ES2976307T3

ES2976307T3 - Formulaciones de partículas lipídicas para la entrega de ARN y compuestos terapéuticamente eficaces solubles en agua a una célula diana

Info

Publication number: ES2976307T3
Application number: ES16712339T
Authority: ES
Inventors: Hossam Hefesha; Ugur Sahin; Heinrich Haas; Sebastian Kreiter; Yves Hüsemann; Mustafa Diken; Kerstin Reuter
Original assignee: Tron Translationale Onkologie An Derunivsmedizin Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gm; Biontech SE
Current assignee: Tron Translationale Onkologie An Derunivsmedizin Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gm; Biontech SE
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2024-07-29
Anticipated expiration: 2036-03-30
Also published as: JP2018513143A; US11337922B2; EP3277263B1; US11045418B2; EP3277263A1; US20220249372A1; WO2016156398A1; US20210338580A1; JP6716600B2; HK1250009A1; WO2016155809A1; US20180263907A1; AU2016239318A1; AU2016239318B2; CA2978980A1; CA2978980C

Abstract

La presente invención se refiere a partículas lipídicas que comprenden al menos un lípido catiónico, al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua y ARN. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende tales partículas. Dicha composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta inmune. También es útil en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que implica un antígeno. Además, la presente invención se refiere a un método para producir las partículas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de partículas lipídicas para la entrega de ARN y compuestos terapéuticamente eficaces solubles en agua a una célula diana

Campo técnico

La presente invención se refiere a partículas lipídicas que comprenden ARN y uno o más bifosfonatos y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas partículas para la administración tanto del ARN como del(los) bifosfonato(s) a un órgano diana o una célula diana después de la administración parenteral. Más detalladamente, las partículas comprenden lipoplexes de ARN que comprenden al menos un lípido catiónico y ARN y uno o más bifosfonatos. El ARN y los bifosfonatos son absorbidos por la célula, el ARN se traduce preferiblemente en un péptido o proteína y los bifosfonatos estimulan las células T γδ. La composición farmacéutica de la invención es aplicable para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria. También es útil en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que implica un antígeno tal como una proteína. Además, la presente invención se refiere a un método para producir dichas partículas lipídicas que comprenden ARN y uno o más bifosfonatos.

Antecedentes

El desarrollo de formulaciones farmacéuticas inyectables para la administración de compuestos farmacéuticamente activos es una necesidad insatisfecha con diversas aplicaciones terapéuticas como el tratamiento del cáncer u otras enfermedades graves. Para ello se han desarrollado diferentes tipos de formulaciones de nanopartículas para la administración de fármacos. Normalmente, la partícula portadora se optimiza de acuerdo con las propiedades moleculares del fármaco que se va a administrar.

Un mecanismo de absorción típi

ingerida se encierra primero en el endosoma. Para aplicaciones terapéuticas, a menudo es necesario que la carga se libere desde el endosoma al citosol. Los principales obstáculos en el desarrollo farmacéutico de formulaciones de administración de fármacos para compuestos solubles en agua son la liberación no deseada de la carga antes de la absorción celular, así como la liberación ineficiente desde la luz endosómica al citosol.

La liberación de ciertos compuestos solubles en agua se puede lograr usando vesículas lipídicas vesiculares que proporcionan un transporte seguro al sitio objetivo al encapsular completamente la molécula activa. Dichos portadores vesiculares deben ser suficientemente estables para evitar la liberación prematura de la carga y apoyar la entrada celular de la vesícula integral. Por lo tanto, los lípidos similares a fluidos que se usan comúnmente para la transfección no son adecuados para tal fin.

También se sabe en la técnica que el ADN y el ARN pueden administrarse mediante las denominadas formulaciones lipoplex, en las que el ADN o el ARN se unen a lípidos o liposomas catiónicos para formar formulaciones de nanopartículas inyectables.

Los requisitos de los sistemas descritos para la administración tanto de ácidos nucleicos con un peso molecular sustancial como de pequeñas moléculas solubles en agua tienden a excluirse entre sí. Para la administración de pequeñas moléculas solubles en agua, se prefieren vehículos vesiculares como liposomas o cápsulas ya que son suficientemente estables para evitar una liberación no deseada. Sin embargo, dichos vehículos vesiculares no son ideales para el transporte de polielectrolitos biológicos con peso molecular moderado o alto, como ARN o ADN, porque la eficacia de encapsulación es a menudo baja y pueden provocar interacciones electrostáticas de los ácidos nucleicos con la membrana lipídica de la partícula portadora pueden evocar defectos como huecos y agujeros que aceleran las fugas y la liberación prematura de las pequeñas moléculas encapsuladas. Por tanto, las diferentes propiedades moleculares de los compuestos solubles en agua y de los ácidos nucleicos de bajo peso molecular son perjudiciales para la administración conjunta de fármacos de ambas moléculas. Además, la formulación de administración del fármaco debería permitir la traducción del ADN/ARN administrado en proteína.

Por tanto, existe la necesidad de proporcionar formulaciones mejoradas para la administración de moléculas pequeñas y ácidos nucleicos terapéuticamente eficaces a una célula diana. Además, dichas formulaciones deberían permitir la traducción posterior del ácido nucleico contenido en el péptido o proteína que codifica.

El documento WO 2013/143683 A1 se refiere al suministro de formulaciones farmacéuticas para administrar ARN a células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas (CD) en el bazo después de la administración sistémica. Las formulaciones descritas permiten inducir una respuesta inmunitaria después de la administración sistémica de ARN codificante de antígeno.

Los inventores descubrieron sorprendentemente que las partículas lipídicas descritas en el presente documento cumplen todos los requisitos mencionados anteriormente.

Resumen de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una partícula lipídica que comprende:

(i) al menos un lípido catiónico y/o sensible al pH,

(ii) al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua que sea útil en inmunoterapia, y

(iii) ARN que codifica al menos un antígeno, en el que el antígeno es preferiblemente un antígeno asociado a una enfermedad o provoca una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a una enfermedad o células que expresan un antígeno asociado a una enfermedad,

en el que la partícula comprende una organización laminar que comprende de 2 a 40 laminillas por fila, y en el que el compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua que es útil en inmunoterapia es un bifosfonato que estimula las células T γδ.

En una realización, el bifosfonato que estimula las células T γδ estimula las células T V<y>9V82. En una realización preferida, el bifosfonato que estimula las células T γδ es un bifosfonato que contiene nitrógeno (aminobisfosfonato) o se selecciona del grupo que consiste en ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico y sales de los mismos. En algunas realizaciones, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMEPC), 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o o propano 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio (DOTAP).

En algunas realizaciones, la partícula comprende al menos un lípido auxiliar, preferiblemente un lípido neutro o un lípido cargado negativamente. En una realización preferida, el al menos un lípido auxiliar comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol), 1 -palmitoil-2-oleoil-sn- glicero-3fosfocolina (POPC) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOpC).

En algunas realizaciones, la partícula se puede obtener mediante la adición del ARN a una dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua. En una realización preferida, la dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua se puede obtener mediante inyección de una solución de lípidos en etanol en una fase acuosa que comprende al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende partículas lipídicas de acuerdo con el primer aspecto para uso terapéutico, en la que la composición comprende preferiblemente uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización, el uso comprende administración parenteral, preferiblemente mediante administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica o administración intraarterial. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además al menos un adyuvante.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica del segundo aspecto para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria contra el cáncer.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica del segundo aspecto para su uso en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que implica un antígeno, preferiblemente una enfermedad cancerosa.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una partícula lipídica del primer aspecto que comprende las siguientes etapas de:

(i) proporcionar una dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua, y

(ii) agregar ARN a la dispersión lipídica que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua.

En una realización, la dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua se proporciona mediante inyección de una solución de lípidos en etanol en una fase acuosa que comprende al menos un compuesto terapéuticamente compuesto soluble en agua eficaz, en el que el número de cargas positivas derivadas de los lípidos catiónicos dividido por el número de cargas negativas derivadas del ARN está preferiblemente entre 0.025 y 4.

Resumen de la enseñanza

La presente divulgación proporciona enseñanzas que, en algunos aspectos, van más allá de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio e ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención. En particular, no se debe interpretar que los términos “realización” y “aspecto” se refieren necesariamente a una realización de la invención, a menos que la “realización” o “aspecto” en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones.

Las referencias a métodos de tratamiento en el resumen y la descripción detallada deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En un primer aspecto, la presente enseñanza se refiere a una partícula lipídica que comprende:

(i) al menos un lípido catiónico y/o sensible al pH,

(ii) al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua, y

(iii) ARN.

En una realización, el lípido forma una estructura que recibe al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua y el ARN.

En una realización, la partícula de la enseñanza comprende una organización interna laminar. En una realización, la organización interna laminar comprende de 2 a 40, preferiblemente de 2 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, en particular de 3 a 8 laminillas por fila.

En una realización, el ARN es farmacéuticamente activo o codifica al menos un péptido o proteína farmacéuticamente activo tal como un péptido o proteína inmunológicamente activo. En una realización, el ARN codifica al menos un antígeno. En una realización, el antígeno es un antígeno asociado a una enfermedad o provoca una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a una enfermedad o células que expresan un antígeno asociado a una enfermedad.

En una realización, el compuesto terapéuticamente eficaz tiene una masa molecular inferior a 1000 Da. En una realización, el compuesto terapéuticamente eficaz es útil en inmunoterapia. En una realización, el compuesto terapéuticamente eficaz es un agente que estimula las células T γδ, preferiblemente células T Vy9V62. En una realización, el agente que estimula las células T γδ es un bifosfonato, preferiblemente un bifosfonato que contiene nitrógeno (aminobisfosfonato). En una realización, el agente que estimula las células T γδ se selecciona del grupo que consiste en ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico y sus sales.

En una realización, la partícula de la enseñanza comprende al menos un lípido auxiliar. En una realización, el lípido auxiliar es un lípido neutro o un lípido cargado negativamente. En una realización, el al menos un lípido auxiliar comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol), 1 -palmitoil-2-oleoil-snglicerol-3fosfocolina (POPC) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), preferiblemente DOPC, DOPE y/o Chol.

En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMEPC), 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o o propano 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio (DOTAP), preferiblemente DOTAP y/o DOTMA.

En una realización, la partícula de la enseñanza tiene un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1000 nm. En una realización, la partícula tiene un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 800 nm. En una realización, la partícula tiene un diámetro promedio de aproximadamente 200 nm o menos. Las partículas que tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 800 nm son preferiblemente útiles para dirigirse a células presentadoras de antígenos, preferiblemente células presentadoras de antígenos en el bazo, preferiblemente células presentadoras de antígenos profesionales tales como células dendríticas. Las partículas que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 200 nm o menos son preferiblemente útiles para atacar células tumorales.

En una realización, la partícula tiene un diámetro promedio

(i) menor de 200 nm, o

(ii) en el intervalo de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1000 nm, preferiblemente de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 800 nm, más preferiblemente de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 600 nm.

En una realización, la partícula de la enseñanza tiene un potencial zeta negativo.

En una realización, la partícula de la enseñanza se puede obtener mediante la adición del ARN a una dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua. En una realización, la dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua se puede obtener mediante inyección de una solución de lípidos (que comprende al menos un lípido catiónico) en al menos un líquido disolvente orgánico miscible tal como una solución en etanol de los lípidos en una fase acuosa que comprende al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua.

En un segundo aspecto, la presente enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende partículas de acuerdo con el primer aspecto.

En una realización, después de la administración sistémica de las partículas, al menos una porción del ARN y al menos una porción del compuesto terapéuticamente eficaz se administran a una célula diana, preferiblemente a la misma célula diana. En una realización, al menos una porción del ARN y al menos una porción del compuesto terapéuticamente eficaz se administran al citosol de la célula diana. En una realización, el ARN es ARN que codifica un péptido o proteína y el ARN es traducido por la célula diana para producir el péptido o proteína. En una realización, la célula diana es una célula del bazo, preferiblemente una célula presentadora de antígeno, más preferiblemente una célula presentadora de antígeno profesional, más preferiblemente una célula dendrítica. Por tanto, las partículas de la enseñanza pueden usarse para administrar ARN y un compuesto terapéuticamente eficaz a dicha célula diana. Por consiguiente, la presente enseñanza también se refiere a un método para administrar ARN y un compuesto terapéuticamente eficaz a una célula diana, preferiblemente a la misma célula diana, en un sujeto que comprende la administración sistémica de las partículas de la enseñanza que comprenden el ARN y el compuesto terapéuticamente efectivo al sujeto. En una realización, el ARN y el compuesto terapéuticamente eficaz se administran al citosol de la célula diana. En una realización, el ARN es ARN que codifica un péptido o proteína y el ARN es traducido por la célula diana para producir el péptido o proteína. En una realización, la célula diana es una célula del bazo, preferiblemente una célula presentadora de antígeno, más preferiblemente una célula presentadora de antígeno profesional, más preferiblemente una célula dendrítica.

En una realización, después de la administración sistémica de las partículas, se produce acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el bazo. Por tanto, las partículas de la enseñanza pueden usarse para expresar ARN en el bazo.

En una realización, después de la administración sistémica de las partículas, no se produce ninguna o esencialmente ninguna acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el pulmón y/o el hígado.

En una realización, después de la administración sistémica de las partículas, la acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el bazo es al menos 5 veces la cantidad de acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el pulmón y/o hígado.

En una realización, después de la administración sistémica de las partículas, se produce acumulación de ARN y/o expresión de ARN en células presentadoras de antígenos, preferiblemente células presentadoras de antígenos profesionales en el bazo. Portanto, las partículas de la enseñanza pueden usarse para expresar ARN en dichas células presentadoras de antígenos.

En una realización, las células presentadoras de antígenos son células dendríticas y/o macrófagos.

En una realización, la administración sistémica es mediante administración parenteral, preferiblemente mediante administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica o administración intraarterial.

En una realización, la composición farmacéutica comprende además uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización, la composición farmacéutica comprende además al menos un adyuvante.

En una realización, la composición farmacéutica se formula para administración sistémica.

En un tercer aspecto, la presente enseñanza se refiere a partículas del primer aspecto o una composición farmacéutica del segundo aspecto para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria contra el cáncer.

En un cuarto aspecto, la presente enseñanza se refiere a partículas del primer aspecto o una composición farmacéutica del segundo aspecto para su uso en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que implica un antígeno, preferiblemente una enfermedad cancerosa.

En un quinto aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para administrar un antígeno a células presentadoras de antígenos, preferiblemente células presentadoras de antígenos profesionales, en el bazo, o expresar un antígeno en células presentadoras de antígenos, preferiblemente células presentadoras de antígenos profesionales, en el bazo que comprende administrar a un sujeto partículas del primer aspecto o una composición farmacéutica del segundo aspecto. En este aspecto, el antígeno o una porción del mismo está codificado preferiblemente por el ARN en las partículas de la enseñanza.

En un sexto aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria contra el cáncer, en un sujeto que comprende administrar al sujeto partículas del primer aspecto o una composición farmacéutica del segundo aspecto.

En un séptimo aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para estimular, cebar y/o expandir células T en un sujeto que comprende administrar al sujeto partículas del primer aspecto o una composición farmacéutica del segundo aspecto.

En un octavo aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad que implica un antígeno, preferiblemente una enfermedad cancerosa, en un sujeto que comprende administrar al sujeto partículas del primer aspecto o una composición farmacéutica del segundo aspecto. En este aspecto, el antígeno o una porción del mismo está codificado preferiblemente porelARN en las partículas.

En un noveno aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para producir una partícula del primer aspecto que comprende las siguientes etapas de

(ii) agregar ARN a la dispersión lipídica que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua. En una realización, el método comprende dializar la dispersión lipídica coloidal.

En una realización, la dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua se proporciona mediante inyección de una solución de lípidos (que comprende al menos un lípido catiónico) en al menos un líquido disolvente orgánico miscible tal como una solución de lípidos en etanol en una fase acuosa que comprende al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua.

En una realización, el número de cargas positivas derivadas de los lípidos catiónicos dividido por el número de cargas negativas derivadas del ARN está entre 0.025 y 4.

Las realizaciones del lípido catiónico, el compuesto terapéuticamente eficaz, el ARN y/o la partícula producida son como se describen anteriormente.

En una realización aún más preferida, el número de cargas positivas derivadas de los lípidos catiónicos dividido por el número de cargas negativas derivadas del ARN está entre 0.025 y 4, preferiblemente es 0.025, 0.125, 0.250, 0.375, 0.500, 0.625, 0.750, 0.875, 1, 2, 3 o 4. Este resumen de la enseñanza no describe necesariamente todas las características de la enseñanza.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

La Figura 1 muestra la retención de ácido zoledrónico (ZA) en función de la concentración inicial de ZAen dispersiones lipídicas coloidales. La relación molar DOTMA/DOPE en la composición lipídica usada fue 66.66/33.33 (= 2/1). Se disolvió ZA en tampón HEPES 100 mM a una concentración de 20 mg/ml y se ajustó el pH a 4 aproximadamente con NaOH. La concentración de lípidos fue de aprox. 12 mM. El ácido zoledrónico libre y encapsulado se cuantificó mediante HPLC. Como puede verse, la retención de ZA aumenta constantemente al aumentar las concentraciones iniciales de ZA hasta 4 mg/ml.

Figura 2

La Figura 2 muestra la retención de ácido zoledrónico (ZA) en función de la concentración de DOTMAen dispersiones lipídicas coloidales. Se prepararon dispersiones lipídicas coloidales que comprenden ZA con diferentes fracciones molares totales de composición lipídica. La composición de dispersión de lípidos coloidales probada contenía DOTMA/DOPE en una proporción molar de 2/1 y contenía DOTMA3, 6 o 12 mM, respectivamente. Se disolvió ZAen tampón HEPES 100 mM a una concentración de 20 mg/ml y se ajustó el pH a 4 aproximadamente con NaOH. La ZA retenida y liberada se cuantificó mediante HPLC. Esta figura muestra que la cantidad absoluta de ZA retenida es proporcional a DOTMAy a la concentración total de lípidos en el coloide.

Figura 3

La Figura 3 muestra la liberación de ZAa partir de la dispersión coloidal de ZA después de unirse al ARN. Se mezclaron dispersiones lipídicas coloidales que comprendían ZA en las que se varió la fracción molar total de lípidos con PBS como control, ARN o Triton x100. La composición lipídica fue DOTMA/DOPE en una relación molar 2/1. Se prepararon dispersiones de ZA/lípidos al mezclar un volumen calculado de dispersiones de lípidos que comprendían ZAcon el volumen calculado de ARN en tres concentraciones de lípidos diferentes: 2, 4 y 6 mM. Las dispersiones de ZA/lípidos y ARN se mezclaron en una proporción de 1:1 (v/v). La relación de carga de lípido catiónico/ARN fue lípido catiónico/ARN (mol/base) = 1/2. Para PBS y Tritonx100, el volumen de ARN calculado se reemplazó por PBS fisiológico o solución acuosa de Tritón x100 al 10 %. Los LNP que comprenden ZAy ARN se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se determinó el ZA libre mediante HPLC como se mencionó anteriormente. Los resultados indican que la complejación de la dispersión coloidal de ZA con ARN conduce a la retención de la mayoría de ZA; sólo se liberaron porcentajes menores de 0, 23, y 22 % de ZA retenido con respecto a las concentraciones de lípidos totales de 2, 4, y 6 mg/ml, respectivamente. Este hallazgo se confirmó mediante la sustitución del ARN con Triton x100 (como control negativo), lo que condujo a una liberación del 100 % del ZA retenido. Los resultados in vivo en los que se detectó acumulación de IPP en el riñón y la médula ósea respaldan estos resultados.

