CN106232819B - 赋予病毒抗性的修饰的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰的RDR1基因，其能够赋予植物以病毒抗性及/或增加植物中的病毒抗性，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，且其中所述修饰选自与非修饰的野生型RDR1基因相比增加RDR1基因的mRNA水平的修饰；增加RDR1蛋白质水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质活性的修饰。所述修饰可包含RDR1基因编码序列的上游的修饰，如调控元件的修饰，优选地为顺式调控元件的修饰。所述修饰的调控元件选自例如结合转录抑制子的转录因子结合位点，对其修饰导致转录抑制的减少或缺失；和/或转录激活子的转录因子结合位点，对其修饰导致转录的诱导或增强；及/或微小RNA结合位点，对其修饰导致基因抑制的减少或缺失；及/或小RNA序列，对其修饰导致基因抑制的减少或缺失。

Description

赋予病毒抗性的修饰的基因
本发明涉及修饰的RDR基因，其能够对植物赋予病毒抗性和/或增加病毒抗性。本发明进一步涉及使用所述修饰的RDR基因用于对植物赋予病毒抗性和/或增加病毒抗性的用途。
病毒是攻击植物的主要病原体群体之一，导致影响相关作物方面的负面效应，如影响植物生长、植物活力、产品质量、和产量潜能。和大多数真核生物一样，植物已经针对包括病毒在内的入侵病原体建立了主动防御机制。
除了结构和物理障碍如细胞壁外，目前公认的大致还有三种类型的植物免疫系统可保护植物免受病原体侵害。第一种类型对来自许多微生物种类的分子产生应答，其使用跨膜模式识别受体(PPR)，可以与微生物相关分子模式(MAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)发生反应。
第二种类型的植物免疫系统采用抗性(R)基因编码的多态NB-LRR(核苷酸结合的富亮氨酸重复)蛋白质产物。NB-LRR蛋白质能够探测到来自不同来源的病原体效应子蛋白或其活性。在病原体方面，由Avr基因编码的特异的无毒(Avr)蛋白质或效应子触发宿主植物的R蛋白介导的免疫应答。R基因和Avr的作用/反应引起过敏反应(HR)，这是植物对多类型致病微生物的最常见的反应之一。然而，尽管已有几个克隆的R基因和它们相应的Avr蛋白，却仍不能完全清楚病原体Avr蛋白质如何被其宿主所识别。
植物用来保护自身免受病毒或其他病原体侵害的第三种重要的防御机制基于RNA沉默或RNA干扰。RNA沉默是指一类基因沉默效应，其中一个或多个基因的表达被小RNA所下调或完全抑制。大量基因家族及其相关蛋白质家族已被确定为RNA沉默系统的组分。在其中，包括Dicer酶(DCR)基因、Dicer酶样(DCL)基因、Argonaute(AGO)核酸酶基因，以及RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)基因。这些基因家族分别包含数个成员，其能以不同组合形式在不同的物种中起作用，并有针对特定病原体或病原体群体的具体功能性和相互作用类型。
在宿主植物受到病毒性感染时，RNA病毒建立病毒复制，导致病毒来源的dsRNA的存在。该dsRNA通过作为特定的DCL蛋白质(一种内切核糖核酸酶)的底物发挥功能，触发植物的RNA沉默系统，将所述dsRNA裂解成典型长度为约20-25个碱基对的短片段。在经过进一步加工后，这些短的病毒来源siRNA片段的单链形式被加载到AGO蛋白上，作为宿主植物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)的一部分。在RISC中，所述siRNA被AGO蛋白用作指导模板，最终通过一系列的识别和裂解过程导致病毒RNA的降解。
RDR基因被认为在此免疫系统中通过以从头合成方式增强生产DCL蛋白质的病毒特异性底物dsRNA而起作用。所得的siRNA积累随后很可能增加对该病毒RNA的识别的效率，从而使其更积极地被沉默或降解
作为对策，许多病毒已经演化出通过激活RNA沉默抑制子(RSS)而规避或抑制RNA沉默途径的系统。具体RSS的存在有助于抑制植物的防御，这进而又重新使病毒基因组在目标宿主植物中能够复制和传播，从而有利于进一步感染。
特定植物和具体病毒间的沉默和抑制途径的平衡在决定病毒是否会成功建立感染上或在该植物是否将足够强壮能完全或充分抵抗承受攻击上起着很大的作用。
虽然已经鉴定出多种所提及的基因都参与植物免疫系统，但很多调节机制、所述这些基因之间的关系、其中不同蛋白质的作用方式仍然难以捉摸。此外，尚未解出个体基因在克服病原体抗沉默的同时对病毒沉默的贡献情况。另外，期望解读相关基因的结构及其表达调节方式的研究仍在进行中。
因此，目前还不清楚参与所述RNA沉默途径的何种基因在靶向诱导针对病原体尤其是针对病毒的抗性中是优选的候选，也不清楚应该以何种方式进行修饰以获得所需的效果。
本发明的一个目标是提供一种对植物赋予病毒抗性的方法。
在形成本发明的研究过程中，检测到RDR基因中的修饰。该修饰导致相比于野生型RDR基因，RDR基因的增强表达。所述增强的表达可被检测为RDR基因的mRNA积累水平的增加；RDR蛋白质水平的增加；和/或RDR蛋白质的活性增加。
