ES2986334T3 - Gen modificado que confiere resistencia al virus - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un gen RDR1 modificado capaz de conferir resistencia a virus a una planta y/o aumentar la resistencia a virus en una planta, cuya modificación da como resultado una expresión mejorada del gen RDR1, y en donde la modificación se selecciona de una modificación que aumenta el nivel de ARNm del gen RDR1; una modificación que aumenta el nivel de la proteína RDR1; y/o una modificación que aumenta la actividad de la proteína RDR1, en comparación con un gen RDR1 de tipo salvaje no modificado. La modificación puede comprender una modificación aguas arriba de la secuencia codificante del gen RDR1, tal como una modificación de un elemento regulador, preferiblemente de un elemento regulador que actúa en cis. El elemento regulador modificado se selecciona, por ejemplo, de un sitio de unión de factor de transcripción para un represor transcripcional, cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de represión transcripcional; y/o un sitio de unión de factor de transcripción para un activador transcripcional, cuya modificación conduce a la inducción o mejora de la transcripción; y/o un sitio de unión de microARN, cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de represión génica; y/o una pequeña secuencia de ARN, cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de la represión genética. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Gen modificado que confiere resistencia al virus
La presente invención se refiere a un genRDRmodificado que es capaz de conferir y/o aumentar la resistencia al virus a una planta. También se describe en la presente memoria el uso de dicho genRDRmodificado para conferir y/o aumentar la resistencia al virus a una planta.
Los virus son uno de los principales grupos de patógenos que atacan a las plantas, lo que produce efectos negativos que influyen en aspectos relevantes de los cultivos, como el crecimiento de las plantas, el vigor de las plantas, la calidad del producto y el potencial de rendimiento. Como la mayoría de los eucariotas, las plantas han establecido mecanismos de defensa activos contra los patógenos invasores, entre los que se encuentran los virus.
Además de las barreras estructurales y físicas, como las paredes celulares, que protegen a las plantas contra los patógenos, actualmente se reconocen aproximadamente tres tipos de sistemas inmunitarios de las plantas. El primer tipo responde a moléculas de muchas clases de microbios, usando receptores de reconocimiento de patrones transmembrana (PPR) que pueden reaccionar a los patrones moleculares asociados a microbios (MAMP) y a los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP).
El segundo tipo de sistema inmunitario vegetal usa los productos proteicos polimórficos NB-LRR (repetición rica en leucina que se une a nucleótidos) codificados por genes de resistencia (R). Las proteínas NB-LRR son capaces de detectar proteínas efectoras de patógenos o su actividad a partir de diversas fuentes. Por el lado del patógeno, una proteína o efector de avirulencia (Avr) específico, codificado por los genes Avr, desencadena las respuestas inmunitarias mediadas por la proteína R de la planta huésped. El genRy la acción/reacción delAvrprovocan la respuesta de hipersensibilidad (HR), una de las reacciones más comunes de las plantas a muchos tipos de organismos patógenos. Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de varios genesRclonados y sus correspondientes proteínas Avr, todavía no está del todo claro cómo su huésped reconoce las proteínas Avr patógenas.
Un tercer mecanismo de defensa importante que usan las plantas para defenderse de los virus u otros patógenos se basa en el silenciamiento o la interferencia del ARN. El silenciamiento del ARN se refiere a una clase de efectos de silenciamiento génico mediante los cuales la expresión de uno o más genes es regulada negativamente o suprimida por completo por los ARN pequeños. Se han identificado varias familias de genes y sus familias de proteínas relacionadas como componentes del sistema silenciador del ARN. Entre ellos se encuentran los genes Dicer(DCR),los genes tipo Dicer(DCL),los genes de nucleasa Argonaute(AGO)y los genes de ARN polimerasa(RDR)dependientes de ARN. Cada una de esas familias de genes contiene varios miembros, que pueden actuar en diferentes combinaciones en diferentes especies y tienen su propia funcionalidad y tipo de interacción particulares contra patógenos o grupos de patógenos específicos.
Tras la infección viral de la planta huésped, un virus de ARN establece la replicación viral, lo que resulta en la presencia de ARNbc derivado del virus. Este ARNbc activa el sistema silenciador del ARN de la planta al funcionar como sustrato para una proteína DCL específica, una endorribonucleasa, que escinde el ARNbc en fragmentos cortos de longitudes típicas que oscilan entre 20 y 25 pares de bases. Tras un procesamiento posterior, las formas monocatenarias de estos fragmentos cortos de ARNip derivados de virus se cargan en una proteína AGO, que forma parte del complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de la planta huésped. En el RISC, las proteínas AGO usan el ARNip como molde guía que, en última instancia, resulta en la degradación del ARN viral a través de una serie de procesos de reconocimiento y escisión.
Se cree que los genesRDRdesempeñan un papel en este sistema inmunitario al aumentar la producción de sustratos de ARNbc específicos del virus para las proteínas DCL mediante la síntesisde novo.La acumulación de ARNip resultante aumenta entonces presuntamente la eficacia con la que se produce el reconocimiento del ARN viral, que, en consecuencia, puede silenciarse o degradarse más activamente.
Como contramedida, muchos virus han desarrollado un sistema para eludir o inhibir las vías de silenciamiento del ARN, mediante la activación de los supresores del silenciamiento del ARN (RSS). La presencia de un RSS particular puede contribuir a la inhibición de la defensa de la planta, lo que a su vez vuelve a permitir la replicación del genoma viral y la propagación en la planta huésped diana, lo que facilita una mayor infección.
El equilibrio entre las rutas silenciadoras y supresoras de una determinada planta y un virus en particular desempeña un papel importante a la hora de determinar si un virus logrará establecer una infección o si la planta demostrará ser lo suficientemente fuerte como para ser total o suficientemente resistente para resistir el ataque.
Si bien se ha reconocido la participación de los diversos genes mencionados en los sistemas de inmunidad de las plantas como tales, gran parte de los mecanismos reguladores, las relaciones entre esos genes y las formas en que funcionan las diferentes proteínas sigue siendo difícil de entender. Además, no se ha resuelto la contribución de los genes individuales al silenciamiento viral, al tiempo que supera el antisilenciamiento del patógeno. Además, aún se están realizando más investigaciones para desentrañar la estructura de los genes relevantes y la forma en que se regula su expresión.
En consecuencia, no está claro qué gen que está implicado en la ruta de silenciamiento del ARN sería un candidato preferido como objetivo para inducir resistencia contra patógenos, en particular contra virus, y de qué manera debería modificarse para obtener el efecto deseado.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un medio para conferir resistencia al virus a una planta.
Durante la investigación que condujo a la presente invención, se detectó una modificación en un genRDR.Esta modificación dio como resultado la expresión mejorada del genRDRen comparación con el genRDRde tipo natural. La expresión mejorada se puede detectar como un aumento en el nivel de acumulación de ARNm del genRDR;como un aumento en el nivel de la proteína RDR; y/o como un aumento de la actividad de la proteína RDR.
La familia de genesRDR,que codifica las ARN polimerasas dependientes del ARN, comprende varios miembros. En las plantas, los genesRDRse agrupan comúnmente en cuatro grupos, indicados como grupos I-IV. En muchas plantas hay una combinación de genesRDRen el genoma. El genoma deArabidopsis thalianacodifica seis genesRDR, AtRDRIaAtRDR6,mientras que, por ejemplo, el genoma deOryza sativacontiene 5 genesRDR,incluidosOsrDRIaOsrDR4,como así como elOsSHL2,que está agrupado con elRDR6.Una determinada especie también puede comprender varias copias del genRDRdel mismo grupo, por ejemplo soja(Glycine max),que tiene dos genesRDRIy dos genesRDR2,o sorgo(Sorghum bicolor),que tiene cuatro copias del gen RDR6 en su genoma.
