ES3031007T3 - Peptide for preventing, modulating and/or reducing cardiovascular disease - Google Patents

Abstract

Métodos y materiales para prevenir y modular la aterosclerosis. En particular, péptidos pequeños capaces de interactuar con CD40, lo que interfiere con la capacidad de CD40 para interactuar con CD154, lo que afecta la inflamación y la aterosclerosis. El uso de estos péptidos para reducir la aterosclerosis, y en particular, la respuesta inflamatoria autoinmune que puede ser un factor desencadenante de la misma. El uso de estos péptidos cortos para reducir el colesterol LDL. Métodos y materiales para detectar linfocitos T que expresan CD40 (linfocitos Th40). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido para prevenir, modular y/o reducir una enfermedad cardiovascular

La presente divulgación se refiere a péptidos para su uso en métodos para la reducción del colesterol LDL, en donde el péptido inhibe la interacción de<c>D40 y CD154.

Estado de la técnica

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se calcula que en 2015 murieron 17,7 millones de personas por enfermedades cardiovasculares (ECV), que representaron el 31 % de todas las muertes mundiales. Las ECV, también pueden conocerse como enfermedades del corazón y de los vasos sanguíneos, e incluyen numerosos problemas, muchas de las cuales están relacionadas con un proceso denominado aterosclerosis. Asimismo, de acuerdo con el Proyecto de Coste y Utilización de los Servicios Sanitarios(Healthcare Cost and Utilization Project,HCUP), patrocinado por la Agencia de Investigación y Calidad Sanitarias(Agency for Healthcare Research and Quality,AHRQ), en 2011, sólo la aterosclerosis coronaria supuso más de 10.400 millones de dólares en costes hospitalarios. Por consiguiente, en 2011, la aterosclerosis coronaria por sí sola fue una de las diez afecciones más caras en cuanto a hospitalizaciones en los Estados Unidos.

La aterosclerosis se define por la formación de placas arteriales que pueden provocar ataque cardíaco y accidente cerebrovascular. La formación de placas arteriales se debe a la deposición de células, sustancias, productos de desecho y restos celulares, entre otros, pero sin limitación: colesterol, células muertas, células dendríticas, macrófagos espumosos, macrófagos, mastocitos, monocitos, células de músculo liso, linfocitos T, colágeno, calcio y fibrina. Los cambios inflamatorios en la pared arterial y la placa pueden desempeñar un papel crucial y causal en el desarrollo de la enfermedad aterosclerótica. Por consiguiente, se ha investigado el concepto de aterosclerosis como enfermedad autoinmune e inflamatoria; sin embargo, no se ha establecido un control terapéutico. La importancia de controlar la inflamación se pone de manifiesto en los ensayos clínicos actuales dirigidos a otros aspectos de las enfermedades y muerte por causas autoinmunes, inflamatorias y cardiovasculares.

Por ejemplo, el Ensayo de Reducción de Inflamación Cardiovascular(Cardiovascular Inflammation Reduction Trial,CIRT) intenta utilizar el metotrexato contra la interleucina 6 (IL-6) para comprobar si el metotrexato reduce las tasas de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y muerte cardiovascular entre los pacientes con enfermedad de la arteria coronaria con diabetes de tipo 2. Otro ejemplo incluye, el Estudio de Resultados de Trombosis Anti-inflamatorios con Canakinumab(Canakinumab Anti-inflammatory Thrombosis Outcomes Study,CANTOS), que estudia si el canakinumab puede bloquear la citocina proinflamatoria interleucina-1p (IL-1p) para reducir las tasas de infarto de miocardio recurrente, accidente cerebrovascular y las tasas de muerte cardiovascular en pacientes con ataque cardíaco que permanecen en situación de alto riesgo debido a niveles elevados del biomarcador inflamatorio proteína C reactiva de alta sensibilidad (PCR-as). Estos estudios reconocen que la inflamación desempeña un papel fundamental en la aterotrombosis y la aterosclerosis; sin embargo, estos estudios también reconocen que se desconoce si la inhibición de la inflamación per se reducirá las tasas de eventos vasculares.

Las lesiones ateroscleróticas en mamíferos y seres humanos se caracterizan por ser una enfermedad inflamatoriafibroproliferativa crónica de la pared de los vasos sanguíneos que contiene monocitos, macrófagos, células endoteliales, células de músculo liso, plaquetas y linfocitos T. Cada uno de estos tipos celulares puede expresar uno o ambos del par coestimulador CD40/CD154. Esta díada es responsable de potenciar la respuesta inmunitaria y puede contribuir a muchas enfermedades inflamatorias crónicas, incluida la artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes tipo 1 (DT1). Sin embargo, no existe ninguna terapia viable para esta díada altamente aterogénica.

La inflamación puede producirse cuando las células inflamatorias, tales como neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, macrófagos, plaquetas y células endoteliales, responden a eventos inflamatorios o estímulos nocivos, tales como, microorganismos invasores, células dañadas, u otros irritantes. La respuesta inflamatoria del cuerpo es beneficiosa porque, por ejemplo, en el caso de microorganismos invasores, la respuesta inflamatoria es una etapa importante en la localización del agente infeccioso para su eliminación por el sistema inmunitario. Sin embargo, en la autoinmunidad no hay infección, pero la inflamación grave está presente o es persistente. La inflamación en este caso, denominada inflamación crónica aséptica (ICA), es perjudicial, ya que destruye los tejidos normales. Los resultados de esta inflamación aséptica alteran la vida y, en algunos casos, la ponen en peligro. Asimismo, como en la inflamación aguda, este proceso está mediado por células inmunitarias, incluyendo linfocitos T.

Una de las principales preocupaciones de la medicina moderna es cómo controlar la ICA como la que se produce durante las enfermedades autoinmunes, así como la forma de controlar la inflamación aguda resultante de un traumatismo. La inflamación, tanto crónica como aguda, conduce a la degeneración de los tejidos y, finalmente, a la pérdida de función de los órganos principales. La ICA no se limita a una sola enfermedad, pero es determinante en numerosas enfermedades autoinmunes, incluyendo, pero sin limitación: diabetes tipo 1 (DT1), esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal(inflammatory bowel disease,IBS), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), incluyendo los tipos autoimunes de asma, ateroesclerosis, vasculitis, hipertensión, tiroiditis, incluyendo las enfermedades de Hashimoto y Graves, cirrosis biliar primaria, enfermedad de Paget, enfermedad de Addison, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lesión pulmonar aguda e inflamación crónica aséptica (ICA) asociadas al trasplante de órganos.

Los trastornos autoinmunitarios se clasifican en dos tipos: específicos de órganos (dirigidos principalmente a un órgano) y no específicos de órganos (ampliamente extendidos por todo el cuerpo). Ejemplos de trastornos autoinmunes específicos de órganos son la diabetes tipo 1 (DT1) insulinodependiente, que afecta al páncreas; tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Graves, que afectan a la glándula tiroides; anemia perniciosa, que afecta a la sangre; enfermedad de Addison, que afecta a las glándulas suprarrenales; hepatitis activa crónica, que afecta al hígado; miastenia gravis, que afecta al músculo; y esclerosis múltiple (EM), que afecta a los tejidos del sistema nervioso. Un ejemplo de trastorno autoinmune no específico de órganos es la artritis reumatoide (AR). Las enfermedades autoinmunes suelen ser crónicas, debilitantes y potencialmente mortales. Los Institutos Nacionales de Salud(National Institutes of Health,NIH) calculan que hasta 23,5 millones de estadounidenses padecen enfermedades autoinmunes y que la prevalencia va en aumento. Se calcula que las enfermedades autoinmunes figuran entre las diez principales causas de muerte entre las mujeres de todos los grupos de edad hasta los 65 años.

La inflamación aguda, como se observa durante un traumatismo o una septicemia, también está mediada por las células inmunitarias. Mientras que aún no se ha identificado una lista amplia, completa y exhaustiva de los mediadores moleculares de este proceso, está fuertemente implicado un papel destacado para los linfocitos T, linfocitos, neutrófilos, macrófagos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y otras células inflamatorias. Por tanto, un proceso para modular estos tipos celulares puede controlar la respuesta inflamatoria.

Se ha demostrado que un subconjunto único de linfocitos T desempeña un papel decisivo en el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Estas células se caracterizan fenotípicamente como CD4loCD40+ (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol., 34:1488, 2004; Vaitaitis, G.M.,et al.,Cutting Edge, J. Immunol., 170:3455, 2003; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 99:3782, 2002; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Int'l J. of Mol. Med. 4:231, 1999), y se denominan linfocitos Th40. (Waid, D.M.,et al.(2004) Eur. J. of Immunol. 34:1488; Vaitaitis, G.M.,et al.,Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455, 2003; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3782, 2002; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Int'l J. of Mol. Med. 4:231, 1999). La expresión de CD40 se asocia típicamente a las células presentadoras de antígenos y la mayoría de las técnicas anteriores describen la expresión de CD40 en los linfocitos B, macrófagos, monocitos y otras células; sin embargo, las proteínas CD40 también se expresan en los linfocitos T (Waid, D.M.,et al.,2004. Eur. J. of Immunol., 34:1488, 2004; Vaitaitis, G.M.,et al.,Cutting Edge, J. Immunol., 170:3455, 2003; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 99:3782, 2002; Wagner, D.H.,et al.,Int'l. J. of Mol. Med., 4:231, 1999; Bourgeois, C.,et al.,Science, 297:2060, 2002; Fanslow, W.C.,et al.,J. de Inmun., 152:4262, 1994; Ramsdell, F.,et al.,J. of Immunol. 152:2190, 1994; Grabstein, K. H.,et al.,J. of Immunol., 150:3141, 1993; Armitage, RJ.,et al.,Sem. in Immun., 5:401, 1993; Cooper, C.J.,et al.,J of Immunol., 173:6532, 2004). Mientras que los linfocitos Th40 comprenden una proporción del compartimento CD4+ periférico en ratones no autoinmunes, sin tratamiento previo (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol., 34:1488, 2004; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Int'l J. of Mol. Med., 4:231, 1999), y en seres humanos (Waid. D.M.,et al.,Clin. Immunol. 124:138, 2007), esta proporción se amplía drásticamente hasta alcanzar el 50 % del compartimento CD4+ en ratones propensos a la autoinmunidad (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol. 34:1488, 2004; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3782, 2002; Wagner, D.H.,et al.,Int'l J. of Mol. Med., 4:231, 1999) y seres humanos (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol. 34:1488, 2004; Waid. D.M.,et al.,Clin. Immunol. 124:138, 2007; Waid. D.M.,et al.,Clin. Immunol. 124:138, 2007). Estos linfocitos T no expresan marcadores de activación temprana y se presentan en el fenotipo indiferenciado de ratones no expuestos.