编码RNA依赖的RNA聚合酶的RDR基因家族包括数个成员。在植物中，RDR基因通常被分为四个基因簇，表示为基因簇I-IV。在许多植物中，基因组中都存在有RDR基因的组合。拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组编码6个RDR基因，AtRDR1至AtRDR6，而例如水稻(Oryza sativa)基因组包含5个RDR基因，包括OsRDR1至OsRDR4，以及与RDR6成簇的OsSHL2。特定物种也可包括相同基因簇的多个RDR基因拷贝，例如大豆(Glycine max)，它有两个RDR1基因和两个RDR2基因，或高粱(Sorghum bicolor)，它在基因组中具有4个RDR6基因拷贝。
AtRDR3、AtRDR4和AtRDR5分类在基因簇III中，而AtRDR1在基因簇I中、AtRDR2在基因簇II中、AtRDR6在基因簇IV中。其它物种的直向同源RDR基因也相应分类。
属于RDR1簇(基因簇Ⅰ)、RDR2簇(基因簇II)，以及RDR6簇(基因簇IV)的植物基因可通过在所编码的蛋白质的推定催化结构域中的高度保守的共同DLDGD基序而鉴定，这将其与基因簇III的RDR基因区别开，后者含有共同的DFDGD基序。具有DLDGD基序的RDR基因分类在一起成为RDRα类，而具有DFDGD基序的RDR基因属于RDRγ类。在DLDGD基序附近，RDRα类基因还共享一些其他共同的保守基序，这些基因通过这些基序可以很容易地被分类到RDRα类中。想进一步归类到基因簇I、II或IV是比较困难的，因为尽管有共同的基序，RDR基因中还有相当宽范围的序列，即使只考虑RDRα基因的情况下也是如此。然而，本发明的RDR基因可归类为RDR1基因。
因此本发明提供了一种能够对植物赋予抗性和/或增加植物中的病毒抗性的修饰的RDR1基因，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，且其中所述修饰选自增加RDR1基因的mRNA水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质活性的修饰。如本文所使用的，所述在特定水平上的增加或活性的增加指的是相比于非修饰的野生型RDR1基因。
要获得相关的效应，在mRNA水平上的增加是稳态mRNA水平的增加。稳态的mRNA水平的增加可以由以下情况引起：通过增加mRNA的合成；和/或降低mRNA降解；和/或增加mRNA的稳定性。这里所提到的mRNA水平包括mRNA的积累水平。
出人意料的是，该基因的增强表达导致包含所述修饰的基因的植物产生病毒抗性和/或病毒抗性增加。基因赋予针对病原体抗性的机制经常是抗性基因被沉默或表达降低的机制。通过减少其表达的起作用的抗性基因的实例是elf4E基因、DMR6基因、高丝氨酸激酶基因、MLO基因及其他。因此，意想不到的是，本发明中的RDR1基因的活性得到实际增强，从而诱导和/或增加针对病毒的抗性。
在一个实施方式中，增加RDR1基因的mRNA水平和/或RDR1蛋白质水平和/或RDR1蛋白质的活性的修饰包括在RDR1基因的编码序列的上游的修饰，和/或在RDR1基因的编码基因内的修饰，和/或在RDR1基因的编码序列的下游的修饰。
可以以各种方式来实现RDR1基因表达的增强。一种选择是修饰基因编码序列起始位置的上游区域，该区域包括启动子和5'非翻译区(5'-UTR)，也称为前导序列。因为这些区域都参与了基因转录为mRNA及随后翻译的调控，因此，在基因的表达中，合适的修饰可通过增加mRNA水平和/或增加蛋白质的水平而使表达增加。
类似地，可通过在RDR1基因的编码序列(CDS)中创建修饰而提升RDR1基因的表达，其中CDS被定义为包含5'-UTR和3'-UTR之间的整个区域，包括外显子以及内含子。形成野生型RDR1基因的等位基因变体的CDS多态性可能能够引起基因表达的增强。启动子、前导序列和/或CDS中的个体修饰的组合可以进一步提高RDR1基因的表达和/或活性。
在一个实施方式中，增加RDR1基因的mRNA水平和/或RDR1蛋白质水平和/或RDR1蛋白的活性的修饰是顺式作用调控元件的修饰和/或反式调控元件的修饰。
调控元件是基因到mRNA的转录必需的，其调控了转录的时空速率，进而影响基因的表达。
顺式作用调控元件，也简称顺式作用元件或顺式调控元件，通常位于待转录的实际基因序列附近，并且例如通常存在于基因的启动子序列和前导序列中，尽管它们也可以位于距离基因转录起点的上游或下游较远位置。此外，紧接在CDS后的3'-UTR区域具有顺式作用元件，其往往参与了转录后基因表达的调控，尽管不完全是这种情况。顺式调控元件包括转录因子的结合位点(“TF结合位点”)，用于转录抑制子以及激活子，以及微小RNA靶标位点。
反式作用调控元件，也称为反式作用因子，包括转录因子和小RNA，例如微小RNA。转录因子是蛋白质，其结合DNA上的特异性结合位点，即它们相应的顺式调控元件，从而控制基因的转录。转录因子单独地或在与复合物中的其他蛋白质，通过促进(此时为转录激活子)，或者阻断(此时为转录抑制子)RNA聚合酶向特异基因的募集执行此功能。
微小RNA的是小非编码RNA分子，经由与其mRNA靶分子内互补序列进行碱基配对在基因表达的转录和转录后调控中发挥功能，并通例如降解其靶转录物或阻止翻译而诱导基因抑制。微小RNA形成一类重要的小RNA；siRNA则是另一类小RNA。通常小RNA由不同的不编码蛋白质的基因生成，因此也被称为非编码RNA。在一些情况下，小RNA被描述为源自蛋白质编码基因的内含子序列，极少地情况下也源自其他元件。
转录抑制子负面影响转录并减少基因表达；反过来转录激活子对转录产生积极的影响，并由此增强基因表达。
