ES2967031T3 - Detección de la capacidad de inhibición de una primera cepa microbiana sobre la producción de gas de una segunda cepa microbiana productora de gas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para cuantificar la capacidad de inhibición de al menos una primera cepa bacteriana o de levadura potencialmente inhibidora frente a una segunda cepa bacteriana o de levadura potencialmente indeseable productora de gas, basándose en una medida de la producción total de gas. Ejemplos de una primera cepa bacteriana o de levadura son cepas bacterianas probióticas del género Bacillus, Lactobacillus o Lactococcus, y ejemplos de cepa bacteriana o de levadura productora de gas son bacterias tales como Clostridium, fusobacterias, Escherichia coli y Salmonella o levaduras tales como Saccharomyces o Pichia. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de la capacidad de inhibición de una primera cepa microbiana sobre la producción de gas de una segunda cepa microbiana productora de gas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para evaluar y/o cuantificar la capacidad de inhibición de al menos una primera cepa microbiana, potencialmente inhibidora, hacia al menos una segunda cepa microbiana, productora de gas, potencialmente indeseable.
Antecedentes de la invención
Un número de cepas microbianas productoras de gas son indeseables. Por ejemplo,Clostridium perfringenstipo A,Clostridium perfringenstipo C, yClostridium septicumson productoras de toxinas y están implicadas en muchas enfermedades.Clostridium perfringenstipo A está implicada en mionecrosis (gangrena gaseosa) en seres humanos, enterotoxemia de corderos, ganado y cabras, y enteritis necrótica en aves de corral, yClostridium perfringenstipo C está implicada en "pasmo" en ovejas, enterotoxemia en corderos y cerdos, y enteritis necrótica en aves de corral (Hatheway 2016 Toxigenic clostridia. Clin Microbiol Rev 2016;3:66-98).
Las cepas microbianas potencialmente indeseables tal comoClostridiumspp. pueden ser inhibidas por otras cepas microbianas.
La capacidad de una cepa microbiana de inhibir otra cepa microbiana, potencialmente indeseable, se evalúa convenientementein vitropor el cocultivo de las dos cepas microbianas en un medio sólido y la evaluación de la presencia o ausencia de zonas de inhibición. Este método se usó, por ejemplo, en el documento WO 2018/167171 para evaluar la actividad inhibidora de cepas deBacillus subtilisdepositadas como DSM32324 y DSM32325 contraEscherichia coliyClostridium perfringens.Sin embargo, solo se puede hacer una evaluación cualitativa de la inhibición basada en este método. Además, el método tiene baja sensibilidad y se puede usar solo con cepas que crecen de una manera uniforme en medios de agar. Algunas cepas, tal comoClostridium septicum,no se pueden contar fácilmente porque no crecen en colonias distintas. Los métodos convencionales de evaluar la capacidad de inhibición también padecen ser bastante laboriosos y no consideran las dificultades de cultivar cepas microbianas anaerobias. Por ejemplo, los métodos convencionales habitualmente no son aplicables a cepas microbianas anaerobias obligadas ya que no se puede prevenir alguna exposición a O<2>con estos métodos.
El documento WO2018/226521 describe métodos y composiciones para la reducción de gas intestinal/flatulencia. El ejemplo 1 describe un sistema de prueba en donde un tubo Durham invertido, un tubo pequeño invertido que puede servir como una trampa para burbujas de gas generadas durante la fermentación, se coloca en un tubo de ensayo con 10 ml de medio. La producción de gas se evalúa por inspección visual de una manera cualitativa; - sin producción de gas, producción de gas mínima (pequeñas burbujas en el tubo Durham), + cantidad sustancial de producción de gas (la mitad del tubo Durham lleno con burbujas de gas), y ++ cantidad excesiva de producción de gas (casi el 90% del tubo Durham lleno con burbujas de gas). No se proporciona dosis de inoculación de las bacterias. La solicitud de patente tampoco proporciona información sobre cuando se evalúa la producción de gas, es decir, el tiempo de incubación del experimento. Por tanto, el método descrito en el ejemplo 1 no es reproducible.
Por tanto, existe una necesidad para un método eficaz respecto al tiempo, fiable y cuantitativo para evaluar la capacidad de al menos una primera cepa microbiana para inhibir al menos una segunda cepa microbiana productora de gas, potencialmente indeseable. En particular, se necesita un método automatizado y cuantitativo que sea estandarizado y reproducible y pueda distinguir entre la eficacia de cepas bacterianas individuales para controlar el crecimiento de cepas productoras de gas de una manera no dejada a la evaluación subjetiva humana.
Compendio de la invención
Los presentes inventores han desarrollado un método que se puede usar para evaluar, de una manera cuantitativa, la eficacia de inhibición de cepas microbianas. Este método se basa en el hallazgo que, cuando una cepa microbiana productora de gas se cultiva en presencia de una cepa microbiana capaz de inhibir dicha cepa microbiana productora de gas, el gas total producido por la cepa microbiana productora de gas se reduce. Por tanto, determinando la reducción en la producción de gas total es posible evaluar cualitativa y cuantitativamente la capacidad de inhibición de la cepa microbiana sobre una cepa microbiana productora de gas, potencialmente indeseable.
Además, el método presente permite realizar ensayos de dosis y respuesta, así como ensayar varias cepas microbianas independiente o simultáneamente.
El método presente también se puede usar como un ensayo de medio o alto rendimiento para cribar la capacidad de inhibición de cepas microbianas conocidas o nuevas hacia cepas microbianas productoras de gas, potencialmente indeseables.
