ES2964907T3 - Virus adenoasociado modificado químicamente - Google Patents

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Mathieu Mevel
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Nantes
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

La invención se refiere a virus adenoasociados (AAV) modificados químicamente y su uso en terapia génica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Virus adenoasociado modificado químicamente
Campo de la invención
La invención se refiere a virus adenoasociados (AAV) modificados químicamente y su uso en terapia génica.
Antecedentes de la invención
La terapia génica se desarrolló originalmente para corregir genes defectuosos que subyacen a enfermedades genéticas. Hoy en día, la terapia génica se usa cada vez más en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades adquiridas tales como cánceres.
La terapia génica se basa en el aporte terapéutico de ácido nucleico al núcleo de células del paciente. A continuación, los ácidos nucleicos pueden insertarse en el genoma de la célula efectora o pueden permanecer episómicos. El aporte de un ácido nucleico terapéutico a las células efectoras de un sujeto se puede llevar a cabo mediante diversos métodos, incluyendo el uso de vectores sintéticos y virales. Entre los muchos vectores virales disponibles (por ejemplo, retrovirus, lentivirus, adenovirus y similares), el virus adenoasociado (AAV) recombinante está ganando popularidad como vector versátil para terapia génica, particularmente para aplicaciones in vivo.Las principales ventajas de los AAV recombinantes (rAAV) residen en su amplio tropismo, su alta eficacia de transducción, su expresión episómica persistente y su alto perfil de seguridad, en particular debido a que el AAV silvestre no está asociado con ninguna enfermedad humana. Los ensayos clínicos en seres humanos con rAAV han demostrado una expresión duradera a niveles terapéuticos cuando se dirigen a tejidos tales como la retina, el hígado o las neuronas motoras. Se están llevando a cabo varios ensayos clínicos que usan rAAV como vector génico para un amplio tipo de trastornos. La FDA y la EMA han autorizado recientemente voretigén neparvovec (Luxturna®), que es una cápside de un vector viral adenoasociado de serotipo 2 (AAV2) que comprende un ADNc que codifica la proteína de 65 kDa del epitelio pigmentario retiniano humano (hRPE65), para el tratamiento de la pérdida de visión debida a la distrofia retiniana hereditaria provocada por mutaciones bialélicas confirmadas de RPE65. Como ejemplo adicional, Zolgensma® (onasemnogén abeparvovec-xioi) acaba de ser aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes pediátricos menores de 2 años con atrofia muscular espinal (AME). Zolgensma® es un vector AAV9 capaz de aportar una copia funcional y no mutada del gen defectuoso en AME, a saber, el gen SMN1,en motoneuronas.
A pesar de estos éxitos, ciertos ensayos clínicos han demostrado algunas limitaciones de estos vectores, en el tratamiento de ciertas enfermedades. Su primera limitación radica en su inmunogenicidad. Debido a su naturaleza no integrativa, la terapia génica sistémica con vectores AAV, especialmente en pacientes pediátricos, podría verse limitada por la proliferación tisular que induce una dilución del vector con el tiempo. Sin embargo, la readministración de los vectores podría verse impedida por anticuerpos neutralizantes (Nab) persistentes activados después de la primera administración del vector viral. Por otra parte, se demostró además que la inmunidad humoral preexistente a ciertos serotipos de AAV, especialmente AAV del serotipo 2, es altamente prevalente en seres humanos. Los anticuerpos neutralizantes (NAb) anti-AAV pueden prevenir completamente la transducción en un tejido diana, lo que da como resultado una falta de eficacia, particularmente cuando el vector se administra directamente en el torrente sanguíneo. Como resultado, los sujetos seropositivos a Nab contra AAV generalmente quedan excluidos de los ensayos de terapia génica.
Una limitación adicional de los AAV reside en su amplio tropismo, que puede dar como resultado la expresión del transgén en otros tejidos distintos de aquellos en los que se desea la expresión del transgén.
El AAV como vector génico también puede sufrir un índice terapéutico reducido. A veces, es necesaria la administración de dosis altas de AAV para lograr una transducción eficaz. Por ejemplo, aunque los vectores AAV2 pueden dirigirse eficazmente al hígado, la expresión del transgén puede restringirse a un número muy pequeño de los hepatocitos transfectados debido a la degradación de los vectores mediada por el proteasoma intracelular, por lo que pueden ser necesarias dosis altas de AAV-2 para lograr el efecto terapéutico buscado. Estas dosis altas plantean un desafío no solo para la producción de vectores, sino que también aumentan el riesgo de una respuesta inmunitaria, entre ellas la inducción de Nab.
Se han propuesto varias estrategias para superar los inconvenientes del AAV, especialmente los del AAV del serotipo 2 (AAV2) en la terapia génica. Algunas de ellas se basan en la modificación de las proteínas de la cápside de los vectores.
En ese sentido, se demostró que las mutaciones en los residuos de tirosina expuestos a la superficie en AAV2 permiten eludir la fosforilación y la ubiquitinación posterior, evitando así la degradación mediada por proteasoma. De hecho, se cree que la falta de ubiquitinación de la cápside mejora el tráfico intracelular de los vectores virales hacia el núcleo, lo que da como resultado un aumento de la eficacia de transducción en los hepatocitos tanto in vitro como in vivo (Zhong et al., PNAS, 2008,105, 7827-7832; Markusic et al. Molecular Therapy, 2010, 18, 2048-2056).Se observaron resultados similares para AAV8 en la eficacia de transferencia génica en células retinianas (Petrs-Silva, 2009, Molecular Therapy, 17:463-471).
También se propusieron modificaciones químicas de las cápsides virales para introducir un ligando en la cápside o enmascarar ciertos aminoácidos expuestos a fin de modificar la antigenicidad, el tropismo o la eficacia de transducción del AAV. Como primera estrategia, varios estudios han explorado la incorporación genética de aminoácidos no naturales con cadenas laterales modificadas que comprenden un grupo reactivo tal como grupos alquino, azido o aminofenilo que permiten el posterior acoplamiento selectivo de ligandos mediante reacciones ortogonales. Por ejemplo, en el documento WO2015/062516, un aminoácido no natural, tal como un aminoácido que comprende un azido, se inserta en la cápside mediante modificación genética antes de una etapa de acoplamiento con un ligando mediante reacción de clic a fin de cambiar su tropismo por la célula efectora.
Otra estrategia reside en la modificación química directa de la cápside viral sin ninguna mutagénesis preliminar dirigida al sitio de las proteínas de la cápside.
Sobre ese asunto, Leeet al.(Biotechnol Bioeng 2005, 92:24-34) examinan el potencial de conjugar la superficie de AAV con cadenas de polietilenglicol activadas para proteger el vector de anticuerpos neutralizantes. Horowitzet al.(Bioconj Chem, 2011, 22(4):529-532) describen un enfoque químico para enmascarar selectivamente residuos de arginina sobre la cápside viral basándose en la glucación con metilglioxal. El AAV modificado químicamente resultante conservaba la capacidad de infectar neuronas en cerebro de ratón y fue redirigido desde el hígado al músculo esquelético y cardíaco después de una infección sistémica en ratones. Además, estos AAV glucados mostraron una antigenicidad alterada que podría permitir evadir la neutralización de anticuerpos. Por fin, la solicitud de patente internacional WO2017/212019 propone un método para modificar químicamente la cápside de AAV acoplando covalentemente un ligando que soporta un grupo isotiocianato que reacciona con un grupo amino presente en un residuo de aminoácido tal como lisina o arginina.
Sin embargo, todavía se necesitan nuevos métodos que permitan modular las propiedades de los AAV cuando se usen como vectores de aporte de genes en terapia génica.
Compendio de la invención
La invención se refiere a un virus adenoasociado (AAV) que tiene al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en su cápside, donde dicho residuo de tirosina modificado químicamente es de fórmula (I):
donde:
X1 se selecciona del grupo que consiste en:
Ar es un resto arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.
X1 está preferiblemente en la posición orto del grupo fenol.
En algunas realizaciones, al menos un residuo de tirosina modificado químicamente tiene la fórmula (la):
donde
- X1, y Ar son como se definen anteriormente,
- El espaciador es un grupo para ligar el grupo "Ar" al resto funcional "M" que comprende preferiblemente hasta 1000 átomos de carbono y que está preferiblemente en forma de una cadena química que comprende opcionalmente heteroátomos y/o restos cíclicos,
- n es 0 o 1 , y
- M es un resto funcional que comprende un grupo seleccionado entre un agente protector estérico, un agente marcador, un ligando específico para el tipo de célula, un resto farmacológico y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones particulares, X1 es de fórmula (a) y/o "Ar" se selecciona entre fenilo, piridilo, naftilo y antracenilo sustituidos o no sustituidos.
En algunas otras realizaciones, la al menos una tirosina modificada químicamente en la cápside del AAV tiene la fórmula (Ic):
donde:
- X2 es -C(=O)-NH, -C(=O)-O, -C(=O)-O-C(=O)-, O-(C=O)-, NH-C(=O)- , NH-C(=O)-NH, -O-C=O-O-, O, NH, -NH(C=S)- o -(C=S)-NH-, preferiblemente -(C=O)-NH - o -(C=O)-O-- X2 está en la posición para, meta u orto, preferiblemente en la posición para del grupo fenileno,
- El espaciador, n y M son como se definen anteriormente.
El “espaciador”, cuando está presente, puede seleccionarse del grupo que consiste en cadenas hidrocarbonadas C2-C40 saturadas o insaturadas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, y/o "M" pueden comprender, o consistir en, un ligando dirigido al tipo de célula, preferiblemente seleccionado de un mono- o un polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, un péptido dirigido al músculo (MTP) o angiopep-2 , una proteína o un fragmento del mismo, un receptor membranario o un fragmento del mismo, un aptámero, un anticuerpo incluyendo un anticuerpo de cadena pesada, y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, vitaminas y fármacos tales como ligandos CB1 y/o CB2.
En algunas otras realizaciones, el “espaciador” (cuando está presente) se selecciona del grupo que consiste en cadenas alquílicas C2-C20 lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, P<l g>A, polímero de alquildiamina y combinaciones de los mismos, teniendo dichos polímeros de 2 a 20 monómeros y/o "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de un proteína seleccionada de transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico PFGF, un mono- o polisacárido que comprende uno o varios residuos de galactosa, manosa, N-acetilgalactosamina, GalNac puenteada, o manosa-6-fosfato, un MTP seleccionado de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 7, y vitaminas tales como ácido fólico.
