ES2991818T3 - Agrupaciones de oro (AuC) y composición para el tratamiento de la cirrosis hepática - Google Patents

Agrupaciones de oro (AuC) y composición para el tratamiento de la cirrosis hepática Download PDF

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Abstract

Los grupos de oro unidos a ligando y las composiciones que comprenden los grupos de oro unidos a ligando se utilizan para tratar la cirrosis hepática y fabricar un medicamento para el tratamiento de la cirrosis hepática. Métodos para tratar la cirrosis hepática. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Agrupaciones de oro (AuC) y composición para el tratamiento de la cirrosis hepática
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo técnico del tratamiento de la cirrosis hepática, en particular a las agrupaciones de oro unidas a ligandos (AuC) y a la composición que comprende los AuC unidos a ligandos para su uso en el tratamiento de la cirrosis hepática.
Antecedentes de la invención
El hígado es el órgano sólido más grande del cuerpo humano y desempeña numerosas funciones importantes, como: producir proteínas sanguíneas que ayudan a la coagulación, transportan oxígeno y contribuyen al sistema inmunitario; almacenar el exceso de nutrientes y devolver algunos de ellos al torrente sanguíneo; producir bilis para ayudar a digerir los alimentos; ayudar al organismo a almacenar azúcar (glucosa) en forma de glucógeno; eliminar sustancias nocivas del torrente sanguíneo, como las drogas y el alcohol; y descomponer las grasas saturadas y producir colesterol. La cirrosis hepática es una enfermedad lentamente progresiva, que se desarrolla a lo largo de muchos años debido a un daño prolongado y continuo del hígado. Con el desarrollo de la cirrosis hepática, el tejido sano del hígado se destruye gradualmente y es sustituido por tejido cicatricial. El tejido cicatricial bloquea el flujo de sangre a través del hígado y ralentiza la capacidad del hígado para procesar nutrientes, hormonas, fármacos y toxinas naturales. También reduce la producción de proteínas y otras sustancias elaboradas por el hígado. La cirrosis puede acabar provocando una insuficiencia hepática que puede requerir un trasplante de hígado y/o cáncer de hígado.
En la fase inicial de la cirrosis hepática, no hay síntomas evidentes debido a la fuerte función compensatoria del hígado. En su fase más avanzada, los síntomas incluyen daño de la función hepática, hipertensión portal, hemorragia gastrointestinal alta, encefalopatía hepática, infección secundaria, hiperfunción del bazo, ascitis, cancerización y otras complicaciones. La cirrosis hepática es el resultado de la deformación y el endurecimiento progresivos del hígado. Histopatológicamente, la cirrosis hepática se caracteriza por una extensa necrosis celular hepática, regeneración nodular de los hepatocitos residuales, hiperplasia del tejido conjuntivo y formación de tabiques fibrosos, que conducen a la destrucción de la estructura lobular hepática y a la formación de pseudolóbulos.
La cirrosis hepática tiene diferentes causas. Algunas personas con cirrosis tienen más de una causa de daño hepático. Las causas comunes de cirrosis incluyen el abuso prolongado del alcohol, la infección crónica por hepatitis B y C, la enfermedad del hígado graso, los metales tóxicos, las enfermedades genéticas, los trastornos de la nutrición, los venenos industriales, los fármacos, los trastornos circulatorios, los trastornos metabólicos, la colestasis, la esquistosomiasis, etc.
La cirrosis hepática puede diagnosticarse mediante numerosas pruebas/técnicas. Por ejemplo, un análisis de sangre podría sugerir cirrosis hepática si aumentan los niveles de las enzimas hepáticas, incluidas la alanina transaminasa (ALT), la aspartato transaminasa (AST) y la fosfatasa alcalina (ALP), y la bilirrubina, y disminuyen los niveles de proteínas en sangre.
En la actualidad, aunque los tratamientos pueden retrasar el avance de la cirrosis hepática abordando sus causas, no existen tratamientos específicos para la cirrosis hepática.
El documento WO 2013/176468 Al divulga una nanopartícula de oro que se une a un fármaco proteico para tratar una enfermedad hepática. Preferiblemente, la nanopartícula de oro puede tener un tamaño de partícula de 10 nm o más, más preferiblemente de 10 nm a 30 nm.
Los documentos WO 2018024111 A 1 y WO 2018095429 Al se refieren a la aplicación farmacéutica de la agrupación de oro ligado al ligando descrito en la presente divulgación para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA) y el glaucoma, respectivamente. No se pronuncian sobre el tratamiento de la cirrosis en vivo.
Noelia et al. o el documento US 2018/169044 Al enseña a tratar la enfermedad hepática con NAC combinada con otros componentes eficaces, como glicina, vitamina D, bFCF, teanina y otros aminoácidos. El documento US 2018/036270 A1 solo menciona brevemente que la NAC puede utilizarse para tratar enfermedades hepáticas, no se presentan más detalles.
El documento WO 00/06244 A2 y EP 2226082 A2 revelan el uso de partículas de oro para terapia, pero ninguno de ellos se refiere a un tratamiento en cirrosis hepática.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona agrupaciones de oro unidos a ligandos y una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la cirrosis hepática en un sujeto.
Determinadas realizaciones de la presente invención proporcionan una agrupación de oro unida a ligando para su uso en el tratamiento de la cirrosis hepática, en el que la agrupación de oro unida a ligando comprende un núcleo de oro; y un ligando unido al núcleo de oro;
caracterizado porque el núcleo de oro tiene un diámetro comprendido entre 0,5 y 3 nm;
el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en L-cisteína y sus derivados, D-cisteína y sus derivados, y oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados;
la L-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo formado por L-cisteína, N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC) y N-acetil-L-cisteína (L-NAC); la D-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo formado por D-cisteína, N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC) y N-acetil-D-cisteína (D-NAC); y
los oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados son dipéptidos que contienen cisteína, tripéptidos que contienen cisteína o tetrapéptidos que contienen cisteína.
En determinadas realizaciones de la agrupación de oro ligada a ligando para su uso, el núcleo de oro tiene un diámetro comprendido entre 0,5 y 2,6 nm.
En determinadas modalidades de la agrupación de oro unida a ligando para su uso, los dipéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en L(D)-cisteína-L(D)-arginina dipéptido (CR), L(D)-arginina-L(D)-cisteína dipéptido (RC), L(D)-histidina-L(D)-cisteína dipéptido (HC) y L(D)-cisteína-L(D)-histidina dipéptido (CH). En determinadas realizaciones de la agrupación de oro unida a ligando para su uso, los tripéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tripéptido (GCR), L(D)-prolina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tripéptido (PCR), L(D)-lisina-L(D)-cisteína-L(D)-prolina tripéptido (KCP) y L(D)-glutatión (GSH).
En determinadas realizaciones de la agrupación de oro unida a ligando para su uso, los tetrapéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en tetrapéptido de glicina-L(D)-serina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GSCR), y tetrapéptido de glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GCSR).
Determinadas realizaciones de la presente invención proporcionan una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la cirrosis hepática, en la que la composición farmacéutica comprende una agrupación de oro unida a ligando y un excipiente farmacéuticamente aceptable, y la agrupación de oro unida a ligando comprende un núcleo de oro; y un ligando unido al núcleo de oro;
caracterizado porque el núcleo de oro tiene un diámetro comprendido entre 0,5 y 3 nm;
el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en L-cisteína y sus derivados, D-cisteína y sus derivados, y oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados;
la L-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo formado por L-cisteína, N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC) y N-acetil-L-cisteína (L-NAC); la D-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo formado por D-cisteína, N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC) y N-acetil-D-cisteína (D-NAC); y
los oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados son dipéptidos que contienen cisteína, tripéptidos que contienen cisteína o tetrapéptidos que contienen cisteína.