Por tanto, es un aspecto de la presente divulgación proporcionar un método para cuantificar la inhibición de al menos una primera cepa microbiana sobre la producción de gas de al menos una segunda cepa microbiana productora de gas, el método comprende:
a) proporcionar al menos una primera cepa microbiana;
b) proporcionar al menos una segunda cepa microbiana productora de gas;
c) cultivar la al menos una primera cepa microbiana y la al menos una segunda cepa microbiana productora de gas en un sistema de cultivo cerrado;
d) determinar el volumen del gas total producido en el sistema de cultivo cerrado de c);
e) determinar el volumen del gas total producido por la al menos una segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva en ausencia de cualquier cepa microbiana adicional en un sistema de cultivo cerrado; y f) comparar el volumen del gas total de d) y e).
Más específicamente, la presente invención proporciona un método para cuantificar la eficacia de inhibición de al menos una primera cepa bacteriana o de levadura sobre una única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas, el método comprende:
a) proporcionar al menos una primera cepa bacteriana o de levadura que no produce gas o solo volúmenes despreciables de gas;
b) proporcionar una única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas;
c) cultivar la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura y la única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas en un sistema de cultivo cerrado que es impermeable a gas y a la que no se añaden nutrientes adicionales y los productos de desecho no se eliminan;
d) medir el volumen del gas total producido en el sistema de cultivo cerrado de c) durante un periodo de tiempo por medio de un dispositivo medidor de gas automático que mide la presión del gas producido;
e) medir el volumen del gas total producido por la única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas cuando se cultiva en ausencia de cualquier otra cepa bacteriana o de levadura adicional en un sistema de cultivo cerrado durante el mismo periodo de tiempo por medio de un dispositivo medidor de gas automático que mide la presión del gas producido; y
f) comparar la presión del gas total de d) y e).
En una forma de realización de la presente divulgación cuando la presión del gas total de d) es menor que la presión del gas total de e), la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura inhibe la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación cuando la presión del gas total de d) es igual a o mayor que la presión del gas total de e), la al menos una primera cepa microbiana no inhibe la segunda cepa microbiana productora de gas.
Mediante el uso de un dispositivo medidor de gas automático se proporciona un método que se puede estandarizar y hace posible cuantificar la eficacia de inhibición de cepas individuales para controlar el crecimiento de cepas productoras de gas de una manera reproducible.
Al contrario que el estado de la técnica, el método de la presente invención hace posible diferenciar entre la eficacia inhibidora de cepas individuales incluso si la diferencia es pequeña y calcular si la diferencia es estadísticamente significativa incluso para diferencias pequeñas no detectables por inspección visual.
En una forma de realización, los métodos de la presente divulgación se llevan a caboin vitro.Por ejemplo, los métodos de la presente divulgación pueden comprender medir y determinar la producción de gasin vitrode al menos una segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva en presencia de al menos una primera cepa microbiana, potencialmente inhibidora.
Un aspecto adicional de la presente divulgación es proporcionar un uso de un sistema medidor de gas para detectar y/o cuantificar el efecto inhibidor de al menos una primera cepa microbiana sobre al menos una segunda cepa microbiana productora de gas.
Un aspecto incluso adicional de la presente divulgación es proporcionar un uso de un sistema medidor de gas para identificar una primera cepa microbiana capaz de inhibir al menos una segunda cepa microbiana productora de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación el sistema medidor de gas comprende:
a) viales adecuados para el cultivo de una o más cepas microbianas en un sistema de cultivo cerrado;
b) un dispositivo medidor de gas; y
c) medios para determinar el volumen total de gas producido en el sistema de cultivo cerrado.
Los viales adecuados para el cultivo de una o más cepas microbianas en un sistema de cultivo cerrado se conocen en la técnica. Los viales de plástico o viales de vidrio, que son impermeables a gas, son adecuados.
Los dispositivos medidores de gas también se conocen en la técnica. Los dispositivos medidores de gas automáticos son adecuados.
Los medios para determinar el volumen total de gas producido en el sistema de cultivo cerrado también se conocen en la técnica y dependen del dispositivo medidor de gas usado. Por ejemplo, los dispositivos medidores de gas automáticos también pueden ser capaces de determinar el volumen total de gas.
Definiciones
Una “cepa microbiana” como se usa en el presente documento se refiere a un microorganismo que permanece genéticamente sin cambios cuando se hace crecer o multiplica. Se incluye la multiplicidad de microorganismos idénticos. Los ejemplos de microorganismos que están dentro del ámbito de esta invención son bacterias y levaduras mientras hongos anaerobios, protozoos y bacteriófagos se consideran fuera del ámbito de la presente invención.
“Una cepa microbiana productora de gas” como se usa en el presente documento se refiere a una cepa microbiana que produce cantidades perceptibles de gas durante el metabolismo. Las cepas microbianas productoras de gas habitualmente son cepas microbianas que emplean la fermentación como un medio de producir energía para su crecimiento. Algunos clostridios, fusobacterias,Escherichia coliySalmonellason ejemplos de bacterias productoras de gas. Los ejemplos de otros microorganismos productores de gas son levaduras tal comoSaccharomycesyPichia,por ejemplo,Pichia fermentans, Pichia canadensis,yPichia anómala.
Un “sistema de cultivo cerrado” como se usa en el presente documento se refiere a un dispositivo que se usa para propagar microorganismos de al menos una cepa microbiana. Tal sistema debería permitir que se produzca al menos una división celular y ser impermeable a gas. Además, durante un lote de cultivo en un sistema de cultivo cerrado no se añaden nutrientes adicionales al sistema y los productos de desecho no se eliminan. Los cultivos en un sistema cerrado habitualmente siguen una curva de crecimiento predicha.
“Volumen de gas total” como se usa en el presente documento se refiere al gas acumulado total producido durante un lote de cultivo de al menos una cepa microbiana productora de gas en un sistema de cultivo cerrado. El volumen de gas total es una suma de los volúmenes de todos los gases producidos durante el cultivo, en donde dichos gases habitualmente son cualquiera de dióxido de carbono, monóxido de carbono, metano, nitrógeno, oxígeno y otros gases. El volumen del gas total se puede medir en, por ejemplo, ml, cm3, u otras unidades de volumen o en unidades de presión, por ejemplo, psi. Para facilidad de entendimiento, la invención se describe mediante el uso del término “volumen de gas total”. Sin embargo, como es evidente de lo anterior, se debe considerar que este término cubre tanto el volumen del gas total como la presión del gas total a menos que se indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto.