En ratones diabéticos no obesos(non-obese diabetic,NOD), los linfocitos Th40 aparecen en niveles exagerados en el bazo, en los ganglios linfáticos y en el páncreas, incluso antes de la aparición de la diabetes (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol. 34:1488, 2004; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3782, 2002). Se observa un elevado número y porcentaje de estos linfocitos T en la sangre periférica de los pacientes con diabetes tipo 1 (DT1) en comparación con los controles no autoinmunes y los pacientes con diabetes tipo 2 (Waid. D.M,et al.,Clin. Immunol., 124:138, 2007).

El aumento observado en los linfocitos Th40 podría significar que esos linfocitos T responden al antígeno o que la expresión de CD40 está inducida por la activación. Además, varios clones de linfocitos T diabetogénicos son CD40+ (Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3782, 2002). Los linfocitos Th40 primarios purificados de ratones NOD y de ratones NOD prediabéticos (12 - semanas de edad) transfieren con éxito la diabetes de tipo 1 a ratones receptores No obesos diabéticos/Inmunodeficiencia combinada grave(Non-Obese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency,NOD/scid), demostrando directamente la patogenicidad del subconjunto de linfocitos T Th40 (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol. 34:1488, 2004; Wagner, D.H., Jr.,et al.,2002. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 99:3782, 2002). Se ha demostrado que los linfocitos Th40 se infiltran en las células beta de los islotes destruyendo la producción de insulina, lo que sugiere una especificidad antigénica de los islotes (Waid, D.M.,et al.,Eur. J. of Immunol. 34:1488, 2004; Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3782, 2002). También se ha demostrado que los linfocitos Th40 son necesarios para la transferencia de la diabetes. Linfocitos T periféricos (bazo y ganglios linfáticos regionales) agotados para CD40, a continuación, Treg agotados para CD25, no fueron capaces de transferir la diabetes a los receptores con Scid (Inmunodeficiencia combinada grave). Aunque se eliminaron los linfocitos Treg, si el subconjunto de linfocitos T CD40+ autoagresivos está ausente, no se produce la transferencia de enfermedad.

Mientras que los linfocitos Th40 son importantes en el desarrollo de la autoinmunidad, otro factor importante es la expresión del ligando de CD40, CD154. CD154 se induce temporalmente en los linfocitos T activados en respuesta a la estimulación de CD3/TCR (Lederman, S.et al.,J. of Exp. Med., 175:1091, 1992). También se ha demostrado la expresión de CD154 en las plaquetas, monocitos, basófilos, eosinófilos, células dendríticas, fibroblastos, músculo liso y células endoteliales (Russo, S.et al.,J. Immunol. 171:5489, 2003; Stumpf, C.,et al.,Eur. J. Heart Fail., 5:629, 2003; Schonbeck, U.,et al.,Cell Mol. Life Sci. 58:4, 2001). CD154 es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) y se ha descrito una forma soluble de CD154 (sCD154) (Russo, S.,et al.,J. Immunol. 171:54892003; Stumpf, C.,et al.,Eur. J. Heart Fail 5:629, 2003; Toubi, E.,et al.,Autoimmunity 37:457, 2004). Por tanto, sCD154 puede actuar como una citocina (Stumpf, C.,et al.,Eur. J. Heart Fail. 5:629, 2003). Aunque el CD154 no se ha relacionado genéticamente en los estudios sobre la DT1, el sCD154 está significativamente elevado en la DT1 y puede desempeñar un papel en el proceso de la enfermedad (Varo, N.et al.,Circulation 107:2664, 2003; Cipollone, F.,et al.,Diabetologia 48:1216, 2005; Devaraj, S.,et al.,Diabetes 55:774, 2006). Se ha establecido la importancia de la interacción de CD40-CD154 en la autoinmunidad (Wagner, D.H., Jr.,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3782, 2002; Kobata, T.,et al.,Rev. Immunogenet. 2:74, 2000; Homann, D.,et al.,Immunity 16:403, 2002; Goodnow, C. C.,et al.,Lancet 357:2115, 2001; Balasa, B.,et al.,J. of Immunol. 159:4620, 1997). El bloqueo de la interacción de CD40-CD154 puede prevenir la artritis inducida por colágeno, (Durie, F.H.,et al.,Science 281:1328, 1993) encefalitis autoinmune experimental (Howard, L.M.,et al.,Autoimmunity 37:411, 2004), prostatitis (Grossman, M.E.,et al.,J. Immunother.

24:237, 2001), y diabetes tipo 1 en el modelo de ratón NOD (Durie, F.H.et al.,Science 281:1328, 1993; Balasa, B.et al.,Journal of Immunology 159:4620, 1997; Howard, L.M.,et al.,Autoimmunity 37:411, 2004; Grossman, M.E.et al.,J. Immunother. 24:237, 2001). En el modelo de diabetes, fue esencial administrar un anticuerpo bloqueante de CD154 a los ratones NOD a las 3 semanas de edad porque a las 9 semanas, los anticuerpos bloqueantes no tuvieron ningún efecto en la prevención de la diabetes (Balasa, B.et al.,J. of Immunol. 159:4620, 1997).

Trabajos anteriores también han demostrado que el subconjunto de linfocitos Th40 induce la transcripción, traducción y translocación nuclear de RAG1 y RAG2 (genes activadores de la recombinación) (Vaitaitis, G.M.,et al.,Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455, 2003) cuando Cd40 está activado (Vaitaitis, G.M.et al.,Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455, 2003). La activación de CD3 no induce RAG1 o RAG2 en los linfocitos T (Vaitaitis, G.M.,et al.,Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455, 2003). Tras la inducción de RAG1/RAG2, la revisión del receptor de linfocitos T (TCR) mediada por CD40 se produce en linfocitos T periféricos (Vaitaitis, G.M.et al.,Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455, 2003). La inducción por CD40 de la revisión del TCR es dependiente de RAG. Los linfocitos T aislados de un ratón TCR-Tg sufren una revisión del TCR cuando CD40 se activa, pero los linfocitos T del ratón TCR-Tg.RAG-/- no revisan el TCR cuando CD40 se activa (Wagner, D.H., Jr.et al.,Int'l J. of Mol. Med. 4:231, 1999).

CD40 es una proteína integral de membrana de 50 kDa de la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-R). Se expresa constitutivamente como un homotrímero (Foy TM,et al.,Ann. Rev. of Immunol., 14:591, 1996). En general, la estimulación de todos los tipos de células que expresan CD40 induce operaciones que contribuyen a la inflamación, como la potenciación de moléculas coestimuladoras y de adhesión, y la regulación al alza de enzimas proteolíticas (Mach, F.et al.,Atherosclerosis. 137 Supl: S89-95, 1998).

El ligando del CD40, el CD154, es una proteína de 39 kDa que pertenece a la familia del factor de necrosis tumoral (TNF). CD40 forma un trímero que se une a CD154 en la interfaz de los tres monómeros. El CD154 se expresa comúnmente en células más allá del CD154 expresado en la superficie, ya que CD154 también puede existir en una forma soluble biológicamente activa (sCD154) que se desprende de la superficie celular tras la activación. La principal fuente de sCD154 son las plaquetas. (Foy t M,et al.,Ann. Rev. of Immunol., 14:591, 1996).

Los modelos de ratón manipulados genéticamente se utilizan para la investigación y el desarrollo de la aterosclerosis porque los ratones de tipo silvestre suelen ser muy resistentes al desarrollo y la progresión de la aterosclerosis. Estudios anteriores han intentado bloquear la interacción de CD40/CD154 utilizando anticuerpos monoclonales, y este enfoque ha demostrado su eficacia en varios estudios con modelos de ratón que utilizan modelos ateroscleróticos deficientes en ApoE-/- o LDLr. Adicionalmente, en estos mismos modelos de ratón construidos con una deleción de CD154 se observaron reducciones significativas en la formación general de placas y también pueden haber contribuido a la producción de un fenotipo de placa más estable. Desde el punto de vista clínico, las placas estables son identificables y se caracterizan por un mayor contenido de colágeno y músculo liso, una gruesa capa fibrosa, y una disminución observable de linfocitos T, macrófagos y la acumulación de lípidos.

Se han propuesto múltiples opciones de tratamiento para abordar y controlar tanto la inflamación crónica como la aguda. Muchos enfoques utilizan antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que atacan la producción de leucotrienos y prostaglandinas, productos celulares que causan inflamación localizada. Otros enfoques utilizan fármacos inmunosupresores más potentes, como la ciclofosfamida, metotrexato y azatioprina que suprimen la respuesta inmunitaria y detienen la progresión de la enfermedad. Otros tratamientos implican el uso de anticuerpos monoclonales (mAb) diseñados para alterar las respuestas inmunitarias a los tejidos propios, como ocurre en las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, todos estos tratamientos suelen tener efectos secundarios graves y a largo plazo.

Las terapias inmunomoduladoras actuales pueden basarse en tratamientos con anticuerpos monoclonales que pueden dar lugar a complicaciones. Por ejemplo, los anticuerpos administrados a un sujeto pueden producir reacciones cruzadas con dianas no previstas y causar complicaciones nefríticas graves, y los que actúan específicamente contra CD154 pueden causar complicaciones embólicas. Además, la interacción de CD40-CD154 puede desempeñar un papel importante en la generación de anticuerpos, lo que puede indicar que la administración de un anticuerpo monoclonal podría inducir la generación de autoanticuerpos y complicaciones posteriores, que pueden inhibir el restablecimiento de la función inmunitaria normal (véase en general Banchereau, J.et al.,Annu. Rev. of Immunol.