AtRDR3, AtRDR4,yAtRDRSse agrupan en el grupo III, mientras queAtRDR1está en el grupo I,AtRDR2en el grupo II yAtRDR6en el grupo IV. Los genesRDRortólogos de otras especies se agrupan en consecuencia.
Los genes vegetales que pertenecen al grupoRDR1(grupo I), el grupoRDR2(grupo II) y el grupoRDR6(grupo IV) pueden identificarse mediante un motivo DLDGD común altamente conservado en el supuesto dominio catalítico de la proteína codificada, que los distingue de los genesRDRdel grupo III, que contienen un motivo DFDGD común. Los genesRDRcon un motivo DLDGD se agrupan en la claseRDRa,mientras que los genesRDRcon el motivo DFDGD pertenecen a la claseRDRy.Junto al motivo DLDGD, los genes de la claseRDRacomparten varios otros motivos conservados comunes, por los que se pueden agrupar fácilmente en la claseRDRa.La posterior categorización en el grupo I, 11 o IV es más difícil porque, a pesar de los motivos comunes, en los genesRDRse representa una gama bastante amplia de secuencias, incluso si solo se consideran los genesRDRa.Sin embargo, el genRDRde la invención se clasificó como un genRDRI.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un genRDRImodificado, en donde el genRDRImodificado comprende una modificación que da como resultado una expresión mejorada del genRDR1,y en donde que la modificación comprende la deleción de un elemento regulador, cuyo elemento regulador comprende laId. de sec. n.°: 6, y en donde el genRDRImodificado es capaz de conferir y/o aumentar la resistencia contra uno o más virus de la familiaPotyviridaea una planta en la que está presente el genRDRImodificado.
También se describe en la presente memoria un genRDRImodificado capaz de conferir resistencia a una planta y/o aumentar la resistencia al virus en una planta, en donde la modificación se selecciona de una modificación que aumenta el nivel de ARNm del genRDR1;y/o una modificación que aumenta el nivel de la proteína RDR1; y/o una modificación que aumenta la actividad de la proteína RDR1.
Como se usa en la presente memoria, el aumento en un cierto nivel o el aumento en la actividad se compara con un genRDRIde tipo natural no modificado.
Para obtener un efecto relevante, el aumento en el nivel de ARNm es un aumento en el nivel de ARNm en estado estacionario. El aumento del nivel de ARNm en estado estacionario puede deberse a un aumento en la síntesis de ARNm; y/o una disminución en la descomposición del ARNm; y/o un aumento en la estabilidad del ARNm. El nivel de ARNm tal como se menciona en la presente memoria comprende el nivel de acumulación de ARNm.
Sorprendentemente, la expresión mejorada del gen dio como resultado una resistencia al virus y/o una mayor resistencia al virus de una planta que comprende el gen modificado. El mecanismo a través del cual los genes confieren resistencia contra los patógenos es con frecuencia un mecanismo en el que el gen de resistencia se silencia o se reduce su expresión. Ejemplos de genes de resistencia que actúan mediante la reducción de su expresión son el genelf4E,el genDMR6,el gen de la homoserina cinasa, los genesMLOy otros. Por tanto, era inesperado que en la presente invención la actividad del genRDRIaumentara realmente y, por lo tanto, se indujera y/o aumentara la resistencia contra los virus.
En la presente memoria se describe además una modificación que aumenta el nivel de ARNm del genRDRIy/o el nivel de la proteína RDR1 y/o la actividad de la proteína RDR1. Dicha modificación puede comprender una modificación aguas arriba de la secuencia codificante del genRDR1.También se describe en la presente memoria una modificación en la secuencia codificante del genRDRIy/o una modificación posterior de la secuencia codificante del genRDR1.
La mejora de la expresión de un genRDRIse puede lograr de varias maneras. Una opción es la modificación de la región aguas arriba del inicio de la secuencia codificante del gen, región que comprende el promotor y la región 5' no traducida (5'-UTR), también denominada secuencia líder. Dado que estas regiones están implicadas en la regulación de la transcripción génica en ARNm y la posterior traducción y, por lo tanto, en la expresión génica, una modificación adecuada puede conducir a un aumento de la expresión mediante un aumento del nivel de ARNm y/o un aumento del nivel de la proteína.
La expresión del genRDRItambién se puede impulsar mediante la creación de una modificación en la secuencia codificante (CDS) del genRDRI,por lo que el CDS se define como que comprende toda la región entre la 5'-UTR y la 3'-UTR, incluidos los exones y los intrones. Los polimorfismos en el CDS que dan como resultado variantes alélicas del genRDRIde tipo natural son potencialmente capaces de provocar una mejora en la expresión del gen. Las combinaciones de modificaciones individuales en el promotor, el líder y/o el CDS pueden mejorar aún más la expresión y/o la actividad del genRDRI.
Una modificación que aumenta el nivel de ARNm del genRDR1y/o el nivel de la proteína RDR1 y/o la actividad de la proteína RDR1 puede ser una modificación de un elemento regulador de acción cis y/o la modificación de un elemento regulador de acción transactiva.
Los elementos reguladores son esenciales para la transcripción del gen en ARNm y regulan la velocidad de transcripción tanto espacial como temporal, lo que afecta a la expresión de un gen.
Los elementos reguladores que actúan en cis, también abreviados como elementos que actúan en cis o elementos reguladores en cis, normalmente se encuentran cerca de la secuencia génica real que se va a transcribir y, por ejemplo, están presentes habitualmente en la secuencia promotora y en la secuencia líder de un gen, aunque también pueden estar ubicados a una gran distancia aguas arriba o aguas abajo del inicio de la transcripción del gen. Además, la región 3'-UTR que sigue inmediatamente al CDS también puede albergar elementos que actúan en cis, que a menudo, aunque no únicamente, participan en la regulación de la expresión génica postranscripcional. Los elementos reguladores cis incluyen sitios de unión para los factores de transcripción ('sitios de unión a TF'), tanto para los represores transcripcionales como para los activadores, y los sitios diana de los microARN.
Los elementos reguladores de transacción, también denominados factores de transacción, incluyen factores de transcripción y ARN pequeños, por ejemplo microARN. Los factores de transcripción son proteínas que se unen a sitios de unión específicos, es decir, sus correspondientes elementos reguladores en cis, en el ADN y, por tanto, controlan la transcripción de un gen. Los factores de transcripción realizan esta función solos o con otras proteínas de un complejo al promover, como activadores de la transcripción, o al bloquear, como represor de la transcripción, el reclutamiento de la ARN polimerasa hacia genes específicos.
Los microARN son pequeñas moléculas de ARN no codificantes que funcionan en la regulación transcripcional y postranscripcional de la expresión génica mediante el apareamiento de bases con secuencias complementarias dentro de sus moléculas diana de ARNm e induciendo la represión génica mediante, por ejemplo, la degradación de sus transcripciones diana o la prevención de la traducción. Los microARN forman una clase importante de ARN pequeños; ARNip son otra clase de ARN pequeños. Por lo general, los ARN pequeños son generados por genes distintos que no codifican proteínas y, por lo tanto, también se denominan ARN no codificantes. En algunos casos, se han descrito pequeños ARN que se originan a partir de secuencias intrónicas de genes que codifican proteínas y, muy raramente, también de otros elementos.
Los represores transcripcionales influyen negativamente en la transcripción y reducen la expresión génica; los activadores transcripcionales, a su vez, tienen un efecto positivo en la transcripción y, por lo tanto, mejoran la expresión del gen.
