ES2974905T3

ES2974905T3 - Composiciones, kits y métodos para inducir citorresistencia adquirida mediante el uso de inductores de proteínas de estrés

Info

Publication number: ES2974905T3
Application number: ES15846121T
Authority: ES
Inventors: Richard Zager; Ali Cm Johnson
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2024-07-02
Anticipated expiration: 2035-09-28
Also published as: JP2017535522A; BR112017006531B1; CN107072190A; SI3200582T1; JP2021130710A; US20160271164A1; SG10201902831UA; IL287607B; EP3200582A2; CA2963089C; JP7549640B2; IL251455B; US20210275567A1; US10912793B2; MX2017004148A; US10639321B2; BR112017006531A2; US12083145B2; EP3200582B1; LT3200582T

Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones, kits y métodos para proteger órganos induciendo citorresistencia adquirida sin causar daño al órgano. Las composiciones, kits y métodos utilizan proteínas hemo, hierro y/o vitamina B12 y, opcionalmente, agentes que afectan el metabolismo de la proteína hemo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones, kits y métodos para inducir citorresistencia adquirida mediante el uso de inductores de proteínas de estrés

Campo de la descripción

La presente descripción proporciona composiciones y kits para su uso en métodos para proteger a los órganos mediante la inducción de una citorresistencia adquirida sin causar lesiones en el órgano.

Antecedentes de la descripción

La lesión a un órgano corporal puede provocar respuestas protectoras por parte del órgano de manera que pueda protegerse mejor en caso de que los eventos nocivos (es decir, los traumatismos) continúen o reaparezcan. Por ejemplo, un episodio de lesión renal puede provocar respuestas protectoras que, después de un lapso de 18 horas, protegen al riñón contra las formas posteriores y más graves de daño renal. Esta protección puede durar un período de tiempo prolongado (días a semanas). Este fenómeno protector es conocido en la técnica como “ preacondicionamiento isquémico” o “citorresistencia adquirida” .

Un concepto ha sido el uso del fenómeno de citorresistencia adquirida para proteger a los órganos de manera preventiva, especialmente cuando un traumatismo conocido es inminente. Por ejemplo, el fenómeno podría inducirse para proteger los órganos antes de un traumatismo, tal como exposición a la cirugía, la derivación cardiopulmonar o administraciones de toxicidad por radiocontraste. Este enfoque no se ha aplicado en el uso clínico, sin embargo, debido a que no ha habido un mecanismo para inducir la citorresistencia adquirida de una manera controlada sin causar una lesión inaceptable al órgano que debe protegerse.

El documento CN 103-355-655 describe una composición farmacéutica con una función de mejora de la anemia alimentaria y un método de preparación de la composición.

E. A. JANKOWSKI Y COL. “ Iron deficiency and heart failure: diagnostic dilemmas and therapeutic perspectives” , EUROPEAN HEART JOURNAL, vol. 34, n.° 11, 25 de octubre de 2021, páginas 816-829, analiza la deficiencia de hierro que constituye una comorbilidad frecuente en pacientes con insuficiencia cardíaca.

El documento US 2006/166360 describe un método para reducir el material de almacenamiento de lípidos intracelular de una célula, tejido u órgano para trasplante y presenta soluciones.

El documento US 2004/258745 describe una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno artificial, que tiene una alta eficacia de transporte de oxígeno; una presión osmótica coloidal requerida, una presión osmótica cristaloide, pH y equilibrio de electrolitos apropiados.

Resumen de la descripción

La invención se define por las reivindicaciones, que indican:

1. Un kit para su uso en un método para proteger un órgano de un paciente humano contra lesiones basadas en un traumatismo programado que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de (i) hierro sacarosa, y (ii) uno de Cr-protoporfirina, Sn-protoporfirina, o Zn-protoporfirina.

2. Una composición para su uso en un método para proteger un órgano de un paciente humano contra lesiones basadas en un traumatismo programado que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de (i) hierro sacarosa, y (ii) Sn-protoporfirina.

3. Un kit o composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en donde el método comprende administrar el kit o la composición al paciente al menos 2 horas o al menos 4 horas antes de que se produzca el traumatismo programado, en donde el traumatismo programado resulta ser consecuencia de una cirugía, una quimioterapia o una toxicidad por radiocontraste.

4. Un kit o composición para su uso de la reivindicación 3, en donde el traumatismo programado resulta ser consecuencia de una toxicidad por radiocontraste.

5. Un kit o composición para su uso de la reivindicación 3, en donde el traumatismo programado resulta ser consecuencia de una quimioterapia.

6. Un kit o composición para su uso de la reivindicación 3, en donde el traumatismo programado resulta ser consecuencia de una cirugía.

7. Un kit o composición para su uso de la reivindicación 6, en donde el traumatismo programado resulta ser consecuencia de una cirugía de trasplante de órganos.

8. Un kit o composición para su uso de la reivindicación 7, en donde el órgano es un corazón, riñón, hígado o pulmón.

La presente descripción proporciona composiciones y kits para su uso en métodos que permiten la inducción de la citorresistencia adquirida sin causar lesiones en el órgano. Debido a que la citorresistencia adquirida puede inducirse sin causar lesiones en el órgano, el fenómeno puede usarse en un entorno clínico para proteger a los órganos de manera preventiva, especialmente cuando se acerca un traumatismo conocido.

Sin quedar limitado por teoría alguna, las composiciones y kits para su uso en métodos inducen citorresistencia adquirida mediante la regulación por aumento de la expresión de proteínas de estrés protectoras. Las realizaciones particulares inducen citorresistencia adquirida a través de la administración de hierro sacarosa y de Sn- Cr- o Znprotoporfirina en cierto nivel, o con un enfoque, de manera que el hierro sacarosa y Sn-, Cr- o Zn-protoporfirina no causen lesiones en el órgano que debe protegerse.

Los enfoques que inducen citorresistencia adquirida sin causar lesiones incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de hierro sacarosa y de Sn-, Cr- o Zn-protoporfirina.

Una forma ilustrativa de hierro incluye hierro sacarosa. Los inhibidores de degradación de hemoproteínas ilustrativos incluyen protoporfirinas metálicas. Las composiciones ilustrativas incluyen depósitos de liberación lenta. Las vías de administración ilustrativas incluyen inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular. Los métodos ilustrativos para reducir la toxicidad incluyen la administración con manitol, glicina y solución salina. Ejemplos, realizaciones y combinaciones adicionales se proporcionan en la Descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Las FIG. 1A y 1B muestran la expresión de ARNm (FIG. 1A) y la expresión de proteína (FIG. 1B) de hemo oxigenasa después de la administración de vehículo (control), mioglobina (Mgb) o mioglobina en combinación con Snprotoporfirina (SnPP; Mgb SnPP) 18 horas antes del traumatismo con glicerol. Esta FIG. demuestra que la administración de mioglobina sola induce la molécula de la molécula citoprotectora representativa hemo oxigenasa 1 (HO-1), y que la combinación de HO-1 más un inhibidor transitorio de hemo oxigenasa (SnPP) aumenta drásticamente los aumentos de ARNm y de proteína HO-1 inducidos por mioglobina.

Los paneles izquierdos de la FIG. 2 muestran daño renal celular después de la insuficiencia renal aguda inducida por glicerol. Mientras que la lesión grave se observa en ausencia de preacondicionamiento (necrosis extensa, parte superior izquierda; formación de cilindros grave, parte inferior izquierda), el tratamiento previo con mioglobina SnPP 18 h antes de la inyección de glicerol dio como resultado una histología renal esencialmente normal (paneles derechos superior e inferior).

La FIG. 3 muestra que N-Mgb SnPP eleva el ARNm para la proteína de estrés protectora, interleucina-10 (IL-10). La FIG. 4 muestra que N-Mgb SnPP eleva los niveles de ARNm (izquierda) y proteína (derecha) de haptoglobina. La FIG. 5 muestra la evaluación del impacto de unión de nitrito equimolar a Fe de mioglobina en la expresión de la toxicidad de mioglobina. Las células HK-2 (una línea celular de los túbulos proximales derivada de riñón humano normal) se incubaron en medio libre de suero de queratinocitos en condiciones normales (control) o en presencia de 10 mg/ml de mioglobina de músculo esquelético de caballo o mioglobina nitrada (producida por adición de nitrito Na equimolar a 10 mg/ml de mioglobina). Después de 18 horas de incubación, se evaluó la gravedad de la lesión celular (% de muerte celular) mediante el ensayo de MTT. La mioglobina indujo el 40 % de muerte celular (disminución del 40 % en la absorción celular de MTT), en comparación con las células incubadas de control. La unión de nitrito a mioglobina redujo la muerte celular en un 75 %. Por lo tanto, la unión de nitrito es capaz de reducir los efectos citotóxicos de la mioglobina.

La FIG. 6 muestra la relación dosis-respuesta entre la hemo oxigenasa 1 (HO-1) en plasma y la dosis de N-mioglobina administrada. A los ratones normales se les inyectó por vía intramuscular (IM) 0, 1, 2 o 5 mg/Kg de mioglobina nitrada SnPP (dosis constante de 1 pmol). Dieciocho horas después, se evaluaron los niveles de HO-1 en plasma mediante ELISA. Se observó una relación de dosis-respuesta pronunciada entre la dosis de N-mioglobina administrada y los niveles de HO-1 en plasma. Por lo tanto, el ensayo de HO-1 tiene una posible utilidad biomarcadora para la inducción de HO-1 inducida por N-Mgb/SnPP.

La FIG. 7 muestra el mantenimiento de los niveles de creatinina en suero normales en una variación de 25 veces en la dosis de N-mioglobina. Los ratones se sometieron a una infusión subcutánea durante 2 horas de 1, 3, 6, 12 o 25 mg/Kg de mioglobina nitrada (que contenía SnPP a una dosis constante de 1 pmol). Dieciocho horas después, se evaluó la posible lesión renal midiendo las concentraciones de creatinina en suero. No se observó un aumento significativo en ninguna de las dosis de N-Mgb, lo que indica una falta de sobretoxicidad (n, 2-4 ratones/grupo). La FIG. 8 muestra la histología renal 18 horas después de la administración de N-Mgb-SnPP. Los 2 paneles superiores son secciones de riñón teñidas con PAS de un ratón de control (C) y un ratón 18 horas después del tratamiento (Rx) con N-Mgb-SnPP. El epitelio tubular de los ratones tratados mantiene un aspecto histológico normal con unas microvellosidades completamente intactas (tinción oscura de la membrana luminal). Los 2 paneles inferiores representan secciones teñidas con hematoxilina y eosina. No es evidente una lesión histológica con pretratamiento con N-Mgb-SnPP.

La FIG. 9 muestra la inducción sinérgica de HO-1 con un tratamiento con N-Mgb-SnPP de ratones normales. El panel izquierdo representa niveles de ARNm de HO-1 4 horas después del tratamiento. Mientras que la N-Mgb sola y la SnPP indujeron aumentos de ARNm escasos, se observa un aumento de ARNm de HO-1 de 20 veces con la administración de los agentes combinados. A las 18 horas después de la administración, se observó un aumento sinérgico de la proteína HO-1 (valores de P vs. controles). GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; HO-1, hemo oxigenasa 1; ARNm, ARN mensajero; N-Mgb, mioglobina nitrada; SnPP, estaño protoporfirina.

La FIG. 10 muestra la inducción sinérgica de IL-10 con un tratamiento con N-Mgb-SnPP de ratones normales. El panel izquierdo representa los niveles de ARNm de IL-10 a las 4 horas después del tratamiento. N-Mgb sola y SnPP sola provocaron aumentos mínimos o nulos de ARNm de IL-10. Sin embargo, con la administración combinada, se observó un aumento de ARNm de IL-10 de 10 veces. Como se muestra en el panel derecho, solo el tratamiento combinado indujo aumentos de la proteína de IL-10 según lo evaluado en el punto de tiempo de 18 horas (valores de P vs. controles).

La FIG. 11 muestra la expresión de ARNm y de proteína haptoglobina después de la administración de N-Mgb-SnPP a ratones normales. La N-Mgb 1 SnPP combinadas provocaron aumentos mucho mayores de ARNm de haptoglobina a las 4 horas después de la inyección de lo que provocó cualquiera de los agentes solos. Sin embargo, a las 18 horas después de la administración del agente, N-Mgb sola y N-Mgb SnPP indujeron aumentos de la proteína haptoglobina comparables. Esto sugiere que N-Mgb explica los aumentos de haptoglobina producidos mediante la administración combinada de N-Mgb SnPP. (Valores de P vs. controles).

La FIG. 12 muestra grados de protección inducidos por agentes de prueba en el modelo de AKI inducida por rabdomiólisis con glicerol. Los ratones de control (C) desarrollaron AKI marcada como se indica por las concentraciones de BUN y creatinina. SnPP no confirió una protección significativa, mientras que N-Mgb indujo un efecto protector leve. Por el contrario, la administración combinada de N-Mgb-SnPP confirió una protección funcional completa según se midió por los niveles normales de BUN y creatinina a las 18 horas después de la administración de glicerol (los niveles normales se representan por la línea horizontal sólida).

La FIG. 13 muestra que un tratamiento (Rx) combinado con N-Mgb 1 SnPP confiere una protección marcada contra el modelo de AKI con maleato. La inyección de maleato provocó aumentos marcados de BUN y creatinina. El tratamiento (Rx) confirió un efecto protector casi completo (las líneas horizontales representan concentraciones normales de BUN y creatinina). Valor de P vs. sin tratamiento (sin Rx).

La FIG. 14 muestra que la cardiotoxicidad inducida por maleato se reduce mediante un pretratamiento con N-Mgb SnPP. Los ratones se trataron con una inyección de 1 mg/Kg de N-mioglobina 1 pmol de SnPP o vehículo IV). Dieciocho horas después, se les administró IP 800 mg/Kg de maleato. El grado de lesión miocárdica se determinó 18 horas después de la inyección de maleato midiendo las concentraciones de troponina I en plasma (por ELISA). La inyección de maleato causó un aumento de 10 veces en los niveles de troponina en plasma. El pretratamiento con N-Mgb+SnPP redujo el aumento de troponina inducido por maleato en un 75 %.

La FIG. 15 muestra que el tratamiento (Rx) con N-Mgb SnPP confiere protección contra una enfermedad renal progresiva inducida por isquemia-reperfusión (I/R) unilateral. Los ratones se sometieron a 30 minutos de isquemia renal izquierda con o sin pretratamiento con N-Mgb-SnPP 18 horas antes. A las 2 semanas posteriores a la isquemia, la I/R produjo una reducción del 38 % en la masa renal (medido según el peso del riñón). El pretratamiento (Rx) confirió una protección significativa según se mide por una reducción de solamente el 12 % en la masa renal. La protección también estuvo implicada por reducciones marcadas en los niveles de ARNm y proteína NGAL en los riñones izquierdos 2 semanas después de la isquemia.

La FIG. 16 muestra una relación de dosis-respuesta entre dosis crecientes de N-Mgb (con una dosis fija de SnPP, 1 umol) y niveles de proteína HO-1/haptoglobina en la corteza renal y el plasma. El aumento de las dosis de N-Mgb administradas por vía intraperitoneal produjo el aumento de los niveles de cada proteína en plasma y corteza renal. Los coeficientes de correlación para las concentraciones de plasma vs. renal fueron de 0,57 y 0,82 para HO-1 y haptoglobina, respectivamente. Las correlaciones entre la dosis administrada y los niveles de proteína plasmática fueron r = 0,85 y r = 0,75 para HO-1 y haptoglobina, respectivamente.

La FIG. 17 muestra una relación dosis-respuesta entre la dosis IP administrada de N-Mgb vs. las concentraciones de BUN/creatinina a las 18 horas después de la administración de glicerol. El aumento de las dosis de N-Mgb (con una dosis fija de SnPP; 1 umol) provocó un aumento de los grados de protección contra la AKI inducida por glicerol. Cuando se analiza con los resultados dados en la FIG. 16, son evidentes las fuertes relaciones directas entre las concentraciones de HO-1/haptoglobina cortical renal y en plasma y los grados de protección contra la AKI inducida por glicerol. Las líneas horizontales indican concentraciones normales de BUN y creatinina. Como se muestra en el panel derecho, las dosis administradas fueron bien toleradas por el riñón, como lo demuestra el mantenimiento de concentraciones normales de creatinina en plasma a las 18 horas en el intervalo de dosificación analizado.

La FIG. 18 muestra la regulación por aumento de la expresión génica de HO-1, haptoglobina (hapto) e IL-10 en el hígado y el corazón con un tratamiento combinado de N-Mgb/SnPP. Se presentan los grados de aumento con el tratamiento, expresados como un aumento múltiplo sobre los valores de control. Cada uno aumentó tanto en el hígado (2 paneles superiores) como en el corazón (2 paneles inferiores). Los valores individuales se proporcionan en las Tablas 9 y 10.

La FIG. 19 muestra que el preacondicionamiento con N-Mgb-SnPP mitiga la lesión hepática posisquémica y la lesión hepatotóxica. Los grados de lesión por isquemia-reperfusión (I/R) hepática se evaluaron según los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) y alanina aminotransferasa (ALT) en plasma. El pretratamiento con N-Mgb-SnPP disminuyó significativamente las concentraciones de LDH y ALT (paneles izquierdo y central). También disminuyó el grado de lesión hepatotóxica inducida por inyección intraperitoneal de glicerol (panel derecho).

La FIG. 20 muestra la apariencia total de las secciones hepáticas obtenidas a las 18 horas después de la isquemia sin (parte superior) y con pretratamiento con N-Mgb-SnPP (parte inferior). La isquemia hepática provocó necrosis macroscópica extensa como se demuestra por el aspecto gris blanquecino del hígado (parte superior). Sin embargo, con un pretratamiento con N-Mgb-SnPP, el hígado mantuvo un aspecto casi normal (parte inferior).

La FIG. 21 muestra que la vitamina B12 y la Fe sacarosa induce cada una, aumentos marcados de proteína HO-1 en las 4 horas y persisten durante 18 horas de su inyección IV.

La FIG. 22 muestra que la inyección de maleato causó AKI grave como se indica por aumentos marcados de BUN y PCr con respecto a los controles (C) a los que se les inyectó maleato. Ni SnPP sola ni FeS sola alteraron significativamente la gravedad de la lesión renal. Sin embargo, FeS SnPP combinadas confirieron una protección marcada, como se indica por reducciones del 75 % en concentraciones de BUN/PCr (las líneas horizontales representan los promedios de los niveles de BUN/PCr en ratones normales).

La FIG. 23 muestra que dentro de las 18 horas de inducción de IRI, se produjeron aumentos de 4 veces en las concentraciones de BUN y PCr. El pretratamiento con FeS SNPP confirió una protección significativa, disminuyendo los niveles de BUN y PCr en un 50 %. Las líneas horizontales representan los niveles promedios de BUN/PCr en ratones normales.

La FIG. 24 muestra que la inyección de maleato indujo una AKI severa. El pretratamiento con FeS B12 mitigó notablemente esta lesión, como se indica por reducciones de BUN/PCr. Las líneas horizontales representan los niveles promedios de BUN/PCr en ratones normales.

La FIG. 25 muestra que una insuficiencia renal grave se produjo en las 18 horas después de la inyección de glicerol. El pretratamiento con FeS B12 confirió una protección funcional sustancial, como se indica mediante reducciones marcadas en las concentraciones tanto de BUN como de PCr a las 18 h. Las líneas horizontales representan los niveles promedios de BUN/PCr en ratones normales.

La FIG. 26 muestra aumentos marcados y significativos en el ARNm de HO-1, como se evalúa a las 4 horas después de la inyección. A las 18 horas, los niveles de ARNm de HO-1 volvieron a valores normales.

La FIG. 27 muestra que los aumentos de ARNm a las 4 horas se correlacionan con un aumento significativo en los niveles de proteína HO-1. Estos niveles permanecieron elevados en el punto de tiempo de 18 h, particularmente en el caso de la administración de FeS.

Descripción detallada

La lesión a un órgano corporal puede provocar respuestas protectoras por parte del órgano de manera que pueda protegerse mejor en caso de que los eventos nocivos (es decir, los traumatismos) continúen o reaparezcan. Este fenómeno protector es conocido en la técnica como “ preacondicionamiento isquémico” o “ citorresistencia adquirida” . Un concepto ha sido el uso del fenómeno de citorresistencia adquirida para proteger a los órganos de manera preventiva, especialmente cuando un traumatismo conocido es inminente. Por ejemplo, el fenómeno podría inducirse para proteger los órganos antes de un traumatismo, tal como exposición a cirugía, angioplastia con balón, lesión por isquemia-reperfusión cardíaca o cerebral inducida, o toxicidad por radiocontraste. Como alternativa o adicionalmente, el fenómeno podría inducirse en donantes de órganos (p. ej., riñón, hígado) para prevenir o reducir la lesión por almacenamiento en frío y/o lesión por isquemia-reperfusión por reimplante. Sin embargo, estos enfoques no se han aplicado al uso clínico, debido a que, hasta la presente descripción, no ha habido un mecanismo para inducir con éxito la citorresistencia adquirida de una manera controlada sin causar una lesión en el órgano que debe protegerse.