Por ejemplo, M es un ligando específico para el tipo de célula para dirigirse específicamente a hepatocitos y comprende al menos un resto de fórmula (111):
y/o el “espaciador” es una cadena de polietilenglicol que comprende de 2 a 10 monómeros.
Como ejemplo adicional, el AAV comprende al menos una tirosina modificada químicamente en su cápside que es de fórmula (II):
En algunas otras realizaciones, el AAV de la invención tiene además al menos un residuo de aminoácido modificado químicamente adicional en la cápside, que es diferente de un residuo de tirosina, soportando preferiblemente dicho residuo de aminoácido un grupo amino modificado químicamente con un grupo de fórmula (V):
donde:
- N* es el nitrógeno del grupo amino de un residuo de aminoácido, por ejemplo de un residuo de lisina o de un residuo de arginina,
- Ar, el espaciador, n y M tiene la misma definición que Ar, espaciador, n y M como se define en la fórmula (II) anterior.
El AAV de la invención puede ser de cualquier tipo. Por ejemplo, el AAV puede ser un AAV recombinante, preferiblemente seleccionado entre AAV que tiene una cápside silvestre, AAV de serotipo natural, AAV variante, AAV seudotipado, AAV con cápsides híbridas o mutadas y AAV autocomplementario.
La invención también se refiere a un método para modificar químicamente la cápside de un AAV, más precisamente para modificar químicamente al menos un residuo de tirosina en la cápside de un AAV, que comprende incubar dicho AAV con un reactivo químico que soporta un grupo reactivo seleccionado entre un sal de arildiazonio y un resto de 4 fenil-1,2,4-triazol-3,5-diona (PTAD) en condiciones propicias para hacer reaccionar dicho grupo reactivo con un residuo de tirosina presente en la cápside del AAV para formar un enlace covalente.
En algunas realizaciones, el método de la invención comprende incubar el AAV con un reactivo químico de fórmula (VI d)
a fin de obtener al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en la cápside de fórmula (Ic):
donde:
- X2 es -C(=O)-NH, -C(=O)-O, -C(=O)-O-C(=O)-, O-(C=O)-, NH-C(=O)-, NH-C(=O)-NH, - O-C=O-O-, O, NH, -C=S-NH o NH-C=S-, preferiblemente -(C=O)-NH- o -(C=O)-O-
- X2 está en la posición para, meta u orto, preferiblemente en la posición para del grupo fenilo,
- el espaciador es un grupo hidrocarbonado que comprende de 2 a 400 átomos de carbono,
- n es 0 o 1 , y
- M es un resto químico que comprende un agente protector estérico, un agente marcador, un ligando específico para el tipo de célula o un resto farmacológico.
La invención también se refiere a un AAV obtenible u obtenido mediante el método de la invención. Un objeto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un AAV como se define anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención se refiere además a dicho AAV o dicha composición farmacéutica para su uso como agente de diagnóstico o como fármaco in vivo, preferiblemente en terapia génica. La invención también se refiere al uso de dicho AAV o dicha composición farmacéutica como agente de diagnóstico y como vector génico ex vivo o in vitro.
Figuras
Figura 1, Figura 4C, Figura 6C, Figura 7C y Figura 8C: Integridad de la proteína de la cápside de AAV medida mediante SDS-PAGE y tinción con plata. Se añadieron 1012 vg de los vectores AAV2-Luc-GFP, AAV2-GFP y AAV8-GFP a una solución de 2, 3, 4, 6, 7 u 8 (3E5 o 3E6 eq) en tampón de TBS (pH 9,3) y se incubaron durante 4 h a temperatura ambiente. Se analizaron 1010 vg de cada condición mediante SDS-PAGE y tinción con plata. VP1, VP2 y VP3 son las tres proteínas que constituyen la cápside de AAV. El peso molecular de la proteína de la cápside se indica a la derecha de las imágenes según una escala de proteínas. AAV2 2: AAV2 incubado con compuesto 2 (invención), AAV2 3: AAV2 incubado con compuesto 3 (comparativo), AAV2 4: AAV2 incubado con compuesto 4 (comparativo), AAV2 6: AAV2 incubado con compuesto 6 (invención), AAV2 7: AAV2 incubado con compuesto 7 (invención), AAV2 8: AAV2 incubado con compuesto 8 (comparativo), AAV8 4: AAV8 incubado con compuesto 4 (comparativo), AAV8 2: AAV2 incubado con compuesto 2 (invención).
Figura 2, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9: análisis de transferencia por puntos. Se añadieron 1012 vg de vectores AAV2-Luc-GFP, AAV2-GFP o AAV8-GFP a una solución de compuestos 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9,10, 11 y 12 (3E5 o 3E6 eq) en tampón de TBS (pH 9,3) y se incubaron durante 4 h a temperatura ambiente. (A-B) Se analizaron 109 vg de cada condición mediante transferencia de por puntos usando el anticuerpo A20 o ADK8 que reconoce la cápside ensamblada (A ), o usando FITC-lectina de soja o FITC-lectina concanavalina A que reconoce el azúcar GalNAc y manosa (B).
Figura 3, Figura 4: Inmunoelectrotransferencias. Se añadieron 1012 vg de vectores AAV2-Luc-GFP o AAV2-GFP a una solución de compuestos 2, 3 o 4 (3E5 o 3E6 eq) en tampón de TBS (pH 9,3) y se incubaron durante 4 h a temperatura ambiente. Se analizaron 1012 vg de las muestras mediante inmunoelectrotransferencia usando un anticuerpo policlonal contra las proteínas de la cápside para detectar proteínas VP (A) o usando FITC-lectina de soja que reconoce el azúcar GalNAc (B-C). VP1, VP2 y VP3 son las tres proteínas que constituyen la cápside de AAV. El peso molecular de la proteína de la cápside se indica a la derecha de las imágenes según una escala de proteínas. B y C son imágenes de la misma transferencia con tiempos de exposición cortos (B) y largos (C) durante el desarrollo.
Figura 10: Infectividad de AAV2-GFP y AAV2+2: AAV2 modificado químicamente con compuesto 2 (invención) (3E5 y 3E6 eq) en células HEK mediante análisis por FACS.
Figura 11: Infectividad de AAV2-GFP y AAV2+2: AAV2 modificado químicamente con compuesto 2 (invención) (3E5 y 3E6 eq) en células HuH7 mediante análisis por FACS.
Figura 12A y 12B: muestran ejemplos de restos "M" según la invención.
Descripción detallada de la invención
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia (o para diagnóstico cuando sea apropiado).
Según el conocimiento de los inventores, los métodos descritos en la técnica anterior para modificar químicamente las cápsides de AAV se dirigen a residuos de aminoácidos que soportan grupos amino tales como arginina y lisina. Sin embargo, existen otros residuos de aminoácidos de interés para modificar químicamente, tales como los residuos de tirosina expuestos a la superficie. De hecho, la tirosina expuesta a la superficie puede desempeñar un papel fundamental en la inmunogenicidad así como en la degradación proteasómica de AAV en las células. Los inventores han concebido un nuevo método que permite modificar químicamente los residuos de tirosina presentes en la superficie de la cápside de AAV. Este método se basa en la reacción específica de un grupo arildiazonio o un grupo PTAD con el grupo fenilo en el residuo de tirosina, lo que da como resultado un acoplamiento covalente.
Los inventores prepararon varios ligandos de PTAD y diazonio que soportaban un resto de azúcar para modificar químicamente las cápsides de vectores de AAV sobre residuos de tirosina.
Como prueba de concepto, los inventores demostraron que el resto de N-acetilgalactosamina y manosa puede inmovilizarse covalentemente sobre la superficie de la cápside de AAV incubando partículas de AAV con un arildiazonio que soporta N-acetilgalactosamina o manosa (compuestos 2, 6, 7 y 12) en tampón acuoso a pH básico, como lo demuestra el análisis de transferencia por puntos con detección de lectina de soja y concanavalina A.
El inventor demostró además que el acoplamiento covalente no alteraba las subunidades de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2 y AAV8, lo que sugiere que la integridad de los AAV se mantiene, como también lo demuestra la inmunotinción con el anticuerpo A20 y el anticuerpo ADK8, respectivamente. Es de destacar que los inventores demostraron además que los vectores AAV2 modificados químicamente con el compuesto de diazonio 2 aún siguen siendo infecciosos en células HEK de líneas celulares no hepáticas, pero muestran una eficacia de transducción menos importante que la observada con vectores no modificados químicamente (Fig. 10). Por el contrario, en la línea celular hepática HuH7 (que expresa niveles bajos de ASPGR), los vectores AAV2 modificados químicamente con el compuesto de diazonio 2 mostraron una mayor expresión del transgén evidenciada por una mayor intensidad de fluorescencia (Fig. 11). Por lo tanto, la modificación química de los residuos de tirosina de la cápside con ligandos que soportan azúcar daría como resultado una reorientación de los AAV y una modificación de su tropismo in vivo,por lo que podrían reducirse los efectos colaterales.
• AAV modificado químicamente de la invención
Por consiguiente, la invención se refiere a un virus adenoasociado (AAV) que tiene al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en su cápside.
Según se usa en este documento, un virus adenoasociado (AAV) se refiere a un virus pequeño, sin envoltura, de la familia de dependoparvovirus que tiene un genoma de ADN lineal monocatenario de aproximadamente 5 kb de largo. El AAV silvestre tiene dos marcos de lectura abiertos (ORF) principales flanqueados por dos repeticiones terminales invertidas (ITR). Los ORF 5' y 3' codifican proteínas de replicación y de la cápside, respectivamente. El ITR contiene 145 nucleótidos y sirve como origen de replicación del genoma de AAV y señal de empaquetado. En el AAV recombinante, los ORF virales se reemplazan por el casete de expresión génica exógeno, mientras que las proteínas de replicación y de la cápside se proporcionan en trans.
Por consiguiente, en el contexto de la invención, un AAV recombinante se refiere a un AAV en el que se ha introducido una secuencia de ácido nucleico exógena en el genoma viral. Dicha secuencia de ácido nucleico exógena puede ser de cualquier tipo y se selecciona en vista del uso previsto del AAV. Por ejemplo, dicho ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de ARN o ADN.
