CN114207142A - 第一微生物菌株对第二产气微生物菌株产气的抑制能力的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于总产气量的测量，定量至少一种潜在抑制性第一细菌或酵母菌株对产气潜在不良第二细菌或酵母菌株的抑制能力的方法。第一细菌或酵母菌株的实例是芽孢杆菌属、乳杆菌属或乳球菌属的益生菌细菌菌株，产气细菌或酵母菌株的实例是诸如梭菌属、梭杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌属等细菌或诸如酵母属或毕赤酵母属(Pichia)等酵母。
Description
技术领域
本发明涉及用于评估和/或定量至少一种潜在抑制性第一微生物菌株对至少一种产气、潜在不良第二微生物菌株的抑制能力的方法。
背景技术
许多产气微生物菌株是不期望的。例如，A型产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、C型产气荚膜梭菌和败毒梭菌(Clostridium septicum)均会产生毒素并与许多疾病有关。A型产气荚膜梭菌与人的肌坏死(气性坏疽)、羔羊、牛和山羊的肠毒血症以及家禽的坏死性肠炎有关，C型产气荚膜梭菌与绵羊的“击伤”、羔羊和猪的肠毒血症以及家禽的坏死性肠炎有关(Hatheway 2016Toxigenic clostridia.Clin Microbiol Rev 2016；3:66–98)。
其他微生物菌株可以抑制潜在的不良微生物菌株，例如梭菌属的物种(Clostridum spp.)。
通常通过在固体培养基上共培养这两种微生物菌株并评估抑菌圈存在或不存在来体外评价微生物菌株抑制另一种潜在不良微生物菌株的能力。例如，该方法在WO 2018/167171中用于评估保藏为DSM32324和DSM32325的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株对大肠杆菌(Escherichia coli)和产气荚膜梭菌的抑制活性。然而，基于这种方法只能对抑制进行定性评估。此外，该方法灵敏度低，只能用于在琼脂培养基上以均匀方式生长的菌株。一些菌株，例如败毒梭菌，无法轻松计数，因为它们不会生长成明显的菌落。评估抑制能力的常规方法也遭受相当耗时之苦且未考虑培养厌氧微生物菌株的困难。例如，传统方法通常不适用于专性厌氧微生物菌株，因为这些方法无法防止某些O2暴露。
WO2018/226521描述了用于减少肠道气体/肠胃胀气的方法和组合物。实施例1描述了一种测试系统，其中将倒置的杜氏管，即一种可以用作发酵过程中生成的气泡的捕集装置的小倒置管，放置在具有10ml培养基的试管中。通过目测以定性方式评估气体产生：-无气体产生，+气体产生极少(杜氏管中的小气泡)，++大量气体产生(杜氏管的一半充满气泡)，以及+++过量气体产生(几乎90％的杜氏管充满气泡)。没有提供细菌的接种剂量。该专利申请也没有提供关于何时评估气体产生的信息，即实验的孵育时间。因此，实施例1描述的方法是不可重复。
因此，需要一种时间效率高、可靠且定量的方法来评估至少一种第一微生物菌株抑制至少一种产气、潜在不良第二微生物菌株的能力。特别是，需要这样一种自动化定量方法，其是标准化且可重复的，并且可以以不留给人主观评价的方式区分个体细菌菌株控制产气菌株生长的效率。
发明内容
本发明人开发了可以用于以定量方式评估微生物菌株抑制效率的方法。该方法基于以下发现：当在能够抑制产气微生物菌株的微生物菌株存在的情况下培养所述产气微生物菌株时，由所述产气微生物菌株产生的总气体减少。因此，通过确定总气体产生的减少，可以定性和定量地评估微生物菌株对产气、潜在不良微生物菌株的抑制能力。
此外，本方法允许进行剂量反应试验以及独立或同时测试几种微生物菌株。
本方法还可用作筛选已知或新微生物菌株对产气、潜在不良微生物菌株的抑制能力的中通量测定或高通量测定。
因此，本公开的一个方面是，提供了用于定量至少一种第一微生物菌株对至少一种产气第二微生物菌株产气的抑制的方法，该方法包括：
a)提供至少一种第一微生物菌株；
b)提供至少一种产气第二微生物菌株；
c)在封闭培养系统中培养所述至少一种第一微生物菌株和所述至少一种产气第二微生物菌株；
d)确定c)的所述封闭培养系统中产生的总气体体积；
e)确定当在不存在任何其他微生物菌株的情况下、在封闭培养系统中培养时，所述至少一种产气第二微生物菌株产生的总气体体积；以及
f)比较d)和e)的总气体体积。
更具体而言，本发明提供了定量至少一种第一细菌或酵母菌株对单一产气第二细菌或酵母菌株的抑制效率的方法，该方法包括：
a)提供至少一种不产生气体或仅产生体积可忽略不计的气体的第一细菌或酵母菌株；
b)提供单一产气第二细菌或酵母菌株；
c)在封闭培养系统中培养至少一种第一细菌或酵母菌株和单一产气体第二细菌或酵母菌株，该系统是不透气的并且不添加额外的养分，且不去除废产物；
d)通过测量产生的气体压力的自动气体测量装置测量一段时间内在c)的封闭培养系统中产生的总气体体积；
e)通过测量产生的气体压力的自动气体测量装置，测量当在不存在任何其他细菌或酵母菌株的情况下、在封闭培养系统中培养时，在相同的时间段内，单一产气第二细菌或酵母菌株产生的总气体体积；以及
f)比较d)和e)的总气体压力。
在本公开的一个实施方案中，当d)的总气体压力低于e)的总气体压力时，所述至少一种第一细菌或酵母菌株抑制所述产气第二细菌或酵母菌株。
在本公开的一个实施方案中，当d)的总气体压力等于或高于e)的总气体压力时，所述至少一种第一微生物菌株不抑制所述产气第二微生物菌株。
通过使用自动气体测量装置，提供了可以标准化并且使得有可能定量个别菌株的抑制效率，从而以可重复的方式控制产气菌株生长的方法。
与现有技术相比，本发明的方法使得有可能区分个别菌株的抑制效率，即使差异小，并且即使对于目测无法检测到的小差异，计算差异是否是统计学显著的。
在一个实施方案中，本公开的方法在体外进行。例如，本公开的方法可以包括，测量和确定当在至少一种潜在抑制性第一微生物菌株存在的情况下培养时至少一种产气第二微生物菌株的体外产气量。
本公开的另一方面是，提供气体测量系统用于检测和/或定量至少一种第一微生物菌株对至少一种产气第二微生物菌株的抑制作用的用途。
本公开的又一方面是，提供气体测量系统用于鉴定能够抑制至少一种产气第二微生物菌株的第一微生物菌株的用途。
在本公开的一个实施方案中，气体测量系统包括：
a)适合在封闭培养系统中培养一种或多种微生物菌株的小瓶；
b)气体测量装置；和
c)用于确定所述封闭培养系统中产生的气体总体积的器件。
适合在封闭培养系统中培养一种或多种微生物菌株的小瓶是本领域已知的。不透气的塑料小瓶或玻璃小瓶是合适的。
气体测量装置在本领域中也是已知的。自动气体测量装置是合适的。
用于确定封闭培养系统中产生的气体总体积的方法，也是本领域已知的，并且取决于所用的气体测量装置。例如，自动气体测量装置也能够确定气体的总体积。
定义
本文所用“微生物菌株”是指在生长或繁殖时保持遗传不变的微生物。包括许多相同的微生物。在本发明范围内的微生物的实例是细菌和酵母，而厌氧真菌、原生动物和噬菌体被认为不在本发明的范围内。