La modificación de un represor transcripcional o de su elemento de unión cis-regulador, cuya modificación da como resultado la reducción o ausencia de la represión, puede resultar en un aumento de la transcripción y en un nivel más alto de ARNm. Se espera que una modificación que, por ejemplo, dé como resultado la deleción o la deleción parcial de un represor transcripcional o su elemento de unión tenga el efecto de un aumento en el nivel de ARNm. Además, se espera que una modificación que, por ejemplo, dé como resultado la interrupción de la función de un factor de transcripción que actúa como represor de la transcripción tenga el efecto de un aumento en el nivel de ARNm.
La modificación, por ejemplo la duplicación, de un activador transcripcional o de su elemento de unión cis-regulador también puede resultar en un aumento adicional de la transcripción. Una modificación que conduzca a una mayor tasa de activación o a una activación más eficiente podría conducir a un nivel más alto de ARNm.
La modificación de un ARN pequeño, por ejemplo un microARN, de la secuencia que codifica o genera el ARN pequeño, o de sus sitios diana complementarios en el gen objetivo, puede resultar en consecuencia en una reducción de la represión de la expresión génica del gen objetivo, a través de un aumento en un nivel más alto de ARNm en estado estacionario.
Además, en la presente memoria se describe un genRDRIque comprende un elemento regulador modificado, en donde el elemento regulador se selecciona de un sitio de unión del factor de transcripción para un represor transcripcional, cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de represión transcripcional; y/o un sitio de unión del factor de transcripción para un activador transcripcional, cuya modificación conduce a la inducción o mejora de la transcripción; y/o un sitio de unión al microARN, por lo que la modificación conduce a la reducción o ausencia de represión génica; y/o una secuencia de ARN pequeña, por ejemplo una secuencia de microARN, por lo que la modificación conduce a la reducción o ausencia de represión génica.
También se describe en la presente memoria una modificación que aumenta el nivel de ARNm del genRDRIy/o el nivel de la proteína RDR1 y/o la actividad de la proteína RDR1 comprende la deleción o la deleción parcial de un elemento que actúa en cis, preferiblemente la deleción o la deleción parcial de un sitio de unión al factor de transcripción para un represor transcripcional.
Una modificación que aumenta el nivel de ARNm del genRDRIy/o el nivel de la proteína RDR1 y/o la actividad de la proteína RDR1 puede comprender una modificación en el promotor o en la región 5'-UTR del genRDRI,preferiblemente de un elemento que actúa en cis en el promotor o en la región 5'-UTR.
Una modificación en el genRDRItambién puede ser una modificación en un exón de la región 5'-UTR del genRDRI,preferiblemente una modificación de un elemento que actúa en cis en un exón de la región 5'-UTR.
Además, la modificación puede comprender la deleción o la deleción parcial de un sitio de unión al factor de transcripción para un represor transcripcional en un exón, opcionalmente en el primer exón, de la región 5'-UTR de un genRDRI.
También se describe en la presente memoria un genRDRImodificado que es un genRDRIendógeno.
Durante la investigación que condujo a la presente invención, se identificó una planta deCucumis sativusque comprende una mutación en un genRDR.La mutación dio como resultado un aumento de la expresión, que se detectó como un aumento significativo del nivel de ARNm en estado estacionario del genRDR.Este genRDRen particular que se modificó se clasificó como perteneciente a la claseRDRa,ya que comprendía el motivo DLDGD típico y, en particular, al grupoRDRI.Este gen se designa en lo sucesivo comoCsRDR1_II.La secuenciaCsRDR1_IIde tipo natural se puede encontrar en la Figura1 (Id. de sec. n.°: 4(ADN) eId. de sec. n.°: 5(proteína)).
Investigaciones posteriores identificaron que la mutación en el genCsRDR1_IIera una deleción de 46 pares de bases a unos 1000 pares de bases aguas arriba del codón de inicio ATG del CDS del genCsRDR1_II.Más específicamente, se determinó que la deleción estaba en la 5'-UTR, y particularmente en el primer exón de la región 5'-UTR del gen(Figura 2, Id. de sec. n.°: 6).
La región aguas arriba del CDS de un gen que codifica una proteína comprende comúnmente un gran número de elementos reguladores en cis. En algunos casos, también puede albergar secuencias que pueden dar como resultado ARN pequeños, en particular microARN. Por tanto, la modificación en esta región aguas arriba puede tener un efecto sobre la expresión del gen.
La secuencia de tipo natural del genCsRDR1_IIcomprende varias secuencias que codifican elementos reguladores en cis en el área modificada, específicamente en el primer exón de la 5'-UTR, que se vieron afectados por la deleción. Los elementos cis-reguladores identificados en la 5'-UTR incluyen al menos dos secuencias cortas que codifican cajas PY o cajas de pirimidina, que funcionan como sitios de unión al factor de transcripción. La deleción incluyó parte de una de las cajas PY, lo que provocó la ausencia funcional de esta caja PY en particular. Además, un sitio de unión del factor de transcripción (TF) con una secuencia WAAAG, en el que W puede ser A o T, se localizó en la región modificada y se delecionó parcialmente(EJEMPLO 1). Opcionalmente, otros sitios de unión a TF también se localizaron en la modificación y se vieron afectados por ella.
Además de los sitios de unión al TF, la región 5'-UTR del genCsRDR1_IIcomprendía un tramo de aproximadamente 23 nt que se identificó por comportarse potencialmente de manera similar a un microARN. Se eliminó parte de la secuencia que codifica este elemento similar al miARN, dejando que el elemento similar al miARN no fuera funcional(EJEMPLO 1).
Los microARN normalmente necesitan una secuencia de ARNm diana para el apareamiento, que en las plantas suele localizarse en el CDS de un gen que codifica una proteína. Se determinó notablemente que el extremo 3' del CDS del propio genCsRDR1_II de Cucumis sativuscomprende una secuencia diana plausible para el elemento similar al miARN detectado, como lo indica el alto nivel de complementariedad de secuencia con el elemento similar al miARN detectado en la 5'-UTR del mismo gen.
Posteriormente se llevó a cabo una investigación detallada y, de manera muy sorprendente e interesante, se detectó que otros genesRDRIdel genoma deCucumis sativuscomprendían una secuencia diana casi totalmente complementaria al elemento similar al microARN delCsRDR1_IIen los extremos 3' de sus respectivos CDS.(EJEMPLO 2,Figura3).
Se concluyó que la deleción o deleción parcial de un elemento regulador aguas arriba del codón de inicio, particularmente en la 5'-UTR del genCsRDR1_IIdeCucumis sativus, dio como resultado un aumento en el nivel de ARNm del genCsRDR1_II.La deleción o la deleción parcial hace que el elemento regulador no funcione. El elemento regulador no funcional da como resultado un aumento del nivel de ARNm. El aumento del ARNm conduce a una mayor expresión del genCsRDR1_II.
También se describe en la presente memoria un genRDRImodificado que comprende una deleción en el primer exón de la 5'-UTR. En una realización preferida, la deleción en el primer exón de la 5'-UTR del genRDR1comprende la deleción o deleción parcial de un elemento que actúa en cis, cuyo elemento que actúa en cis es preferiblemente un sitio de unión al factor de transcripción, más preferiblemente un sitio de unión al represor de la transcripción, y/o la deleción o deleción parcial de un miARN o elemento similar a un miARN.
Además, en la presente memoria se describe un elemento modificado que actúa en cis que es un sitio de unión al factor de transcripción con laId. de sec. n.°: 1y/o laId. de sec. n.°: 2,y un miARN modificado o un elemento similar a un miARN que comprende laId. de sec. n.°: 3 (tabla 1).