En realizaciones preferidas, el AAV de la invención es un AAV recombinante. Normalmente, dicho AAV recombinante se va a usar como vector génico para aplicaciones in vivo o in vitro, eso significa que el AAV de la invención es un vector de AAV recombinante. Para una revisión sobre el AAV como vector en terapia génica, se puede consultar Naso et al., Biodrugs, 2017, 31:317-334.
Sólo a modo de ilustración, un AAV recombinante para uso como vector en terapia génica puede comprender un casete de expresión génica exógeno que reemplaza los ORF virales y se coloca entre las dos ITR. Dicho casete puede comprender un promotor, el gen de interés y un terminador. El promotor y el gen de interés se seleccionan dependiendo del tejido/órgano efector y de la afección a tratar. Como otro ejemplo, el AAV recombinante para uso en terapia génica puede comprender una plantilla de ADN para recombinación homóloga en células. Un AAV recombinante de este tipo se puede usar en combinación con herramientas de edición génica para promover la recombinación homóloga en células efectoras in vivo, in vitro o ex vivo. Las herramientas de edición génica pueden ser de cualquier tipo y abarcan, entre otras, CRISPR/Cas9, la nucleasa con dedos de cinc, una meganucleasa, así como ARN y ADN que codifican dichas proteínas.
En el contexto de la invención, el término "AAV" incluye todos los tipos de AAV, incluyendo el AAV silvestre y el AAV recombinante o variante. Las variantes de AAV abarcan, sin limitación, AAV que tiene una cápside mutada o sintética tal como AAV con cápside híbrida, AAV seudotipado así como AAV autocomplementario (scAAV).
La cápside de un AAV silvestre está compuesta por tres proteínas de la cápside superpuestas llamadas proteína viral 1 (VP1), VP2 y VP3. La ingeniería genética de la cápside se refiere a modificaciones de aminoácidos de dicha(s) proteína(s) de la cápside, por ejemplo en sus bucles hipervariables.
Según se usa en este documento, ”un AAV que tiene una cápside modificada genéticamente” o ”un AAV que tiene una cápside mutada" se refiere a un AAV en el que se han introducido una o varias modificaciones de aminoácidos en al menos una proteína de la cápside (es decir, VP1 y/o VP2 y/o VP3) en comparación con la versión silvestre de dicha proteína de la cápside.
Según se usa en este documento, "una modificación de aminoácidos” abarca la inserción, eliminación o sustitución de uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 100) aminoácidos.
Según se usa en este documento, "un residuo de tirosina modificado químicamente” significa que al menos una tirosina presente en la cápside del virus ha sido modificada químicamente mediante acoplamiento covalente de una entidad química, normalmente mediante el acoplamiento covalente de dicha entidad química en el anillo de fenilo de la tirosina. Dicha tirosina es normalmente un residuo expuesto a la superficie presente en VP1, VP2 o VP3. Una tirosina expuesta a la superficie significa que la tirosina es accesible para el acoplamiento covalente. Dichos residuos de tirosina pueden identificarse mediante modelado molecular de las proteínas de la cápside o de la propia cápside completa.
Según se usa en este documento, ”al menos un residuo de tirosina modificado químicamente” abarca al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 910, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más residuos de tirosina modificados químicamente.
En algunas realizaciones, el AAV modificado químicamente de la invención comprende varios residuos de tirosina modificados químicamente en su cápside.
Dicha tirosina modificada químicamente puede estar presente en VP1 y/o VP2 y/o VP3.
En algunas realizaciones, al menos el 0,1%, por ejemplo al menos el 0,5, 1,2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40% o más de los residuos de tirosina expuestos a la superficie de la cápside están modificados químicamente. En el contexto de la invención, el AAV puede ser un AAV con cápside silvestre o un AAV que tiene una cápside mutada y/o sintética.
En algunas realizaciones, el AAV de la invención es un AAV recombinante con una cápside silvestre. En otra realización, el AAV es un AAV recombinante que tiene una cápside mutada, es decir, una o más modificaciones de aminoácidos en al menos una proteína de la cápside en comparación con la proteína de la cápside original correspondiente.
En una realización particular, el AAV es un AAV recombinante que tiene una cápside mutada, en el que las modificaciones de aminoácidos no están relacionadas con ningún residuo de tirosina presente en las proteínas de la cápside.
Hay varios serotipos de AAV que pueden ser bien silvestres o bien sintéticos. Todos los serotipos están contemplados en el marco de la invención.
Un "serotipo" se define tradicionalmente sobre la base de la falta de reactividad cruzada entre los anticuerpos para un virus en comparación con otros virus. Dichas diferencias de reactividad cruzada se deben habitualmente a diferencias en las secuencias/los determinantes antigénicos de las proteínas de la cápside (por ejemplo, debido a diferencias en las secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 de los serotipos de AAV). El AAV incluye diversos serotipos naturales y sintéticos (por ejemplo, serotipos híbridos, quiméricos o barajados).
Dichos serotipos no limitantes incluyen AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10 (tales como -cy10 o -rh10), -11, - rh74 o variantes de la cápside de AAV genomodificadas tales como AAV-2i8, AAV2G9, -LK3, -DJ y -Anc80. En el contexto de la invención, los serotipos sintéticos también incluyen AAV pseudotipado, a saber AAV resultante de la mezcladura de una cápside y un genoma procedentes de diferentes serotipos virales, tales como AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8, así como AAV con cápsides híbridas derivadas de múltiples serotipos diferentes, tales como AAV-DJ, que contiene una cápside híbrida derivada de ocho serotipos.
Los serotipos sintéticos también abarcan variantes específicas en las que se introduce un nuevo sitio de unión a glucano en la cápside de AAV y se describen en particular en el documento WO2014144229 (que divulga en particular el serotipo AAV2G9). Otros serotipos de AAV incluyen los descritos en los documentos EP2292779 y EP1310571. Además, otros serotipos de AAV incluyen los obtenidos mediante barajado, como se describe en Koerber et al. (Molecular Therapy (2008), 16(10), 1703-1709), inserción de péptidos (p. ej. Deverman et al., Nat Biotechnol (2016), 34(2), 204-209) o diseño racional de la cápside (revisado en Büning et al., Curr Opin Pharmacol (2015), 24, 94-104). En algunas realizaciones, el AAV se selecciona de serotipos naturales, preferiblemente del grupo que consiste en<AAV-2, AAV-3b, AAV-5, AAV->8<, AAV-9 y AAVrh10, más preferiblemente>A<a>V-2.<Por ejemplo, el>A<a>V<de la invención>puede ser un vector de AAV recombinante de serotipo -2.
El AAV puede dirigirse a una gran variedad de células, tejidos y órganos. Ejemplos de células a las que se dirige el AAV abarcan, entre otros, hepatocitos; células de la retina; es decir, fotorreceptores, epitelio pigmentario retiniano (RPE); células musculares, es decir mioblastos, células satélite; células del sistema nervioso central (SNC), es decir, neuronas, gliales; células del corazón; células del sistema nervioso periférico (SNP); osteoblastos; células tumorales, células sanguíneas tales como linfocitos, células hematopoyéticas que incluyen células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes inducidas (iPS) y similares.
Ejemplos de tejidos y órganos a los que puede dirigirse el AAV incluyen hígado, músculo, músculo cardíaco, músculo liso, cerebro, hueso, tejido conectivo, corazón, riñón, pulmón, ganglio linfático, glándula mamaria, mielina, próstata, testículos, timo, tiroides, tráquea y similares. Los tipos de células preferidos son hepatocitos, células retinianas, células musculares, células del SNC, células del SNP y células hematopoyéticas. Los tejidos y órganos preferidos son el hígado, los músculos, el corazón, los ojos y el cerebro.
El tropismo de los AAV puede variar según su serotipo. Por ejemplo, el AAV-2 se puede usar para transducir el sistema nervioso central (SNC), el riñón y las células fotorreceptoras, mientras que el AAV-8 es eficaz para transducir el SNC, el corazón, el hígado, las células fotorreceptoras, el epitelio pigmentario retiniano (EPR) y el músculo esquelético. El AAV puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como transfección transitoria en líneas celulares de interés, por ejemplo en células HEK293 según se describe en la sección de Ejemplos. A este respecto, se puede hacer referencia a Naso et al., Biodrugs, 2017, 31:317-334 que proporcionan una revisión sobre los AAV como vectores en terapia génica y describen los métodos tradicionales para producir AAV a escala industrial.
El AAV de la invención puede tener otros aminoácidos de la cápside que hayan sido modificados químicamente. Por ejemplo, el AAV puede comprender uno o varios grupos amino de la cápside que han sido modificados mediante el método divulgado en el documento WO2017/212019, a saber haciendo reaccionar dicho(s) grupo(s) amino en la cápside con un ligando que soporta grupos reactivos con isotiocianato. Alternativa o adicionalmente, el AAV de la invención puede tener uno o varios residuos de arginina de la cápside modificados mediante glucación, por ejemplo mediante reacción con metilglioxal como se describe en Horowitz (anteriormente).
Normalmente, al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en la cápside tiene la fórmula (I):
donde:
Xi se selecciona del grupo que consiste en:
y
- Ar es un resto arileno o heteroarileno opcionalmente sustituido.
En una realización preferida, el AAV de la invención tiene al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en su cápside, donde dicho al menos un residuo de tirosina modificado químicamente tiene la fórmula (Ia):
donde:
X1 se selecciona del que consiste en:
- n es 1 o 0 "n es 1 " significa que el grupo “espaciador” está presente, "n es 0" significa que el espaciador está ausente,
- Ar es un resto arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido,
- el espaciador es un grupo químico que liga "Ar" con "M",
- M es un resto funcional, cuya naturaleza depende de la modificación funcional del AAV que se busca realizando la modificación química.
- X i
X1 es de fórmula (a) o (b) según se describe anteriormente. Preferiblemente, X1 es de fórmula (a).
X1 puede estar en la posición orto, meta o para, preferiblemente en la posición para.
- grupo Ar
Según se mencionó anteriormente, Ar es un resto arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido.