En determinadas realizaciones de la composición farmacéutica para su uso, el núcleo de oro tiene un diámetro comprendido entre 0,5 y 2,6 nm.
En determinadas realizaciones de la composición farmacéutica, los dipéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo formado por el dipéptido L(D)-cisteína-L(D)-arginina (CR), el dipéptido L(D)-arginina-L(D)-cisteína (RC), el dipéptido L(D)-histidina-L(D)-cisteína (HC) y el dipéptido L(D)-cisteína-L(D)-histidina (CH).
En determinadas realizaciones de la composición farmacéutica para su uso, los tripéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tripéptido (GCR), L(D)-prolina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tripéptido (PCR), L(D)-lisina-L(D)-cisteína-L(D)-prolina tripéptido (KCP) y L(D)-glutatión (GSH).
En determinadas realizaciones de la composición farmacéutica para su uso, los tetrapéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en tetrapéptido de glicina-L(D)-serina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GSCR), y tetrapéptido de glicina-L(D)-cisteína-L(D)-serina-L(D)-arginina (GCSR).
Los objetivos y las ventajas de la invención llegarán a ser evidentes en la descripción detallada siguiente de realizaciones preferidas de esta en conexión con los dibujos adjuntos.
Descripción de los dibujos
Las realizaciones preferidas según la presente invención se describirán ahora con referencia a las figuras, en las que los mismos números de referencia denotan elementos similares.
La FIG. 1 muestra espectros ultravioleta-visible (UV), imágenes de microscopio electrónico de transmisión (MET) y diagramas de distribución del tamaño de partícula de nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC (L-NIBC-AuNP) con diferentes tamaños de partícula.
La FIG. 2 muestra espectros ultravioleta-visible (UV), imágenes MET y diagramas de distribución del tamaño de partícula de agrupaciones de oro ligadas al ligando L-NIBC (L-NIBC-AuC) con diferentes tamaños de partícula. La FIG. 3 muestra espectros infrarrojos de L-NIBC-AuC con diferentes tamaños de partícula.
La FIG. 4 muestra diagramas UV, infrarrojos, MET y de distribución del tamaño de las partículas de las agrupaciones de oro unidas al ligando CR (CR-AuC).
La FIG. 5 muestra diagramas UV, infrarrojos, MET y de distribución del tamaño de las partículas de las agrupaciones de oro unidas al ligando RC (RC-AuC).
La f Ig .6 muestra los diagramas de UV, infrarrojo, MET y distribución de tamaño de partículas de las agrupaciones de oro (Cap-AuC) unidas con el ligando l-[(2S)-2-metil-3-tiolo-1-oxopropil]-L-prolina (es decir, Cap).
La FIG. 7 muestra diagramas UV, infrarrojos, MET y de distribución del tamaño de las partículas de las agrupaciones de oro unidas al ligando GSH (GSH-AuC).
La FIG. 8 muestra diagramas UV, infrarrojos, MET y de distribución del tamaño de las partículas de las agrupaciones de oro unidas al ligando D-NIBC (D-NIBC-AuC).
La FIG. 9 muestra los diagramas UV, infrarrojo, MET y de distribución del tamaño de partícula de las agrupaciones de oro unidas al ligando L-cisteína (L-Cys-AuC).
La FIG. 10 presenta gráficos de barras que muestran los efectos de diferentes dosis de A-01 y A-02 sobre los niveles séricos de (A) ALT, (B) AST, (C) Tb IL, (D) MAO y (E) ALB en ratones cirróticos modelo, donde 1) denota el grupo de control en blanco, 2) el grupo modelo, 3) el grupo positivo tratado con sorafenib, 4) el grupo de dosis baja de A-01, 5) el grupo de dosis alta de A-01, 6) el grupo de dosis baja de A-02 y 7) el grupo de dosis alta de A-02.
La FIG. 11 presenta gráficos de barras que muestran los efectos de diferentes dosis de B-01 y B-02 sobre los niveles séricos de (A) ALT, (B) AST, (C) T<b>IL, (D) MAO y (E) ALB en ratones cirróticos modelo, donde 1) denota el grupo de control en blanco, 2) el grupo modelo, 3) el grupo positivo tratado con sorafenib, 4) el grupo de dosis baja de B-01, 5) el grupo de dosis alta de B-01, 6) el grupo de dosis baja de B-02 y 7) el grupo de dosis alta de B-02.
La FIG. 12 presenta gráficos de barras que muestran los efectos de la dosis alta de C sobre los niveles séricos de (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO y (E) ALB en ratones cirróticos modelo, donde 1) denota el grupo de control en blanco, 2) el grupo modelo, 3) el grupo positivo tratado con sorafenib, 4) el grupo de dosis alta del fármaco C. La FIG. 13 presenta imágenes de tinción HE: (A) el grupo de control en blanco; (B) el grupo modelo; (C) el grupo de control positivo; (D) A-01 grupo de dosis baja; (E) A-01 grupo de dosis alta.
La FIG. 14 presenta gráficos de barras que muestran los efectos de los fármacos D, E y F sobre los niveles séricos de (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO y (E) ALB en ratones cirróticos modelo, donde 1) denota el grupo de control en blanco, 2) el grupo modelo, 3) el grupo del fármaco D, 4) el grupo del fármaco E y 5) el grupo del fármaco F.
Descripción detallada de las realizaciones
La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de determinadas realizaciones de la invención.
Las agrupaciones de oro (AuC) son una forma especial de oro que existe entre los átomos de oro y las nanopartículas de oro. Los AuC tienen un tamaño inferior a 3 nm y están compuestas por solo varios átomos de oro o algunos centenares, lo que provoca el colapso de la estructura de apilamiento cúbica centrada en la cara de las nanopartículas de oro. Como resultado, los AuC presentan estructuras electrónicas discretas similares a las de las moléculas, con un hueco HOMO-LUMO distinto, a diferencia de los niveles de energía continuos o casi continuos de las nanopartículas de oro. Esto conduce a la desaparición del efecto de resonancia plasmónica superficial y de la correspondiente banda de absorción de resonancia plasmónica (520 ± 20 nm) en el espectro UV-visible que poseen las nanopartículas de oro convencionales.
La presente invención proporciona un AuC ligado a un ligando.
En determinadas realizaciones, el AuC unido a ligando comprende un ligando y un núcleo de oro, en el que el ligando está unido al núcleo de oro. La unión de ligandos con núcleos de oro significa que los ligandos forman complejos estables en solución con los núcleos de oro mediante enlace covalente, enlace de hidrógeno, fuerza electrostática, fuerza hidrofóbica, fuerza de van der Waals, etc. En determinadas realizaciones, el diámetro del núcleo de oro está comprendido entre 0,5 y 3 nm. En determinadas realizaciones, el núcleo de oro tiene un diámetro comprendido entre 0,5 y 2,6 nm.
En determinadas realizaciones, el ligando del AuC unido al ligando es un compuesto u oligopéptido que contiene tiol. En determinadas realizaciones, el ligando se une al núcleo de oro para formar un enlace ligando AuC a través del enlace Au-S.
En determinadas realizaciones, el ligando es, entre otros, L-cisteína, D-cisteína o un derivado de la cisteína. En determinadas realizaciones, el derivado de cisteína es N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC), N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC), N-acetil-L-cisteína (L-NAC) o N-acetil-D-cisteína (D-NAC).