Figura 4

La Figura 4 muestra la microscopía electrónica de criotransmisión (Cryo-TEM) de LNP que comprenden ZAy ARN. La composición lipídica de los LNP era una relación molar DOTMA/DOPE 2/1, contenían ARN en una relación positiva/negativa (lípido catiónico/nucleótido de ARN) de 1.3:2. La concentración final de lípidos fue de 0.3 mM. Después del ensamblaje, las formulaciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de las mediciones Cryo-TEM. Como se muestra en todas las imágenes, las partículas tienen un tamaño de aproximadamente 200 nm a 400 nm, con una organización laminar interna. El número de laminillas organizadas varía y se estima que oscila entre 2 y 10 unidades.

Figura 5

La Figura 5 muestra la expresión de ARN-IVT de luciferasa en CD después de la incubación con LNP que contienen ZA en comparación con ARN desnudo in vitro. La expresión de luciferasa se evaluó mediante luminiscencia que indica la tasa metabólica de luciferina como sustrato para luciferasa en recuentos por segundo (cps). En total, las iCD de dos donantes se probaron por separado y se muestra el valor medio incluida la DE. La incubación con LNP que contienen ZA conduce a una expresión notable en las CD.

Figura 6

La Figura 6 muestra la expresión relativa de marcadores de maduración después de la incubación in vitro de células dendríticas con LNP que contienen ZA(con o sin ARN) en comparación con un control positivo (cóctel de maduración que contiene IL-4, g M-CSF, IL-1p, TNF-a, IL-6 y PGE-2). Aquí, se muestra la expresión relativa de CD83 (A), CD86 (B) y HLA-DR (C). Los datos de expresión se normalizaron sin control de estimulación. En total, se analizaron cuatro donantes por separado y se muestra el valor medio incluida la DE.

Figura 7:

La Figura 7 muestra la expresión relativa de marcadores de maduración en células dendríticas in vitro. Para determinar la influencia de las LNP (es decir, ARN unido a ZA coloidal/dispersión lipídica) en la maduración de células dendríticas (CD) in vitro en comparación con un control positivo (cóctel de maduración que contiene IL-4, GM-CSF, IL-1p, TNF-a, IL-6 y PGE-2), ARN desnudo y dispersión coloidal de ZA/lípidos (es decir, ácido zoledrónico (ZA) atrapado en una dispersión coloidal). Las células dendríticas se incubaron durante 24 h y 48 h con LNP que contenían ZA en 3 concentraciones diferentes de ZA (0.5, 5 y 50 pm). Aquí, se muestra la expresión relativa de los marcadores de maduración CD80 (A), CD83 (B), CD86 (C) y<h>L<a>-D<r>(D). En total, se han analizado 2 donantes por separado y se muestra el valor medio incluida la DE.

Figura 8

La figura 8 muestra la acumulación de IPP en CD in vitro como medida de la absorción celular de ZA. Las células dendríticas se incubaron durante la noche con diferentes formulaciones de ZA, es decir, ZA libre o formuladas en LNP en un rango de dosis de 0.1 a 125 pm. En este ensayo, sólo si ZA está disponible intracelularmente, se espera un aumento de la concentración de IPP. Los LNP que comprenden ZAy ARN se probaron en comparación con Z<a>libre. El ZA libre y el formulado en LNP muestran dependencia de la dosis con respecto a la acumulación de IPP; sin embargo, con el ZA en los LNP, fueron necesarias dosis mucho más bajas (al menos un orden de magnitud) para inducir valores elevados de IPP Esto indica que las LNP eran funcionales como portadoras para proporcionar la absorción de ZAal citosol de las células.

Figura 9

La Figura 9 muestra la actividad y los efectos in vivo de las LNP que comprenden ZAy ARN que codifican luciferina.

6 h después de Inyección i.v. de LNP que comprenden ZAy ARN que codifican luciferina, los LNP son (A) capaces de apuntar específicamente al tejido del bazo, lo que genera una señal de bioluminiscencia detectable in vivo. Además, analizadas 24 h después de la inyección, las poblaciones de células esplénicas muestran que (B) las LNP que comprenden ZA complejadas con eGFP-RNAse dirigen principalmente a células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas (CD), los macrófagos (mO) y los monocitos, y (C) es capaz de regular positivamente la expresión del marcador de maduración CD86 en CD esplénicas y macrófagos en comparación con ratones no tratados (cntr).

Figura 10

La Figura 10 muestra los niveles de IPP tisular después de la administración de ARN y ZA que comprende LNP a ratones. 6, 24 y 48 h después de la Inyección i.v. de LNP que comprenden ZA complejado con ARN que codifica Luciferina y a una dosis de 1.5 |jg de ácido zoledrónico (ZA)/ratón inyectado, se observa un aumento de los niveles de IPP en el pulmón, el hígado y el bazo de los ratones tratados en comparación con el tejido de los ratones no tratados. Los niveles más altos de PPI se observan después de 24 h y para el tejido del bazo (1 animal/punto temporal). Esto indica que los LNP que comprenden ZAyARN pueden entregar ZA al compartimento citosólico de las células diana.

Figura 11

La Figura 11 muestra la acumulación de isopentenilpirofosfato (IPP) después de la incubación de tres concentraciones diferentes de ácido zoledrónico y ARN (Luc) que encapsula LNP con CD. Por el contrario, el grupo no tratado o la aplicación de ZA libre no aumentaron los valores de IPP

Figura 12

El ácido zoledrónico provocó la acumulación de isopentenilpirofosfato (IPP) en el bazo>pulmón>hígado. La aplicación de ácido zoledrónico y ARN (Luc) que encapsula las LNP dio como resultado una acumulación de isopentenilpirofosfato (IPP) en el bazo>pulmón>hígado. Por el contrario, el grupo no tratado no aumentó los valores de IPP Las barras representan valores medios de IPP de 3 animales 24 h después de la administración i.v.

Figura 13

El panel A es una imagen de imágenes in vivo que muestra la biodistribución de LNP (LNP2 - 4) in vivo. El panel B muestra un gráfico (“cuantificación”) de la señal de luciferasa medida en la región de interés que aquí es la ubicación del bazo. El panel C muestra el estado de activación (maduración) de las células CD esplénicas extraídas 24 h después de la inyección de LNP2-4.

Figura 14

De acuerdo con la Figura 5, aquí se muestra la expresión de ARN-IVT de luciferasa en CD después de la incubación con diferentes LNP que contienen ZA in vitro. La expresión de luciferasa se evaluó mediante luminiscencia que indica la tasa metabólica de luciferina como sustrato para luciferasa en recuentos por segundo (cps). En total, los iCD de dos donantes se probaron por separado y se muestra el valor medio incluida la DE. A partir de LNP-4, los otros LNP que contienen ZA. La incubación con los otros LNP que contienen ZA, LNP-2 y LNP-3, conduce a una expresión notable en las CD.

Figura 15

De acuerdo con la Figura 7, aquí se muestra la expresión relativa de marcadores de maduración en células dendríticas in vitro. Para determinar la influencia de diferentes LNP (es decir, ARN unido a ZA coloidal/dispersión lipídica) en la maduración de células dendríticas (CD) in vitro en comparación con un control positivo (cóctel de maduración que contiene IL-4, GM-CSF, IL -1p, TNF-a, IL-6 y PGE-2) se incubaron células dendríticas durante 24 h y 48 h con diferentes LNP que contenían ZA en 3 concentraciones diferentes de ZA (0.05, 0.5 y 5 jm ). Aquí, se muestra la expresión relativa de los marcadores de maduración CD80 (A), CD83 (B), CD86 (C) y H<l>A-DR (D). En total, se han analizado 2 donantes por separado y se muestra el valor medio incluida la DE.

Figura 16

La Figura 16 muestra la frecuencia de células T<y>962 después del cocultivo de iCD cargadas con ZA con PBL criopreservados. Para determinar si el compuesto retenido, ZA, todavía es funcional, los iCD se cargaron durante 24 h con diferentes LNP que contienen ZAy posteriormente se coincubaron con PBL durante 7 días. La expansión de las células T<y>9§2, es decir, una mayor frecuencia, finalmente se evaluó mediante citometría de flujo. En dos donantes diferentes, probados de forma independiente, se pudo observar que el compuesto de retención, Za , en todos los LNP diferentes sigue siendo funcional y conduce a una frecuencia aún mayor de células T y952 en comparación con ZA libre.

Descripción detallada

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.

A continuación se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas; sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas formas y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como que limitan la presente enseñanza sólo a las realizaciones descritas explícitamente. Se debe entender que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, si en una realización preferida la partícula de la presente enseñanza comprende un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua y si en otra realización preferida la partícula de la presente enseñanza comprende ARN que codifica al menos un antígeno, es una realización preferida contemplada que la partícula de la presente enseñanza comprende un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua y ARN que codifica al menos un antígeno.

Preferiblemente, los términos utilizados en el presente documento se definen como se describe en “A multilingual glosary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza, (1995).

La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprende”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implican la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pero sin exclusión de ningún otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas. Los términos “un” y “una” y “el” y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente contradicha por el contexto. La enumeración de rangos de valores en este documento simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del rango. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la especificación como si se enumerara individualmente en este documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “como”), proporcionados en este documento tiene como objetivo simplemente ilustrar mejor la enseñanza y no plantea una limitación en el alcance de la enseñanza reivindicada. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.

A continuación se proporcionarán definiciones que se aplican a todos los aspectos de la presente enseñanza.

En el contexto de la presente enseñanza, el término “partícula” se refiere a una entidad estructurada formada por moléculas o complejos moleculares. En una realización, el término “partícula” se refiere a una estructura de tamaño micro o nano, tal como una estructura compacta de tamaño micro o nano.

En el contexto de la presente enseñanza, el término “partícula lipídica” se refiere a una partícula que contiene lípidos, en particular lípidos catiónicos.

En una realización, las partículas de la presente enseñanza tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1000 nm, por ejemplo, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 900 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 200 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 300 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 400 nm.

En una realización, las partículas de la presente enseñanza tienen un diámetro promedio de al menos aproximadamente 50 nm, al menos aproximadamente 60 nm, al menos aproximadamente 70 nm, al menos aproximadamente 80 nm, al menos aproximadamente 90 nm, al menos aproximadamente 100 nm, al menos aproximadamente 150 nm, al menos aproximadamente 200 nm, al menos aproximadamente 250 nm, al menos aproximadamente 300 nm, al menos aproximadamente 400 nm, al menos aproximadamente 500 nm, al menos aproximadamente 600 nm, al menos aproximadamente 700 nm, al menos aproximadamente 800 nm, al menos aproximadamente 900 nm, y/o las partículas de la presente enseñanza tienen un diámetro promedio de no más de aproximadamente 1000 nm, no más de aproximadamente 900 nm, no más de aproximadamente 800 nm, no más de aproximadamente 700 nm, no más de aproximadamente 600 nm, no más de aproximadamente 500 nm, no más de aproximadamente 400 nm, no más de aproximadamente 300 nm, no más de aproximadamente 250 nm, no más de aproximadamente 200 nm, no más de aproximadamente 150 nm, no más de aproximadamente 100 nm, no más de aproximadamente 90 nm, no más de aproximadamente 80 nm, no más de aproximadamente 70 nm, no más de aproximadamente 60 nm.

En una realización preferida, las partículas de la presente enseñanza tienen un diámetro promedio (i) en el rango de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 400 nm, preferiblemente de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm, o (ii) en el rango de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1000 nm, preferiblemente de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 800 nm, más preferiblemente de aproximadamente

300 nm a aproximadamente 600 nm.

Las partículas de la enseñanza pueden comprender una estructura lipídica capaz de recibir y/o retener un compuesto terapéuticamente eficaz y capaz de recibir y/o retener el ARN, preferiblemente mediante la unión del ARN a un lípido catiónico comprendido en la estructura lipídica. En otras palabras, el interior de la estructura lipídica puede estructurarse de manera que se cargue en él un compuesto terapéuticamente eficaz. Estas estructuras lipídicas pueden tener un alto contenido de lípidos. De acuerdo con la enseñanza, el término “ lípido” se refiere a cualquier derivado de ácido graso u otro compuesto anfifílico que sea capaz de formar una fase lipídica liotrópica, o más preferentemente, una fase liotrópica laminar. En particular, el término “ lípido” se refiere a cualquier derivado de ácido graso que sea capaz de formar una bicapa de manera que una parte hidrofóbica de la molécula lipídica se oriente hacia la bicapa mientras que una parte hidrofílica se orienta hacia la fase acuosa. El término “ lípido” comprende lípidos neutros, aniónicos o catiónicos. Los lípidos comprenden preferiblemente un dominio hidrófobo con al menos una, preferiblemente dos, cadenas de alquilo o un resto de colesterol y un grupo de cabeza polar. Las cadenas alquílicas de los ácidos grasos en el dominio hidrofóbico del lípido no están limitadas a una longitud o número específico de dobles enlaces. Sin embargo, se prefiere que el ácido graso tenga una longitud de 10 a 30, preferiblemente de 14 a 25 átomos de carbono. El lípido también puede comprender dos ácidos grasos diferentes.

Los lípidos pueden incluir fosfolípidos o derivados de los mismos, esfingolípidos o derivados de los mismos, o glicolípidos o derivados de los mismos. Los fosfolípidos pueden ser glicerofosfolípidos. Los ejemplos de glicerofosfolípido incluyen, sin limitarse a ellos, fosfatidilglicerol (PG), incluido dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG); fosfatidilcolina (PC), incluyendo fosfatidilcolina de yema de huevo y dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC); ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) y esfingomielina (SM) y derivados de los mismos.

El término “ lípido catiónico” se refiere a un lípido que tiene una carga neta positiva. El lípido catiónico comprende preferiblemente un grupo de cabeza catiónico, es decir, cargado positivamente. El dominio hidrofóbico de los lípidos catiónicos preferiblemente no es diferente de los lípidos neutros o aniónicos. El grupo de cabeza polar de los lípidos catiónicos comprende preferentemente derivados de amina, como aminas primarias, secundarias y/o terciarias, amonio cuaternario, diferentes combinaciones de aminas, sales de amidinio o grupos guanidina y/o imidazol además de los grupos de cabeza de piridinio, piperizina y aminoácidos como lisina, arginina, ornitina y/o triptófano. Más preferiblemente, el grupo de cabeza polar del lípido catiónico comprende derivados de amina. Más preferiblemente, el grupo de cabeza polar del lípido catiónico comprende un amonio cuaternario. El grupo principal del lípido catiónico puede comprender múltiples cargas catiónicas. Se prefiere que el grupo de cabeza del lípido catiónico comprenda una carga catiónica. Los lípidos monocatiónicos incluyen 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMEPC), 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano. (DOTAP), propano de 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio (DMTAP), bromuro de 2,3-di(tetradecoxi)propil-(2-hidroxietil)-dimetilazanio (DMRIE), bromuro de didodecil(dimetil)azanio (DDAB), Bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DORIE), 3p-[N-(N\N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (CD-Chol) o fosfatidilcolina de éter dioleílico (DOEPC), pero son no limitado a ello. Los lípidos catiónicos se pueden usar solos o en combinación con colesterol, con fosfolípidos neutros u otros componentes de ensamblaje lipídico conocidos. Las estructuras lipídicas cargadas positivamente descritas en el presente documento también pueden incluir otros componentes utilizados normalmente en la formación de vesículas (por ejemplo, para estabilización). Los ejemplos de dichos otros componentes incluyen, sin limitarse a ellos, alcoholes grasos, ácidos grasos y/o ésteres de colesterol o cualquier otro excipiente farmacéuticamente aceptable que pueda afectar la carga superficial, la fluidez de la membrana y ayudar en la incorporación del lípido al ensamble lipídico. Ejemplos de esteroles incluyen colesterol, hemisuccinato de colesterilo, sulfato de colesterilo o cualquier otro derivado del colesterol. Preferiblemente, el al menos un lípido catiónico comprende DMEPC y/o DOTMA.

De acuerdo con la presente enseñanza, el término “ lípido catiónico” también incluye lípidos sensibles al pH. El término “ lípido sensible al pH” se refiere a cualquier derivado de ácido graso u otro compuesto anfifílico que sea capaz de formar una fase lipídica liotrópica y que tenga un valor de pKa entre pH 5 y pH 7.5. Esto significa que el lípido no está cargado a un pH por encima del valor de pKa y cargado positivamente por debajo del valor de pKa. El “ lípido sensible al pH” se puede usar además de o en lugar de un lípido catiónico, por ejemplo uniendo el ARN al lípido o mezcla de lípidos a pH bajo. Los lípidos que responden al pH incluyen, pero no se limitan a, 1,2-dioleiloxi-3-dimetilamino-propano (DODMA).

El término “ lípido auxiliar” se refiere a un lípido capaz de aumentar la eficacia del suministro de partículas basadas en lípidos tales como partículas basadas en lípidos catiónicos a un objetivo, preferiblemente en una célula. El lípido auxiliar puede ser neutro, cargado positivamente o negativamente. Preferiblemente, el lípido auxiliar es neutro o está cargado negativamente. Ejemplos de lípidos auxiliares incluyen 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3fosfocolina (POPC) y 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfocolina (DOPC), pero no se limitan a ellos. Preferiblemente, el al menos un lípido auxiliar comprende DOPE y/o Chol.

En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende DOTMA y el al menos un lípido auxiliar comprende DOPE o DOPC o derivados de los mismos, o colesterol o derivados del mismo.

Como se usa en el presente documento, el término “estructura laminar” u “organización laminar” significa la formación de capas en forma laminar.

El término “técnica de inyección de etanol” se refiere a un proceso en el que una solución de etanol que comprende lípidos se inyecta rápidamente en una solución acuosa a través de una aguja. Esta acción dispersa los lípidos por toda la solución y promueve la formación de estructuras lipídicas, por ejemplo la formación de vesículas lipídicas tales como la formación de liposomas.

Usando la técnica de inyección de etanol, una dispersión de lípidos coloidal que comprende un compuesto terapéuticamente eficaz se forma preferiblemente de la siguiente manera: se inyecta una solución de etanol que comprende lípidos, tales como lípidos catiónicos como DMEPC, DOTMAy DOTAP y lípidos auxiliares, en una solución acuosa que comprende un compuesto terapéuticamente eficaz, por ejemplo, un bifosfonato, particularmente aminobisfosfonato como el ácido zoledrónico, por ejemplo, bajo agitación.

Las partículas de la presente enseñanza se pueden obtener añadiendo ARN a una dispersión lipídica coloidal que comprende el compuesto terapéuticamente eficaz. En una realización, las partículas de la presente enseñanza se pueden obtener mediante un proceso que comprende una etapa de extrusión y/o una etapa de liofilización de la partícula. Preferiblemente, las partículas se extruyen, por ejemplo, mediante filtración, a través de una membrana que tiene poros con un diámetro de 0.02 a 1 pm, preferiblemente de 0.3 a 0.6 pm o entre 0.02 y 0.2 pm. Debe entenderse que el tamaño de los poros se elige dependiendo del tamaño deseado de las partículas. Se prefiere que la membrana sea una membrana de policarbonato o una membrana de éster de celulosa. El compuesto terapéuticamente eficaz no retenido se elimina preferentemente mediante diálisis.