Según se usa en este documento, "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos, que preferiblemente tiene de 6 a 14 átomos, que tiene al menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugado y que opcionalmente puede estar sustituido. Un "arilo" puede contener más de un anillo aromático tal como sistemas de anillos condensados o un grupo arilo sustituido con otro grupo arilo. Arilo abarca, sin limitación, fenilo, antracenilo, naftilo, indenilo, bifenilo divalente.
"Heteroarilo” se refiere a un grupo heteroarilo. "Grupo heteroarilo" se refiere a un grupo químico, que tiene preferiblemente de 5 a 14 átomos en el anillo, en el que de 1 a 4 heteroátomos son átomos del anillo en el anillo aromático y el resto de los átomos del anillo son átomos de carbono. Heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo y selenio. Grupos heteroarilo adecuados incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquilpirrolilo, N-óxido de piridilo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, quinazolinilo y quinolinilo.
Ejemplos de grupos heteroarilo bicíclicos abarcan, sin limitación, grupos heteroarilo bicíclicos que pueden mencionarse incluyendo grupos 1 H-indazolilo, benzo[1,2,3]tiadiazolilo, benzo[1,2,5]tiadiazolilo, benzotiofenilo, imidazo[1,2-a]piridilo, quinolinilo, indolilo e isoquinolinilo.
"Sustituido" u "opcionalmente sustituido" incluye grupos sustituidos por uno o varios sustituyentes, normalmente 1,2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes. Por ejemplo, los sustituyentes pueden seleccionarse independientemente de alquilo C1-C6, un grupo arilo, cicloalquilo C3-C6, heterocicloalquilo C2-C6, alcoxi C1-C6, alquilamino C1-C6, aminoalquil C1-C6-, alquil(C1-C6)-aminoalquil-, -N3, -NH2, -F, -I, -Br, -Cl, -CN, alcanoílo C1-C6, carboxiéteres C1-C6, acilamino C1-C6, -COOH, -CONH2, -NO2, -SO3H, aminoalquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxialquilo C2-C10, alcoxicarboniloxi C2-C6, -CN, -CF3 y alcoxialquilo C2-C6.
Los sustituyentes preferidos son halógenos, -OH, NH2, NO2, alquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, hidroxialquilo C1-C3 y haloalquilo C1-C3.
La expresión "opcionalmente sustituido" puede ser reemplazada por la expresión "sustituto o no sustituido" a lo largo de esta solicitud.
En algunas realizaciones, "Ar" se selecciona entre arilo y heteroarilo que comprende de 5 a 14 átomos en el anillo, por ejemplo de 6 a 10 átomos en el anillo, estando dicho arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido. Por ejemplo, dicho grupo arilo o heteroarilo puede comprender 1, 2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente entre halógenos, -OH, NH2, NO2, alquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, hidroxialquilo C1-C3 y haloalquilo C1-C3.
En algunas realizaciones particulares, "Ar" se selecciona del grupo que consiste en fenilo, piridilo, naftilo y antracenilo sustituidos o no sustituidos. Dichos compuestos aromáticos pueden comprender de 1 a 3 sustituyentes, preferiblemente seleccionados independientemente entre halógenos, -OH, NH2, NO2, alquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, hidroxialquilo C1-C3 y haloalquilo C1-C3.
- Grupo espaciador
El “espaciador” es un grupo químico opcional, que de ese modo puede estar presente o ausente.
Cuando está presente, el “espaciador” se usa para ligar el grupo "Ar" al resto funcional "M". El “espaciador” puede ser cualquier cadena química que pueda comprender heteroátomos así como restos cíclicos tales como grupos cicloalquilo o aromáticos. El “espaciador” puede comprender hasta 1.000 átomos de carbono e incluso más. La longitud y la naturaleza química del espaciador se pueden optimizar dependiendo del resto "M" que se pretende acoplar con los residuos de tirosina y el efecto biológico que se busca. De hecho, además de su función de ligación, el “espaciador” se puede usar para refinar las propiedades del resto funcional "M". Por ejemplo, el "espaciador" puede disminuir el impedimento estérico de "M" con respecto a la cápside, mejorar la accesibilidad de "M" para unirse con una entidad biológica de interés, mejorar la unión de "M" con una entidad de interés y/o aumentar la solubilidad de "M".
En algunas realizaciones, el “espaciador” es un grupo de cadena química que comprende de 2 a 1000 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 500 átomos de carbono, de 2 a 300 átomos de carbono, por ejemplo de 2 a 100 átomos de carbono, de 2 a 40 átomos de carbono, de 4 a 30 átomos de carbono o de 4 a 20 átomos de carbono. Normalmente, el “espaciador” se selecciona del grupo que consiste en polímeros que incluyen homopolímeros, copolímeros y polímeros de bloques, péptidos, oligosacáridos y cadenas hidrocarbonadas saturadas o insaturadas opcionalmente interrumpidas por uno o varios heteroátomos (por ejemplo, S, O, Se, P o NH), teniendo opcionalmente al menos uno de sus extremos un heteroátomo tal como S, O y NH, y opcionalmente sustituido por uno o varios sustituyentes tales como hidroxilo, halógenos, alcoxi C1-C3, -CN, -CF3 o alquilo C1-C3, y combinaciones de los mismos.
Según se usa en este documento, "combinaciones" significa que el grupo espaciador puede comprender varias cadenas hidrocarbonadas, cadenas oligoméricas o cadenas poliméricas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) ligadas por cualquier grupo apropiado, tales como grupos -O-, -S-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -C(O)-O-C(O)-, -NH-, -NH-CO-NH-, -O-CO-NH-, NH-(CS)-NH-, NH-CS- fosfodiéster o fosforotioato.
En algunas realizaciones, el espaciador se puede seleccionar del grupo que consiste en poliéteres tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol, poli(alcohol vinílico) (PVA), poliésteres tales como polilactato, poliacrilato, polimetacrilato, polisilicona, poliamida tal como policaprolactona y poli( N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) (pHPMA), poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA), polímeros de alquildiaminas, cadenas hidrocarbonadas insaturadas o saturadas, ramificadas o no ramificadas, que opcionalmente tienen un heteroátomo tal como O, NH y S en al menos un extremo, y combinaciones de los mismos.
Según se usa en este documento, alquildiamina se refiere a NH2-(CH2)r-NH2 donde r es un número entero de 2 a 20, por ejemplo de 2 a 10, tal como 2, 3, 4 y 5. Un polímero de alquildiaminas (también conocido como poliaminas) se refiere a un compuesto de fórmula NH2-[(CH2)r-NH]t-H siendo r como se define anteriormente y t es un número entero de al menos 2, por ejemplo de al menos 3, 4, 5, 10 o más. Los polímeros de alquildiaminas de interés son, por ejemplo, espermidina y espermina.
Por ejemplo, el espaciador comprende al menos un resto polietilenglicol que comprende de 2 a 40 monómeros, por ejemplo de 2 a 10 o de 2 a 6 monómeros. Sólo a modo de ilustración, el espaciador puede comprender de 2 a 10 bloques de trietilenglicol ligados entre sí mediante conectores. Como otro ejemplo, el espaciador puede ser un derivado de trietilenglicoletilamina hidrófilo C12. Alternativamente, el espaciador puede ser una cadena hidrocarbonada C2-C40, en particular una cadena alquílica C10-C20 o una cadena alquílica C2-C10, tal como una cadena alquílica C6, saturada o insaturada. La cadena alquílica puede tener un grupo tal como NH, S u O en al menos un extremo.
Como ejemplos adicionales, el espaciador puede seleccionarse entre espermidina, putrescina, espermina y combinaciones de las mismas.
En una realización particular, el grupo espaciador se selecciona del grupo que consiste cadenas alquílicas C2-C20 lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de diaminoalquilo y combinaciones de los mismos. Preferiblemente dichos polietilenglicol, polipropilenglicol, PLGA, pHMA y polímero de alquildiaminas comprenden de 2 a 40 monómeros, preferiblemente de 2 a 10 o de 10 a 20 monómeros.
Por ejemplo, el grupo “espaciador” puede comprender uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) bloques de trietilenglicol.
- Fracción ”M ”
El resto funcional "M" puede ser de cualquier tipo. Normalmente, "M" se selecciona dependiendo del efecto biológico que se busca al modificar químicamente la cápside del AAV.
Por ejemplo, "M" puede comprender un resto seleccionado entre un agente dirigido, un agente protector estérico, un agente marcador o un fármaco. "M" puede ser también una (nano)partícula, incluyendo una (nano)partícula magnética y un punto cuántico. Por ejemplo, M puede ser una (nano)partícula de hierro, colorante, silicio, oro o carbono.
En algunas realizaciones, "M" comprende, o consiste en, un agente marcador, por ejemplo un tinte fluorescente como fluoresceína, rodamina, tintes de boro-dipirrometeno (Bodipy) y Alexa fluor, o un radionúclido.
En otras realizaciones, "M" comprende, o consiste en, un agente protector estérico, por ejemplo un agente capaz de enmascarar ciertos epítopos de la cápside, evitando así la unión de anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, "M" puede ser un polietilenglicol (PEG), pHPMA o un polisacárido.
En una realización específica, "M" comprende, o consiste en, un agente protector estérico capaz de enmascarar residuos de tirosina, mediante lo cual se evita la degradación proteasómica del AAV en la célula.
En algunas realizaciones, M comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula, a saber un ligando que permite dirigirse a un tipo específico de célula. Este ligando puede permitir modificar el tropismo del AAV, es decir, su capacidad para infectar y/o transducir selectivamente una línea celular, tejido u órgano dados. Por ejemplo, "M" puede ser un ligando que se une específicamente a una entidad biológica membranaria (por ejemplo, un receptor membranario) de la célula efectora. Dicho ligando puede ser, por ejemplo, un mono- o polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, angiopep-2, péptidos dirigidos al músculo, una proteína o un fragmento de la misma, un receptor membranario o un fragmento del mismo, ligandos CB1 y CB2, un aptámero, un anticuerpo que incluye un anticuerpo de cadena pesada, y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, moléculas químicas pequeñas que se sabe que se unen a la entidad biológica efectora y similares.
En algunas realizaciones, "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de proteínas tales como transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico PFGF.