本文所用“产气微生物菌株”是指在代谢过程中产生明显量的气体的微生物菌株。产气微生物菌株通常是利用发酵作为为其生长产生能量的方式的微生物菌株。一些梭菌、梭杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌属(Salmonella)是产气细菌的实例。其他产气微生物的实例是诸如酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)等酵母，例如发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)。
本文所用“封闭培养系统”是指用于繁殖至少一种微生物菌株的微生物的装置。这样的系统应当允许发生至少一次细胞分裂并且是不透气的。此外，在封闭培养系统中的培养批次期间，不会向系统添加额外的养分，也不去除废产物。封闭系统中的培养物通常遵循预测的生长曲线。
本文所用“总气体体积”是指在至少一种产气微生物菌株在封闭培养系统中的培养批次期间产生的总累积气体。总气体体积是培养期间产生的所有气体的体积之和，其中所述气体通常为二氧化碳、一氧化碳、甲烷、氮气、氧气和其他气体中的任意一种。总气体体积可以以例如毫升、立方厘米或其他体积单位或以压力单位例如psi测量。为便于理解，本发明使用术语“总气体体积”来描述。然而，从上文显而易见，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则该术语应解释为涵盖总气体体积和总气体压力。
本文所用“抑制”是指与微生物菌株在不同培养条件下的生长相比，所述微生物菌株的生长减少，例如当与至少一种其他微生物菌株组合生长时，微生物菌株生长的减少，其相比于相同菌株当作为单一菌株单独生长时的生长。
可以监测不同的参数以检测微生物菌株的抑制，这取决于所述微生物菌株的代谢。培养物的浊度和抑菌圈的存在通常分别用于确定液体培养物和固体培养物中是否存在抑制。在本公开中，封闭培养系统中产生的总气体体积已被用作监测一种或多种产气微生物菌株生长的灵敏且精确的方式，并且该参数已用作测量抑制的方式。
术语“益生菌微生物菌株”是指，当应用于动物或人时有益地影响宿主的活的或冻干的微生物培养物、死微生物、微生物碎片和微生物的提取物或上清液(FAO/WHO(2001)Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milkwith Live Lactic Acid Bacteria.Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultationon Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in FoodIncluding Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria)。益生菌微生物菌株可以作为直接饲喂微生物(Direct-Fed Microbial,DFM)施用。
术语“直接饲喂微生物”或“DFM”是指活的微生物，包括孢子，其当以足够的量施用时，可以为宿主带来益处，例如改善消化或健康。
具体实施方式
在本公开的一个方面，提供了用于检测至少一种第一微生物菌株对至少一种产气第二微生物菌株的抑制的方法，该方法包括：
a)提供至少一种第一微生物菌株；
b)提供至少一种产气第二微生物菌株；
c)在封闭培养系统中培养所述至少一种第一微生物菌株和所述至少一种产气第二微生物菌株；
d)确定c)的所述封闭培养系统中产生的总气体体积；
e)确定当在不存在任何其他微生物菌株的情况下、在封闭培养系统中培养时，所述至少一种产气第二微生物菌株产生的总气体体积；以及
f)比较d)和e)的总气体体积。
在本公开的一个方面，提供了用于定量至少一种第一微生物菌株对至少一种产气第二微生物菌株的抑制的方法，该方法包括：
a)提供至少一种第一微生物菌株；
b)提供至少一种产气第二微生物菌株；
c)在封闭培养系统中培养所述至少一种第一微生物菌株和所述至少一种产气第二微生物菌株；
d)确定c)的封闭培养系统中产生的总气体体积；
e)确定当在不存在任何其他微生物菌株的情况下、在封闭培养系统中培养时，所述至少一种产气第二微生物菌株产生的总气体体积；以及
f)比较d)和e)的总气体体积。
在本公开的一个实施方案中，用一种潜在抑制性第一微生物菌株和一种产气第二微生物菌株进行本公开的方法。对本领域普通技术人员显而易见的是，可以用一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或甚至更多种第一微生物菌株结合一种、二、三、四、五、六、七、八、九或十种或甚至更多种第二微生物菌株进行本公开的方法。重要的是，微生物菌株的数目将是已知和确定的，这与菌株的数目是未知的并且要高得多的生物样品形成对比。
在本公开的一个实施方案中，所述至少一种第一微生物菌株是单一微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，所述至少一种第一微生物菌株是两种或更多种微生物菌株。例如，可以确定两种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定三种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定四种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定五种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定六种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定七种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定八种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，可以确定九种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力，或可以确定十种微生物菌株的组合对一种产气第二微生物菌株的抑制能力。这可能是有用的，因为一些微生物菌株，其全都落入第一微生物菌株的定义之内，当作为组合存在时，与如果作为单一菌株存在时相比，可以更大程度地抑制产气微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，至少一种第二微生物菌株是单一微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，至少一种第二微生物菌株是两种或更多种微生物菌株。例如，可以确定第一微生物菌株对以下的抑制能力：一种产气第二微生物菌株，或两种产气第二微生物菌株的组合，例如三种产气第二微生物菌株的组合，例如四种产气第二微生物菌株的组合，例如五种产气第二微生物菌株的组合。这可能是有用的，因为一些产气第二微生物菌株，其全都落入第二微生物菌株的定义，可能同时存在于体内。
为了便于理解，下文通过使用术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“所述(the)”而不是“至少一个/一种(at least one)”来描述本发明。然而，在描述本发明的上下文中，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则这些术语应解释为涵盖单数和复数。