En determinadas realizaciones, el ligando es, entre otros, un oligopéptido que contiene cisteína y sus derivados. En determinadas realizaciones, el oligopéptido que contiene cisteína es un dipéptido que contiene cisteína. En determinadas realizaciones, el dipéptido que contiene cisteína es el dipéptido L(D)-cisteína-L(D)-arginina (CR), el dipéptido L(D)-arginina-L(D)-cisteína (RC) o el dipéptido L(D)-cisteína-L-histidina (CH). En determinadas realizaciones, el oligopéptido que contiene cisteína es un tripéptido que contiene cisteína. En determinadas realizaciones, el tripéptido que contiene cisteína es el tripéptido glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GCR), el tripéptido L(D)-prolina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (PCR) o el L(D)-glutatión (GSH). En determinadas realizaciones, el oligopéptido que contiene cisteína es un tetrapéptido que contiene cisteína. En determinadas realizaciones, el tetrapéptido que contiene cisteína es el tetrapéptido glicina-L(D)-serina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GSCR) o el tetrapéptido glicina-L(D)-cisteína-L(D)-serina-L(D)-arginina (GCSR).
En determinadas realizaciones, el ligando es un compuesto que contiene tiol. En determinadas realizaciones, el compuesto que contiene tiol es l-[(2S)-2-metil-3-tiol-l-oxopropil]-L(D)-prolina, ácido tioglicólico, mercaptoetanol, tiofenol, D-3-trolovol o dodecil mercaptano.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de la cirrosis hepática en un sujeto. En determinadas realizaciones, el sujeto es humano. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal de compañía, como un perro.
En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un AuC ligado a un ligando como el descrito anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el excipiente es una solución tamponada con fosfato o una solución salina fisiológica.
La presente invención proporciona un uso de los AuC unidos a ligando anteriormente divulgados para fabricar un medicamento para el tratamiento de la cirrosis hepática en un sujeto.
La presente invención proporciona un uso de los AuC ligados a ligandos descritos anteriormente para tratar la cirrosis hepática en un sujeto o un método para tratar la cirrosis hepática en un sujeto utilizando los AuC ligados a ligandos descritos anteriormente. En determinadas realizaciones, el método de tratamiento comprende la administración al sujeto de una cantidad farmacéuticamente eficaz de AuC ligados al ligando. La cantidad farmacéuticamente eficaz puede determinarse mediante estudiosin vivorutinarios.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el único propósito de ilustrar los principios de la presente invención; de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Realizaciones
Realización 1. Preparación de AuC ligados a ligandos
1.1 Disolviendo HAuCU en metanol, agua, etanol, n-propanol o acetato de etilo para obtener una solución A en la que la concentración deHAuCU sea de entre 0,01 y 0,03 M;
1.2 Disolviendo un ligando en un disolvente para obtener una solución B en la que la concentración del ligando es de 0,01 a 0,18 M; el ligando incluye, entre otros, L-cisteína, D-cisteína y otros derivados de la cisteína como N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC), N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC), N-acetil-L-cisteína (L-NAC) y N-acetil-D-cisteína (D-NAC), oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados, incluidos, entre otros, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y otros péptidos que contienen cisteína, como L(D)-cisteína-L(D)-arginina dipéptido (CR), L(D)-arginina-L(D)-cisteína dipéptido (RC), L(D)-cisteína-L(D)-histidina (CH), glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tripéptido (GCR), L(D)-prolina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tripéptido (PCR), L(D)-glutatión (GSH), glicina-L(D)-serina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina tetrapéptido (GSCR) y glicina-L(D)-cisteína-L(D)-serina-L(D)-arginina tetrapéptido (GCSR), y otros compuestos que contengan tiol, como uno o varios de l-[(2S)-2-metil-3-tiol-l-oxopropil]-L(D)-prolina, ácido tioglicólico, mercaptoetanol, tiofenol, D-3-trolovol y dodecilmercaptano; el disolvente es uno o varios de los siguientes: metanol, acetato de etilo, agua, etanol, n-propanol, pentano, ácido fórmico, ácido acético, éter dietílico, acetona, anisol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, pentanol, acetato de butilo, tributil metil éter, acetato de isopropilo, dimetil sulfóxido, formiato de etilo, acetato de isobutilo, acetato de metilo, 2-metil-1-propanol y acetato de propilo;
1.3 Mezclando la solución A y la solución B de manera que la relación molar entre HAuCU y el ligando sea 1:(0,01~100), agitando en un baño de hielo durante 0,1~48 h, añadiendo una solución de NaBH<4>en agua, etanol o metanol de 0,025~0,8 M, y continuando con la agitación en un baño de agua helada y reaccionando durante 0,1~12 h. La relación molar entre el NaBH<4>y el ligando es de 1:(0,01~100);
1.4 Utilizando tubos de ultrafiltración MWCO 3 K~30 K para centrifugar la solución de reacción a 8000~17500 rpm por gradiente durante 10~100 min después de finalizar la reacción para obtener el precipitado de AuC ligado a ligando en diferentes tamaños medios de partícula. La apertura de las membranas de filtración para tubos de ultrafiltración de diferentes MWCO determina directamente el tamaño de los AuC ligados a ligandos que pueden pasar las membranas. Este paso puede omitirse opcionalmente;
1.5 Disolviendo en agua el precipitado de AuC unido al ligando con diferentes tamaños medios de partícula obtenido en el paso (1.4), introduciéndolo en una bolsa de diálisis y dializándolo en agua a temperatura ambiente durante 1~7 días;
1.6 Liofilización de AuC ligados a ligandos durante 12~24 h después de la diálisis para obtener una sustancia pulverulenta o floculante, es decir, AuC ligados a ligandos.
Según se ha detectado, el tamaño de partícula de la sustancia pulverulenta o floculante obtenida por el método anterior es inferior a 3 nm (distribuido en 0,5-2,6 nm en general). No hay pico de absorción obvio a 520 nm. Se determina que el polvo o los flóculos obtenidos son AuC ligados a ligandos.
Realización 2. Preparación y caracterización de AuC unidos con diferentes ligandos
2.1 Preparación de AuC ligados a L-NIBC, es decir, L-NIBC-AuC
Tomando como ejemplo el ligando L-NIBC, se detalla la preparación y confirmación de AuC unidos con el ligando L-NIBC.
2.1.1 Pesar 1,00 g de HAuCU y disolverlo en 100 ml de metanol para obtener una solución A 0,03 M;
2.1.2 Pesar 0,57 g de L-NIBC y disolver en 100 ml de ácido acético glacial (ácido acético) para obtener una solución B de 0,03 M;
2.1.3 Medir 1 ml de la solución A, mezclar con 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml o 5 ml de la solución B respectivamente (es decir, la relación molar entre HAuCU y L-NIBC es 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 y 1:5 respectivamente). Reaccionar en un baño de hielo bajo agitación durante 2 horas, agregar rápidamente 1 ml de una solución de NaBH<4>en etanol de 0,03 M (preparada pesando 11,3 mg de NaBH<4>y disolviendo en 10 ml de etanol) cuando la solución se torne incolora a partir de un amarillo brillante. Continuar la reacción durante 30 minutos después de que la solución se torne marrón oscuro y agregar 10 ml de acetona para finalizar la reacción.