En algunas otras realizaciones, "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de mono- o polisacáridos, por ejemplo que comprende uno o varios de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, N-acetilgalactosamina (GalNac) y GalNac puenteada. Los monosacáridos o polisacáridos pueden ser naturales o sintéticos.
En otra realización, "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de vitaminas tales como ácido fólico.
Según una realización, el ligando específico para el tipo de célula incluido en "M" puede derivarse de, o puede consistir en, un péptido dirigido al músculo (MTP). Dicho ligando puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASSLNIA (SEQ ID NO: 1); WDANGKT (SEQ ID NO: 2); GETRAPL (SEQ ID NO: 3); CGHHPVYAC (SEQ ID NO: 4); HAIYPRH (SEQ ID NO: 5), CQLFPLFRC cíclico (SEQ ID NO: 6) o la secuencia de SEQ ID NO: 7 como se muestra a continuación:
R-X-R-R-B-R-R-X-R-F-Q-I-L-Y-R-X-R-B-R-X-R-B (SEQ ID NO:6)
en la que X es un residuo de ácido aminohexanoico y B es un residuo de beta-alanina.
Según se usa en este documento, CQLFPLFRC cíclico de SEQ ID NO:6 se refiere a:
En determinadas realizaciones, "M" es un péptido dirigido a células cancerosas y comprende un péptido tal como RGD, incluido RGD cíclico.
Cuando "M" comprende un resto peptídico, tal como un péptido dirigido al músculo (MTP), dicho resto peptídico puede comprender una modificación química en su extremo N o su extremo C. Por ejemplo, el extremo N del resto peptídico se puede acilar o acoplar a un resto tal como -C(=O)-(resto PEG)-NH2.
En otras realizaciones, "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de pequeñas moléculas u hormonas tales como naproxeno, ibuprofeno, colesterol, progesterona o estradiol.
En una realización adicional, "M" comprende, o consiste en, un ligando CB1 y/o CB2, por ejemplo:
Los ligandos derivados de galactosa, que son reconocidos por el receptor de asialoglicoproteína (ASPGPr), se pueden usar para dirigirse específicamente a los hepatocitos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, "M" es un ligando para dirigirse específicamente a hepatocitos y comprende al menos un resto de fórmula (IIIa), (IIIb) o (Mío):
En algunas otras realizaciones, "M" es un ligando para dirigirse a células musculares, en particular células de músculo esquelético, y comprende al menos un resto manosa-6-fosfato:
En algunas otras realizaciones, "M" es un ligando para fotorreceptores o células neuronales y comprende al menos un resto manosa de fórmula (ííIf):
En algunas realizaciones, "M" es multivalente, lo que significa que comprende al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) restos de ligando de interés, tales como ligandos específicos para el tipo de célula según se describe anteriormente. Por ejemplo, M puede comprender un conector polifuncional que soporta varios (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5 o 6) ligandos para el tipo de célula. Los ligandos para el tipo de célula pueden ser iguales o diferentes.
Por ejemplo, "M" puede comprender un resto de fórmula (IV):
donde n es un número entero de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 20.
Como otro ejemplo de ligandos multivalentes, "M" puede comprender un resto de fórmula (IV) en la que los grupos GalNac se reemplazan por manosa, fosfato-6-manosa, GalNac puenteada, ligandos CB1 y/o CB2 o péptidos.
En alguna realización particular, "M" puede comprender tanto un resto marcador tal como un marcador fluorescente o un radionúclido como un ligando específico para el tipo de célula. Sólo a modo ilustrativo, M puede ser:
a saber un péptido dirigido al músculo de SEQ ID NO: 1 ligado a K-FITC.
Otros ejemplos de restos químicos que pueden usarse como restos "M" se proporcionan en la Figura 12A y en la Figura 12B.
Como se mencionó anteriormente, los AAV modificados químicamente preferidos son aquellos que comprenden al menos una tirosina modificada químicamente de fórmula (Ia) o (I), en la que X1 es de fórmula (a).
En una realización particular, X1 está en la posición orto del grupo fenilo de la tirosina. Por consiguiente, la invención se refiere a una partícula de AAV que comprende al menos una tirosina modificada químicamente presente en la cápside, que tiene la fórmula (Ib):
donde "Ar", el “espaciador” , n y "M" son como se definen anteriormente para la fórmula (I).
En algunas realizaciones de la invención, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Ib) y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- “Ar” se selecciona del grupo que consiste en fenilo, piridilo, naftilo y antracenilo sustituidos o no sustituidos. “Ar” puede comprender de 1 a 3 sustituyentes, preferiblemente seleccionados independientemente entre halógenos, -OH, NH2, NO2, alquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, hidroxialquilo C1-C3 y haloalquilo C1-C3 y/o
- El “espaciador”, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste en cadenas hidrocarbonadas C2-C40 saturadas o insaturadas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, comprendiendo los polímeros preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando dirigido al tipo de célula, preferiblemente seleccionado entre un monoo polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, péptidos dirigidos al músculo (MTP) o angiopep-2, una proteína o un fragmento de la misma, un receptor membranario o un fragmento del mismo, un aptámero, un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo de cadena pesada y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, una vitamina y moléculas químicas pequeñas tales como medicamentos, por ejemplo ligandos CB1 y/o CB2.
En otras realizaciones, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Ib) y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- "Ar" se selecciona entre un fenilo o un piridilo opcionalmente sustituidos, y/o
- el “espaciador” (cuando esté presente) se selecciona del grupo que consiste en cadenas alquílicas C2-C40, preferiblemente C2-C20, lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, donde el polímero comprende preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de proteínas tales como transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico pFGF, péptidos dirigidos al músculo como los descritos anteriormente y de mono- o polisacáridos, por ejemplo que comprende uno o varios de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, N-acetilgalactosamina o GalNac puenteada, ligandos CB1 y/o CB2 y vitaminas tales como ácido fólico.
En una realización particular, "Ar" es un fenilo opcionalmente sustituido. Normalmente, el fenilo puede estar sustituido con uno o varios sustituyentes seleccionados entre halógenos tales como Cl, Br, I o F, alquilo C1-C6, hidroxialquilo Ci -C<6>, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6, -CN, -NO2, y similares.
En algunas realizaciones, "Ar" es un fenilo no sustituido, estando dicho fenilo unido al grupo espaciador (cuando n es 1) o al grupo M (cuando n es 0) mediante un conector X2.
Por consiguiente, un objeto adicional de la invención es un AAV que comprenda al menos una tirosina modificada químicamente, siendo dicha tirosina modificada químicamente de fórmula (Ic):
donde:
X2 es -C(=O)-NH, -C(=O)-O, -C(=O)-O-C(=O)-, O-(C=O)-, NH-C(=O)- , NH-C(=O)-NH, y -O-C=O-O-, O, NH, NH(C=S)-, -(C=S)-NH-, preferiblemente -(C=O)-NH- o -(C=O)-O]- y
el “espaciador”, n y M son como se describen anteriormente
X2 puede estar en la posición para, meta u orto, preferiblemente en la posición para del grupo fenilo.
En algunas realizaciones de la invención, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Ic) y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- el “espaciador”, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste en cadenas hidrocarbonadas C2-C40 saturadas o insaturadas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, comprendiendo los polímeros preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando dirigido al tipo de célula, preferiblemente seleccionado entre un monoo polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, péptidos dirigidos al músculo (MTP) o angiopep- 2, una proteína o un fragmento de la misma, un receptor membranario o un fragmento del mismo, un aptámero, un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo de cadena pesada y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, una vitamina y moléculas químicas pequeñas tales como medicamentos, por ejemplo ligandos CB1 y/o CB2.
En otra realización, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Ic) y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- el “espaciador” (cuando está presente) se selecciona del grupo que consiste en cadenas alquílicas C2-C40, preferiblemente C2-C20, lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, donde el polímero comprende preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de proteínas tales como transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico pFGF, péptidos dirigidos al músculo como los descritos anteriormente y de mono- o polisacáridos, por ejemplo que comprende uno o varios ligandos de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, N-acetilgalactosamina o GalNac puenteada, ligandos CB1 y/o CB2 y vitaminas tales como ácido fólico.
En algunas realizaciones, X2 es -C(=O)NH- y está en la posición para. Por consiguiente, la invención también se refiere a un AAV que comprende al menos una tirosina modificada químicamente presente en su cápside, siendo dicha tirosina modificada químicamente de fórmula (Id):
En algunas realizaciones, n es 1.
En algunas realizaciones adicionales u otras, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Id) y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
el “espaciador”, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste cadenas hidrocarbonadas C2-C40 saturadas o insaturadas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, comprendiendo los polímeros preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
"M" comprende, o consiste en, un ligando dirigido al tipo de célula, preferiblemente seleccionado entre un mono- o polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, péptidos dirigidos al músculo (MTP), o angiopep- 2, una proteína o un fragmento de la misma, un receptor membranario o un fragmento del mismo, un aptámero, un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo de cadena pesada y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, una vitamina y moléculas químicas pequeñas como medicamentos, por ejemplo ligandos CB1 y/o CB2.
En otras realizaciones, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Id) y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- el “espaciador” (cuando está presente) se selecciona del grupo que consiste en cadenas alquílicas C2-C40, preferiblemente C2-C20, lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, donde el polímero comprende preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de proteínas tales como transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico pFGF, péptidos dirigidos al músculo como los descritos anteriormente y de mono- o polisacáridos, por ejemplo que comprende uno o varios ligandos de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, N-acetilgalactosamina o GalNac puenteada, ligandos CB1 y/o CB2 y vitaminas tales como ácido fólico.
En algunas otras realizaciones, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (la) con Xi que es de fórmula (b), preferiblemente en la posición orto y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- el “espaciador”, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste cadenas hidrocarbonadas C2-C40 saturadas o insaturadas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, comprendiendo los polímeros preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando dirigido al tipo de célula, preferiblemente seleccionado entre un monoo polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, péptidos dirigidos al músculo (MTP) o angiopep-2, una proteína o un fragmento de la misma, un receptor membranario o un fragmento del mismo, un aptámero, un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo de cadena pesada y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, una vitamina y moléculas químicas pequeñas como medicamentos, por ejemplo ligandos CB1 y/o CB2.