可以根据总气体体积来确定产气微生物菌株的产气能力。可以通过测量一段时间内的产气量，例如在培养期间定期测量，或通过在培养期结束时测量累积气体，来确定微生物菌株培养期间产生的总气体体积。如果在培养期间测量产气量，则可以选择各个测量之间的时间间隔以提供所需的精度，例如提供几乎连续的测量。当以这种方式测量产气量时，即使在实验之后也可以返回到任何所需的时间点。
在本发明的一个实施方案中，在封闭培养系统中培养4小时的时间段，例如培养8小时的时间段，例如培养12小时的时间段，例如培养18小时的时间段，例如培养24小时的时间段，例如培养30小时的时间段，例如培养36小时的时间段，例如培养42小时的时间段，例如培养48小时的时间段，例如培养54小时的时间段，例如培养60小时的时间段，例如培养66小时的时间段，例如培养72小时的时间段，在培养期间测量累积产气量。
为了确定一种产气微生物菌株产生的总气体体积，应当将所述产气微生物菌株作为单一菌株培养在封闭培养系统中。
本公开提供了通过在同一封闭培养系统中一起培养第一微生物菌株和产气第二微生物菌株并测量在所述第一和第二微生物菌株培养期间产生的总气体体积来确定所述第一微生物菌株是否抑制所述产气第二微生物菌株的方法。如果在封闭培养系统中作为单一菌株培养时产气第二微生物菌株产生的总气体体积是已知的，则可以通过以下方式评估和定量第一微生物菌株对产气第二微生物的抑制能力，即比较：
-产气第二微生物菌株作为单一菌株培养时即在不存在其他微生物菌株的情况下产生的总气体体积，与
-产气第二微生物菌株与潜在抑制性第一微生物菌株一起培养时产生的总气体体积。
在存在抑制性微生物菌株的情况下共培养产气微生物菌株，会导致可由本领域技术人员确定的产气量减少。
在本公开的一个实施方案中，当d)的总气体体积小于e)的总气体体积时，第一微生物菌株能够抑制产气第二微生物菌株。如果需要，可以定量第一微生物菌株对产气第二微生物菌株的抑制。
在本公开的一个实施方案中，当d)的总气体体积等于或大于e)的总气体体积时，第一微生物菌株不能抑制产气第二微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，在确定d)的总气体体积之前，确定e)的总气体体积。例如，在确定d)的总气体体积时，e)的总气体体积可能是已知的。在这种情况下，可以从本文公开的方法中省略步骤e)，并且可以将d)的气体总体积与这样的预定气体体积进行比较，以确定第一微生物菌株对产气第二微生物菌株的抑制能力。
在本公开的一个实施方案中，确定e)的总气体体积与确定d)的总气体体积同时进行。例如，并行进行一系列测试以评估产气第二微生物菌株当作为单一菌株培养时以及当与第一微生物菌株一起培养时的总产气量。
在本公开的一个实施方案中，在确定d)的总气体的体积之后，确定e)的总气体体积。例如，首先在确定d)的总气体体积后，获知e)的总气体体积。
在本公开的一个实施方案中，通过自动化气体产生系统确定总气体体积。可以使用若干种自动化气体产生系统，并且它们可以商业获得，例如ANKOM RF Gas ProductionSystem(ANKOM RF气体产生系统)(ANKOM Technology,US)、Fermograph(ATTOCorporation,JP)、AMPTS II、μFLOW以及相关相关产品(Bioprocess Control,SE).
在本公开的一个实施方案中，产生的总气体是在封闭培养系统中培养至少4小时后的累积产气量，例如培养至少8小时后，例如培养至少12小时后，例如培养至少18小时后，例如培养至少24小时后，例如培养至少30小时后，例如培养至少36小时后，例如培养至少42小时后，例如培养至少48小时后，例如培养至少54小时后，例如培养至少60小时后，例如培养至少66小时后，例如培养至少72小时后。例如，产生的总产气体是在培养结束时测量的累积产气量，此时产气第二微生物菌株不再生长。
在本公开的一个实施方案中，与确定封闭培养系统中的总产气量同时测量和确定产气第二微生物菌株的生长。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株的生长曲线以及总培养时间是已知的。
在本公开的一个实施方案中，封闭培养系统是液体培养系统。液体可有利地用于培养不易在固体培养基上生长的产气微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，封闭培养系统是厌氧培养系统。厌氧培养可有利地用于检测和/或定量对厌氧产气微生物菌株的抑制。
在本公开的一个实施方案中，该方法进一步包括计算第一微生物菌株对产气第二微生物菌株的抑制百分比。抑制百分比可以例如基于算法来计算，该算法考虑了产气第二微生物菌株当作为单一菌株培养时以及当存在潜在抑制性第一微生物菌株培养时产生的总气体体积。
通常认为有利的是，将产气菌株抑制到相当大的程度，例如至少50％，例如至少66％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％。
本发明的方法可以区分个别菌株的抑制效率，即使差异是小的，并且即使对于小的差异可以计算该差异是否是统计学显著的。可以根据菌株对一种或多种产气菌株的抑制效率，对该菌株进行排序。
在本公开的一个实施方案中，该方法进一步包括，针对它们对相同产气第二细菌或酵母菌株的抑制效率，比较至少两种第一细菌或酵母菌株的抑制效率。
本公开还涉及用于筛选和评估许多微生物菌株抑制产气微生物菌株的能力的方法。尽管存在具有相同目的的筛选方法，但本公开的方法提供了优于主要基于在琼脂平板上形成抑菌圈的先前已知方法的若干优点。由于易于确定在封闭培养系统中培养期间产生的总气体体积，本公开的方法允许对抑制进行精确定量。此外，本公开的方法允许筛选在固体培养基上生长不好、培养后不能计数或生长不均匀而形成丝状体的微生物菌株。
在一个实施方案中，本公开内容涉及用于筛选第一潜在抑制性微生物菌株对产气、潜在不良第二微生物菌株的微生物抑制能力的中通量测定或高通量测定。
对于正确定量第一微生物菌株对产气第二微生物菌株的抑制的本发明方法，重要的是，与产气第二微生物菌株产生的总气体体积相比，第一微生物菌株产生的总气体体积可以忽略不计。
因此，在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株不产生或仅产生体积可忽略不计的气体。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株不是产气微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株能够抑制产气微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株是益生菌微生物菌株。
微生物菌株通常分为需氧菌株或厌氧菌株。一些需氧菌株也能够在缺氧的情况下生长，即它们不是严格需氧的。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株是需氧的，并且所述菌株是兼性厌氧的、微需氧的或耐氧的。