En otra realización, las partículas de la presente enseñanza se pueden obtener sin una etapa de extrusión.

El término “extrusión” o “extrusión” se refiere a la creación de objetos tales como partículas que tienen un perfil de sección transversal fijo. En particular, se refiere a la reducción de tamaño de una partícula, preferiblemente un liposoma, mediante lo cual la partícula se fuerza a través de filtros con poros definidos.

El término “ liofilización” o “ liofilización” se refiere a la liofilización de una partícula congelándola y luego reduciendo la presión circundante para permitir que el medio congelado en la partícula se sublime directamente de la fase sólida a la fase gaseosa.

La expresión “compuesto terapéuticamente eficaz” se refiere a cualquier compuesto que sea terapéuticamente eficaz cuando se administra a un individuo. El término “compuesto terapéuticamente eficaz” se refiere además a cualquier agente que cambia, preferiblemente cura, alivia o detiene parcialmente las manifestaciones clínicas de una enfermedad determinada y sus complicaciones en una intervención terapéutica que comprende la administración de dicho compuesto.

En una realización, el compuesto terapéuticamente eficaz en las partículas de la presente enseñanza es soluble en agua. Las propiedades hidrófilas del compuesto terapéuticamente eficaz pueden mejorar su eficacia de carga y evitar la liberación no deseada. Se prefiere que el compuesto terapéuticamente eficaz tenga una carga negativa neta. Es más preferido que el compuesto terapéuticamente eficaz tenga doble carga negativa. En una realización, el compuesto terapéuticamente eficaz es una molécula pequeña. Un tamaño pequeño del compuesto puede mejorar aún más la eficacia de encapsulación. Se describe que los compuestos de molécula pequeña actúan como buenos antagonistas, agonistas o moduladores alostéricos de diversos objetivos.

En el presente contexto, el término “tratamiento”, “tratar” o “ intervención terapéutica” se refiere al manejo y cuidado de un individuo con el propósito de combatir una condición tal como una enfermedad o trastorno. El término pretende incluir el espectro completo de tratamientos para una afección determinada que padece el individuo, como la administración del compuesto terapéuticamente eficaz para aliviar los síntomas o complicaciones, retrasar la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, para aliviar o aliviar los síntomas y complicaciones, y/o curar o eliminar la enfermedad, trastorno o afección, así como prevenir la afección, entendiendo por prevención el manejo y cuidado de un individuo con el fin de combatir la enfermedad, condición o trastorno e incluye la administración de los compuestos activos para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones. El individuo a tratar es un animal, preferentemente un mamífero, en particular un ser humano. En el presente contexto, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” de un compuesto significa una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clínicas de una enfermedad determinada y sus complicaciones en una intervención terapéutica que comprende la administración de un compuesto. La reacción deseada para una terapia de una enfermedad o afección también puede ser el retraso de la aparición o la inhibición de la aparición de la enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la presente enseñanza depende de la afección o enfermedad, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del individuo, incluyendo la edad, la condición fisiológica, la altura y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia opcional complementaria, la vía de administración específica y factores similares.

En el contexto de la presente enseñanza, el término “ARN” se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos y comprende todos los tipos de ARN descritos en el presente documento. El término “ribonucleótido” se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término “ARN” comprende ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado recombinantemente tal como ARN modificado que difiere del ARN natural por adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos, particularmente análogos de ARN naturales. El ARN utilizado de acuerdo con la presente enseñanza puede tener una composición conocida, o la composición del ARN puede ser parcial o totalmente desconocida. El término “ARNm” significa “ARN mensajero” y se refiere a un transcrito que se genera utilizando una plantilla de ADN y codifica un péptido o proteína. Normalmente, el ARNm comprende una 5'-UTR, una región codificante de proteína y una 3'-UTR. El ARNm puede generarse mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. La metodología de transcripción in vitro es conocida por el experto. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente. El término “ARN antisentido” se refiere a ARN monocatenario que comprende residuos de ribonucleótidos, que son complementarios al ARNm. El término “ARNip” significa “ARN de interferencia pequeño”, que es una clase de moléculas de ARN de doble cadena que comprenden preferiblemente de 20 a 25 pares de bases. Preferiblemente, el ARNip es capaz de unirse específicamente a una porción de la molécula de ARNm. Esta unión induce un proceso en el que se corta dicha porción de la molécula de ARNm y con ello se inhibe la expresión génica de dicha molécula de ARNm. El término “microARN” se refiere a una molécula de ARN monocatenario no codificante que comprende preferiblemente de 20 a 25 pares de bases. Preferiblemente, el microARN es capaz de unirse específicamente a una porción de la molécula de ARNm. Esta unión induce un proceso en el que se inhibe la traducción de dicha molécula de ARNm y, por tanto, la expresión génica de dicha molécula de ARNm. El ARN puede modificarse mediante una tapa 5' o un análogo de tapa 5', por ejemplo, logrado mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN en presencia de dicha tapa 5' o análogo de tapa 5', en donde dicha tapa 5' se incorpora cotranscripcionalmente en la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante transcripción in vitro, y la tapa 5' puede unirse al ARN postranscripcionalmente usando enzimas de protección, por ejemplo, enzimas de protección del virus vaccinia. El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN usado en la presente enseñanza puede ser una extensión o truncamiento de la cola poli (A) de origen natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región codificante de dicho ARN.

En el contexto de la presente enseñanza, el término “transcripción” se refiere a un proceso, en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la enseñanza, el término “transcripción” comprende “transcripción in vitro”, en el que el término “transcripción in vitro” se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, se aplican vectores de clonación para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación se denominan generalmente vectores de transcripción y, de acuerdo con la enseñanza, están abarcados por el término “vector”. De acuerdo con la enseñanza, el ARN utilizado en la presente enseñanza es preferentemente ARN transcrito in vitro (IVT-RNA) y puede obtenerse mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Se puede obtener una plantilla de ADN para la transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.

La plantilla de vector que contiene ADNc puede comprender vectores que llevan diferentes insertos de ADNc que después de la transcripción dan como resultado una población de diferentes moléculas de ARN opcionalmente capaces de expresar diferentes péptidos o proteínas o pueden comprender vectores que llevan sólo una especie de inserto de ADNc que después de la transcripción sólo resulta en una población de una especie de ARN capaz de expresar solo un péptido o proteína. Por tanto, es posible producir ARN capaz de expresar un único péptido o proteína únicamente o producir composiciones de diferentes ARN capaces de expresar más de un péptido o proteína, por ejemplo, una composición de péptidos o proteínas.

El término “expresión” se utiliza en el presente documento en su significado más amplio y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína. Con respecto al ARN, el término “expresión” o “traducción” se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. La expresión puede ser transitoria o estable.

De acuerdo con la enseñanza, el ARN puede ser ARN codificante, es decir, ARN que codifica un péptido o proteína. Dicho ARN puede expresar el péptido o proteína codificado. Por ejemplo, dicho ARN puede ser un ARN que codifica y expresa un antígeno o un compuesto inmunológicamente activo (que no codifica un antígeno). Alternativamente, el ARN puede ser ARN no codificante tal como ARN antisentido, microARN (miARN) o ARNip.

Un “ARN farmacéuticamente activo” es un ARN que codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo o es farmacéuticamente activo por sí solo, por ejemplo, tiene una o más actividades farmacéuticas tales como las descritas para las proteínas farmacéuticamente activas. Por ejemplo, el ARN puede ser una o más hebras de ARN de interferencia (ARNi). Dichos agentes incluyen ARN de interferencia cortos (ARNip) o ARN en horquilla corta (ARNsh), o precursores de un ARNip o ARN similar a microARN, dirigidos a un transcrito objetivo, por ejemplo, un transcrito de un transcrito endógeno relacionado con una enfermedad de un sujeto.

Un “péptido o proteína farmacéuticamente activo” tiene un efecto positivo o ventajoso sobre la condición o estado de enfermedad de un sujeto cuando se administra al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, un péptido o proteína farmacéuticamente activo tiene propiedades curativas o paliativas y puede administrarse para mejorar, aliviar, aliviar, revertir, retrasar la aparición o disminuir la gravedad de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. Un péptido o proteína farmacéuticamente activo puede tener propiedades profilácticas y puede usarse para retrasar la aparición de una enfermedad o para disminuir la gravedad de dicha enfermedad o condición patológica. El término “péptido o proteína farmacéuticamente activo” incluye proteínas o polipéptidos completos, y también puede referirse a fragmentos farmacéuticamente activos de los mismos. También puede incluir análogos farmacéuticamente activos de un péptido o proteína. El término “péptido o proteína farmacéuticamente activo” incluye péptidos y proteínas que son antígenos, es decir, la administración del péptido o proteína a un sujeto provoca una respuesta inmunitaria en un sujeto que puede ser terapéutica o protectora parcial o total.

Los ejemplos de proteínas farmacéuticamente activas incluyen, pero no se limitan a, citoquinas y proteínas del sistema inmunitario tales como compuestos inmunológicamente activos (por ejemplo, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina, factor de necrosis tumoral (TNF), interferones, integrinas, direccioninas, seletinas, receptores de localización, receptores de células T, inmunoglobulinas, antígenos solubles del complejo mayor de histocompatibilidad, antígenos inmunológicamente activos como bacterias, parásitos, o antígenos virales, alérgenos, autoantígenos, anticuerpos), hormonas (insulina, hormona tiroidea, catecolaminas, gonadotropinas, hormonas tróficas, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, leptinas y similares), hormonas de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humano), factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento similar a la insulina y similares), receptores de factores de crecimiento, enzimas (activador del plasminógeno tisular, estreptoquinasa, colesterol biosintético o degradativo, enzimas esteriodogénicas, quinasas, fosfodiesterasas, metilasas, desmetilasas, deshidrogenasas, celulasas, proteasas, lipasas, fosfolipasas, aromatasas, citocromos, adenilato o guanilato ciclasas, neuramidasas y similares), receptores (receptores de hormonas esteroides, receptores de péptidos), proteínas de unión (proteínas de unión a hormona de crecimiento o factor de crecimiento y similares), factores de transcripción y traducción, proteínas supresoras del crecimiento tumoral (por ejemplo, proteínas que inhiben la angiogénesis), proteínas estructurales (tales como colágeno, fibroína, fibrinógeno, elastina, tubulina, actina y miosina), proteínas sanguíneas (trombina, albúmina sérica, Factor VII, Factor VIII, insulina, Factor IX, Factor X, activador del plasminógeno tisular, proteína C, factor von Wilebrand, antitrombina III, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias de granulocitos de eritropoyetina (GCSF) o factor VIII modificado, anticoagulantes y similares.

En una realización, la proteína farmacéuticamente activa de acuerdo con la enseñanza es una citocina que participa en la regulación de la homeostasis linfoide, preferiblemente una citocina que participa y preferiblemente induce o mejora el desarrollo, preparación, expansión, diferenciación y/o supervivencia de Células T En una realización, la citocina es una interleucina. En una realización, la proteína farmacéuticamente activa de acuerdo con la enseñanza es una interleucina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-21.

En una realización particularmente preferida de la enseñanza, el ARN en las partículas codifica una citoquina que está implicada en y preferiblemente induce o mejora el desarrollo, preparación, expansión, diferenciación y/o supervivencia de células T, preferiblemente una interleucina tal como una interleucina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-21, y el al menos un compuesto terapéuticamente eficaz retenido en las partículas comprende un agente que estimula las células T γδ tales como ácido zoledrónico.

De acuerdo con la enseñanza, el término “péptido” comprende oligopéptidos y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente tres o más, preferiblemente cuatro o más, preferiblemente seis o más, preferiblemente ocho o más, preferiblemente diez o más, preferiblemente 14 o más, preferiblemente 16 o más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. El término “proteína” se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos “péptidos” y “proteínas” son sinónimos y se usan indistintamente en el presente documento.

De acuerdo con la enseñanza, el término “codificación de ARN” significa que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede dirigir el ensamblaje de aminoácidos para producir la proteína o péptido que se codifica durante el proceso de traducción. Preferiblemente, el ARN de acuerdo con la enseñanza es capaz de interactuar con la maquinaria de traducción celular permitiendo la traducción de la proteína o péptido.

El término “carga neta de la partícula” se refiere a la suma total de cargas, tales como cargas positivas y negativas. Por ejemplo, si la partícula comprende un mayor número de cargas negativas que positivas, la carga neta de la partícula es negativa. Si la partícula comprende un mayor número de cargas positivas que negativas, la carga neta de la partícula es positiva. Si la partícula comprende un número igual de cargas positivas y negativas, la carga neta de la partícula es neutra, particularmente electroneutra. Así, la carga neta de la partícula de acuerdo con la enseñanza puede ser negativa, positiva o neutra. Preferiblemente, la carga neta de la partícula es negativa.

El término “diámetro promedio” se refiere al diámetro medio de las partículas y se puede calcular dividiendo la suma del diámetro de cada partícula por el número total de partículas. Aunque el término “diámetro” se usa normalmente para referirse a la longitud máxima de un segmento de línea que pasa por el centro y conecta dos puntos en la periferia de un objeto esférico, también se usa aquí para referirse a la longitud máxima de un segmento de línea. pasando por el centro y conectando dos puntos en la periferia de partículas que tienen una forma sustancialmente esférica u otras formas.

El término “antígeno” se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se va a generar una respuesta inmunitaria. El término “antígeno” incluye en particular proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, especialmente ARN y ADN, y nucleótidos. El término “antígeno” también incluye agentes que se vuelven antigénicos -y sensibilizantes- sólo mediante transformación (por ejemplo, de forma intermedia en la molécula o por finalización con la proteína corporal). Un antígeno es preferiblemente presentable por células del sistema inmunitario tales como células presentadoras de antígeno como células dendríticas o macrófagos. Además, un antígeno o un producto de procesamiento del mismo es preferiblemente reconocible por un receptor de células T o B, o por una molécula de inmunoglobulina tal como un anticuerpo. En una realización preferida, el antígeno es un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

El término “antígeno tumoral” se refiere a un constituyente de las células cancerosas que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular. En particular se refiere a aquellos antígenos que se producen, preferiblemente en grandes cantidades, intracelularmente o como antígenos de superficie en células tumorales. Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen HER2, EGFR, VEGF, antígeno CAMPATH1, CD22, CA-125, HLA-DR, linfoma de Hodgkin o mucina-1, pero no se limitan a ellos.

El término “antígeno viral” se refiere a cualquier componente viral que tenga propiedades antigénicas, es decir, que pueda provocar una respuesta inmunitaria en un individuo. El antígeno viral puede ser una ribonucleoproteína viral o una proteína de la envoltura.

El término “antígeno bacteriano” se refiere a cualquier componente bacteriano que tenga propiedades antigénicas, es decir, que pueda provocar una respuesta inmunitaria en un individuo. El antígeno bacteriano puede derivar de la pared celular o de la membrana citoplasmática de la bacteria.

El término “antígeno asociado a enfermedad” se usa en su sentido más amplio para referirse a cualquier antígeno asociado con una enfermedad. Un antígeno asociado a una enfermedad es una molécula que contiene epítopos que estimularán el sistema inmunitario del huésped para generar una respuesta inmunitaria específica del antígeno celular y/o una respuesta de anticuerpos humorales contra la enfermedad. Por tanto, el antígeno asociado a la enfermedad puede utilizarse con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades están preferiblemente asociados con infección por microbios, típicamente antígenos microbianos, o asociados con cáncer, típicamente tumores.

El término “enfermedad” se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con síntomas y signos específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, como enfermedades autoinmunes. En los seres humanos, “enfermedad” se utiliza a menudo de manera más amplia para referirse a cualquier condición que causa dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o muerte al individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades suelen afectar a las personas no sólo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida y la personalidad.

El término “enfermedad que implica un antígeno” se refiere a cualquier enfermedad que implica un antígeno, por ejemplo, Enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno. La enfermedad que involucra un antígeno puede ser una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad cancerosa o simplemente cáncer. Como se mencionó anteriormente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

El término “enfermedad infecciosa” se refiere a cualquier enfermedad que puede transmitirse de un individuo a otro o de un organismo a otro, y está causada por un agente microbiano (por ejemplo, un resfriado común). Las enfermedades infecciosas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana o una enfermedad parasitaria, enfermedades causadas por un virus, una bacteria y un parásito, respectivamente. En este sentido, las enfermedades infecciosas pueden ser, por ejemplo, hepatitis, enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia o gonorrea), tuberculosis, VIH/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), difteria, hepatitis B, hepatitis C, cólera, síndrome respiratorio agudo severo (SARS), la gripe aviar y la gripe.

El término “enfermedad autoinmunitaria” se refiere a cualquier enfermedad en la que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, sistema inmunitario) a algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunitario pierde su capacidad de reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como propio y lo ataca como si fuera extraño. Las enfermedades autoinmunes se pueden clasificar en aquellas en las que predominantemente un órgano está afectado (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis autoinmunitaria) y aquellas en las que el proceso de la enfermedad autoinmunitaria se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es causada por células T que atacan las vainas que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto resulta en pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Las enfermedades autoinmunitarias son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, lupus, esclerosis múltiple, artritis reumática, anemia hemolítica, tiroiditis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis, diabetes, esclerodermia, psoriasis y similares.

Los términos “enfermedad cancerosa” o “cáncer” se refieren o describen la condición fisiológica en un individuo que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer de huesos, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región del ano, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tiroides, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (CNS), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma hipofisario. El término “cáncer” de acuerdo con la enseñanza también comprende metástasis de cáncer.

El término “respuesta inmunitaria” se refiere a una reacción del sistema inmune tal como ante organismos inmunogénicos, tales como bacterias o virus, células o sustancias. El término “respuesta inmunitaria” incluye la respuesta inmunitaria innata y la respuesta inmunitaria adaptativa. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria está relacionada con una activación de células inmunes, una inducción de la biosíntesis de citoquinas y/o la producción de anticuerpos.

Se prefiere que la respuesta inmunitaria inducida por las partículas de la presente enseñanza comprenda las etapas de activación de células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y/o macrófagos, presentación de un antígeno o fragmento del mismo por dichas células presentadoras de antígeno y activación de células T citotóxicas debido a esta presentación.

El término “compuesto inmunológicamente activo” se refiere a cualquier compuesto que altere una respuesta inmunitaria, preferiblemente induciendo y/o suprimiendo la maduración de células inmunes, induciendo y/o suprimiendo la biosíntesis de citocinas, y/o alterando la inmunidad humoral estimulando la producción de anticuerpos mediante Células B. Los compuestos inmunológicamente activos poseen una potente actividad inmunoestimulante que incluye, pero no se limitan a, actividad antiviral y antitumoral, y también pueden regular negativamente otros aspectos de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, desviando la respuesta inmunitaria de una respuesta inmunitaria TH2, que es útil para tratar una amplia gama de enfermedades mediadas por TH2. Los compuestos inmunológicamente activos pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, el ARN en las partículas de la presente enseñanza codifica un compuesto inmunológicamente activo. Dicho compuesto preferiblemente no codifica un antígeno.