“ Inhibición” como se usa en el presente documento se refiere a una disminución en el crecimiento de una cepa microbiana comparado con el crecimiento de dicha cepa microbiana en diferentes condiciones de cultivo, tal como una disminución en crecimiento de una cepa microbiana cuando se hace crecer en combinación con al menos otra cepa microbiana comparado con el crecimiento de la misma cepa cuando se hace crecer sola como una cepa única.
Se pueden seguir diferentes parámetros para detectar inhibición de una cepa microbiana dependiendo del metabolismo de dicha cepa microbiana. La turbidez del cultivo y la presencia de zonas de inhibición típicamente se usan para determinar si hay o no inhibición en cultivos líquidos y cultivos sólidos, respectivamente. En la presente divulgación, el volumen de gas total producido en un sistema de cultivo cerrado se ha usado como una manera sensible y precisa para seguir el crecimiento de una cepa o cepas microbiana(s) productora(s) de gas y este parámetro se tiene que usar como un medio de medir la inhibición.
El término “cepa microbiana probiótica” se refiere a un cultivo de microorganismos vivos o liofilizados, microorganismos muertos, fragmentos de microorganismos y extractos o sobrenadantes de microorganismos que, cuando se aplican a un animal o ser humano, afectan beneficiosamente al huésped (FAO/WHO (2001) Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria). Las cepas microbianas probióticas se administran como microbiano de alimentación directa (DFM).
El término microbiano de alimentación directa” o “DFM” significa microorganismos vivos incluyendo esporas que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio, tal como digestión o salud mejorada, en el huésped.
Divulgación detallada de la invención
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para detectar la inhibición de al menos una primera cepa microbiana sobre al menos una segunda cepa microbiana productora de gas, el método comprende:
a) proporcionar al menos una primera cepa microbiana;
b) proporcionar al menos una segunda cepa microbiana productora de gas;
c) cultivar la al menos una primera cepa microbiana y la al menos una segunda cepa microbiana productora de gas en un sistema de cultivo cerrado;
d) determinar el volumen del gas total producido en el sistema de cultivo cerrado de c);
e) determinar el volumen del gas total producido por la al menos una segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva en ausencia de cualquier cepa microbiana adicional en un sistema de cultivo cerrado; y f) comparar el volumen del gas total de d) y e).
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para cuantificar la inhibición de al menos una primera cepa microbiana sobre al menos una segunda cepa microbiana productora de gas, el método comprende:
a) proporcionar al menos una primera cepa microbiana;
b) proporcionar al menos una segunda cepa microbiana productora de gas;
c) cultivar la al menos una primera cepa microbiana y la al menos una segunda cepa microbiana productora de gas en un sistema de cultivo cerrado;
d) determinar el volumen del gas total producido en el sistema de cultivo cerrado de c);
e) determinar el volumen del gas total producido por la al menos una segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva en ausencia de cualquier cepa microbiana adicional en un sistema de cultivo cerrado; y f) comparar el volumen del gas total de d) y e).
En una forma de realización de la presente divulgación los métodos de la presente divulgación se llevan a cabo con una primera cepa microbiana potencialmente inhibidora y una segunda cepa microbiana productora de gas. Evidente para un experto en la materia, los métodos de la presente divulgación se pueden realizar con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o incluso más primeras cepas microbianas combinadas con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o incluso más segundas cepas microbianas. De forma importante, el número de cepas microbianas será conocido y definido en contraste a una muestra biológica donde el número de cepas es desconocido y mucho mayor.
En una forma de realización de la presente divulgación la al menos una primera cepa microbiana es una única cepa microbiana.
En una forma de realización de la presente divulgación la al menos una primera cepa microbiana es dos o más cepas microbianas. Por ejemplo, la capacidad de inhibición de una combinación de dos cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de tres cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de cuatro cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de cinco cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de seis cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de siete cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de ocho cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, una combinación de nueve cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar, o una combinación de diez cepas microbianas sobre una segunda cepa microbiana productora de gas se puede determinar. Esto puede ser útil ya que algunas cepas microbianas, todas dentro de la definición de una primera cepa microbiana, pueden inhibir cepas microbianas productoras de gas a un mayor nivel cuando están presentes en combinación en comparación a si están presentes como cepa única.
En una forma de realización de la presente divulgación la al menos una segunda cepa microbiana es una única cepa microbiana.
En una forma de realización de la presente divulgación la al menos una segunda cepa microbiana es dos o más cepas microbianas. Por ejemplo, la capacidad de inhibición de una primera cepa microbiana se puede determinar sobre una segunda cepa microbiana productora de gas, o una combinación de dos segundas cepas microbianas productoras de gas, tal como de una combinación de tres segundas cepas microbianas productoras de gas, tal como de una combinación de cuatro segundas cepas microbianas productoras de gas, tal como de una combinación de cinco segundas cepas microbianas productoras de gas. Esto puede ser útil ya que algunas segundas cepas microbianas productoras de gas, todas dentro de la definición de una segunda cepa microbiana, pueden estar presentes simultáneamentein vivo.
Para facilidad de entendimiento, la invención se describe en lo siguiente mediante el uso de los términos “un” y “una” y “el” y “la” más que “al menos una”. Sin embargo, en el contexto de describir la invención se debe interpretar que estos términos cubren tanto el singular como el plural a menos que se indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto.