在本发明的一个实施方案中，第一微生物菌株是厌氧的，并且所述菌株是厌氧的、兼性厌氧的、耐氧的或专性厌氧的。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株是细菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)，例如以下物种：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，例如解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens)或解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、安全芽孢杆菌(Bacillus safensis)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)或特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株是乳酸细菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)，例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、双科特迪瓦乳杆菌(Lactobacillus diolivorans)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于乳球菌属(Lactococcus)，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于肠球菌属(Enterococcus)，例如屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌的细菌，其实例是大肠杆菌Nissle 1917。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于片球菌属(Pediococcus)，例如戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus)或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于丙酸杆菌属(Propionibacterium)，例如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)或产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)，例如动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
在本公开的一个实施方案中，第一微生物菌株选自由以下组成的组：
a)保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株，
b)保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株，
c)保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株，
d)保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株，
e)保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株，
f)保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株，和
g)保藏为PTA-6752的费氏丙酸杆菌菌株。
在一个实施方案中，至少一种微生物菌株是两种细菌菌株，即保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株和保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株。
在一个实施方案中，至少一种微生物菌株是两种细菌菌株，即保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株和保藏为PTA-6752的费氏丙酸杆菌菌株。
在一个实施方案中，至少一种微生物菌株是三种细菌菌株，即保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株以及保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株是病原微生物菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株是细菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株能够进行厌氧发酵。例如，当在封闭培养系统中厌氧培养时，第二微生物菌株能够产生气体。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株是厌氧的。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株是厌氧的，并且所述菌株是厌氧的、兼性厌氧的、耐氧的或专性厌氧的。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于梭菌属(Clostridium)。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于物种产气荚膜梭菌或败毒梭菌。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于败毒梭菌物种，并且至少一种微生物菌株是三种细菌菌株，即保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株以及保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于A型产气荚膜梭菌物种。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于A型产气荚膜梭菌物种，并且至少一种微生物菌株是两种细菌菌株，即保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株和保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于A型产气荚膜梭菌物种，并且至少一种微生物菌株是两种细菌菌株，即保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株和保藏为PTA-6752的费氏丙酸杆菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于C型产气荚膜梭菌物种。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于C型产气荚膜梭物种，并且至少一种微生物菌株是两种细菌菌株，即保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株和保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于C型产气荚膜梭菌物种，并且至少一种微生物菌株是两种细菌菌株，即保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株和保藏为PTA-6752的费氏丙酸杆菌菌株。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于梭杆菌门或埃希氏菌属，例如大肠杆菌，或沙门氏菌属(Salmonella)。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于酵母属(Saccharomyces)。