La presente descripción proporciona composiciones y kits para su uso en métodos que permiten la inducción de citorresistencia adquirida sin lesiones en el órgano que debe protegerse. Debido a que la citorresistencia adquirida puede inducirse sin causar lesiones en el órgano, el fenómeno puede usarse en un entorno clínico para proteger a los órganos de manera preventiva, especialmente cuando se acerca un traumatismo conocido.

Sin quedar limitado por teoría alguna, las composiciones y kits para su uso en métodos inducen citorresistencia adquirida mediante la regulación por aumento de la expresión de proteínas de estrés protectoras. La citorresistencia adquirida puede inducirse a través de la administración de hierro sacarosa y de Sn-, Cr- o Zn-protoporfirina en un cierto nivel, o con un enfoque, de modo que la hierro sacarosa y Sn- Cr- o Zn-protoporfirina no causan una lesión en el órgano que debe protegerse. La inducción de la citorresistencia adquirida también se puede lograr administrando compuestos que regulan por aumento las proteínas de estrés a través de las mismas vías biológicas o similares utilizadas por las hemoproteínas. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, hierro y metabolitos asociados.

Un “traumatismo” es un hecho que probablemente provoque lesiones en un órgano. Los traumatismos a modo de ejemplo incluyen choque (presión arterial baja), hipoperfusión renal, cirugía, isquemia-reperfusión cardíaca o cerebral inducida, derivación cardiopulmonar, angioplastia con balón, administraciones de toxicidad por radiocontraste, quimioterapia, administración de fármacos, administración de fármacos nefrotóxicos, traumatismo contuso, punción, envenenamiento, tabaquismo, etc.

Un “traumatismo” es un efecto perjudicial en un órgano demostrado por la muerte celular dentro del órgano, daño celular dentro del órgano, estructura dañada dentro del órgano y/o función disminuida del órgano en comparación con uno o más grupos de control, condiciones o niveles de referencia relevantes.

La “ ausencia de lesión” en un órgano, “ sin causar una lesión” en un órgano, “ no daña el órgano” y expresiones similares significan que cualquier efecto en un órgano concuerde, según el alcance del buen juicio médico, con una relación beneficio/riesgo razonable de administración. La ausencia de una lesión puede ser demostrada mostrando que la función de un órgano no es estadísticamente de manera significativa diferente de un grupo de control, afección o nivel de referencia relevante según una prueba conocida de función de órgano en ese momento mediante el uso de comparaciones estadísticas apropiadas. Los ensayos a modo de ejemplo de la función del órgano incluyen medir marcadores asociados con la función del órgano; medir el rendimiento de un órgano; y medir una métrica de rendimiento del órgano en comparación con uno o más grupos de control, condiciones o niveles de referencia relevantes.

Al inducir la citorresistencia adquirida, las composiciones y los kits para su uso en los métodos descritos en la presente memoria protegen a los órganos de una lesión, tal como lesión inducida por traumatismo. “ Proteger a un órgano de una lesión” y expresiones similares incluyen uno o más de: regulación por aumento de la expresión de proteínas de estrés protectoras; conservar la función del órgano en su totalidad o en parte (p. ej., medir el rendimiento de un órgano; medir una métrica de rendimiento del órgano); reducir la lesión celular en el órgano (en particular realizaciones, como se manifiesta por una disminución de la filtración de las proteínas intracelulares en la circulación) y reducir la muerte celular dentro del órgano en comparación con uno o más grupos de control, condiciones o niveles de referencia relevantes.

Numerosos ensayos que pueden usarse para evaluar la presencia o ausencia de una lesión y protección asociada pueden usarse en modelos animales y humanos de la función del órgano. La falta de lesión y/o protección de un órgano puede confirmarse comparando una medida relevante de un sujeto con un nivel de referencia. Los niveles de referencia pueden incluir niveles o valores “ normales” o “ de control” , definidos según, por ejemplo, límites de discriminación o umbrales de definición de riesgo, para definir los puntos de corte y/o los valores anormales para la función del órgano. El nivel de referencia puede ser un nivel de indicios que se encuentran típicamente en un sujeto que no padece una lesión en el órgano. Otras expresiones para “ niveles de referencia” incluyen “ índice” , “valor de referencia” , “ estándar” , “ saludable” , “ prelesión” , etc. Tales niveles normales pueden variar, en función de si los indicios se usan solos o en una fórmula combinados con otros indicios para generar una puntuación. Alternativamente, el nivel de referencia puede obtenerse a partir de una base de datos de puntuaciones de sujetos previamente sometidos a una prueba que no desarrollaron lesión en el órgano durante un período de tiempo clínicamente relevante. Los niveles de referencia también pueden obtenerse a partir de, p. ej., un sujeto o población de control cuyo estado de lesión en el órgano se conoce. El nivel de referencia puede obtenerse a partir de uno o más sujetos que han estado expuestos al tratamiento para una lesión en el órgano, o de sujetos que han mostrado mejoras en la función del órgano después de una lesión como resultado de la exposición al tratamiento. El nivel de referencia puede obtenerse a partir de uno o más sujetos con lesión en el órgano que no se han expuesto al tratamiento. Un nivel de referencia también puede obtenerse a partir de algoritmos de gravedad de una lesión o índices calculados de los estudios de población.

Un “ nivel de referencia” puede referirse a un valor estandarizado para la función del órgano que representa un nivel no asociado con cualquier lesión; un nivel asociado con un tipo particular de lesión; un nivel asociado con una gravedad de la lesión, o un nivel asociado con un sujeto particular en el momento de un diagnóstico, al comienzo de un tratamiento, o en un punto de tiempo durante un tratamiento. El nivel de referencia puede ser un nivel de referencia universal que es útil en una variedad de ubicaciones de prueba o puede ser un nivel de referencia específico para una ubicación de prueba y un ensayo específico usado para medir la función del órgano. El nivel de referencia se obtiene a partir de (i) un individuo que no tiene lesión en el órgano ni lesión en el órgano de un tipo particular; o (ii) un grupo de individuos que no tienen lesión en el órgano ni lesión en el órgano de un tipo particular. Los niveles de referencia para un sujeto también pueden estar relacionados con los puntos de tiempo en los que el sujeto se somete a tratamientos para controlar la evolución o la regresión natural de la lesión en el órgano del sujeto. Los niveles R pueden obtenerse a partir de un “conjunto de datos” . Un conjunto de datos representa un conjunto de valores numéricos que resultan de la evaluación de una muestra (o población de muestras) en una condición deseada. Los valores del conjunto de datos se pueden obtener, por ejemplo, mediante la obtención experimental de medidas de una muestra y construyendo un conjunto de datos a partir de estas mediciones; o alternativamente, mediante la obtención de un conjunto de datos de un proveedor de servicios tal como un laboratorio, o de una base de datos o un servidor en el que se ha almacenado el conjunto de datos.

Regulación por aumento de las proteínas de estrés protectoras. Sin quedar limitado por teoría alguna, la regulación por aumento de una serie de proteínas de estrés conlleva a la inducción de citorresistencia adquirida. La “ regulación por aumento” incluye un aumento en la expresión de un gen o molécula de ácido nucleico de interés o la actividad de una proteína, por ejemplo, un aumento en la expresión génica o actividad de la proteína en comparación con la expresión o actividad en un gen o proteína de otro modo idéntica o comparable que no se ha regulado por aumento. La regulación por aumento de las siguientes proteínas de estrés a modo de ejemplo puede conllevar a la inducción de citorresistencia adquirida hemo oxigenasa (HO) , haptoglobina, hemopexina, hepcidina, alfa-1 antitripsina (AAT), interleucina-10 (IL-10), proteínas de choque térmico, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (nGa L) y HMG CoA reductasa.

La hemo oxigenasa (HO) es la enzima que limita la velocidad en el catabolismo del hemo. Existen tres isozimas de HO distintas: HO-1 (p. ej., Id. de sec. n.°:1), HO-2 (isoforma A; p. ej., Id. de sec. n.°:2; isoforma B; p. ej., Id. de sec. n.°. 3; isoforma C; p. ej., Id. de sec. n.°: 4) y HO-3 (p. ej., Id. de sec. n.°: 5). HO-1 es una isozima cuya expresión está regulada por aumento después de diversas formas de estrés tisular, tal como mediante la inducción por hemoproteínas, metales pesados, hipoxia y diversas vías sensibles a redox. Por el contrario, HO-2 es una isozima expresada de forma constitutiva. HO-3 es una isozima recientemente identificada cuyas funciones son actualmente desconocidas.

La haptoglobina (p. ej., Id. de sec. n.°:6) es una proteína en plasma sanguíneo que tiene un peso molecular de 86.000 a 400.000 y desempeña un papel importante en el metabolismo de la hemoglobina liberada en el torrente sanguíneo. Cuando se libera de forma excesivamente en la sangre, la hemoglobina se excreta en la orina a través de los túbulos renales, lo que da como resultado no sólo una pérdida de hierro sino también trastornos de los túbulos renales. Debido a que la haptoglobina se une de manera selectiva y firme a la hemoglobinain vivoy, por lo tanto, forma un complejo hemoglobina-haptoglobina, tiene funciones importantes en la recuperación de hierro y en la prevención de trastornos renales.

La hemopexina (Hpx; p. ej., Id. de sec. n.°:7) es una proteína de 60 kDa que se encuentra presente en el plasma en cantidades altas detrás solamente de albúmina, inmunoglobulina y proteasas plasmáticas. La hemopexina a menudo también se denomina beta-1B-glicoproteína. La hemopexina tiene una alta afinidad con respecto a hemo (K<d><10‘ 12 M), y se cree que la función biológica de Hpx está relacionada con el transporte de hemo, evitando así daños oxidativos inducidos por hemo y pérdida de hierro unida a hemo. Los secuestradores de hemopexina liberan hemo del plasma que induce un cambio estructural mediante lo cual el complejo hemo-Hpx obtiene una mayor afinidad por los receptores en el hígado, donde es envuelto por endocitosis mediada por receptores y se libera hemo a un pH bajo en los endosomas. Después de eso, Hpx regresa a la circulación y puede someterse a rondas adicionales de transporte.

La hemopexina se pliega en dos dominios homólogos, cada uno de 200 aminoácidos, unidos por un enlazador de 20 residuos de aminoácidos. Hay un 25 % de identidad de secuencia entre los dos dominios. Dos histidinas coordinan el hierro hemo, concretamente His213 del péptido enlazador e His270 de un bucle del dominio C-terminal, dando un complejo estable bis-histidilo Fe (III). La numeración es con respecto a la proteína madura. Clin. Chim. Acta, 312, 2001, 13-23 y DNA Cell Biol., 21, 2002, 297-304 proporcionan revisiones de la química de Hpx.

La hecidina (prepropéptido; p. ej., Id. de sec. n.°:8) es la señal clave que regula la homeostasis de hierro (Philpott, Hepatology 35:99 3 (2002); Nicolas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:4396 (2002)). Los altos niveles de hepcidina humana dan como resultado una reducción de los niveles de hierro, y viceversa. Las mutaciones en el gen de hepcidina que dan como resultado la falta de actividad de hepcidina están asociadas con la hemocromatosis juvenil, una enfermedad de sobrecarga de hierro grave (Roetto y col., Nat. Genet., 33:21-22, 2003). Los estudios en ratones han demostrado una función de hepcidina en el control de la homeostasis de hierro normal (Nicolas y col., Nat. Genet., 34:97-101, 2003; Nicolas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:4596-4601, 2002; Nicolas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:8780-8785, 2001).

Además, se acumulan datos que implican la hepcidina en el secuestro de hierro durante la inflamación (véanse, p. ej., Weinstein y col., Blood, 100:3776-36781, 2002; Kemna y col., Blood, 106:1864-1866, 2005; Nicolas y col., J. Clin. Invest., 110:1037-1044, 2002; Nemeth y col., J. Clin. Invest., 113:1271-1276, 2004; Nemeth y col., Blood, 101:2461-2463, 2003 y Rivera y col., Blood, 105:1797-1802, 2005). Se ha observado que la expresión del gen de hepcidina se regula por aumento fuertemente después de los estímulos inflamatorios, tales como infecciones, que inducen la respuesta de fase aguda de los sistemas inmunitarios innatos de los vertebrados. En los ratones, se demostró que la expresión del gen de hepcidina estaba regulada por aumento mediante lipopolisacárido (LPS), turpentina, adyuvante completo de Freund e infecciones adenovirales. La expresión de hepcidina es inducida por la citocina inflamatoria IL-6. También se descubrió una fuerte correlación entre la expresión de hepcidina y la anemia de inflamación en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo infecciones bacterianas, fúngicas y víricas.

La hepcidina humana, un péptido de 25 aminoácidos (p. ej., Id. de sec. n.°:9) con actividad antimicrobiana y de regulación del hierro, fue descubierta de forma independiente por dos grupos que investigan nuevos péptidos antimicrobianos. (Krause y col., FEBS Lett. 480:147 (2000); Park y col., J. Biol. Chem. 276:7806 (2001)). También se ha denominado LEAP-1 (péptido antimicrobiano expresado en el hígado). Posteriormente se identificó un ADNc de hepcidina que codifica un pre-propéptido de 83 aminoácidos en ratones y un pre-propéptido de 84 aminoácidos en ratas y seres humanos en una búsqueda de genes específicos del hígado que estaban regulados por hierro (Pigeon y col., J. Biol. Chem. 276:7811 (2001)). El péptido señal N-terminal de 24 residuos se escinde primero para producir pro-hepcidina, que luego se procesa adicionalmente para producir hepcidina madura, que se encuentra tanto en sangre como en orina. En la orina humana, la forma predominante contiene 25 aminoácidos, aunque también están presentes los péptidos más cortos de 22 y 20 aminoácidos.

El péptido maduro se destaca por contener ocho residuos de cisteína unidos como cuatro puentes disulfuro. La estructura de hepcidina fue estudiada por Hunter y col., J. Biol. Chem., 277:37597-37603 (2002), mediante RMN usando hepcidina sintetizada químicamente con un tiempo de retención de HPLC idéntico al de la hepcidina nativa purificada a partir de la orina. Hunter y col., informaron sobre su determinación de que la hepcidina se plegó en una estructura de bucle de horquilla que contenía un enlace disulfuro vecino (C1-C8, C2-C7, C3-C6, C4-C5).

La alfa-1 antitripsina (AAT; p. ej., Id. de sec. n.°:10) es una glioproteína secretada por hepatocitos y que normalmente está presente en el suero y en la mayoría de los tejidos en concentraciones altas, donde actúa como un inhibidor de las serinas proteasas. La inhibición de la proteasa por AAT es un componente esencial de la regulación de la proteólisis del tejido, y la deficiencia de AAT está implicada en la patología de varias enfermedades. Además de su actividad como una antiproteasa, la AAT podría tener una función biológica antiinflamatoria importante puesto que tiene una capacidad inhibidora sobresaliente con respecto a muchos mediadores de inflamación y con respecto a los radicales oxidantes (Branly M. Am J Respir Cell Mol. Biol., 2002; 27: 652-654). La interleucina-10 (IL-10; p. ej., Id. de sec. n.°:11) es una citocina pleiotrópica producida por varios tipos de células, tales como macrófagos, monocitos, linfocitos T y linfocitos B tipo Th2 y reguladores. La IL-10 es una citocina con propiedades inmunosupresoras y antiinflamatorias; regula diversas actividades mieloides y linfoides celulares e inhibe directamente la producción de varias citocinas inflamatorias mediante linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (NK). La IL-10 se conoce como un factor de proliferación de linfocitos B y es activa en autoinmunidad, producción de anticuerpos, tumorigénesis y tolerancia al trasplante. Eur. J. Immunogenet. 199724(I): 1-8. La IL-10 también altera la respuesta de los macrófagos a la infección, pero estimula los receptores Fc en las mismas células. Annals Allergy Asthma Immunol. 1997 79:469-483; J. Immunol. 1993 151: 1224-1234; y J. Immunol. 1992 149:4048-4052.

Se observó originalmente que las proteínas de choque térmico se expresaban en mayores cantidades en células de mamífero que se expusieron a elevaciones repentinas de la temperatura, mientras que la expresión de la mayoría de las proteínas celulares se redujo significativamente. Desde entonces se ha determinado que tales proteínas se producen en respuesta a diversos tipos de estrés, incluida la privación de glucosa.

Las proteínas de choque térmico tienen la capacidad de unirse a otras proteínas en sus estados no nativos y, en particular, de unirse a péptidos nacientes que surgen de los ribosomas o se extruyen en el retículo endoplásmico. Hendrick y Hartl., Ann. Rev. Biochem. 62:349-384 (1993); Hartl., Nature 381:571-580 (1996). Además, se ha demostrado que las proteínas de choque térmico desempeñan un papel importante en el plegamiento y ensamblaje adecuados de proteínas en el citosol, retículo endoplásmico y mitocondrias; en vista de esta función, se denominan “ chaperonas moleculares” . Frydman y col., Nature 370: 111-117 (1994); Hendrick y Hartl., Ann. Rev. Biochem. 62:349-384 (1993); Hartl, Nature 381:571-580 (1996).

Los ejemplos de proteínas de choque térmico incluyen BiP (también denominada grp78 (p. ej., Id. de sec. n.°:12)), hsp/hsc70 (p. ej., Id. de sec. n.°:13), gp96 (grp94) (p. ej., Id. de sec. n.°:14), hsp60 (p. ej., Id. de sec. n.°:15), hsp40 (p. ej., Id. de sec. n.°:16), hsp70/72 (p. ej., Id. de sec. n.°:17) y hsp90 (isoterma 1; p. ej., Id. de sec. n.°:18; isoforma 2; p. ej., Id. de sec. n.°:19).

Las lipocalinas son una familia de proteínas de unión a ligando extracelular que se encuentran en una variedad de organismos de bacterias hasta seres humanos. Las lipocalinas poseen muchas funciones diferentes, tales como la unión y transporte de pequeñas moléculas hidrófobas, transporte de nutrientes, regulación del crecimiento celular, modulación de la respuesta inmunitaria, inflamación y síntesis de prostaglandina.

La lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL; p. ej., Id. de sec. n.°: 20), que también se conoce como lipocalina de neutrófilos humanos (HNL), proteína de unión a péptido N-formilo y proteína relacionada con a2-microglobulina de 25 kDa, es una proteína de 24 kDa, que puede existir como un monómero, un homodímero o un heterodímero con proteínas, tales como gelatinasa B o metaloproteinasa-9 de matriz (MMP-9). También se ha identificado una forma trimérica de NGAL. NGAL es secretada por gránulos específicos de neutrófilos humanos activados. Se han identificado proteínas homólogas en ratón (24p3/uterocalina) y rata (proteína relacionada con a2-microglobulina/lipocalina relacionada con neu). Los datos estructurales han confirmado que NGAL tiene una estructura de cilindro p de ocho cadenas, que es característica de las lipocalinas; sin embargo, NGAL tiene una cavidad inusualmente grande revestida con residuos de aminoácidos más polares y con carga positiva que la observada normalmente en las lipocalinas. Se cree que NGAL se une a sustancias lipófilas pequeñas, tales como lipopolisacáridos derivados de bacterias y péptidos de formilo, y puede funcionar como modulador de inflamación.

NGAL es un marcador temprano de lesión o enfermedad renal aguda. Además de ser secretada por gránulos específicos de neutrófilos humanos activados, NGAL también se produce por nefrones en respuesta al daño epitelial tubular y es un marcador de lesión tubulointersticial (Tl). Los niveles de NGAL aumentan en la necrosis tubular aguda (ATN) por isquemia o nefrotoxicidad, incluso después de la isquemia renal “subclínica” leve. Por otra parte, se sabe que NGAL es expresada por el riñón en casos de enfermedad renal crónica (ERC) y lesión renal aguda (IRA); véanse, p.ej., Devarajan y col., Amer. J. Kidney Diseases 52(3); 395-399 (septiembre de 2008); y Bolignano y col., Amer. J. Kidney Diseases 52(3): 595-605 (septiembre de 2008). Se han sugerido niveles elevados de NGAL urinaria como predictivos de insuficiencia renal progresiva. Se ha demostrado previamente que la NGAL se expresa considerablemente por túbulos renales muy temprano después de lesión isquémica o nefrotóxica tanto en modelos animales como humanos. NGAL es rápidamente secretada en la orina, donde se puede detectar y medir fácilmente. NGAL es resistente a proteasas, lo que sugiere que puede recuperarse en la orina como un marcador fiel de la expresión de NGAL en túbulos renales.