La capacidad de producción de gas de una cepa microbiana productora de gas se puede determinar en términos de volumen de gas total. El volumen de gas total producido durante el cultivo de una cepa microbiana se puede determinar midiendo la producción de gas durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a intervalos regulares durante el cultivo, o midiendo el gas acumulado al final del periodo de cultivo. Si la producción de gas se mide durante el cultivo, se pueden seleccionar los intervalos de tiempo entre las medidas individuales para proporcionar la precisión deseada, por ejemplo, para proporcionar una medida casi continua. Cuando la producción de gas se mide de esta manera, es posible volver a cualquier punto de tiempo deseado después del experimento.
En una forma de realización de la presente invención la producción de gas acumulada se mide durante el cultivo durante un periodo de tiempo de 4 horas de cultivo en el sistema de cultivo cerrado, tal como durante un periodo de tiempo de 8 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 12 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 18 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 24 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 30 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 36 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 42 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 48 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 54 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 60 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 66 horas de cultivo, tal como durante un periodo de tiempo de 72 horas de cultivo.
Con el fin de determinar el volumen de gas total producido por una cepa microbiana productora de gas, dicha cepa microbiana productora de gas se debe cultivar como una cepa única en un sistema de cultivo cerrado.
La presente divulgación proporciona un método para determinar si una primera cepa microbiana inhibe una segunda cepa microbiana productora de gas cultivando dichas primera y segunda cepas microbianas juntas en el mismo sistema de cultivo cerrado y midiendo el volumen de gas total producido durante el cultivo de la primera y segunda cepas microbianas. Siempre que el volumen de gas total producido por la segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva en el sistema de cultivo cerrado como una cepa única sea conocido, será posible evaluar y cuantificar la capacidad de inhibición de la primera cepa microbiana contra la segunda cepa microbiana productora de gas comparando:
- el volumen de gas total producido cuando la segunda cepa microbiana productora de gas se cultiva como una cepa única, es decir, en ausencia de las otras cepas microbianas; con
- el volumen de gas total producido cuando la segunda cepa microbiana productora de gas se cultiva junto con la primera cepa microbiana potencialmente inhibidora.
El cocultivo de una cepa microbiana productora de gas en presencia de una cepa microbiana inhibidora producirá una disminución en la producción de gas que puede determinar el experto en la materia.
En una forma de realización de la presente divulgación cuando el volumen del gas total de d) es menor que el volumen del gas total de e), la primera cepa microbiana es capaz de inhibir la segunda cepa microbiana productora de gas. Si se desea, la inhibición de la segunda cepa microbiana productora de gas por la primera cepa microbiana se puede cuantificar.
En una forma de realización de la presente divulgación cuando el volumen del gas total de d) es igual a o mayor que el volumen del gas total de e), la primera cepa microbiana no es capaz de inhibir la segunda cepa microbiana productora de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación determinar el volumen del gas total de e) se realiza antes de determinar el volumen del gas total de d). Por ejemplo, el volumen del gas total de e) puede ser ya conocido en el momento de determinar el volumen del gas total de d). En tales casos, la etapa e) se puede omitir de los métodos divulgados en el presente documento y el volumen total de gas de d) se puede comparar a tal volumen de gas predeterminado para determinar la capacidad inhibidora de la primera cepa microbiana sobre la segunda cepa microbiana productora de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación determinar el volumen del gas total de e) se realiza simultáneamente a determinar el volumen del gas total de d). Por ejemplo, se realizan una serie de ensayos en paralelo para evaluar la producción de gas total de una segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva como una cepa única y cuando se cultiva junto con una primera cepa microbiana.
En una forma de realización de la presente divulgación determinar el volumen del gas total de e) se realiza posteriormente a determinar el volumen del gas total de d). Por ejemplo, el volumen del gas total de e) se sabe primero después de determinar el volumen del gas total de d).
En una forma de realización de la presente divulgación determinar el volumen del gas total se realiza por medio de un sistema de producción de gas automatizado. Se pueden usar varios sistemas de producción de gas automatizados y están comercialmente disponibles, por ejemplo, sistema de producción de gas ANKOM RF (ANKOM Technology, EE UU), Fermograph (ATTO Corporation, JP), AMPTS II, pFLOW y productos relacionados (Bioprocess Control, SE).
En una forma de realización de la presente divulgación el gas total producido es la producción de gas acumulada después de al menos 4 horas de cultivo en el sistema de cultivo cerrado, tal como después de al menos 8 horas de cultivo, tal como después de al menos 12 horas de cultivo, tal como después de al menos 18 horas de cultivo, tal como después de al menos 24 horas de cultivo, tal como después de al menos 30 horas de cultivo, tal como después de al menos 26 horas de cultivo, tal como después de al menos 42 horas de cultivo, tal como después de al menos 48 horas de cultivo, tal como después de al menos 54 horas de cultivo, tal como después de al menos 60 horas de cultivo, tal como después de al menos 66 horas de cultivo, tal como después de al menos 72 horas de cultivo. Por ejemplo, el gas total producido es la producción de gas acumulada medida al final del cultivo que es cuando la segunda cepa microbiana productora de gas ya no crece más.
En una forma de realización de la presente divulgación el crecimiento de la segunda cepa microbiana productora de gas se mide y determina en paralelo con la determinación de la producción de gas total en el sistema de cultivo cerrado.
En una forma de realización de la presente divulgación la curva de crecimiento, así como el tiempo de cultivo total de la segunda cepa microbiana productora de gas se conoce.
En una forma de realización de la presente divulgación el sistema de cultivo cerrado es un sistema de cultivo líquido. Se puede usar ventajosamente líquido para cultivar cepas microbianas productoras de gas que no crecen fácilmente en medios sólidos.
En una forma de realización de la presente divulgación el sistema de cultivo cerrado es un sistema de cultivo anaerobio. El cultivo anaerobio se puede usar ventajosamente para detectar y/o cuantificar la inhibición en cepas microbianas productoras de gas anaerobias.