在本公开的一个实施方案中，产气第二微生物菌株属于毕赤酵母属(Pichia)，例如发酵毕赤酵母、加拿大毕赤酵母和异常毕赤酵母。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“该(the)”以及类似指代词的使用，应解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包括/包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的列举仅旨在作为单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
附图说明
图1：在48小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株
保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株
和保藏为DSM7534的败毒梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图2：在48小时孵育期间，保藏DSM7534的败毒梭菌菌株作为单一菌株
与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株一起
以及与保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图3：在48小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株
保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株
保藏为DSM7534的败毒梭菌菌株
和败毒梭菌菌株D
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图4：在48小时孵育期间，保藏为DSM7534的败毒梭菌菌株作为单一菌株
与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株一起
以及与保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株一起
的累积压力图。在48小时孵育期间，败毒梭菌菌株D作为单一菌株
与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株一起
以及与保存为DSM17236的地衣芽孢杆菌一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图5：在48小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株
枯草芽孢杆菌菌株A
保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株
和保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图6：在48小时孵育期间，保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株作为单一菌株
与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株一起
与枯草芽孢杆菌菌株A一起
以及与保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图7：在48小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株
保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株
费氏丙酸杆菌菌株B
以及保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图8：在48小时孵育期间，保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌作为单一菌株
与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌一起
与费氏丙酸杆菌菌株B一起
以及与保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图9：在48小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株
乳酸乳球菌菌株C
以及保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图10：在48小时孵育期间，保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌菌株作为单一菌株
与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株一起
以及与乳酸乳球菌菌株C一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图11：在23小时孵育期间，保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株
和保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图12：在24小时孵育期间，保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株
作为单一菌株以及与保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图13：在24小时孵育期间，保藏为DSM16568的植物乳杆菌CH6072菌株、保藏为NCIMB30117的乳酸乳球菌SR 3.54菌株和保藏为DSM22502的屎肠球菌M74菌株的混合物
以及保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图14：在24小时孵育期间，保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株