En un determinado aspecto de la invención, la deleción en el primer exón de la 5'-UTR comprende laId. de sec. n.°: 6,opcionalmente en combinación con la inserción de laId. de sec. n.°: 7 (tabla 1).
Tabla 1.
En la presente memoria se describe un genRDRImodificado, en donde la modificación da como resultado una expresión mejorada, y cuya modificación comprende la deleción o la deleción parcial de un elemento regulador, cuyo elemento regulador comprende laId. de sec. n.°: 1y/o laId. de sec. n.°: 2 y/olaId. de sec. n.°: 3.
En una realización particular de la invención, la secuencia de tipo natural de un genRDR1de la invención se representa por laId. de sec. n.°: 4(Cucumis sativus),lasId. de sec. n.°: 8y21(Daucus carota),lasId. de sec. n.°: 9y20(Solanum lycopersicum),lasId. de sec. n.°: 10y19(Citrullus lanatus),lasId. de sec. n.°: 11y22(Cucumis meto),lasId. de sec. n.°: 12y27(Spinacia oteracea),lasId. de sec. n.°: 13y23(Phaseolus vulgaris),lasId. de sec. n.°: 14y29(Spinacia oteracea),lasId. de sec. n.°: 15y28(Beta vulgaris),lasId. de sec. n.°: 16y24(Lactuca sativa),lasId. de sec. n.°: 17y26(Brassica oteracea)o lasId. de sec. n.°: 18y25(Lactuca sativa).Cuando se indican dos Id. de sec. n.° para una determinada especie de cultivo, la primera se refiere a la secuencia 2 kb aguas arriba del codón de inicio, que incluye el promotor y la región 5'-UTR, y la segunda se refiere al CDS, incluido el codón de inicio.
También se describe en la presente memoria el uso de un genRDR1modificado para conferir y/o aumentar la resistencia al virus a un virus de ARN en una planta que comprende el genRDRImodificado, cuya resistencia y/o aumento de resistencia está causada por la expresión mejorada del genRDRImodificado en comparación con la expresión de un genRDR1de tipo natural no modificado. El genRDRImodificado es capaz de conferir o aumentar la resistencia al virus a una planta en la que está presente el genRDRImodificado, en particular a una planta seleccionada de cualquiera de las especiesPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica oteracea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis meto, Cucumis sativus, Spinacia oteracea, Solanum lycopersicum o Citrullus lanatus.
La expresión mejorada del genRDRImodificado en una planta se demuestra como un aumento en el nivel de ARNm del genRDRI,y/o un aumento en el nivel de la proteínaRDR1,y/o un aumento en la actividad de la proteínaRDR1.
La invención proporciona además una planta que comprende el genRDRImodificado de la invención, planta que muestra resistencia y/o mayor resistencia al virus debido a la expresión mejorada del genRDR1modificado en comparación con una planta que comprende el genRDR1de tipo natural. Además, en la presente memoria se describe una planta en donde la modificación del genRDRIcomprende la deleción o deleción parcial de un elemento regulador aguas arriba del codón de inicio del gen, opcionalmente en la 5'-UTR. Más particularmente, en la presente memoria se describe una planta en donde la modificación del genRDRIcomprende la deleción o deleción parcial de un elemento que actúa en cis, cuyo elemento que actúa en cis es preferiblemente un sitio de unión al factor de transcripción, más preferiblemente un sitio de unión al represor de la transcripción, y/o la deleción o deleción parcial de un miARN o elemento similar al miARN.
Tal como se usa en la presente memoria, mostrar y/o aumentar la resistencia significa que la presencia de un genRDRImodificado conduce a un nivel de resistencia al virus en una planta que no tiene resistencia a un determinado virus, y/o la presencia del genRDR1modificado aumenta la resistencia en una planta que ya tiene un nivel de resistencia a un determinado virus. El nivel de resistencia se compara con el de una planta isogénica que no comprende el genRDR1modificado de la invención.
Una planta de la invención es una planta en la que un genRDR1ortólogo se modifica adecuadamente, cuya modificación da como resultado una expresión mejorada deRDR1,por ejemplo, una planta seleccionada de cualquiera de las especiesPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica olerácea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis meto, Cucumis sativus, Spinacia oleracea, Solanum lycopersicum, Citrullus lanatusuOryza sativa.
Una planta que comprende un genRDR1modificado de la invención, cuya modificación conduce a una mayor expresión del genRDRI,muestra resistencia al virus y/o tiene una mayor resistencia al virus. Se cree que el aumento de la expresión del genRDRIconduce a una mayor formación de ARNbc, lo que a su vez podría conducir a una mayor tasa de producción de ARNip. El nivel más alto de ARNip se puede usar posteriormente de forma eficaz en el RISC, lo que conduce a una mayor activación y a una mayor tasa de degradación del ARN viral. Este sistema permite el establecimiento de una amplia resistencia al virus en diferentes especies de cultivos debido al aumento de la expresión del genRDRI.
Debido a este mecanismo, un virus contra el que la expresión mejorada del genRDRIproporciona y/o aumenta la resistencia a o en una planta pertenece al grupo de virus con un genoma de ARN, preferiblemente virus de ARN monocatenario que pueden tener un único genoma de ARN monocatenario positivo (virus ARN(+) o virus ARNmc(+)) o un único genoma de ARN monocatenario negativo (virus ARN(-)). Las familias de virus vegetales comunes con genomas de ARN(+) comprendenPotyviridae,por ejemplo, el géneroIpomovirusy el géneroPotyvirus,yVirgaviridae,que comprende el géneroTobamovirus.Las familias de virus con genomas de ARN(-) incluyenBunyaviridae,por ejemplo, la familiaTospovirus.La presencia del genRDRImodificado, con expresión mejorada, en una planta confiere y/o aumenta la resistencia contra uno o más virus ARN(+) de la familiaPotyviridae.
La invención también se refiere a una semilla que comprende un genRDRImodificado de la invención, en donde la planta que crece a partir de la semilla muestra resistencia y/o una mayor resistencia a uno o más virus de ARN, en particular a uno o más virus de ARN de la familiaPotyviridae.Una semilla de la invención es preferiblemente una semilla de cualquiera de las especiesPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica oleracea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis melo, Cucumis sativus, Spinacia oleracea, Solarium lycopersicumoCitrullus lanatus.
Las especies de virus pertenecientes a los virus ARN que causan grandes problemas al infectar un gran número de cultivos son, por ejemplo, pero no se limitan a, el virus del amarilleamiento de las venas del pepino (CVYV), el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV), el virus de la mancha anular de la papaya (PRSV), el virus del mosaico de la sandía (WMV), el virus del mosaico del moteado verde del pepino (CGMMV), el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus del mosaico del tomate (ToMV), el virus del moteado suave del pimiento (PMMoV), el virus del moteado del pimiento (PepMoV), el virus Y de la patata (PVY), el virus X de la patata (PVX), el virus del mosaico de la soja (SMV), el virus del mosaico enano del maíz (MDMV), el virus del torrado del tomate (ToTV), el virus del mosaico del pepino (PepMV), el virus de la necrosis de la yema del cacahuete (PBNV) y el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV).
Una planta que comprende un genRDR1modificado de la invención muestra preferiblemente resistencia contra CVYV, opcionalmente en combinación con una mayor resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o ZYMV.
Se realizaron investigaciones adicionales para observar el efecto de un genRDR1modificado de la invención en el pepino(Cucumissativus). Se descubrió que una planta de pepino que comprendía un genCsRDR1_IImodificado que conducía a una expresión mejorada deCsRDR1_IItenía resistencia al virus y/o una mayor resistencia al virus. Dicha planta de pepino mostró particularmente resistencia y/o mayor resistencia a uno o más virus de ARN, más específicamente a uno o más virus ARNmc(+). Se observó que dicha planta de pepino tenía resistencia a CVYV y, opcionalmente, también mostró un aumento en la resistencia a CMV y/o la resistencia a CGMMV y/o la resistencia a ZYMV. Una planta, preferiblemente una planta de pepino, que comprende un genCsRDR1_IImodificado de la invención muestra preferiblemente resistencia a CVYV, opcionalmente en combinación con un aumento de la resistencia al CMV (EJEMPLO 3).