转录抑制子或其顺式调控结合元件的修饰导致抑制的减少或缺失，可能会导致转录的增加和mRNA的更高水平。例如导致转录抑制子或其结合元件的删除或部分删除的修饰预计具有增加mRNA水平的效应。此外，例如导致充当转录抑制子的转录因子的功能被破坏的修饰预计具有增加mRNA水平的效应。
类似地，例如转录激活子或其顺式调控结合元件的复制这种修饰导致转录的进一步增加。导致更高速率的活化或更高效率活化的修饰可导致更高水平的mRNA。
对小RNA，如微RNA，对编码或生成小RNA的序列或在靶标基因中其互补靶标位点的修饰可以通过增加更高稳态水平的mRNA而相应地导致对靶基因的基因表达的抑制减少。
本发明涉及RDR1基因，其包含修饰的调控元件，其中所述调控元件选自转录抑制子的转录因子结合位点，对其进行的修饰导致转录抑制的减少或缺失；和/或转录激活子的转录因子结合位点，对其进行的修饰导致转录的诱导或增强；和/或微小RNA结合位点，其中所述修饰导致基因抑制的减少或缺失；和/或小RNA序列，例如微小RNA序列，其中所述修饰导致基因抑制的减少或缺失。
在一个实施方式中，增加RDR1基因的mRNA水平和/或RDR1蛋白质水平和/或RDR1蛋白活性的修饰包括顺式作用元件的删除或部分删除，优选地为转录抑制子的转录因子结合位点的删除或部分删除。
在一个实施方式中，增加RDR1基因的mRNA水平和/或RDR1蛋白质水平和/或RDR1蛋白活性的修饰包括在RDR1基因的启动子或5'-UTR区域中的修饰，优选地为对启动子或5'-UTR区域中的顺式作用元件的修饰。
在一个实施方式中，RDR1基因中的修饰是在RDR1基因的5'-UTR区域的外显子中的修饰，优选地为对5'-UTR区域的外显子中的顺式作用元件的修饰。
在进一步优选的实施方式中，所述修饰包括对外显子中转录抑制子的转录因子结合位点的删除或部分删除，任选在RDR1基因的5'-UTR区域的第一外显子中。
在一个实施方式中，修饰的RDR1基因是内源性RDR1基因。
在形成本发明的研究过程中，鉴定了黄瓜(Cucumis sativus)植物，其包括RDR基因中的突变。该突变导致增强的表达，这是检测为所述RDR基因的稳态mRNA水平的显著增加。所述具体的修饰的RDR基因被归类为属于RDRα类，因为它包含的典型DLDGD基序，特别，属于RDR1基因簇。该基因在下文被记为CsRDR1_II。野生型CsRDR1_II序列可见于图1(SEQID No.4(DNA)和SEQ ID No.5(蛋白质))。
进一步的研究发现在CsRDR1_II基因中的突变是在所述CsRDR1_II基因的CDS的ATG起始密码子的上游约1000bp处的46bp的删除。更具体地，该删除被确定为在5'-UTR中，特别在基因的5'-UTR区的第一外显子中(图2，SEQ ID No.6)。
蛋白质编码基因的CDS的上游区域通常包括大量的顺式调控元件。在某些情况下，它也可以具有能潜在地形成小RNA，特别是微小RNA的序列。因此该上游区域的修饰对基因表达有影响。
所述CsRDR1_II基因的野生型序列包括大量编码修饰区域内顺式调节元件的序列，特别是在5'-UTR的第一外显子中，这些序列受到所述删除的影响。所鉴定的在5'-UTR中的顺式调控元件包括至少两个编码PY盒或嘧啶盒的短序列，其充当转录因子结合位点。所述删除包括其中一个PY盒的一部分，从而导致功该特定PY盒的功能缺失。此外，具有WAAAG序列(其中W可以是A或T)的转录因子(TF)结合位点位于修饰区域中并被部分删除(实施例1)。任选地，其他TF结合位点也位于修饰内并受到所述修饰的影响。
除了TF结合位点，所述CsRDR1_II基因的5'-UTR区包含约23nt的片段，其被鉴定为可能以微小RNA样方式起作用。编码该miRNA样元件的序列的一部分已被删除，留下无功能的miRNA样元件(实施例1)。
微小RNA通常需要靶标mRNA序列用于配对，对植物而言这段序列通常位于蛋白质编码基因的CDS中。显著地，已确定黄瓜CsRDR1_II基因的CDS的3'端本身就包括用于所检测到的miRNA样元件的合理靶序列，这一点由其与该基因的5'-UTR中检测到的miRNA样元件有高水平的序列互补性得到表明。
随后进行详细研究，非常令人惊讶且极有趣地检测到在黄瓜基因组中其他RDR1基因在其各自的CDS的3'-末端都包括与来自CsRDR1_II的微小RNA样元件几乎完全互补的靶序列(实施例2，图3)。
得出结论为起始密码子上游，特别是在黄瓜CsRDR1_II基因的5'-UTR中调控元件的删除或部分删除，导致CsRDR1_II基因的mRNA水平增加。所述删除或部分删除使该调控元件无功能。所述无功能的调控元件导致mRNA水平增加。所述mRNA的增加导致CsRDR1_II基因的增强表达。
在一个实施方式中，本发明涉及修饰的RDR1基因，其包含在5'-UTR的第一外显子中的删除。在一个优选实施方式中，RDR1基因的5'-UTR的第一外显子中的删除包括顺式作用元件的删除或部分删除，其中顺式作用元件优选地为转录因子结合位点，更优选地为转录抑制子结合位点，和/或miRNA或miRNA样元件的删除或部分删除。
在一个特定的实施方式中，所述修饰的顺式作用元件是SEQ ID No.1和/或SEQ IDNo.2的转录因子结合位点，且所述修饰的miRNA或miRNA样元件包含SEQ ID No.3(表1)。
在某一特定方面，5'-UTR的第一外显子的删除包括SEQ ID No.6，任选与SEQ IDNo.7(见表1)的插入相结合。
表1.