2.1.4 Tras la reacción, la solución de reacción se somete a centrifugación en gradiente para obtener polvo de L-NIBC-AuC con diferentes tamaños de partícula. Método específico: Una vez completada la reacción, la solución de reacción se transfiere a un tubo de ultrafiltración con MWCO de 30 K y un volumen de 50 ml, y se centrifuga a 10 000 rpm durante 20 min, y el retentado en el tubo interior se disuelve en agua ultrapura para obtener polvo con un tamaño de partícula de unos 2,6 nm. A continuación, la solución mezclada en el tubo exterior se transfiere a un tubo de ultrafiltración con un volumen de 50 ml y un MWCO de 10 K, y se centrifuga a 13000 rpm durante 30 min. El retentado en el tubo interior se disuelve en agua ultrapura para obtener polvo con un tamaño de partícula de aproximadamente 1,8 nm. A continuación, la solución mezclada en el tubo exterior se transfiere a un tubo de ultrafiltración con un volumen de 50 ml y MWCO de 3 K, y se centrifuga a 17500 rpm durante 40 min. El retentado en el tubo interior se disuelve en agua ultrapura para obtener polvo con un tamaño de partícula de aproximadamente 1,1 nm.
2.1.5 Precipitar el polvo en tres tamaños de partícula diferentes obtenidos por centrifugación en gradiente, eliminar el disolvente respectivamente, soplar el producto bruto para secarlo con N<2>, disolverlo en 5 ml de agua ultrapura, ponerlo en una bolsa de diálisis (MWCO es 3 KDa), poner la bolsa de diálisis en 2 l de agua ultrapura, cambiar el agua cada dos días, dializarlo durante 7 días, liofilizarlo y guardarlo para un uso futuro.
2.2 Caracterización de los L-NIBC-AuC
Se realizó un experimento de caracterización del polvo obtenido anteriormente (L-NIBC-AuC). Mientras tanto, las nanopartículas de oro modificadas con el ligando L-NIBC (L-NIBC-AuNP) se utilizan como control. El método para preparar nanopartículas de oro cuyo ligando es L-NIBC se refiere a la referencia (W. Yan, L. Xu, C. Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang y N. A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114; X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan y J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623).
2.2.1 Observación de la morfología mediante microscopio electrónico de transmisión (MET)
Los polvos de prueba (muestra de L-NIBC-AuC y muestra de L-NIBC-AuNP) se disolvieron en agua ultrapura hasta 2 mg/l como muestras, y luego se prepararon muestras de prueba por el método de la gota colgante. Más concretamente, se gotearon 5 pl de las muestras sobre una película ultrafina de carbono, se volatilizaron de forma natural hasta que desapareció la gota de agua y, a continuación, se observó la morfología de las muestras mediante MET de alta resolución de emisión de campo s Te M/EDS JEM-2100F.
Las cuatro imágenes MET de L-NIBC-AuNP se muestran en los paneles B, E, H y K de la FIG. 1; las tres imágenes MET de L-NIBC-AuC se muestran en los paneles B, E y H de la FIG. 2.
Las imágenes de la FIG. 2 indican que cada una de las muestras de L-NIBC-AuC tiene un tamaño de partícula uniforme y buena dispersabilidad, y el diámetro medio de L-NIBC-AuC (referido al diámetro del núcleo de oro) es de 1,1 nm, 1,8 nm y 2,6 nm respectivamente, en buena concordancia con los resultados de los paneles C, F e I de la FIG. 2. En comparación, las muestras de L-NIBC-AuNP tienen un tamaño de partícula mayor. Su diámetro medio (referido al diámetro del núcleo de oro) es de 3,6 nm, 6,0 nm, 10,1 nm y 18,2 nm respectivamente, en buena concordancia con los resultados de los paneles C, F, I y L de la FIG. 1.
2.2.2 Espectros de absorción ultravioleta-visible (UV-vis.)
Los polvos de prueba (muestra de L-NIBC-AuC y muestra de L-NIBC-AuNP) se disolvieron en agua ultrapura hasta alcanzar una concentración de 10 mg l'1, y se midieron los espectros de absorción UV-vis. a temperatura ambiente. El intervalo de barrido era de 190 a 1100 nm, la cubeta de muestra era una cubeta de cuarzo estándar con un recorrido óptico de 1 cm y la cubeta de referencia estaba llena de agua ultrapura.
Los espectros de absorción UV-vis. de las cuatro muestras de L-NIBC-AuNP con diferentes tamaños se muestran en los paneles A, D, G y J de la FIG. 1, y la distribución estadística del tamaño de partícula se muestra en los paneles C, F, I y L de la FIG. 1; los espectros de absorción UV-vis. de tres muestras de L-NIBC-AuC. con diferentes tamaños se muestran en los paneles A, D y G de la FIG. 2, y la distribución estadística del tamaño de partícula se muestra en los paneles C, F e I de la FIG. 2.
La FIG. 1 indica que, debido al efecto plasmón superficial, las L-NIBC-AuNP presentaban un pico de absorción a unos 520 nm. La posición del pico de absorción es relevante con el tamaño de las partículas. Cuando el tamaño de las partículas es de 3,6 nm, el pico de absorción UV aparece a 516 nm; cuando el tamaño de las partículas es de 6,0 nm, el pico de absorción UV aparece a 517 nm; cuando el tamaño de las partículas es de 10,1 nm, el pico de absorción UV aparece a 520 nm, y cuando el tamaño de las partículas es de 18,2 nm, el pico de absorción aparece a 523 nm. Ninguna de las cuatro muestras presenta ningún pico de absorción por encima de 560 nm.
La FIG. 2 indica que en los espectros de absorción UV de tres muestras de L-NIBC-AuC con diferentes tamaños de partícula, el pico de absorción por efecto plasmón superficial a 520 nm desapareció, y aparecieron dos picos de absorción evidentes por encima de 560 nm y las posiciones de los picos de absorción variaron ligeramente con los tamaños de partícula de los AuC. Esto se debe a que los AuC presentan propiedades similares a las de las moléculas debido al colapso de la estructura cúbica centrada en la cara, lo que conduce a la discontinuidad de la densidad de estados de los AuC, la división del nivel de energía, la desaparición del efecto de resonancia del plasmón y la aparición de un nuevo pico de absorción en la dirección de onda larga. Se puede concluir que las tres muestras de polvo de diferentes tamaños de partícula obtenidas anteriormente son todas AuC ligados a ligandos.
2.2.3 Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier
Los espectros infrarrojos se midieron en un espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier VERTEX80V fabricado por Bruker en modo de reflexión total en alto vacío de polvo sólido. El intervalo de barrido está comprendido entre 4000 y 400 cm'1 y el número de barridos es de 64. Tomando como ejemplo las muestras de L-NIBC-AuC, las muestras de ensayo eran polvo seco de L-NIBC-AuC con tres tamaños de partícula diferentes y la muestra de control era polvo puro de L-NIBC. Los resultados se muestran en la FIG. 3.
La FIG. 3 muestra el espectro infrarrojo de L-NIBC-AuC con diferentes tamaños de partícula. En comparación con el L-NIBC puro (curva inferior), las vibraciones de estiramiento S-H de los L-NIBC-AuC con diferentes tamaños de partícula desaparecieron por completo en 2500-2600 cm-1, mientras que se siguieron observando otros picos característicos del L-NIBC, lo que demuestra que las moléculas de L-NIBC se unieron con éxito a la superficie de los AuC a través del enlace Au-S. La figura también muestra que el espectro infrarrojo de los AuC ligados al ligando es irrelevante con su tamaño.
Los AuC unidos con otros ligandos se prepararon por un método similar al anterior, salvo que se ajustaron ligeramente el disolvente de la solución B, la relación de alimentación entre HAuCU y el ligando, el tiempo de reacción y la cantidad de NaBH<4>añadida. Por ejemplo cuando se utiliza L-cisteína, D-cisteína, N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC) o N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC) como ligando, se selecciona ácido acético como disolvente; cuando se utiliza dipéptido CR, dipéptido RC o l-[(2S)-2-metil-3-tiol-l-oxopropil]-L-prolina como ligando, se selecciona agua como disolvente, y así sucesivamente; los demás pasos son similares, por lo que no se proporcionan más detalles en el presente documento.