En otras realizaciones, la tirosina modificada químicamente presente en la cápside tiene la fórmula (Ia) con X1 que es de fórmula (b), preferiblemente en la posición orto, y se caracteriza además por una o varias de las siguientes particularidades:
- el “espaciador” (cuando está presente) se selecciona del grupo que consiste en cadenas alquílicas C2-C40, preferiblemente C2-C20, lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, donde el polímero comprende preferiblemente de 2 a 40 monómeros, y/o
- "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de proteínas tales como transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico PFGF, péptidos dirigidos al músculo como los descritos anteriormente y de mono- o polisacáridos, por ejemplo que comprende uno o varios ligandos de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, N-acetilgalactosamina o GalNac puenteada, CB1 y/o CB2 y vitaminas tales como ácido fólico.
Sólo a modo de ilustración, el AAV de la invención puede comprender al menos una tirosina modificada químicamente en la cápside, de fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (I Id):
El AAV de la invención puede comprender al menos una tirosina modificada químicamente en la cápside, de fórmula (IIe), (IIf) o (IIg):
En todas las realizaciones descritas anteriormente, especialmente en las que la al menos una proteína modificada químicamente es de fórmula (I), (Ia), (Ib), (Ic) (Id), (IIa), (IIb), (IIc). (IId), (IIe), (IIf) y (IIg), el AAV es preferiblemente un AAV recombinante, más preferiblemente un vector de<a>A<v>recombinante.
Según se mencionó anteriormente, el AAV puede tener una cápside "natural" o una cápside modificada genéticamente, a saber que comprende una o varias mutaciones en al menos una proteína de la cápside, a saber VP1, VP2 y/o VP3. En algunas realizaciones adicionales o alternativas, el AAV puede ser de un serotipo seleccionado entre AAV-2, AAV-3b, AAV-5, AAV-8, AAV-9 y AAVrh10, más preferiblemente AAV-2. Alternativamente, el AAV es de un serotipo sintético.
En algunas realizaciones adicionales, el AAV de la invención puede tener al menos un residuo de aminoácido modificado químicamente adicional en la cápside, que es diferente de un residuo de tirosina, por ejemplo un residuo de arginina o lisina. En algunas realizaciones, dicho residuo de aminoácido soporta un grupo amino en su cadena lateral y está modificado químicamente con un grupo de fórmula (V):
donde:
- N* es el nitrógeno del grupo amino de la cadena lateral de un residuo de aminoácido, por ejemplo de un residuo de lisina,
- Ar, el espaciador, n y M son como se definen en las Fórmulas (Ia), (Ib), (Ic) y (Id). No hace falta decir que Ar, el espaciador, n y M en la fórmula (V) pueden ser iguales o diferentes a los presentes en la al menos una tirosina modificada químicamente según se describe anteriormente.
Dicha modificación sobre el grupo amino se puede introducir como se describe en el documento WO2017212019.
La modificación o las modificaciones químicas de la cápside del AAV pueden modificar una o varias funcionalidades y/o propiedades biológicas. Dependiendo de la naturaleza de "M" que está unido covalentemente en la superficie del AAV modificado químicamente, dicho AAV modificado químicamente puede tener una o varias propiedades biológicas modificadas en comparación con el mismo AAV pero no modificado químicamente, tales como:
- Un tropismo modificado, por ejemplo una selectividad aumentada del AAV hacia un órgano, tejido o célula específicos (ya se administre in vivo o transduciendo tejidos o células en cultivo) o una selectividad desplazada del AAV de un tejido/órgano/célula a otro, y/o
- Una inmunorreactividad alterada del AAV, por ejemplo una inmunogenicidad disminuida del AAV y/o una afinidad disminuida por los anticuerpos neutralizantes, y/o dicho AAV activa una respuesta humoral alterada cuando se administra in vivo, por ejemplo no se generan anticuerpos neutralizantes dirigidos a AAV
- Una mayor eficacia de infectividad de las partículas de AAV, y/o
- Una mayor eficacia de transducción del AAV hacia una célula, tejido u órgano específicos.
- Una toxicidad celular reducida cuando se transducen células en cultivo.
- Inducir mortalidad celular dirigida en células cancerosas
- Visualización/verificación de la partícula de AAV tras la administración in vivo o tras la modificación de células in vitro con estas partículas de AAV
Aplicaciones teranósticas; por ejemplo combinar un agente terapéutico y un agente de diagnóstico
En algunas realizaciones, el AAV modificado químicamente de la invención puede tener una mayor eficacia de transducción, que puede resultar de un mayor tráfico intracelular hacia los núcleos, una disminución en la degradación proteasómica, una decapsidación intranuclear más eficaz, una estabilización más rápida del genoma del vector y/o de una disminución en la interacción con anticuerpos neutralizantes y/o de una reducción de la eliminación de AAV mediada por anticuerpos in vivo, en comparación con el AAV no modificado químicamente. En algunas otras realizaciones, el AAV puede tener una mayor eficacia de infectividad y/o un aumento en la selectividad para una célula, tejido u órgano dados en comparación con el AAV no modificado químicamente in vivo o in vitro.
En algunas otras realizaciones, cuando el AAV se usa como fármaco, por ejemplo como vector génico, estas propiedades modificadas pueden dar como resultado una mejora en el índice terapéutico del AAV, que puede resultar de una disminución en la dosis a administrar al paciente para lograr el efecto terapéutico buscado y/o una disminución en la toxicidad del AAV.
En una realización particular, el AAV modificado químicamente de la invención muestra un tropismo preferencial por un órgano o célula seleccionados entre hígado, corazón, cerebro, articulaciones, retina y músculo esquelético. En otra realización o realización adicional, el AAV modificado químicamente de la invención muestra un tropismo preferencial por células cultivadas seleccionadas entre, entre otras, hepatocitos, cardiomiocitos, miocitos, neuronas, neuronas motoras, células pigmentarias retinianas, fotorreceptores, condrocitos, células madre hematopoyéticas. (HSC) o células madre pluripotentes inducidas (iPS).
• Métodos para preparar el AA V modificado químicamente de la invención
La invención también se refiere a un método para modificar químicamente la cápside de un AAV, más precisamente para modificar químicamente al menos un residuo de tirosina en la cápside de un AAV, que comprende incubar dicho AAV con un reactivo químico que soporta un grupo reactivo seleccionado entre una sal de arildiazonio y un resto 4-fenil-1,2,4-triazol-3,5-diona (PTAD) en condiciones propicias para hacer reaccionar dicho grupo reactivo con un residuo de tirosina presente en la cápside del AAV a fin de formar un enlace covalente.
En una realización particular, el método de la invención es para obtener un AAV modificado químicamente que comprende al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en su cápside, donde dicho residuo de tirosina modificado químicamente tiene la fórmula (Ia):
que comprende incubar el AAV con un reactivo químico seleccionado de entre
en condiciones propicias para hacer reaccionar dicho reactivo químico con un residuo de tirosina presente en la cápside del AAV para formar un enlace covalente.
No hace falta decir que:
- Ar, el espaciador y n son como se definen anteriormente para la fórmula (Ia) y,
- cuando X1 es de fórmula (a), el reactivo químico es de fórmula (VIa), y cuando X1 es de fórmula (b), el reactivo químico es de fórmula (VI b).
Normalmente, las partículas de AAV se incuban con el reactivo químico en condiciones adecuadas para promover la formación de un enlace covalente entre el grupo fenilo de un residuo de tirosina y dicho reactivo químico sin perjudicar la integridad estructural de dicho AAV.
La incubación se puede realizar en un tampón acuoso que tenga un pH de 5 a 11, preferiblemente de 7 a 10, por ejemplo de 8,5 a 10,5, por ejemplo de 9 a 10.
El tampón puede seleccionarse entre tampón de TRIS, tampón de carbonato de sodio - bicarbonato de sodio, tampón de fosfato, por ejemplo PBS o solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS).
Cuando el reactivo químico es de fórmula (VIa), el pH del tampón acuoso puede ser básico, por ejemplo por encima de 7, tal como de 8,5 a 10, por ejemplo de 9 a 10, por ejemplo de 9,0 a 9,6. Este pH básico puede permitir aumentar la reactividad y/o especificidad del reactivo de sal de arildiazonio hacia el grupo fenilo del residuo de tirosina. Por ejemplo, un tampón apropiado para realizar la incubación del AAV con un reactivo de arildiazonio es el tampón de TRIS.
La incubación puede durar desde varios minutos hasta varias horas, por ejemplo desde 5 min hasta 6 h, por ejemplo de 3 a 4 horas. Normalmente, la incubación finaliza cuando se logra un rendimiento suficiente de acoplamiento. La temperatura de incubación es normalmente de 10°C a 50°C. Preferiblemente, la incubación se realiza a temperatura ambiente, es decir, a una temperatura de 18°C a 30°C, por ejemplo a alrededor de 20°C. La incubación puede realizarse bajo agitación.
La relación molar del reactivo químico a las partículas de AAV puede ser de 1,10 a 1, 108, por ejemplo de 1,105 a 1,107, p.ej. 1,106 a 5,106.
El medio puede comprender uno o varios compuestos adicionales. Por ejemplo, cuando el reactivo químico es de fórmula (VIc), el medio puede comprender un oxidante o un sistema que produce un oxidante, tal como H2O2.
El contraanión presente en el reactivo de sal de arildiazonio puede ser de cualquier tipo, preferiblemente TsO-, BF4-, Cl-, AcO-, PF<6>-, TfO- o CF3CO2-En una realización particular, el AAV resultante comprende al menos una tirosina modificada químicamente de fórmula (Ib). Por consiguiente, el reactivo químico tiene la fórmula (Vía):
en la que Ar, el espaciador, n y M son como se definen en la fórmula (Ib).
En algunas otras realizaciones, el AAV resultante comprende al menos una tirosina modificada químicamente de fórmula (Ic). Por consiguiente, el reactivo químico tiene la fórmula (VId):
donde X2, el espaciador, n y M son como se definen en la fórmula (Ic)
En otra realización, el AAV resultante comprende al menos una tirosina modificada químicamente de fórmula (Id). Por consiguiente, el reactivo químico tiene la fórmula (VIe):
donde el espaciador, n y M son como se definen en la fórmula (Id)
El método de la invención puede comprender una o varias etapas adicionales antes o después de la etapa de incubación que se describe anteriormente.