En una forma de realización de la presente divulgación el método además comprende calcular el porcentaje de inhibición de la primera cepa microbiana sobre la segunda cepa microbiana productora de gas. El porcentaje de inhibición se puede, por ejemplo, calcular basado en un algoritmo que considera el volumen del gas total producido por la segunda cepa microbiana productora de gas cuando se cultiva como cepa única y cuando se cultiva en presencia de la primera cepa microbiana potencialmente inhibidora.
En general se considera ventajoso que la cepa productora de gas se inhiba a un nivel sustancial tal como al menos el 50%, tal como al menos el 66%, tal como al menos el 75%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%, por ejemplo, al menos el 95%.
El método de la presente invención hace posible diferenciar entre la eficacia inhibidora de cepas individuales incluso si la diferencia es pequeña y calcular si la diferencia es estadísticamente significativa incluso para pequeñas diferencias. Las cepas se pueden clasificar en base a su eficacia inhibidora sobre una o más cepas productoras de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación el método además comprende comparar la eficacia inhibidora de al menos dos primeras cepas bacterianas o de levadura con respecto a su eficacia inhibidora hacia la misma segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas.
La presente divulgación también se refiere a métodos para cribar y evaluar un número de cepas microbianas para su capacidad para inhibir una cepa microbiana productora de gas. Aunque existen métodos de cribado que tienen el mismo fin los métodos de la presente divulgación proporcionan varias ventajas sobre métodos previamente conocidos que en gran parte se basan en la formación de zonas de inhibición en placas de agar. Los métodos de la presente divulgación permiten una cuantificación precisa de la inhibición gracias a la facilidad en determinar el volumen de gas total producido durante el cultivo en un sistema de cultivo cerrado. Además, los métodos de la presente divulgación permiten el cribado contra cepas microbianas que no crecen bien en medio sólido, que no se pueden contar después del cultivo, o que no crecen uniformemente, sino que forman filamentos en su lugar.
En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a un ensayo de medio o alto rendimiento para cribar la capacidad de inhibición de microorganismos de una primera cepa microbiana, potencialmente inhibidora, hacia una segunda cepa microbiana productora de gas, potencialmente indeseable.
Para que el presente método cuantifique correctamente la inhibición de una primera cepa microbiana sobre una segunda cepa microbiana productora de gas es importante que el volumen de gas total producido por la primera cepa microbiana sea despreciable comparado con el volumen de gas total producido por la segunda cepa microbiana productora de gas.
Por tanto, en una forma de realización de la presente divulgación, la primera cepa microbiana no produce gas o solo volúmenes despreciables de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana no es una cepa microbiana productora de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es capaz de inhibir una cepa microbiana productora de gas.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es una cepa microbiana probiótica. Las cepas microbianas en general se clasifican como cepas aerobias o anaerobias. Algunas cepas aerobias también son capaces de crecer en ausencia de oxígeno, es decir, no son aerobias estrictas.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es aerobia y dicha cepa es anaerobia facultativa, microaerófila o aerotolerante.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es anaerobia y dicha cepa es anaerobia, anaerobia facultativa, aerotolerante o anaerobia obligada.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es una cepa bacteriana.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroBacillus,tal como de la especieBacillus altitudinis, Bacillus amyloliquefaciens,por ejemplo,Bacillus amyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciensoBacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum, Bacillus atrophaeus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus simplex, Bacillus stratosphericus, Bacillus subtilis, Bacillus siamensis, Bacillus vallismortis, Bacillus velezensis,oBacillus tequilensis.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es una cepa bacteriana del ácido láctico.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroLactobacillus,tal comoLactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuteri,yLactobacillus rhamnosus.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroLactococcus, tal comoLactococcus lactis.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroEnterococcus,tal comoEnterococcus faecium.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroEscherichia,por ejemplo, bacterias de la especieEscherichia coli,un ejemplo de las cuales esEscherichia coliNissle 1917.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroPediococcus,tal comoPediococcus pentasaceusoPediococcus acidilactici.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroPropionibacterium,tal comoPropionibacterium freudenreichiioPropionibacterium acidipropionici.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana es del géneroBifidobacterium,tal comoBifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis,oBifidobacterium longum.
En una forma de realización de la presente divulgación la primera cepa microbiana se selecciona del grupo que consiste en:
a) la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840,
b) la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324,
c) la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325,
d) la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM17231,
e) la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236,
f) la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750, y
g) la cepa dePropionibacterium freudenreichiidepositada como PTA-6752.
En una forma de realización la al menos una cepa microbiana es dos cepas bacterianas, la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 y la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM17231.
En una forma de realización la al menos una cepa microbiana es dos cepas bacterianas, la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 y la cepa dePropionibacterium freudenreichiidepositada como PTA-6752. En una forma de realización la al menos una cepa microbiana es tres cepas bacterianas, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325, y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es una cepa microbiana patógena.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es una cepa bacteriana.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es capaz de fermentación anaerobia. Por ejemplo, la segunda cepa microbiana es capaz de producir gas cuando se cultiva de forma anaerobia en un sistema de cultivo cerrado.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es anaerobia. En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es anaerobia, y dicha cepa es anaerobia, anaerobia facultativa, aerotolerante o anaerobia obligada.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es del géneroClostridium.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringensoClostridium septicum.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium septicumy la al menos una cepa microbiana es tres cepas bacterianas, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325, y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringenstipo A.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringenstipo A y la al menos una cepa microbiana es dos cepas bacterianas, la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 y la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM17231.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringenstipo A y la al menos una cepa microbiana es dos cepas bacterianas, la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 y la cepa dePropionibacterium freudenreichiidepositada como PTA-6752. En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringenstipo C.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringenstipo C y la al menos una cepa microbiana es dos cepas bacterianas, la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 y la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM17231.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es de la especieClostridium perfringenstipo C y la al menos una cepa microbiana es dos cepas bacterianas, la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 y la cepa dePropionibacterium freudenreichiidepositada como PTA-6752. En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es del filo fusobacteria o el géneroEscherichiatal comoEscherichia coli,oSalmonella.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es del géneroSaccharomyces.
