ultrasonidos durante 10 minutos; después, los lisados celulares se centrifugaron a 4 °C, 12.000 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de vidrio y se extrajeron con éter cuatro veces en 4 volúmenes de éter, se secaron y se reconstituyeron en 300 ul de tampón de ensayo de GMPc. Las muestras se analizaron usando un kit de GMPc de radioinmunoensayo competitivo (Perkin-Elmer; Boston, MA). Estos estudios mostraron que MANP2W activaba selectivamente pGC-A (FIG. 7A), ya que no activaba pGC-B (FIG. 7B).

OTRAS REALIZACIONES

Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, se pretende que la descripción anterior ilustre, y no limite, el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido natriuréticocaracterizado por queel polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 15.

2. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 6 o 15 de la reivindicación 1.

3. Un vector que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 2.

4. Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 2.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 4, en donde la célula hospedadora es una célula hospedadora eucariota.

6. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y el polipéptido de la reivindicación 1.

7. Una composición para su uso en un método para tratar un trastorno cardiovascular o metabólico en un mamífero que lo necesite, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de dicha composición, comprendiendo la composición el polipéptido de la reivindicación 1.

8. La composición para el uso de la reivindicación 7, en donde el trastorno cardiovascular es la hipertensión, y en donde la composición se administra en una cantidad eficaz para reducir la presión sanguínea del mamífero.

9. La composición para el uso de la reivindicación 7, en donde la composición se administra a una dosis de 0,01 ng/kg a 50 |jg/kg.

10. La composición para el uso de la reivindicación 7, en donde la composición se administra por vía intravenosa.