El término “células inmunitarias” se refiere a células del sistema inmunitario implicadas en la defensa del cuerpo de un individuo. El término “células inmunitarias” abarca tipos específicos de células inmunitarias y sus precursores, incluidos leucocitos que comprenden macrófagos, monocitos (precursores de macrófagos), granulocitos tales como neutrófilos, eosinófilos y basófilos, células dendríticas, mastocitos y linfocitos tales como células B, células T y células citolíticas naturales (NK). Los macrófagos, los monocitos (precursores de los macrófagos), los neutrófilos, las células dendríticas y los mastocitos son células fagocíticas.

El término “células fagocíticas” se refiere a células que protegen el cuerpo de un individuo ingiriendo (fagocitosando) partículas extrañas dañinas, bacterias y células muertas o moribundas.

El término “macrófago” se refiere a un subgrupo de células fagocíticas producidas por la diferenciación de monocitos. Los macrófagos que se activan por inflamación, citoquinas inmunes o productos microbianos envuelven y matan de manera no específica patógenos extraños dentro del macrófago mediante un ataque hidrolítico y oxidativo que resulta en la degradación del patógeno. Los péptidos de proteínas degradadas se muestran en la superficie de las células de los macrófagos, donde pueden ser reconocidos por las células T, y pueden interactuar directamente con los anticuerpos en la superficie de las células B, lo que resulta en la activación de las células T y B y una mayor estimulación de la respuesta inmunitaria. Los macrófagos pertenecen a la clase de células presentadoras de antígenos. Preferiblemente, los macrófagos son macrófagos esplénicos.

El término “célula dendrítica” (CD) se refiere a otro subtipo de células fagocíticas que pertenecen a la clase de células presentadoras de antígenos. Preferiblemente, las células dendríticas se derivan de células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. Estas células progenitoras inicialmente se transforman en células dendríticas inmaduras. Estas células inmaduras se caracterizan por una alta actividad fagocítica y un bajo potencial de activación de células T Las células dendríticas inmaduras toman muestras constantemente del entorno circundante en busca de patógenos como virus y bacterias. Una vez que han entrado en contacto con un antígeno presentable, se activan hasta convertirse en células dendríticas maduras y comienzan a migrar al bazo o al ganglio linfático. Las células dendríticas inmaduras fagocitan los patógenos y degradan sus proteínas en pequeños trozos y, al madurar, presentan esos fragmentos en la superficie celular utilizando moléculas MHC. Simultáneamente, regulan positivamente los receptores de la superficie celular que actúan como correceptores en la activación de las células T, como CD80, CD86 y CD40 mejorando en gran medida su capacidad para activar las células T También regulan positivamente CCR7, un receptor quimiotáctico que induce a las células dendríticas a viajar a través del torrente sanguíneo hasta el bazo o a través del sistema linfático hasta un ganglio linfático. Aquí actúan como células presentadoras de antígenos y activan las células T colaboradoras y las células T citolíticas, así como las células B, presentándoles antígenos, junto con señales coestimuladoras no específicas de antígenos. Por lo tanto, las células dendríticas pueden inducir activamente una respuesta inmunitaria relacionada con las células T o B. Preferiblemente, las células dendríticas son células dendríticas esplénicas.

El término “célula presentadora de antígeno” (APC) es una célula de una variedad de células capaces de presentar, adquirir y/o presentar al menos un antígeno o fragmento antigénico en (o en) su superficie celular. Las células presentadoras de antígenos se pueden distinguir en células presentadoras de antígenos profesionales y células presentadoras de antígenos no profesionales.

El término “células presentadoras de antígenos profesionales” se refiere a células presentadoras de antígenos que expresan constitutivamente las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II (MHC clase II) necesarias para la interacción con células T vírgenes. Si una célula T interactúa con el complejo molecular MHC de clase II en la membrana de la célula presentadora de antígeno, la célula presentadora de antígeno produce una molécula coestimuladora que induce la activación de la célula T. Las células presentadoras de antígenos profesionales comprenden células dendríticas y macrófagos.

La expresión “células presentadoras de antígenos no profesionales” se refiere a células presentadoras de antígenos que no expresan constitutivamente moléculas de MHC de clase II, sino tras la estimulación por ciertas citoquinas tales como interferón gamma. Las células presentadoras de antígenos no profesionales a modo de ejemplo incluyen fibroblastos, células epiteliales del timo, células epiteliales de la tiroides, células gliales, células beta pancreáticas o células endoteliales vasculares.

El término “maduración” se define en el presente documento como la acción de macrófagos y células dendríticas altamente fagocíticas inmaduras que dan como resultado modificaciones fenotípicas y/o funcionales de estas células. Especialmente, en células dendríticas, la modificación fenotípica asociada está representada por un aumento de la expresión en la superficie celular de las moléculas CD40, c D80, CD86, CD83, MHC clase I y Ii y/o una disminución de la expresión en la superficie celular de la molécula CD14. Los cambios funcionales pueden ser la pérdida de propiedades fagocíticas, la adquisición de capacidades de migración, una mayor eficiencia de estimulación de las células T alogénicas y cambios en el perfil de expresión de citocinas y quimiocinas, y particularmente un aumento de la secreción de IL-12. La producción de IL-12 por parte de las CD es crítica para su función in vivo, ya que se ha demostrado que esta citoquina genera una polarización de la respuesta inmunitaria hacia la vía Thl in vivo. Una respuesta inmunitaria de tipo Thl se considera una respuesta inmunitaria que implica la estimulación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno, mientras que una respuesta inmunitaria detipoTh2 implica más bien una estimulación de la respuesta de anticuerpos y, finalmente, una falta de respuesta de los linfocitos citotóxicos a un antígeno.

Si, de acuerdo con la enseñanza, se desea inducir o mejorar una respuesta inmunitaria mediante el uso de partículas como se describe en el presente documento, la respuesta inmunitaria puede desencadenarse o mejorarse mediante el compuesto terapéuticamente eficaz retenido dentro de las partículas. Por ejemplo, el compuesto terapéuticamente eficaz puede estimular determinadas células inmunitarias, como las células T. Preferiblemente, dichas células T son células T<y>8, más preferiblemente células T V<y>9V82. Alternativa o adicionalmente, la respuesta inmunitaria puede ser desencadenada o potenciada por el ARN unido al lípido catiónico en las partículas. Por ejemplo, las proteínas o péptidos codificados por los ARN o sus productos de procesión pueden presentarse mediante proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) expresadas en células presentadoras de antígenos. El complejo peptídico MHC puede luego ser reconocido por células inmunes como las células T o B, lo que lleva a su activación.

Los términos “células T” o “ linfocitos T” se relacionan con tipos de linfocitos que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Las células T o los linfocitos T se pueden distinguir de otros linfocitos, como las células B y las células citolíticas naturales (NK), por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. No tienen propiedades presentadoras de antígenos (sino que requieren células B o células NK para su propiedad presentadora de antígenos). Se llaman células T porque maduran en el timo. Las células T son capaces de reconocer un antígeno cuando se muestran en la superficie de las células presentadoras de antígeno o en la matriz junto con una o más moléculas de MHC o una o más moléculas de MHC no clásicas.

El término “células T y8” (células T gamma delta) se refiere a un subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. La mayoría de las células T tienen un TCR compuesto por dos cadenas de glicoproteínas llamadas cadenas a- y p-TCR. Por el contrario, en las células T<y>8, el TCR está formado por una cadena Y y una cadena 8. Este grupo de células T suele ser mucho menos común que las células T ap. Las células T y8 humanas desempeñan un papel importante en las respuestas de vigilancia del estrés, como las enfermedades infecciosas y la autoinmunidad. También se sugiere que los cambios inducidos por la transformación en los tumores causan respuestas de vigilancia del estrés mediadas por células T γδ y mejoran la inmunidad antitumoral. Es importante destacar que, después de la interacción con el antígeno, las células T γδ activadas en los sitios lesiónales proporcionan citocinas (por ejemplo, INTy, TNFa) y/o quimiocinas que median el reclutamiento de otras células efectoras y muestran funciones efectoras inmediatas como la citotoxicidad (a través de las vías del receptor de muerte y de los gránulos citolíticos) y ADCC.

La mayoría de las células T γδ en sangre periférica expresan el receptor de células T Vy9V52 (TCRγδ). El término “células T V<y>9/V52” se refiere a células que constituyen la principal población de células T γδ en la sangre periférica humana. Las células T Vy9V52 son exclusivas de humanos y primates y se supone que desempeñan un papel temprano y esencial en la detección del “peligro” de patógenos invasores, ya que se expanden dramáticamente en muchas infecciones agudas y pueden superar a todos los demás linfocitos en unos pocos días, por ejemplo, en tuberculosis, salmonelosis, ehrlichiosis, brucelosis, tularemia, listeriosis, toxoplasmosis y malaria.

Las células T γδ responden a pequeños antígenos fosforilados no peptídicos (fosfoantígenos) tales como pirofosfatos sintetizados en bacterias y pirofosfato de isopentenilo (IPP) producido en células de mamíferos a través de la vía del mevalonato. Mientras que la producción de IPP en células normales no es suficiente para la activación de las células T y6, la desregulación de la vía del mevalonato en las células tumorales conduce a la acumulación de IPP y la activación de las células T γδ. Los aminobisfosfonatos también pueden aumentar terapéuticamente los IPP, que inhiben la enzima farnesil pirofosfato sintasa (FPPS) de la vía del mevalonato. Entre otros, el ácido zoledrónico (ZA, zoledronato, Zometa™, Novartis) representa un aminobisfosfonato que ya se administra clínicamente a pacientes para el tratamiento de la osteoporosis y la enfermedad ósea metastásica. Tras el tratamiento de PBMC in vitro, ZA es absorbido especialmente por los monocitos. La IPP se acumula en los monocitos y se diferencian en células presentadoras de antígenos que estimulan el desarrollo de células T γδ. En este contexto, se prefiere la adición de interleucina-2 (IL-2) como factor de crecimiento y supervivencia para las células T γδ activadas. Finalmente, se ha descrito que ciertas aminas alquiladas activan las células T Vγ9Vδ2 in vitro, aunque solo en concentraciones milimolares.

De acuerdo con la enseñanza, el término “agente que estimula las células T γδ” se refiere a compuestos que estimulan el desarrollo de células T γδ, en particular células T Vγ9Vδ2, in vitro y/o in vivo, en particular induciendo la activación y expansión de Células T γδ. Preferiblemente, el término se refiere a compuestos que in vitro y/o in vivo aumentan el pirofosfato de isopentenilo (IPP) producido en células de mamíferos, preferiblemente inhibiendo la enzima farnesil pirofosfato sintasa (FPPS) de la ruta del mevalonato.

Un grupo particular de compuestos que estimulan las células T γδ son los bifosfonatos, en particular los bifosfonatos que contienen nitrógeno (N-bifosfonatos; aminobisfosfonatos). Según las enseñanzas, el ácido zoledrónico (INN) o zoledronato (comercializado por Novartis con los nombres comerciales Zometa, Zomera, Aclasta y Reclast) es un bifosfonato particularmente preferido. Zometa se utiliza para prevenir fracturas esqueléticas en pacientes con cánceres como el mieloma múltiple y el cáncer de próstata, así como para tratar la osteoporosis. También se puede utilizar para tratar la hipercalcemia de una enfermedad maligna y puede ser útil para tratar el dolor causado por metástasis óseas.

Los términos “estimulación de células T” o “estimulación de células T” se refieren a la inducción o activación de una respuesta de células T mediante una señal primaria, tal como mediante la interacción con un complejo antígeno-MHC de clase II a través del receptor de células T de antígeno. El término también incluye la coestimulación de células T, como por ejemplo a través de citoquinas (por ejemplo, proteínas CD80 o CD86). Una célula T se activa si ha recibido un evento de señalización primaria que inicia una respuesta inmunitaria por parte de la célula T.

El término “cebado de células T” se refiere a la inducción de un primer contacto de la célula T con su antígeno específico (por ejemplo, mediante células dendríticas que presentan el antígeno a las células T), lo que provoca la diferenciación de la célula T en una célula T efectora (por ejemplo, una célula T citotóxica o una célula T auxiliar).

Los términos “células T en expansión” o “expansión de células T” se refieren al aumento del número de células T, preferiblemente células T que reconocen específicamente un antígeno. Se prefiere que el número de células T que reconocen específicamente un antígeno, por ejemplo, aumenta un antígeno codificado a partir del ARN que adorna la partícula de la presente enseñanza, o un producto de procesión del antígeno. El antígeno o producto de procesión del antígeno se presenta preferiblemente en el contexto de moléculas de MHC, tal como en la superficie de células presentadoras de antígeno como células dendríticas o macrófagos.

El término “ inmunoterapia” se refiere al tratamiento de una enfermedad o afección induciendo, potenciando o suprimiendo una respuesta inmunitaria. Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmunitaria se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen una respuesta inmunitaria se clasifican como inmunoterapias de supresión. El término “ inmunoterapia” incluye inmunización antigénica o vacunación antigénica, o inmunización tumoral o vacunación tumoral. El término “ inmunoterapia” también se refiere a la manipulación de respuestas inmunitarias de modo que respuestas inmunitarias inapropiadas se modulen hacia otras más apropiadas en el contexto de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumática, alergias, diabetes o esclerosis múltiple.

Los términos “ inmunización” o “vacunación” describen el proceso de administrar un antígeno a un individuo con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, por razones terapéuticas o profilácticas.

El término “tratamiento terapéutico” se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la esperanza de vida de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que ha tenido previamente una enfermedad.

Los términos “tratamiento profiláctico” o “tratamiento preventivo” se refieren a cualquier tratamiento que tiene como objetivo evitar que se produzca una enfermedad en un individuo. Los términos “tratamiento profiláctico” o “tratamiento preventivo” se utilizan aquí indistintamente.

Los términos “proteger”, “prevenir”, “profiláctico”, “preventivo” o “protector” se relacionan con la prevención y/o el tratamiento de la aparición y/o la propagación de una enfermedad, por ejemplo, tumor, en un individuo. Por ejemplo, una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente enseñanza, se puede proteger al individuo receptor del desarrollo de un tumor. Por ejemplo, una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente enseñanza, se puede detener el desarrollo de una enfermedad, por ejemplo, conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de un tumor. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento del tumor, en particular una interrupción del progreso del tumor, que conduce preferiblemente a la eliminación del tumor. Una administración terapéutica de una inmunoterapia puede proteger al individuo, por ejemplo, de la diseminación o metástasis de tumores existentes.

El término “compuesto soluble en agua” se refiere a cualquier compuesto que sea capaz de disolverse en agua. Generalmente, la solvatación subyacente surge debido a la atracción entre las cargas positivas y negativas del compuesto con las cargas parcialmente negativas y parcialmente positivas de las moléculas de H2O, respectivamente. Los compuestos que se disuelven en agua también se denominan “hidrófilos” (“amantes del agua”). La solubilidad en agua (Sw), también conocida como solubilidad acuosa, es la cantidad máxima de una sustancia que puede disolverse en agua en equilibrio a una temperatura y presión determinadas. Generalmente, la cantidad limitada viene dada por el producto de solubilidad. Siguiendo la definición de solubilidad de la Farmacopea Europea, “poco soluble” significa que el volumen aproximado de disolvente en mililitros por gramo de soluto es de 30 a 100 (a una temperatura entre 15 °C y 25 °C), “soluble” significa que el volumen aproximado de solvente en mililitros por gramo de soluto es de 10 a 30 (a una temperatura entre 15 °C y 25 °C), “ libremente soluble” significa que el volumen aproximado de solvente en mililitros por gramo de soluto es de 1 a 10 (a una temperatura entre 15 °C y 25 °C), y “muy soluble” significa que el volumen aproximado de solvente en mililitros por gramo de soluto es menor que 1 (a una temperatura entre 15 °C y 25 °C). Para los fines de la presente enseñanza, el ARN se considera un compuesto hidrófilo.

El término “compuesto de molécula pequeña” se refiere aquí a una molécula con baja masa molecular que puede actuar para afectar procesos biológicos. Las moléculas pequeñas pueden incluir cualquier número de agentes terapéuticos actualmente conocidos y utilizados, o pueden ser moléculas pequeñas sintetizadas en una biblioteca de tales moléculas con el fin de seleccionar funciones biológicas. El compuesto de molécula pequeña normalmente tiene una masa molecular igual o menor que 1,000 Da, tal como igual o menor que 500 Da. El compuesto de molécula pequeña sirve preferiblemente como molécula reguladora de procesos biológicos tales como un sustrato enzimático, un antagonista o una molécula activadora alostérica o inhibidora alostérica. Se prefiere que la molécula sea capaz de unirse a otra molécula, tal como una proteína, ácido nucleico o polisacárido, y actuar como efector, alterando la actividad de la otra molécula.

Los términos “ individuo” y “sujeto” se usan en el presente documento indistintamente. Se refieren a un ser humano u otro mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado vacuno, cerdo, oveja, caballo o primate) que puede padecer o es susceptible a una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) pero que puede o no tener la enfermedad o trastorno. En muchas realizaciones, el individuo es un ser humano. A menos que se indique lo contrario, los términos “ individuo” y “sujeto” no denotan una edad particular y, por tanto, abarcan adultos, ancianos, niños y recién nacidos. En realizaciones preferidas de la presente enseñanza, el “ individuo” o “sujeto” es un “paciente”.

El término “paciente” significa un individuo o sujeto para tratamiento, en particular un individuo o sujeto enfermo, incluyendo seres humanos, primates no humanos u otros animales, en particular mamíferos tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores como ratones y ratas. En realizaciones particularmente preferidas de la presente enseñanza, el paciente es un ser humano.

Las partículas de la presente enseñanza se pueden administrar en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada. El término “composición farmacéutica” se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz o una sal del mismo, preferiblemente junto con excipientes farmacéuticos tales como tampones, conservantes y modificadores de la tonicidad. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un individuo. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como formulación farmacéutica. La composición farmacéutica se puede administrar local o sistémicamente, preferiblemente sistémicamente. En el contexto de la presente enseñanza, la composición farmacéutica comprende la partícula de la enseñanza. Esta partícula es terapéuticamente eficaz.

El término “administración sistémica” se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de modo que el agente se distribuya ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolle un efecto biológico. Por ejemplo, el agente puede desarrollar su efecto deseado en la sangre y/o alcanzar su sitio de acción deseado a través del sistema vascular. Las rutas sistémicas típicas de administración incluyen la administración mediante la introducción del agente directamente en el sistema vascular o la administración oral, pulmonar o intramuscular en la que el agente se adsorbe, ingresa al sistema vascular y se transporta a uno o más sitios de acción deseados a través de la sangre.

De acuerdo con la enseñanza, se prefiere que la administración sistémica sea mediante administración parenteral. El término “administración parenteral” se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente no pase por el intestino. El término “administración parenteral” incluye administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica o administración intraarterial pero no se limita a las mismas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden preferiblemente al menos un adyuvante. El término “adyuvante” se refiere a compuestos que, cuando se administran en combinación con un antígeno o péptido antigénico a un individuo, prolongan, mejoran o aceleran una respuesta inmunitaria. Se supone que los adyuvantes ejercen su actividad biológica mediante uno o más mecanismos, incluido un aumento de la superficie del antígeno, una prolongación de la retención del antígeno en el cuerpo, un retraso de la liberación del antígeno y la dirección del antígeno a los macrófagos, aumento de la captación del antígeno, mejora del procesamiento del antígeno, estimulación de la liberación de citocinas, estimulación y activación de células inmunitarias como células B, macrófagos, células dendríticas, células T y activación inespecífica de células inmunitarias. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones oleosas (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (como el alumbre), productos bacterianos (como la toxina de Bordetella pertussis) o complejos inmunoestimulantes. Ejemplos de adyuvantes incluyen saponinas, adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, tocoferol o alumbre, pero no se limitan a los mismos.