12:881, 1994).

Otros estudios han demostrado que el bloqueo de la interacción de CD154 mediante el uso de anticuerpos monoclonales, o la limitación del receptor CD40 mediante anticuerpos monoclonales puede derogar la aterosclerosis, y puede conferir un fenotipo de placa más favorable caracterizado por una menor inflamación y una mayor fibrosis. Estos estudios demostraron además que la formación neointimal y la reestenosis pueden limitarse bloqueando la interacción de CD154. Los estudios relativos a la nefritis lúpica pueden haber demostrado que el bloqueo de las señales mediadas por CD40 puede reducir los anticuerpos anti ADN bicatenario (anti-ADNbc). Asimismo, estos estudios pueden demostrar que la reducción del anti-ADNbc se asoció a un aumento de los niveles séricos de complemento y a una reducción de la inflamación glomerular, lo que puede considerarse positivo desde una perspectiva clínica. Sin embargo, el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos a la díada CD40/CD154 se abandonó debido a los acontecimientos tromboembólicos que podrían haber estado relacionados con el funcionamiento de CD154 en la estabilización del trombo. Se postula que CD154 estabiliza los trombos por interacción con la integrina aiibp3, y por inhibición de CD154, los trombos pueden ser menos estables y, como consecuencia, desprender émbolos que provoquen eventos trombóticos.

El documento US 2013/0236495 divulga péptidos que se unen a la proteína CD40 de modo que afectan a la interacción de CD40 y CD154 para reducir la inflamación en enfermedades.

Existe una necesidad en la técnica de compuestos que pueden reducir el colesterol LDL en sujetos en necesidad de los mismos. Los presentes desarrollos pueden abordar esta necesidad mediante la descripción de péptidos para su uso en métodos para reducir el colesterol LDL que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de péptidos CD40. Además, los presentes desarrollos pueden proporcionar la ventaja añadida de prevenir la generación de autoanticuerpos, y permitir así la reanudación de la función inmunitaria normal.

Esta exposición de antecedentes tiene carácter meramente informativo y no pretende ser una explicación completa o exhaustiva de todos los antecedentes potencialmente relevantes.

Resumen

Los presentes avances proporcionan péptidos para su uso en métodos novedosos de reducción del colesterol LDL. La aterosclerosis puede surgir como resultado de una respuesta inflamatoria crónica de los glóbulos blancos en las paredes de las arterias. Se postula que la respuesta inflamatoria crónica y la consiguiente acumulación de placa en las arterias pueden estar causadas por niveles elevados de colesterol y triglicéridos en la sangre, hipertensión arterial y tabaquismo.

Los avances actuales se basan en el conocimiento de que la interacción del ligando de CD40 (proteína CD154) con la proteína CD40 expresada en los linfocitos T (linfocitos Th40), puede ser importante en el desarrollo de la aterosclerosis y las enfermedades autoinmunes. Los avances actuales pueden basarse en la elucidación de los residuos críticos en CD40 y CD154 que pueden ser importantes para esta interacción. Los presentes avances se refieren al bloqueo de la interacción entre una proteína CD40 y una proteína CD154 mediante el uso de pequeños péptidos que interaccionan con la proteína CD40 en un lugar donde normalmente se uniría la proteína CD154. Los péptidos preferidos para el uso de la invención tal como se define en el presente documento son aquellos que tienen menos de 25 aminoácidos de longitud y que se unen a una proteína CD40, inhibiendo así su interacción con una proteína CD154.

En una realización, el péptido a utilizar puede unirse a una proteína CD40 con una Kd superior a 106. Además, en esta realización, el péptido a utilizar puede afectar a la interacción entre CD40 y CD154. Adicionalmente, una realización preferida puede inhibir la unión de CD40 a CD154. Asimismo, en esta realización, el péptido a utilizar se une a CD40 en el lugar donde CD40 interactúa con CD154.

Un aspecto de los presentes desarrollos, es un péptido para su uso en un método para reducir el colesterol LDL en un sujeto, en donde el péptido se une específicamente a la célula presentadora de CD40 en el sitio de unión de CD154, en donde el método comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido y en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:3, SEQ iD NO:4, SEQ ID NO:5, S<e>Q iD NO:6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un gráfico del efecto de varios péptidos de CD154 en el desarrollo de diabetes en ratones NOD. Se han testado el de 6 meros (SEQ ID NO: 4), 8 meros (SEQ ID NO: 5), 10 meros (SEQ NO: 24), 13 meros (SEQ ID NO:25), 15 meros (SEQ ID NO: 7), y 24 meros (SEQ ID NO:26).

La Fig. 2A es un gráfico del efecto de un péptido de 15 meros de CD154 sobre la relación de CD4/CD8 en ratones NOD.

La Fig. 2B es un gráfico del efecto del péptido de 15 meros en los páncreas tratados frente a los de control extirpados, examinados y puntuados.

La Fig. 3 es un gráfico de reversión de la diabetes en ratones NOD utilizando un péptido de 15 meros de CD154. La Fig. 4 es un diagrama de puntos de la detección de linfocitos Th40 utilizando un péptido de 15 meros de CD154. La Fig. 5 es un diagrama de puntos de un cribado de linfocitos B utilizando un péptido de 15 meros de CD154. La Fig. 6 es un gráfico que muestra una comparación de los niveles de linfocitos Th40 en ratones diabéticos y no diabéticos.

La Fig. 7 es un gráfico que demuestra el efecto del tratamiento con el péptido de 15 meros sobre la granulación de insulina del páncreas.

La Fig. 8 es un gráfico que muestra el efecto de las mutaciones en el péptido de 15 meros sobre la capacidad del péptido de 15 meros para inhibir el desarrollo de diabetes en ratones NOD.

La Fig. 9 es un gráfico que muestra el número de células (*106) de CD3+CD4+CD40+ en diferentes modelos de ratones.

La Fig. 10 es un gráfico que muestra el porcentaje de linfocitos TH40 en la sangre periférica de sujetos humanos en sujetos de control y diabéticos.

La Fig. 11 es un gráfico de puntos que compara los datos de células CD4+ y CD40 obtenidos mediante citometría de flujo.

La Fig. 12 es un gráfico que muestra el porcentaje de linfocitos Th40 de la población CD3+CD4+ de los modelos de ratones.

La Fig. 13 es un gráfico que muestra el recuento de linfocitos Th40 en sangre periférica de ratones ApoE-/-. La Fig. 14 es una imagen con un aumento de 200x que muestra linfocitos Th40 en la región del hombro de la placa en el modelo de ratón ApoE-/-.

La Fig. 15 es un gráfico del control por interferón gamma de la proliferación de Th40.

La Fig. 16 es un gráfico del exceso de producción de interferón gamma en células CD3+CD4+CD40+.

La Fig. 17 es una muestra de manchas del arco aórtico de la curvatura menor del arco aórtico.

La Fig. 18 es una mancha de la curvatura menor del arco aórtico en sujetos de control y tratados.

La Fig. 19 es un gráfico de mediciones de área de la curvatura menor de los arcos aórticos y las placas.

Las Figs. 20-23 son gráficos de sujetos tratados y de ratones ApoE de control.

La Fig. 23 es un gráfico del nivel de colesterol LDL en ratones tratados y no tratados.

La Fig. 24 es una tabla de datos de coágulos sanguíneos en sujetos humanos.

La Fig. 25 es una tabla que muestra la estabilidad relativa del péptido evaluada mediante el análisis ExPaSY. La Fig. 26 es una transferencia de Western que compara muestras de control y tratadas de ratones sujetos. La Fig. 27 es un gráfico del colesterol LDL medido en sujetos tratados y no tratados.

La Fig. 28A es una imagen de una tinción con Sudán IV en proyección de cirujano de la aorta tratada con KGYY6. La Fig. 28B es una imagen de una tinción con Sudán IV en proyección de cirujano de la aorta de control.

La Fig. 29 es un gráfico que demuestra la reducción de las áreas de lesión de la tinción con Sudán IV.

La Fig. 30 es un gráfico de la reducción del volumen de la placa para el área bajo la curva.

La Fig. 31 es un gráfico de la composición de la placa en ratones tratados con KGYY6 y en ratones sujetos de control.

La Fig. 32A es una imagen de secciones teñidas con tricrómico de un sujeto tratado con KGYY6.

La Fig. 32B es una imagen de secciones teñidas con tricrómico de sujetos de control.

Descripción detallada

La presente materia objeto se basa en el descubrimiento de que un subconjunto único de linfocitos T, que expresan la proteína CD40, por lo que se denominan linfocitos Th40, puede ser determinante en la inflamación autoinmune. Asimismo, la implicación de los linfocitos Th40 en el proceso autoinmune puede depender de la interacción entre la proteína CD40, expresada en la superficie de la célula T, y la proteína CD154. La interacción de CD40 y CD154 tiene como resultado la transmisión de señales de activación entre las células y la posterior activación del linfocito Th40. Dicha activación provoca la propagación del linfocito Th40 y un aumento de la inflamación (por ejemplo, un aumento del número de células inmunitarias y moléculas inmunorreguladoras, presentes en el sistema). Por consiguiente, la inhibición de la interacción de CD40/CD154 puede modular la actividad de los linfocitos Th40 y, por tanto, afectar a la inflamación. Por tanto, la presente materia objeto se refiere a los péptidos y a su administración, que pueden afectar a la interacción entre una proteína CD40 y una proteína CD154, modulando así la inflamación.

Antes de describir adicionalmente el presente avance, debe entenderse que la presente invención no se limita estrictamente a las realizaciones particulares descritas, dado que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones.

Debe tenerse en cuenta que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Debe entenderse además que, tal como se utiliza en el presente documento, el término "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico. Como tal, los términos "un", "uno", "una", "uno/a o más" y "al menos uno/a" se pueden usar indistintamente. De forma similar, las expresiones "que comprende/n", "que incluye/n" y "que tiene/n" se pueden usar indistintamente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque también puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que son, para mayor claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar junto con una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención, que son, por razones de brevedad, descritas en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier combinación secundaria adecuada. La presente invención abarca específicamente todas las combinaciones de las realizaciones y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de las combinaciones se divulgase individual y explícitamente. Adicionalmente, la presente invención también abarca específicamente todas las subcombinaciones y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de dichas subcombinaciones se divulgase individual y explícitamente en el presente documento.

Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación pretende servir como fundamento para el uso de dicha terminología excluyente tal como "solamente", "solo" y similares en relación con la cita de los elementos de las reivindicaciones o para el uso de una limitación "negativa".

Además, en el presente documento, el término animal se refiere a un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos adecuados en los que utilizar los métodos de la presente invención incluyen, entre otros, animales de granja, animales destinados al deporte, mascotas, primates, ratones, ratas, caballos, perros, gatos y seres humanos. El término animal puede utilizarse indistintamente con los términos sujeto o paciente. Como se utiliza en el presente documento, los términos interactuar, interacción y similares, significa que dos moléculas entran en una proximidad física suficiente como para provocar una modulación de la inflamación. Uno de estos tipos de interacción es una interacción de unión. En dicha interacción, el péptido se asocia con CD40 para formar un complejo. Un ejemplo de formación de complejos es la asociación de un antígeno con un anticuerpo. De acuerdo con la presente materia objeto, la unión de un péptido del presente documento a una proteína CD40 puede ser reversible (por ejemplo, interacciones de unión no covalentes) o no reversible (por ejemplo, interacciones de unión covalentes). Asimismo, una interacción reversible puede ser fuerte o débil, la fuerza de la interacción viene determinada por las fuerzas (por ejemplo, cargas iónicas, enlace de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, etc.) ejercida por cada proteína sobre la otra proteína del complejo. Los factores que afectan a la fuerza de una interacción entre dos moléculas son conocidos por los expertos en la materia. Una medida útil de la fuerza de unión entre dos moléculas, como un péptido y una proteína, es la constante de disociación (Kd). Los péptidos preferidos para el uso de la presente invención son aquellos que se unen a una proteína CD40 con una Kd de no más de aproximadamente 1 x 10-6 M, aproximadamente 1 x 10-7 M, o aproximadamente 1 x 10-8 M. Los péptidos que se prefieren especialmente son los que tienen una Kd inferior a aproximadamente 1 x 10-9 M. En una realización, un péptido para su uso en el presente documento se une a una proteína CD40 con una Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 25 nM, inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 3 nM, inferior a 2 nM o inferior a 1 nM. Los métodos de medición y análisis de las interacciones de unión entre un péptido y una proteína CD40 son conocidos por los expertos en la materia.

Como se utiliza en el presente documento, modular la inflamación significa cambiar el nivel de linfocitos Th40 presentes en un animal, o en un cultivo de linfocitos T. Como se utiliza en el presente documento, los términos nivel, número, recuento y concentración pueden utilizarse indistintamente. La modulación de la inflamación puede significar un aumento o una disminución del número de linfocitos Th40 presentes en el entorno inflamatorio. Por consiguiente, la modulación puede ser positiva o negativa. La modulación positiva (también denominada regulación al alza) de la inflamación se refiere a un aumento del número de linfocitos Th40 en el entorno inflamatorio. La modulación negativa (también denominada regulación a la baja) de la inflamación se refiere a una reducción del número de linfocitos Th40 presentes en el entorno inflamatorio. Un péptido preferido es el que efectúa la regulación a la baja de la inflamación, reduciendo así el número de linfocitos Th40 presentes en el entorno inflamatorio. La modulación positiva y negativa de la inflamación puede dar lugar o no a un cambio en el tipo y la cantidad de moléculas inmunorreguladoras presentes en el entorno inflamatorio.

Los expertos en la materia apreciarán que tanto un sistema de cultivo celular como el sistema inmunitario de un animal comprenden niveles basales de células inmunitarias y moléculas inmunorreguladoras. Las expresiones nivel basal y nivel normal pueden utilizarse indistintamente. Con respecto al sistema inmunitario de un animal, como se utiliza en el presente documento, el nivel basal de un tipo de célula inmunitaria (por ejemplo, linfocito Th40), o una molécula inmunorreguladora, se refiere al número medio de ese tipo de célula o molécula inmunorreguladora, presente en una población de individuos considerados sanos (es decir, libres de enfermedades metabólicas, autoinmunes o infecciosas). Con respecto a un sistema de cultivo celular, como se utiliza en el presente documento, el nivel basal de un tipo de célula inmunitaria o de una molécula inmunorreguladora, se refiere al nivel medio de ese tipo de célula o molécula inmunorreguladora, presente en una población de células que no está activada. Los expertos en la materia son capaces de determinar si una célula T, o una población de dichas células, está activada. Por ejemplo, la expresión de las proteínas CD69, CD25 y/o CD154 por una célula indica que la célula ha sido activada.

El nivel basal de una célula o molécula puede ser una cantidad específica (por ejemplo, una concentración específica) o puede abarcar un rango de cantidades. Niveles, o rangos, basales, de células inmunitarias y moléculas inmunorreguladoras son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, en un individuo sano, el nivel normal de linfocitos T CD4+ presentes en la sangre humana es de 500-1500 células/ml. La variabilidad en esta medición puede deberse a diferencias en el método utilizado para determinar el recuento de células. Además, los niveles normales de células también pueden indicarse como porcentaje de una población total de células. Por ejemplo, en un individuo sano, los linfocitos Th40 representan menos del 25 % de la población total de linfocitos T. Por tanto, como se utiliza en el presente documento, el término inflamación se refiere a un entorno inflamatorio en el que los linfocitos Th40 constituyen más de aproximadamente el 25 %, más de aproximadamente el 30 %, más de aproximadamente el 35 %, más de aproximadamente el 40 %, más de aproximadamente el 45 %, más de aproximadamente el 50 %, más de aproximadamente el 55 %, más de aproximadamente el 60 %, más de aproximadamente el 65 %, más de aproximadamente el 70 %, más de aproximadamente el 75 %, o más de aproximadamente el 80 % de la población total de linfocitos T. Los métodos para medir diferentes tipos de linfocitos T en la población de linfocitos T son conocidos por los expertos en la materia. Además, en el presente documento se divulga un método novedoso para detectar linfocitos Th40 utilizando péptidos del presente documento.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión entorno inflamatorio se refiere a la población global de células inmunitarias y a las moléculas inmunorreguladoras relacionadas, que están presentes en un cultivo de células o en el cuerpo de un animal. Como tal, la expresión entorno inflamatorio engloba los tipos, y/o las cantidades relativas de células inmunitarias y moléculas inmunorreguladoras (por ejemplo, citocinas) presentes en un cultivo de células, o en un animal, que intervienen en la reacción inflamatoria. Ejemplos de células englobadas por el término entorno inflamatorio incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T, neutrófilos, macrófagos, granulocitos y similares. El entorno inflamatorio está relacionado con las células y moléculas que median en la inflamación aguda y crónica. Los expertos en la materia apreciarán que el entorno inflamatorio se refiere al sistema al que se administran los péptidos del presente documento. En una realización, el sistema es un sistema de cultivo celular. En una realización, el sistema es un animal completo.

Un péptido preferido para su uso en el presente documento es aquel que interacciona selectivamente con una proteína CD40 en solución, según se determine mediante un ensayo como un ensayo inmunoabsorbente, o en la superficie de una célula T. Como se utiliza en el presente documento, los términos selectivamente, selectivo, específico, y similares, indican que el péptido tiene mayor afinidad por una proteína CD40 que por proteínas no relacionadas con la proteína CD40. Más específicamente, los términos selectivamente, selectivo, específico y similares indican que la afinidad del péptido por CD40 es significativamente mayor desde el punto de vista estadístico que su afinidad por un control negativo (por ejemplo, una proteína no relacionada, como la albúmina), medida mediante un ensayo estándar (por ejemplo, ELISA). Los expertos en la materia conocen técnicas adecuadas para evaluar la capacidad de un péptido para interactuar selectivamente con una proteína CD40. Dichos ensayos pueden ser ensayosin vitroo ensayosin vivo.Ejemplos de ensayos útiles incluyen, pero no se limitan a, un inmunoensayo enzimático, un inmunoensayo enzimático competitivo, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo de fluorescencia, un ensayo quimioluminiscente, un ensayo de flujo lateral, un ensayo de flujo continuo, un ensayo de aglutinación, un ensayo basado en partículas (por ejemplo, utilizando partículas como, pero sin limitación, partículas magnéticas o polímeros plásticos, como perlas de látex o poliestireno), un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo de inmunotransferencia (por ejemplo, una transferencia de Western), un ensayo de fosforescencia, un ensayo de flujo continuo, un ensayo de cromatografía, un ensayo basado en la electroforesis en gel de poliacrilamida(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE), un ensayo de resonancia de plasmón superficial, un ensayo espectrofotométrico, un ensayo basado en partículas, un ensayo sensorial electrónico y un ensayo de citometría de flujo. Los métodos para realizar estos ensayos son bien conocidos por los expertos en la materia. En una realización, un ensayo puede realizarse utilizando células en cultivo, o puede realizarse en un animal completo. Los ensayos pueden diseñarse para dar resultados cualitativos, cuantitativos o semicuantitativos, en función de cómo se utilicen y del tipo de resultado que se desee obtener.