Figure BDA0001123088850000081
Figure BDA0001123088850000091
表1:
SEQ ID No.1的前四个核苷酸(粗体)与SEQ ID No.6的最后四个核苷酸互补，被删除。因此，PY盒被部分删除。
SEQ ID No.2与SEQ ID No.6最后五个核苷酸互补，被删除。因此该TF结合位点被完全删除。
SEQ ID No.3的前14个核苷酸(粗体)与SEQ ID No.6号的前14个核苷酸反向互补。因此该miRNA样元件被部分删除。
在一个实施方式中，本发明涉及修饰的RDR1基因，其中所述修饰导致增强的表达，且其中所述修饰包括调控元件的删除或部分删除，所述调控元件包含SEQ ID No.1和/或SEQ IDNo.2和/或SEQ ID No.3。
在一个具体的实施方式中，本发明RDR1基因的野生型序列是由SEQ ID No.4(黄瓜(Cucumis sativus))，SEQ ID No.8和21(胡萝卜(Daucus carota))，SEQ ID No.9和20(番茄(Solanum lycopersicum))、SEQ ID No.10和19(西瓜(Citrullus lanatus))、SEQ IDNo.11和22(甜瓜(Cucumis melo))、SEQ ID No.12和27(菠菜(Spinacia oleracea))、SEQID No.13和23(菜豆(Phaseolus vulgaris))，SEQ ID No.14和29(菠菜(Spinaciaoleracea))、SEQ ID No.15和28(甜菜(Beta vulgaris))、SEQ ID No.16和24(莴苣，(Lactuca sativa)、SEQ ID No.17和26(甘蓝(Brassica oleracea))或SEQ ID No.18和25(莴苣(Lactuca sativa))所示。当两个SEQ ID No.表示一特定的作物种类时，第一个序列指的是起始密码子的上游2kb的序列，包括启动子和5'-UTR区，而第二个序列指代CDS，包括起始密码子。
本发明还涉及修饰的RDR1基因用于在包含所述修饰的RDR1基因的植物中赋予和/或增加针对RNA病毒的病毒抗性的用途，所述抗性和/或增加的抗性是由修饰的RDR1相比非修饰的野生型RDR1基因的表达的增强表达而引起的。所述修饰的RDR1基因能够赋予或增加其中存在所述修饰的RDR1基因的植物的病毒抗性，特别是选自以下任意物种的植物：菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄或西瓜。
在植物中修饰的RDR1基因的增强表达表现为RDR1基因的mRNA水平的增加，和/或RDR1蛋白质水平的增加，和/或RDR1蛋白质活性的增加。
本发明进一步提供了包含本发明的修饰的RDR1基因的植物，相比包含野生型RDR1基因的植物，所述植物由于修饰的RDR1基因的增强表达而显示出针对病毒的抗性和/或增加的抗性。根据进一步的方面，本发明提供了植物，其中所述RDR1基因的修饰包括基因的起始密码子的上游调控元件的删除或部分删除，任选在5'-UTR中。更具体地，本发明提供了植物，其中所述RDR1基因的修饰包括顺式作用元件的删除或部分删除，其中顺式作用元件优选地为转录因子结合位点，更优选地为转录抑制子结合位点，和/或miRNA或miRNA样元件的删除或部分删除。
如本文中所使用的，示出和/或增加抗性意味着修饰的RDR1基因的存在导致没有针对特定病毒的抗性的植物中产生一定水平的病毒抗性，和/或修饰的RDR1基因的存在在已具有针对特定病毒的一定水平抗性的植物中增加所述抗性。抗性水平是与不包含本发明的修饰的RDR1基因的等基因植物相比的。
在一个特定的实施方式中，本发明的植物包含修饰的RDR1基因，其中所述修饰是包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No 2的修饰的转录因子结合位点，和/或包含SEQ ID No 3的修饰的miRNA或miRNA样元件(表1)。
本发明的植物是这样的植物，其中直向同源RDR1基因得到适当的修饰，该修饰导致增强的RDR1表达，例如为选自以下任意物种的植物：菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄、西瓜或水稻。
包含本发明的修饰的RDR1基因的植物显示出病毒抗性和/或具有增加的病毒抗性，其中所述修饰导致RDR1基因的增强表达。所述RDR1基因的增加表达被认为导致dsRNA的增强形成，这进而又可能导致siRNA产生的更高速率。所述更高水平的siRNA可以随后在RISC中有效地使用，从而增加活化和病毒RNA降解的更高速率。该系统使得能够在不同作物品种中由于增加的RDR1基因表达而建立广泛的病毒抗性。
由于此机制，RDR1基因表达在植物产生的和/或增加的抗性所针对的病毒属于具有RNA基因组的病毒，优选地为单链RNA病毒，可以为单个正链RNA基因组((+)RNA病毒或(+)ssRNA病毒)或单个负链RNA基因组((-)RNA病毒)。常见的具有(+)RNA基因组的植物病毒家族包括马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，例如番薯病毒属(Ipomovirus)、马铃薯Y病毒属和帚状病毒科(Virgaviridae)，包括烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。具有(-)RNA基因组的病毒家族包括布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，例如番茄斑萎病毒属(Tospovirus)家族。植物中所述具有增强表达的修饰的RDR1基因的存在，优选地赋予和/或增加针对一种或多种(+)RNA病毒，特别是马铃薯Y病毒科家族和/或帚状病毒科家族的抗性。