En una forma de realización de la presente divulgación la segunda cepa microbiana productora de gas es del géneroPichia,tal comoPichia fermentans, Pichia canadensis,yPichia anomala.
El uso de los términos “un” y “una” y “el” y “la” y referentes similares en el contexto de describir la invención (en especial en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar que cubre tanto el singular como el plural a menos que se indique de otra manera en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. Los términos “comprender”, “tener”, “incluir” y “contener” se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significa “incluir, pero no limitado a”) a menos que se indique otra cosa. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento se pretende solamente que sirva como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que está en el intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la especificación como si se enumeraran individualmente en el presente documento. Todos lo métodos descritos en el presente documento se puede realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o de otra manera se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en el presente documento, se pretende solamente para iluminar mejor la invención y no representa ninguna limitación en el ámbito de la invención a menos que se reivindique de otra manera. Ningún vocabulario en la especificación se debe interpretar como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
Leyenda a las figuras
Figura 1: Gráfico de presión acumulada de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( ~ >, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 ( —o— ),y la cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 ( - 0— ) durante incubación de 48 h. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 2: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 ( junto con la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( ■ ), y junto con la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 ( ♦ )• En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 3: Gráfico de presión acumulada de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 (n~)<la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 ( —x— )# la cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 ( - ° - ) yClostridium septicumcepa D ( —<a>— ) durante incubación de 48 h. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 4: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 durante incubación de 48 h como cepa única ( - ' ) , junto con la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( —o— ), y junto con la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 ( —* — )■ Gráfico de presión acumulada deClostridium septicumcepa D durante incubación de 48 h como cepa única ( —a— ), junto con la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( ♦ )» y junto con la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 ( — )■ En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 5: Gráfico de presión acumulada de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324<( ~ f - 1 - ) />Bacillus subtiliscepa A ( ■ ), la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 ( —¿5— ), y la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 ( - ^ — ) durante incubación de 48 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 6: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 ( —0— ), junto con la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( —0— ),junto conBacillus subtiliscepa A ( ♦ )< y junto con la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 ( — )• En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 7: Gráfico de presión acumulada de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( —P-)>la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 ( — ),Propionibacterium freudenreichiicepa B ( “ x— )»y la cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 ( —0— ) durante incubación de 48 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 8: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 durante incubación de 48 horas como cepa única ( - °— ), junto con de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( ■ >, junto conPropionibacterium freudenreichiicepa B ( —x— ), y junto con la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 t * )• En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 9: Gráfico de presión acumulada de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 (Lactococcus lactiscepa C ( —a— ), y la cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 ( durante incubación de 48 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 10: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 durante incubación de 48 horas como cepa única ( - j unto con de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 ( • ), y junto conLactococcus lactiscepa C ( — )■ En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 11: Gráfico de presión acumulada de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM17231 ( ~ ° — )»y la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 (—° — )durante incubación de 23 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 12: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 ( - o- )durante 24 horas de incubación como cepa única, y junto con la cepa deBacillus subtilisdepositada como ( ■ X En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 13: Gráfico de presión acumulada de una mezcla de la cepa deLactobacillus plantarumCH6072 depositada como DSM16568, la cepa deLactococcus lactisSR 3.54 depositada como NCIMB30117 y cepa deEnterococcus faeciumM74 depositada como DSM22502 ( ~ P ” )< y la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 ( - )durante incubación de 24 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 14: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 ( —0— )durante incubación de 24 horas como cepa única, y junto con una mezcla de la cepa deLactobacillus plantarumCH6072 depositada como DSM16568, cepa deLactococcus lactisSR 3.54 depositada como NCIMB30117 y cepa deEnterococcus faeciumM74 depositada como DSM22502 ( ■ ). En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 15: Gráfico de presión acumulada de una mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840 ( —G— ) durante incubación de 48 horas. Presión de gas acumulada de una cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 ( — ) yClostridium septicumcepa D ( - °— ) durante incubación de 48 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 16: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 ( —¿s— ) durante incubación de 48 horas como cepa única, y junto con una mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840 (ú)■ Gráfico de presión acumulada deClostridium septicumcepa D durante incubación de 48 h como cepa única (—° — )y junto con una mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840 (* n el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 17: Gráfico de presión acumulada de una mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 y la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 ( —G— ) , y la cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 ( - c— ) durante incubación de 24 horas. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 18: Gráfico de presión acumulada de la cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 ( — durante incubación de 24 horas como cepa única, y junto con una mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 y la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 ( • X En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la presión (psi).
Figura 19. Curva de crecimiento de la cepa deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 (• en medio BHI. En el eje x está el tiempo (h) y en el eje y está la densidad óptica (DO<600>nm).
Figura 20: Morfología de colonia deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180.
Figura 21: Morfología de colonia deBacillus subtilisdepositada como DSM32324.
Figura 22. Enumeración de botellas después de carrera, UFC/ml promedio en triplicado. I: Botellas inoculadas conBacillus subtilisdepositada como DSM32324; colonias con morfología deBacillus; II: Botellas inoculadas conClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180; colonias con morfología deClostridium;III: Botellas inoculadas conBacillus subtilisyClostridium perfringens;colonias con morfología deBacillus;y IV: Botellas inoculadas conBacillus subtilisyClostridium perfringens(mismas botellas que en III); colonias con morfología deClostridium.La línea discontinua es el límite de detección.
Depósito y solución de experto
La cepa deBacillus subtilisDSM32324 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 8 de junio, 2016, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
La cepa deBacillus subtilisDSM32325 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 8 de junio, 2016, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
La cepa deBacillus subtilisDSM17231 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 7 de abril, 2005, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
La cepa deBacillus licheniformisDSM17236 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 7 de abril, 2005, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
La cepa deBacillus amyloliquefaciensDSM25840 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 3 de abril, 2012, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
La cepa deLactobacillus animalisPTA-6750 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), EE<u>U el 26 de mayo, 2005 por Nutrition Physiology Corp., Guymon, Oklahoma, EE UU. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes y la cepa está públicamente disponible como el documento US 8.496.925 ha publicado en referencia a la cepa.