La enzima HMG-CoA reductasa desempeña un papel fundamental en la producción de colesterol y otros isoprenoides en el hígado y otros tejidos a través de la vía del mevalonato. La conversión de 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A (HMG-CoA) en mevalonato es catalizada por la HMG-CoA reductasa, y es una etapa temprana y de limitación de la velocidad en la vía de biosíntesis del colesterol en el hígado y otros tejidos. Los aumentos inducidos por estrés en HMG CoA reductasa median la síntesis de colesterol, lo que produce un aumento del colesterol en la membrana plasmática.

La expresión de proteínas de estrés protectoras es regulada por aumento mediante la administración de hemoproteínas. Las hemoproteínas son metaloproteínas que contienen un grupo prostético hemo (un anillo de protoporfirina con un Fe central; un anillo de protoporfirina incluye cuatro anillos de pirrol enlazados por puentes de metina. También se pueden unir cuatro cadenas laterales de metilo, dos de vinilo y dos de propionato). Las hemoproteínas pueden ser hemoproteínas de bajo peso molecular. Las “ hemoproteínas de bajo peso molecular” incluyen aquellas con un peso molecular de 25 kDa o menos; 24 KDa o menos; 23 kDa o menos; 22 kDa o menos; 21 kDa o menos; 20 kDa o menos; 19 kDa o menos; 18 kDa o menos; 17 kDa o menos; 16 kDa o menos; 15 kDa o menos; 14 kDa o menos; 13 kDa o menos; 12 kDa o menos; 11 kDa o menos; o 10 kDa o menos. Las hemoproteínas pueden eliminarse rápidamente cuando se administran por vía intravenosa. “ Eliminar rápidamente” significa una tasa de excreción urinaria que tiene una tasa de depuración urinaria de >50 % de creatinina o urea sérica. Las hemoproteínas pueden ser hemoproteínas de bajo peso molecular que se eliminan rápidamente cuando se administran por vía intravenosa. La mioglobina (p. ej., Id. de sec. n.°:21) es una hemoproteína que puede usarse con las composiciones y kits para su uso en los métodos descritos en la presente memoria. Las referencias a hemoproteínas incluyen hemoproteínas modificadas, hemoproteínas variantes y hemoproteínas análogas D sustituidas. Las referencias a mioglobina incluyen mioglobina modificada, mioglobina variante y mioglobina análoga D sustituida. La mioglobina está presente en el tejido muscular estriado y funciona para almacenar y suministrar oxígeno mediante la unión reversible de O<2>en el sitio de unión abierto de mioglobina. A través de esta unión reversible, la mioglobina crea una fuente intracelular de oxígeno para las mitocondrias celulares. A diferencia de la hemoglobina, otra hemoproteína, la mioglobina, existe naturalmente solo como un monómero.

Cuando el tejido muscular está dañado, la mioglobina se libera en el torrente sanguíneo. Grandes cantidades de mioglobina en la sangre pueden causar lesiones renales provocando la constricción de los vasos renales, formar cilindros obstructores en los lúmenes de los túbulos renales e iniciar la inflamación intersticial, como se describe en Zager, R. A., Ren. Fail., 14, 341-344 (1992). Por otra parte, Nath y col. indican que las hemoproteínas, tales como la hemoglobina, cuando se liberan en el espacio extracelular, pueden incitar la toxicidad del tejido y que la mioglobina está directamente implicada en la patogénesis de la insuficiencia renal en la rabdomiólisis. J. Clin. Invest., julio de 1992 (90)1: 267-70. Por consiguiente, las hemoproteínas y, la mioglobina en particular, pueden dañar el sistema renal.

Cualquier compuesto que bloquee la unión de hemo a HO puede funcionar como un inhibidor de degradación de la hemoproteína. Por ejemplo, se conoce un número de análogos sintéticos de hierro protoporfirina IX. Estos compuestos están disponibles comercialmente y/o pueden sintetizarse con facilidad mediante métodos conocidos. Incluyen, por ejemplo, platino, zinc, níquel, cobalto, cobre, plata, manganeso, cromo y estaño protoporfirina IX. Por conveniencia, estos compuestos pueden referirse genéricamente como Me-protoporfirina o MePP, donde Me significa metal, y específicamente mediante la utilización del símbolo químico del metal, tal como Cr-protoporfirina (CrPP), Sn-protoporfirina (SnPP), Zn-protoporfirina (ZnPP) para los compuestos de cromo, estaño y zinc protoporfirina, respectivamente.

El hecho de que el bloqueo de la acción de HO pudiera ayudar beneficiosamente en la inducción de la citorresistencia adquirida sin causar una lesión fue inesperado. Por ejemplo, Nath y col., mostraron que la desactivación del gen HO-1 en ratones empeoró la lesión renal en el modelo de la toxicidad de la hemoproteína con glicerol. Los autores afirmaron que HO-1 es unprotectorcrítico contra la toxicidad aguda inducida por hemoproteínain vivo.Am. J. of Path., mayo de 2000156(5): 1527-1535.

Por otra parte, el hecho de que las Me-protoporfirinas pudieran usarse en combinación con una hemoproteína para inducir citorresistencia adquirida sin causar una lesión fue inesperado. Esto se debe a que generalmente se cree que las Me-protoporfirinas afectan negativamente a los órganos en diversos modelos de lesión en el órgano. Por ejemplo, Agarwal y col. descubrieron que el pretratamiento con Sn-protoporfirina exacerbada la lesión renal en un modeloin vivobasado en HO de lesión renal mediada por hemoproteína. En particular, el pretratamiento con Snprotoporfirina dio lugar a valores más altos de creatinina en suero en los días 3 a 5 y a depuraciones de inulina más bajas en el día 5. La hemodinámica renal estudiada en el día 2 después del cisplatino demostró una reducción de las tasas de flujo sanguíneo renal, mayor resistencia vascular renal y mayor excreción fraccionaria de sodio en ratas tratadas con Sn-protoporfirina. Kidney Int. octubre de 1995 48(4): 1298-307. En el modelo de rabdomiólisis por glicerol, Nath y col., descubrieron que el riñón responde a altas cantidades de hemoproteínas al inducir HO y que el bloqueo de la acción de HO con un inhibidor competitivo (en este caso, Sn-protoporfirina) exacerbó la disfunción renal. J. Clin. Invest. Jul de 1992: 90(1): 267-70. Ferenbach y col., y Goodman y col., han demostrado de manera similar que la inhibición de HO usando Me-protoporfirinas empeora el daño renal. Véanse Nephron. Exp. Nephrol. abril de 2010 115(3): e33-7 y Kidney Int. octubre de 2007 72(8): 945-53, respectivamente. Basándose en estas enseñanzas de la técnica, un experto en la técnica no habría esperado los efectos beneficiosos de la inhibición de HO-1 que se describen actualmente.

Sin quedar ligado a teoría alguna, las hemoproteínas activan los factores de transcripción sensibles a redox, lo que produce la regulación por aumento de las proteínas citoprotectoras sensibles a redox. Esta vía se inicia mediante el contenido de hierro de Mgb. Por lo tanto, como se demuestra en la presente memoria, los enfoques alternativos para inducir la señalización génica citoprotectora tubular renal mediada por hierro también son eficaces. Estas alternativas son la administración de hierro.

La información de secuencia proporcionada por las bases de datos públicas puede usarse para identificar secuencias de proteínas relacionadas y relevantes adicionales y secuencias de ácido nucleico asociadas que codifican tales proteínas.

Hierro Las referencias al hierro se refieren a complejos de carbohidratos de hierro. Estos complejos están disponibles comercialmente y/o pueden sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica.

El complejo de carbohidratos de hierro de la descripción es hierro sacarosa.

“ Hierro” dentro de las reivindicaciones y realizaciones a modo de ejemplo se refiere a hierro sacarosa.

Composiciones. El hierro sacarosa y la Sn-protoporfirina pueden proporcionarse individualmente o en combinación dentro de una composición. La composición incluye hierro sacarosa y Sn-protoporfirina y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se pueden usar sales y/o profármacos de principios activos.

Una sal farmacéuticamente aceptable incluye cualquier sal que mantenga la actividad del principio activo y sea aceptable para su uso farmacéutico. Una sal farmacéuticamente aceptable también se refiere a cualquier sal que pueda formarsein vivocomo resultado de la administración de un ácido, otra sal o un profármaco que se convierte en un ácido o sal.

Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas se pueden preparar a partir de un ácido inorgánico o de un ácido orgánico. Ejemplos de tales ácidos inorgánicos son ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, carbónico, sulfúrico y fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados pueden seleccionarse de clases de ácidos orgánicos alifáticos, cicloalifáticos, aromáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, carboxílicos y sulfónicos.

Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales metálicas hechas de sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc o sales orgánicas hechas de N,N'-dibenciletileno-diamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina, lisina, arginina y procaína.

Un profármaco incluye un principio activo que se convierte en un compuesto terapéuticamente activo después de la administración, tal como por escisión de una proteína o por hidrólisis de un grupo biológicamente lábil.

Las composiciones incluyen principios activos de al menos 0,1 % p/v de composición; al menos 1 % p/v de composición; al menos 10 % p/v de composición; al menos 20 % p/v de composición; al menos 30 % p/v de composición; al menos 40 % p/v de composición; al menos 50 % p/v de composición; al menos 60 % p/v de composición; al menos 70 % p/v de composición; al menos 80 % p/v de composición; al menos 90 % p/v de composición; al menos 95 % p/v de composición; o al menos 99 % p/v de composición.

[0001]Los principios activos se pueden proporcionar como parte de una composición que puede incluir, por ejemplo, al menos 0,1 % p/p de composición; al menos 1 % p/p de composición; al menos 10 % p/p de composición; al menos 20 % p/p de composición; al menos 30 % p/p de composición; al menos 40 % p/p de composición; al menos 50 % p/p de composición; al menos 60 % p/p de composición; al menos 70 % p/p de composición; al menos 80 % p/p de composición; al menos 90 % p/p de composición; al menos 95 % p/p de composición; o al menos 99 % p/p de composición.

Las realizaciones particulares incluyen hierro sacarosa, en combinación con SnPP. Estas realizaciones pueden incluir adicionalmente hemoproteínas (p. ej., mioglobina o mioglobina nitrada) y/o un inhibidor de la degradación de la hemoproteína (p. ej., protoporfirinas, hemina y/o hematina y/o sus formas nitradas).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo usados generalmente incluyen todos y cada uno de los agentes retardantes de la absorción, antioxidantes, aglutinantes, agentes tamponantes, agentes espesantes o cargas, agentes quelantes, recubrimientos, agentes disgregantes, medios de dispersión, geles, agentes isotónicos, lubricantes, conservantes, sales, disolventes o codisolventes, estabilizantes, tensioactivos y/o vehículos de administración.

Los antioxidantes a modo de ejemplo incluyen ácido ascórbico, metionina y vitamina E.

Los agentes tamponantes a modo de ejemplo incluyen tampones de citrato, tampones de succinato, tampones de tartrato, tampones de fumarato, tampones de gluconato, tampones de oxalato, tampones de lactato, tampones de acetato, tampones de fosfato, tampones de histidina y/o sales de trimetilamina.

Un agente quelante a modo de ejemplo es EDTA.

Los agentes isotónicos a modo de ejemplo incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, incluyendo alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol o manitol.

Los conservantes a modo de ejemplo incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metil parabeno, propilparabeno, cloruro de octadecil dimetil bencil amonio, haluros de benzalconio, cloruro de hexametonio, alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente espesante a un aditivo que solubiliza el principio activo o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden incluir alcoholes de azúcar polihídricos; aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico y treonina; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y cicloles, tales como inositol; PEG; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, alfa-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos); proteínas tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos tales como xilosa, manosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa, y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes están típicamente presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 partes en peso basándose en el peso del principio activo.

Las composiciones pueden formularse para administración, por ejemplo, mediante inyección, inhalación, infusión, perfusión, lavado o ingestión. Las composiciones pueden formularse además para administración intravenosa, intradérmica, intraarterial, intranodal, intralinfática, intraperitoneal, intralesional, intraprostática, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratecal, intratumoral, intramuscular, intravesicular, oral y/o subcutánea y, más particularmente, mediante inyección intravenosa, intradérmica, intraarterial, intranodal, intralinfática, intraperitoneal, intralesional, intraprostática, intravaginal, intrarrectal, intratecal, intratumoral, intramuscular, intravesicular y/o subcutánea.

Para la inyección, las composiciones pueden formularse como soluciones acuosas, tales como en tampones que incluyen solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológica. Las soluciones acuosas pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la formulación puede estar en forma liofilizada y/o en polvo para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Las realizaciones particulares se formulan para administración intravenosa.

Para administración oral, las composiciones pueden formularse como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen aglutinantes (goma tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina), cargas tales como azúcares, p. ej., lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o su sal, tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas pueden recubrirse con azúcar o recubrirse de forma entérica mediante el uso de técnicas estándar. También se pueden usar agentes aromatizantes, tales como menta, aceite de gaulteria, saborizante de cereza, saborizante de naranja, etc.

Las composiciones pueden formularse como un aerosol. El aerosol se proporciona como parte de un inhalador anhidro, líquido o de polvo seco. Los pulverizadores en aerosol de envases presurizados o nebulizadores también pueden usarse con un propelente adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, se puede determinar una unidad de dosificación proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. También se pueden formular cápsulas y cartuchos de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo de la hemoproteína y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Las composiciones también pueden formularse como preparaciones en depósito. Las preparaciones en depósito pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como sales poco solubles.

De manera adicional, las composiciones pueden formularse como sistemas de liberación sostenida que utilizan matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen al menos un principio activo. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los sistemas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los principios activos después de la administración durante unas pocas semanas hasta más de 100 días. Las preparaciones en depósito se pueden administrar mediante inyección; inyección parenteral; instilación; o implantación en tejidos blandos, una cavidad corporal u ocasionalmente en un vaso sanguíneo con inyección con agujas finas.

Las formulaciones en depósito pueden incluir una variedad de polímeros bioerosionables que incluyen poli(lactida), poli(glicólido), poli(caprolactona) y poli(lactida)-co (glicólido) (PLG) con relaciones de lactida:glicólido, pesos moleculares promedio, polidispersidades y productos químicos de grupo terminal deseables. La mezcla de tipos de polímeros diferentes en diferentes relaciones mediante el uso de diversos grados puede dar como resultado características tomadas de cada uno de los polímeros contribuyentes.

El uso de diferentes disolventes (por ejemplo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo, triacetina, N-metil pirrolidona, tetrahidrofurano, fenol o combinaciones de los mismos) puede alterar el tamaño y la estructura de las micropartículas con el fin de modular las características de liberación. Otros disolventes útiles incluyen agua, etanol, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metil-2-pirrolidona (NMP), acetona, metanol, alcohol isopropílico (IPA), benzoato de etilo y benzoato de bencilo.

Los modificadores de liberación a modo de ejemplo pueden incluir tensioactivos, detergentes, potenciadores de la viscosidad de fase interna, agentes complejantes, moléculas tensioactivas, codisolventes, quelantes, estabilizantes, derivados de celulosa, (hidroxipropil)metilcelulosa (HPMC), acetato de HPMC, acetato de celulosa, pluronics (p. ej., F68/F127), polisorbatos, Span® (Croda Americas, Wilmington, Delaware), poli(alcohol vinílico) (P<v>A), Brij® (Croda Americas, Wilmington, Delaware), isobutirato de acetato de sacarosa (SAIB), sales y tampones.

Los excipientes que se dividen en el límite de fase externa de micropartículas, tales como tensioactivos que incluyen polisorbatos, dioctilsulfosuccinatos, poloxámeros, PVA, también pueden alterar las propiedades que incluyen estabilidad y tasas de erosión de partícula, hidratación y estructura de canal, transporte interfacial y cinética de una manera favorable.

El procesamiento adicional de las formulaciones en depósito de liberación sostenida puede utilizar excipientes estabilizantes que incluyen manitol, sacarosa, trehalosa y glicina con otros componentes, tales como polisorbatos, PVAs y dioctilsulfosuccinatos en tampones, tales como Tris, citrato o histidina. También se puede usar un ciclo de liofilización para producir polvos de muy baja humedad que se reconstituyen con un tamaño y características de rendimiento similares a la suspensión original.

Cualquier composición puede incluir ventajosamente cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable que incluya aquellos que no produzcan reacciones significativamente adversas, alérgicas u otras reacciones adversas que superen el beneficio de administración. Los vehículos y formulaciones farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990. Por otra parte, las formulaciones pueden prepararse para cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo requiera la Oficina de Normas Biológicas de la FDA de Estados Unidos y/u otros organismos de regulación extranjeros relevantes.

Kits. También se describen kits. Los kits que incluyen uno o más recipientes que incluyen uno o más de los principios activos y/o composiciones se describen en la presente memoria. Los kits pueden incluir uno o más recipientes que contienen uno o más principios activos y/o composiciones que se usarán en combinación con los principios activos y/o composiciones. Asociado con dicho(s) recipiente(s) puede encontrarse un aviso en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleje la aprobación por parte del organismo de la fabricación, uso o venta para administración en humanos.

Opcionalmente, los kits incluyen además instrucciones para usar el kit en los métodos. El kit puede incluir instrucciones con respecto a la preparación de los principios activos y/o composiciones para la administración; administración de los principios activos y/o composiciones; niveles de referencia apropiados para interpretar los resultados asociados con el uso del kit; eliminación adecuada de los desechos relacionados; y similares. Las instrucciones pueden estar en forma de instrucciones impresas proporcionadas dentro del kit o las instrucciones pueden imprimirse en una parte del propio kit. Las instrucciones pueden estar en forma de una hoja, folleto, prospecto, CD-Rom o dispositivo legible por ordenador, o pueden redirigir a instrucciones en una ubicación remota, tal como un sitio web. Las instrucciones pueden estar en inglés y/o en cualquier idioma nacional o regional. Se pueden incluir posibles efectos secundarios y contraindicaciones para el uso posterior de los componentes del kit basándose en los síntomas de un sujeto. Los kits e instrucciones también pueden adaptarse según el tipo de órgano a proteger y el tipo de traumatismo que presente el órgano.

El envase, los principios activos y/o las composiciones, e instrucciones se combinan en un pequeño kit compacto con instrucciones impresas para el uso de cada uno de los principios activos y/o composiciones. Cuando se proporciona más de un principio activo y/o composición, la secuenciación de uso de los principios activos y/o composiciones puede etiquetarse en el kit.

Los kits incluyen algunos o todos los suministros médicos necesarios para usar el kit eficazmente, eliminando así la necesidad de localizar y recolectar dichos suministros médicos. Dichos suministros médicos pueden incluir jeringas, ampollas, tubos, mascarillas faciales, un dispositivo de transferencia de fluido sin aguja, una tapa de inyección, esponjas, tiras adhesivas estériles, Chloraprep, guantes y similares. Se pueden realizar variaciones en el contenido de cualquiera de los kits. Los kits particulares proporcionan materiales para administrar composiciones mediante administración intravenosa.

[0002]Métodos de uso. Como se ha indicado, las composiciones y kits para su uso en los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para proteger a los órganos contra lesiones mediante la inducción de citorresistencia adquirida en ausencia de una lesión. Existen numerosos usos posibles para las composiciones y kits para su uso en métodos.

Los métodos incluyen tratar órganos con principios activos que incluyen sales y profármacos de los mismos. El tratamiento de los órganos incluye suministrar cantidades terapéuticamente eficaces. Las cantidades terapéuticamente eficaces incluyen aquellas que proporcionan cantidades, tratamientos profilácticos y/o tratamientos terapéuticos eficaces.

Un órgano es una parte de un sujeto que normalmente es autónomo y tiene una función vital específica. Los ejemplos de órganos incluyen el corazón, el hígado, los riñones, el bazo, el páncreas, el cerebro, los pulmones, los intestinos, el estómago, etc. Las cantidades terapéuticamente eficaces pueden administrarse directamente a los órganos.

Las cantidades terapéuticamente eficaces también se pueden administrar a los órganos administrando la cantidad terapéuticamente eficaz al sujeto en el que se aloja el órgano. Los sujetos incluyen seres humanos, animales veterinarios (perros, gatos, reptiles, aves, etc.), ganado (caballos, ganado bovino, cabras, cerdos, pollos, etc.) y animales de investigación (monos, ratas, ratones, peces, etc.). El tratamiento de sujetos incluye administrar cantidades terapéuticamente eficaces. Por lo tanto, a menos que se indique lo contrario, la administración a un órgano puede realizarse mediante la administración a un sujeto, lo que da como resultado un suministro fisiológico al órgano o puede realizarse mediante la administración directamente al órgano.

Una “cantidad eficaz” es la cantidad de un principio activo o composición necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico deseado en un órgano o sujeto. Las cantidades eficaces a menudo se administran con fines de investigación. Las cantidades eficaces protegen a los órganos contra lesiones mediante la inducción de la citorresistencia adquirida en ausencia de una lesión.

Un “tratamiento profiláctico” incluye un tratamiento administrado a un órgano que no presente signos o síntomas de lesión en el órgano o presente únicamente signos o síntomas tempranos de lesión en el órgano de modo que el tratamiento se administra con el fin de reducir, prevenir o disminuir el riesgo de desarrollar otra lesión en el órgano. Por lo tanto, un tratamiento profiláctico funciona como un tratamiento preventivo contra la lesión en el órgano.