本发明还涉及包含本发明的修饰的RDR1基因的种子，其中由所述种子生长的植物显示出针对一种或多种RNA病毒的抗性和/或增加的抗性，特别是针对马铃薯Y病毒科家族和/或帚状病毒科家族的一种或多种RNA病毒的抗性。本发明的种子优选是以下任意物种的种子：菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄或西瓜。
属于RNA病毒并通过感染大量栽培作物导致重大问题的病毒物种为例如，但不限于，黄瓜脉黄化病毒(CVYV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、木瓜环斑病毒(PRSV)、西瓜花叶病毒(WMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)、辣椒斑驳病毒(PepMoV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、大豆花叶病毒(SMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、番茄托拉多病毒(ToTV)、凤果花叶病毒(PepMV)、花生芽坏死病毒(PBNV)和番茄斑萎病毒(TSWV)。
包含本发明的修饰的RDR1基因的植物优选地显示出对CVYV的抗性，任选地与增加的对CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性相组合。
进行进一步的研究，观察本发明的修饰的RDR1基因在黄瓜(Cucumis sativus)中的效果。发现包含导致增强的CsRDR1_II表达的修饰的CsRDR1_II基因的黄瓜植物具有病毒抗性和/或增加的病毒抗性。所述黄瓜植物特别显示出对一种或多种RNA病毒，更具体地为针对一种或多种(+)ssRNA病毒的抗性和/或增加的抗性。观察到所述黄瓜植物具有CVYV抗性和任选地也显示出增加的抗CMV抗性和/或CGMMV抗性和/或ZYMV抗性。一种植物，优选黄瓜植物，其包含本发明的修饰的CSRDR1_II基因，优选地显示出CVYV抗性，任选地与增加的CMV抗性相组合(实施例3)。
本发明涉及一种修饰的CsRDR1_II基因，该修饰导致CsRDR1_II基因的增强表达，其中当所述修饰的CsRDR1_II基因存在于黄瓜植物中时，其能够赋予和/或增加对CVYV和/或ZYMV和/或CMV和/或CGMMV的抗性。修饰的CsRDR1_II基因尤其能够在黄瓜中赋予对CVYV的抗性，并增加对CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性。本发明的一部分是黄瓜植物，其包含本发明的修饰的CsRDR1_II基因并显示出对CVYV抗性和增加的对CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性。
在一个具体的实施方式中，CsRDR1_II基因中的修饰是在5'-UTR的第一外显子中删除SEQ ID No.6，任选地与SEQ ID No.7的5bp的插入相组合(见表1)。
在一个具体的实施方式中，CsRDR1_II基因中的修饰是使得5'-UTR中的调控元件变得无功能的修饰，特别是包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No 3，或其组合的调控元件。所述调控元件的无功能性可以由所述各SEQ ID No中一个或多个序列的突变或删除或部分删除而实现。
本发明进一步涉及修饰的CsRDR1_II基因用于赋予和/或增加黄瓜植物的病毒抗性或者在黄瓜植物中赋予和/或增加病毒抗性的用途，优选赋予和/或增加对CVYV和/或CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性，最优选赋予其针对CVYV的病毒抗性，任选地与对CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的增加的抗性相组合，其中所述修饰导致CsRDR1_II基因的增强表达。
本发明的一部分还是植物，特别为黄瓜植物，其包含如本文公开的修饰的CsRDR1_II基因。
一旦该基因存在于植物中，导致增强的RDR1基因表达的修饰类型则会产生病毒抗性和/或增加的病毒抗性。当植物为性相容时，可使用杂交将本发明的修饰的RDR1基因从包含修饰的RDR1基因的植物向缺乏修饰的RDR1基因的植物中进行基因渗入，任选地组合以辅助活力种子发育或促进其发育成植物的技术。在具体情况下，可使用标准育种方法将修饰的CsRDR1_II基因从包含修饰的CsRDR1_II基因的黄瓜植物向缺乏修饰的CsRDR1_II基因的黄瓜植物中进行基因渗入。
杂交后任选进行胚胎拯救技术或其他技术，使得组合和基因渗入成功完成，所述技术为本领域技术人员已知。
技术上而言，可在很多作物中鉴定RDR1直向同源物，用于此的方法在本领域已知。在本研究中，使用Blast程序将CsRDR1_II序列与其他植物基因组的序列进行比对。将最佳匹配鉴定为候选RDR1基因。之后，除此之外还基于共同基序进一步选择最接近的匹配(实施例5)。最接近的匹配被认为是CsRDR1_II基因的功能性直向同源物，发现其当表达增强时会输送和/或增加抗性。基于相同的机制，在植物物种中功能上等价的RDR1基因的增强表达会导致所述作物中的病毒抗性和/或增加的病毒抗性。
在一个实施方式中，具有增强表达的修饰的RDR1基因是对于CsRDR1_II而言修饰的RDR1基因的直向同源物，图4和图5中给出以下物种的所述直向同源物的实例：菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄、西瓜、水稻和拟南芥。
在一个实施方式中，本发明涉及生产显示出针对一种或多种RNA病毒的抗性和/或具有增加的抗性的植物的方法，特别是针对马铃薯Y病毒科家族和/或帚状病毒科家族的一种或多种RNA病毒，该方法包括修饰RDR1基因，由所述修饰导致增强表达，特别是对由SEQID No.4(黄瓜)、SEQ ID No.8和21(胡萝卜)、SEQ ID No.9和20(番茄)、SEQ ID No.10和19(西瓜)、SEQ ID No.11和22(甜瓜)、SEQ ID No.12和27(菠菜)、SEQ ID No.13和23(菜豆)、SEQ ID No.14和29(菠菜)、SEQ ID No.15和28(甜菜)、SEQ ID No.16和24(莴苣)、SEQ IDNo.17和26(甘蓝)或SEQ ID No.18和25(莴苣)所示的RDR1基因进行修饰。