La invención se refiere a un genCsRDR1_IImodificado, cuyo tipo natural está representado por la Id. de sec. n.°: 4, que comprende una deleción de un elemento regulador, elemento regulador que comprende la Id. de sec. n. °: 6, cuya modificación conduce a una expresión mejorada del genCsRDR1_II,en donde el genCsRDR1_IImodificado es capaz de conferir y/o aumentar la resistencia a CVYV y/o ZYMV y/o CMV y/o CGMMV cuando está presente en una planta deCucumis sativus.El genCsRDR1_IImodificado es capaz de conferir resistencia contra CVYV y aumentar la resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o ZYMV enCucumis sativus.Una planta deCucumis sativusque comprende un genCsRDR1_IImodificado de la invención que muestra resistencia contra CVYV y una mayor resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o ZYMV es parte de la invención.
En una realización particular, la modificación en el genCsRDR1_IIes una deleción de la Id. de sec. n.°: 6 en el primer exón de la 5'-UTR, opcionalmente en combinación con una inserción de 5 pb de la Id. de sec. n.°: 7 (tabla 1).
La modificación en el genCsRDR1_IIes una modificación que hace que un elemento regulador en la 5'-UTR no sea funcional, en particular un elemento regulador que comprende la Id. de sec. n.°: 1 o la Id. de sec. n.°: 2 o la Id. de sec. n.°: 3, o una combinación de las mismas. La falta de funcionalidad de dicho elemento regulador se puede lograr mediante una mutación o una deleción o una deleción parcial de una o más secuencias según dichas Id. de sec. n. °.
También se describe en la presente memoria el uso de un genCsRDR1_IImodificado, cuya modificación conduce a una expresión mejorada del genCsRDR1_II,para conferir y/o aumentar la resistencia al virus a o en una planta deCucumis sativus,preferiblemente conferir y/o aumentar la resistencia al virus contra CVYV y/o CMV y/o CGMMV y/o ZYMV, lo más preferiblemente para conferir resistencia al virus contra el CVYV, opcionalmente en combinación con aumento de la resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o ZYMV.
También forman parte de esta invención las plantas, en particular las plantas deCucumis sativus,que comprenden un genCsRDR1_IImodificado tal como se describe en la presente memoria.
Los tipos de modificación que conducen a una mayor expresión del genRDRIdan como resultado una resistencia al virus y/o un aumento de la resistencia al virus una vez que el gen está presente en una planta. Un genRDRImodificado de la invención puede introgresarse de una planta que comprende el genRDRImodificado en una planta que carece del genRDRImodificado, utilizando cruces cuando las plantas son sexualmente compatibles, combinado opcionalmente con técnicas que ayudan al desarrollo de semillas viables o facilitan el desarrollo en una planta. En un caso particular, un genCsRDR1_IImodificado se puede introgresar de una planta deCucumis sativusque comprende el genCsRDR1_IImodificado a una planta deCucumis sativusque carece del genCsRDR1_IImodificado usando métodos de reproducción estándar.
Opcionalmente, el cruzamiento puede ir seguido de técnicas de rescate de embriones u otras técnicas que den como resultado una combinación e introgresión exitosas, técnicas que son conocidas por el experto en la materia.
La identificación de los ortólogos deRDRIpuede realizarse técnicamente en muchos cultivos, cuyos métodos son conocidos en la técnica. En la presente investigación, se utilizó un programa Blast para comparar la secuenciaCsRDR1_IIcon las secuencias de otros genomas de plantas. Los mejores resultados se identificaron como genesRDRIcandidatos. Después de esto, los aciertos más cercanos se seleccionaron adicionalmente, entre otras cosas, basándose en motivos comunes (Ejemplo 5). Se considera que los más cercanos son los ortólogos funcionales del genCsRDR1_II,que se descubrió que transmite y/o aumenta la resistencia cuando se mejora la expresión. Basándose en el mismo mecanismo, la expresión mejorada de un genRDRIfuncional equivalente en una especie de planta conduce a la resistencia al virus y/o a un aumento de la resistencia al virus en dicho cultivo.
En una realización, un genRDRImodificado con expresión mejorada es un genRDRImodificado ortólogo aCsRDR1_II,cuyos ejemplos de ortólogos se presentan en la Figura 4 y la Figura 5 para las especiesPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica oleracea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis melo, Cucumis sativus, Spinacia oleracea, Solanum lycopersicum, Citrullus lanatus, Oryza sativayArabidopsis thaliana.
En una realización, la invención se refiere a un método para producir una planta que muestre resistencia y/o tenga una resistencia aumentada contra uno o más virus de ARN de la familiaPotyviridae,que comprende modificar un genRDRI,de modo que la modificación conduce a una expresión mejorada, y en donde la modificación comprende una eliminación de un elemento regulador, cuyo elemento regulador comprende la Id. de sec. n.°: 6, en particular modificar un genRDRIrepresentado por las Id. de sec. n.°: 4(Cucumis sativus),las Id. de sec. n.°: 8 y 21(Daucus carota),las Id. de sec. n.°: 9 y 20(Solanum lycopersicum),las Id. de sec. n.°: 10 y 19(Citrullus lanatus),las Id. de sec. n.°: 11 y 22(Cucumis melo),las Id. de sec. n.°: 12 y 27(Spinacia oleracea),las Id. de sec. n.°: 13 y 23(Phaseolus vulgaris),las Id. de sec. n.°: 14 y 29(Spinacia oleracea),las Id. de sec. n.°: 15 y 28(Beta vulgaris),las Id. de sec. n.°: 16 y 24(Lactuca sativa),las Id. de sec. n.°: 17 y 26(Brassica oleracea)o las Id. de sec. n.°: 18 y 25(Lactuca sativa).
Tal como se mencionó anteriormente, los ortólogos de los genesRDRIya se han identificado y agrupado en varios cultivos. La presente investigación ha identificado específicamente los genesRDRIque se parecen más a la secuenciaCsRDR1_IImediante la comparación de motivos proteicos comunes. Cada genRDRIortólogo alberga elementos reguladores, en particular elementos reguladores cis, aguas arriba de su codón de inicio, en la secuencia promotora y/o 5'-UTR, en el CDS y/o en la 3'-UTR. Los motivos de secuencia de los elementos reguladores son conocidos o pueden ser reconocidos por el experto en la técnica y pueden identificarse usando técnicas conocidas por el experto en la técnica. La modificación adecuada de un elemento regulador conduce a una expresión mejorada del gen, y tales genesRDRImodificados ortólogos también son genes de la invención.
La modificación adecuada comprende la modificación de un sitio de unión del factor de transcripción (TF) para un represor transcripcional, modificación que conduce a la reducción o ausencia de represión transcripcional; modificación de un sitio de unión del factor de transcripción para un activador transcripcional, modificación que conduce a la inducción o mejora de la transcripción; modificación de un sitio de unión del microARN, modificación que conduce a la reducción o ausencia de la represión génica; y/o modificación de una secuencia de ARN pequeña, en particular una secuencia de microARN, cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de represión génica.
La modificación que comprende la deleción o alteración al menos parcial de un sitio de unión a TF, un sitio de unión al microARN o una secuencia de microARN normalmente dará como resultado la falta de funcionalidad de dicho elemento regulador. Cuando tal elemento está implicado en la represión génica, la falta de funcionalidad reducirá la represión y conducirá a una mayor expresión del gen en comparación con un gen que tiene un elemento regulador funcional.