Un “tratamiento terapéutico” incluye un tratamiento administrado a un órgano que presente síntomas o signos de lesión en el órgano y se administra al órgano con el fin de reducir el empeoramiento de la lesión en el órgano.

La cantidad de dosis real administrada a un órgano (o sujeto) particular puede ser determinada por un médico, veterinario o investigador teniendo en cuenta parámetros tales como factores físicos y fisiológicos, incluyendo la diana; peso corporal; gravedad de la afección; próximos traumatismos, cuando se conozcan; tipo de órgano que requiere protección; intervenciones terapéuticas anteriores o concurrentes; idiopatía del sujeto; y vía de administración.

La cantidad y concentración del principio activo en una composición, así como la cantidad de la composición administrada, se pueden seleccionar en base a factores clínicamente relevantes, la solubilidad del principio activo en la composición, la potencia y la actividad del principio activo, y la forma de administración de la composición, así como si el principio activo es modificado (p. ej., nitrado, PEGilado) o administrado en combinación con un inhibidor de degradación de la hemoproteína (p. ej., un inhibidor de HO-1) entre otras consideraciones.

Una composición que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio o principios activos puede administrarse por vía intravenosa a un sujeto para la protección de órganos de una manera clínicamente segura y eficaz, que incluye una o más administraciones separadas de la composición. Por ejemplo, pueden administrarse de 0,05 mg/kg a 5,0 mg/kg a un sujeto por día en una o más dosis (p. ej., dosis de 0,05 mg/kg QD, 0,10 mg/kg QD, 0,50 mg/kg QD, 1,0 mg/kg QD, 1,5 mg/kg QD, 2,0 mg/kg QD, 2,5 mg/kg QD, 3,0 mg/kg QD, 0,75 mg/kg BID, 1,5 mg/kg BID, o 2,0 mg/kg BID). Para ciertos órganos e indicaciones, la dosis diaria total de un principio activo puede ser de 0,05 mg/kg a 3,0 mg/kg administrada por vía intravenosa a un sujeto de una a tres veces al día, incluyendo la administración de dosis diarias totales de 0,05-3,0, 0,1-3,0, 0,5-3,0, 1,0-3, 1,5-3,0, 2,0-3,0, 2,5-3,0, y 0,5-3,0 mg/kg/día de composición mediante el uso de dosificación por infusión intravenosa QD, BID o TID durante 60 minutos. Las composiciones pueden administrarse por vía intravenosa QD o BID a un sujeto con, p. ej., dosis diarias totales de 1,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg de una composición con hasta 92-98 % p/p de una hemoproteína.

Las dosis útiles adicionales a menudo pueden variar de 0,1 a 5 pg/kg o de 0,5 a 1 pg/kg. En otros ejemplos, una dosis puede incluir 1 pg /kg, 5 pg /kg, 10 pg /kg, 15 pg /kg, 20 pg /kg, 25 pg /kg, 30 pg /kg, 35 pg/kg, 40 pg/kg, 45 pg/kg, 50 pg/kg, 55 pg/kg, 60 pg/kg, 65 pg/kg, 70 pg/kg, 75 pg/kg, 80 pg/kg, 85 pg/kg, 90 pg/kg, 95 pg/kg, 100 pg/kg, 150 pg/kg, 200 pg/kg, 250 pg/kg, 350 pg/kg, 400 pg/kg, 450 pg/kg, 500 pg/kg, 550 pg/kg, 600 pg/kg, 650 pg/kg, 700 pg/kg, 750 pg/kg, 800 pg/kg, 850 pg/kg, 900 pg/kg, 950 pg/kg, 1000 pg/kg, de 0,1 a 5 mg/kg, o de 0,5 a 1 mg/kg. En otros ejemplos, una dosis puede incluir 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, o más.

Cada una de las dosis descritas de principios activos puede ser una combinación de hierro sacarosa y Sn-, Cr- o Znprotoporfirina. Cuando se incluyen en combinaciones para producir una dosis, tal como una dosis indicada en la presente memoria, los sustituyentes en la combinación pueden proporcionarse en relaciones a modo de ejemplo tales como: 1:1; 1:1,25; 1:1,5; 1:1,75; 1:8; 1:1,2; 1:1,25; 1:1,3; 1:1,35; 1:1,4; 1:1,5; 1: 1,75; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6: 1:7; 1:8; 1:9; 1:10; 1:15; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50; 1:60; 1:70; 1:80; 1:90; 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500; 1:600; 1:700; 1:800; 1:900; 1:1000; 1:1:1; 1:2:1; 1:3:1; 1:4:1; 1:5;1; 1:10:1; 1:2:2; 1:2:3; 1:3:4; 1:4:2; 1:5;3; 1:10:20; 1:2:1:2; 1:4:1:3; 1:100:1:1000; 1:25:30:10; 1:4:16:3; 1:1000:5:15; 1:2:3:10; 1:5:15:45; 1:50:90:135; 1:15:1.8:2.3; 1:10:1 00:10 00 o relaciones beneficiosas adicionales dependiendo del número y de la identidad de los sustituyentes en una combinación para alcanzar la dosificación indicada. Los sustituyentes en una combinación pueden proporcionarse dentro de la misma composición o dentro de diferentes composiciones.

Las cantidades terapéuticamente eficaces se pueden lograr mediante la administración de dosis únicas o múltiples durante el transcurso de un régimen de tratamiento (p. ej., QID, TID, BID, diariamente, cada dos días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas, mensualmente, cada 2 meses, cada 3 meses, cada 4 meses, cada 5 meses, cada 6 meses, cada 7 meses, cada 8 meses, cada 9 meses, cada 10 meses, cada 11 meses o anualmente).

Las composiciones se pueden administrar dentro de las 48 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 46 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 44 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 42 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 40 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 38 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 36 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 34 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 32 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 30 horas después de un traumatismo inminente, dentro de l 28 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 26 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 24 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 22 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 20 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 18 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 16 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 14 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 12 horas después de un traumatismo inminente, dentro de l 10 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 8 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 6 horas después de un traumatismo inminente, dentro de las 4 horas después de un traumatismo inminente, o dentro de las 2 horas después de un traumatismo inminente. Las composiciones se administran dentro de las 18 horas después de un traumatismo inminente.

De manera adicional, las composiciones se pueden administrar al menos 48 horas antes de un traumatismo inminente,, al menos 46 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 44 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 42 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 40 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 38 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 36 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 34 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 32 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 30 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 28 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 26 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 24 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 22 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 20 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 18 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 16 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 14 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 12 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 10 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 8 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 6 horas antes de un traumatismo inminente, al menos 4 horas antes de un traumatismo inminente o al menos al menos 2 horas antes de un traumatismo inminente. Las composiciones se administran al menos 18 horas antes de un traumatismo inminente.

Protección de trasplante. Los órganos pueden protegerse contra lesiones durante un trasplante. Las composiciones se pueden administrar (i) a un donante de órganos antes del aislamiento de un órgano del donante; (ii) al órgano aislado antes del trasplante, y/o (iii) al receptor del trasplante de órganos. Este método de uso puede aplicarse a cualquier órgano que sea capaz de trasplante de un sujeto individual a un segundo sujeto individual. Las cantidades terapéuticamente eficaces pueden administrarse directamente a un órgano después de que se retire de un sujeto o antes de la implantación en un segundo sujeto.

Protección del sistema renal. Hasta la descripción actual, no hubo agentes capaces de prevenir o mitigar la aparición de AKI en pacientes con riesgo alto, tales como los individuos que se someten a cirugía, derivación cardiopulmonar o toxicidad por radiocontraste. Cabe señalar que la insuficiencia renal aguda es un factor de riesgo importante tanto para la morbilidad como para la mortalidad, así como la necesidad de diálisis renal a largo plazo. Esto último le cuestan al gobierno Federal miles de millones de dólares en su enfermedad renal en estadio terminal/programa Medicare. Por lo tanto, la prevención de AKI/insuficiencia renal aguda presentó una necesidad clínica crítica y completamente insatisfecha.

“ Lesión renal aguda” , (AKI) también conocida como “ insuficiencia renal aguda” (ARF) o “ insuficiencia renal aguda” , se refiere a una enfermedad o afección donde se produce una pérdida rápida de la función renal debido al daño en los riñones, lo que da como resultado la retención de productos residuales de nitrógeno (urea y creatinina) y distintos de nitrógeno que normalmente son excretados por el riñón. Dependiendo de la gravedad y duración de la disfunción renal, esta acumulación está acompañada por alteraciones metabólicas, tales como acidosis metabólica (acidificación de la sangre) e hiperpotasemia (niveles elevados de potasio), cambios en el equilibrio del fluido corporal, efectos sobre muchos otros sistemas de órganos/insuficiencia del sistema de órganos, sobrecarga del volumen intravascular, coma y muerte. Puede estar caracterizada por oliguria o anuria (disminución o cese de la producción de orina), aunque puede producirse ARF no oligorúrica. AKI es una complicación grave en los hospitales, lo que da como resultado una estancia hospitalaria prolongada y una mortalidad elevada. La enfermedad cardíaca y la cirugía cardíaca son ambas causas comunes de AKI. Una vez que los pacientes padecen AKI, su mortalidad es alta.

AKI puede ser una consecuencia de diversas causas que incluyen a) prerrenal (causas en el suministro de sangre), que incluye hipovolemia o disminución del volumen sanguíneo, generalmente debido a choque o deshidratación y pérdida de fluido o uso excesivo de diuréticos; síndrome hepatorrenal, en el que la perfusión renal se ve comprometida debido a la insuficiencia hepática; problemas vasculares, tales como enfermedad ateroembólica y trombosis venosa renal, que pueden producirse como una complicación del síndrome nefrótico; infección, normalmente sepsis e inflamación sistémica debido a infección; quemaduras graves; secuestración debido a pericarditis y pancreatitis; e hipotensión debido a antihipertensivos y vasodilatadores; b) daño renal intrínseco, que

incluye isquemia renal (reducciones o interrupción de flujo sanguíneo transitorio), toxinas o medicamentos (p. ej., algunos AINE, antibióticos de aminoglucósido, contraste yodado, litio, nefropatía de fosfato debido a la preparación intestinal para colonoscopia con fosfatos de sodio); rabdomiólisis o desintegración del tejido muscular, donde la liberación resultante de mioglobina en la sangre afecta al riñón, que también puede ser causado por lesión (especialmente lesión por aplastamiento o traumatismo contundente importante), estatinas, estimulantes y algún otro fármaco; hemólisis o descomposición de glóbulos rojos, que puede ser causada por diversas afecciones tales como enfermedad de células falciformes y lupus eritematoso; mieloma múltiple, ya sea debido a hipercalcemia o a “ nefropatía por cilindros” ; glomerulonefritis aguda, que puede deberse a una variedad de causas, tales como enfermedad de la membrana basal antiglomerular/síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener o nefritis lúpica aguda con lupus sistémico eritematoso; y c) causas posrenales (causas obstructivas en el tracto urinario) que incluyen medicación que interfiere con el vaciado normal de la vejiga (p. ej., anticolinérgicos); hipertrofia prostática benigna o cáncer de próstata; piedras en los riñones; neoplasia maligna abdominal (p. ej., cáncer de ovario, cáncer colorrectal); catéter urinario obstruido; o fármacos que pueden causar cristaluria y fármacos que pueden generar mioglobinuria y cistitis.

Los métodos (no según la invención reivindicada) incluyen proteger el riñón mediante la inducción de citorresistencia adquirida. Como se ha indicado, las cantidades terapéuticamente eficaces apropiadas pueden determinarse inicialmente mediante el uso de modelos animales para identificar intervalos de dosis. Cantidades terapéuticamente eficaces particulares de principio activo incluyen 10 mg/kg; 20 mg/kg; 30 mg/kg; 40 mg/kg; 50 mg/kg; 60 mg/kg; 70 mg/kg; 80 mg/kg; 90 mg/kg y 100 mg/kg.

Los modelos animales a modo de ejemplo de lesión renal incluyen: insuficiencia renal inducida por glicerol (imita la rabdomiólisis); ARF inducida por isquemia-reperfusión (simula los cambios inducidos por reducción del flujo sanguíneo renal, lo que produce isquemia tisular y muerte celular de los túbulos celulares); modelos inducidos por fármacos tales como gentamicina, cisplatino, AINE, ARF inducida por ifosfamida (imita la insuficiencia renal debido a la administración clínica de los fármacos respectivos); uranio, ARF inducida por dicromato de potasio (imita el riesgo laboral); ARF inducida por S-(1,2-diclorovinilo)-L-cisteína (simula la disfunción renal inducida por agua contaminada); ARF inducida por sepsis (imita la insuficiencia renal inducida por infección); y ARF inducida por radiocontraste (imita la insuficiencia renal en pacientes durante el uso de medios de radiocontraste en el momento del cateterismo cardíaco). Para obtener más información sobre estos modelos, véase Singh y col., Pharmacol. Rep. 2012, 64(1): 31 44.

Las pruebas conocidas de función renal incluyen ultrasonido; tomografía computarizada; y la medición de lactato deshidrogenasa (LDH), nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina, depuración de creatinina, depuración de yodotalamato, índice de filtración glomerular y depuración de inulina.

Protección hepática. Los modelos animales a modo de ejemplo de lesión hepática incluyen: lesión por isquemiareperfusión; fibrosis hepática inducida químicamente usando hepatotoxinas (tetracloruro de carbono, tioacetamida, dimetilo o nitrosamina de dietilo); ligamiento de los conductos biliares; el modelo de Schistsomiasis; el modelo de hepatitis de Concanavalina A; ratones transgénicos VHC inducible; diversos modelos genéticos; elModelo de infusión de etanol entérico (modelo de Tsukamoto-French); y elmodelo de deficiencia de metionina y colina.

Además, varios compuestos hepatotóxicos, que incluyen ciertas terapias, inducen citotoxicidad. Los compuestos hepatotóxicos pueden producir citotoxicidad hepática por ataque químico directo o por la producción de un metabolito tóxico. La citotoxicidad puede inducirse por ataque químico directo usando los siguientes fármacos: Anestésicos, tales como enflurano, fluroxeno, halotano y metoxiflurano; Neuropsicotrópicos, tales como cocaína, hidrazidas, metilfenidato y tricíclicos; Anticonvulsivos, tales como feniletilina y ácido valproico; Analgésicos, tales como acetaminofeno, clorzoxazona, dantroleno, diclofenaco, ibuprofeno, indometacina, salicatos, toleína y zoxazolamina; Hormonas, tales como lacetohexamida, carbutamida, glipizida, metahexamida, propiltiouracilo, tamoxifeno, diestilbestrol; Antimicrobianos, tales como anfotericina B, clindamicina, ketoconazol, mebendazol, metronidazol, oxacilina, ácido paraminosalicílico, penicilina, rifampicina, sulfonamidas, tetraciclina y zidovudina; Fármacos cardiovasculares, tales como amiodarona, dilitiazem, a-metildopa, mexiletina, hidrazalina, ácido nicotínico, papaverina, perhexilina, procainamida, quinidina y tocainamida; e Inmunosupresores y Antineoplásicos, tales como, asparaginasa, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, doxorrubicina, fluorouracilo, metotrexato, mitramicina, 6-MP, nitrosoureas, tamoxifeno, tioguanina y vincristina; y Fármacos diversos, tales como disulfiram, ion yoduro, oxifenisatina, vitamina A y ácido paraminobenzoico.

Los compuestos hepatotóxicos que inducen la colestasis, una interrupción en el flujo biliar, pueden adoptar varias formas. La colestasis centribular está acompañada por cambios inflamatorios portales. Se han registrado cambios en los conductos biliares con algunos fármacos tales como eritromicina, mientras que la colestasis canalicular pura es característica de otros fármacos tales como los esteroides anabólicos. La colestasis crónica se ha relacionado con tales fármacos como metiltestosterona y estradiol. La enfermedad colestática puede ser inducida mediante el uso de compuestos hepatotóxicos que incluyen los siguientes: esteroides anticonceptivos, esteroides androgénicos, esteroides anabólicos, ácido acetilsalicílico, azatioprina, benzodiazepina, ácido quenodesoxicólico, clordiazepóxido, estolato de eritromicina, flufenazina, furosemida, griseofulvina, haloperidol, imipramina, 6-mercaptopurina, metimazol, metotrexato, metildopa, metilenodiamina, metiltestosterona, naproxeno, nitrofurantoína, penicilamina, perfenazina, proclorperazina, promazina, tiobendazol, tioridazina, tolbutamida, trimetoprimsulfametoxazol, arsénico, cobre, y paraquat.

Algunos fármacos, aunque principalmente colestáticos, también pueden producir hepatotoxicidad y, por lo tanto, la lesión hepática que causan es mixta. Los fármacos que causan lesión hepática mixta incluyen, por ejemplo, los siguientes: clorpromazina, fenilbutazona, halotano, clordiazepóxido, diazepam, alopurinol, fenobarbital, naproxeno, propiltiouracilo, cloranfenicol, trimetoprimsulfametoxazol, aminona, disopiramida, azatioprina, cimetidina y ranitidina. La detección de una o más enzimas del ciclo arginina/urea/NO, enzimas de sulfuración y/o productos relacionados con la descomposición de la espectrina tiene función de diagnóstico de lesión hepática. Los ejemplos de estos marcadores incluyen: argininosuccinato sintetasa (ASS) y argininosuccinato liasa (ASL), sulfuración (estrógeno sulfotransferasa (EST)), escualeno sintasa (SQS), glucógeno fosforilasa hepática (GP), carbamoil-fosfato sintetasa (CPS-1), a-enolasa 1, proteína regulada por glucosa (GRP) y productos de degradación de espectrina.

La detección de biomarcadores como diagnóstico de lesión hepática, tal como lesión debida a isquemia, puede correlacionarse con las pruebas existentes. Estos pueden incluir: alcalina fosfatasa (AP); 5'-nucleotidasa (5'-ND); aglutamil transpeptidasa (G-GT); leucina aminopeptidasa (LAP); aspartato transaminasa (AST); alanina transaminasa (ALT); fructosa-1,6-difosfato aldolasa (ALD); LDH; isocitrato deshidrogenasa (ICDH); ornitina-carbamoiltransferasa (OCT); sorbitol deshidrogenasa (SDH) arginasa; guanasa; creatina fosfoquinasa (CPK); colinesterasa (ChE); niveles de péptido tipo III del procolágeno (PIIIP); niveles de amoníaco en sangre en hepatoencefalopatías; ligando en niveles en necrosis y hepatoma; niveles de hialuronato debido al daño celular endotelial hepático; niveles de a-1-fetoproteína (AFP) para detectar hepatoma; niveles de antígeno carcinoembrionario (CEA) para detectar la metástasis del cáncer en el hígado; aumentos de los anticuerpos contra una variedad de componentes celulares, tales como, mitocondriales, y proteína de membrana hepática nuclear y específica; y detección de proteínas, tales como albúmina, globina, aminoácidos, colesterol y otros lípidos. Asimismo, el análisis bioquímico de una variedad de minerales, metabolitos y enzimas obtenidos de biopsias hepáticas puede ser útil para identificar biomarcadores adicionales en trastornos hepáticos heredados, adquiridos e inducidos experimentalmente.

La cantidad de biomarcadores detectados puede estar correlacionada con las pruebas de la función hepática para evaluar aún más la lesión hepática. Como entenderá un experto en la materia, las pruebas de función hepática incluyen las siguientes: evaluación de la depuración hepática de aniones orgánicos, tales como bilirrubina, verde de indocianina (ICG), sulfobromoftaleína (BSP) y ácidos biliares; evaluación del flujo sanguíneo hepático mediante mediciones de galactosa y depuración de ICG; y evaluación de la función microsomal hepática, mediante el uso de la prueba de aminopirina en el aliento y la prueba de depuración de cafeína. Por ejemplo, la bilirrubina sérica se puede medir para confirmar la presencia y gravedad de la ictericia y para determinar el grado de hiperbilirrubinemia, como se observa en la enfermedad hepática parenquimal. Los aumentos de aminotransferasa (transaminasa) reflejan la gravedad del daño hepatocelular activo, mientras que se registran aumentos de fosfatasa alcalina con colestasis e infiltrados hepáticos (Isselbacher, K. y Podolsky, D. en Hartison's Principles of Internal Medicine, 12a edición. Wilson y col., eds., 2: 1301-1308 (1991)).