如前所述，已经在多种作物中鉴定出RDR1基因的直向同源物并将其分组。本研究通过比较共同蛋白质基序，具体地鉴定出最类似于CsRDR1_II序列的RDR1基因。每种直向同源RDR1基因都在其起始密码子的上游、启动子和/或5'-UTR序列、CDS和/或3’-UTR内具有调控元件，特别是顺式调控元件。调控元件的序列基序是本领域技术人员已知或可识别的，且可通过技术人员已知的技术进行鉴定。调控元件的合适修饰导致基因的增强表达，而这些直向同源的修饰的RDR1基因也是本发明的基因。
合适的修饰包括对转录抑制子的转录因子(TF)结合位点的修饰，所述修饰导致转录抑制的减少或缺失；对转录激活子的转录因子结合位点的修饰，所述修饰导致转录的诱导或增强；对微小RNA结合位点的修饰，所述修饰导致基因抑制的减少或缺失；及/或对小RNA序列的修饰，特别为微小RNA序列的修饰，所述修饰导致基因抑制的减少或缺失。
包含TF结合位点、微小RNA结合位点或微小RNA序列的至少部分删除或改变的修饰通常导致所述调控元件的无功能性。当这种元件参与基因抑制时，所述无功能性将减少抑制并导致该基因相比于具有功能性调控元件的基因的增强表达。
在一个实施方式中，通过诱变的方式将所述修饰引入对于CsRDR1_II为直向同源的内源RDR1基因中。诱变包括通过使用一种或多种化学化合物，如甲基磺酸乙酯、亚硝甲脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、聚氨酯、苯酚和环氧乙烷，和/或通过物理方法，如UV-辐射、快中子照射、X射线、γ射线辐射，和/或通过遗传元件，如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件的插入而随机引入至少一个修饰。
诱变还包括通过同源重组、基于寡核苷酸诱导突变、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)系统更特异地靶向性引入至少一个修饰。
备选地，可使用遗传修饰方法将本发明的修饰的RDR1基因引入植物中。遗传修饰包括使用来自不可杂交物种的基因或合成基因进行异源转基因修饰或同源转基因，以及使用来自作物植物本身或其性相容供体植物的编码某种(农业)性状的天然基因进行同源转基因修饰或同源转基因。
在一个实施方式中，修饰的RDR1基因是外源RDR1基因，可通过异源转基因方法或同源转基因方法将其引入植物中。
本发明还涉及修饰的重组RDR1基因，其中所述修饰的重组RDR1基因的表达由强启动子驱动，所述启动子可操作地连接至RDR1基因序列，所述基因序列包括5’-UTR、CDS，和/或3’-UTR。很多强的组成型启动子的实例在本领域已知；其中最常用的是例如花椰菜花叶病毒35S-启动子(pCaMV 35S)及其修饰形式、来自多种植物物种的泛素启动子、来自多种植物物种的肌动蛋白启动子，以及延伸因子1α(EIF1)启动子。
在一个实施方式中，本发明涉及基因构建物，所述基因构建物包含选择性标记物、启动子序列、RDR1基因序列及终止子序列。
本发明确立的是，RDR1基因的增强活性导致及/或增加植物的病毒抗性，优选地为对一种或多种RNA病毒的抗性，更优选对一种或多种(+)ssRNA病毒的抗性、甚至更优选地对一种或多种属于马铃薯Y病毒科家族和/或帚状病毒科家族的病毒的抗性。
在一个实施方式中，修饰的，特别为增强的RDR1基因表达在植物中导致和/或增加对CVYV和/或CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性，所述植物属于黄瓜属，特别属于黄瓜和/或甜瓜。在一个优选的实施方式中，修饰的，特别为增强的RDR1基因表达在植物中导致对CVYV的抗性并增加对CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性，所述植物属于黄瓜属，特别属于黄瓜和/或甜瓜。在一个最优选的实施方式中，修饰的，特别为增强的RDR1基因表达在植物中导致对CVYV的抗性并增加对CMV的抗性，所述植物属于黄瓜属，特别属于黄瓜和/或甜瓜。
基因的增强活性或上调可以以很多方式获得。可将RDR1基因的启动子或5’-UTR区域(该启动子或5’-UTR区域经修饰而使转录增加)与非修饰的，任选地内源的RDR1基因序列相组合。
还可以通过例如使用包括增强基因表达的强启动子与RDR基因的cDNA序列组合的构建物诱导过表达的方式上调RDR1基因表达(实施例4)。
在一个进一步的实施方式中，目标在于过表达RDR1基因的任意异源转基因方法都可能涉及可诱导启动子序列的用途。在此种方法中，可使用外部因子或处理，凭借这些外部因子或处理对可操作地连接至所述异源转基因核酸序列的启动子序列活性的影响而诱导和/或调制异源转基因的时间和/或空间表达模式。所述可诱导启动子可选自热诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子，醇诱导型启动子或其他。用诱导可诱导启动子的活性的试剂和/或条件(例如热休克或热处理、特定化学物质、特定类固醇如地塞米松，或醇)对异源转基因植物的处理激活可诱导启动子，其使得异源转基因的瞬时(过)表达。
用于并入修饰的RDR1基因的异源转基因方法可导致受体植物中增强的RDR1表达或过表达，所述方法包括其他植物物种的启动子和5’-UTR，或使用RDR1基因的CDS组合增强基因表达的其他强启动子和/或前导序列。而增强的或过表达的RDR1基因并入到植物中可导致和/或增加该植物的病毒抗性。
除了增强RDR1基因的转录活性，复制基因组中RDR1基因座也可实现相同的效果。在这种情况下，从两个或更多分开的基因座转录出高度相似的转录物，这可导致mRNA及所编码蛋白质的更高稳态水平。
附图
图1-黄瓜CsRDR1_II的DNA(SEQ ID No.4，包括上游2kb序列)和蛋白质序列(SEQID No.5)。