La presente invención preparó y obtuvo una serie de AuC ligados a ligandos mediante el método anterior. Los ligandos y los parámetros del proceso de preparación se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Parámetros de re aración de AuC unidos con diferentes li andos en la resente invención
Las muestras enumeradas en la tabla 1 se confirman mediante los métodos anteriores. Las características de seis diferentes AuC ligados a ligandos se muestran en la FIG. 4 (CR-AuC), en la FIG. 5 (RC-AuC), en la FIG. 6 (Cap-AuC) (Cap denota l-[(2S)-2-metil-3-tiol-l-oxopropil]-L-prolina), en la FIG. 7 (GSH-AuC), en la FIG. 8 (D-NIBC-AuC), y en la FIG. 9 (L-Cys-AuC). Las FIG. 4 a FIG. 9 muestran espectros UV (panel A), espectros infrarrojos (panel B), imágenes MET (panel C) y distribución del tamaño de las partículas (panel D).
Los resultados indican que los diámetros de los AuC unidos con diferentes ligandos obtenidos a partir de la tabla 1 son todos inferiores a 3 nm. Los espectros ultravioleta también muestran la desaparición del pico a 520±20 nm y la aparición de un pico de absorción en otras posiciones. La posición del pico de absorción podría variar con los ligandos y los tamaños de las partículas, así como con las estructuras. En determinadas situaciones, no existe un pico de absorción especial, debido principalmente a la formación de mezclas de AuC con partículas de diferentes tamaños y estructuras o a determinados AuC especiales que desplazan la posición del pico de absorción más allá del rango del espectro UV-visible. Mientras tanto, los espectros infrarrojos por transformada de Fourier también muestran la desaparición del pico de absorción infrarroja del ligando tiol (entre las líneas punteadas del panel B de las FIG. 4-8), mientras que los demás picos infrarrojos característicos se mantienen, lo que sugiere que todas las moléculas de ligando se han unido con éxito a los átomos de oro para formar AuC ligados a ligandos, y la presente invención ha obtenido con éxito AuC ligados con los ligandos enumerados en la tabla 1.
Realización 3
3.1 Materiales y animales
3.1.1 Muestra de ensayo
A-01: agrupaciones de oro unidas al ligando L-NIBC (L-NIBC-AuC), 0,9 ±0,2 nm.
A-02: agrupaciones de oro unidas al ligando L-NIBC (L-NIBC-AuC), 1,9 ±0,5 nm.
B-01: agrupaciones de oro unidas al ligando L-cis (L-cis-AuC), 1,0 ±0,2 nm.
B-02: agrupaciones de oro unidas al ligando L-cis (L-cis-AuC), 1,7 ±0,3 nm.
C: Nanopartículas modificadas con L-NIBC (L-NIBC-AuNP), 6,3 ±1,5 nm
Todas las muestras de ensayo se prepararon siguiendo el método descrito anteriormente con ligeras modificaciones, y su calidad se caracterizó utilizando los métodos descritos anteriormente.
3.1.2 Muestra de control positiva
Sorafenib.
3.1.3 Animales para experimentos y grupos
Se adquirieron 120 ratones SPF macho C57BL/6N, de 6-8 semanas de edad y 16-20 g de peso corporal, a Beijing Huafukang Experimental Animal Technology Co., Ltd. ltd. (número de licencia de producción: SCXK (Jing) 2019-0008). Según el peso corporal, se dividieron aleatoriamente en 12 grupos(n= 10): grupo de control en blanco, grupo modelo, grupo de control positivo, grupo de dosis baja A-01, grupo de dosis alta A-01, grupo de dosis baja A-02, grupo de dosis alta A-02, grupo de dosis baja B-01, grupo de dosis alta B-01, grupo de dosis baja B-02, grupo de dosis alta B-02 y grupo de dosis alta C.
3.2 Protocolo de modelización
A excepción del grupo de control en blanco, el modelo de cirrosis hepática de los ratones de los demás grupos se preparó mediante el método de tratamiento de inducción con tetracloruro de carbono (CCD). El protocolo de modelado fue el siguiente: (1) A cada ratón se le inyectó por vía intraperitoneal CCl<4>al 10 % (diluido con aceite de oliva) a razón de 7 |jl/g de peso corporal, dos veces por semana durante un total de 8 semanas; a los ratones del grupo de control en blanco se les inyectó por vía intraperitoneal la misma cantidad de disolvente de aceite de oliva. (2) A partir de la 6.a semana, se seleccionaron dos ratones y se sacrificaron 48 horas después de la última inyección cada semana. Se observó el aspecto del hígado. Una vez que el aspecto se ajustaba a las características de la cirrosis (la 8.a semana), se fijó el tejido hepático con formol. La tinción HE y la tinción de Masson se utilizaron para evaluar el modelo de cirrosis.
3.3 Administración
Después de la modelización exitosa, se administró a los ratones del grupo de control positivo 25 mg/kg de sorafenib por vía intragástrica; a los ratones de los grupos de dosis baja o alta de A-01, A-02, B-01 y B-02 se les administró mediante inyección intraperitoneal 2,5 o 10 mg/kg, respectivamente, del material de prueba correspondiente; a los ratones del grupo de dosis alta de C se les administró por inyección intraperitoneal una dosis de 40 mg/kg de C; y a los ratones del grupo de control en blanco y del grupo modelo se les administró intraperitonealmente solución salina fisiológica a 10 ml/kg. La administración se realizó una vez al día durante 20 días consecutivos.
3.4 Pruebas bioquímicas
Una vez finalizada la administración, se extrajo sangre de la órbita del ratón y se obtuvieron sueros para realizar pruebas bioquímicas de albúmina (ALbumin, ALB), bilirrubina total (TBil), alanina alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y monoaminooxidasa (MAO) utilizando el kit Zhongsheng Beikong y un analizador bioquímico (Siemens). El método de detección se realizó siguiendo estrictamente las instrucciones del kit.
La tabla 2 muestra la información sobre los roductos de los kits utilizados ara las ruebas bio uímicas
3.5 Examen patológico
3.5.1 Tinción HE
Tras la eutanasia, las muestras de tejido hepático de ratón se fijaron con paraformaldehído al 4% durante más de 48 h. Tras la fijación, las muestras de hígado se deshidrataron con alcohol en gradiente y se trataron con xileno y etanol. A continuación, los tejidos hepáticos se sumergieron en cera y se incrustaron. Después de recortar, fijar y reparar el material incrustado, los tejidos hepáticos se cortaron con un microtomo de parafina, y los cortes tenían un grosor de 4 |jm. El proceso principal de la tinción HE es el siguiente: Tras cocerlas en el horno a 65 °C, las láminas se trataron con xileno y se deshidrataron con etanol en gradiente. Los cortes se tiñeron secuencialmente con hematoxilina, solución potenciadora del color azul y eosina al 0,5 %, después se trataron con etanol y xileno en gradiente y se sellaron con goma neutra. La fibrosis del tejido hepático se observó con un microscopio.
3.5.2 Tinción de Masson
Tras el horneado, las láminas de tejido de hígado de ratón se desparafinaron y deshidrataron. Tras la cromización, el núcleo se tiñó con la solución de tinción de hematoxilina de Regaud. Tras lavarlas con agua, las láminas se tiñeron con fucsina ácida roja Ponceau de Masson, se sumergieron en una solución acuosa de ácido acético glacial al 2 % y se diferenciaron con una solución de ácido fosfomolíbdico al 1 %. Después de teñirlas directamente con una solución de azul de anilina o verde claro, las láminas se sumergieron durante un rato en una solución acuosa de ácido acético glacial al 0,2 %, se transparentaron con alcohol al 95 %, alcohol anhidro y xileno, y se sellaron con goma neutra. El tejido hepático se observó con un microscopio.