En una realización, el péptido puede interactuar con la proteína CD40 de forma que disminuya la fuerza de la interacción entre la proteína CD40 y una proteína CD154. Los métodos para medir la fuerza de unión entre el péptido y una proteína CD40 son conocidos por los expertos en la materia. Un péptido preferido para su uso es aquel que reduce la fuerza de la interacción entre una proteína CD40 y una proteína CD154. Los péptidos preferidos para su uso en el presente documento reducen la fuerza de unión entre una proteína CD40 y una proteína CD154 en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. Un péptido particularmente preferido para su uso es aquel que inhibe completamente la unión de CD40 a CD154. La inhibición completa de la unión entre CD40 y CD154 significa que cuando un péptido del presente documento se pone en proximidad con una proteína CD40 y una proteína CD154 en condiciones que normalmente permitirían la interacción de CD40 y CD154, no se produce tal interacción y no se estimulan las señales de activación en la célula que expresa CD40. En consecuencia, no se produce una modulación de la inflamación mediada por CD40/CD154. El péptido para su uso en el presente documento interactúa con la proteína CD40 en el sitio de unión de CD154. Un ejemplo de dicho péptido es un antagonista competitivo del ligando de CD40. Como se utiliza en el presente documento, los péptidos que interfieren con o inhiben, la unión de una proteína CD154 a una proteína CD40 se denominan pequeños péptidos interferentes(small interfering peptides,SIP). Tal como se utiliza en el presente documento, un pequeño péptido interferente es un péptido que, mediante propiedades fisicoquímicas, interfiere en la interacción de una proteína CD40 con una proteína CD154, impidiendo así que las señales de activación lleguen a la célula portadora de CD40, limitando así la activación de la célula portadora de CD40 y, en consecuencia, la inflamación. Como se demuestra en el presente documento, las consecuencias de dicha interferencia son la prevención de la activación y propagación de los linfocitos T y la prevención o reducción de la inflamación. Como se demuestra en el presente documento, en algunos casos, los resultados de dicha inhibición o prevención de la interacción entre CD40 y CD154 pueden incluir datos observables que demuestren que la aterosclerosis, y las características de las enfermedades asociadas a ella, se evitan, modulan y/o reducen.

Adicionalmente, un pequeño péptido interferente, puede, a través de sus propiedades fisicoquímicas, interferir en la interacción de una proteína CD40 con una proteína CD154, impidiendo así que las señales de activación lleguen a la célula portadora de CD40, limitando así la activación de la célula portadora de CD40 y, en consecuencia, modulando, inhibiendo y previniendo la aterosclerosis. Como se demuestra en el presente documento, las consecuencias de esta interferencia son la prevención de la activación y propagación de los linfocitos T y la prevención, reducción o modulación del desarrollo aterosclerótico.

Se entiende por los expertos en la materia que los péptidos preferidos para su uso son relativamente cortos, ya que son más fáciles y menos costosos de producir. Los péptidos preferidos son los que tienen menos de 20 aminoácidos de longitud. Un péptido preferido es el que tiene 4, 6, 8, 10, 13, 15 o 24 aminoácidos de longitud. En una realización, el péptido a utilizar es un aminoácido seleccionado del grupo de SEQ ID NO:3 (secuencia central, véase la Tabla 1), SEQ ID NO:4 (6 meros, véase la Tabla 1), SEQ ID NO:5 (8 meros de ratón, véase la Tabla 1), SEQ ID NO:6 (8 meros de ser humano, véase la Tabla 1), SEQ ID NO:8 (15 meros de ser humano, véase la Tabla 1), SEQ ID NO:9 (24 meros, véase la Tabla 1). Las secuencias de dichos péptidos se muestran a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1.

continuación

Se ha demostrado que la interacción de una proteína CD40 y una proteína CD154 se produce en regiones concretas de cada proteína. Los inventores han demostrado ahora que, sorprendentemente, un péptido que comprende sólo una porción corta de la región CD154 que interactúa con CD40 es capaz de unirse a una proteína CD40, modulando así la aterosclerosis.

En una realización, el péptido a utilizar es lo más corto posible y, sin embargo, comprende una cantidad suficiente de la proteína CD154 para permitir la interacción con una proteína CD40 de manera que module la aterosclerosis. En una realización, un péptido para uso en el presente documento comprende 6, 13 o 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, e interactúa con CD40 de tal manera que modula la aterosclerosis. El péptido a utilizar comprende una secuencia central de lisina-glicina-tirosina-tirosina (KGYY; SEQ ID NO:3), que corresponde a los aminoácidos 142-145 de la SEQ ID NO:1 y a los aminoácidos 143-146 de la SEQ ID NO:2. En una realización del presente documento, un péptido para su uso comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9, siempre que el péptido interactúe con la proteína CD40 de manera que module la aterosclerosis. En una realización de la presente materia objeto, un péptido para su uso en el presente documento es una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 y SEQID NO:9.

Mientras que los péptidos de la presente materia objeto pueden seleccionarse enteramente de o a partir de secuencias que son responsables de la interacción del péptido con una proteína CD40, además, pueden contener secuencias de aminoácidos que no interactúan con una proteína CD40, pero que tienen otras funciones útiles. Cualquier secuencia de aminoácidos adicional y útil puede ser añadida a la secuencia que interactúa con CD40, siempre que las secuencias adicionales no tengan un efecto no deseado sobre la capacidad de la secuencia de interacción con CD40 para interactuar con una proteína CD40. Por ejemplo, además de la secuencia de aminoácidos responsable de interactuar con una proteína CD40, un péptido del presente documento puede contener secuencias de aminoácidos útiles para visualizar o purificar el péptido. Estas secuencias actúan como marcadores (por ejemplo, enzimas) o etiquetas (sitios de unión a anticuerpos). Ejemplos de tales marcadores y etiquetas son, pero no se limitan a, B-galactosidasa, luciferasa, glutatión-S-transferasa, tiorredoxina, etiquetas HIS, etiquetas de biotina y etiquetas fluorescentes. Los expertos en la materia conocen otras secuencias útiles para marcar y etiquetar proteínas.

Análogamente, los péptidos del presente documento pueden ser modificados, siempre que dicha modificación no afecte significativamente a la capacidad del péptido para modular la aterosclerosis. Tales modificaciones se pueden realizar, por ejemplo, para aumentar la estabilidad, solubilidad o capacidad de absorción de la proteína. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a PEGilación, glicosilación y modificación química del péptido.

Los péptidos del presente documento pueden obtenerse de la naturaleza (por ejemplo, obtenidos a partir de plantas, animales o microorganismos) o pueden producirse en un laboratorio (por ejemplo, de forma recombinante o sintética). Los péptidos preferidos son los sintetizados. También se incluyen los péptidos que son combinaciones de moléculas naturales y sintéticas. Los métodos generales para producir y aislar péptidos recombinantes o sintéticos son conocidos por los expertos en la materia. Cabe señalar que, como se utiliza en el presente documento, una molécula aislada, o biológicamente pura, es aquella que ha sido apartada de su medio natural. Como tal, los términos aislado, biológicamente puro, y similares, no reflejan necesariamente el grado de purificación de la proteína.

Como se ha descrito en el presente documento, la interacción de la proteína CD40 y la proteína CD154 es necesaria para la implicación de los linfocitos Th40 en la aterosclerosis. Por consiguiente, la inhibición de la interacción entre una proteína CD40 y CD154 mediante péptidos del presente documento es un método útil para afectar a la aterosclerosis. En una realización del presente documento, el péptido para su uso reduce la interacción entre la proteína CD40 y la proteína CD154 en al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. En una realización, el péptido para su uso reduce la interacción entre la proteína CD40 y la proteína CD154 en un factor de al menos 10, al menos 100, al menos 1000, al menos 10.000. Los métodos para medir la fuerza de la interacción entre la proteína CD40 y la proteína CD154 se han discutido anteriormente, y también son conocidos por los expertos en la materia.

Los péptidos y métodos descritos en el presente documento son adecuados tanto para su uso en cultivos celulares como para el tratamiento de un paciente. En el presente documento, el término paciente se refiere a cualquier animal que necesite dicho tratamiento. El animal puede ser un ser humano o un animal no humano. Un animal preferido para tratar es un mamífero. Un péptido puede administrarse o aplicarseper se,o como composiciones farmacéuticas. Un péptido para uso del mismo, o una composición farmacéutica para uso de la misma, puede administrarse a un paciente por diversas vías, incluyendo, pero con limitación, por inyección (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraperitoneal), mediante inhalación, por administración oral (por ejemplo, en una pastilla, comprimido, cápsula, polvo, jarabe, solución, suspensión, película fina, dispersión o emulsión), transdérmica, transmucosa, pulmonar, bucal, intranasal, sublingual, intracerebral, intravaginal, rectal o tópica o por cualquier otro método conveniente conocido por los expertos en la materia.

La cantidad de un péptido del presente documento y/o de una composición farmacéutica del mismo que será eficaz puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar conocidas en la técnica. Dicha cantidad depende de, entre otros factores, el paciente tratado, incluyendo, aunque no de forma limitativa, el peso, la edad y el estado de salud del paciente, el efecto previsto del compuesto, la forma de administración y el criterio del médico prescriptor. Además, dentro de este contexto, debe tenerse en cuenta que en el tratamiento de un paciente que presente un trastorno de interés, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente o agentes como éstos. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del compuesto que produce una mejoría de uno o más síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente.

Un péptido para uso del mismo, o una composición farmacéutica para uso de la misma, pueden administrarse solos o en combinación con uno o más otros agentes farmacéuticos, incluyendo otros compuestos de la presente divulgación. La composición farmacéutica específica depende del modo de administración deseado, tal como conoce bien el experto.

Porque los inventores han descubierto que los linfocitos Th40 están íntimamente implicados en el desarrollo de enfermedades autoinmunes y aterosclerosis, los péptidos para su uso divulgados en el presente documento pueden utilizarse para afectar a la aterosclerosis resultante de dichas enfermedades.

Un ejemplo de una enfermedad que es particularmente susceptible de tratamiento utilizando un péptido de los presentes avances puede ser la aterosclerosis. En la aterosclerosis, se producen cambios inflamatorios de la pared arterial que dan lugar a la formación y acumulación de placa arterial. Por consiguiente, el control de las células inflamatorias y la señalización celular a través de la interacción de CD40-CD154 podría utilizarse para controlar, modular y/o reducir las lesiones ateroscleróticas que se caracterizan como enfermedad inflamatoria-fibroproliferativa crónica de la pared vascular. Se han desarrollado varios modelos murinos de aterosclerosis. La progresión de la formación de lesiones es observable en ratones transgénicos deficientes en apolipoproteína E (ApoE) y puede observarse mediante la medición del arco aórtico, el número y el tipo de placa, y se caracteriza de acuerdo con la estadificación de la aterosclerosis de la American Heart Association, que va de AHA tipo I a AHA tipo V. El AHA tipo 1, puede caracterizarse por lesiones tempranas o iniciales, puede estar compuesto por células histológicamente "normales", infiltración de macrófagos y células espumosas aisladas. El AHA tipo V, puede caracterizarse por lesiones avanzadas o complicadas, incluyendo, entre otros, una mayor disfunción endotelial caracterizada por defectos superficiales, hematoma, hemorragia y/o trombosis.