En un ejemplo, la modificación puede introducirse en un genRDRIendógeno que es ortólogo aCsRDR1_IImediante mutagénesis. La mutagénesis comprende la introducción aleatoria de al menos una modificación por medio de uno o más compuestos químicos, como metanosulfonato de etilo, nitrosometilurea, hidroxilamina, proflavina, N-metil-N-nitrosoguanidina, N-etil-N-nitrosourea, N-metil-N-nitro-nitrosoguanidina, sulfato de dietilo, etilenimina, azida de sodio, formalina, uretano, fenol y óxido de etileno, y/o por medios físicos, como radiación ultravioleta, exposición rápida a neutrones, rayos X, irradiación gamma, y/o por inserción de elementos genéticos, tales como transposones, ADN-T, elementos retrovirales.
La mutagénesis también comprende la introducción más específica y dirigida de al menos una modificación por medio de recombinación homóloga, inducción de mutación basada en oligonucleótidos, nucleasas con dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) o sistemas de repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR).
Un genRDRImodificado de la invención puede introducirse alternativamente en una planta mediante modificación genética. La modificación genética comprende modificación transgénica o transgénesis, usando un gen de una especie que no se puede cruzar o un gen sintético, y modificación cisgénica o cisgénesis, usando un gen natural, que codifica un rasgo (agrícola), de la propia planta de cultivo o de una planta donadora de sexualmente compatible.
Se describe en la presente memoria un genRDRImodificado que es un genRDRIexógeno que puede introducirse en una planta mediante un método transgénico o un método cisgénico.
También se describe en la presente memoria un genRDRIrecombinante modificado, en donde la expresión de dicho genRDRIrecombinante modificado es impulsada por un promotor fuerte, cuyo promotor está unido operativamente a una secuencia del genRDRI,cuya secuencia génica incluye la 5'-UTR, la CDS y/o la 3'-UTR. En la técnica se conocen muchos ejemplos de promotores constitutivos fuertes; algunos de los más utilizados son, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (pCaMV 35S) y sus versiones modificadas, los promotores de ubiquitina de varias especies de plantas, los promotores de actina de varias especies de plantas y el promotor del factor de alargamiento 1 alfa(ElF1□).
Además, en la presente memoria se describe un constructo génico, cuyo constructo génico comprende un marcador seleccionable, una secuencia promotora, una secuencia génicaRDR1y una secuencia terminadora.
La actividad mejorada de un genRDRIpuede conducir a y/o puede aumentar la resistencia al virus de una planta, preferiblemente a uno o más virus de ARN, más preferiblemente a uno o más virus ARNmc(+), incluso más preferiblemente a uno o más virus que pertenecen a la familiaPotyviridaey/oVirgaviridae.
En una realización, la expresión del genRDRImodificada, en particular mejorada, conduce a y/o aumenta la resistencia contra CVYV y/o CMV y/o CGMMV y/o ZYMV en una planta que pertenece al géneroCucumis,en particular aCucumis sativusy/oCucumis melo.En una realización preferida, la expresión del genRDR1modificada, en particular mejorada, conduce a la resistencia contra CVYV y aumenta la resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o ZYMV en una planta que pertenece al géneroCucumis,en particular aCucumis sativusy/oCucumis melo.En la realización más preferida, la expresión del genRDR1modificada, en particular mejorada, conduce a la resistencia contra CVYV y aumenta la resistencia contra CMV en una planta que pertenece al géneroCucumis,en particular aCucumis sativus.
La actividad mejorada o la regulación positiva del gen se pueden obtener de muchas maneras. Un promotor o región 5'-UTR de un genRDRI, cuyo promotor o 5'-UTR se modifica de tal manera que aumenta la transcripción, se puede combinar con una secuencia del genRDR1no modificada, opcionalmente endógena.
La expresión del genRDRItambién se puede regular por incremento induciendo la sobreexpresión, por ejemplo, usando un constructo que comprende un promotor fuerte que mejora la expresión génica en combinación con la secuencia de ADNc del genRDR(EJEMPLO 4).
Cualquiera de los enfoques transgénicos destinados a sobreexpresar un genRDRIpuede implicar el uso de secuencias promotoras inducibles. En este enfoque, se pueden usar factores o tratamientos externos para inducir y/o modular el patrón de expresión temporal y/o espacial de un transgén, en virtud del efecto que estos factores o tratamientos externos tienen sobre la actividad de la secuencia promotora a la que la secuencia de ácido nucleico transgénica está unida operativamente. El promotor inducible puede seleccionarse del grupo que comprende promotores inducibles por calor, promotores inducibles por productos químicos, promotores inducibles por esteroides, promotores inducibles por alcohol u otros. El tratamiento de las plantas transgénicas con los agentes y/o condiciones que inducen la actividad del promotor inducible (como un choque térmico o un tratamiento térmico, productos químicos específicos, esteroides específicos como la dexametasona o el alcohol) activa el promotor inducible, lo que da como resultado la (sobre)expresión transitoria del transgén.
Los enfoques transgénicos para incorporar el genRDRImodificado, incluidos el promotor y el 5'-UTR, en otras especies de plantas, o usar el CDS de un genRDRIen combinación con otra secuencia promotora y/o líder fuerte que mejore la expresión génica, pueden conducir a una mayor expresión o sobreexpresión delRDRIen una planta receptora. Un genRDR1mejorado o sobreexpresado incorporado en una planta puede conducir a y/o aumentar la resistencia al virus de esa planta.
Además de mejorar la actividad transcripcional de un genRDRI,se puede lograr el mismo efecto mediante la duplicación del locusRDR1en el genoma. En tal caso, se transcriben transcripciones muy similares a partir de dos o más loci separados, lo que puede conducir a un nivel de estado estacionario más alto del ARNm y de la proteína o proteínas codificadas.
Figuras
Figura 1- ADN deCsRDR1_IIdeCucumis sativus(Id. de sec. n.°: 4,incluidos 2 kb aguas arriba) y secuencia de proteínas(Id. de sec. n.°: 5)
Figura 2- Secuencia delecionada en la 5'-UTR del genCsRDR1_IImodificado. La secuencia de 46 pb ctttccatggccataacaccaaatattctctattgaatgtaatttc(Id. de sec. n.°: 6)está presente en la 5'-UTR de la planta susceptible (“vatbaar” ), pero se deleciona en la planta resistente. Además, está presente una inserción de una secuencia de 5 pb mucho más corta: acctg(Id. de sec. n.°: 7).
Figura 3- Secuencia del elemento similar a microARN deCsRDR1_II(Tabla 1, Id. de sec. n.°: 3) y alineación con posibles secuencias diana en los extremos 3' del CDS deCsRDR1_IIy otros dos genesRDRIdeCucumis sativus.(Id. de sec. n.°: 52-55).
Figura 4- Secuencias de ADN de ortólogos deCsRDR1_IIenPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica olerácea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis melo, Cucumis sativus, Spinacia oleracea, Solaríum lycopersicum, Citrullus lanatus, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana.La Figura4aproporciona las secuencias 2 kb aguas arriba del codón de inicio(Id. de sec. n.°: 8-18),la Figura4bmuestra estas secuencias alineadas. La Figura4cproporciona las secuencias génicas que parten de ATG(Id. de sec. n.°: 19-29),la Figura4dproporciona estas secuencias alineadas. La descripción general a continuación indica qué Id. de sec. n.° están vinculadas a qué especies en las secuencias alineadas en lasFiguras 4b, 4dy5b.