Los sistemas y parámetros de puntuación adicionales utilizados para evaluar la función hepática incluyen el sistema de puntuación de Child-Pugh de la siguiente manera:

Sistema de puntuación de Child-Pugh

Medida 1 punto 2 puntos 3 puntos

Bilirrubina (total) <34 (<2) 34-50 (2-3) >50 (>3)

pmol/l (mg/dl)

Albúmina sérica >35 28-35 <28

g/l

INR <1,7 1,71-2,20 >2,20

Ascitos Ninguno Leve Severo

Encefalopatía hepática Ninguno Grado I-II (o suprimido con medicación) Grado III-IV (o refractario) Puede usarse la prueba de depuración plasmática de indocianina usando un sensor de luz mediante presión táctil, así como un sistema de puntuación de función hepática posoperatoria desarrollado por Schindl y col., (Schindl M y col. 2005, Archives of Surgery 140(2):183-189). Este sistema puntúa la disfunción hepática según los niveles de ácido láctico, bilirrubina total, INR y encefalopatía posoperatoria. Las puntuaciones totales de 0, 1-2, 3-4 o >4 se usan para clasificar la disfunción hepática como ausente, leve, moderada o grave, respectivamente. Además, se puede evaluar la relación de sal biliar a fosfolípido.

Protección cardíaca. Los modelos animales de lesión cardíaca a modo de ejemplo incluyen: modelos de infarto de miocardio (MI), modelos de remodelación pos-MI, modelos de terapia génica, modelos de terapia celular, modelos de constricción aórtica transversal (TAC), modelos de apoplejía isquémica aguda, modelos de isquemia renal y de extremidades, el modelo de perfusión de Langendorff y el modelo de cardiomiopatía inducida por doxorrubicina. Véase también, por ejemplo, modelos animales de lesión cardíaca llevados a la práctica por el Cardiovascular Research Laboratory, Baltimore, MD.

Se pueden usar diversos métodos para detectar lesiones cardíacas, que incluyen formación de imágenes no invasivas, tales como formación de imágenes de resonancia magnética (MRI), ultrasonido, tomografía computarizada por rayos X (TC), tomografía computarizada de emisión de fotón único (SPECT) y/o tomografía por emisión de positrones (PET). Las medidas adicionales pueden incluir ecocardiografía, electrocardiograma, catéter de presión Mikro-tip, telemetría, inmunohistoquímica y estudios biológicos moleculares. La patente de Estados Unidos n.° 2002/0115936 describe un método y un aparato para la evaluación de la función cardíaca mediante el control del movimiento de la tráquea.

Las pruebas conocidas de función cardíaca incluyen medir los niveles de PDH, los niveles de lactato de plasma y/o la oxidación de carbohidratos cardíacos. Los marcadores asociados con la lesión cardíaca no isquémica incluyen: Precursor de alfa-2-HS-glicoproteína (p. ej., Id. de sec. n.°:22); Asporina; Subunidad ATP sintasa delta (mitocondrial); Sustancia epicárdica del vaso sanguíneo (p. ej., Id. de sec. n.°:23); C6ORF142; Anhidrasa carbónica 1; Anhidrasa carbónica 3; Ceruloplasmina; Factor de coagulación IX; Cadena de colágeno alfa-3(VI); Dermatopontina; Proteína de matriz extracelular tipo fibulina que contiene EGF 1; Cadena de fibrinógeno gamma; Fibulina-1; Fibulina-2; Proteína de choque térmico HSP 90-beta (p. ej., Id. de sec. n.°:24); Subunidad de hemoglobina alfa; Subunidad de hemoglobina beta; Región C de la cadena de Ig alfa-1; Región C de la cadena de Ig alfa-2; Región C de la cadena de Ig gamma-2; Regiones C de la cadena de Ig lambda; Región C de la cadena de Ig mu; Proteína de unión a factor p de crecimiento de transformación latente 2; Glucoproteína asociada a microfibrilo 4; Miosina-2; Proteína A amiloide en suero: Proteína que contiene sorbina y el dominio SH32 (p. ej., Id. de sec. n.°:25); y Proteína que contiene sorbina y el dominio SH32 (p. ej., Id. de sec. n.°:26).

Los marcadores asociados con la lesión cardíaca isquémica incluyen: Precursor de alfa-2-HS-glicoproteína (p. ej., Id. de sec. n.°:22); Alfa-2-macroglobulina; Anhidrasa carbónica 1; Subunidad de hemoglobina alfa; Subunidad de hemoglobina beta; Región C de la cadena de Ig alfa-1; Región C de la cadena de Ig alfa-2; Región C de la cadena de Ig mu; Leiomodina-1 (p. ej., Id. de sec. n.°:27); Cadena ligera reguladora de miosina MRLC2 (p. ej., Id. de sec. n.°:28); Nexilina (p. ej., Id. de sec. n.°:29); Subunidad a de componente E1 de piruvato deshidrogenasa; proteína A amiloide en suero; y forma somática.

Protección pulmonar. Los modelos animales de lesión pulmonar, que incluyen lesión pulmonar aguda incluyen inducción de lesiones por instilación intratraqueal de endotoxinas (LPS), ventilación mecánica, hipoxemia, bacterias vivas(E. coli),hiperoxia, bleomicina, ácido oleico, ligadura y punción cecal, y aspiración ácida. Para obtener más información sobre los modelos de lesión pulmonar, véase Assay Depot, descrito como el mercado en línea más grande del mundo para los servicios de investigación farmacéutica.

Los síntomas de la lesión pulmonar incluyen respiración rápida y dificultosa presión arterial baja y dificultad para respirar. Se puede usar cualquier tipo de prueba de función pulmonar. La prueba de función pulmonar generalmente se puede dividir en tres áreas principales. El primer tipo de prueba pulmonar generalmente se denomina espirometría que proporciona mediciones en términos de volumen y frecuencia de respiración de diferentes esfuerzos inspiratorios y espiratorios del paciente . Además, varios caudales en varias etapas de una prueba también son el tipo de datos generados a partir de la prueba de espirometría. Una segunda área de prueba pulmonar es un conjunto de procedimientos diseñados para determinar la uniformidad de la distribución del aire inspirado a través de los pulmones de un paciente. En virtud de tales pruebas, puede determinarse la insuficiencia pulmonar aunque la ventilación alveolar de un paciente sea normal. Un tercer tipo de prueba pulmonar se refiere a la capacidad de los pulmones de difundir el aire inspirado a través de membranas alveolares y tales pruebas proporcionan una indicación de la capacidad del pulmón de convertir la sangre venosa en sangre arterial intercambiando oxígeno por dióxido de carbono.

El volumen de respiración se puede evaluar usando un dispositivo de detección de flujo de volumen conectado a las vías respiratorias de un sujeto (p. ej., mediante el uso de un espirómetro o taquímetro) o midiendo las excursiones mecánicas de las paredes torácicas y abdominales. También se pueden usar técnicas que dependen de los registros de los movimientos de la pared torácica y la pared abdominal que se basan en un calibrador de tensiones (registro de los cambios en la longitud de la circunferencia del cuerpo), o que se basan en bucles conductores eléctricos inductivos elásticos dispuestos alrededor del tórax y abdomen del paciente. Los registros de la inductancia de los bucles se pueden usar para calcular la magnitud de las variaciones del área de sección transversal del tórax y los compartimentos abdominales. La patente de Estados Unidos 4.308.872 es un ejemplo de esta tecnología de estimación con bucles de autoinductancia. Dichos métodos pueden usarse para mediciones cuantitativas de los volúmenes respiratorios después de un procedimiento de calibración.

Las pruebas de la función pulmonar pueden incluir medir el volumen de respiración, los gases en la sangre arterial y/o el gradiente de A-a O<2>.

Protección contra la sepsis. La sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) se caracteriza por un estado inflamatorio de todo el cuerpo con la presencia de infección. La sepsis puede producir fiebre, respiración rápida y presión arterial baja y puede dañar todos los órganos, incluidos los órganos del sistema cardiovascular, el sistema inmunológico y el sistema endocrino.

Los modelos animales de septicemia incluyen sepsis inducida por ligadura y punción cecal (CLP) individualmente o en combinación con instilación de bacterias (p. ej.,Pseudomonas aeruginosaoStreptococcus pneumoniae).Los modelos animales de sepsis también incluyen la administración intravenosa o intraperitoneal de un agente receptor de tipo toll (TLR), tal como lipopolisacárido (LPS o endotoxina) o zimosano. Otros modelos de sepsis incluyen peritonitis por stent de colon ascendente y modelos inmunoestimuladores en etapa tardía. Para obtener más información con respecto a los modelos de sepsis, véase Assay Depot, descrito como el mercado en línea más grande del mundo para los servicios de investigación farmacéutica.

La protección contra la sepsis puede confirmarse midiendo la presión arterial, los gases sanguíneos, las mediciones de citocinas y la función del órgano secundario como se describe en otra parte de la presente memoria (p. ej., función pulmonar, hepática, cardíaca, renal).

Ejemplo de referencia 1. Protección Renal. Los datos descritos en las FIG. 1-4 y las Tablas 1-7 se recopilaron mediante el uso de los siguientes protocolos

Modelo de AKI por glicerol. Este es un modelo ampliamente usado de AKI inducida por rabdomiólisis que se ha empleado en todo el mundo durante 50 años. El modelo se usó para evaluar si las intervenciones profilácticas confieren protección contra AKI. Básicamente, el protocolo es el siguiente: Se estudiaron ratones CD-1 macho (35 45 gramos), obtenidos de Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Los ratones se mantuvieron en condiciones de vivero estándar y, generalmente, se alojaron durante 1-3 semanas antes del estudio. Los ratones se colocaron en una jaula de restricción cilíndrica, y luego se les administró una inyección de las sustancias de prueba (véase más abajo) o vehículo de sustancia de prueba en la vena de la cola. A continuación, los ratones se devolvieron a sus jaulas. Dieciocho horas (h) después, los ratones se anestesiaron brevemente mediante inhalación de isoflurano, y recibieron una inyección intramuscular de glicerol hipertónico (50 %) en una dosis de 9 ml/Kg de peso corporal. La dosis se divide en dos, con la mitad inyectada en el músculo de cada una de las extremidades traseras. A continuación, los ratones se devolvieron a sus jaulas. Dieciocho horas después, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital (50-100 mg/Kg), la cavidad abdominal se abrió mediante una incisión abdominal en la línea media, se obtuvo una muestra de sangre de la vena cava abdominal y se extirparon los riñones. Se obtuvo una sección transversal renal y se fijó en formalina para el análisis histológico posterior. Las muestras de sangre terminales se analizaron para BUN y creatinina, mediante el uso de kits de ensayo disponibles comercialmente. El tejido renal restante se sometió a disección cortical, y los tejidos corticales se extrajeron después para obtener la proteína y ARN. Las muestras de proteínas se guardaron para el análisis de los niveles de HO-1, y las muestras de ARN se sometieron a RT-PCR para cuantificar el ARNm de HO-1, así como los niveles de otros ARNm de genes de estrés (p. ej., NGAL, haptoglobina, hemopexina, hepicidina).

Preparación de prueba: Se usó músculo esquelético de caballo liofilizado (mioglobina) (Sigma Chemicals) como agente de prueba.

Mioglobina SnPP: A 5 mg de mioglobina seca se le añadieron 0,9 ml de PBS 0,1 ml de una solución madre de SnPP (50 umol/ml). Las concentraciones finales resultantes fueron 5 mg/ml de mioglobina 5 umoles/ml de SnPP. A la vena de la cola se le inyectó 200 ul de esta solución, que equivale a 1 mg de mioglobina 1 umol de SnPP.

Mioglobina nitrada: El nitrito de Na se añadió a mioglobina para lograr una relación de 1-5 mol/mol a mioglobina (p. ej., 1-5 umol de nitrito/1 umol de mioglobina). Las concentraciones finales resultantes fueron de 5-10 mg/ml de mioglobina 0,04-0,4 mg/ml de nitrito. A la vena de la cola se le inyectó 200 ul de esta solución.

Mioglobina PEG: A una solución madre de 20 mg/ml de Mgb en PBS se le añadió 100 mg/ml de PEG-6000; .250 ul. Esto se administró como una inyección subcutánea en el cuello dorsal (250 ul de inyección total). Para Mgb/PEG SnPP combinados, se añadió SnPP a la preparación anterior en una concentración de 3 mg/ml.

Estos son los materiales de prueba administrados a ratones para evaluar la protección contra el modelo AKI por glicerol, como se señaló anteriormente.

Efectos independientes de cada agente de prueba: Para evaluar si la mioglobina SnPP tuvo un efecto mayor que la mioglobina sola o SnPP sola, se crearon las mismas soluciones que las indicadas anteriormente de la siguiente manera: mioglobina SnPP; SnPP sola, o mioglobina sola. Estas se usaron en el modelo de glicerol indicado anteriormente.

Experimentos cuatro horas después de mioglobina vs. mioglobina SnPP vs. SnPP sola. Para confirmar que la mioglobina SnPP tiene un efecto sinérgico en la inducción de los niveles de ARNm de HO-1 y la proteína HO-1, cada una de las combinaciones anteriores se administró de forma individual mediante la inyección en la vena de la cola. Cuatro horas más tarde, los ratones se sacrificaron como se indicó anteriormente y los riñones se cosecharon para evaluar los niveles de ARNm y proteínas de HO-1. Para obtener información adicional con respecto a los métodos, véase Zager y col., Am J Physiol Renal Physiol. 30 de julio de 2014. Pii

Tabla 1. SnPP cuadruplica la cantidad de inducción de ARNm de HO-1 a las 4 horas después de la inyección vs. mioglobina sola (ARNm de HO-1/GAPDH)

Como se muestra en la Tabla 2, en el punto de tiempo de 4 horas, se registra un aumento preferencial en la expresión de la proteína HO-1 (por ELISA). Dado que solamente son 4 horas después de la inyección, los aumentos de ARNm son superiores a los aumentos de la proteína a medida que la síntesis de la proteína debe seguir a la inducción de ARNm, lo que requiere más tiempo.

Tabla 2. Aumento preferencial en la expresión de la proteína HO-1 (por ELISA) en el punto de tiempo de 4 h (Corteza: ng de HO-1/mg de proteína)

La Tabla 3 muestra la inducción de ARNm de HO-1 aproximadamente 18 horas (durante la noche) después de la inyección vs. mioglobina sola (ARNm de HO-1/GAPDH) vs. mioglobina en combinación con SnPP.

Tabla 3. Inducción de ARNm de HO-1 durante la noche después de la inyección con control (PBS), mioglobina sola (ARNm de HO-1/GAPDH) y mioglobina en combinación con SnPP

La Tabla 4 muestra la inducción de la proteína HO-1 aproximadamente 18 horas (durante la noche) después de la inyección de control vs. mioglobina sola (ARNm de HO-1/GAPDH) vs. mioglobina en combinación con SnPP.

Tabla 4. Inducción de proteína HO-1 durante la noche después de la inyección de control, mioglobina sola (ARNm de HO-1/GAPDH) y mioglobina en combinación con SnPP

Las FIG. 1A y 1B muestran la expresión de ARNm de HO (FIG. 1A) y la expresión de proteína (FIG. 1B) después del vehículo (control), mioglobina (Mgb) o mioglobina en combinación con la administración de SnPP (Mgb SnPP) 18 horas antes del traumatismo con glicerol. Los datos indican que existe una potenciación de la inducción de HO-1 inducida por mioglobina con el tratamiento concomitante con SnPP.

La Tabla 5 muestra la inducción de la expresión de la proteína haptoglobina después de la exposición a mioglobina sola o mioglobina en combinación con PEG en comparación con el control con vehículo. Los datos demuestran que la mioglobina PEG inducen aumentos mucho mayores en la expresión de haptoglobina citoprotectora que la mioglobina sola.

Tabla 5. Expresión de la proteína haptoglobina durante un punto de tiempo de 4 horas después de la inyección SQ Control Mioglobina sola Mioglobina PEG

9,5 ± -2,9 ng/mg de proteína 32,7 ± 6,3 ng/mg de proteína 118,8 ± 20 ng/mg de proteína

p<001 vs. control;

p<0,025 vs. mioglobina sola

La Tabla 6 muestra los niveles de LDH en plasma, un marcador sensible de lesión hepática, renal, pulmonar y cardíaca. Mioglobina SnPP no causó un aumento de LDH en el punto de tiempo de 4 horas.

Tabla 6. Mioglobina SnPP no causa un aumento de LDH en el punto de tiempo de 4 horas (Plasma: Absorbancia U LDH/ml)

Los paneles a la izquierda de la FIG. 2 muestran daño renal celular después del traumatismo con glicerol y los paneles a la derecha de la FIG. 2 muestran el efecto protector del tratamiento previo con mioglobina en combinación con SnPP.

La FIG. 3 muestra que N-Mgb SnPP eleva preferiblemente la proteína de estrés protectora, interleucina-10 (IL-10). La FIG. 4 muestra que N-Mgb SnPP eleva la proteína de estrés protectora, haptoglobina.

Ejemplo de referencia 2. Protección hepática. La lesión hepatotóxica se evaluó mediante niveles de LDH en plasma 24 horas después del traumatismo. La lesión hepática incluyó una inyección de 9 ml/kg de glicerol (este es el mismo modelo que se usa para causar lesiones renales). La lesión hepática elevó LDH en plasma de 3,5 a 114 unidades/ml. Con un tratamiento previo con mioglobina/SnPP, los niveles de LDH en plasma se redujeron en un 75 %.

Tabla 7. La lesión hepatotóxica se evaluó por niveles de LDH en plasma 24 horas después del traumatismo Sujeto N.° Control Lesión hepática Lesión hepática Mioglobina SnPP 1 3,7 4,4

2 2,1 130,1 10,4

3 3,9 69,5 20,9

4 4,1 87,5 60,2

5 128,3 38,9

6 155,4 61,3

Media3,5 114,2 32,7Error estándar 0,5 15,6 10,1

Prueba de la t no emparejada

(traumatismo /-mioglobina SnPP)<p<0,0014>

Los datos descritos en los Ejemplos 1 y 2 muestran que la hemoproteína, la hemoproteína modificada y la hemoproteína en combinación con un inhibidor de degradación de la hemoproteína protegen al riñón y al hígado de lesiones debido al traumatismo con glicerol. La protección se evidencia a través de marcadores de lesión (LDH), función orgánica (BUN y creatinina) e inducción de proteínas de estrés protectoras (HO-1 y haptoglobina).

Ejemplo de referencia 3. La FIG. 5 muestra la evaluación del impacto de unión de nitrito equimolar a Fe de mioglobina en la expresión de la toxicidad de mioglobina. Las células HK-2 (una línea celular de los túbulos proximales derivada de riñón humano normal) se incubaron en medio libre de suero de queratinocitos en condiciones normales (control) o en presencia de 10 mg/ml de mioglobina de músculo esquelético de caballo o mioglobina nitrada (producida por adición de nitrito Na equimolar a 10 mg/ml de mioglobina). Después de 18 horas de incubación, se evaluó la gravedad de la lesión celular (% de muerte celular) mediante el ensayo de MTT. La mioglobina indujo el 40 % de muerte celular (disminución del 40 % en la absorción celular de MTT), en comparación con las células incubadas de control. La unión de nitrito a mioglobina redujo la muerte celular en un 75 %. Por lo tanto, la unión de nitrito es capaz de reducir los efectos citotóxicos de la mioglobina.

La FIG. 6 muestra la relación dosis-respuesta entre la hemo oxigenasa 1 (HO-1) en plasma y la dosis de N-mioglobina administrada. A los ratones normales se les inyectó IM 0, 1, 2 o 5 mg/Kg de mioglobina nitrada SnPP (dosis constante de 1 pmol). Dieciocho horas después, se evaluaron los niveles de HO-1 en plasma mediante ELISA. Se observó una relación de dosis-respuesta pronunciada entre la dosis de N-mioglobina administrada y los niveles de HO-1 en plasma. Por lo tanto, el ensayo de HO-1 tiene una posible utilidad biomarcadora para la inducción de HO-1 inducida por N-Mgb/SnPP.

La FIG. 7 muestra el mantenimiento de los niveles de creatinina en suero normales en una variación de 25 veces en la dosis de N-mioglobina. Los ratones se sometieron a una infusión subcutánea durante 2 horas de 1, 3, 6, 12 o 25 mg/Kg de mioglobina nitrada (que contenía SnPP a una dosis constante de 1 pmol). Dieciocho horas después, se evaluó la posible lesión renal midiendo las concentraciones de creatinina en suero. No se observó un aumento significativo en ninguna de las dosis de N-Mgb, lo que indica una falta de sobretoxicidad (n, 2-4 ratones/grupo).