Asimismo, la aterosclerosis puede ser particularmente susceptible de tratamiento con un péptido del presente avance. El riesgo de aterosclerosis puede deberse a factores familiares (por ejemplo, la herencia) o a otros factores, como el estado físico del individuo. El nivel de actividad aterosclerótica y de enfermedad puede variar de un individuo a otro en función de numerosos factores, como el nivel de actividad, la dieta, el tabaquismo, y otros factores variables que son dinámicos, como los niveles de inflamación. Los expertos en la materia conocen algunos métodos de evaluación del riesgo de aterosclerosis.

Los inventores han demostrado también que, sorprendentemente, los péptidos del presente documento pueden utilizarse para invertir el proceso de la enfermedad en individuos que ya muestran signos de aterosclerosis. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión revertir la aterosclerosis significa reducir la infiltración del arco aórtico, placa y lesiones de un individuo con aterosclerosis a un nivel comparable al de niveles observablemente más bajos o, en algunos casos, a niveles que pueden ser más comunes en un individuo no aterosclerótico.

Como se ha descrito, los péptidos para uso de la presente invención se unen selectivamente a una célula que expresa CD40. Por consiguiente, los péptidos de la presente materia objeto pueden utilizarse para identificar linfocitos Th40. En general, un ensayo para detectar linfocitos Th40 utilizando un péptido del presente documento comprende (a) obtener una muestra de células; (b) poner en contacto un péptido del presente documento con dichas células en condiciones adecuadas para permitir la unión del péptido a los linfocitos Th40, si presente; (c) lavar dichas células utilizando condiciones que interrumpan las interacciones no específicas y que eliminen el péptido no unido; y (d) detectar el péptido unido a las células. La detección del péptido unido puede realizarse directa o indirectamente. Por ejemplo, la detección directa puede lograrse utilizando un péptido marcado con un marcador detectable, como se divulga en el presente documento. Después de la etapa de lavado indicada anteriormente, a continuación, las células se criban simplemente para detectar la presencia de un marcador detectable. La presencia de un marcador detectable en la muestra celular indica la presencia de linfocitos Th40 y, por tanto, de aterosclerosis dependiente de Th40. Como alternativa, la detección indirecta implica el uso de una segunda molécula, tal como un anticuerpo, que se une al péptido. En un ensayo de detección indirecta, después de la etapa de lavado indicada anteriormente, se añade a la muestra celular una molécula de detección que se une al péptido. La molécula de detección está marcada con un marcador detectable. Después de lavar la molécula de detección no unida, las células se criban para detectar la presencia de un marcador detectable. La presencia de un marcador detectable en la muestra celular indica la presencia de linfocitos Th40. Debe entenderse que los ensayos descritos en el presente documento son ejemplos de ensayos útiles, y que pueden emplearse otras técnicas de ensayo. Las técnicas de ensayo adecuadas son conocidas por los expertos en la materia, y también se describen en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2a edición (diciembre de 1989).

La tecnología de ensayo descrita anteriormente también puede utilizarse para identificar otras moléculas que afectan a la interacción de una proteína CD40 con una proteína CD514. Ejemplos de dichas moléculas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos y moléculas pequeñas. Por ejemplo, pueden diseñarse ensayos que prueben la capacidad de las moléculas para competir con un péptido de los presentes desarrollos para unirse a un linfocito Th40. Por ejemplo, un péptido marcado con un marcador detectable, puede mezclarse con una molécula de prueba y una población de células que se sabe que contienen linfocitos Th40, en condiciones que permitan la unión del péptido a los linfocitos Th40. Tras un periodo de incubación adecuado, las células se lavan para eliminar el péptido no unido y se criban cuanto a la presencia de marcador detectable. Como alternativa, el péptido marcado podría unirse a los linfocitos Th40 en primer lugar, y después de una etapa de lavado para eliminar el péptido no unido, la molécula de ensayo podría añadirse a las células que contienen el péptido unido. Tras un periodo de incubación y una etapa de lavado para eliminar la molécula no unida o el péptido liberado, las células se criban para detectar la presencia de un marcador detectable. En cualquier caso, la ausencia del marcador detectable en la muestra celular indica que la molécula de ensayo es capaz de competir con el péptido para unirse a los linfocitos Th40, mientras que la presencia del marcador detectable indicaría que la molécula de ensayo no inhibe la unión del péptido a los linfocitos Th40. No es necesario que la inhibición de la unión sea del 100%, ya que dicho ensayo también sería útil para identificar moléculas que inhiban parcialmente la unión del péptido a los linfocitos Th40. Los expertos en la materia entienden que dichos ensayos implicarían el uso de controles positivos (por ejemplo, péptido no marcado) y controles negativos (por ejemplo, una proteína/molécula que se sabe que no se une a los linfocitos Th40).

Porque el aumento de los niveles de linfocitos Th40 se asocia con el desarrollo de enfermedades autoinmunes, los presentes avances pueden utilizarse para identificar a pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades autoinmunes y aterosclerosis relacionada con enfermedades autoinmunes y/o enfermedades cardiovasculares en general.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 (no forma parte de la invención)

Este Ejemplo demuestra el efecto de varios fragmentos peptídicos de CD154 sobre las relaciones de CD4/CD8 y el desarrollo de diabetes en ratones NOD.

Los péptidos se diseñaron a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína CD154 de ratón (SEQ ID NO:1) en la base de datos SwissPro. Los péptidos (8 meros (SEQ ID NO: 5; S<e>Q ID NO: 6), 10 meros (SEQ ID NO:24), 13 meros (SEQ ID NO:25), 15 meros (SEQ ID NO: 7), 24 meros (SEQ ID NO:26), mezclado (SEQ ID NO: 23), y RGD (ácido arginilglicilaspártico) fueron encargados a New England Peptide. El péptido RGD es una secuencia de 15 aminoácidos de la secuencia CD154 que no incluye el motivo de unión a CD40. Los péptidos liofilizados se suspendieron en solución salina estéril a 1 mg/ml. A continuación, se inyectaron 25 ug (1 mg/kg) de un péptido concreto en la vena de la cola de ratones NOD de 6 semanas de edad. Los ratones de control recibieron 100 ul de solución salina estéril. Esto es mucho antes de la aparición de la diabetes (y la aterosclerosis), pero después de que haya comenzado el daño a los islotes pancreáticos. Semanalmente tras la inyección inicial, se inyectaron otros 100 ug de péptido (o 100 ul de solución salina en el caso de los ratones de control) en la vena de la cola. A las 10 semanas de edad, se monitorizó la diabetes de los ratones, como indica un nivel de glucosa en sangre superior a 250 mg/dl durante tres días consecutivos. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 1. Durante este tiempo, también se extrajo sangre de la vena caudal, o por punción venal submandibular, y se determinó el nivel de células CD4+ y CD8+ por citometría de flujo utilizando anticuerpos para la proteína CD4 y la proteína CD8. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2A.

Se extirparon los páncreas y se examinaron histológicamente en busca de infiltrados celulares y se asignaron puntuaciones en función de datos observables, medibles y cuantificables: 0 = sin infiltración; 1 = infiltración de un polo; 2 = peri-insulitis, infiltrados bipolares; 3 = infiltración del 75 % y 4 = infiltración total. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2B.

Los resultados demuestran que el tratamiento con un péptido no relacionado con la proteína CD154 no redujo el desarrollo de diabetes en ratones NOD. Por el contrario, el tratamiento de ratones con un péptido de 15 meros derivado de la proteína CD154 previno la aparición de la diabetes. Además, los péptidos de 13 meros derivados de la proteína CD154 tenían efectos significativos sobre el desarrollo de la diabetes. Adicionalmente, los datos demuestran que el péptido de 15 meros no provocó un compromiso del sistema inmunitario, como determinado por la relación CD4/CD8. Ejemplo 2 (no forma parte de la invención)

Este Ejemplo demuestra el efecto del péptido de 15 meros sobre la hiperglucemia en ratones NOD recientemente diabéticos.

Seis ratones de los que habían recibido el péptido de 6 meros del Ejemplo 1, y que posteriormente habían desarrollado diabetes, fueron inyectados por vía intravenosa con 100 ug del péptido de 15 meros. A continuación, estos ratones recibieron inyecciones semanales del péptido de 15 meros en las venas de la cola, y se controlaron sus niveles de glucosa en sangre dos veces por semana. El péptido de 15 meros se administró durante un total de diez semanas, tras lo cual se interrumpió el tratamiento. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 3.

Este estudio demuestra que la inyección del péptido de 15 meros en ratones ya diabéticos puede revertir la hiperglucemia. También demuestra que la interrupción del tratamiento provoca el retorno de la hiperglucemia en un plazo de 7 semanas.

Ejemplo 3

Este estudio demuestra la capacidad del péptido de 15 meros para unirse a linfocitos Th40 y células B.

Se aislaron linfocitos totales de ratones NOD de 9 semanas de edad. Los linfocitos se incubaron con anti-CD, anti-CD8, y péptido de 15 meros marcado con FITC, y luego analizados por citometría de flujo. Se separaron las células para CD4 (se incluyeron las poblaciones CD4hi y CD4lo) y CD4 frente al péptido de 15 meros. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 4.

Se aislaron células B del bazo de ratones NOD. Las células MHC-II+ clasificadas se purificaron a partir de linfocitos totales. Las células se tiñeron con el péptido de 15 meros marcado con FITC, anti-CD40, y los marcadores de linfocitos B CD19 y CD21. Las células MHC-II+ se separaron para CD19+ y CD21+ y, a continuación, se midió el péptido de 15 meros frente al anticuerpo CD40. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 5.