La composición farmacéutica de acuerdo con la enseñanza se aplica generalmente en una “cantidad farmacéuticamente eficaz” y en “una preparación farmacéuticamente aceptable”.

El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

La expresión “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad concreta, la reacción deseada se refiere preferentemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende frenar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o invertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad también puede ser un retraso de la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha afección. Una cantidad eficaz de las partículas o composiciones descritas en el presente documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si está presente), la vía de administración específica y factores similares. De acuerdo con lo anterior, las dosis administradas de las partículas o composiciones descritas en el presente documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas mediante una vía de administración diferente y más localizada).

Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, vehículos y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término “excipiente” pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes aromatizantes o colorantes.

El término “diluyente” se refiere a un agente diluyente y/o diluyente. Además, el término “diluyente” incluye uno cualquiera o más de suspensiones y/o medios de mezcla fluidos, líquidos o sólidos.

El término “portador” se refiere a uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para una administración a un ser humano. El término “portador” se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación del componente activo. Preferiblemente, los componentes portadores son líquidos estériles tales como agua o aceites, incluidos aquellos que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. Soluciones salinas y dextrosa acuosa y También se pueden usar soluciones de glicerina como compuestos portadores acuosos.

Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Ejemplos de vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticos se pueden seleccionar con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender como, o además de, el(los) vehículo(s), excipiente(s) o diluyente(s), cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente(s) de recubrimiento adecuados y/o agente(s) solubilizante(s). Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa fluida, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

Los términos “reductor” o “ inhibidor” o expresiones similares se relacionan con la capacidad de provocar una disminución global, preferiblemente de al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50%, al menos 80% o al menos 100% en el nivel, por ejemplo, nivel de expresión, particularmente en comparación con un control. Los términos “reducir” o “ inhibir” o expresiones similares incluyen una reducción o inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción o inhibición a cero o esencialmente a cero, particularmente en comparación con un control.

Los términos “aumentar” o “mejorar” o expresiones similares se relacionan con la capacidad de provocar un aumento o mejora general, preferiblemente de al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, en al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 80 % o al menos 100 % en el nivel, por ejemplo, nivel de expresión, particularmente en comparación con un control.

El término “acumulación de ARN” se refiere al enriquecimiento de ARN en su sentido más amplio. Preferiblemente, el enriquecimiento es un enriquecimiento local en un cuerpo, órgano, tejido, tipo de célula, orgánulos celulares o compartimento celular. El término “acumulación de ARN” se refiere preferiblemente a un aumento de concentración de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 80 % o al menos 100 %. De acuerdo con la enseñanza, el término “acumulación de ARN” puede significar un aumento de la concentración del ARN a lo largo del tiempo en un individuo, órgano, tejido, tipo de célula, orgánulo celular o compartimento celular (por ejemplo, cambio de la concentración de ARN antes y después del tratamiento) o puede referirse a diferencias de concentración entre diferentes individuos, órganos, tejidos, tipos de células, orgánulos celulares o compartimentos celulares (por ejemplo, diferencia de concentración de ARN entre pulmón y bazo).

Se prefiere en una realización que el ARN en las partículas de la presente enseñanza, después de la administración sistémica, se entregue al bazo y/o se exprese en el bazo.

En una realización, las partículas de la presente enseñanza se administran al bazo para activar las células presentadoras de antígeno esplénico. Por lo tanto, se prefiere que después de la administración sistémica de las partículas de la presente enseñanza se produzca la liberación de ARN y/o la expresión de ARN en células presentadoras de antígenos. Las células presentadoras de antígenos son preferentemente células presentadoras de antígenos profesionales o células presentadoras de antígenos no profesionales. Más preferiblemente, las células presentadoras de antígenos profesionales son células dendríticas y/o macrófagos, incluso más preferiblemente células dendríticas esplénicas y/o macrófagos esplénicos.

En una realización preferida, la administración sistémica de las partículas de la presente enseñanza da como resultado un aumento de la expresión de al menos un marcador de maduración en células dendríticas y/o macrófagos tales como células dendríticas esplénicas y/o macrófagos esplénicos. Preferiblemente, el marcador de maduración se selecciona del grupo que consiste en moléculas CD40, CD80, CD86, CD83, MHC de clase I y II tales como HLA-DR. Más preferiblemente, el marcador de maduración se selecciona del grupo que consiste en moléculas CD40, CD86, y MHC de clase II. Aún más preferiblemente, el marcador de maduración se selecciona del grupo que consiste en CD40, CD86 y HLA-DR.

El término “aproximadamente” significa mayor o menor que el valor o rango de valores indicados en 1/10 de los valores indicados, pero no pretende limitar ningún valor o rango de valores. Por ejemplo, un valor de concentración de aproximadamente el 30 % significa una concentración entre el 27 % y el 33 %. Cada valor o rango de valores precedido por el término “aproximadamente” también pretende abarcar la realización del valor absoluto o rango de valores indicado.

El término “porción” se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular, el término “porción de la misma” puede designar una fracción continua o discontinua de la misma. Una porción puede comprender al menos el 1 %, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, preferentemente al menos el 40%, preferentemente al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, incluso más preferentemente al menos el 80 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % y lo más preferentemente el 100 %.

Los agentes y composiciones proporcionados en el presente documento se pueden usar solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

En particular, el tratamiento del cáncer representa un campo donde las estrategias de combinación son especialmente deseables ya que frecuentemente la acción combinada de dos, tres, cuatro o incluso más fármacos/terapias contra el cáncer genera efectos sinérgicos que son considerablemente más fuertes que el impacto de un enfoque monoterapéutico. Por tanto, en otra realización de la presente enseñanza, un tratamiento contra el cáncer que utiliza las partículas de la enseñanza se puede combinar eficazmente con otros diversos fármacos. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, combinaciones con terapias tumorales convencionales, estrategias de múltiples epítopos, inmunoterapia adicional y enfoques de tratamiento dirigidos a la angiogénesis o la apoptosis (para una revisión, consulte, por ejemplo, Andersen et al. 2008: Cancer Treatment: the combine of vacunación with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743.) La administración secuencial de diferentes agentes puede inhibir el crecimiento de células cancerosas en diferentes puntos de control, mientras que otros agentes pueden, por ejemplo, inhibe la neoangiogénesis, la supervivencia de células malignas o metástasis, convirtiendo potencialmente el cáncer en una enfermedad crónica. La siguiente lista proporciona algunos ejemplos no limitantes de fármacos y terapias anticancerígenos que pueden usarse en combinación con la presente enseñanza:

1. Quimioterapia

La quimioterapia es el estándar de atención para múltiples tipos de cáncer. Los agentes quimioterapéuticos más comunes actúan matando las células que se dividen rápidamente, una de las principales propiedades de las células cancerosas. Por tanto, una combinación con fármacos quimioterapéuticos convencionales como, por ejemplo, Los agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa y otros agentes antitumorales que afectan la división celular o la síntesis de ADN pueden mejorar significativamente los efectos terapéuticos de la presente enseñanza al eliminar las células supresoras, reiniciar el sistema inmunitario y transformar las células tumorales más susceptibles a la muerte mediada por el sistema inmunitario o por activación adicional de células del sistema inmunitario. En múltiples estudios se ha demostrado una acción anticancerígena sinérgica de los fármacos quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos basados en vacunas (ver, por ejemplo, Quoix et al. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125-33.; ver también Liseth et al. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979; ver también Hirooka et al 2009: A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74). Hay cientos de fármacos quimioterapéuticos disponibles que son básicamente adecuados para terapias combinadas. Algunos ejemplos (no limitantes) de fármacos quimioterapéuticos que pueden combinarse con la presente enseñanza son carboplatino (Paraplatin), cisplatino (Platinol, Platinol-AQ), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), docetaxel (Taxotere), doxorrubicina (Adriamycin), erlotinib (Tarceva), etopósido (VePesid), fluorouracilo (5-FU), gemcitabina (Gemzar), mesilato de imatinib (Gleevec), irinotecán (Camptosar), metotrexato (Folex, Mexate, Amethopterin), paclitaxel (Taxol, Abraxane), sorafinib (Nexavar), sunitinib (Sutent), topotecán (Hycamtin), vincristina (Oncovin, Vincasar PFS) y vinblastina (Velban).

2. Cirugía

La cirugía del cáncer, una operación para extirpar el tumor, sigue siendo la base del tratamiento del cáncer. La cirugía se puede combinar con otros tratamientos contra el cáncer para eliminar las células tumorales restantes. La combinación de métodos quirúrgicos con un tratamiento inmunoterapéutico posterior es un enfoque prometedor que se ha demostrado en innumerables ocasiones.

3. Radiación

La radioterapia sigue siendo un componente importante del tratamiento del cáncer, ya que aproximadamente el 50 % de todos los pacientes con cáncer reciben radioterapia durante el curso de su enfermedad. El objetivo principal de la radioterapia es privar a las células cancerosas de su potencial de multiplicación (división celular). Los tipos de radiación que se utilizan para tratar el cáncer son la radiación de fotones (rayos X y rayos gamma) y la radiación de partículas (haces de electrones, protones y neutrones). Hay dos formas de administrar la radiación a la ubicación del cáncer. La radiación de haz externo se administra desde fuera del cuerpo dirigiendo rayos de alta energía (fotones, protones o radiación de partículas) a la ubicación del tumor. La radiación interna o braquiterapia se administra desde el interior del cuerpo mediante fuentes radiactivas, selladas en catéteres o semillas directamente en el sitio del tumor. Las técnicas de radioterapia que son aplicables en combinación con la presente enseñanza son, por ejemplo, fraccionamiento (radioterapia administrada en un régimen fraccionado, por ejemplo, fracciones diarias de 1.5 a 3 Gy administradas durante varias semanas), radioterapia conformada 3D (3DCRT; administración de radiación al volumen macroscópico del tumor), radioterapia de intensidad modulada (IMRT; intensidad controlada por computadora) modulación de múltiples haces de radiación), radioterapia guiada por imágenes (IGRT; una técnica que comprende imágenes previas a la radioterapia que permiten la corrección) y radioterapia corporal estereotáxica (SRBT, que administra dosis individuales muy altas de radiación en solo unas pocas fracciones de tratamiento). Para una revisión de la radioterapia, consulte Baskar et al. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193-199.

4. Anticuerpos

Los anticuerpos (preferiblemente anticuerpos monoclonales) logran su efecto terapéutico contra las células cancerosas a través de diversos mecanismos. Pueden tener efectos directos en la producción de apoptosis o muerte celular programada. Pueden bloquear componentes de vías de transducción de señales como, por ejemplo, receptores del factor de crecimiento, deteniendo eficazmente la proliferación de células tumorales. En las células que expresan anticuerpos monoclonales, pueden provocar la formación de anticuerpos antiidiotipo. Los efectos indirectos incluyen el reclutamiento de células que tienen citotoxicidad, como monocitos y macrófagos. Este tipo de destrucción celular mediada por anticuerpos se denomina citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los anticuerpos también se unen al complemento, lo que provoca toxicidad celular directa, conocida como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Combinar métodos quirúrgicos con fármacos o métodos inmunoterapéuticos es un enfoque exitoso, como por ejemplo, demostrado en Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother.32(4): 333-40. La siguiente lista proporciona algunos ejemplos no limitantes de anticuerpos anticancerígenos y objetivos potenciales de anticuerpos (entre paréntesis) que pueden usarse en combinación con la presente enseñanza: Abagovomab (CA-125), Abciximab (CD41), Adecatumumab (EpCAM), Afutuzumab (CD20), Alacizumab pegol (VEGFR2), Altumomab pentetato (CEA), Amatuximab (MORAb-009), Anatumomab mafenatox (TAG-72), Apolizumab (h La -DR), Arcitumomab (c e a ), Bavituximab (fosfatidilserina), Bectumomab (CD22), Belimumab (BAFF), Bevacizumab (VEGF-A), Bivatuzumab mertansina (CD44 v6), Blinatumomab (CD19), Brentuximab vedotina (CD30 TNFRSF8), Cantuzumab mertansina (mucina CanAg), Cantuzumab ravtansina (MUC1), Capromab pendetida (células de carcinoma de próstata), Carlumab (CNTO888), Catumaxomab (EpCAM, CD3), Cetuximab (e Gf R), Citatuzumab bogatox (EpcAM), Cixutumumab (receptor de IGF-1), Claudiximab (Claudin), Clivatuzumab tetraxetan (MUC1), Conatumumab (TRAII,-R2), Dacetuzumab (CD40), Dalotuzumab (receptor I del factor de crecimiento similar a la insulina), Denosumab (RANKL), Detumomab (linfoma de células B), Drozitumab (DR5), Ecromeximab (gangliósido GD3), Edrecolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7), Enavatuzumab (PDL192), Ensituximab (NPC-1C), Epratuzumab (CD22), Ertumaxomab (HER2/neu, CD3), Etaracizumab (integrina avp3), Farletuzumab (receptor de folato 1), FBTA05 (CD20), Ficlatuzumab (SCH 900105), Figitumumab (receptor IGF-1), Flanvotumab (glicoproteína 75), Fresolimumab (TGF-p), Galiximab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamicina (CD33), Gevokizumab (IL-1 p), Girentuximab (anhidrasa carbónica 9 (CA-IX)), Glembatumumab vedotin (GPNMB), Ibritumomab tiuxetan (c D20), Icrucumab (Ve GFR-1), Igovoma (CA-125), Indatuximab ravtansina (SDC1), Intetumumab (CD51), Inotuzumab ozogamicina (CD22), Ipilimumab (CD152), Iratumumab (CD30), Labetuzumab (CEA), Lexatumumab (TRAII,-R2), Libivirumab (antígeno de superficie de la hepatitis B), Lintuzumab (CD33), Lorvotuzumab mertansina (CD56), Lucatumumab (CD40), Lumiliximab (CD23), Mapatumumab (TRAIL-R1), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74), Mitumomab (gangliósido GD3), Mogamulizumab (CCR4), Moxetumomab pasudotox (CD22), Nacolomab tafenatox (antígeno C242), Naptumomab estafenatox (5T4), Narnatumab (RON), Necitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Nivolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R a), Onartuzumab (dispersión humana receptor del factor quinasa), Oportuzumab monatox (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Oxelumab (OX-40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzumab (HER2/neu), Pintumomab (adenocarcinoma antígeno), Pritumumab (vimentina), Racotumomab (ácido N-glicolilneuramínico), Radretumab (dominio extra B de fibronectina), Rafivirumab (glucoproteína del virus de la rabia), Ramucirumab (VEGFR2), Rilotumumab (HGF), Rituximab (CD20), Robatumumab (<i>G<f>-1), Samalizumab (CD200), Sibrotuzumab (FAP), Siltuximab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Tacatuzumab tetraxetan (alfa-fetoproteína), Taplitumomab paptox (CD19), Tenatumomab (tenascina C), Teprotumumab (CD221), Ticilimumab (CTLA-4), Tigatuzumab (TrA iL-R2), TNX-650 (IL-13), Tositumomab (CD20), Trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumab (CTlA-4), Tucotuzumab celmoleukin (EpCAM), Ublituximab (MS4A1), Urelumab (4-1Bb ), Volociximab (integrina a5p1), Votumumab (antígeno tumoral CTAA16.88), Zalutumumab (EGFR), Zanolimumab (C<d>4).

5. Citocinas, quimiocinas, moléculas coestimuladoras, proteínas de fusión.

El uso combinado de las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza, tales como las composiciones farmacéuticas que codifican antígenos de la presente enseñanza, con citocinas, quimiocinas, moléculas coestimuladoras y/o proteínas de fusión de las mismas para provocar efectos beneficiosos de modulación inmunitaria o de inhibición tumoral es otra realización de la presente enseñanza. Para aumentar la infiltración de células inmunes en el tumor y facilitar el movimiento de las células presentadoras de antígenos hacia los ganglios linfáticos que drenan el tumor, se podrían utilizar varias quimiocinas con estructuras C, CC, CXC y CX3C. Algunas de las quimiocinas más prometedoras son, por ejemplo, CCR7 y sus ligandos CCL19 y CCL21, además de CCL2, CCL3, CCL5 y CCL16. Otros ejemplos son CXCR4, CXCR7 y CXCL12. Además, las moléculas coestimuladoras o reguladoras tales como, por ejemplo, Los ligandos B7 (B7.1 y B7.2) son útiles. También son útiles otras citocinas tales como, por ejemplo, especialmente interleucinas (por ejemplo, IL-1 a IL17), interferones (por ejemplo, IFNalfal a IFNalfa8, IFNalfal 0, IFNalfa13, IFNalfa14, IFNalfa16, IFNalfa17, IFNalfa21, IFNbetal, IFNW, IFNE1 e IFNK), factores hematopoyéticos, TGF (por ejemplo, TGF-a, TGF-p, y otros miembros de la familia TGF), finalmente miembros de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral y sus ligandos así como otras moléculas estimuladoras, que comprenden, pero no se limitan a, 4-1BB, 4-1BB-L, CD137, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFR1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.beta.R, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn114, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT y CD95 (Fas/APO-1), proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides, apoptosis relacionada con el receptor de TNF -proteína mediadora (TRAMP) y receptor de muerte-6 (DR6). Especialmente CD40/CD40L y OX40/OX40L son objetivos importantes para la inmunoterapia combinada debido a su impacto directo en la supervivencia y proliferación de las células T. Para una revisión, ver Lechner et al.

2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins forthe immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340.

6. Tratamientos bacterianos

Los investigadores han estado utilizando bacterias anaeróbicas, como Clostridium novyi, para consumir el interior de tumores pobres en oxígeno. Estos deberían morir al entrar en contacto con las caras oxigenadas del tumor, por lo que serían inofensivos para el resto del cuerpo. Otra estrategia es utilizar bacterias anaeróbicas que hayan sido transformadas con una enzima que pueda convertir un profármaco no tóxico en un fármaco tóxico. Con la proliferación de bacterias en las zonas necróticas e hipóxicas del tumor, la enzima se expresa únicamente en el tumor. Por tanto, un profármaco aplicado sistémicamente se metaboliza hasta convertirse en fármaco tóxico sólo en el tumor. Se ha demostrado que esto es eficaz con el anaerobio no patógeno Clostridium sporogenes.