作为单一菌株以及与保藏为DSM16568的植物乳杆菌CH6072菌株、保藏为NCIMB30117的乳酸乳球菌SR 3.54菌株和保藏为DSM22502的粪肠球菌M74菌株的混合物一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图15：在48小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株的混合物
的累积压力图。在48小时孵育期间，保藏为DSM7534的败毒梭菌菌株
和败毒梭菌菌株D
的累积气压。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图16：在48小时培养期间，保藏为DSM7534的败毒梭菌菌株
作为单一菌株以及与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株的混合物一起
的累积压力图。在48小时培养期间，败毒梭菌菌株D作为单一菌株
以及与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株的混合物一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图17：在24小时孵育期间，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株的混合物
和保藏为NTC3180的C型产气荚膜梭菌菌株
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图18：在24小时孵育期间，保藏为NTC3180的C型产气荚膜梭菌菌株
作为单一菌株以及与保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株的混合物一起
的累积压力图。x轴是时间(小时)，y轴是压力(psi)。
图19：保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌菌株
在BHI培养基中的生长曲线。x轴是时间(小时)，y轴是光密度(OD600nm)。
图20：保藏为NTC3180的C型产气荚膜梭菌的菌落形态。
图21：保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌的菌落形态。
图22：运行后的瓶子计数，平均CFU/mL，一式三份。I：接种了保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌的瓶子；具有芽孢杆菌形态的菌落；II：接种了保藏为NTC3180的C型产气荚膜梭菌的瓶子；具有梭菌形态的菌落；III：接种了枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌的瓶子；具有芽孢杆菌形态的菌落；和IV：接种了枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌的瓶子(与III相同的瓶子)；具有梭菌形态的菌落。虚线是检测限。
保藏和专家解决方案
枯草芽孢杆菌菌株DSM32324已于2016年6月8日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig))。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
枯草芽孢杆菌菌株DSM32325已于2016年6月8日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
枯草芽孢杆菌菌株DSM17231已于2005年4月7日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
地衣芽孢杆菌菌株DSM17236已于2005年4月7日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
解淀粉芽孢杆菌菌株DSM25840已于2012年4月3日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
动物乳杆菌菌株PTA-6750已于2005年5月26日由美国俄克拉荷马州盖蒙的营养生理学公司(Nutrition Physiology Corp.,Guymon,Oklahoma,USA)保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。该保藏是在国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的，并且该菌株可公开获得，因为涉及该菌株的US 8,496,925已经授权。
费氏丙酸杆菌菌株PTA-6752已于2005年5月25日由美国俄克拉荷马州盖蒙的营养生理学公司保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。该保藏是在国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的，并且该菌株可公开获得，因为涉及该菌株的US 7,063,836已经授权。
植物乳杆菌菌株DSM16568已于2004年7月13日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
乳酸乳球菌菌株NCIMB30117可公开获得，因为涉及该菌株的瑞典专利SE 511 828已经授权。
屎肠球菌菌株DSM22502已于2009年4月22日由丹麦的科.汉森有限公司保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行的。
对于所有上述确定的保藏微生物，适用以下附加说明：
关于各自指定国家的各自专利局，申请人请求上述保藏微生物的样品仅可为请求者指定的专家所用，直到被授予专利权之日或申请已被驳回或撤回或被视为被撤回之日。
实施例
材料
Ankom RF气体生产系统，ANKOM RF气体生产系统(ANKOM Technology，美国)
蓝盖瓶(耐压)，Duran目录号218152402
BHI(脑心浸液)肉汤，Oxoid，CM225
血板(具有羊血的胰蛋白胨大豆琼脂)，Oxoid，PB5012A
MRD(最大回收稀释剂)，Oxoid，CM0733
TSA平板(胰蛋白胨大豆琼脂)，Oxoid，PO5012A
保藏为DSM7534的败毒梭菌菌株和保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌是模式菌株，并且公众可从DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124)获得。
公众可从Culture Collections,Public Health England,Porton Down,Salisbury,SP4 0JG,UK(英国索尔兹伯里SP4 0JG波顿唐的英国公共卫生局菌种中心)获得保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌。
接种前
使芽孢杆菌菌株在TSA平板上生长(37℃，需氧孵育，过夜)。将每个菌株的菌落接种在BHI肉汤中，并使其生长过夜(37℃，需氧)，这种繁殖用于接种瓶子。