图2-修饰的CsRDR1_II基因的5'-UTR中被删除的序列。这46bp序列ctttccatggccataacaccaaatattctctattgaatgtaatttc(SEQ ID No.6)存在于易感(“vatbaar”)植物的5'-UTR中，但在抗性植物中被删除。此外，存在一个短得多的5bp序列的插入：acctg(SEQ IDNo.7)。
图3-CsRDR1_II的微小RNA样元件的序列(表1，SEQ ID No.3)及与CsRDR1_II和黄瓜的其他两个RDR1基因的CDS的3'端的潜在靶序列的比对情况。(SEQ ID No.52-55)。
图4-菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄、西瓜、水稻、拟南芥中CsRDR1_II直向同源物的DNA序列。图4a给出了起始密码子的上游2kb的序列(SEQ ID No.8-18)，图4b给出了比对的这些序列。图4c给出从ATG开始的基因序列(SEQ ID No.19-29)，图4d给出了比对的这些序列。下文的概述指出在图4b，4d和5b中比对的序列中哪些SEQ IDNo.被连接至哪个物种。
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图5-在菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄、西瓜、水稻、拟南芥中CsRDR1_II直向同源物(SEQ ID No.30-51)的蛋白质序列(图5a)和蛋白序列比对(图5b)。
图6-CsRDR1_II及其已鉴定的直向同源基因的系统发育树。CsRDR1_II被表示为Cucumber_cs9930v2_emv_14138。对于这些物种，最类似CsRDR1_II的基因用*指出。其他基因关系稍远，但仍然包含相同的基序。
图7-CsRDR1_II基因的上调的相对表达报告，呈现为mRNA水平的增加。在图7a中给出结果，其中P(H1)是备选假设样品组和对照组之间的差异仅出于偶然的概率。TRG为目标值，REF为参考值。
图7b中的图表是箱形图，其中，箱形表示四分位范围，或观察值的中间50％的值。虚线代表基因表达中位数，竖线表示最小和最大的观察值。
图7c给出非标准化的结果，其不具有相对选定管家基因标准化的表达值。
实施例
实施例1
黄瓜中的RDR1修饰
在黄瓜基因组中鉴定出在5号染色体上的两个相邻RDR1基因，这两个RDR1基因反向分布。对黄瓜植物群体进行遗传分析并对5号染色体上的RDR1基因重新测序。重新测序结果表明，RDR1基因之一在整个群体中表现为单态，记为CsRDR1_I。然而另一个RDR1基因在编码区为单态性，但其在含有启动子和5'-UTR的ATG起始密码子的上游区域表现为多态性，记为CsRDR1_II。所述黄瓜CsRDR1_II基因和蛋白质序列示于图1。
所检测的多态性为ATG密码子的上游约1000bp处46bp的删除，在限定5'-UTR的区域中。取代该片段，在这个位置存在短的5bp的插入(图2)。为确定该删除是否对基因表达有效果，测定CsRDR1_II mRNA的稳态水平。分析结果表明相比具有野生型CsRDR1_II基因的植物中mRNA的水平，具有所述删除的黄瓜植物中稳态CsRDR1_II mRNA的水平为约100倍高(图7)。
推测CDS的上游区域中的删除已破坏转录起始的抑制子的功能，该破坏导致有mRNA水平的更高积累。
实施例2
调控元件检测
对发生删除的区域的进一步研究的确显示出存在有数个顺式调控元件。所述46bp删除的后果是这些元件中的一个(被鉴定为嘧啶盒或PY盒)被部分删除。部分删除使PY盒变成无功能。所述PY盒是可参与mRNA转录抑制的TF结合位点。PY盒的无功能性随后则通过降低基因抑制导致更高水平的稳态mRNA(图2)。
附加的PY盒存在于基因的起始密码子的上游区域中。在其他PY盒之一中进行附加的修饰可能导致甚至更高的mRNA水平，这一点是很有用的。备选地，在野生型RDR1基因的其他顺式调节元件，诸如其他PY盒中的修饰可能导致与本研究中观察到的相同的效果。
此外，详细的研究显示在CsRDR1_II基因的CDS的上游修饰的区域中可能存在另一个调控元件。鉴定出一个23nt的片段，它可能充当微小RNA。该元件在本文中称为“微小RNA样”，其似乎在CsRDR1_II基因的CDS的3'端有近乎互补的反向靶序列(表1，SEQ ID No.3；图3)。
黄瓜基因组中还进一步包含至少两种具有DLDGD基序的RDR1基因。这两个基因都令人意外地显示出在其CDS区的3'末端中的高度互补的23nt片段，表明CsRDR1_II基因的元件很可能成为微小RNA的候选(图3)。
在修饰的CsRDR1_II基因中的46bp删除包含部分的所述微小RNA样元件。部分删除通常使某个元件变得无功能。本元件能够以顺式调控和/或反式调控的方式起作用。这样的顺式和/或反式作用的微小RNA的非功能性对CsRDR1_II基因和/或其他靶基因的mRNA水平有影响。
被定位于修饰的区域中的第三个调节元件是具有保守WAAAG核心基序的转录因子(TF)结合位点，其中W可以是A或T。结合于此位点的转录因子属于C2C2-Dof蛋白质家族，已知其参与几个过程中基因表达的调控，包括植物防御机制。所述鉴定出的46bp删除包括该结合位点的一部分，这使此TF结合位点失活，有可能影响基因的转录和随后的表达。
实施例3
与修饰的CsRDR1_II相关的病毒抗性
比较含有如实施例1中所描述的两个野生型RDR1基因(分别标记为CsRDR1_I和CsRDR1_II)的黄瓜植物与含有至少一个修饰的CsRDR1_II基因的植物对病毒的抗性。所述修饰是如上文实施例中所描述的删除。
设计PCR测定法以能够在植物群体中区分两个CsRDR1_II等位基因。就对CVYV、CMV、CGMMV和ZYMV的抗性，筛选含有野生型CsRDR1_II基因和修饰的CsRDR1_II等位基因的植物。