3.6 Resultados
3.6.1 Modelización con éxito
Los hígados de los ratones del grupo modelo estaban divididos en masas redondas u ovaladas de diferentes tamaños por la proliferación de septos fibrosos. Los índices séricos de ALT, TBil y AST aumentaron significativamente en comparación con el grupo de control en blanco, el suero ALB disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control en blanco, y el índice MAO no presentó diferencias significativas con respecto al grupo de control, pero su valor también aumentó. Todos los resultados anteriores sugieren que este modelado experimental fue un éxito.
3.6.2 Efectos de los medicamentos de ensayo sobre la alanina aminotransferasa (ALT), la bilirrubina total (TBil), la aspartato aminotransferasa (AST), la monoaminooxidasa (MAO) y la albúmina (ALB)
3.6.2.1 Fármacos de ensayo A-01 y A-02
Como se muestra en la FIG. 10A, la actividad ALT del grupo modelo es extremadamente superior a la del grupo de control en blanco (aumentó de 43,5±8,1 U/L a 188,5±4,9 U/L;P<0,01), lo que indica que las funciones hepáticas de los ratones cirróticos modelo presentaban cambios patológicos. Después de la administración de A-01 y A-02 en dosis altas y bajas, la actividad de ALT de todos los grupos tratados disminuyó significativamente (la más alta es 41,5±5,4 U/L para el grupo de dosis baja de A-02; la más baja es 30,0±5,9 U/L para el grupo de dosis alta de A-01; y 42,8±5,4 U/L para el grupo de control positivo), y regresó al nivel similar del grupo de control en blanco o incluso más bajo, que es significativamente diferente de la del grupo modelo(P<0,01).
Como se muestra en la FIG. 10B, la actividad de AST en suero del grupo modelo aumentó significativamente en comparación con el grupo de control en blanco (aumentó de 141,9±13,5 u /l a 192,0±11,3 U/L;P<0,05). Después de la administración de A-01 y A-02, la actividad AST de todos los grupos tratados disminuyó, donde la administración de dosis altas de A-01 y A-02 redujo significativamente la actividad AST (130±12,8 U/L para el grupo de dosis alta de A-01; 131,3±9,9 U/L para el grupo de dosis alta de A-02; ambosP<0,01), obviamente superior al grupo de control positivo (165,5±11,6 U/L).
Como se muestra en la FIG. 10C, la concentración de TBil del grupo modelo fue significativamente mayor que la del grupo de control en blanco (aumentó de 1,02±0,20 pmol/l a 2,91±0,39 pmol/l), y hubo una diferencia significativa con respecto al grupo de control en blanco(P<0,01). Después de la administración de dosis altas y bajas de A-01 y A-02, las concentraciones de TBil fueron todas significativamente reducidas (la más alta es 0,91±0,13 pmol/l; la más baja es 0,78±0,25 pmol/l); están en el nivel similar del grupo de control en blanco, pero son extremadamente significativamente diferentes del grupo modelo(P<0,01).
Como se muestra en la FIG. 10D, la actividad MAO del grupo modelo se incrementa en comparación con el grupo de control en blanco (18,8±2,9 U/L para el grupo de control en blanco; 21,5±0,7 U/L para el grupo modelo), pero no hay diferencia estadística, lo que sugiere que los cambios de la actividad MAO en los ratones con cirrosis inducida por tetracloruro de carbono no son significativos. La administración de A-01 y A-02 no afectó significativamente la actividad de MAO de todos los grupos tratados, pero la actividad de MAO de todos los grupos tratados disminuyó (el más alto es 19,3±1,5 U/L y el más bajo es 18,5±1,9 U/L); están en el similar al nivel del grupo de control en blanco. En comparación, la actividad MAO del grupo de control positivo no disminuyó (21,3±2,1 U/L). Este resultado sugiere que A-01 y A-02 pueden ajustar la actividad de MAO al nivel del grupo de control en blanco, desempeñando un papel en la recuperación de las funciones hepáticas en ratones con cirrosis.
Como se muestra en la FIG. 10E, el nivel de ALB del grupo modelo disminuye significativamente en comparación con el grupo de control en blanco (disminuyó de 24,2±0,6 g/l a 22,1±1,3 g/l), y hay una diferencia significativa con el grupo de control en blanco (P<0.05), mostrando que la administración de tetracloruro de carbono puede disminuir significativamente los niveles séricos de ALB. La administración de diferentes dosis de A-01 y A-02, y el control positivo d no afectó significativamente a los niveles séricos de ALB.
El fármaco sorafenib positivo redujo significativamente los niveles de ALT, AST y TBIL, pero puede no tener un efecto de alivio en ratones cirróticos para el índice MAO. Los resultados sugieren que A-01 y A-02 tienen un efecto reparador sobre la función hepática en ratones cirróticos, y el efecto es mejor que el del fármaco de control positivo.
3.6.2.2 Drogas de ensayo B-01 y B-02
Como se muestra en la FIG. 11 A, las dosis bajas y altas de B-01 y B-02 pudieron reducir significativamente la actividad de ALT (la más alta es 46,3±7,4 U/L; la más baja es 33,0±7,1 U/L); están en el nivel similar al del grupo de control en blanco, pero significativamente diferente del grupo modelo (188,5±4,9 U/L;P<0,01).
Como se muestra en la FIG. 11B, en comparación con el grupo modelo (192,0±11,3 U/L), la administración de dosis bajas de B-01 puede reducir significativamente la actividad de AST a niveles normales (132,3±10,0 U/L y 129,7±26,6 U/L respectivamente; P<0,01), y la administración de dosis bajas de B-02 puede reducir significativamente la actividad de AST (149,6±21,8 U/L; P<0,05); están en un nivel similar al del grupo de control en blanco. Sin embargo, la administración de altas dosis de B-02 reduce la actividad de AST en cierta medida, pero no hubo diferencias significativas (P> 0,05). En comparación, el fármaco positivo sorafenib también puede disminuir la actividad AST a 165,5±11,6 U/L (P<0,05), pero el efecto no es tan bueno como la administración de B-01 dosis baja y alta y B-02 dosis baja.
Como se muestra en la FIG. 11C, las dosis bajas y altas de B-01 y B-02 redujeron todas significativamente el TBil (la más alta es de 1,28±0,12 pmol/l; la más baja es de 0,96±0,15 pmol/l); están en un nivel similar al del grupo de control en blanco (1,02±0,20 pmol/l), pero son significativamente diferentes del grupo modelo (2,91±0,39 pmol/l; P<0,01).
Como se muestra en la FIG. 11D, en comparación con el grupo modelo (21,5±0,7 U/L), la dosis baja de B-01 (17,3±1,3 U/L; P<0,01) y la dosis alta de B-02 (18,3±0,6 U/L; P<0,05) redujeron significativamente los niveles séricos de MAO al grupo de control en blanco (18,8±2,9 U/L), pero el medicamento de control positivo no tiene efecto en el nivel sérico de MAO (21,3±2,1 U/L).
Como se muestra en la FIG. 11E, la administración de los fármacos de prueba y del fármaco de control positivo no tuvo ningún efecto significativo sobre los niveles de ALB.