Figura 5- Secuencias de proteínas(Figura 5a)y secuencias de proteínas alineadas(Figura 5b)de ortólogos deCsRDR1_IIenPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica olerácea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis meto, Cucumis sativus, Spinacia oleracea, Solarium lycopersicum, Citrullus lanatus, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana.(Id. de sec. n.°: 30-51).
Figura 6- Árbol filogenético deCsRDR1_IIy sus genes ortólogos identificados.CsRDR1_IIse presenta como Pepino _cs9930v2_emv_14138. Por especie, el gen más similar aCsRDR1_IIse indica con *. Los otros genes son un poco más distantes, pero aún contienen los mismos motivos.
Figura 7- Informe de expresión relativa de la regulación positiva del genCsRDR1_IIpresentado como un aumento en el nivel de ARNm. En la Figura7ase muestran los resultados, en los que P (H1) es la probabilidad de la hipótesis alternativa de que la diferencia entre los grupos de muestra y de control se debe únicamente al azar. TRG es la diana, REF es la referencia.
El gráfico de la Figura7bes un diagrama de caja, en donde el cuadro representa el rango intercuartílico, o el 50 % medio de las observaciones. La línea punteada representa la mediana de la expresión génica, los bigotes representan las observaciones mínimas y máximas.
La Figura 7cmuestra los resultados no normalizados, que no tienen valores de expresión normalizados para las amas de casa seleccionadas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Modificación de RDRI en Cucumis sativus
En el genoma deCucumis sativusse identificaron dos genesRDRIadyacentes en el cromosoma 5, cuyos genesRDRIestaban orientados inversamente. Se analizó genéticamente una población de plantas deCucumis sativusy se volvieron a secuenciar los genesRDRIdel cromosoma 5. La resecuenciación mostró que uno de los genesRDRI,indicado conCsRDR1_I,era monomórfico en toda la población. Sin embargo, el otro gen RDRI, indicado conCsRDRI-II,era monomórfico en la región codificante, pero era polimórfico en la región aguas arriba del codón de inicio ATG, que contenía el promotor y la 5'-UTR. El genCsRDR1_IIdeCucumis sativusy la secuencia proteica se presentan en la Figura1.
El polimorfismo detectado fue una deleción de 46 pares de bases a aproximadamente 1000 pb aguas arriba del codón ATG, en la región que define la 5'-UTR. En lugar de este estiramiento, estaba presente una inserción corta de 5 pb en esta ubicación (Figura 2). Para determinar si la deleción tenía un efecto sobre la expresión génica, se determinó el nivel en estado estacionario del ARNm deCsRDR1_II.El análisis mostró un nivel aproximadamente 100 veces mayor de ARNm deCsRDR1_IIen estado estacionario en las plantas deCucumis sativusque tenían la deleción en comparación con el nivel de ARNm en las plantas que tenían el genCsRDR1_IIde tipo natural (Figura 7).
Se supuso que la deleción en la región aguas arriba del CDS había interrumpido la funcionalidad de un represor del inicio de la transcripción, lo que conduce a niveles de acumulación más altos del ARNm.
Ejemplo 2
Detección de elementos normativos
Un estudio posterior de la región en la que se produjo la deleción mostró de hecho la presencia de varios elementos reguladores en cis. Como consecuencia de la deleción de 46 pb, uno de estos elementos, identificado como caja de pirimidina o caja PY, se delecionó parcialmente. La deleción parcial hace que la caja PY no sea funcional. La caja PY es un sitio de unión al TF que puede estar implicado en la represión de la transcripción del ARNm. La falta de funcionalidad de la caja PY da como resultado un nivel más alto de ARNm en estado estacionario al reducir la represión génica (Figura 2).
Hay cajas PY adicionales en la región aguas arriba del codón de inicio del gen. Es muy factible que una modificación adicional en una de las otras cajas PY pueda resultar en niveles de ARNm aún más altos. Alternativamente, una modificación en otros elementos reguladores cis de un genRDR1de tipo natural, como las otras cajas PY, podría tener el mismo efecto que el observado en la presente investigación.
Además, un estudio detallado mostró la posible presencia de otro elemento regulador en la región modificada aguas arriba del CDS del genCsRDR1_II.Se identificó un tramo de 23 nt que podría actuar como un microARN. Este elemento, denominado en la presente memoria “ similar a microARN” , parecía tener una secuencia diana inversa casi complementaria en el extremo 3' del CDS del genCsRDR1_II(tabla 1, Id. de sec. n.°: 3; Figura 3).
El genoma deCucumis sativuscontiene además al menos otros dos genesRDRIcon un motivo DLDGD. Sorprendentemente, ambos genes mostraron un tramo de 23 nt altamente complementario en el extremo 3' de sus regiones CDS, lo que indica que el elemento del genCsRDR1_IIes un candidato muy probable para un microARN (Figura 3).
La deleción de 46 pb en el genCsRDR1_IImodificado comprendía parte de este elemento similar a microARN. Las deleciones parciales suelen hacer que un elemento deje de ser funcional. El presente elemento tiene la capacidad de actuar de una manera cis-reguladora y/o transreguladora. La falta de funcionalidad de tal microARN de acción cis y/o trans tiene un efecto sobre el nivel de ARNm del genCsRDR1_IIy/u otros genes diana.
Un tercer elemento regulador que se posicionó en la región modificada es un sitio de unión al factor de transcripción (TF) con un motivo central WAAG conservado, por lo que W puede ser A o T. Los factores de transcripción que se unen a este sitio pertenecen a la familia de proteínas C2C2-Dof, que se sabe que participan en la regulación de la expresión génica en varios procesos, incluidos los mecanismos de defensa de las plantas. La deleción de 46 pb identificada incluye parte de este sitio de unión, lo que deja inactivo este sitio de unión a TF, lo que probablemente influya en la transcripción y posterior expresión del gen.
Ejemplo 3
Resistencia al virus en relación con CsRDR1_II modificado
Las plantas deCucumis sativusque contenían dos genesRDRIde tipo natural tal como se describe en el ejemplo 1, denominadosCsRDR1_IyCsRDR1_II,se compararon para determinar la resistencia al virus con las plantas que contenían al menos un genCsRDR1_IImodificado. La modificación es la deleción tal como se describe en los ejemplos anteriores.
Se diseñó un ensayo de PCR para poder discriminar entre los dos alelosCsRDR1_IIen una población de plantas. Las plantas que contenían el genCsRDR1_IIde tipo natural y el aleloCsRDR1_IImodificado se examinaron para determinar su resistencia contra CVYV, CMV, CGMMV y Z<y>M<v>.
Hubo una correlación perfecta entre la presencia del aleloCsRDR1_IImodificado y, por consiguiente, el aumento de la expresión del gen y la resistencia contra CVYV en el pepino. Además, la presencia del aleloCsRDR1_IImodificado influyó en la resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o Z<y>M<v>. Para estos virus, el aleloCsRDR1_IImodificado y, por tanto, la expresión mejorada del gen, contribuye al nivel de resistencia. En la presencia real y el nivel de resistencia contra CMV, ZYMV y/o CGMMV, están involucrados otros genes de resistencia, pero una vez que esos otros genes están presentes, la combinación con una expresión mejorada del genCsRDR1_IIconduce a un nivel de resistencia aumentado o mejorado.
Ejemplo 4
La sobreexpresión transgénica de un gen RDR1 produce resistencia a CVYV en el melón
Se diseña un constructo de sobreexpresión para un genRDR1ortólogo del melón (Figura 4), que comprende el ADNc completo del genRDR1, unido operativamente al promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y al terminadornos.La secuencia de ADNc (incluida la 5'UTR) se obtuvo mediante RT-PCR a partir de una biblioteca de ADNc de hojas de melón. El constructo comprende además el genNPTII(que confiere resistencia a la kanamicina) como marcador de selección de plantas (bajo el control del promotorNOS).