La cepa dePropionibacterium freudenreichiiPTA-6752 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), EE UU el 25 de mayo, 2005 por Nutrition Physiology Corp., Guymon, Oklahoma, EE UU. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes y la cepa está públicamente disponible como el documento US 7.063.836 ha publicado en referencia a la cepa.
La cepa deLactobacillus plantarumDSM16568 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 13 de julio, 2004, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
La cepa deLactococcus lactisNCIMB30117 está públicamente disponible como ha publicado la patente sueca SE 511 828 en referencia a la cepa.
La cepa deEnterococcus faeciumDSM22502 se ha depositado en el DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) el 22 de abril, 2009, por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. El depósito se ha hecho bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes.
Ejemplos
Materiales
Sistema de producción de gas Ankom RF, ANKOM RF Gas Production System (ANKOM Technology, EE UU).
Botellas de tapa azul (resistentes a la presión), Duran cat. 218152402
Caldo BHI (infusión de cerebro y corazón), Oxoid, CM225
Placas de sangre (agar de triptona de soja con sangre de oveja), Oxoid, PB5012A
MRD (diluyente de recuperación máxima), Oxoid, CM0733
Placas TSA (agar de triptona de soja) Oxoid, PB PO5012A
La cepa deClostridium septicumdepositada como DSM7534 y la deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 son cepas tipo y están públicamente disponibles de DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig).
La cepa deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 está públicamente disponible de Culture Collections, Public Health England, Porton Down, Salisbury, SP40JG, UK.
Antes de la inoculación
Las cepas deBacillusse hicieron crecer en placas TSA (37°C, incubación aerobia, durante la noche). Una colonia de cada cepa se inoculó en caldo BHI y se hizo crecer durante la noche (37°C, aerobio), esta propagación se usó para inocular las botellas.
Las cepas deClostridiumspp. se hicieron crecer en placas de sangre (37°C, incubación anaerobia, 1-2 días). Una colonia de cada cepa se inoculó en caldo BHI y se hizo crecer 1-3 días (37°C, anaerobio).
Se añadieron 90 ml de caldo BHI a una botella de tapa azul de 100 ml (resistente a la presión) y se autoclavó (121°C, 15 min). Las botellas se incubaron de forma anaerobia durante la noche antes de correr el experimento.
Inoculación
Las botellas se inocularon con 0,5 ml de propagación de una cepa deBacillusy 0,5 ml de una cepa deClostridium.Las cepas también se inocularon como cepas únicas, aquí también se añadieron 0,5 ml de agua estéril. Las botellas se purgaron con CO<2>antes de que un módulo Ankom (cabeza) se atornillara con seguridad en la botella. Las botellas se incubaron a 37°C. La carrera se inició después de colocar todos los módulos en el incubador. Para registrar la producción de gas, los ajustes fueron intervalo en vivo 50 s, intervalo de registro 10 min, liberación de presión global 0,75 psi, apertura de válvula 250 ms. La producción de gas acumulada se registró durante 24-72 horas.
Las inoculaciones en los ejemplos 1 a 4 se llevaron a cabo en duplicado y las inoculaciones en el ejemplo 5 se llevaron a cabo en triplicado.
Ejemplo 1
Las cepas deBacillus subtilisdepositadas como DSM32324 y DSM32325 no produjeron gas (o muy poco) durante la incubación de 48 h como cepas únicas (Fig. 1).
La producción total de gas deClostridium septicumdepositada como DSM7534 cuando se cultiva como colonia única también se muestra en la figura 1.
La cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 redujo la producción de gas deClostridium septicumdepositada como DSM7534 en el 97% comparada a cuando la cepa deClostridium septicumse cultivó como cepa única (Fig. 2).
La cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 redujo la producción de gas deClostridium septicumdepositada como DSM7534 en el 96% comparada a cuando la cepa deClostridium septicumse cultivó como cepa única (Fig. 2).
Ejemplo 2
La cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 y la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 no produjeron gas (o muy poco) durante la incubación de 48 h como cepas únicas (Fig. 3).
Se han ensayado dos cepas diferentes deClostridium septicumy los resultados en la figura 3 indican que el gas total producido durante la incubación es específico de la cepa.
La cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 inhibió ambas cepas deClostridium septicumpor completo (Fig. 4).
Los resultados proporcionados en la figura 4 indican que la cepa deBacillus licheniformisdepositada como DSM17236 inhibió a un gran nivel ambas cepas deClostridium septicumensayadas en que proporcionó alguna reducción (68%) deClostridium septicumcepa D (Fig. 4) y una mayor reducción (76%) deClostridium septicumdepositada como DSM7534.
Ejemplo 3
La figura 5 muestra que la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750,Bacillus subtiliscepa A y la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 no produjeron gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 también se muestra en la figura 5.
Los resultados en la figura 6 indican que la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 inhibió al menos parcialmente (23%)Clostridium perfringenstipo A depositada como DSM756.Bacillus subtiliscepa A produjo alguna reducción de la producción de gas deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756, pero a menor grado (6%).Lactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 produjo una reducción del 36% de la producción de gas total después de incubación conClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756.
Ejemplo 4
La figura 7 muestra queLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750,Propionibacterium freudenreichiicepa B yBacillus subtilisdepositada como DSM32324 no produjeron gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 también se muestra en la figura 7.
Los resultados en la figura 8 indican queBacillus subtilisdepositada como DSM32324 inhibióClostridium perfringenstipo C (NCTC3180) por completo.Lactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 mostró buena inhibición al reducir la producción de gas total deClostridium perfringenstipo C (NCTC3180) en el 74% después de la incubación.Propionibacterium freudenreichiicepa B mostró algo de inhibición al reducir la producción de gas total deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 en el 27% después de la incubación.