Este estudio demuestra que una mayoría sustancial, 90 % de los linfocitos T CD40+, también se unen al péptido de 15 meros, demostrando así que el péptido de 15 meros es altamente específico para las células CD40+. También muestra que el 90 % de las células B eran CD40 positivas, sólo el 8 % de los linfocitos B se unieron al péptido de 15 meros.

Ejemplo 4 (no forma parte de la invención)

Este ejemplo demuestra el nivel de células CD40 positivas en la sangre de sujetos con diabetes tipo I y de sujetos no diabéticos (control).

Se obtuvo 1 ml de sangre total de cada individuo y se incubó con péptido de 15 meros conjugado con biotina. A continuación, las células se expusieron a peroxidasa de rábano picante(horseradish peroxidase,HRP)-avidina, se lavaron y se determinó la absorbancia a 405 nm con un espectrofotómetro. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 6.

Este estudio demuestra que las células sanguíneas de pacientes con diabetes de tipo I presentaban una mayor actividad de unión al péptido de 15 meros que las células de controles no diabéticos.

Ejemplo 5 (no forma parte de la invención)

Este ejemplo demuestra el nivel de granulación de insulina observado en el páncreas de ratones NOD tratados con el péptido de 15 meros o con un péptido de ovoalbúmina.

Al inicio de la diabetes, seis ratones NOD fueron inyectados con 100 ug/ml del péptido de 15 meros (SEQ ID NO:7), dando como resultado la reversión de la hiperglucemia en el 80 % de los receptores. Seis semanas después de revertir la hiperglucemia, los ratones se han sacrificado y se extrajo el páncreas para su análisis. El páncreas fue fijado, seccionado y, a continuación, teñido con una tinción de aldehído/fucsina que permite detectar los gránulos de insulina. La granulación del tejido se puntuó del siguiente modo: 4=completamente granulado; 3=75 % de islotes granulados; 2= 50 % de islotes granulados, y peri-insulitis; 1=25 % de islotes granulados; 0= no se detectan gránulos de insulina. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 7.

Este análisis demuestra que el péptido de 15 meros preservó los gránulos de insulina en la mayoría de los ratones, y mejoró significativamente en los ratones diabéticos a los que se les revirtió con el péptido en comparación con los ratones diabéticos que recibieron un péptido irrelevante.

Ejemplo 6 (no forma parte de la invención)

Este ejemplo demuestra el efecto de las mutaciones en el péptido de 15 meros sobre su capacidad para prevenir la aparición de la diabetes.

Los péptidos se diseñaron y produjeron como se describe en el Ejemplo 1. Los péptidos variantes se produjeron de modo que en cada variante, se sustituyó una glicina por un aminoácido correspondiente a un aminoácido en las posiciones 1-9 de SEQ ID NO:7, como se indica a continuación:

Gly-1 G-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:11)

Gly-2 V-G-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:12)

Gly-3 V-L-G-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:13)

Gly-4 V-L-Q-G-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:14)

Gly-5 V-L-Q-W-G-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:15)

Gly-6 V-L-Q-W-A-G-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:16)

Gly-7 V-L-Q-W-A-K-G-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:17)

Gly-9 V-L-Q-W-A-K-K-G-G-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:18)

Gly-10 V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-G-T-M-K-S-N (SEQ ID NO:19)

Gly-11 V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-G-M-K-S-N (SEQ ID NO:20)

Gly-12 V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-G-K-S-N (SEQ ID NO:21)

Los ratones NOD se colocaron en grupos de 10, y los ratones de cada grupo se inyectaron IV semanalmente con 50 ug de péptido silvestre (WT; Legend) o un péptido variante (en PBD, pH 7,2) mencionado anteriormente. El desarrollo de la diabetes se controló midiendo semanalmente los niveles de glucosa en sangre. Se consideró que los ratones eran "diabéticos" cuando la glucemia era de 250 mg/dl o superior durante 2 lecturas consecutivas. Las inyecciones comenzaron a las 6 semanas de edad = prediabetes.

Este ejemplo demuestra que la sustitución de una glicina en cualquiera de las posiciones 1-7, o 9-12, reduce la capacidad del péptido de 15 meros para inhibir el desarrollo de la diabetes. También demuestra que tales mutaciones no suprimen por completo la capacidad del péptido de 15 meros mutado para inhibir el desarrollo de la diabetes. Ejemplo 7 (no forma parte de la invención)

Este ejemplo demuestra que la misma elevación de los niveles de linfocitos Th40 en el modelo de aterosclerosis de ratón con deficiencia de ApoE también es notablemente elevada en la diabetes tipo 1 (DT1) humana.

En la sangre periférica se midió el recuento total de células CD3+CD4+CD40+ en ratones NOD, NOR (resistentes no obesos diabéticos), y ratones BALB/c (control) como en la Figura 9. Esto se comparó con el porcentaje de linfocitos Th40 en sangre periférica en sujetos humanos para poblaciones de control, diabéticas/de reciente aparición y diabéticas de larga duración, como en la Figura 10. Además, se aislaron linfocitos de ratones NOD de 9 semanas de edad. Los linfocitos se incubaron con anti-CD, anti-CD8, y péptido de 15 meros marcado con FITC, y luego analizados por citometría de flujo. Se separaron las células para CD4 (se incluyeron las poblaciones CD4hi y CD4lo) y CD4 frente al péptido de 15 meros. Estos resultados se muestran en la Figura 11.

Se seleccionaron ratones deficientes en ApoE con una dieta normal para recibir una dosis de 1 mg/kg del péptido de 15 meros (SEQ ID NO: 7) por inyección IV en la cola, tres veces por semana durante 26 semanas, a partir de las 9 semanas de edad y también se utilizó un control. A las 25 semanas, los animales fueron sometidos a eutanasia, se les pesó y se les extrajo sangre, el bazo y el páncreas para su análisis. A continuación, se perfundió a los sujetos mediante punción cardíaca con paraformaldehído al 4 %. Se diseccionaron los arcos aórticos, se deshidrataron en gradiente de sacarosa y se congelaron rápidamente. Se obtuvieron aproximadamente treinta y cinco secciones longitudinales de 8 um por ratón para diversos procedimientos de tinción. La citometría de flujo se realizó utilizando un MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotec Inc.). Se realizaron análisis adicionales utilizando elsoftwarede citometría de flujo unicelular FlowJo ® (FlowJo, LLC propiedad integral de BectonDickinson, Inc.).

Los ratones NOD mostraron un aumento de los niveles de linfocitos Th40 en relación con todas las células CD3+CD4+ antes de la hiperglucemia, como se muestra en la Figura 12.

Además, los ratones NOD analizados en este estudio demostraron una infiltración significativa de Th40 en la aorta en comparación con las poblaciones de ratones NOD de control y jóvenes no diabéticos, como se muestra en la Figura 13.

Se observó una placa aórtica de ejemplo de una de las secciones longitudinales a un aumento de 200x utilizando tinción de oil-red-0, tricrómico e inmunofluorescencia, y se muestra en la Figura 14. Esta microscopía y tinción de la aorta mostró que no sólo los linfocitos Th40 están aumentadas en la aorta de forma similar a la sangre periférica como se demuestra en las Figs. 10-14, pero también los linfocitos Th40 se encuentran en la región del hombro de la placa en el modelo ApoE-/ (la región de crecimiento de la placa/aterosclerosis). En la Figura 14,10y20identifican células que representan (linfocitos Th40) CD3+, CD4+, y CD40+ que tienen CD40 intracelular significativo.30demuestra linfocito Th40 con expresión extracelular y sin CD40 demostrable intracelularmente.40identifica célula CD3+, CD4+, CD40neg.

Ejemplo 8 (no forma parte de la invención)

Este ejemplo demuestra la producción de interferón gamma en células CD3+CD4+CD40+ que parecen producir interferón gamma (IFNy) en abundancia. Adicionalmente, el interferón gamma controla la proliferación de Th40. Se seleccionaron ratones deficientes en ApoE con una dieta normal para recibir una dosis de 1 mg/kg del péptido de 15 meros (SEQ ID NO: 7) por inyección IV en la cola, tres veces por semana durante 26 semanas, a partir de las 9 semanas de edad y también se utilizó un control. A las 25 semanas, los animales fueron sometidos a eutanasia, se les pesó y se les extrajo sangre, el bazo y el páncreas para su análisis. A continuación, se perfundió a los sujetos mediante punción cardíaca con paraformaldehído al 4 %. Se diseccionaron los arcos aórticos, se deshidrataron en gradiente de sacarosa y se congelaron rápidamente. Se obtuvieron aproximadamente treinta y cinco secciones longitudinales de 8 pm por ratón para diversos procedimientos de tinción. La citometría de flujo se realizó utilizando un MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotec Inc.). Se realizaron análisis adicionales utilizando elsoftwarede citometría de flujo unicelular FlowJo ® (FlowJo, LLC propiedad integral de BectonDickinson, Inc.).

Como se demuestra en la Figura 14 mediante microscopía confocal, CD40 puede ser interno o externo a la célula CD3+CD4+. Se realizó además una citometría de flujo que demostró que, si bien la mayoría de las células CD3+ parecen tener capacidad para producir CD40, las células CD3+CD4+CD40+ parecen producir interferón gamma (IFN<y>) en abundancia. Este estudio de citometría de flujo incorporó tanto la tinción externa como la interna de CD3, CD4, CD40 e IFNy.

La Figura 16 demuestra que el interferón gamma controla la proliferación de Th40. Los linfocitos Th40 aislados se reticularon con anticuerpo frente a CD40. El gráfico de la Figura 16 denota la proliferación de linfocitos Th40 reticulados (activados) (CD40 XL) frente al anticuerpo contra IFN<y>y los controles no reticulados (UN). Adicionalmente, bloqueando el IFNy, los linfocitos Th40 activados no proliferan.

Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra que KGYY15 (15 meros - SEQ ID NO:7) deroga la aterosclerosis.