使梭菌属物种(Clostridium spp.)的菌株在血平板上生长(37℃，厌氧孵育，1-2天)。将每个菌株的菌落接种在BHI肉汤中，并使其生长1-3天(37℃，厌氧)。
将90mL BHI肉汤添加到100mL蓝盖瓶(耐压)并高压灭菌(121℃,15min)。在进行实验之前，将瓶子厌氧孵育过夜。
接种
用0.5mL芽孢杆菌菌株繁殖物和0.5mL梭菌属菌株接种瓶子。还将菌株作为单一菌株接种，这里还添加了0.5mL的无菌水。在将Ankom组件(头部)牢固地拧到瓶子上之前，先用CO2冲洗瓶子。将瓶子在37℃下孵育。将所有组件放入培养箱后开始运行。为了记录产气量，设置为：实时间隔50s，记录间隔10min，全局压力释放0.75psi，阀门打开250ms。记录了24-72小时的累积产气量。
实施例1-4中的接种一式两份进行，实施例5中的接种一式三份进行。
实施例1
| 菌株 | |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32325 |
| 败毒梭菌 | DSM7534 |
保藏为DSM32324和DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株作为单一菌株在48小时孵育期间不产生气体(或产生很少气体)(图1)。
图1还显示了作为单一菌株培养时保藏为DSM7534的败毒梭菌的总产气量。
与将败毒梭菌菌株作为单一菌株培养时相比，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株使保藏为DSM7534的败毒梭菌的产气量减少了97％(图2)。
与将败毒梭菌菌株作为单一菌株培养时相比，保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株使保藏为DSM7534的败毒梭菌的产气量减少了96％(图2)。
实施例2
| 菌株 | |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| 地衣芽孢杆菌 | DSM17236 |
| 败毒梭菌 | DSM7534 |
| 败毒梭菌 | 菌株D |
保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株作为单一菌株在48小时孵育期间不产生气体(或非常少)(图3)。
已经测试了两种不同的败毒梭菌菌株，图3的结果表明，培养期间产生的总气体是菌株特异性的。
保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株完全抑制了两种测试的败毒梭菌菌株(图4)。
图4提供的结果表明，保藏为DSM17236的地衣芽孢杆菌菌株在很大程度上抑制了两种测试的败毒梭菌菌株，因为它提供了败毒梭菌菌株D的一些减少(68％)(图4)和保藏为DSM7534的败毒梭菌的更高减少(76％)。
实施例3
| 菌株 | |
| 动物乳杆菌 | PTA-6750 |
| 枯草芽孢杆菌 | 菌株A |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| A型产气荚膜梭菌 | DSM756 |
图5显示，保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株、枯草芽孢杆菌菌株A和保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株在孵育期间不产生气体。图5还显示了保存为DSM756的A型产气荚膜梭菌的总产气量。
图6的结果表明，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株至少部分(23％)抑制了保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌。枯草芽孢杆菌菌株A导致保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌的产气量有一些减少，但程度较低(6％)。保藏为PTA-6750的动物乳杆菌与保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌一起孵育后，导致总产气量减少了36％。
实施例4
| 菌株 | |
| 动物乳杆菌 | PTA-6750 |
| 费氏丙酸杆菌 | 菌株B |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| C型产气荚膜梭菌 | NCTC3180 |
图7显示，保藏为PTA-6750的动物乳杆菌、费氏丙酸杆菌菌株B和保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌在孵育期间不产生气体。图7还显示了保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌的总产气量。
图8的结果表明，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌完全抑制了C型产气荚膜梭菌(NCTC3180)。保藏为PTA-6750的动物乳杆菌通过在孵育后将C型产气荚膜梭菌(NCTC3180)的总产气量减少74％显示出良好的抑制作用。费氏丙酸杆菌菌株B通过在孵育后将保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌的总产气量减少27％显示出一定的抑制作用。
实施例5
| 菌株 | |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| 乳酸乳球菌 | 菌株C |
| C型产气荚膜梭菌 | NCTC3180 |
图9显示，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株和乳酸乳球菌菌株C当作为单一菌株生长时在孵育期间不产生气体。图9还显示了保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌的总产气量。
图10的结果表明，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌完全抑制保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌，并且乳酸乳球菌菌株C表现出在孵育后有限减少(29％)保藏为NCTC3180的C型产气荚膜梭菌的产气量。
实施例6
| 菌株 | |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM17231 |
| A型产气荚膜梭菌 | DSM756 |
图11显示，保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌菌株在孵育期间不产生气体。图11还显示了保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌的总产气量。
图12的结果表明，保藏为DSM17231的枯草芽孢杆菌导致保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌的产气量有一些减少，但程度较低(11％)。