Ejemplo 5
La figura 9 muestra que la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 yLactococcus lactiscepa C cuando se hacen crecer como cepas únicas no produjeron gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 también se muestra en la figura 9.
Los resultados en la figura 10 indican queBacillus subtilisdepositada como DSM32324 inhibióClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 por completo y queLactococcus lactiscepa C mostró reducción limitada de la producción de gas deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 (29%) después de la incubación.
Ejemplo 6
La figura 11 muestra que la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM17321 no produjo gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 también se muestra en la figura 11.
Los resultados en la figura 12 indican queBacillus subtilisdepositada como DSM17321 produjo algo de reducción de la producción de gas deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756, pero un bajo grado (11%).
Ejemplo 7
La figura 13 muestra que la mezcla de la cepa deLactobacillus plantarumdepositada como DSM16568, la cepa deLactococcus lactisdepositada como NCIMB30117 y la cepa deEnterococcus faeciumdepositada como DSM22502 no produjo gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 también se muestra en la figura 13.
Los resultados en la figura 14 muestran que la mezcla de la cepa deLactobacillus plantarumdepositada como DSM16568, la cepa deLactococcus lactisdepositada como NCIMB30117 y la cepa deEnterococcus faeciumdepositada como DSM22502 produjo algo de reducción de la producción de gas deClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756, pero un bajo grado (15%).
Ejemplo 8
La figura 15 muestra que la mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840 no produjo gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium septicumcomo DSM7534 yClostridium septicumcepa D también se muestra en la figura 15.
Los resultados en la figura 16 muestran que la mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324, la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32325 y la cepa deBacillus amyloliquefaciensdepositada como DSM25840 inhibió por completoClostridium septicumdepositada como DSM7534 yClostridium septicumcepa D.
Ejemplo 9
La figura 17 muestra que la mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 y la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 no produjo gas durante la incubación. La producción de gas total deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 también se muestra en la figura 17.
Los resultados en la figura 18 muestran que la mezcla de la cepa deBacillus subtilisdepositada como DSM32324 y la cepa deLactobacillus animalisdepositada como PTA-6750 produjo la reducción de la producción de gas deClostridium perfringenstipo C depositada como NCTC3180 (95%).
Ejemplo 10
Se midió la densidad óptica (DO<600>nm) de cultivos que contienenClostridium perfringenstipo A depositada como DSM756 en medio BHI después de incubación a 37°C (Fig. 19). La curva de crecimiento indica una correlación con la producción de gas.
Ejemplo 11
El contenido de las botellas después de una carrera se enumeró realizando una dilución en serie en MRD y siembra por extensión en placas de sangre de diluciones apropiadas. Las placas se incubaron de forma anaerobia a 37°C durante la noche. Se contaron las colonias basado en diferentes morfologías de colonia (véase, Fig. 20 y 21).
Las botellas inoculadas con tantoBacillus subtiliscomoClostridium perfringensmostraron una reducción respecto a clostridios cuando se enumeran en placas de sangre (Fig. 22). Comparado con las botellas inoculadas conClostridium perfringenssolo hubo una caída de aprox. 3 log.
No hubo colonias de clostridios visibles en las placas cuando se enumeran las botellas con la combinación de tantoBacillus subtiliscomoClostridium perfringens.Basado en el esquema de siembra el nivel de clostridios estaba por debajo de 1E+06 UFC/ml en las botellas con la combinación de cepas, indicado con una línea discontinua en la figura 22 que es el límite de detección.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método para cuantificar la eficacia de inhibición de al menos una primera cepa bacteriana o de levadura sobre una única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas, el método comprende:
    a) proporcionar al menos una primera cepa bacteriana o de levadura que no produce gas o solo volúmenes despreciables de gas;
    b) proporcionar una única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas;
    c) cultivar la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura y la única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas en un sistema de cultivo cerrado que es impermeable a gas y al que no se añaden nutrientes adicionales y los productos de desechos no se eliminan;
    d) medir el volumen del gas total producido en el sistema de cultivo cerrado de c) durante un periodo de tiempo por medio de un dispositivo medidor de gas automático que mide la presión del gas producido;
    e) medir el volumen del gas total producido por la única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas cuando se cultiva en ausencia de cualquier cepa bacteriana o de levadura adicional en un sistema de cultivo cerrado durante el mismo periodo de tiempo por medio de un dispositivo medidor de gas automático que mide la presión del gas producido; y
    f) comparar la presión del gas total de d) y e).
  2. 2. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde cuando la presión del gas total de d) es menor que la presión del gas total de e), la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura inhibe la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas.
  3. 3. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cuando la presión del gas total de d) es igual a o mayor que la presión del gas total de e), la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura no inhibe la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas.
  4. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sistema de cultivo cerrado es un sistema de cultivo anaerobio.
  5. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura es una cepa bacteriana o de levadura
  6. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura es dos o más cepas bacterianas o de levadura.
  7. 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura es una cepa bacteriana.
  8. 8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura es del géneroBacillus.
  9. 9. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura es una cepa bacteriana del ácido láctico.
  10. 10. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura es de los génerosLactobacillusoLactococcus.
  11. 11. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas es una cepa bacteriana.
  12. 12. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas es del géneroClostridium.
  13. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas es de las especiesClostridium perfringensoClostridium septicum.
  14. 14. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método además comprende calcular el porcentaje de inhibición de la al menos una primera cepa bacteriana o de levadura sobre la segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas.
  15. 15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método además comprende comparar la eficacia inhibidora de al menos dos primeras cepas bacterianas o de levadura con respecto a su eficacia inhibidora hacia la misma única segunda cepa bacteriana o de levadura productora de gas.
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