Por ejemplo, el método de la invención puede comprender una etapa de proporcionar o producir las partículas de AAV que se van a modificar químicamente.
La invención también puede comprender una etapa de proporcionar o preparar el reactivo químico.
El reactivo químico puede producirse mediante rutas sintéticas. Por ejemplo, se puede preparar un reactivo químico de fórmula (VI I a) a partir del nitroderivado reduciendo -NO2 en -NH2, p.ej. mediante hidrogenación con Pd/C como catalizador y a continuación formando el grupo arildiazonio a partir del derivado de anilina, por ejemplo por reacción con tBuONO. Sólo como ilustración, se puede hacer referencia a la síntesis del compuesto de fórmula II descrita en la sección de Ejemplos.
El método de la invención también puede comprender una o varias etapas adicionales después de la etapa de incubación, tales como:
- una etapa de desactivación del reactivo químico sin reaccionar al final de la etapa de incubación y/o
- una etapa de retirada del reactivo sin reaccionar, por ejemplo mediante diálisis o filtración en flujo tangencial y/o
- una etapa de recogida de las partículas de AAV modificadas químicamente y/o
- una etapa de purificación de las partículas de AAV modificadas químicamente y/o
- una etapa de recuperación de las partículas de AAV modificadas químicamente y/o
- una etapa de formulación y/o envasado del AAV modificado químicamente.
El método de la invención puede comprender además una etapa de modificación química de un residuo de aminoácido distinto del residuo de tirosina de la cápside del AAV. Por ejemplo, dicho residuo de aminoácido modificado químicamente adicional puede soportar un grupo amino en su cadena lateral.
En una realización particular, el método de la invención puede comprender una etapa de incubación del AAV con un reactivo químico de fórmula (VII):
en condiciones propicias para promover la reacción de dicho reactivo químico con el grupo amino de un residuo de aminoácido, por ejemplo un residuo de lisina o un residuo de arginina, presente en la cápside del AAV, de modo que se forme un enlace covalente. Esta etapa permite modificar químicamente un grupo amino presente en un residuo de aminoácido de la cápside según la siguiente fórmula:
donde:
- N* es el nitrógeno del grupo amino de un residuo de aminoácido, por ejemplo de un residuo de lisina, - Ar, el espaciador, n y M son como se definen en las Fórmulas (Ia), (Ib), (Ic) y (Id). No hace falta decir que Ar, el espaciador, n y M en la fórmula (V) pueden ser iguales o diferentes a los presentes en la al menos una tirosina modificada químicamente según se describe anteriormente.
Normalmente, esta etapa se puede realizar en un tampón acuoso, tal como tampón de TRIS, a un pH de 8 a 10, por ejemplo a un pH de aproximadamente 9,3 y una temperatura de 10°C a 50°C, por ejemplo a temperatura ambiente. Se pueden encontrar más detalles sobre la ejecución de esta etapa en el documento WO2017/212019.
Esta etapa se puede realizar antes, concomitantemente o después de la etapa de modificación química de al menos un residuo de tirosina en la cápside del AAV, según se describe anteriormente.
La invención también se refiere al AAV modificado químicamente obtenible, u obtenido, mediante el método de la invención según se describe anteriormente.
En un aspecto adicional, la invención también se refiere a un método para modificar una o varias propiedades biológicas del AAV, más precisamente las de un AAV recombinante destinado a ser usado como vector génico en terapia génica. De hecho, dependiendo de la naturaleza del resto "M", el método para modificar químicamente la cápside de un AAV, más precisamente para modificar químicamente al menos un residuo de tirosina en la cápside de un AAV, según se describe anteriormente, puede permitir:
- Modificar el tropismo, por ejemplo aumentar la selectividad del AAV hacia un órgano, tejido o célula específicos (bien administrado in vivo o bien transduciendo tejidos o células en cultivo) o cambiar la selectividad del AAV de un tejido/órgano/célula a otro, y/o
- Alterar la inmunorreactividad del AAV, por ejemplo disminuir la inmunogenicidad del AAV y/o disminuir la afinidad por anticuerpos neutralizantes, y/o dicho AAV activa una respuesta humoral alterada cuando se administra in vivo, por ejemplo no se generan anticuerpos neutralizantes dirigidos a AAV, y/o
- Aumentar la eficacia de infectividad de las partículas de AAV, y/o
- Reducir los efectos colaterales, es decir, transducir células que no son necesarias para proporcionar un beneficio del fármaco y que podrían ser incluso perjudiciales.
- Incrementar la eficacia de transducción del AAV hacia una célula, tejido u órgano específicos.
- Reducir la toxicidad celular al transducir células en cultivo.
- Inducir mortalidad dirigida a células en células cancerosas
- Permitir la visualización/verificación de la partícula de AAV tras la administración in vivo o tras la modificación de células in vitro con estas partículas de AAV
- combinar un agente terapéutico y un agente de diagnóstico en el AAV
• Usos del AAV de la invención
El AAV modificado químicamente de la invención se puede usar como herramienta de investigación o como medicamento, por ejemplo como vectores para el aporte de ácidos nucleicos terapéuticos tales como ADN o ARN y/o como medio de diagnóstico, por ejemplo, como agente de obtención de imágenes o una combinación de ambos, incluido el uso teranóstico.
En algunas realizaciones, el AAV modificado químicamente de la invención se usa para aportar un ácido nucleico en una célula y, por lo tanto, es un AAV recombinante.
El AAV recombinante se puede administrar a la célula in vivo, ex vivo o in vitro. La célula puede derivarse de cualquier mamífero, incluidos seres humanos, primates, vacas, ratones, ovejas, cabras, cerdos, ratas y similares. La célula puede ser de cualquier tipo, incluidos hepatocitos, cardiomiocitos, miocitos, neuronas, neuronas motoras, células pigmentarias retinianas, fotorreceptores, condrocitos, células madre hematopoyéticas (HSC) o células madre pluripotentes inducidas (iPS).
El AAV recombinante de la invención puede usarse para aportar un ácido nucleico terapéutico de interés en un sujeto. Por tanto, la invención se refiere a un método para aportar un ácido nucleico terapéutico de interés en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar el AAV modificado químicamente de la invención a un sujeto que lo necesite. El AAV recombinante de la invención se puede aportar al sujeto mediante cualquier vía apropiada. Las vías de administración apropiadas abarcan, sin limitación, las vías de inhalación, tópica, intratisular (por ejemplo, intramuscular, intracardiaca, intrahepática, intrarrenal), conjuntival (por ejemplo, intrarretiniana, subretiniana), mucosa (por ejemplo, bucal, nasal), intraarticular, intravítrea, intracraneal, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intraventricular, intracisternal, intraperitoneal e intralinfática. Normalmente, la vía de administración se selecciona dependiendo del tejido/órgano elegido, a saber dependiendo del tejido/órgano en el que se busca la transducción.
La dosis de AAV a administrar al sujeto normalmente la determina el experto en la técnica en vista de las particularidades específicas del sujeto, el efecto terapéutico buscado y el tejido/órgano efector. Se podrá requerir una única administración o varias administraciones del AAV para conseguir el efecto terapéutico buscado. El AAV de la invención normalmente se administra en forma de una composición farmacéutica, a saber como una mezcla con uno o varios excipientes farmacéuticos.
Las afecciones a tratar mediante la administración del AAV pueden ser de cualquier tipo e incluyen trastornos genéticos, así como trastornos adquiridos. Los trastornos genéticos de interés abarcan trastornos musculares genéticos tales como distrofia muscular de Duchenne, leucodistrofia, atrofia muscular espinal (AME), hemofilia, anemia falciforme y distrofia retiniana hereditaria. El AAV modificado químicamente también se puede usar para tratar trastornos tales como cánceres, artritis, artrosis, cardiopatías congénitas y adquiridas, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer así como enfermedades infecciosas tales como hepatitis C.
Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un AAV modificado químicamente de la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticos pueden seleccionarse entre excipientes bien conocidos tales como vehículos, conservantes, antioxidantes, tensioactivos, tampones, agentes estabilizadores y similares.
La invención se refiere además a un método in vivo o ex vivo para aportar un ácido nucleico de interés en una célula que comprende poner en contacto el AAV modificado químicamente de la invención con la célula. La célula puede proceder del paciente. Después de la transducción, la célula puede trasplantarse al paciente que lo necesite. La célula puede ser, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. El ácido nucleico de interés puede ser de cualquier tipo y se selecciona dependiendo del efecto buscado.
Por ejemplo, el AAV puede comprender un casete de expresión génica exógeno. Dicho casete puede comprender un promotor, el gen de interés y un terminador. Como otro ejemplo, el AAV de la invención puede comprender una plantilla de ADN para recombinación homóloga en células. Este AAV recombinante se puede usar en combinación con herramientas de edición génica, para promover la recombinación homóloga en células efectoras. Las herramientas de edición génica pueden ser de cualquier tipo y abarcan, entre otras, CRISPR/Cas9, nucleasa con dedos de cinc, meganucleasa así como ARN y ADN que codifican dichas proteínas.
La invención también se refiere a una célula anfitriona transfectada con un AAV modificado químicamente de la invención, dicha célula anfitriona puede ser de cualquier tipo.
Por ejemplo, dicha célula anfitriona puede ser hepatocitos, cardiomiocitos, miocitos, neuronas, neuronas motoras, células pigmentarias retinianas, fotorreceptores, condrocitos, células madre hematopoyéticas (HSC) o células madre pluripotentes inducidas (iPS).
Aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se divulgan en la siguiente sección experimental, que debe considerarse ilustrativa y no limitativa del alcance de la presente solicitud.
Ejemplos
Se prepararon los siguientes compuestos:
La síntesis de los compuestos 3, 9 y 10 y el procedimiento de acoplamiento sobre el grupo amino de la cápside de AAV ya están publicados en Chemical Science, 2020, 11, 1122-1131. La síntesis de otros compuestos se describe anteriormente.
1. Síntesis del compuesto 2 (Invención)
El ligando 2 se prepara como sigue:
El compuesto A (1 eq, 1,12 mmol) se solubilizó en DCM, se añadieron DMAP (5 eq, 5,6 mmol) y cloruro de 4-nitrobenzoílo (3 eq, 3,3 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución orgánica se lavó con HCl 1 M, agua y NaHCO3, se secó sobre MgSO4. Después de la concentración, el aceite de naranja se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, AcOEt/MeOH 85/15). Se obtiene un sólido ligeramente amarillo del compuesto B. Rendimiento: 51,7%.