7. Inhibidores de quinasa

Otro gran grupo de objetivos potenciales para la terapia complementaria contra el cáncer comprende inhibidores de quinasa, porque el crecimiento y la supervivencia de las células cancerosas están estrechamente entrelazados con la desregulación de la actividad quinasa. Para restablecer la actividad normal de la quinasa y, por tanto, reducir el crecimiento tumoral, se utiliza una amplia gama de inhibidores. El grupo de quinasas dirigidas comprende tirosina quinasas receptoras, por ejemplo, BCR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-2/ErbB2, IGF-IR, PDGFR-a, PDGFR-p, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFR1, FGFR3, F<g>F<r>4, CSF1R, c-Met, RON, c-Ret, ALK, tirosina quinasas citoplasmáticas, por ejemplo, c-SRC, c-YES, Abl, JAK-2, serina/treonina quinasas, por ejemplo, ATM, Aurora A y B, CDK, mTOR, PKCi, PLK, b-Raf, S6K, STK11/LKB1 y lípido quinasas, por ejemplo, PI3K, SK1. Los inhibidores de quinasas de molécula pequeña son, por ejemplo, PHA-739358, Nilotinib, Dasatinib y PD166326, NSC 743411, Lapatinib (GW-572016), Canertinib (CI-1033), Semaxinib (SU5416), Vatalanib (PTK787/ZK222584), Sutent (SU11248), Sorafenib (BAY 43-9006) y leflunomida (SU101). Para obtener más información, consulte, por ejemplo, Zhang et al. 2009: Targeting cancerwith small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39.

8. Receptores tipo Toll

Los miembros de la familia de receptores tipo Toll (TLR) son un vínculo importante entre la inmunidad innata y adaptativa y el efecto de muchos adyuvantes depende de la activación de los TLR. Una gran cantidad de vacunas establecidas contra el cáncer incorporan ligandos para TLR para estimular las respuestas a las vacunas. Además de TLR2, TLR3, TLR4, especialmente TLR7 y TLR 8, se han examinado para la terapia del cáncer en enfoques de inmunoterapia pasiva. Los TLR7 y TLR8, estrechamente relacionados, contribuyen a las respuestas antitumorales al afectar las células inmunitarias, las células tumorales y el microambiente tumoral y pueden ser activados por estructuras análogas de nucleósidos. Todos los TLR se han utilizado como inmunoterapéuticos independientes o adyuvantes de vacunas contra el cáncer y pueden combinarse sinérgicamente con las formulaciones y métodos de la presente enseñanza. Para obtener más información, consulte van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49-55.

9. Inhibidores de angiogénesis

Además de las terapias que se dirigen a receptores inmunomoduladores afectados por mecanismos de escape mediados por tumores y supresión inmunitaria, existen terapias que se dirigen al entorno tumoral. Los inhibidores de la angiogénesis previenen el crecimiento extenso de vasos sanguíneos (angiogénesis) que los tumores necesitan para sobrevivir. La angiogénesis promovida por las células tumorales para satisfacer sus crecientes demandas de nutrientes y oxígeno, por ejemplo, puede bloquearse dirigiéndose a diferentes moléculas. Ejemplos no limitantes de moléculas mediadoras de angiogénesis o inhibidores de angiogénesis que pueden combinarse con la presente enseñanza son VEGF soluble (isoformas de VEGF VEGF121 y VEGF165, receptores VEGFR1, VEGFR2 y correceptores Neuropilina-1 y Neuropilina-2) 1 y NRP- 1, angiopoyetina 2, TSP-1 y TSP-2, angiostatina y moléculas relacionadas, endostatina, vasostatina, calreticulina, factor plaquetario 4, TIMP y CDAI, Meth-1 y Meth-2, IFN-a, -p y -<y>, CXCL10 IL-4, -12 y -18, protrombina (dominio kringle-2), fragmento de antitrombina III, prolactina, VEGI, SPARC, osteopontina, maspina, canstatina, proteína relacionada con la proliferina, restina y fármacos como, por ejemplo, bevacizumab, itraconazol, carboxiamidotriazol, TNP-470, CM101, IFN-a, factor plaquetario 4, suramina, SU5416, trombospondina, antagonistas de VEGFR, esteroides angiostáticos heparina, angiogénesis derivada del cartílago Factor inhibidor, inhibidores de metaloproteinasas de matriz, 2-metoxiestradiol, tecogalan, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina, inhibidores de prolactina a Vp3, linomida, tasquinimod. Para una revisión, consulte Schoenfeld and Dranoff 2011: Antiangiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81.

10. Fármacos de terapia dirigida de moléculas pequeñas

Los fármacos de terapia dirigida de moléculas pequeñas son generalmente inhibidores de dominios enzimáticos en proteínas mutadas, sobreexpresadas o de otro modo críticas dentro de la célula cancerosa. Ejemplos destacados y no limitantes son los inhibidores de la tirosina quinasa imatinib (Gleevec/Glivec) y gefitinib (Iressa). El uso de moléculas pequeñas, por ejemplo, El malato de sunitinib y/o el tosilato de sorafenib dirigidos a algunas quinasas en combinación con vacunas para la terapia del cáncer también se describen en la solicitud de patente anterior US2009004213.

11. Vacunas basadas en virus

Hay varias vacunas contra el cáncer basadas en virus disponibles o en desarrollo que pueden usarse en un enfoque terapéutico combinado junto con las formulaciones de la presente enseñanza. Una ventaja del uso de tales vectores virales es su capacidad intrínseca para iniciar respuestas inmunitarias, con reacciones inflamatorias que ocurren como resultado de la infección viral creando la señal de peligro necesaria para la activación inmunitaria. Un vector viral ideal debería ser seguro y no debería introducir una respuesta inmunitaria anti-vector para permitir estimular respuestas antitumorales específicas. Se han utilizado virus recombinantes como los virus vaccinia, los virus del herpes simple, los adenovirus, los virus adenoasociados, los retrovirus y los virus avipox en modelos de tumores animales y, basándose en sus alentadores resultados, se han iniciado ensayos clínicos en humanos. Las vacunas basadas en virus especialmente importantes son las partículas similares a virus (VLP), pequeñas partículas que contienen ciertas proteínas de la capa externa de un virus. Las partículas similares a virus no contienen ningún material genético del virus y no pueden causar una infección, pero pueden construirse para presentar antígenos tumorales en su cubierta. Las VLP pueden derivarse de diversos virus como, por ejemplo, el virus de la hepatitis B u otras familias de virus que incluyen Parvoviridae (por ejemplo, virus adenoasociado), Retroviridae (por ejemplo, VIH) y Flaviviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C). Para una revisión general, ver Sorensen and Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177-93; Las partículas similares a virus contra el cáncer se revisan en Buonaguro et al. 2011: Desarrollos en vacunas basadas en partículas similares a virus para enfermedades infecciosas y cáncer. Expert Rev Vaccines 10(11): 1569-83; y en Guillén et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133.

12. Estrategias de múltiples epítopos

El uso de múltiples epítopos muestra resultados prometedores para la vacunación. Las tecnologías de secuenciación rápida combinadas con sistemas de algoritmos inteligentes permiten la explotación del mutanoma tumoral y pueden proporcionar epítopos múltiples para vacunas individualizadas que pueden combinarse con la presente enseñanza. Para obtener más información, consulte 2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762-772; furthermore Castle et al. 2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5):1081-91.

13. Transferencia adoptiva de células T

Por ejemplo, una combinación de una vacunación con antígeno tumoral y transferencia de células T se describe en: Rapoport et al. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin afterASCT formyeloma. Blood 117(3):788-97.

14. Terapias dirigidas a base de péptidos

Los péptidos pueden unirse a receptores de la superficie celular o a la matriz extracelular afectada que rodea el tumor. Los radionucleidos que están unidos a estos péptidos (por ejemplo, RGD) acaban destruyendo la célula cancerosa si el nucleido se desintegra en las proximidades de la célula. Especialmente los oligo o multímeros de estos motivos de unión son de gran interés, ya que esto puede conducir a una mayor especificidad y avidez del tumor. Para ejemplos no limitantes, consulte Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61.

15. Otras terapias

Existen numerosas otras terapias contra el cáncer que se pueden combinar con la presente enseñanza para crear efectos sinérgicos. Ejemplos no limitantes son tratamientos dirigidos a la apoptosis, hipertermia, terapia hormonal, terapia con telomerasa, terapia de potenciación de insulina, terapia génica y terapia fotodinámica.

La presente enseñanza se describe en detalle mediante las figuras y ejemplos siguientes, que se utilizan sólo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Gracias a la descripción y a los ejemplos, el experto puede acceder a otras formas de realización que también están incluidas en la enseñanza.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Preparación de dispersiones lipídicas coloidales que comprenden ZA mediante técnica de inyección de etanol y procesamiento posterior

Se adquirieron 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) de Avanti Polar Lipids (Alabastro, AL). El colesterol (pureza del 99 %) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). El ácido zoledrónico se obtuvo de CHEMOS GmbH (Regenstauf, Alemania). La solución salina tampón fosfato libre de ARNasas y el tampón hepes se adquirieron de Ambion (Darmstadt, Alemania). El agua libre de ARNasa se adquirió de B-Braun (Melsungen, Alemania). Todos los reactivos eran de grado analítico. Los coloides se prepararon mediante una técnica de inyección de etanol modificada de acuerdo con el siguiente protocolo:

• Se transfirieron 1.5 ml de la solución acuosa de ácido zoledrónico (0.66, 1.33, 2.0, 3.33, 6.67, 10.0, 20 mg/ml) en tampón HEPES 100 mM, pH 4.0 a un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. El vaso de precipitados se colocó en un agitador magnético y la solución se agitó a 400 rpm usando un agitador modelo de calamar grande IKA (IKA, Konigswinter Alemania).

• Se diluyeron adicionalmente 0.492 ml de una solución lipídica en etanol (DOTMA/DOPE; relación molar 2:1 y concentración total de lípidos 270 y 135 mM para DOTMA y DOPE, respectivamente) con etanol absoluto hasta 0.666 ml (200 y 100 mM para DOTMA y DOPE, respectivamente) y se inyectan con una jeringa (tipo jeringa: Omnifix®-F jeringa de plástico estéril de 1 ml, B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

• Después de la inyección de lípidos, la suspensión se agitó durante 10 minutos.

• Después de 10 minutos, se añadieron al coloide 3 ml de agua libre de ARNasa. La dispersión de lípidos y ZAse agitó durante 20 minutos.

Filtración del coloide

• La dispersión bruta obtenida de la dispersión coloidal se pasó a través de una membrana CE Minisart de 0.45 pm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemania).

Diálisis del coloide

La diálisis del coloide filtrado para eliminar el ácido zoledrónico libre y el residuo de etanol se llevó a cabo de la siguiente manera:

• Cada 1 ml del coloide se dializó frente a 200 ml de PBS utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer 10K sin ARNasa (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Alemania).

• La diálisis se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 24 horas y a una velocidad de agitación de 400 rpm. El coloide se recuperó en un tubo Falcon estéril para realizar caracterizaciones fisicoquímicas adicionales.

Retención de ácido zoledrónico (ZA) en el coloide

Se cuantificó el ácido zoledrónico retenido mediante HPLC. El sistema HPLC constaba de una bomba cuaternaria G1311B, un detector DAD (detector de matriz de diodos) G4212B, un muestreador automático AS Hip G1367E, un termostato de horno de columna G1330B y una ChemStation para LC revisión B.04.02 (Agilent technologies, Colorado, EE. UU.). La fase estacionaria fue la columna xSelect CSH (C18) (150 mm * 4.6 mm * 3.5 pm) (Waters, Eschborn, Alemania). La fase móvil era una mezcla de metanol (20 %) y tampón fosfato 30 mM (80 %) que contenía bromuro de tetrabutilamonio 5 mM (TCI Deutschland GmbH, Eschborn, Alemania) ajustado a pH 7.2. Para la determinación del pH de la fase móvil se utilizó un medidor de pH inoLab pH 7310P (WTW, Weilheim, Alemania). El caudal y la temperatura del horno de columna fueron 1 ml/min y 50 °C. La longitud de onda de detección fue de 215 nm. El volumen de inyección ascendió a 25 pl. El ácido zoledrónico libre se determinó usando Ultracel de alta recuperación con una membrana de celulosa regenerada y MWCO de 30 KD (Millipore, Schwalbach/Ts., Alemania) y usando los siguientes pasos:

• Eliminación de cualquier conservante mediante filtración de una solución de NaOH 0.1 M seguida de PBS a través de la membrana.

• Transferir 500 pl de la muestra de coloide a tubos Ultracel de 0.5 ml.

• Centrifugación de la muestra a 4000 xg utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo de 40° Pico 21 (Thermoscientific, Osterode, Alemania) a temperatura ambiente durante 15 minutos.

• Recolección del filtrado en un vial de vidrio de HPLC para su cuantificación.

• Medición de la concentración de ácido zoledrónico en el filtrado mediante HPLC como se mencionó anteriormente.

Cálculo del % de eficiencia de retención

% de eficiencia de retención = [(ZAtotal en coloide dializado - ZA libre en coloide dializado/ZAtotal en coloide dializado] • (100).

Formación de LNP que comprenden ZAy ARN

De acuerdo con la relación requerida de lípido catiónico/ARN (mol/base), el volumen calculado de ZA/coloide lipídico se añadió al volumen calculado deARN/PBS. La mezcla se incubó durante al menos 15 minutos para formar LNP

Retención de ácido zoledrónico (ZA) en función de la concentración inicial de ZA en dispersiones lipídicas coloidales

La dispersión lipídica coloidal se preparó mediante la técnica de inyección de etanol como se describió anteriormente. La composición lipídica fue DOTM<a>/DOPE en una proporción molar de 2/1. Se disolvió ZA en tampón HEPES 100 mM a una concentración de 20 mg/ml y se ajustó el pH a 4 aproximadamente con NaOH 5 M. La concentración de lípidos fue de aprox. 12 mM. El ácido zoledrónico retenido y libre se cuantificó mediante HPLC. El ácido zoledrónico libre se determinó utilizando Ultracel de alta recuperación con membrana de celulosa regenerada y MWCO de 30 KD. Las muestras se centrifugaron a 4000 xg usando una centrífuga de rotor de ángulo fijo de 40° Pico 21 a temperatura ambiente durante 15 minutos. El filtrado se recogió en un vial de HPLC para su cuantificación.

Retención de ZA en LNP que comprenden ácido zoledrónico y ARN

Se mezclaron dispersiones lipídicas coloidales que comprendían ZAcon diferentes fracciones molares de lípido con PBS como control, ARN y Triton x100. La composición lipídica fue DOTMA/DOPE en una relación molar 2/1. Se prepararon dispersiones de ZA/lípidos mezclando un volumen calculado de dispersiones de lípidos que comprendían ZA con el volumen calculado de ARN en tres concentraciones de lípidos diferentes: 2, 4 y 6 mM. Las dispersiones de ZA/lípidos y ARN se mezclaron en una proporción de 1:1 (v/v). La relación de carga de lípido catiónico/ARN (mol/base) fue de 1:2. Para PBS y Tritonx100, el volumen de ARN calculado se reemplazó por PBS fisiológico o solución acuosa de Triton x100 al 10 %. Los LNP que comprenden ZAyARN se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se transfirieron a tubos Ultracel de 0.5 ml previamente limpios de conservantes mediante filtración de solución de NaOH 0.1 M seguida de PBS a través de la membrana. Las muestras se centrifugaron a 4000 xg utilizando una centrífuga con rotor de ángulo fijo de 40° Pico 21 (Thermoscientific, Osterode, Alemania) a temperatura ambiente durante 15 minutos. El filtrado se recogió en un vial de vidrio de HPLC para su cuantificación. Medición de la concentración de ácido zoledrónico en el filtrado mediante HPLC como se mencionó anteriormente.

Microscopía electrónica de criotransmisión (Cryo-TEM) de LNP que comprenden ácido zoledrónico y ARN

La composición lipídica de las LNP era DOTMA/DOPE en una proporción molar de 2:1, contenían ARN en una proporción positiva/negativa (lípido catiónico/nucleótido de ARN) de 1.3:2. La concentración final de lípidos fue de 0.3 mM. Después del ensamblaje, las formulaciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de las mediciones Cryo-TEM. Se aplicaron tres pl de la muestra a rejillas EM de 3 mm de película de soporte de carbón perforado con descarga luminosa (cobre, malla 300, película de 3.5 micrómetros/1 micrómetros, Quantifoil, Plano, Jena, Alemania). Inmediatamente después de la aplicación, las muestras se secaron (1.5 segundos, -1 fuerza de transferencia, transferencia única, 90 % de humedad, 15 grados Celsius) y se congelaron en etano líquido mediante un sistema de congelación por inmersión automático (Vitrobot, Mark II, FEI Company, Eindhoven, Los Países Bajos). Las muestras vitrificadas se almacenaron en nitrógeno líquido. La transferencia a baja temperatura se realizó mediante un soporte de criotransferencia de nitrógeno líquido de inclinación única (modelo 626, Gatan, Pleasanton, EE. UU.). Se ha utilizado un microscopio Tecnai F30 (FEI Company, Eindhoven, Países Bajos) sintonizado a un voltaje de aceleración de 300 kV para microscopía crioelectrónica de transmisión de dosis bajas. La adquisición de datos se realizó en una cámara CCD UltraScan US4000 (Gatan, Pleasanton, EE. UU.). Los tamaños de píxeles han estado entre 0.15 y 1 nm a nivel de muestra. Las imágenes han sido tomadas con el software Digital Micrograph (Gatan, Pleasanton, EE. UU.) y se muestran sin procesamiento adicional de datos.

Células PBMC

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de donaciones de Capa Leucocitaria, extraídas de “Transfusions-Zentrale” de la Universitatsmedizin Mainz, mediante centrifugación de densidad en un gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque.

Después del aislamiento, las PBMC se procesaron adicionalmente para generar células mononucleares CD14+ usando MicroBeads CD14 y columnas LS (Miltenyi Biotec). Se usaron células CD14+ purificadas para generar células dendríticas inmaduras (iCD) convencionales mediante cultivo de 5 días en medio estándar suplementado con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml).

Se congelaron células empobrecidas en CD14, es decir, linfocitos de sangre periférica (PBL), en nitrógeno líquido para usarse posteriormente en experimentos de cocultivo.

El medio estándar fue RPMI 1640. que contenía FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml y 100 mg/ml.

Citometría de flujo

Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales (mAb): anti-CD83 marcado con FITC (HB15e, BD Pharmingen), anti-CD86 marcado con PE (IT2.2, BD Pharmingen), anti-HLA-DR marcado con APC (<g>46-6, BD Pharmingen). La viabilidad de las células siempre se evaluó utilizando el colorante de viabilidad fijable eFluor506 (eBioscience).

Todos los datos citoméricos de flujo se adquirieron utilizando el citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star).

Proliferación/expansión de células T y982

Para comprobar la funcionalidad del compuesto retenido, ZA, se evaluó la expansión de las células T<y>982 después del cocultivo de iCD cargadas con ZAcon PBL criopreservados.

Para la evaluación de la frecuencia ex vivo de células T y982, se tiñeron PBMC recién aisladas con mAB anti-CD3, anti-TCR-V82 y se analizaron mediante citometría de flujo. Por lo tanto, las iCD se incubaron como se indica durante 24 h en medio estándar (1x106 células/ml) que contenía ZA5 pm. Después de cargar con ZA, los iCD se centrifugaron y se lavaron con PBS. El cocultivo de iCD con PBL se configuró en una proporción de 20 (iCD): 1 células T y982 ex vivo. El medio se complementó con 10 U/ml de IL-2 (Proleukin). Después de una incubación de 7 días, las células se recogieron, se lavaron y se tiñeron con mAB anti-CD3 y anti-TCR-V82 para evaluar la frecuencia de las células T y982 y su expansión mediante citometría de flujo. Para el análisis, la tasa de expansión se determinó dividiendo la cantidad de células completas de células T y982 antes o después de un cultivo de 7 días.