Los resultados anteriores muestran que B-01 y B-02 reducen significativamente los niveles de ALT, AST, TBIL y MAO, y tienen un cierto efecto dependiente de la dosis en la recuperación de la función hepática de ratones cirróticos, y sus efectos son al menos en algunos indicadores mejores que los fármacos de control positivo.
3.6.2.3 Drogas de ensayo C
Como se muestra en la FIG. 12, en comparación con el grupo modelo, la administración de la dosis alta del fármaco C no tiene una mejora significativa en los niveles de (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO y (E) ALB en comparación con el grupo de control modelo, e incluso muestra una tendencia de cierto deterioro, lo que sugiere que el fármaco C es ineficaz para mejorar las funciones hepáticas de los ratones cirróticos y podría ser tóxico.
3.6.3 Análisis patológicos
La cirrosis hepática se caracteriza patológicamente por fibrosis difusa del tejido hepático y la formación de pseudolobulillos. Los resultados del análisis patológico mediante tinción HE mostraron que, como se observa en la FIG. 13A, el tejido hepático normal de los ratones del grupo de control en blanco tenía una estructura clara, lobulillos hepáticos intactos, hepatocitos dispuestos ordenadamente con una disposición radial centrada en la vena central, núcleo de hepatocitos normal y solo una pequeña cantidad de tejido fibroso en el área de drenaje. Como se muestra en la FIG. 13B, en el tejido hepático del grupo modelo, los hepatocitos estaban desordenados, aparecieron estructuras en forma de globo, los lobulillos hepáticos casi desaparecieron, se formaron abundantemente pseudolobulillos (como indican las flechas orientadas a la derecha en la FIG. 13B) y una gran cantidad de protofibrillas proliferadas estaban presentes en los tejidos hepáticos, formando tabiques fibrosos redondos u ovalados (como indican las flechas orientadas a la izquierda en la FIG. 13B). Como se muestra en la FIG. 13C, en comparación con el grupo de control modelo, el grupo de control positivo mostró una reducción significativa de los daños hepáticos; los hepatocitos evidentemente tenían una disposición ordenada; la hiperplasia fibrosa, aunque aumentada, se redujo notablemente, no formando tabiques fibrosos; los pseudolobulillos casi desaparecieron; pero en comparación con los tejidos hepáticos normales, los tejidos hepáticos en el grupo de control positivo mostraron aumentos aparentes de los espacios intercelulares (como indican las flechas orientadas hacia abajo). En comparación con el grupo de control modelo, los 4 grupos tratados con los fármacos de agrupaciones de oro (A-01, A-02, B-01 y B-02) mostraron que sus hepatocitos se recuperaron significativamente de los daños hepáticos, como lo demuestra la reducción evidente de la hiperplasia fibrosa y los pseudolobulillos, y que la recuperación depende de la dosis hasta cierto punto.
Las FIG. 13D y 13E muestran las imágenes de HE que reflejan los efectos de la administración de las dosis baja y alta del fármaco A-01 respectivamente en la recuperación de los daños hepáticos. Como se muestra en la FIG. 13D, el grupo de administración de la dosis baja del fármaco A-01 mostró una disposición relativamente ordenada de los hepatocitos, casi desaparición de pseudolobulillos, una reducción evidente de la hiperplasia fibrosa, pero los espacios entre los hepatocitos, en comparación con los tejidos hepáticos normales, están aumentados en cierta medida (como se indica con las flechas orientadas hacia abajo en la FIG. 13D). Como se muestra en la FIG. 13E, en comparación con el grupo de administración de la dosis baja del fármaco A-01, el grupo de administración de la dosis alta del fármaco A-01 tuvo efectos aún mejores en la reducción de los daños hepáticos, con desaparición completa de los pseudolobulillos, sin observación de hiperplasia fibrosa, sin aumentos discernibles de los espacios inter-hepatocitarios y sin diferencia aparente con los tejidos hepáticos normales. En conclusión, el fármaco A-01 mostró mejores efectos en la recuperación de los daños hepáticos que el fármaco de control positivo.
Los resultados de la tinción de Masson arrojaron las mismas conclusiones que los de la tinción de HE.
Los otros 3 fármacos también mostraron efectos similares del fármaco A-01; no es necesaria una descripción detallada.
En resumen, los cuatro fármacos de prueba A-01, A-02, B-01 y B-02 redujeron significativamente la hiperplasia fibrosa hepática y los pseudolóbulos hepáticos. Los resultados de las pruebas de los indicadores de la función hepática también mostraron la recuperación de la función hepática. Los cambios más significativos fueron la alanina aminotransferasa (ALT) y la bilirrubina total (TBil). La aspartato aminotransferasa (AST) y la monoaminooxidasa (MAO) también se recuperaron significativamente, mientras que la albúmina (ALB) no experimentó cambios significativos. Los cuatro fármacos de las agrupaciones de oro pueden mejorar significativamente la función hepática y parte de la estructura patológica del hígado en ratones cirróticos, y los efectos totales son superiores a los del fármaco de control positivo sorafenib, lo que proporciona una base experimental para su aplicación en el futuro. Sin embargo, el fármaco C no tiene un efecto terapéutico evidente y no puede utilizarse para el tratamiento de la cirrosis hepática.
Realización 4
4.1 Materiales y animales
4.1.1 Muestra de ensayo
D: agrupaciones de oro unidas al ligando L-NAC (L-NAC-AuC), 0,5-3 nm.
E: agrupaciones de oro unidas al ligando CR (CR-AuC), 0,5-3 nm.
F: agrupaciones de oro unidas al ligando RC (RC-AuC), 0,5-3 nm.
Todas las muestras de ensayo se prepararon siguiendo el método descrito anteriormente con ligeras modificaciones, y su calidad se caracterizó utilizando los métodos descritos anteriormente.
4.1.2 Animales para experimentos y grupos
Se adquirieron 50 ratones SPF macho C57BL/6N, de 6-8 semanas de edad y 16-20 g de peso corporal, a Beijing Huafukang Experimental Animal Technology Co., Ltd. ltd. (número de licencia de producción: SCXK (Jing) 2019-0008). Según el peso corporal, se dividieron aleatoriamente en 5 grupos(n= 10): grupo de control en blanco, grupo modelo, grupo de administración del fármaco D, grupo de administración del fármaco E y grupo de administración del fármaco F.
4.2 Protocolo de modelización
A excepción del grupo de control en blanco, el modelo de cirrosis hepática de los ratones de los demás grupos se preparó mediante el método de tratamiento de inducción con tetracloruro de carbono (CCU). El protocolo de modelado fue el siguiente: (1) A cada ratón se le inyectó por vía intraperitoneal CCl<4>al 10 % (diluido con aceite de oliva) a razón de 7 |jl/g de peso corporal, dos veces por semana durante un total de 8 semanas; a los ratones del grupo de control en blanco se les inyectó por vía intraperitoneal la misma cantidad de disolvente de aceite de oliva. (2) A partir de la 6.a semana, se seleccionaron dos ratones y se sacrificaron 48 horas después de la última inyección cada semana. Se observó el aspecto del hígado. Una vez que el aspecto se ajustaba a las características de la cirrosis (la 8.a semana), se fijó el tejido hepático con formol. La tinción HE y la tinción de Masson se utilizaron para evaluar el modelo de cirrosis.
4.3 Administración
Tras el modelado satisfactorio, los ratones de los tres grupos de administración de fármacos recibieron por inyección intraperitoneal una dosis de 40 mg/kg respectivamente de los correspondientes fármacos de agrupaciones de oro; y a los ratones del grupo de control en blanco y del grupo modelo se les administró por vía intraperitoneal solución salina fisiológica a 10 ml/kg. La administración se realizó una vez al día durante 20 días consecutivos.