Ejemplo de referencia 4. Introducción. La lesión renal aguda (AKI) es un factor de riesgo bien reconocido de morbilidad, mortalidad y el inicio de la enfermedad renal crónica (CKD; Ishani y col. J Am Soc Nephrol 2009;20:223-8; Xue y col. J Am Soc Nephrol 2006;17:1135-42; Liangos y col. Clin J Am Soc Nephrol 2006;1:43-51; Wald y col. documento JAMA 2009; 302:1179-85; Goldberg y col. Kidney Int 2009;76:900-6). Sin embargo, actualmente no existen formas de prevención de AKI probadas. Ha quedado claramente establecido que después de un episodio inicial de lesión isquémica o tóxica, el riñón desarrolla una resistencia marcada al daño posterior (p. ej., Honda y col. Kidney Int 1987;31:1233-8; Zager y col. Kidney Int 1984;26:689-700; Zager y col. Lab Invest 1995;72:592-600; Zager, Kidney Int 1995;47:1336-45; Zager, Kidney Int 1995;47:628-37). Este fenómeno, que está mediado en parte por una regulación por aumento de las proteínas de “ estrés” citoprotectoras y antiinflamatorias (p. ej., hemo oxigenasa 1 (HO-1), ferritina, haptoglobina, hemopexina, alfa 1 antitripsina, interleucina 10 (IL-10) se ha denominado estado de “ preacondicionamiento isquémico” o “ citorresistencia adquirida “ . Zager y col. J Am Soc Nephrol 2014;25:998-1012; Deng y col. Kidney Int 2001;60: 2118-28; Zarjou y col. J Clin Invest 2013;123:4423-34; Nath y col. J Clin Invest 1992;90:267-70; Zager y col. Am J Physiol 2012;303:F1460-72; Fink, J Leukoc Biol 2009;86:203-4 Arredouani y col. Immunology 2005;114:263-71; Blum y col. J Am Coll Cardiol 2007; 49:82-7; Galicia y col. Eur J Immunol 2009;39:3404-12; Zager y col. Am J Physiol 2012;303:F139-48; Zager y col. PLoS One 2014;9:e9838; Hunt y Tuder, Curr Mol Med 2012;12:827-35; Janciauskiene y col. J Biol Chem 2007;282:8573-82.

Dada la profunda naturaleza protectora de la citorresistencia adquirida, los investigadores han buscado formas de recapitularla de forma segura en seres humanos. A este respecto, cabe destacar el denominado “ preacondicionamiento remoto” , por el cual se inducen los episodios recurrentes de isquemia de las extremidades superiores e inferiores inflando y desinflando de forma recurrente los manguitos de presión sanguínea. Yang y col. Am J Kidney Dis 2014;64:574-83; Mohd y col. J Surg Res 2014;186:207-16; Li y col. J Cardiothorac Surg 2013;8:43. El objetivo es liberar los “ factores de acondicionamiento” de tejidos desconocidos en la circulación sistémica que producirán respuestas protectoras del tejido (p. ej., en el cerebro, corazón, hígado y riñón). A pesar de su atractivo, este enfoque ha tenido solamente un éxito cuestionable, probablemente debido a las siguientes razones: (1) se desconocen los “ factores” liberados de las extremidades posisquémicas que podrían inducir el “ preacondicionamiento” y cuánta liberación de factores se requiere para inducir este estado; (2) no se han definido las vías celulares mediante las cuales tales factores afectan a los órganos distantes para inducir citorresistencia; y (3) es imposible determinar si el preacondicionamiento deseado realmente se desarrolla en cualquier individuo dado.

Se buscó un enfoque alternativo para inducir la citorresistencia adquirida. Para este fin, se desarrolló un régimen farmacológico que incluye mioglobina nitrada (N-Mgb) estaño protoporfirina (SnPP) en dosis bajas, que regula por aumento de manera notable y sinérgica un hospedador de citoprotectores de células tubulares renales (p. ej., HO-1, haptoglobina e IL-10) en ausencia de toxicidades renales o extrarrenales obvias. Dentro del periodo de 18 horas después de la administración del agente, tienen lugar la resistencia notable a AKI nefrótica, AKI inducida por la eliminación de adenosina trifosfato (ATP) y evolución a CKD posterior a AKI. Además, se expresa la protección hepática contra la lesión posisquémica y tóxica. Por último, se observó que la inducción de este estado citorresistente se puede medir de forma no invasiva utilizando los niveles de HO-1 y haptoglobina en plasma como “ biomarcadores” de su inducción.

Métodos. Enfoque general. Animales. Todos los experimentos se realizaron mediante el uso de ratones CD-1 macho (35-45 g; Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts). Se alojaron en condiciones de vivero estándar con acceso a alimento y agua libre. Los protocolos usados fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y el Uso de Animales (IACUC) del Instituto según las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.

Reactivos inductores de citorresistencia. Se usó músculo esquelético de caballo (#Mb0360; Sigma) como el agente inductor de la citorresistencia principal. Sin embargo, debido a que la mioglobina (Mgb) tiene un potencial nefrotóxico inherente (particularmente en condiciones de agotamiento del volumen y aciduria), se usaron dos enfoques para mitigar los posibles efectos adversos de Mgb. En primer lugar, la Mgb se convirtió en una forma nitrada mediante la adición de una cantidad equimolar de nitrito de sodio (Na). A este respecto, el nitrito es una molécula ambidentada que se une directamente 1:1 a Fe de mioglobina ya sea a través de su componente de oxígeno o nitrógeno. Cotton y col. Advanced inorganic chemistry. Hobocen, NJ: Wiley-Interscience, 1999:1355; Silaghi-Dumirescatu y col, Nitric Oxide 2014; 42C:32-9. Cabe destacar que el Fe es el mediador dominante del efecto citotóxico de Mgb, (Zager y col. J Clin Invest 1992;89:989-95; Zager y Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38) y esta toxicidad se reduce sustancialmente mediante la unión previa a nitrito. Rassaf y col. Circ Res 2014;114:1601-10; Totzeck y col. Circulation 2012;126:325-34 [J Clin Invest 1992;89: 989-95]; Totzeck y col. PLoS One 2014;22:e105951; Hendgen-Cotta y col. Proc Natl Acad Sci US A 2008;105:10256-61.

Además de su capacidad para disminuir la toxicidad mediada por Fe, el nitrito ha estado implicado como un mediador del “ preacondicionamiento remoto” , posiblemente a través de la generación de óxido nítrico (NO). Rasaf, supra. En este sentido, las hemoproteínas reducen directamente el nitrito, con la producción resultante de<n>O. Juncos y col. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kellerman, J Clin Invest 1993;92:1940-9; Zager y col. Am J Physiol 2008;294:F187-97. Por lo tanto, mediante la unión del nitrito directamente a Mgb, la inyección de Mgb con posterior absorción endocítica del túbulo proximal da como resultado un direccionamiento directo de NO y nitrito en los túbulos proximales .

En segundo lugar, para que hemo Fe induzca la mayor parte de su citotoxicidad, primero debe liberarse de su sitio de secuestración dentro del anillo de porfirina. Esta liberación de Fe está mediada por la escisión del anillo de porfirina a través de HO-1. Por consiguiente, para atenuar la posible citotoxicidad de Mgb, se administró junto con un inhibidor de HO-1 transitorio, SnPP. A este respecto, se ha informado previamente que la adición de SnPP a células tubulares proximales cultivadas expuestas a Mgb (HK-2) o a segmentos de túbulos proximales de ratón cargados con hemoin vivoreduce la toxicidad de Mgb hasta un 85 %. Zager y Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38. Esta acción citoprotectora está indicada además mediante observaciones de que SnPP puede mitigar la insuficiencia renal aguda posisquémica (ARF). Juncos y col. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kaizu y col. Kidney Int 2003;63:1393-403.

Impacto de Mgb, SnPP y Mgb 1 SnPP en la señalización de hemo cortical renal. Se postuló que (1) N-Mgb sería una molécula de señalización potente, lo que genera la regulación por aumento del elemento que responde a hemo y los genes sensibles a redox, que provocan actividades citoprotectoras (p. ej., HO-1, haptoglobina, hemopexina e IL-10); (2) SnPP puede regular por aumento dichos genes de forma independiente; y (3) cuando se administran en conjunto, la coadministración de N-Mgb SnPP puede generar una señalización aditiva o sinérgica del elemento sensible a hemo. El siguiente experimento analizó estas hipótesis.

Treinta y dos ratones se dividieron en 4 grupos iguales: (1) ratones de control; (2) ratones tratados con inyección de 1 mg de N-Mgb (como un bolo a través de la vena de la cola); (3) ratones tratados con 1 mmol de SnPP (a través de la vena de la cola); y (4) ratones tratados con combinación de N-Mgb 1 SnPP. Después de 4 horas (n = 16) o 18 horas (n = 16), los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital (50 mg/kg), se abrió el abdomen mediante una incisión abdominal en la línea media y se extirparon los riñones. Para determinar los posibles efectos sobre los órganos extrarrenales, también se extirpó un lóbulo hepático y el corazón. Los tejidos se colocaron en hielo y luego se extrajeron para obtener la proteína y el ARN (RNeasy Plus Mini; Qiagen, Valencia, California) y se sometieron a ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y a reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para obtener ARN mensajero (ARNm) y proteína HO-1, haptoglobina e IL-10. Zager y col. J Am Soc Nephrol 2014;25:998-1012; Zager y col. Am J Physiol 2012;303:F139-48; Como evaluación de la función renal, a los ratones de control y a los ratones tratados con N-Mgb SnPP 18 horas después se les midió los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina en plasma. Adicionalmente, se cortaron secciones de riñón fijadas con formalina al 10 % (3 mM) y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) y ácido periódico Schiff (PAS) para evaluar aún más la posible lesión.

Evaluaciones de la citorresistencia. Modelo de AKI inducida por rabdomiólisis con glicerol. Veinte ratones se dividieron en 4 grupos iguales (controles, ratones tratados con N-Mgb, SnPP y ratones tratados con inyecciones de N-Mgb SnPP en la vena de la cola) como se describió anteriormente. 18 horas después, los ratones se anestesiaron brevemente con isoflurano y se les inyectó inmediatamente 9 ml/kg de glicerol al 50 %, administrados en dosis igualmente divididas en cada extremidad posterior. A las 18 horas después de la inyección de glicerol, los ratones se anestesiaron con pentobarbital, se abrió el abdomen, se obtuvo una muestra de sangre para evaluaciones de BUN y creatinina de la vena cava y se extrajeron los riñones. El grupo de control posglicerol y el grupo de glicerol pretratado con N-Mgb SnPP tenían secciones de riñón teñidas con H y E.

Modelo de AKI con maleato. Cuando se inyecta en roedores, el maleato experimenta una absorción selectiva de los túbulos proximales mediante transportadores de aniones orgánicos e induce una disminución profunda de ATP específica de túbulos proximales. Kellerman, J Clin Invest 1993;92:1940-9; Zager y col. Am J Physiol 2008;294:F187-97. Esto culmina en AKI grave. El siguiente experimento evaluó si el pretratamiento con N-Mgb SnPP puede proteger contra esta forma de daño renal. Se dividieron doce ratones en 2 grupos iguales, que recibieron inyección de N-Mgb-SnPP o vehículo. Dieciocho horas después, todos recibieron una inyección intraperitoneal (IP) de maleato de Na (600 mg/kg). Zager y col. Am J Physiol 2008;294:F187-97. 18 horas después, los ratones se anestesiaron y se obtuvieron muestras de sangre terminal de la vena cava inferior para las mediciones de BUN y creatinina.

Evaluación de AKI posisquémica a CKD. Después de 30 minutos de isquemia renal unilateral, el riñón dañado experimenta una transición a CKD, que se manifiesta por pérdida tubular progresiva, inflamación intersticial y fibrosis, culminando en un 40 % de pérdida de masa renal (peso renal). Zager y col. Am J Physiol 2011;301:F1334-45; Zager y col. Kidney Int 2013;84:703-12. Para determinar si el tratamiento con N-Mgb-SnPP podría mitigar la evolución de la enfermedad posisquémica, se pretrataron 6 ratones con estos agentes y 18 horas después se anestesiaron con pentobarbital y se sometieron a 30 minutos de oclusión de pedicular renal izquierda realizada mediante una incisión abdominal en la línea media a una temperatura corporal de 37 °C.

El riñón derecho se mantuvo intacto. Después del período de isquemia renal, se retiró la pinza vascular y se confirmó la reperfusión completa mediante la pérdida de cianosis renal. A continuación, los ratones recibieron sutura y se dejó que se recuperaran de la anestesia. Seis ratones, sometidos al mismo protocolo quirúrgico, pero sin pretratamiento con N-Mgb-SnPP, sirvieron como controles. Dos semanas después, se volvió a abrir la incisión abdominal y se extrajeron los riñones. El grado relativo de lesión renal entre los 2 grupos se evaluó mediante la pérdida de masa renal izquierda (según lo determinado por el peso húmedo renal) frente al peso de los riñones izquierdo de 6 ratones normales. Los niveles de ARNm y proteína de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) cortical renal también se evaluaron como marcadores adicionales de daño renal.

Relaciones dosis-respuesta después de inyecciones IP de N-Mgb-SnPP. Para evaluar si una velocidad de administración más lenta de N-Mgb-SnPP (frente a la inyección intravenosa [IV] en bolo) también induce una regulación por aumento de proteínas citoprotectoras y la citorresistencia renal, a los ratones se les inyectó 0, 1, 2,5 o 5 mg de N-Mgb 1 de la dosis estándar de SnPP (1 mmol) (3 ratones; 1 ml de vehículo de solución salina). Dieciocho horas después, los ratones se anestesiaron con pentobarbital, se obtuvo una muestra de sangre y se extirparon los riñones para determinar los niveles de ARNm y proteína HO-1 y haptoglobina. Para evaluar si los niveles de HO-1 y haptoglobina en plasma aumentaron y reflejaron grados de la regulación por aumento de HO-1 y haptoglobina renal, también se determinaron los niveles de HO-1 y haptoglobina en plasma.

Para evaluar si los niveles de HO-1 y haptoglobina en plasma y riñón previamente determinados tienen una correlacionaron con los grados de citorresistencia, otros ratones recibieron una inyección de 0, 2,5 o 5 mg de N-Mgb 1 mmol de SnPP (n = 3 ratones por grupo). Dieciocho horas después, todos los ratones se sometieron al modelo AKI con glicerol como se describió anteriormente. Se determinó la gravedad de la AKI 18 horas después de la inyección de glicerol mediante análisis de BUN y creatinina en plasma.

Experimentos de isquemia hepática. Catorce ratones se sometieron al modelo de isquemia hepática parcial publicado previamente, que se realiza ocluyendo el flujo sanguíneo (en la tríada portal) a 3 de 5 lóbulos hepáticos durante 25 minutos. Zager y col. Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856-68. La mitad de los ratones se pretrataron 18 horas antes con 1 mg de N-Mgb 1 mmol de SnPP como se describió anteriormente. La reperfusión después del período isquémico se evaluó mediante la restauración del color hepático normal en los 3 lóbulos hepáticos implicados. Dieciocho horas después, los ratones se volvieron a anestesiar, la cavidad abdominal se volvió a abrir, y se obtuvo una muestra de sangre terminal para determinar los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y lactato deshidrogenasa (LDH) en plasma como marcadores de daño hepático posisquémico.

Lesión hepatotóxica. Para evaluar si N-Mgb-SnPP puede proteger contra una forma tóxica de lesión hepática, 12 ratones anestesiados recibieron inyecciones de glicerol al 50 %. El glicerol (8 mg/kg) se administró mediante una inyección IP para favorecer la absorción hepatocelular a través de la circulación portal. La mitad de los ratones se habían tratado previamente 18 horas antes con N-Mgb-SnPP (1 mg de Mgb/1 mmol de SnPP) como se describió anteriormente. Cuatro horas después de la inyección de glicerol IP, cuando los ratones todavía aún estaban anestesiados, fueron sacrificados mediante corte transversal de la vena cava abdominal. El grado de lesión hepática aguda se midió mediante concentraciones de ALT en plasma.

Cálculos y estadísticas. Todos los valores se dan como el error estándar promedio 6 de la media. Se realizaron comparaciones estadísticas mediante la prueba de la t de Student no emparejada. Si se realizaron múltiples comparaciones, se aplicó la corrección de Bonferroni. La gravedad de la lesión histológica renal en el modelo AKI con glicerol se calificó en una escala de 11 a 41 (de menor a mayor necrosis tubular y formación de cilindros observada). Los resultados histológicos se compararon mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. La significación estadística se tomó como un valor P de < 0,05

Resultados Función Renal e histología después de la inyección IV de N-Mgb SnPP. No se observaron aumentos de BUN ni de creatinina en plasma a las 18 horas después de la inyección IV de 1 mg de N-Mgb SnPP (BUN, 22 ± 3 frente a 25 ± 3 mg/dl; creatinina, 0,32 ± 0,03 frente a 0,30 ± 0,04 mg/dl; controles frente al tratamiento con Mgb/SnPP, respectivamente). Es más, no hubo evidencia de lesión morfológica renal como lo demuestra la tinción con PAS o H y E. En particular, no se observaron indicios de necrosis tubular o formación de cilindros de hemo en el grupo de tratamiento (véase la FIG. 8). Las microvellosidades tubulares proximales, como se representa por tinción con PAS, permanecieron completamente intactas (2 paneles superiores). En este sentido, se considera que la formación de vesículas y la dilatación de las microvellosidades en lúmenes de túbulos proximales son marcadores de luz microscópica altamente sensibles del daño tubular. Venkatachalam y col. Kidney Int 1978; 14:31-49; Donohoe y col. Kidney Int 1978;13:208-22. Por lo tanto, estos datos indicaron que el tratamiento con N-Mgb-SnPP IV fue bien tolerado por el riñón.

Impacto de N-Mgb y SnPP IV, individualmente y en combinación en las expresiones de HO-1, IL-10 y haptoglobina. Evaluaciones de HO-1 renal. Como se muestra en la FIG. 9, panel izquierdo, N-Mgb sola y SnPP sola provocaron solamente aumentos modestos en los niveles de ARNm de HO-1 a las 4 horas. Por el contrario, se observó un aumento de 20 veces en el ARNm de HO-1 a las 4 horas después de la inyección de N-Mgb SnPP combinadas. A las 18 horas después del tratamiento, estos aumentos de ARNm aumentan se tradujeron en aumentos notorios de la proteína HO-1, siendo 7 veces mayor que los valores de control. Por el contrario, solo se observaron aumentos de proteína HO-1 relativamente pequeños con N-Mgb sola o SnPP sola en el punto de tiempo de 18 horas. Para resumir, estos aumentos de ARNm a las 4 horas y proteína HO-1 a las 18 horas indican un efecto sinérgico de N-Mgb SnPP en la expresión génica de HO-1 cortical renal. (Se presentan datos adicionales de ARNm [18 horas] y proteína HO-1 [4 horas] en la Tabla 8).

Tabla 8. Valores de ARNm y proteína renal a las 4 h (a) y a las 18 h (b) después del tratamiento Rx Sustancia medida Control N-Mgb SnPP SnPP 1 N-Mgb

(a) 4 h después del tratamiento Rx

ARNm de riñón

HO-1 0,61 ± 0,1; 3,38 ± 0,38 4,38 ± 0,28 10,5 ± 1,23(<0,0001) Haptoglobina 0,20 ± 0,06 1,94 ± 0,31 0,19 ± 0,01 5,45 ± 1,16 (<0,005) IL-10 0,56 ± 0,20 1,45 ± 0,6 0,39 ± 0,15 5,18 ± 1,23 (<0,005) Proteína HO-1 13,3 ± 1,3 36,1 ± 2,9 22,9 ± 2,6 55,5 ± 3,7 (<0,001) Haptoglobina 7,9 ± 1,9 17,6 ± 1 13,1 ± 1,3 18,9 ± 2,7 (<0,001) IL-10 304 ± 29 265 ± 54 550 ± 86 838 ± 63 (<0,001) (b) 18 h después del tratamiento Rx

ARNm de corteza renal

HO-1 0,61 ± 0,1; 0,58 ± 0,18 0,63 ± 0,06 1,45 ± 0,61 (NS) Haptoglobina 0,20 ± 0,06 0,24 ± 0,04 0,23 ± 0,08 0,4 ± 0,19 (NS)

IL-10 0,56 ± 0,20 0,43 ± 0,10 0,18 ± 0,09 0,57 ± 0,13 (NS) Proteína renal

HO-1 13,3 ± 1,3 30 ± 6 18 ± 2 71 ± 10 (<0,001) Haptoglobina 10,3 ± 2,7 183,8 ± 20,4 53,5 ± 17,2 203 ± 8 (<0,0001) IL-10 304 ± 29 292 ± 54 454 ± 51 840 ± 60 (<0,001) Abreviaturas HO-1, hemo oxigenasa 1; IL-10, interleucina 10; ARNm, ARN mensajero; N-Mgb, mioglobina nitrada; NS, no significativo; Rx, tratamiento; SnPP, estaño protoporfirina. Niveles individuales de proteína y ARNm cortical renal inducidos por los agentes de prueba administrados solos o en combinación a las 4 h (a) y 18 h (b) después de la inyección.

Evaluaciones de IL-10 renal. Como se muestra en la FIG. 10, panel izquierdo, N-Mgb sola y SnPP sola tuvieron un impacto mínimo o un impacto nulo en los niveles de ARNm de IL-10 en el punto de tiempo de 4 horas. Por el contrario, N-Mgb SnPP combinadas causó un aumento de ARNm de IL-10 de 10 veces a las 4 horas después de la inyección. En correspondencia con estos resultados, se registró una ausencia de aumento de la proteína IL-10 a las 18 horas después de la inyección de N-Mgb sola o de SnPP sola. Por el contrario, se observó un aumento de >2 veces en la proteína IL-10 a las 18 horas después de la inyección de N-Mgb-SnPP combinadas. (Se presentan datos adicionales de ARNm de IL-10 [18 horas] y proteína [4 horas] en la Tabla 8).