Expresión de ARN

Si el ARN todavía está intacto cuando está unido a LNP, la traducción del ARN que codifica la luciferasa se comprobó mediante bioluminiscencia. Aquí, se sembraron 2x10A5 iCD en una placa de 96 pocillos y se incubaron como se indica durante 24 h. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron (300 g, 5 min) y se descartaron los sobrenadantes. Para el sistema de ensayo de luciferasa (Bright Glo™, Promega), los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 pl de medio estándar (sin Pen/Strep) y se añadieron 100 pl de solución de sustrato de ensayo a cada pocillo. La luminiscencia se midió después de 10 minutos de incubación con un lector de luminiscencia (Tecan Infinite M200).

Maduración de CC

Para evaluar si las formulaciones/sustancias conducen a una maduración de las CD después de la incubación, se realizó un análisis de citometría de flujo. Por lo tanto, las iCD se sembraron en medio estándar en una placa de 48 pocillos (1x10A6 CD/ml y pocillo) y se incubaron como se indica durante la noche, aproximadamente 20 h o durante 24 h, así como 48 h. Después de la incubación, las células se recogieron, se lavaron y se tiñeron con mAB anti-CD83, anti-CD86 y anti-HLA-DR. Como control positivo para la maduración se utilizó el llamado “cóctel de maduración” que contiene las siguientes citoquinas: IL-4 (500 U/mL), GM-CSF (800 U/mL), IL-1p (10 ng/mL), TNF-a (10 ng/ml), lL-6 (1000 U/ml) y PGE-2 (1 pg/ml). Para el análisis, la expresión de estos marcadores se normalizó con respecto al control negativo, lo que significa que no hubo estimulación (células solo en medio estándar).

Acumulación de IPP

También se evaluó si las LNP administran ZA al compartimento citosólico de las células diana y posteriormente conducen a una acumulación de IPP. Por lo tanto, se sembraron y se incubaron 1x10A6 iCD/ml (medio estándar) como se indica en un rango de dosis de 0.1-125 pm con respecto a la concentración final de ZAen cultivo celular durante la noche, aproximadamente 20 h. Después de la incubación, se recogieron y lavaron las células de las muestras. Para la extracción, se añadieron acetonitrilo helado (300 pl) y agua (200 pl) a los sedimentos celulares secos. Después de 5 a 10 minutos, las muestras se centrifugaron (13.000 x g, 1 min.). Luego los sobrenadantes solubles se transfirieron a tubos nuevos y se secaron en una centrífuga al vacío. Hasta el análisis por espectrometría de masas de las muestras de IPP se almacenaron a -20 °C.

Animales para experimentos in vivo.

Se obtuvieron ratones Balb/c hembra, de 6 - 12 semanas de edad, procedentes de cría interna del Zentrale Versuchtiereinrichtung (ZVTE) de la Universidad Johannes Gutenberg de Mainz y se alojaron en condiciones normales de laboratorio con ciclos circadianos de luz/oscuridad y libre acceso a comida estándar para ratones y agua potable (Aprobación del Comité de Ética para la Experimentación Animal del Consejo Regional (Koblenz/Rheinland-Pfalz, Alemania, G 12-1-081). Se anestesiaron los ratones con isofluorano y se inyectaron retroorbitalmente las soluciones indicadas.

Expresión de ARN analizada mediante imágenes de bioluminiscencia.

La evaluación de la captación y traducción del ARN codificante de luciferasa (Luc) se realizó mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo no invasivas utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, EE. UU.). 6 h después de la inyección de las soluciones indicadas, los ratones recibieron por vía intraperitoneal una solución acuosa de D-luciferina (150mg/kg de peso corporal). 5 minutos después, los fotones emitidos se recogieron durante 1 minuto. La señal de bioluminiscencia medida en las regiones de interés (ROI) se cuantificó y se presentó como imágenes en escala de colores superpuestas a fotografías en escala de grises de ratones utilizando el software Living Image (Caliper Life Sciences). Para las cuantificaciones, la señal de bioluminiscencia recuperada del órgano o tejido respectivo se normalizó restando la luminiscencia de fondo de una región que no emite señales.

Maduración de CD esplénica analizada mediante ensayo FACS

24 h después de la inyección de las soluciones indicadas, se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se extrajeron los bazos. Los esplenocitos se obtuvieron mediante digestión del bazo con colagenasa (1 mg/ml; Roche) durante 5 minutos y posteriormente presionando los bazos a través de un colador de células de nailon de 70 pm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) usando el émbolo de una jeringa de 1 ml. Después de lavar la malla con PBS y una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 1500 rpm, las células se sometieron a lisis de glóbulos rojos (RBC) durante 5 minutos a temperatura ambiente en el que el sedimento se suspendió en tampón hipotónico (KHCO3/NH4 Cl/EDTA). Y después de una etapa de centrifugación adicional, las células se suspendieron en 10 ml de PBS/FCS al 5 %. Las muestras de esplenocitos se incubaron a 4 °C con anticuerpos monoclonales (mAb) marcados con fluoróforo F4-80, CD40, CD86, NK1.1, CD11c, CD8 (todos de BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania) durante 30 minutos, se lavaron con PBS y se suspendieron en 300 pl de PBS/5 % FCS. Los datos citoméricos de flujo de 0.75 * 106 células se adquirieron en un citómetro de flujo analítico FACSCalibur (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star).

Prueba de acumulación de pirofosfato de isopentenilo (IPP)

24 h después de la inyección de las soluciones indicadas, se sacrificaron los ratones y se recogió el tejido indicado (por ejemplo, bazo). Los esplenocitos se prepararon según el protocolo para la medición de la maduración de las CD esplénicas mediante ensayo FACS, sin lisis de glóbulos rojos. Se extrajeron 5 * 106 esplenocitos utilizando acetonitrilo helado (300 pl) y agua (200 pl) que contenía 0.25 nmol/l de NaF y Na3VO4 para evitar la degradación del pirofosfato de isopentenilo (IPP) (5 min). Después de la centrifugación a 13.000 * g durante 1 min, el extracto sobrenadante soluble se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo y se secó en una centrífuga de vacío, luego se almacenó a -20 °C hasta el análisis de IPP por espectrometría de masas (MS).

Análisis de IPP por espectrometría de masas.

Las muestras se disolvieron en hexilamina al 0.28 % (v/v) en metanol al 2 %. Las cantidades molares de IPP en extractos celulares se determinaron mediante un UHPLC Agilent 1290 Infinity con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6490 (tecnología JetStream, ionización por electropulverización de iones negativos). El IPP es un compuesto muy hidrófilo y, por lo tanto, fue necesario el uso de hexilamina como agente de par iónico para retener este compuesto en una columna de fase reversa. La separación por HPLC se realizó utilizando una columna Poroshell 120 EC-C18 (2.1 x 50 mm, 2.7 pm) y un sistema eluyente que consistía en hexilamina al 2.8 % (v/v), ácido acético al 1 % en metanol (1:50 en agua, eluyente A) y acetonitrilo (eluyente B). El caudal fue de 0.4 ml/min y el volumen de inyección de 20 pl. Después de la separación por HPLC, se adquirieron espectros de masas de iones negativos para IPP utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6490 equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) (Agilent Technologies, Colorado, EE. UU.). Se utilizó el monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM) para el análisis de los compuestos en la muestra y la cuantificación se basó en iones de fragmentos característicos. La curva estándar se creó utilizando IPP sintético. Las concentraciones de las muestras se determinaron utilizando las áreas de los picos de los cromatogramas SRM y la curva estándar.

Ejemplo 2: Formación y caracterización de partículas lipídicas que comprenden una sustancia terapéuticamente activa yARN.

Formación y retención de ZA en el coloide.

Se prepararon dispersiones de lípidos coloidales que comprendían ZA mediante el método de inyección de etanol. En este proceso, se deja caer rápidamente una solución de lípidos en etanol en un medio acuoso a través de una aguja, dispersando los fosfolípidos por todo el medio y promoviendo la formación de vesículas. En este ejemplo no limitante, la composición coloide era DOTMA/DOPE en una relación molar de 2 a 1. Se formaron coloides cuando la solución lipídica etanólica se inyectó en la solución ZA en tampón HEPES pH 4. La concentración total de lípidos en la fase acuosa fue 12 mM, mientras que las concentraciones iniciales de ZA fueron 0.4, 1, 2, 3, 4 y 6 mg/ml, respectivamente. Las dispersiones brutas obtenidas se filtraron a través de una membrana CE (éster de celulosa) de 0.45 pm. No se realizó ninguna filtración o extrusión adicional. Posteriormente se dializaron los coloides para eliminar el ZA libre. Como resultado, la cantidad absoluta de ZA retenida aumenta (Fig. 1) al aumentar las concentraciones iniciales de ZA.

En otro experimento (Fig. 2), se varió la concentración de lípidos totales (concentración de DOTMA entre 3, 6 y 12 mM). Aquí, la cantidad absoluta de ZA retenido aumenta al aumentar las concentraciones de DOTMA entre 3, 6 y 12 mM.

Estas formulaciones de lípido coloidal/ZAse usaron sin procesamiento adicional para la formación de lipoplex de ARN. A partir de estas preparaciones, se midió la retención de ZAtras la adición de ARN. Como control negativo y positivo para la retención, también se investigó la adición de PBS y Triton x100. Al añadir el ARN al coloide lipídico que comprende ZA, los lipoplexes retuvieron el ZA en gran medida. La figura 3 indica que la complejación de la dispersión coloidal de ZA con ARN conduce a la retención de la mayoría de ZA; sólo se liberó el 0.23 y 22 % del ZA retenido con respecto a las concentraciones de lípidos totales de 2, 4, y 6 mg/ml, respectivamente. Este hallazgo se confirmó mediante la sustitución del ARN con Triton x100 (como control negativo), lo que condujo a una liberación del 100 % del ZA retenido. Los resultados in vivo, en los que se detectó acumulación de IPP en el riñón y la médula ósea (que muestran que ZA se entregó junto con el lipoplex al compartimento citosólico de las células diana) respaldan estos resultados.

Se utilizaron imágenes de microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM) para visualizar y determinar el tamaño, el grosor y la organización microscópica de las LNP que comprenden ARN y ZA. Entre otras cosas, se investigaron los LNP que se formaban con una relación de carga de lípido catiónico/ARN de 1.3/2, con una fracción de 0.01 mg/ml de ZA. Después de la complejación del ARN con la dispersión coloidal catiónica ZA, la formulación obtenida crea estructuras laminares organizadas como se muestra en la Fig. 4. Se encontró un tamaño total de las LNP en el rango de 200 a 400 nm, donde era discernible una organización laminar interna distinta con alrededor de 2 a 20 laminillas seguidas (analizando un gran número de imágenes). El número medio de laminillas organizadas seguidas fue de entre 5 y 15. Esta estructura laminar puede retener el ARN y la ZA.

Ejemplo 3: Funcionalidad del ARN y la sustancia terapéuticamente activa en partículas lipídicas que comprenden una sustancia terapéuticamente activa y ARN

Expresión de ARN transcrito in vitro (IVT) de luciferasa (Luc) en células dendríticas (CD) después de la incubación con formulaciones de LNP que comprenden ZAy ARN

Se determinó si el ARN que codifica una proteína tal como un antígeno y unido a una dispersión coloidal ZA todavía estaba intacto y podía traducirse en una proteína funcional tal como un antígeno en células dendríticas (CD). El ARN que codifica la enzima luciferasa (Luc) se incubó con una dispersión coloidal ZA. Los LNP resultantes que comprenden ARN de luciferasa y ZA se incubaron con células dendríticas y se evaluó la expresión de luciferasa mediante luminiscencia, lo que indica la tasa metabólica de luciferina como sustrato para luciferasa en recuentos por segundos (cps). Como resultado de la medición de luminiscencia en células dendríticas incubadas con LNP (es decir, ARN de luciferasa (Luc) unido a la dispersión coloidal ZA) o ARN desnudo (es decir, ARN de luciferasa no unido a la dispersión coloidal ZA), solo las células dendríticas incubadas con LNP mostraron una señal luciferasa. La Fig. 5 demuestra la expresión de ARN-IVT de luciferasa en CD después de la incubación con formulaciones de LNP después de la unión del ARN. En ambos casos, la eficacia de la transfección del ARN mejoró significativamente, lo que demuestra que las LNP entregan el ARN integral a las células diana, donde se capta y se traduce en la proteína (aquí luciferasa). Esto indica que las células dendríticas podrían absorber LNP sin destruir el ARN unido a la dispersión coloidal ZAy que las LNP eran lo suficientemente estables como para que la proteína (aquí luciferasa) que codifica el ARN pudiera traducirse. Por tanto, las LNP y, de acuerdo con lo anterior, las partículas de la presente enseñanza, pueden usarse para inducir la traducción de una proteína tal como un antígeno de elección en células dendríticas. Esto indica además que las LNP y, de acuerdo con lo anterior, las partículas de la presente enseñanza, pueden usarse para inmunoterapia, por ejemplo, vacunación tumoral.

Expresión relativa de marcadores de maduración en células dendríticas después de la incubación con formulaciones de LNP.

La influencia de las LNP (es decir, ARN unido a la dispersión coloidal ZA) en la maduración de células dendríticas (CD) in vitro en comparación con un control positivo (cóctel de maduración que contiene IL-4, GM-CSF, IL-1p, TNF-a, IL-6 y PGE-2), ARN desnudo y dispersión coloidal ZA(es decir, ácido zoledrónico (ZA) atrapado en una dispersión coloidal). La expresión relativa de los marcadores de maduración CD83, CD86 y HLA-DR se determinó mediante citometría de flujo para evaluar la maduración de células dendríticas inducida por LNP. Para el análisis de la expresión relativa, la expresión de CD83, CD86 y HLA-DR se normalizó con respecto al control negativo (células en medio estándar). Como resultado, los LNP evocan una expresión claramente mayor de CD83, CD86 y HLA-DR en comparación con el ARN desnudo y la dispersión coloidal ZA. En cuanto a CD86 y HLA-DR, la expresión inducida por LNP fue comparable con el control positivo. El aumento determinado de la expresión relativa inducida por las LNP estuvo entre un factor de 1.5 y 3 para CD83, entre un factor de 2.0 y 3.5 para CD86 y entre un factor de 1.5 y 2.0 para HLA-DR. Esto indica que las LNP inducen la maduración de las células dendríticas y, por tanto, son capaces de modular la respuesta inmunitaria.

En la Fig. 6, se muestra la expresión normalizada de los marcadores de maduración de las CD después de la administración de las LNP que comprenden ZA y ARN juntos en comparación con el coloide que contiene ZA (liposomas de ZA) únicamente y un control positivo. Se muestra la expresión relativa de CD83 (A), CD86 (B) y HLA-DR (C). Los datos de expresión se normalizaron sin control de estimulación. En total, se analizaron cuatro donantes por separado y se muestra el valor medio incluida la DE. En ambos casos se pudo observar la maduración de las CD, ya que todos los marcadores estaban regulados positivamente. Para la formulación con ARN y ZAjuntos, el efecto fue aún más pronunciado.

En la Fig. 7, se proporcionan los resultados de la medición de la expresión relativa de los marcadores de maduración que demuestran que los liposomas que contienen ZA conducen a la maduración de las CD. Las células dendríticas se incubaron durante 24 h y 48 h con LNP en 3 concentraciones diferentes de ZA (0.5, 5 y 50 |jm). Aquí, se muestra la expresión relativa de los marcadores de maduración CD80 (A), CD83 (B), CD86 (C) y HLA-DR (D). La expresión de todos los marcadores de maduración se reguló positivamente en células dendríticas después de la incubación con LNP decoradas con IVT-RNA. En total, se analizaron dos donantes por separado y se muestra el valor medio incluida la DE. Se podría demostrar que ZAy ARN que contienen LNP conducen a una maduración de las CD dependiente de la dosis. Este efecto en las CD fue aún más pronunciado después de 48 h de incubación.

Funcionalidad del ácido zoledrónico (ZA) retenido después del cocultivo de células dendríticas inmaduras (iCD) incubadas con formulaciones de LNP y linfocitos de sangre periférica (PBL)

Para probar si un agente terapéutico retenido todavía era funcional después de la administración, se evaluó la funcionalidad del ácido zoledrónico (ZA) administrado por las LNP En particular, se probó la capacidad del ácido zoledrónico para inducir la expansión de las células T Vy9V62 (Castella, B., Riganti, C., Fiore, F., Pantaleoni, F., Canepari, M. E., Peola, S., Foglietta, M., Palumbo, A., Bosia, A., Coscia, M., Boccadoro, M., Massaia, M. (2011), The Journal of Immunology 187(4), 1578-90). Para investigar la influencia de las LNP en la tasa de expansión de las células Vy9V62, se cultivaron conjuntamente células dendríticas inmaduras cargadas con ácido zoledrónico (ZA) con linfocitos de sangre periférica que contenían células T Vy9V62. Después de siete días de cocultivo, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-TCR-V82 para evaluar la frecuencia de las células Vy9V62 y su expansión mediante citometría de flujo. Los LNP (es decir, ARN unido a la dispersión coloidal de ZA, dispersión coloidal de ZA (es decir, ZA atrapado en una dispersión coloidal) y ácido zoledrónico libre (ZA) provocan un aumento del porcentaje de células T Vy962 en comparación con el control negativo (sin ácido zoledrónico (ZA)) Para el análisis, la tasa de expansión de las células T Vy962 se determinó dividiendo la cantidad total de células T Vy962 antes del período de cultivo de siete días por la cantidad total de células T Vy962 después del período de cultivo de siete días. El tratamiento con LNP resultó en una tasa de expansión de las células T Vy962 de aproximadamente 60 veces, el tratamiento con dispersión coloidal ZA dio como resultado una tasa de expansión de las células T Vy962 de aproximadamente 40 veces y el tratamiento con ácido zoledrónico libre (ZA) dio como resultado una tasa de expansión de células T Vy962 de aproximadamente 15 veces. Por lo tanto, la expansión inducida por LNP de las células T Vy962 es altamente eficiente e indica una alta funcionalidad del ácido zoledrónico retenido y buenas propiedades de administración del ácido zoledrónico.

Ejemplo 4: Funcionalidad in vivo de partículas lipídicas que comprenden una sustancia terapéuticamente activa y ARN.

Aplicación de LNP da como resultado la expresión de luciferasa (Luc) en el bazo

Para la validación de los resultados in vitro in vivo, se inyectaron LNP que contenían ARN codificante de luciferasa (Luc) (correspondiente a 20 jg de ARN/ratón) en ratones Balb/c. La traducción del ARN de luciferasa (Luc) en las LNP se detectó en presencia de luciferina mediante imágenes de bioluminiscencia. La aplicación de LNP (es decir, ARN de luciferasa (Luc) unido a la dispersión coloidal ZA) dio como resultado la expresión de luciferasa en el bazo. La inyección de LNP (es decir, ARN de luciferasa (Luc) unido a la dispersión coloidal ZA) indujo una señal de luminiscencia significativamente mayor que la inyección de ARN de luciferasa (Luc) desnudo. Esto indica que el ácido zoledrónico (ZA) atrapado no influye negativamente en la captación y traducción del ARN in vivo. Más bien mejora la expresión de proteínas como el antígeno que codifica el ARN.