Este constructo se introduce posteriormente en el genoma de una línea de melones que es susceptible a CVYV, usando el protocolo de transformación mejorado para melones cantalupo desarrollado por Guis y col., 2000 (Sci. Hort.
8: 91-99). Se seleccionan diez plantas de melón T0 independientes que albergan al menos una copia del constructo transgénico, y estas plantas se cultivan en una cabina de crecimiento junto con un conjunto de plantas no transformadas del mismo origen genético. Todas las plantas se inoculan con el virus CVYV y, posteriormente, se monitorizan para detectar síntomas.
En las plantas de control no transformadas se observa una coloración amarillenta distintiva de las venas, mientras que las líneas transformadas no muestran síntomas o solo síntomas menores. El nivel de expresión del ortólogoRDRIse investiga mediante una RT-PCR semicuantitativa, y esto revela que las líneas transgénicas sin síntomas tienen el nivel de expresión más alto del genRDRI,mientras que las líneas transgénicas con síntomas menores tienen niveles de expresión que son intermedios entre el nivel de tipo natural y el nivel de las líneas transgénicas sin síntomas. Esto confirma que existe una buena correlación entre el elevado nivel de expresión del genRDRIen el melón, por un lado, y el nivel de resistencia al virus CVYV, por otro lado.
Ejemplo 5
Identificación de ortólogos de CsRDR1_II
Se sabe que los genesRDRIestán representados en una amplia variedad de especies de cultivos. Los ortólogos del genCsRDR1_IIse identificaron usando un programa Blasting de nucleótidos (BLASTN) para comparar la secuenciaCsRDR1_IIcon las secuencias de otras especies de cultivos. El programa de anotación de proteínas UniProt se usó posteriormente para predecir funcionalmente los mejores resultados, lo que resultó en 5-6 genes candidatos para cada cultivo. Estos genes se seleccionaron para su posterior análisis. La presencia de varios motivos que se conservan comúnmente en las proteínas RDR1, así como un enfoque específico en la similitud en las regiones inicial y final de las secuencias génicas, se usó para especificar aún más los genes más similares. Las secuencias de ADN y proteínas de los ortólogos que se identificaron mediante este método se representan en la Figura 4 y la Figura 5.
Los motivos proteicos que se identificaron enCsRDR1_IIy en sus ortólogos, tal como se menciona en la Figura 5, son los siguientes: CSGS, DLDGD, AVDF(PA)KTG, ASAWY, A(FY)QIRY. El gen ortólogo más similar se encontró en la sandía(Citrullus lanatus).La relación y, por tanto, la similitud entre los diversos ortólogos se representa como un árbol filogenético, realizado con el programa Clustal, en la Figura 6.
Claims (13)
- REIVINDICACIONESi.GenRDR1modificado, en donde el genRDR1modificado comprende una modificación que da como resultado una expresión mejorada del genRDR1, y en donde la modificación comprende la deleción de un elemento regulador, cuyo elemento regulador comprende laId. de sec. n.°: 6,y en donde el genRDR1modificado es capaz de conferir y/o aumentar la resistencia contra uno o más virus de la familiaPotyviridaecontra una planta en la que esté presente el genRDR1modificado.
- 2. Gen según la reivindicación 1, en donde la deleción de laId. de sec. n.°: 6se combina con una inserción representada por laId. de sec. n.°: 7.
- 3. GenRDR1modificado según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de tipo natural de dicho genRDR1está representada por laId. de sec. n.°: 4(Cucumis sativus),lasId. de sec. n.°: 8y21(Daucus carota),lasId. de sec. n.°: 9y20(Solanum lycopersicum),lasId. de sec. n.°: 10y19(Citrullus lanatus),lasId. de sec. n.°: 11y22(Cucumis melo),lasId. de sec. n.°: 12y27(Spinacia oleracea),lasId. de sec. n.°:13y23(Phaseolus vulgaris),lasId. de sec. n.°: 14y29(Spinacia oleracea),las CristalId. de sec. n.°: 15y28(Beta vulgaris),las CristalId. de sec. n.°:16 y 24(Lactuca sativa),las CristalId. de sec. n.°: 17y26(Brassica oleracea)o las CristalId. de sec. n.°: 18y25(Lactuca sativa).
- 4. GenCsRDRl_IImodificado, cuyo tipo natural está representado por la Id. de sec. n.°: 4, que comprende una deleción de un elemento regulador, elemento regulador que comprende laId. de sec. n.°: 6, modificación que conduce a una expresión mejorada del genCsRDRl_II,en donde el genCsRDRl_IImodificado es capaz de conferir y/o aumentar la resistencia a CVYV y/o CMV y/o CGMMV y/o ZYMV cuando está presente en una planta deCucumis sativus.
- 5. GenCsRDRl_IImodificado según la reivindicación 4, en donde la deleción de laId. de sec. n.°: 6se combina con una inserción representada por laId. de sec. n.°: 7.
- 6. GenCsRDRl_IImodificado según la reivindicación 4 o 5, en donde el gen es capaz de conferir resistencia a CVYV.
- 7. GenCsRDRl_IImodificado según la reivindicación 6, en donde el gen confiere además una mayor resistencia a CMV.
- 8. Método para producir una planta que muestre resistencia y/o resistencia aumentada contra uno o más virus de ARN de la familiaPotyviridae,que comprende modificar un genRDR1mediante el cual la modificación conduce a una expresión mejorada, y en donde la modificación comprende una deleción de un elemento regulador, elemento regulador que comprende laId. de sec. n.°: 6,en particular modificar un genRDR1representado por lasId. de sec. n.°: 4(Cucumis sativus),lasId. de sec. n.°: 8y21(Daucus carota),lasId. de sec. n.°: 9y20(Solanum lycopersicum),lasId. de sec. n.°: 10y19(Citrullus lanatus),lasId. de sec. n.°: 11y22(Cucumis melo),lasId. de sec. n.°: 12y27(Spinacia oleracea),lasId. de sec. n.°: 13y23(Phaseolus vulgaris),lasId. de sec. n.°: 14y29(Spinacia oleracea),lasId. de sec. n.°: 15y28(Beta vulgaris),lasId. de sec. n.°: 16y24(Lactuca sativa),lasId. de sec. n.°: 17y26(Brassica oleracea)oId. de sec. n.°: 18y25(Lactuca sativa).
- 9. Método según la reivindicación 8, en donde la deleción de laId. de sec. n.°: 6se combina con una inserción representada por laId. de sec. n.°: 7.
- 10. Planta que comprende un genRDR1modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, cuya planta comprende resistencia y/o resistencia aumentada a uno o más virus de ARN de la familiaPotyviridae.
- 11. Semilla que comprende un genRDR1modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la planta cultivada a partir de la semilla comprende resistencia y/o resistencia aumentada a uno o más virus de ARN de la familiaPotyviridae.
- 12. Planta según la reivindicación 10, o semilla según la reivindicación 11, que es una planta o una semilla de cualquiera de las especiesPhaseolus vulgaris, Beta vulgaris, Brassica oleracea, Daucus carota, Lactuca sativa, Cucumis melo, Cucumis sativus, Spinacia oleracea, Solarium lycopersicum, Citrullus lanatus u Oryza sativa.
- 13. Planta deCucumis sativusque comprende un gen modificado según la reivindicación 1 -7, planta deCucumis sativusque muestra resistencia contra CVYV, opcionalmente en combinación con una mayor resistencia contra CMV y/o CGMMV y/o ZYMV.
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