4.4 Pruebas bioquímicas
Los reactivos y protocolos fueron los mismos que los descritos en la sección 3.4.
4.5 Resultados
4.5.1 Modelización con éxito
Los hígados de los ratones del grupo modelo estaban divididos en masas redondas u ovaladas de diferentes tamaños por la proliferación de septos fibrosos. Los índices séricos de ALT, TBil y AST aumentaron significativamente en comparación con el grupo de control en blanco, el suero ALB disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control en blanco, y el índice MAO no presentó diferencias significativas con respecto al grupo de control, pero su valor también aumentó. Todos los resultados anteriores sugieren que este modelado experimental fue un éxito.
4.5.2 Efectos de los medicamentos de ensayo sobre la alanina aminotransferasa (ALT), la bilirrubina total (TBil), la aspartato aminotransferasa (AST), la monoaminooxidasa (MAO) y la albúmina (ALB)
Como se muestra en la FIG. 14A, la actividad ALT del grupo modelo es extremadamente superior a la del grupo de control en blanco(P<0,01**), lo que indica que las funciones hepáticas de los ratones cirróticos modelo presentaban cambios patológicos. Tras la administración de los fármacos D, E o F, la actividad ALT de todos los grupos tratados disminuyó significativamente, y volvió al nivel similar del grupo de control en blanco, que es significativamente diferente de la del grupo modelo(P<0,01).
Como se muestra en la FIG. 14B, la actividad AST del grupo modelo es significativamente mayor que la del grupo de control en blanco(P<0,05*). Tras la administración de los fármacos D, E o F, la actividad a St de todos los grupos tratados disminuyó significativamente(P<0,05*).
Como se muestra en la FIG. 14C, la concentración de TBil del grupo modelo es significativamente mayor que la del grupo de control en blanco(P<0,01**). Tras la administración de los fármacos D, E o F, la concentración de TBil de todos los grupos tratados disminuyó significativamente hasta el nivel del grupo de control en blanco, pero son significativamente diferentes de las del grupo de control modelo(P<0,01**).
Como se muestra en la FIG. 14D, la actividad MAO del grupo modelo aumentó en comparación con el grupo de control en blanco, pero no hay diferencia estadística(P>0,5), lo que sugiere que los cambios de la actividad MAO en los ratones con cirrosis inducida por el tetracloruro de carbono no son significativos. La administración de los fármacos D, E o F no afectó significativamente a la actividad de la MAO, pero la actividad de la MAO de todos los grupos de administración de fármacos disminuyó hasta el nivel del grupo de control en blanco.
Como se muestra en la FIG. 14E, la concentración de ALB del grupo modelo disminuye en comparación con la del grupo de control en blanco, pero la diferencia no es significativa(P>0,05). Sin embargo, la administración de los fármacos D, E o F aumentó la concentración sérica de ALB, pero la diferencia no es significativa(P>0,05).
En resumen, las tres agrupaciones de fármacos de oro D, E y F mejoraron significativamente la función hepática. La alanina aminotransferasa (ALT) y la bilirrubina total (TBil) mostraron los cambios más significativos, la aspartato aminotransferasa (AST) y la monoaminooxidasa (MAO) mostraron una recuperación evidente, y la albúmina (ALB) también mejoró, aunque no de forma significativa. Estos resultados proporcionan una base experimental para futuras aplicaciones.
Otros tamaños de L-Cys-AuC, L-NIBC-AuC, L-NAC-AuC, CR-AuC, RC-AuC, y otros AuC ligados a ligandos con diferentes tamaños también tienen efectos similares, aunque sus efectos varían en cierta medida. No se describirán aquí en detalle.
Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, se entenderá que las realizaciones son ilustrativas y que el alcance de la invención no está tan limitado. Las realizaciones alternativas de la presente invención serán evidentes para aquellos que tengan conocimientos ordinarios en el campo al que pertenece la presente invención. Tales realizaciones alternativas se consideran incluidas en el ámbito de la presente invención. Por consiguiente, el alcance de la presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas y se apoya en la descripción anterior.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una agrupación de oro unido a un ligando para su uso en el tratamiento de la cirrosis hepática, en donde la agrupación de oro unido a un ligando comprende:
un núcleo de oro; y
un ligando unido al núcleo de oro;
caracterizada por que, el núcleo de oro tiene un diámetro en el intervalo de 0,5-3 nm;
el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en L-cisteína y sus derivados, D-cisteína y sus derivados y oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados;
la L-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo que consiste en L-cisteína, N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC) y N-acetil-L-cisteína (L-NAC); la D-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo que consiste en D-cisteína, N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC) y N-acetil-D-cisteína (D-NAC); y
los oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados son dipéptidos que contienen cisteína, tripéptidos que contienen cisteína o tetrapéptidos que contienen cisteína.
2. La agrupación de oro unido a ligando para su uso de la reivindicación 1, en donde el núcleo de oro tiene un diámetro en el intervalo de 0,5-2,6 nm.
3. La agrupación de oro unido a ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dipéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en dipéptido de L(D)-cisteína-L(D)-arginina (CR), dipéptido de L(D)-arginina-L(D)-cisteína (RC), dipéptido de L(D)-histidina-L(D)-cisteína (HC) y dipéptido de L(D)-cisteína-L(D)-histidina (CH).
4. La agrupación de oro unido a ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los tripéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en tripéptido de glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GCR), tripéptido de L(D)-prolina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (PCR), tripéptido de L(D)-lisina-L(D)-cisteína-L(D)-prolina (KCP) y L(D)-glutatión (GSH).
5. La agrupación de oro unido a ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los tetrapéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en tetrapéptido de glicina-L(D)-serina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GSCR) y tetrapéptido de glicina-L(D)-cisteína-L(D)-serina-L(D)-arginina (GCSR).
6. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la cirrosis hepática, en donde la composición farmacéutica comprende una agrupación de oro unida a ligando y un excipiente farmacéuticamente aceptable, y la agrupación de oro unida a ligando comprende:
un núcleo de oro; y
un ligando unido al núcleo de oro;
caracterizada por que, el núcleo de oro tiene un diámetro en el intervalo de 0,5-3 nm;
el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en L-cisteína y sus derivados, D-cisteína y sus derivados y oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados;
la L-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo que consiste en L-cisteína, N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC) y N-acetil-L-cisteína (L-NAC); la D-cisteína y sus derivados se seleccionan del grupo que consiste en D-cisteína, N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC) y N-acetil-D-cisteína (D-NAC); y
los oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados son dipéptidos que contienen cisteína, tripéptidos que contienen cisteína o tetrapéptidos que contienen cisteína.
7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el núcleo de oro tiene un diámetro en el intervalo de 0,5-2,6 nm.
8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los dipéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en dipéptido de L(D)-cisteína-L(D)-arginina (CR), dipéptido de L(D)-arginina-L(D)-cisteína (RC), dipéptido de L(D)-histidina-L(D)-cisteína (HC) y dipéptido de L(D)-cisteína-L(D)-histidina (CH).
9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los tripéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en tripéptido de glicina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GCR), tripéptido de L(D)-prolina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (PCR), tripéptido de L(D)-lisina-L(D)-cisteína-L(D)-prolina (Kc P) y L(D)-glutatión (GSH).
10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los tetrapéptidos que contienen cisteína se seleccionan del grupo que consiste en tetrapéptido de glicina-L(D)-serina-L(D)-cisteína-L(D)-arginina (GSCR) y tetrapéptido de glicina-L(D)-cisteína-L(D)-serina-L(D)-arginina (GCSR).
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