Evaluaciones de haptoglobina cortical renal. Al igual que con HO-1 e IL-10, la combinación de N-Mgb SnPP indujo los mayores aumentos de ARNm de haptoglobina a las 4 horas después de la inyección del agente (FIG. 11). A las 18 horas después de las inyecciones, se observó un aumento masivo (20 veces) en los niveles de proteína haptoglobina cortical renal en respuesta a la inyección de N-Mgb-SnPP. Sin embargo, los niveles de proteína haptoglobina aumentaron de manera comparable con N-Mgb sola en el punto de tiempo de 18 horas. Esto implica que era el componente N-Mgb de la terapia combinada el que impulsó los aumentos de la proteína haptoglobina a las 18 horas. (Dado este aumento masivo, es posible que no pueda inducirse ningún aumento añadido por la terapia de combinación). Se presentan datos adicionales de ARNm (18 horas) y proteína (4 horas) haptoglobina en la Tabla 8.

Impacto de N-Mgb sola, SnPP sola y N-Mgb SnPP IV en la gravedad del modelo AKI con glicerol. Como se muestra en la FIG. 12, el pretratamiento con SnPP sola prácticamente no tuvo ningún efecto en la gravedad de la AKI inducida por glicerol. N-Mgb sola indujo una protección leve según lo evaluado por los niveles de BUN/creatinina. Sin embargo, cuando se usaron N-Mgb SnPP en conjunto, se observó una protección funcional completa (los niveles de BUN/creatinina permanecieron en valores normales). También se observó una protección histológica coincidente (puntuaciones histológicas de 3,5 ± 0,25 vs 1,25 ± 0,25 para el grupo tratado con glicerol frente a N-Mgb SnPP P < 0,05). A este respecto, el grupo de glicerol no tratado manifestó necrosis tubular generalizada y formación de cilindros, como se ha representado anteriormente. Zager y col. Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856-68. Estos cambios prácticamente estaban ausentes en el grupo de pretratamiento con N-Mgb SnPP.

Modelo de AKI con maleato. Como se representa en la FIG. 13, la inyección de maleato causó una lesión renal grave, como se indica con aumentos marcados de BUN/creatinina. El pretratamiento con N-Mgb SnPP confirió una protección casi completa contra esta lesión como se indica con niveles casi normales de BUN/creatinina.

La FIG. 14 muestra que la cardiotoxicidad inducida por maleato se reduce mediante un pretratamiento con N-Mgb SnPP. Los ratones se trataron con una inyección de 1 mg/Kg de N-mioglobina 1 |jmol de SnPP o vehículo IV). Dieciocho horas después, se les administró IP 800 mg/Kg de maleato. El grado de lesión miocárdica se determinó 18 horas después de la inyección de maleato midiendo las concentraciones de troponina I en plasma (por ELISA). La inyección de maleato causó un aumento de 10 veces en los niveles de troponina en plasma. El pretratamiento con N-Mgb+SnPP redujo el aumento de troponina inducido por maleato en un 75 %.

Modelo de AKI posisquémica. A las 2 semanas después de la isquemia, se observó una reducción del 38 % en la masa renal izquierda posisquemia en los ratones con isquemia unilateral de control (FIG. 15). Por el contrario, sólo se observó una reducción del 12 % en los ratones que habían recibido el tratamiento profiláctico con N-Mgb SnPP (P < 0,005). Esta reducción en la lesión renal también se ilustró mediante reducciones marcadas en los niveles de ARNm y proteína NGAL en el grupo de pretratamiento con N-Mgb- SnPP (FIG. 15).

Relaciones de dosis-respuesta entre niveles de HO-1/haptoglobina cortical renal y en plasma y grados de protección contra AKI inducida por glicerol. Como se muestra en la FIG. 16, los aumentos progresivos en las dosificaciones de N-Mgb IP en ratones normales produjeron aumentos progresivos en los niveles de HO-1 y haptoglobina cortical renal y en plasma. Se observaron correlaciones significativas entre los niveles de HO-1 y haptoglobina cortical renal y en plasma (por ejemplo, r = 0,82 entre los niveles de haptoglobina cortical renal y en plasma). Es más, estas dosis crecientes de N-Mgb se asociaron con la protección progresiva (50 %; 100 %) contra el modelo AKI con glicerol (FIG. 17). Por lo tanto, estos datos implican que el grado de aumento de HO-1 o haptoglobina en plasma puede servir como biomarcadores de la inducción génica renal inducida por N-Mgb-SnPP y los grados de resistencia a ARF posterior. A pesar de administrar 5 mg de N-Mgb (dosis de SnPP estándar), no se observaron pruebas de lesión renal (BUN, creatinina normales; véase la FIG. 17, panel derecho).

Evaluaciones hepáticas. Expresiones de HO-1, IL-10 y haptoglobina hepática en el hígado en respuesta a las inyecciones de N-Mgb/SnPP. Los aumentos múltiplos con respecto a los valores de control para los niveles de ARNm (4 horas) y proteína (18 horas) de HO-1, IL-10 y haptoglobina, se representan en la FIG. 18, paneles superiores. Se observaron aumentos marcados en cada uno. Los valores individuales para cada agente individualmente o en combinación se dan en la Tabla 9.

Tabla 9. Niveles de ARNm y proteína en el hígado 4 h (a) y 18 h (b) después del tratamiento Rx

Sustancia medida Control N-Mgb SnPP SnPP 1 N-Mgb

(a) 4 h después del tratamiento Rx

ARNm hepático

HO-1 1,1 ± 0,12 1,83 ± 0,33 3,15 ± 0,25 5,66 ± 0,29 (<0,001) Haptoglobina 0,5 ± 0,1 0,98 ± 0,1 0,32 ± 0,02 1,01 ± 0,12 (<0,01) IL-10 0,06 ± 0,002 0,67 ± 0,46 0,14 ± 0,1 1.12 ± 0,64 (<0,001) Proteína hepática

Proteína HO-1 10,2 ± 1,2 17 ± 2 7,4 ± 0,7 15,1 ± 1,4 (<0,025) Haptoglobina 115,3 ± 9,6 359,5 ± 39,6 130,0 ± 8,9 351,0 ± 40,7 (<0.001) IL-10 314 ± 36 286 ± 32 485 ± 47 412 ± 34 (=0,1) (b) 18 h después del tratamiento Rx

ARNm hepático

HO-1 1,1 ± 0,12 0,82 ± 0,07 2,56 ± 0,21 2,86 ± 0,4 (<0,001) Haptoglobina 0,5 ± 0,1 0,91 ± 0,07 0,65 ± 0,17 1,19 ± 0,4 (<0,05) IL-10 0,06 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,06 ± 0,02 (NS) Proteína hepática

Proteína HO-1 10,2 ± 1,2 14,9 ± 0,3 18 ± 2,5 22,9 ± 1,2 (<0,0001) Haptoglobina 115,3 ± 9,6 358,8 ± 32,8 212,0 ± 63,6 410 ± 64,3 (<0,001) IL-10 314 ± 36 5988 ± 549 8198 ± 725 8015 ± 225 (<0,001) Abreviaturas HO-1, hemo oxigenasa 1; IL-10, interleucina 10; ARNm, ARN mensajero; N-Mgb, mioglobina nitrada; NS, no significativo; Rx, tratamiento; SnPP, estaño protoporfirina. Niveles individuales de ARNm y proteína en el hígado inducidos por los agentes de prueba administrados individualmente o en combinación a las 4 h (a) y 18 h (b) después de la inyección.

A las 4 horas después de la inyección, los niveles de ARNm HO-1, IL-10 y haptoglobina hepática fueron significativamente mayores con la inyección de N-Mgb SnPP combinadas frente a cualquier agente solo (Tabla 9). Esto se tradujo en mayores aumentos de proteína HO-1, IL-10, y haptoglobina, según se evalúa en el punto de tiempo de 18 horas (P < 0,001 para cada proteína frente a tejidos de control).

Modelo isquémico hepático. La isquemia hepática indujo aumentos marcados en las concentraciones de ALT y LDH en plasma (véase la FIG. 19). Los aumentos de LDH y ALT se redujeron en un 75 % y un 50 %, respectivamente, con un pretratamiento con N-Mgb SnPP (correspondiente a los aumentos de proteína HO-1, haptoglobina e IL-10 hepática; Tabla 9). Como se muestra en la FIG. 20 (parte superior), se observó necrosis generalizada en secciones macroscópicas del hígado posisquémico. El pretratamiento con N-Mgb SnPP condujo a una apariencia hepática total mucho más normal (FIG. 20 (parte inferior)).

Lesión hepatotóxica. Como se muestra en el panel derecho de la FIG. 19, el tratamiento con N-Mgb SnPP también redujo el grado de lesión hepática inducida por glicerol IP según lo evaluado por los niveles de ALT en plasma.

Niveles de ARNm y proteína HO-1, IL-10 y haptoglobina cardíaca. Como se muestra en la parte inferior de la FIG.

18, N-Mgb SnPP combinadas indujeron aumentos de 3 a 4 veces en ARNm de HO-1, haptoglobina e IL-10 a las 4 horas, y aumentos de hasta 3 a 15 veces en sus niveles de proteína en el punto de tiempo de 18 horas. Los valores individuales se dan en la Tabla 10.

Tabla 10. Niveles de ARNm y proteína cardíaca 4 h (a) y 18 h (b) después del tratamiento Rx

Sustancia medida Control N-Mgb SnPP SnPP N-Mgb

(a) 4 h después del tratamiento Rx

ARNm cardíaco

HO-1 0,07 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,14 ± 0,01 0,3 ± 0,01 (<0,001) Haptoglobina 0,31 ± 0,07 0,75 ± 0,10 0,52 ± 0,21 1,32 ± 0,22 (<0,002) IL-10 0,36 ± 0,10 0,86 ± 0,11 0,58 ± 0,16 0,96 ± 0,22 (<0,04) Proteína cardíaca

HO-1 1,50 ± 08 1,64 ± 0,19 1,310,13 1,54 ± 0,09 (NS) Haptoglobina 15,6 ± 5,0 40,4 ± 8,6 19,1 ± 2,1 29,4 ± 4,1 (<0,1) IL-10 8,1 ± 5 21 ± 12 15,8 ± 10 41 ± 14 (<0,035) (b) 18 h después del tratamiento Rx

ARNm cardíaco

HO-1 0,07 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,09 ± 0,03 0,24 ± 0,07 (<0,005) Haptoglobina 0,31 ± 0,07 0,53 ± 0,21 0,59 ± 0,17 1,28 ± 0,2 (<0,002) IL-10 0,36 ± 0,10 0,67 ± 0,10 0,53 ± 0,10 0,64 ± 0,14 (=0,1) Proteína cardíaca

HO-1 1,5 ± 0,08 1,97 ± 0,37 2,67 ± 0,4 4,2 ± 0,98 (<0,01) Haptoglobina 15,6 ± 5,0 249,6 ± 15,0 96,1 ± 36,2 250,7 ± 37,8 (<0,001) L-10 8 ± 5 14,5 ± 10 23,4 ± 14 51,4 ± 19 (<0,035) Abreviaturas HO-1, hemo oxigenasa 1; IL-10, interleucina 10; ARNm, ARN mensajero; N-Mgb, mioglobina nitrada; NS, no significativo; Rx, tratamiento; SnPP, estaño protoporfirina. Niveles individuales de ARNm y proteína cardíaca inducidos por los agentes de prueba administrados solos o en combinación a las 4 h (a) y 18 h (b) después de la inyección.

En general, se observaron aumentos de ARNm y proteína mucho mayores con la administración combinada de agentes frente a cualquier agente solo.

Discusión. En 1992, Nath y col. (J Clin Invest 90:267-70) demostraron que la administración con hemoglobina en la rata puede inducir una marcada protección contra la ARF inducida por rabdomiólisis mediada por glicerol posterior (24 horas después). Esta respuesta protectora se atribuyó a la regulación por aumento de HO-1 mediada por hemo, basándose en 2 observaciones: (1) el pretratamiento con hemo aumentó notablemente los niveles de ARNm y proteína HO-1 renal, así como la actividad enzimática HO-1, y (2) el modelo de glicerol empeoró notablemente mediante la administración del potente inhibidor de HO-1, SnPP, en el momento (y después) de la inyección de glicerol. Desde el momento en que se realizaron estas observaciones transcendentales, se ha establecido bien el papel de HO-1 como una potente molécula antioxidante y antiinflamatoria en múltiples modelos de AKI (p. ej., cisplatino, isquemia renal, endotoxemia; revisado en Nath, Curr Opin Nephrol Hypertens 2014;23:17-24). Es más, sus efectos protectores se han descrito ampliamente en diversas formas de daño de tejido extrarrenal (p. ej., trasplante de cerebro, hígado, corazón, órganos). Kusmic y col. J Transl Med 2014;12:89; Czibik y col. Basic Res Cardiol 2014;109:450; Sharp y col. Transl Stroke Res 2013;6:685-92; Le y col. CNS Neurosci Ther 2013;12:963-8; Huang y col. World J Gastroenterol 2013;21:2937-48; Liu y col. Crit Care Med 2014; 42:e762-71; Wszola y col. Prog Transplant 2014;1: 19-26. Sin embargo, menos preciso que la existencia de acciones de protección de HO es el mecanismo exacto por el cual se ve afectada esa protección. Debido a que la escisión de HO-1 del anillo de porfirina libera Fe catalítico altamente tóxico (que produce efectos adversos directos; Zager y Burkhart, Kidney Int 1997;51:72 8-38) se cree ahora que hay consecuencias secundarias de una mayor actividad de HO-1. Estas incluyen la generación de los antioxidantes biliverdina y bilirrubina, producción de monóxido de carbono citoprotector y aumento de los niveles de ferritina en el tejido (H), con su gran capacidad de unión a Fe catalítico. Zarjou y col. J Clin Invest 2013;123:4423-34; Nath, Curr Opin Nephrol Hypertens 2014;23:17-24. La complejidad adicional para interpretar la participación de HO-1 en la citoprotección surge del hecho de que los inductores de HO-1 (p. ej., hemo) también regulan por aumento varias otras vías citoprotectoras, por ejemplo, haptoglobina (Zager y col. Am J Physiol 2012;303:F139-48), hemopexina (Zager y col. Am J Physiol 2012;303:F1460-72) alfa 1 antitripsina (Zager y col. PLoS One 2014;9:e9838) e IL-10 (como se muestra en la presente descripción). Esto complica la interpretación de los efectos de HO-1 sobre la lesión tisular dada la presencia de múltiples proteínas protectoras de tejido reguladas por aumento.

La interacción de SnPP y HO-1 también es compleja. En primer lugar, como un inhibidor competitivo de HO-1, la administración de SnPP de manera secundaria puede aumentar los niveles de ARNm y proteína HO-1, ya sea por “ inhibición por retroalimentación” enzimática o por la inducción de un estado prooxidante leve con la producción de HO-1 de compensación (p. ej., Kaizu y col. Kidney Int 2003;63:1393-403). En segundo lugar, el resto Sn de SnPP puede regular por aumento de manera independiente HO-1 mediante efectos prooxidantes directos. Barrera-Oviedo y col. Ren Fail 2013;35:132-7. En tercer lugar, siempre que se considere los efectos de SnPP, es importante reconocer que la inducción de HO-1 secundaria podría compensarse posiblemente por la inhibición de HO-1 inducida por SNPP. Sin embargo, cabe señalar que SnPP tiene una semivida relativamente corta (2-4 horas; Berglund y col. Hepatology 1988;8:625-31). Por lo tanto, el retraso del aumento de HO-1 (p. ej., 18 horas después de la administración de glicerol o el tratamiento con N-Mgb-SnPP) debe ser libre para provocar sus efectos biológicos debido a la eliminación previa de SnPP. Este concepto está respaldado por las observaciones de que a las 24 horas después de la administración de SnPP, la HO-1 regulada por aumento fue capaz de provocar un efecto citoprotector (p. ej., contra ARF isquémica; Juncos y col. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kaizu y col. Kidney Int 2003;63:1393-403).

A tenor de las consideraciones mencionadas anteriormente, se planteó la hipótesis de que una combinación de N-Mgb SnPP podría inducir aumentos aditivos o sinérgicos en HO-1 y en otras proteínas citoprotectoras sensibles a redox (p. ej., haptoglobina e IL-10). Esta hipótesis se analizó midiendo los niveles de ARNm y proteína HO-1, haptoglobina e IL-10 a las 4 y 18 horas después de la inyección de N-Mgb, SnPP o N-Mgb SnPP. Como se muestra en las FIG. 7-9, la terapia combinada generalmente indujo respuestas sinérgicas o aditivas. Por ejemplo, a las 4 horas después de la inyección, se observó un aumento de 20 veces en el ARNm de HO-1, lo que no solamente duplica los aumentos observados con N-Mgb o SnPP solas. A las 18 horas, este aumento del ARNm temprano se traduce en aumentos de proteína HO-1 de 7 veces. Se observaron resultados cualitativamente similares con IL-10. Particularmente notable fue un aumento masivo (20 veces) en la proteína haptoglobina a las 18 horas después de la administración de N-Mgb-SnPP. Sin embargo, en este caso, parece que era N-Mgb en lugar de una interacción de N-Mgb-SnPP la responsable en gran parte dado que N-Mgb sola frente a N-Mgb SnPP aumenta indujo aumentos de haptoglobina renal comparable. Claramente, proteínas sensibles a redox citoprotectoras adicionales, distintas de HO-1, IL-10 y haptoglobina, también pueden haber sido inducidas por el protocolo de N-Mgb-SnPP (p. ej., a1 antitripsina, hemopexina, hepcidina). Por lo tanto, parece lógico que las múltiples proteínas citoprotectoras podrían actuar en concierto para mitigar las respuestas de lesiones celulares.

Habiendo observado aumentos corticales renales drásticos en proteínas citoprotectoras después de la administración de N-Mgb-SnPP, se evaluó la eficacia de esta última para la protección contra 3 formas de AKI. La FIG. 12 representa los resultados en el modelo de glicerol. Como se muestra, la administración de SnPP sola no indujo reducciones significativas en los niveles de BUN o creatinina. Cuando se administró N-Mgb sola, se observó un efecto protector leve. Sin embargo, cuando se administran conjuntamente, el pretratamiento con N-Mgb SnPP provocó una protección funcional esencialmente completa como lo indica las concentraciones normales de BUN y creatinina en plasma a las 18 horas después de la inyección de glicerol. Por otra parte, se observó histología renal casi normal. Por lo tanto, estos hallazgos subrayan el principio de que los aumentos sinérgicos en las proteínas citoprotectoras pueden traducirse en una protección sinérgica contra ARF.

Para explorar más el alcance de la protección mediada por N-Mgb-SnPP, se usó el modelo de del ARF mediada por disminución de ATP tubular proximal con maleato. De nuevo, se observó una protección drástica o casi completa (FIG. 13). Debido a que ahora se reconoce bien que la AKI puede iniciar el comienzo de la enfermedad renal crónica progresiva, se valuó si el pretratamiento con N-Mgb-SnPP podría anular este proceso en un modelo de lesión renal posisquémica unilateral publicado previamente (Zager y col. Kidney Int 2013;84:703-12; Zager y col. Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856-68) en el que una pérdida del 40 % de la masa renal normalmente tiene lugar a las 2 semanas. Como se muestra en la FIG. 15, la lesión posisquémica se atenuó notablemente con el pretratamiento con N-Mgb-SnPP como lo demuestra una reducción en la pérdida de masa renal del 38 % al 12 %, y las reducciones marcadas en los niveles de ARNm y proteína NGAL. Por lo tanto, en cada uno de los 3 modelos de AKI heterogéneos, se observó una protección drástica. Aunque el riñón tiene la mayor exposición a los 2 agentes de prueba (p. ej., mediante filtración rápida, endocitosis de Mgb), prácticamente todas las células están expuestas transitoriamente a estos después de su inyección IV. Es más, las protoporfirinas pueden unirse a y ser absorbidas por una variedad de células. Anderson y col. J Pharmacol Exp Ther 1984;228:327-33. Por lo tanto, se cuestionó si el régimen de N-Mgb-SnPP descrito podría regular por aumento también las respuestas protectoras en los órganos extrarrenales. De hecho, este fue el caso, dado que tanto los tejidos hepáticos como cardíacos manifestaron aumentos de ARNm y proteína HO-1, IL-10 y haptoglobina a las 4 y a las 18 horas después de la inyección de N-Mgb-SnPP (como se presenta en las Tablas 9 y 10). Fue sorprendente que N-Mgb sola pudo inducir una respuesta en tejidos extrarrenales, dado que se cree que la endocitosis mediada por megalina-cubulina es una vía específica renal. Esto sugiere la posible absorción extrarrenal, posiblemente a través de receptores depuradores (Canton y col. Nat Rev 2013;13:62 1-34) o que cuando están presentes en la microcirculación, N-Mgb y SnPP son capaces de activar genes citoprotectores intracelulares. Para analizar si la protección extrarrenal puede tener lugar, se evaluó el impacto del pretratamiento con N-Mgb SnPP en el grado de lesión hepática posisquémica. Como se presenta en la FIG. 18, se observaron reducciones marcadas tanto en las concentraciones plasmáticas de LDH como de ALT. Es más, se indicó una protección obvia por la apariencia total de los tejidos hepáticos posisquémicos (FIG. 19). Para analizar aún más la resistencia hepática a la lesión, los ratones se sometieron a una inyección IP de glicerol, que al alcanzar el hígado a través de la circulación portal induce daño hepático leve. Dentro del período de 4 horas de inyección de glicerol IP, se produjeron aumentos en ALT en plasma, que se anularon en gran medida mediante inyección previa de N-Mgb-SnPP.