Se seleccionaron ratones deficientes en ApoE con una dieta normal para recibir una dosis de 1 mg/kg del péptido de 15 meros (SEQ ID NO: 7) por inyección IV en la cola, tres veces por semana durante 26 semanas, a partir de las 9 semanas de edad y también se utilizó un control. A las 25 semanas, los animales fueron sometidos a eutanasia, se les pesó y se les extrajo sangre, el bazo y el páncreas para su análisis. A continuación, se perfundió a los sujetos mediante punción cardíaca con paraformaldehído al 4 %. Se diseccionaron los arcos aórticos, se deshidrataron en gradiente de sacarosa y se congelaron rápidamente.

La Figura 17 muestra un ejemplo de la curvatura menor del arco aórtico, definida proximalmente a partir del flujo aórtico saliente(aortic outflow,AO). De los segmentos vistos en la tinción de tricrómico, se midió distalmente una distancia intimal de 2,4 mm. El área de la pared del arco aórtico subtendida por este tramo de 2,5 mm de la íntima se calculó para cada sección de todos los ratones, con el área máxima de la pared del arco aórtico interno de cada ratón utilizada para calcular los promedios por grupo. La superficie luminal (L), arco aórtico (AO) y la arteria innominada (I) están marcados en esta Figura 17.

La Figura 18 muestra la curvatura menor del arco aórtico de los ratones ApoE de control en comparación con la curvatura menor del arco aórtico de los ratones tratados con el péptido de 15 meros, de acuerdo con las etapas descritas en este ejemplo.

La Figura 19 muestra la reducción del área total conseguida mediante el tratamiento con péptidos. El área total del segmento de 2,5 mm (como se describe en la Figura 17) se redujo sustancialmente.

La Figura 20 muestra la reducción del número de placas, incluidas las lesiones tempranas y la placa avanzada. El número total de placas disminuyó significativamente en el grupo de tratamiento. La placa se subdividió en función de la morfología de las lesiones tempranas (observables como estrías grasas que contienen células espumosas derivadas de macrófagos con diversos grados de acumulación de lípidos) en comparación con los fibroateromas más avanzados (que contienen diversos grados de lípidos o núcleo necrótico y tapones fibrosos). Se incluyeron todas las placas dentro del segmento designado de 2,5 mm. Tanto el número total como el tipo de placa disminuyeron significativamente en los sujetos tratados con el péptido.

Este estudio demuestra que la administración del péptido deroga la aterosclerosis.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra que la administración de KGYY<15>(15 meros - SEQ ID NO:7) aumenta la formación de tapones al tiempo que reduce el avance de la enfermedad existente.

En este estudio, seis ratones ApoE-/- recibieron una dieta normal de 0 a 20 semanas de edad. A las 20 semanas de edad, tres ratones fueron asignados aleatoriamente para recibir dosis de 1 mg/kg de KGYY<15>(15 meros - SEQ ID NO:7) por inyección IV en la cola, una vez a la semana durante 4 semanas. Los ratones de control sólo recibieron vehículo. Después de 4 semanas de tratamiento, los animales fueron sometidos a eutanasia y perfundidos mediante punción cardíaca con paraformaldehído al 4 %. Los arcos aórticos se disecaron en gradiente de sacarosa y se congelaron rápidamente. Se obtuvieron aproximadamente cincuenta, secciones longitudinales de 8 um por ratón. Los portaobjetos se trataron con tinción de tricrómico y se analizaron mediante elsoftwarecellSens para realizar mediciones. Se midió la placa total incluyendo la curvatura menor de 2,5 mm y la arteria innominada.

La Figura 20 muestra que el número de placas tempranas individuales y de placas avanzadas se redujo en los sujetos tratados en comparación con los sujetos de control.

La Figura 21 muestra que la relación entre el tapón y el núcleo de las placas avanzadas se redujo en los sujetos tratados en comparación con los sujetos de control.

La Figura 22 muestra que la anchura media del tapón (tamaño del tapón) fue mayor en los sujetos tratados que en los sujetos de control.

La Figura 23 muestra que la anchura media del núcleo (tamaño del núcleo/tamaño de la placa) disminuyó en los sujetos tratados con el péptido en comparación con los sujetos de control.

Este ejemplo demuestra que la administración de KGYY<15>(15 meros - SEQ ID NO:7) aumenta la formación de tapones al tiempo que reduce el avance de la enfermedad existente. Asimismo, este estudio demuestra además que la administración del péptido KGYY<15>tiende hacia resultados de estabilidad de la placa.

A partir de lo anterior, es evidente que la DT1 comparte con la aterosclerosis la díada CD40-CD154 que impulsa la inflamación autoinmune. Hay un aumento de los niveles de linfocitos Th40 en la sangre periférica de los ratones NOD, pacientes humanos con DT1 y ratones ApoE-/-. Los linfocitos Th40 se infiltran en la pared aórtica y se encuentran dentro de la placa de los ratones ApoE-/-. Los linfocitos Th40 producen la citocina inflamatoria IFNy a un nivel superior al de otras células y esto impulsa la inflamación. El péptido KGYY<15>tiene como objetivo los linfocitos Th40. Además, el péptido especificado deroga y modula la aterosclerosis, lo que puede deberse al bloqueo de Th40 o al bloqueo general de<c>D40. Asimismo, la administración del péptido especificado tiende hacia tipos de placas más estables. Ejemplo 11 (no forma parte de la invención)

Se administró el péptido en sangre humana total de acuerdo con niveles de dosificación similares a los utilizados para los estudios murinos.

La Figura 24 presenta los resultados de los estudios de coagulación observados en seres humanos.

Este estudio demuestra que el péptido KGYY15 administrado a seres humanos no modifica ni cambia significativamente la coagulación de la sangre humana total fuera de los niveles normalmente reconocidos.

Ejemplo 12

Este ejemplo demuestra que los ratones ApoE que han sido modificados genéticamente para obtener aterosclerosis y alimentados con una dieta rica en grasas y tratados con el péptido de 6 meros pueden ver disminuidos los niveles de los valores de colesterol LDL en comparación con los sujetos no tratados.

En este estudio, seis ratones ApoE-/- recibieron una dieta normal de 0 a 20 semanas de edad. A las 20 semanas de edad, tres ratones fueron asignados aleatoriamente para recibir dosis de 1 mg/kg de KGYY6 (6 meros - SEQ ID NO:4) por inyección IV en la cola, una vez a la semana durante 4 semanas. Los ratones de control sólo recibieron vehículo. Los datos obtenidos de los ratones no tratados y comparados con los de los ratones tratados mostraron una reducción estadísticamente significativa (>50 %) de los valores de colesterol LDL. Estos datos figuran en la Figura 27.

Ejemplo 13

Este ejemplo demuestra los cambios ateroscleróticos que experimentaron los ratones ApoE -/- cuando se trataron con KGYY6 (6 meros - SEQ ID NO: 4). Los ratones ApoE -/- fueron alimentados con una dieta rica en grasas durante 16 semanas. Los ratones fueron asignados aleatoriamente para recibir dosis de 1 mg/kg de KGYY6 (6 meros - SEQ ID NO:4) por inyección IV en la cola, una vez a la semana durante 4 semanas. Los ratones de control sólo recibieron vehículo. La aterosclerosis se investigó mediante varios métodos. El análisis en proyección de cirujano utilizando la tinción de Sudán IV (tinción lipídica) demostró una reducción significativa de las áreas de lesión. La Fig. 28A es una imagen de la tinción de Sudán IV en proyección de cirujano de la aorta tratada con KGYY6 y la Fig. 28B es una imagen de la tinción de Sudán en proyección de cirujano de la aorta de control (no tratada). La Fig. 29 es un gráfico que demuestra la reducción de las áreas de lesión de la tinción con Sudán IV.

Además, la medición del área y la morfología de la placa se realizó mediante el método de Paigen. Este método obtiene secciones transversales aórticas secuenciales de 5 pm desde la raíz aórtica comenzando en las valvas de la válvula hasta la aorta ascendente. A intervalos de 50 pm, se tiñen los portaobjetos y se mide la superficie de la lesión aterosclerótica. Las mediciones individuales del área de la placa se trazan frente a los intervalos micrométricos y se establece una curva, con el área bajo la curva (AUC) dando el volumen total de placa. Estos resultados se presentan en forma de gráfico en la Fig. 30, que demuestra que los ratones tratados con KGYY6 mostraron una reducción del volumen de placa bajo la curva. Asimismo, la caracterización de la composición de la placa o de las muestras aórticas se realizó mediante técnicas de tinción con tricrómico y estos resultados se presentan en formato gráfico en la Fig. 31. De hecho, estos datos de la Fig. 31, que se generaron utilizando elsoftwarede análisis Image Pro Plus, cuantifican y demuestran que se han producido cambios en la composición de la placa, incluyendo el aumento del colágeno y la reducción del contenido de músculo liso.

La Fig. 32A es una imagen de células teñidas con tricrómico de las secciones transversales de la aorta del sujeto tratado con KGYY6. La Fig. 32B es una imagen de células teñidas con tricrómico de las secciones transversales de los sujetos de control. En la Figura 32A,50identifica las áreas características de formación de placa.60identifica las valvas de la válvula aórtica. En la Fig. 32B, las áreas de control (no tratadas)50características de la placa (área bajo la curva) son mayores que las de los sujetos tratados con el péptido KGYY6.

A partir de lo anterior, es evidente que se han descrito e ilustrado nuevas y útiles implementaciones de los métodos que satisfacen numerosos desiderata de formas notablemente inesperadas. Es, por supuesto, entendido que tales modificaciones, alteraciones y adaptaciones que se le puedan ocurrir fácilmente al experto que se enfrente a esta divulgación están previstas dentro del espíritu de esta divulgación, que sólo está limitada por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido para su uso en un método para reducir el colesterol LDL, en donde el péptido se une específicamente a una célula presentadora de CD40 en el sitio de unión de CD154, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido y en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, S<e>Q ID NO:5, SEQ<i>D NO:6,<s>E<q>ID NO:8 y SEQ ID NO:9.

2. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.

3. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido afecta la interacción de CD40 y CD154.

4. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la unión de CD40 a CD154.

5. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido se une a CD40 en el lugar donde CD40 interactúa con CD154.

6. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el péptido afecta al perfil de expresión de citoquinas de una población celular tratada con dicho péptido.

7. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el péptido tiene menos de 20 aminoácidos de longitud.