La aplicación de LNP da como resultado una regulación positiva de la expresión de CD40 y CD86 en células dendríticas esplénicas (CD) y en la población de células de macrófagos (mO)

Para probar si la inyección de LNP da como resultado la maduración de células dendríticas esplénicas y macrófagos in vivo, se prepararon esplenocitos de ratones tratados con LNP Posteriormente, se midió mediante citometría de flujo la cantidad de expresión superficial de los marcadores de maduración CD40 y CD86 en células dendríticas y macrófagos. Un aumento de la señal de CD40 y CD86 en comparación con el control negativo (sin tratamiento) solo se detectó en células dendríticas y en la población de células de macrófagos en presencia de ARN de luciferasa (Luc) o hemaglutinina A de influenza (InfHA) unido a la dispersión coloidal de ácido zoledrónico. (LNP Luc-RNAo LNP infHA-RNA) yARN de luciferasa (Luc) o hemaglutinina A de la influenza (InfHA) unido a una dispersión coloidal (es decir, sin ZA) (dispersión coloidal vacía Luc-RNA o dispersión coloidal vacía InfHA- ARN). Por el contrario, no se detectó un aumento de la señal de CD40 y CD86 en comparación con el control negativo (sin tratamiento) en las células dendríticas y en la población de células de macrófagos en presencia de dispersión coloidal ZA, dispersión coloidal vacía o ARN libres (libre Luc-RNA o InfHA-RNA libre). Estos resultados indican que el tratamiento con LNP (es decir, ARN unido a la dispersión coloidal ZA) induce la maduración de células dendríticas y macrófagos in vivo. Dado que el ARN que codifica la luciferasa (Luc-RNA), así como el ARN que codifica la hemaglutinina A de la influenza (InfHA-RNA), inducen la maduración de células dendríticas y macrófagos, la inducción de la maduración parece ser independiente de la proteína codificada. Por lo tanto, cualquier ARN puede unirse a la dispersión coloidal para inducir la maduración de células dendríticas esplénicas y macrófagos. Esto proporciona un método útil para inducir en general la maduración de células dendríticas y macrófagos esplénicos, así como para introducir un antígeno en células dendríticas y macrófagos esplénicos que es específicamente útil para vacunación u otros enfoques inmunoterapéuticos.

El ácido zoledrónico conduce a la acumulación de pirofosfato de isopentenilo (IPP) en el bazo. Después de haber demostrado que el ARN proporcionado por las LNP es funcionalmente activo, se probó in vivo la función del ácido zoledrónico retenido en las LNP. Se ha demostrado que el ácido zoledrónico induce la acumulación de pirofosfato de isopentenilo (IPP) en varias estirpes celulares in vitro y en tejido tumoral in vivo y podría estar directamente relacionado con un mejor resultado clínico del cáncer de diferente origen. (Mitrofan, L.M., Pelkonen, J., Monkkonen, J., (2009), Bone, 45, 1153-60). Por lo tanto, se investigó la acumulación de IPP en el bazo después de la inyección de las formulaciones de LNP mediante espectrometría de masas. El tratamiento con dispersión coloidal de ácido zoledrónico (ZA) y ARN de luciferasa (Luc) unido a dispersión coloidal de ZA (Luc-RNA lNp ) dio como resultado un aumento significativo de la concentración de IPP en el bazo en comparación con el control negativo (sin tratamiento), luciferasa libre. (Luc) ARN (ARN libre), dispersión coloidal vacía y dispersión coloidal vacía unida al ARN codificante de luciferasa (Luc). Esto indica que el ácido zoledrónico liberado por las LNP sigue siendo funcional después de su administración in vivo. Por lo tanto, los datos in vivo confirmaron los resultados de los datos in vitro, lo que indica que el ARN unido a partículas de dispersión coloidal ZAse puede utilizar para la administración de fármacos. En resumen, el ARN unido a la dispersión coloidal ZAes útil para la introducción de proteínas tales como el ARN que codifica antígenos, así como para la administración de fármacos con el fin de inducir/modular la respuesta inmunitaria en un individuo.

Ejemplo 5: Preparación de dispersiones lipídicas coloidales que comprenden ZA mediante técnica de inyección de etanol y procesamiento adicional.

Ejemplo 5.1

Se adquirieron 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) de Avanti Polar Lipids (Alabastro, AL). El colesterol (pureza del 99 %) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). El ácido zoledrónico se obtuvo de CHEMOS GmbH (Regenstauf, Alemania). La solución salina tampón fosfato libre de ARNasas se adquirió de Ambion (Darmstadt, Alemania). El agua libre de ARNasa se adquirió de B-Braun (Melsungen, Alemania). Todos los reactivos eran de grado analítico. Los coloides se prepararon mediante una técnica de inyección de etanol modificada de acuerdo con el siguiente protocolo:

• En un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml, se añadieron 0.25 ml de la solución acuosa de ácido zoledrónico 20 mg/ml en tampón PBS pH 7.4 a 1.25 ml de la solución acuosa de sacarosa al 10 %.

• El vaso de precipitados se colocó en un agitador magnético y la solución se agitó a 400 rpm usando un agitador modelo de calamar grande IKA(IKA, Konigswinter Alemania).

• Se inyectaron 0.600 ml de una solución lipídica en etanol (DOTMA/DOPE; relación molar 2:1 y concentración total de lípidos 200 y 100 para DOTMAy DOPE, respectivamente) mediante una jeringa (tipo de jeringa: Omnifix®-F Jeringa de plástico estéril de 1 ml), B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

Después de 10 minutos, se añadieron al coloide 3 ml de agua libre de ARNasa. La dispersión de lípidos y ZAse agitó durante 20 minutos.

Ejemplo 5.2

Se adquirieron 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). El colesterol (pureza del 99 %) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). El ácido zoledrónico se obtuvo de CHEMOS GmbH (Regenstauf, Alemania). La solución salina tampón fosfato libre de ARNasas y el tampón hepes se adquirieron de Ambion (Darmstadt, Alemania). El agua libre de ARNasa se adquirió de B-Braun (Melsungen, Alemania). Todos los reactivos eran de grado analítico. Los coloides se prepararon mediante una técnica de inyección de etanol modificada de acuerdo con el siguiente protocolo: •

• Se transfirieron 1.5 ml de la solución acuosa de ácido zoledrónico (0.5, 1, 2.0, 4, 8, 10.0, 20 mg/ml) en tampón HEPES 100 mM, pH 4.0 a un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. El vaso de precipitados se colocó en un agitador magnético y la solución se agitó a 400 rpm usando un agitador modelo de calamar grande IKA(IKA, Konigswinter Alemania).

• Se diluyeron adicionalmente 0.500 ml de una solución lipídica en etanol (DOTAP/DOPE; relación molar 2:1 y concentración total de lípidos 180 y 90 mM para DOTAP y DOPE, respectivamente) con etanol absoluto hasta 0.600 ml (200 y 100 mM para DOTAP y DOPE, respectivamente) y se inyectan con una jeringa (tipo jeringa: Omnifix® F jeringa de plástico estéril de 1 ml, B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

Ejemplo 5.3

Se adquirieron 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). El colesterol (pureza del 99 %) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). El ácido zoledrónico se obtuvo de CHEMOS GmbH (Regenstauf, Alemania). La solución salina tampón fosfato libre de ARNasas y el tampón hepes se adquirieron de Ambion (Darmstadt, Alemania). El agua libre de ARNasa se adquirió de B-Braun (Melsungen, Alemania). Todos los reactivos eran de grado analítico. Los coloides se prepararon mediante una técnica de inyección de etanol modificada de acuerdo con el siguiente protocolo:

• Se diluyeron adicionalmente 0.500 ml de una solución lipídica en etanol (DOEPC/DOPC; relación molar 2:1 y concentración total de lípidos 200 y 100 mM para DOEPC y DOPC, respectivamente) con etanol absoluto hasta 0.600 ml (200 y 100 mM para DOEPC y DOPC, respectivamente) y se inyectan con una jeringa (tipo jeringa: Omnifix®-F jeringa de plástico estéril de 1 ml, B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

Ejemplo 6: Preparación de dispersiones lipídicas coloidales que comprenden ZA mediante técnica de inyección de etanol y procesamiento adicional

Ejemplo 6.1

• Se mezclaron 0.5 ml de la solución acuosa de ácido zoledrónico 20 mg/ml en tampón HEPES 100 mM, pH 4.0. con 1 ml de tampón HEPES 100 mM, pH 7.0 y se transfirieron a un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. El vaso de precipitados se colocó en un agitador magnético y la solución se agitó a 400 rpm usando un agitador modelo de calamar grande IKA(IKA, Konigswinter Alemania).

• Se inyectaron 0.492 ml de una solución lipídica en etanol (DOTMA/DOPE; relación molar 1:1 y concentración total de lípidos 135 y 135 mM para DOTMA y DOP<e>, respectivamente) mediante una jeringa (tipo jeringa: Omnifix®-F 1 ml de plástico estéril) jeringa, B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

Filtración del coloide

La dispersión bruta obtenida de la dispersión coloidal se pasó a través de una membrana CE Minisart de 0.45 pm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemania).

Diálisis del coloide

• Cada 1 ml del coloide se dializó frente a 200 ml de PBS utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer 10K sin ARNasa (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Alemania). •

Retención de ácido zoledrónico (ZA) en el coloide

Se cuantificó el ácido zoledrónico retenido mediante HPLC. El sistema HPLC constaba de una bomba cuaternaria G1311B, un detector DAD (detector de matriz de diodos) G4212B, un muestreador automático AS Hip G1367E, un termostato de horno de columna G1330B y una ChemStation para LC revisión B.04.02 (Agilent technologies, Colorado, EE. UU.). La fase estacionaria fue la columna xSelect CSH (C18) (150 mm * 4.6 mm * 3.5 pm) (Waters, Eschborn, Alemania). La fase móvil era una mezcla de metanol (20 %) y tampón fosfato 30 mM (80 %) que contenía bromuro de tetrabutilamonio 5 mM (TCI Deutschland GmbH, Eschborn, Alemania) ajustado a pH 7.2. Para la determinación del pH de la fase móvil se utilizó un medidor de pH inoLab pH 7310P (WTW, Weilheim, Alemania). El caudal y la temperatura del horno de columna fueron 1 ml/min y 50 °C. La longitud de onda de detección fue de 215 nm. El volumen de inyección ascendió a 25 pl. El ácido zoledrónico libre se determinó usando Ultracel de alta recuperación con una membrana de celulosa regenerada y MWCO de 30 KD (Millipore, Schwalbach/Ts., Alemania) y usando las siguientes etapas:

• Transferir 500 pl de la muestra de coloide a tubos Ultracel de 0.5 ml.

Cálculo del % de eficiencia de retención

% de eficiencia de retención = [(ZAtotal en coloide dializado - ZA libre en coloide dializado/ZAtotal en coloide dializado] x 100.

Formación de LNP que comprenden ZAy ARN

De acuerdo con la relación requerida de lípido catiónico/ARN (mol/base), el volumen calculado de ZA/coloide lipídico se añadió al volumen calculado deARN/PBS. La mezcla se incubó durante al menos 15 minutos para formar<l>N<p>

Retención de ZA en LNP que comprenden ácido zoledrónico y ARN

Se mezclaron dispersiones lipídicas coloidales que comprendían ZAcon diferentes fracciones molares de lípido con PBS como control, ARN y Triton x100. La composición lipídica fue DOTMA/DOPE en una relación molar 2/1. Se prepararon dispersiones de ZA/lípidos mezclando un volumen calculado de dispersiones de lípidos que comprendían ZA con el volumen calculado de ARN en tres concentraciones de lípidos diferentes: 2, 4, y 6 mM. Las dispersiones de ZA/lípidos y ARN se mezclaron en una proporción de 1:1 (v/v). La relación de carga de lípido catiónico/ARN (mol/base) fue de 1:2. Para PBS y Tritonx100, el volumen de ARN calculado se reemplazó por PBS fisiológico o solución acuosa de Triton x100 al 10 %. Los LNP que comprenden ZAyARN se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se transfirieron a tubos Ultracel de 0.5 ml previamente limpios de conservantes mediante filtración de solución de NaOH 0.1 M seguida de PBS a través de la membrana. Las muestras se centrifugaron a 4000 xg utilizando una centrífuga con rotor de ángulo fijo de 40° Pico 21 (Thermoscientific, Osterode, Alemania) a temperatura ambiente durante 15 minutos. El filtrado se recogió en un vial de vidrio de HPLC para su cuantificación. Medición de la concentración de ácido zoledrónico en el filtrado mediante HPLC como se mencionó anteriormente.

Ejemplo 6.2

• Se mezclaron 0.5 ml de la solución acuosa de ácido zoledrónico 20 mg/ml en tampón HEPES 100 mM, pH 4.0, con 1 ml de tampón HEPES 100 mM, pH 7.0 y se transfirieron a un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. El vaso de precipitados se colocó en un agitador magnético y la solución se agitó a 400 rpm usando un agitador modelo de calamar grande IKA(IKA, Konigswinter Alemania).

• Se inyectaron 0.492 ml de una solución lipídica en etanol (DOTAP/DOPE; relación molar 2:1 y concentración total de lípidos 180 y 90 mM para DOTAP y DOPE, respectivamente) mediante una jeringa (tipo jeringa: jeringa Omnifix®-F 1 ml de plástico estéril), B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

Filtración del coloide

La dispersión bruta obtenida de la dispersión coloidal se pasó a través de una membrana CE Minisart de 0.45 |jm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemania).

Diálisis del coloide

Retención de ácido zoledrónico (ZA) en el coloide

Se cuantificó el ácido zoledrónico retenido mediante HPLC. El sistema HPLC constaba de una bomba cuaternaria G1311B, un detector DAD (detector de matriz de diodos) G4212B, un muestreador automático AS Hip G1367E, un termostato de horno de columna G1330B y una ChemStation para LC revisión B.04.02 (Agilent technologies, Colorado, EE. UU.). La fase estacionaria fue la columna xSelect CSH (C18) (150 mm * 4.6 mm * 3.5 jm ) (Waters, Eschborn, Alemania). La fase móvil era una mezcla de metanol (20 %) y tampón fosfato 30 mM (80 %) que contenía bromuro de tetrabutilamonio 5 mM (TCI Deutschland GmbH, Eschborn, Alemania) ajustado a pH 7.2. Para la determinación del pH de la fase móvil se utilizó un medidor de pH inoLab pH 7310P (WTW, Weilheim, Alemania). El caudal y la temperatura del horno de columna fueron 1 ml/min y 50 °C. La longitud de onda de detección fue de 215 nm. El volumen de inyección ascendió a 25 μl. El ácido zoledrónico libre se determinó usando Ultracel de alta recuperación con una membrana de celulosa regenerada y MWCO de 30 KD (Millipore, Schwalbach/Ts., Alemania) y usando los siguientes pasos:

• Transferir 500 μl de la muestra de coloide a tubos Ultracel de 0.5 ml.

Cálculo del % de eficiencia de retención

Formación de LNP que comprenden ZAy ARN.

La dispersión lipídica coloidal se preparó mediante la técnica de inyección de etanol como se describió anteriormente. La composición lipídica fue DOTMA/DOPE en una proporción molar de 2/1. Se disolvió ZA en tampón HEPES 100 mM a una concentración de 20 mg/ml y se ajustó el pH a 4 aproximadamente con NaOH 5 M. La concentración de lípidos fue de aprox. 12 mM. El ácido zoledrónico retenido y libre se cuantificó mediante HPLC. El ácido zoledrónico libre se determinó utilizando Ultracel de alta recuperación con membrana de celulosa regenerada y MWCO de 30 KD. Las muestras se centrifugaron a 4000 xg usando una centrífuga de rotor de ángulo fijo de 40° Pico 21 a temperatura ambiente durante 15 minutos. El filtrado se recogió en un vial de HPLC para su cuantificación.

Retención de ZA en LNP que comprenden ácido zoledrónico y ARN

Ejemplo 6.3

Se adquirieron 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) deAvanti Polar Lipids (Alabaster, AL). El colesterol (pureza del 99 %) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). El ácido zoledrónico se obtuvo de CHEMOS GmbH (Regenstauf, Alemania). La solución salina tampón fosfato libre de ARNasas y el tampón hepes se adquirieron de Ambion (Darmstadt, Alemania). El agua libre de ARNasa se adquirió de B-Braun (Melsungen, Alemania). Todos los reactivos eran de grado analítico. Los coloides se prepararon mediante una técnica de inyección de etanol modificada de acuerdo con el siguiente protocolo:

• Se inyectaron 0.492 ml de una solución lipídica en etanol (DOEPC/DOPC; relación molar 2:1 y concentración total de lípidos 180 y 90 mM para DOEPC y DOPC, respectivamente) mediante una jeringa (tipo jeringa: jeringa Omnifix®-F 1 ml de plástico estéril), B. Braun; Melsungen, Alemania, aguja: aguja fina con tamaño 27G) en la solución de ácido zoledrónico con agitación.

Abreviaturas

ZA = ácido zoledrónico

LNP = nanopartículas lipídicas

Luc = Luciferasa

infHA = hemaglutinina A de la gripe

IPP = Pirofosfato de isopentenilo

DOTMA= 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano

DOPE = 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

DOTAP = 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano

DOEPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina

i.v. = intravenoso

CD = célula dendrítica

iCD = célula dendrítica inmadura

PBMC = células mononucleares de sangre periférica

PBL = linfocitos de sangre periférica

mO = macrófago

Cntr = control

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una partícula lipídica que comprende:

(i) al menos un lípido catiónico y/o sensible al pH,

2. La partícula de la reivindicación 1, en la que el bifosfonato que estimula las células T γδ estimula las células T Vy9V82.

3. La partícula de la reivindicación 2, en la que el bifosfonato que estimula las células T γδ es un bifosfonato que contiene nitrógeno (aminobisfosfonato) o se selecciona del grupo que consiste en ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico y sales de los mismos.

4. La partícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos un lípido auxiliar, preferiblemente un lípido neutro o un lípido cargado negativamente.

5. La partícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMEPC), 1,2-di-O-octadecenil-3- propano de trimetilamonio (DOTM<a>) y/o propano de 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio (DOTAP).

6. La partícula de la reivindicación 4 o 5, en la que al menos un lípido auxiliar comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-snglicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3fosfocolina (POPC) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

7. La partícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se puede obtener mediante la adición del ARN a una dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua.

8. La partícula de la reivindicación 7, en la que la dispersión lipídica coloidal que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua se puede obtener mediante inyección de una solución de etanol de los lípidos en una fase acuosa que comprende al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua.

9. Una composición farmacéutica que comprende partículas como se establece en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso terapéutico, en la que la composición comprende preferiblemente uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

10. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 9, en la que el uso comprende administración parenteral, preferiblemente mediante administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica o administración intraarterial.

11. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 9 o 10, en la que la composición comprende además al menos un adyuvante.

12. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria contra el cáncer.

13. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para uso en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que implica un antígeno, preferiblemente una enfermedad cancerosa.

14. Un método para producir una partícula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende las siguientes etapas de:

15. El método de la reivindicación 14, en el que la dispersión de lípidos coloidales que comprende al menos un lípido catiónico y al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua se proporciona mediante inyección de una solución de lípidos en etanol en una fase acuosa que comprende al menos un compuesto terapéuticamente eficaz soluble en agua, en el que el número de cargas positivas derivadas de los lípidos catiónicos dividido por el número de cargas negativas derivadas del ARN está preferiblemente entre 0.025 y 4.