Se ha demostrado previamente que los niveles plasmáticos de haptoglobina o HO-1 pueden servir como biomarcadores de aumento de haptoglobina y HO-1 cortical renal en el establecimiento de ARF. Z Zager y col. Am J Physiol 2012;303:F139-48; Zager y col. J Am Soc Nephrol 2012;23:1048-2057. Por lo tanto, se cuestionó si la haptoglobina y HO-1 en plasma también pueden servir como biomarcadores para la inducción de estas proteínas en el riñón después de la administración de N-Mgb-SnPP y para la aparición del estado citorresistente. De hecho, este fue el caso. Como se muestra en la FIG. 16, las dosis crecientes de N-Mgb-SnPP indujeron aumentos dependientes de la dosis en los niveles de haptoglobina y HO-1 en plasma, y estos aumentos se correlacionan directamente con el contenido de haptoglobina y HO-1 cortical renal. Es más, se observaron relaciones inversas notables entre los aumentos de HO-1 en plasma y haptoglobina en plasma inducidos por N-Mgb-SnPP y concentraciones de BUN posglicerol (r, -0,79/r, -0,71 para los niveles de BUN vs HO-1 y haptoglobina en plasma, respectivamente). Por lo tanto, los incrementos de HO-1/haptoglobina en plasma probablemente confirmarían la actividad biológica de N-Mgb-SnPP en ensayos clínicos, y los grados de aumento de HO-1 y haptoglobina en plasma también podrían predecir los grados de resistencia a AKI posterior.

Una preocupación obvia al aplicar esta estrategia profiláctica a los pacientes son las posibles toxicidades renales y/o extrarrenales. Sin embargo, a este respecto, cabe señalar que ya se ha demostrado que SnPP es bien tolerada en seres humanos (p. ej., Berglund y col. Hepatology 1988;8:625-31; Kappas y col. Pediatrics 1988;81:485-97; Reddy y col. J Perinatol 2003;23: 507-12). Además, se documentó previamente en un sistema de cultivo celular que la adición de nitrito reduce notablemente los efectos citotóxicos de mioglobina en un 75 % (datos no publicados, 2014). Para evaluar el posible margen de seguridadin vivopara N-Mgb SnPP (véanse las FIG. suplementarias), se analizó la cantidad máxima de N-Mgb que se podría administrarse a los ratones antes de la observación de la nefrotoxicidad. Se podría administrar hasta 25 veces la dosis de N-Mgb empleada (con una dosis constante de SnPP) (durante 2 horas) sin inducción de nefrotoxicidad (BUN y creatinina normales, 18 horas más tarde). Finalmente, ni la dosificación estándar de N-Mgb-SnPP (1 mg de N-Mgb/1 mmol de SnPP) ni 5 mg de N-Mgb IP (FIG. 17) indujo lesión renal manifiesta (BUN/creatinina a las 18 horas, o histología), ni aumentó los niveles de ALT hepática o troponina cardíaca. En conjunto, estos datos indican utilidad en la aplicación clínica.

Conclusiones. La administración de N-Mgb, junto con un inhibidor de su degradación (SnPP), produce aumentos drásticos en una serie de proteínas citoprotectoras en el riñón. La potencia de esta respuesta se indica mediante observaciones de que los aumentos de proteína HO-1 renal documentados fueron 15 veces mayores que los que se lograron con metil bardoxolona, un inductor de HO-1 mediado por Nrf-2 bien reconocido. Wu y col. Am J Physiol 2011;300: F1180-92. Dentro del período de 18 horas de su administración, N-Mgb SnPP provocaron una protección drástica contra 3 modelos diversos de AKI: rabdomiólisis inducida por glicerol, disminución de ATP de túbulos proximales inducida por maleato, y evolución de AKI posisquémica a CKD. Sorprendentemente, la administración de N-Mgb SnPP también indujo aumentos sinérgicos en las proteínas citoprotectoras en el hígado, lo que produce una protección drástica contra lesión por isquemia-reperfusión hepática y hepatotoxicidad. Finalmente, N-Mgb SnPP pueden regular por aumento las proteínas citoprotectoras en el corazón, lo que sugiere una protección cardíaca y, por lo tanto, efectos citoprotectores de amplio espectro. Cabe destacar que, cada una de estas respuestas se indujo en ausencia de toxicidad renal, hepática o cardíaca distinguible. Por lo tanto, estos datos sugieren que la coadministración de N-Mgb SnPP puede proporcionar una estrategia profiláctica clínica para proteger tanto contra lesiones renales como extrarrenales, tales como las que se pueden producir durante la derivación cardiopulmonar, la reparación del aneurisma aórtico u otras cirugías complejas de alto riesgo. Por lo tanto, esta estrategia posiblemente podría cumplir varias necesidades clínicas insatisfechas significativas.

Ejemplo de referencia 5. A dos perros mestizos, uno macho, uno hembra, se les extrajo sangre de referencia para la medición de los niveles de hemooxigenasa 1 (HO-1; ELISA canino) en plasma, BUN, creatinina en plasma y lactato deshidrogenasa (LDH). También se obtuvo una muestra de orina rápida de referencia para el ensayo de HO-1. Después, el perro 1 recibió una infusión de 50 ml/50 min de solución normal/NaHCO340 mM que contenía 5 mg/Kg de mioglobina canina nitrada 3,75 mg/Kg de SnPP. El perro 2 recibió 2,5 mg/Kg de N-mioglobina canina 7,5 mg/Kg de SnPP. Cuatro y 26 horas más tarde, se obtuvieron nuevas muestras de sangre. Se recogió una segunda muestra de orina a las 26 horas después de la infusión. Como se muestra en la Tabla 11, la infusión provocó aumentos masivos en las concentraciones de HO-1 urinaria y en plasma en ausencia de lesión renal (en función de los niveles de BUN y creatinina en plasma y previos). Los valores de LDH permanecieron sin cambios, lo que implica una ausencia de lesiones obvias de tejido renal/extrarrenal.

Tabla 11. Inducción de HO-1 en perros

Perro 1 (macho) Perro 2 (hembra)

BUN de referencia (mg/dl) 20 — 28 —

BUN 26 h 28 23

Creatinina de referencia (mg/dl) 0,5 - 0,7 -Creatinina 26 h 0,5 0,6

LDH de referencia (unidades/dl) 0,4 - 0,31

LDH 26 h 0,2 0,31

HO-1 en plasma de referencia (mg/ml) 1,3 - 4,0

HO-1 en plasma 4 h 34 — 44,7

HO-1 en plasma 26 h 155 90,6

HO-1 urinaria de referencia (mg/mg cr) 2 — 0,8

HO-1 urinaria 26 h 18,8 11,1

Ejemplo 6. Efectos de la Fe sacarosa y cianocobalamina (vitamina B<12>) en la inducción de hemooxigenasa 1 en el riñón. La regulación por aumento de hemooxigenasa-1 (HO-1) es un mediador crítico de la actividad citoprotectora de N-mioglobina/SnPP en órganos renales y extrarrenales. Por lo tanto, se buscaron agentes adicionales que puedan inducir la regulación por aumento de HO-1 y, por lo tanto, contribuir a la aparición de protección del tejido contra las formas tóxicas e isquémicas de lesiones. Debido a que el Fe es el mediador crítico de la actividad de N-Mgb, se evaluó el impacto de un polímero de Fe-carbohidrato (Fe sacarosa; peso molecular que varía de 34-61 kDa) en los niveles de HO-1.

Como una estrategia alternativa y/o complementaria, se estudió el impacto de cianocobalamina (vitamina B12) en la inducción de HO-1 en el riñón. La lógica para el análisis de B12 es que tanto el cobalto como el cianuro pueden inducir de forma independiente HO-1. Por lo tanto, B12 podría representar un método seguro para administrar tanto cianuro como cobalto, y como un agente único, ya que ambos son partes integrales de la molécula B12.

Métodos. Se usaron ratones CD-1 macho (25-40 gramos) Charles River, Wilmington, MA) para todos los experimentos. Se alojaron en condiciones de vivero estándar con acceso a alimento y agua libre. Todos los experimentos fueron aprobados por el IACUC del Centro de Investigación sobre el Cáncer Fred Hutchinson según las directrices del NIH.

Efectos de la Fe sacarosa (FeS)/estaño protoporfirina (SnPP) en la gravedad de la AKI. Modelo de AKI con maleato. Cuando se inyecta en roedores, el maleato experimenta una absorción celular de túbulos proximales relativamente selectiva a través de transportadores de aniones orgánicos. Una vez que se produce la acumulación intracelular, el maleato es un sustrato preferido para succinil-CoA:3-oxoácido CoA transferasa. Esto da como resultado la formación de maleil-coenzima A. Con la posterior conversión de maleil CoA en un tioéter estable, se produce la disminución de la coenzima A (CoA) severa. Niveles abundantes de CoA son esenciales para la “activación” de ácidos grasos, lo que permite su posterior metabolismo a través del ciclo de Krebs, produciendo ATP. En ausencia de este proceso, tiene lugar la disminución de ATP de túbulos proximales y lesión celular. Adicionalmente, el maleato conjuga el grupo sulfhidrilo del glutatión (GSH), culminando en la disminución de GSH y posible estrés tubular oxidante.

El siguiente experimento analizó si FeS, SnPP o FeS SnPP combinadas puede mitigar esta forma de lesión renal aguda (AKI). Veintisiete ratones se sometieron a inyecciones IV en la cola de 200 pl de uno de los siguientes: 1) vehículo (solución salina tamponada con fosfato, PBS; n, 10); 2) 1 mg de FeS (American Regent (Shirley, NY; n, 3); 3) 1 pmol de SnPP (Frontier Scientific, Logan, UT; n 7), o FeS SnPP, n, 7). Dieciocho horas más tarde, todos los ratones recibieron una inyección IP de maleato de Na (800 mg/Kg; en 500 ul de PBS). Dieciocho horas después, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital (50 mg/Kg IP), se abrieron las cavidades abdominales y se obtuvieron muestras de sangre de la vena cava abdominal. Se evaluó la gravedad de la lesión renal determinando concentraciones de nitrógeno ureico en sangre plasmática (BUN) y creatinina en plasma (PCr).

Modelo de lesión por isquemia-reperfusión (IRI) renal de AKI. El siguiente experimento evaluó si la combinación de FeS+SnPP puede mitigar el modelo de oclusión de arterias renales de AKI. Los ratones recibieron inyecciones en la vena de la cola de 200 pl de PBS (n, 9) o FeS SnPP (n, 8), como se señaló anteriormente. Dieciocho horas después, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital (40-50 mg/Kg IP), se abrieron las cavidades abdominales, se identificaron los pedículos renales y ambos se bloquearon con pinzas microvasculares. La temperatura corporal se mantuvo a 36-37 °C durante todo el proceso. Después de 22 minutos de isquemia renal bilateral, se retiraron las pinzas, se confirmó visualmente la reperfusión uniforme mediante la reaparición de un color renal normal (pérdida de cianosis tisular) y luego las cavidades abdominales se cerraron en dos capas con sutura de seda. Dieciocho horas después, los ratones se volvieron a anestesiar, se volvieron a abrir las cavidades abdominales, y se obtuvieron muestras de sangre terminales de la vena cava. La gravedad de la lesión renal se determinó por concentraciones de BUN y PCr.

Efectos FeS/B12 en la gravedad de la AKI. Modelo de AKI con glicerol. Los ratones recibieron inyecciones en la vena de la cola de vehículo de PBS (n 6) o la combinación de FeS 1 pmol de B12 (n, 6; B12 de Alfa Aesar, Ward Hill, MA). Dieciocho horas más tarde, los ratones se anestesiaron ligeramente con isoflurano y luego se indujo el modelo de AKI de rabdomiólisis con glicerol (9 ml/Kg de glicerol al 50 %, administrado en dos inyecciones IM igualmente divididas en las extremidades traseras superiores). Dieciocho horas después de la inyección de glicerol, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital y se obtuvieron muestras de sangre terminales de la vena cava. La gravedad de la lesión renal se midió mediante concentraciones de BUN y PCr terminales.

Modelo de AKI con maleato. Los ratones recibieron inyecciones en la vena de la cola de cualquier combinación de FeS+B12 o vehículo (n, 6 por grupo). Dieciocho horas más tarde recibieron inyecciones de maleato IP, como se señaló anteriormente. La gravedad de la AKI se determinó 18 horas después de la inyección de maleato mediante evaluaciones de BUN y PCr terminal.

Efectos de FeS, SnPP y B12 en la inducción cortical renal de hemooxigenasa 1 (HO-1). Los siguientes experimentos evaluaron los efectos de FeS, SnPP y B12 en la posible inducción de la proteína HO-1 citoprotectora. Para este fin, a los ratones se les inyectó cada uno de estos agentes, como se ha indicado anteriormente. 4 o 18 horas después, se anestesiaron y los riñones se extirparon mediante una incisión abdominal en la línea media. Las cortezas renales se diseccionaron en hielo y luego se extrajeron para determinar la proteína y el ARNm. A continuación, las muestras se analizaron para determinar la proteína HO-1 mediante ELISA, y el ARNm de HO-1 mediante RT-PCR, ponderado los niveles de GAPDH. Cinco ratones normales proporcionaron valores de control.

Resultados Efectos de FeS/SnPP en la gravedad de AKI. AKI inducida por maleato: Como se muestra en la FIG. 22, la inyección de maleato causó una AKI grave como se indica por aumentos de BUN y PCr marcados con respecto a los controles a los que se les inyectó maleato (C). Ni SnPP sola ni FeS sola alteraron significativamente la gravedad de la lesión renal. Sin embargo, FeS SnPP combinadas confirieron una protección marcada, como se indica por reducciones del 75 % en concentraciones de BUN/PCr (las líneas horizontales representan los promedios de los niveles de BUN/PCr en ratones normales).

AKI inducida por isquemia-reperfusión (IRI) renal: Dentro del período de 18 horas de inducción de IRI, se produjeron aumentos de 4 veces en las concentraciones de BUN y PCr (FIG. 23). El pretratamiento con FeS SNPp confirió una protección significativa, disminuyendo los niveles de BUN y PCr en un 50 %. Las líneas horizontales representan los niveles promedios de BUN/PCr en ratones normales.

Efectos del FeS/B12 en la gravedad de AKI. AKI inducida por maleato: Nuevamente, la inyección de maleato indujo una AKI severa (FIG. 24). El pretratamiento con FeS B12 mitigó notablemente esta lesión, como se indica por reducciones de BUN/PCr. Las líneas horizontales representan los niveles promedios de BUN/PCr en ratones normales.

Modelo de AKI con glicerol: Se produjo insuficiencia renal grave durante las primeras 18 horas después de la inyección de glicerol (FIG. 25). El pretratamiento con FeS B12 confirió una protección funcional sustancial, como se indica por reducciones marcadas de las concentraciones de BUN y PCr a las 18 h. Las líneas horizontales representan los niveles promedios de BUN/PCr en ratones normales.

Niveles de ARNm y proteína HO-1 cortical renal. Como se muestra en la FIG. 26, cada uno de los agentes indujo aumentos marcados y significativos en el ARNm de HO-1, como se evaluó a las 4 horas después de la inyección. A las 18 horas, los niveles de ARNm de HO-1 volvieron a valores normales. Como se muestra en la FIG. 27, una correlación de los aumentos de ARNm a las 4 h fue un aumento significativo en los niveles de proteína HO-1. Estos niveles permanecieron elevados en el punto de tiempo de 18 h, particularmente en el caso de la administración de FeS.

Ejemplos proféticos. Ejemplo profético 1. Se evaluará si una formulación de depósito confiere una citoprotección igual o mayor con menos toxicidad posible que el tratamiento con mioglobina/SnPP y/o Fe-S y/o B12 intravenoso (IV) . Se añadirán diferentes dosis de mioglobina con SnPP y/o Fe-S y/o B12 como una suspensión a 100 mg/ml de PEG (PEG 5000). Existen dos lógicas para realizar este experimento. Primero, mediante la inyección ya sea intramuscular (IM) o subcutánea (SQ). la mioglobina y SnPP y/o Fe-S y/o B12 se absorberán de forma relativamente lenta (frente a exposición a mioglobina/SnPP y/o Fe-S y/o B12 sistémica instantánea después de la inyección IV). Al ralentizar la absorción de mioglobina y/o Fe-S y/o B12 con una inyección de PEG de depósito, se producirá una exposición renal más lenta y más sostenida a mioglobina y/o Fe-S y/o B12. Esto favorecerá el aumento de la absorción de mioglobina y/o Fe-S y/o B12 y, al mismo tiempo, disminuirá la posible nefrotoxicidad, que se podría generar debido a la rápida carga renal de mioglobina y/o Fe-S y/o B12 (lo que da como resultado la formación de cilindros obstructivos dentro de los lúmenes tubulares). En segundo lugar, PEG es un agente osmótico y experimentará excreción renal. Debido a que un aumento agudo de la osmolalidad urinaria puede inducir las proteínas citoprotectoras por sí solo, y también puede conferir protección mediante un aumento de los caudales urinarios, se puede observar un efecto beneficioso aditivo o sinérgico.

Ejemplo profético 2. La hematina inhibirá HO, y al igual que SnPP, también puede inducir un aumento en la producción de HO (mediante inhibición por retroalimentación enzimática). Por lo tanto, la hematina debe recapitular los efectos beneficiosos del tratamiento con SnPP. Es importante destacar que la hematina ha sido aprobada por la FDA para el tratamiento de la enfermedad clínica, porfiria. Por lo tanto, si la hematina es tan efectiva como SnPP, la hematina puede seleccionarse para un estudio adicional y un desarrollo clínico.

Ejemplo profético 3. Está bien documentado que HO protege contra la sepsis experimental y la endotoxemia. HO-1 estará regulada por aumento según las composiciones, kits y métodos y luego 18 horas más tarde, los ratones serán expuestos a endotoxina. A las 2 y 24 horas después, la gravedad de la sepsis se mide mediante niveles de citocina inflamatoria (TNF, MCP-1) en plasma y en riñón. Además, debido a que la endotoxemia provoca lesión renal, se evaluará la gravedad de la disfunción renal por los niveles de BUN y creatinina. Los resultados se compararán con los ratones sin tratamiento previo sometidos a inyección de fendotoxina. Cuando sea satisfactorio, esto ampliará enormemente la utilidad de las estrategias protectoras descritas para los pacientes con alto riesgo de sepsis (p. ej., pacientes de UCI).

Ejemplo profético 4. Los estudios en curso demostrarán la efectividad del hierro y/o vitamina B12 en la protección de diversos sistemas de órganos contra un traumatismo.

Las composiciones, kits y métodos descritos en la presente memoria se distinguen del “ preacondicionamiento remoto” , mediante lo cual se provoca isquemia en las piernas (p. ej., inflando los manguitos de presión sanguínea) para preacondicionar otros órganos, que ha alcanzado solo un éxito muy limitado. En realizaciones particulares, las composiciones y kits descritos en la presente memoria pueden denominarse “ preacondicionamientofarmacológicoremoto” (RPR).

Salvo que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc., utilizados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones deben entenderse como modificadas en todos los casos por el término “ aproximadamente” . Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente memoria descriptiva son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se obtengan mediante la presente descripción.

A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se indican con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene de manera inherente determinados errores que resultan necesariamente de la desviación típica encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.

Las definiciones y explicaciones que se usan en la presente descripción se entienden y se pretende que sean determinantes en cualquier interpretación futura, a menos que se modifiquen de forma clara e inequívoca en los ejemplos siguientes o cuando la aplicación del significado haga que cualquier interpretación carezca de sentido o carezca o esencialmente de sentido. En los casos en que la interpretación del término lo deje sin sentido o esencialmente sin sentido, la definición debería tomarse del Diccionario Webster, 3a Edición o de un diccionario conocido por los expertos en la materia, tal como el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

Claims

REIVINDICACIONES