实施例7
| 菌株 | |
| 植物乳杆菌 | DSM16568 |
| 乳酸乳球菌 | NCIMB30117 |
| 屎肠球菌 | DSM22502 |
| A型产气荚膜梭菌 | DSM756 |
图13显示，保藏为DSM16568的植物乳杆菌菌株、保藏为NCIMB30117的乳酸乳球菌菌株和保藏为DSM22502的屎肠球菌菌株的混合物在孵育期间不产生气体。图13还显示了保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌的总产气量。
图14的结果显示，保藏为DSM16568的植物乳杆菌菌株、保藏为NCIMB30117的乳酸乳球菌菌株和保藏为DSM22502的屎肠球菌菌株的混合物导致保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌的产气量有一些减少，但程度较低(15％)。
实施例8
| 菌株 | |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32325 |
| 解淀粉芽孢杆菌 | DSM25840 |
| 败毒梭菌 | DSM7534 |
| 败毒梭菌 | 菌株D |
图15显示，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株的混合物在孵育期间不产生气体。图15还显示了保藏为DSM7534的败毒梭菌和败毒梭菌菌株D的总产气量。
图16的结果表明，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株、保藏为DSM32325的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为DSM25840的解淀粉芽孢杆菌菌株的混合物完全抑制了保藏为DSM7534的败毒梭菌和败毒梭菌菌株D。
实施例9
| 菌株 | |
| 枯草芽孢杆菌 | DSM32324 |
| 动物乳杆菌 | PTA-6750 |
| C型产气荚膜梭菌 | NTC3180 |
图17显示，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株的混合物在孵育期间不产生气体。图17还显示了保藏为NTC3180的C型产气荚膜梭菌的总产气量。
图18的结果显示，保藏为DSM32324的枯草芽孢杆菌菌株和保藏为PTA-6750的动物乳杆菌菌株的混合物导致保藏为NTC3180的C型产气荚膜梭菌的产气量减少(95％)。
实施例10
在37℃孵育后，测量了BHI培养基中含有保藏为DSM756的A型产气荚膜梭菌的培养物的光密度(OD600nm)(图19)。生长曲线表明了与产气量的相关性。
实施例11
通过在MRD中进行连续稀释并将适当的稀释物涂布培养在血板上，对运行后瓶子的内容物进行计数。将平板在37℃下厌氧孵育过夜。基于不同的菌落形态，对菌落进行计数(参见图20和21)。
当在血平板上计数时，用枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌两者接种的瓶子显示出关于梭菌的减少(图22)。与仅接种产气荚膜梭菌的瓶子相比，大约下降了3log。
当计数具有枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌的组合的瓶子时，平板上没有可见的梭菌菌落。根据接种方案，具有菌株组合的瓶中梭菌水平低于1E+06CFU/mL，如图22的虚线所示，这是检测限。
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.定量至少一种第一细菌或酵母菌株对单一产气第二细菌或酵母菌株的抑制效率的方法，所述方法包括：
a)提供至少一种不产生气体或仅产生体积可忽略不计的气体的第一细菌或酵母菌株；
b)提供单一产气第二细菌或酵母菌株；
c)在封闭培养系统中培养所述至少一种第一细菌或酵母菌株和所述单一产气第二细菌或酵母菌株，所述系统是不透气的并且不添加额外的养分且不去除废产物；
d)通过测量产生的气体压力的自动气体测量装置测量一段时间内在c)的所述封闭培养系统中产生的总气体体积；
e)通过测量产生的气体压力的自动气体测量装置，测量当在不存在任何其他细菌或酵母菌株的情况下、在封闭培养系统中培养时，在相同的时间内，所述单一产气第二细菌或酵母菌株产生的总气体体积；以及
f)比较d)和e)的总气体压力。
2.根据权利要求1或2所述的方法，其中当d)的总气体压力低于e)的总气体压力时，所述至少一种第一细菌或酵母菌株抑制所述产气第二细菌或酵母菌株。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当d)的总气体压力等于或高于e)的总气体压力时，所述至少一种第一细菌或酵母菌株不抑制所述产气第二细菌或酵母菌株。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述封闭培养系统是厌氧培养系统。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一细菌或酵母菌株是一种细菌或酵母菌株。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一细菌或酵母菌株是两种或更多种细菌或酵母菌株。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一细菌或酵母菌株是细菌菌株。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一细菌或酵母菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一细菌或酵母菌株是乳酸细菌菌株。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一细菌或酵母菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产气第二细菌或酵母菌株是细菌菌株。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产气第二细菌或酵母菌株属于梭菌属(Clostridium)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产气第二细菌或酵母菌株属于物种产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或败毒梭菌(Clostridium septicum)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括计算所述至少一种第一细菌或酵母菌株对所述产气第二细菌或酵母菌株的抑制百分比。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，针对至少两种第一细菌或酵母菌株对相同单一产气第二细菌或酵母菌株的抑制效率，比较所述至少两种第一细菌或酵母菌株的抑制效率。
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