在黄瓜中，修饰的CsRDR1_II等位基因与随后基因的增强表达，以及对CVYV的抗性之间有完美的关联性。此外，修饰的CsRDR1_II等位基因的存在影响对CMV和/或CGMMV和/或ZYMV的抗性。对于这些病毒，修饰的CsRDR1_II等位基因及由此的基因的增强表达都有助于抗性水平。在对CMV、ZYMV和/或CGMMV的抗性的实际存在情况和抗性水平中，也涉及其他抗性基因，但一旦存在那些其他抗性基因，其与增强的CsRDR1_II基因表达的组合导致抗性的增加或增强水平。
实施例4
RDR1基因的异源转基因过表达导致甜瓜中产生CVYV抗性
设计甜瓜的直向同源RDR1基因的过表达构建物(图4)，其包含RDR1基因的全长cDNA，可操作地连接到花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子上，并连接到nos终止子。已通过RT-PCR从甜瓜叶的cDNA文库获得cDNA序列(包括5'UTR)。所述构建物还进一步包括NPTII基因(赋予卡那霉素抗性)，作为植物选择性标记(在NOS启动子控制下)。
随后使用Guis等人,2000(Sci.Hort.8:91-99)开发的用于罗马甜瓜(Cantaloupemelon)的改进转化方案将此构建物引入对CVYV易感的甜瓜品系基因组中。选择十个独立的至少携带一个拷贝异源转基因构建体的T0甜瓜植物，并且将这些植物与一组相同的遗传背景的未转化植物一起在生长室中培养。对所有植物接种CVYV病毒，随后监测症状。
在未转化的对照植物中观察到独特的叶脉变黄，而经转化的品系显示无症状或只显示轻微的症状。通过半定量RT-PCR的方法研究RDR1直向同源物的表达水平，结果显示无症状异源转基因品系具有RDR1基因的最高表达水平，而有轻微症状的异源转基因品系的表达水平介于野生型水平和没有症状的异源转基因品系的水平之间。这证实了在一方面甜瓜中RDR1基因的升高表达水平与另一方面对CVYV病毒的抗性水平之间有良好的关联性。
实施例5
CsRDR1_II直向同源物的鉴定
已知多种作物物种中都存在有RDR1基因。通过使用核苷酸Blasting程序(BLASTN)比较CsRDR1_II序列与其他作物物种的序列来鉴定CsRDR1_II基因的直向同源物。随后使用蛋白注解程序UniProt在功能上预测最佳命中，对每种作物产生5-6个候选基因。将这些基因选作进一步分析。使用RDR1蛋白质中共同保守的数个基序的存在情况及对所述基因序列起始和结束区域相似性的特别关注，以进一步指定最相似的那些基因。通过此方法鉴定出的直向同源物的DNA和蛋白质序列呈现于图4和图5中。
在图5中所提到的CsRDR1_II及其直向同源物中鉴定出的蛋白质基序如下：CSGS、DLDGD、AVDF(PA)KTG、ASAWY、A(FY)QIRY。最相似的直向同源基因见于西瓜中(Citrulluslanatus)。所述多个直向同源物之间的关系及由此的相似性呈现为图6的系统发育树，用Clustal程序制作。
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Claims (13)

1.修饰的RDR1基因，其能够赋予植物以病毒抗性及/或增加植物中的病毒抗性，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，其中所述修饰包含在RDR1基因的5’-UTR区域中由SEQ ID NO:6代表的46bp缺失，并且其中所述RDR1基因的野生型序列由SEQ ID NO:4表示，其中所述修饰的RDR1基因能够对其中存在该修饰的RDR1基因的植物赋予和/或增加对马铃薯Y病毒科的一种或多种病毒的抗性。
2.权利要求1所述的基因，其中由SEQ ID NO:6所代表的46bp缺失被SEQ ID NO:7所代表的5bp插入所取代。
3.修饰的CsRDR1_II基因，其野生型由SEQ ID No.4所示，所述修饰包含在5’-UTR区域中的SEQ ID NO:6代表的46bp缺失，导致CsRDR1_II基因的增强表达，其中所述修饰的CsRDR1_II基因当存在于黄瓜植物中时，能够赋予和/或增加对CVYV的抗性，任选地与增加对CMV的抗性相组合。
4.权利要求3所述的基因，其中由SEQ ID NO:6所代表的46bp缺失被SEQ ID NO:7所代表的5bp插入所取代。
5.权利要求1或2所述的修饰的RDR1基因用于对包含该修饰的RDR1基因的植物赋予和/或增加病毒抗性的用途，所述赋予和/或增加的病毒抗性由相比于非修饰的野生型RDR1基因的表达，所述修饰的RDR1基因的增强表达引起。
6.权利要求5中所述的修饰的RDR1基因用于在植物中赋予和/或增加对一种或多种RNA病毒的抗性的用途，其中所述植物选自以下任意物种：菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番茄、西瓜或水稻。
7.权利要求6中所述的修饰的RDR1基因的用途，其中所述一种或多种RNA病毒是马铃薯Y病毒科的RNA病毒。
8.权利要求3或权利要求4中所述的修饰的CsRDR1_II基因用于对黄瓜植物赋予和/或增加对CVYV的病毒抗性的用途。
9.对植物赋予和/或增加病毒抗性的方法，其中包括，与未修饰的野生型RDR1基因的表达相比，增强所述植物中权利要求1所述的经修饰的RDR1基因的表达。
10.对黄瓜植物赋予和/或增加病毒抗性的方法，其中包括，在所述植物中修饰权利要求3所述的CsRDR1 II基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中组合进行增加对CMV的抗性。
12.生产显示针对马铃薯Y病毒科的一种或多种病毒的抗性或增加的抗性的植物的方法，其中包括修饰RDR1基因，从而所述修饰导致增加的表达，其中待修饰的RDR1基因由SEQID NO:4表示，并且所述修饰包含在RDR1基因的5’-UTR区域中由SEQ ID NO:6代表的46bp缺失。
13.权利要求3或权利要求4中所述的修饰的CsRDR1_II基因的用途，用于对黄瓜植物赋予和/或增加对CVYV的病毒抗性并且与增加对CMV的抗性相组合。
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