RMN 1H (300 MHz, MeOD): 5 (ppm) 8,34 (d, J= 8,98 Hz, 2H), 8,06 (d, J= 9 Hz, 2H), 5,32 (d, J= 3,13 Hz, 1 H), 5,06 (dd, J= 3,3 Hz, J= 11 HZ, 1H), 4,61 (d, J= 8,41 Hz, 1H), 4,12 (m, 3H), 3,95 (m, 2H), 3,65 (m, 12H), 2,10 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,94 (s, 3H), 1,92 (s, 3H). RMN 13C (75 MHz, MeOD): 5 (ppm) 173,66, 172,08, 172,05, 171,75, 168,22, 151,04, 141,44, 129,85 x 2C, 124,66 x 2C, 102,87, 72,18, 71,84, 71,60, 71,39, 71,35, 70,39, 70,21,68,18, 62,73, 51,56, 41,17, 22,92, 20,55 x 2C, 20,51. HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C27H37N3O14Na (M+Na)+ 650,2173, encontrado 650,2172.
El compuesto B (1 eq, 0,6 mmol) se solubilizó en una mezcla H2O/MeOH 1:1 y se añadió resina básica Amberlist. La mezcla se agitó durante 2 horas hasta la desaparición de la materia prima. La resina se filtró y el filtrado se concentró al vacío para dar el producto C correspondiente como un sólido blanco. Rendimiento: Cuantitativo.
RMN 1H (400 MHz, MeOD): 5 (ppm) 8,33 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 8,05 (d, J= 9,2 Hz, 2H), 4,42 (d, J= 8,4 Hz, 1 H), 3,93 (m, 2H), 3,82-3,46 (m, 18H), 1,96 (s, 3H) RMN 13C (100 MHz, MeOD): 5 (ppm) 174,12, 168,29, 151,08, 141,44, 129,78, 124,66, 103,12, 76,79, 73,50, 71,62, 71,54, 71,40, 70,41,69,76, 69, 67, 62,57, 54,29, 41,19, 23,08. HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C21H31N3OnNa (M+Na)+524,1856, encontrado 524,1852.
El compuesto C (1 eq, 0,6 mmol) se solubilizó en MeOH (15 ml), se añadió Pd sobre carbón vegetal (10% p/p). La mezcla se puso bajo atmósfera de H2 y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla se filtró sobre Celite y el filtrado se concentró al vacío para dar un sólido blanco correspondiente al compuesto D. Rendimiento: 82,3%.
RMN 1H (400 MHz, MeOD): 5 (ppm) 7,60 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 6,67 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 4,41 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 3,76-RMN de 3,46 (m, 20 H), 1,96 (s, 3 H)13C (100 MHz, MeOD): 5 (ppm) 174,16, 170,47, 153,15, 129,97, 123,20, 114,76, 103,12, 76,72, 73,49, 71,57, 71,34, 70,79, 69,74, 69,70, 62,56, 54,29, 40,68, 23,09. HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C21H33N3O9Na (M+Na)+ 494,2114, encontrado 494,2108.
Se obtuvo el derivado de sal de diazonio 2 añadiendo HBF4 (1,1 eq) y tBuONO (1,1 eq) en agua ultrapura al aminoderivado D. Cinco minutos después de la mezcladura en vórtex, se confirmó la formación de la sal de diazonio usando una solución de 2-hidroxinaftol. La mezcla de una gota de cada solución da una coloración roja, permitiendo la formación de la sal de diazonio.
2. Síntesis del compuesto 4 (comparativo)
El compuesto A (1 eq, 0,2 mmol) se solubilizó en DCM (15 ml), se añadieron DMAP (5 eq, 1,1 mmol) y cloruro de benzoílo (3 eq, 0,8 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución orgánica se lavó con HCl 1 M, agua y NaHCO3, se secó sobre MgSO4. Después de la concentración, el aceite amarillo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, AcOEt/MeOH 8/2). Se obtiene un sólido blanco de compuesto E. Rendimiento: 67%.
RMN 1H (400 MHz, MeOD): 5 (ppm) 7,83 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,48 (m, 3H), 5,31 (d, J= 3,2 Hz, 1H), 5,06 (dd, J= 11,2 Hz, J= 3,2 Hz, 1H), 4,61 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 4,11 (m, 3H), 3,92 (m, 2H), 3,68-3,59 (m, 12H), 2,12(s, 3H), 2,02 (s, 2H), 1,94 (s, 3H), 1,91 (s, 3H). RMN 13C (100 MHz, MeOD): 5 (ppm) 173,59, 172,07, 172,06, 171,76, 170,31, 135,72, 132,66, 129,56, 128,34, 102,77, 72,23, 71,84, 71,65, 71.46, 71,36, 70,58, 70,10, 68,23, 62,75, 51,65, 40,88, 22,90, 20,56, 20,54, 20,52. HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C27H39N2O12 (M+H)+ 583,2503, encontrado 583,2504.
El compuesto E (1 eq, 0,15 mmol) se solubilizó en una mezcla H2O/MeOH 1:1 y se añadió resina básica Amberlist. La mezcla se agitó durante 2 horas hasta la desaparición de la materia prima. La resina se filtró y el filtrado se concentró al vacío para dar el producto correspondiente como un aceite incoloro. A continuación, el aceite se criosecó para dar un sólido blanco del compuesto 4. Rendimiento: Cuantitativo
RMN 1H (400 MHz, MeOD): 5 (ppm) 7,83 (m, 2H), 7,49 (m, 3H), 4,42 (d, J= 8,4 Hz, 1 H), 3,93 (m, 2H), 3,81-3,56 (m, 16H), 3,46 (m, 1H), 1,96 (s, 3H) RMN 13C (100 MHz, MeOD): 5 (ppm) 174,14, 170,37, 135,69, 132,66, 129,57, 128,32, 103,09, 76,77, 73,52, 71,63, 71,58, 71,40, 70,60, 69,73, 69,70, 62,55, 54,32, 40,91, 23,07 HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C21H32N2O9Na (M+Na)+ 479,2006, encontrado 479,1997.
3. Síntesis del compuesto 5 (Invención)
A una solución de A (160 mg, 0,246 mmol) en DCM seco (5 ml) se le añadieron cloruro de 6-nitro-2-nicotinoílo (91 mg, 0,492 mmol) y DMAP (90 ml, 0,738 mmol). Después de 2 h de agitación a 20°C, la mezcla de la reacción se diluyó con DCM y se lavó con HCl 1 M y una solución acuosa saturada de NaHCO3. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con MgSO4 y la mezcla se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, AcOEt/MeOH: 90/10) para producir la amida F (94 mg, 0,149 mmol) en forma de un sólido blanco. Rendimiento: 61%.
RMN 1H (300 MHz, CDCI3): 5 = 1,92 (s, 3H, AcO), 1,97 (s, 3H, AcO), 2,01 (s, 3H, AcO), 2,13 (s, 3H, NHAc), 3,63-3,94 (m, 13H), 4,06 -4,21 (m, 3H, H-2, H-6a, H-6b), 4,76 (d, 1H , 712= 8,6 Hz, H-1), 5,12 (dd, 1H, 732= 11,3 Hz, 734= 3,5 Hz, H-3), 5,28 (dd, 1H, 74,3= 3,4 Hz, 74,5= 0,8 Hz, H-4), 6,29 (d, 1 H, 7= 9,1 Hz, NHAc), 8,22 (d, 1H, ¡=7,9 Hz, Py), 8,37 (d, 1H, 7= 8,1,7= 0,9 Hz, Py), 8,55 (d, 1 H, 7=7,7,7=0,9 Hz, Py).RMN 13C (100,6 MHz, CDCh): 5 = 20,6 (2 x CH3, 2 x AcO), 20,7 (CH3, AcO), 20,69 (CH3, AcO), 23,2 (CH3, NHAc), 39,4 (CH2), 50,9 (CH, C-5), 61,5 (CH2, C-6), 66,8 (CH, C-4), 68,7 (CH2), 69,7 (CH2), 70,49 (CH2), 70,51 (CH2) 70,6 (CH), 70,7 (CH, C-3), 71,1 (CH2), 101,9 (CH, C-1), 120,1 (CH, Py), 127,7 (CH, Py), 141,6 (CH, Py), 149,6 (C, Py), 155,1 (C, Py), 162,2 (C, CO), 170,3 (C, AcO), 170,4 (C, AcO), 170,5 (C, AcO), 170,6 (C, NHAc). HRMS (ESI): m/z calculado para C26H37N4O14 [M H]+: 629,2306, encontrado: 629,2307
El compuesto F (88 mg, 0,139 mmol) se disolvió en MeOH seco (2,8 ml) y se añadió metóxido de sodio (42 gl de solución 1 M en MeOH, 0,042 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h y se neutralizó añadiendo resina ácida Amberlite IR120 (H), se filtró y los disolventes se evaporaron hasta sequedad. El producto en bruto de la reacción se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una solución de azúcar desprotegido (0,139 mmol) en MeOH (3 ml) se le añadió Pd/C (24 mg, 20% en peso). La suspensión resultante se agitó bajo atmósfera de H2 (1 atm) durante 8 h. El Pd/C se retiró mediante filtración a través de Celite® y el filtrado se evaporó a presión reducida. El producto en bruto de la reacción se liofilizó para dar la anilina G (54 mg, 0,114 mmol) como un sólido blanco. Rendimiento: 82%
RMN 1H (300 MHz, CD3DO): 5 = 1,97 (s, 3H, NHAc), 1,49 (t, 2H, = 5,9 Hz), 3,57-3,80 (m, 13H), 3,84 (bd, 1H, = 3,1 Hz), 4,06 (m, 2H), 4,43 (d, 1H, 71,2= 8,5 Hz, H-1), 6,69 (dd, 1H, 7= 8,4 Hz, 7=0,8 Hz, Py), 7,30 (dd, 1H, = 7,3,7= 0,7 Hz, Py), 7,53 (dd, 1H, = 8,2, = 7,3 Hz, Py). RMN 13C (100,6 MHz, CDCh): 5 = 23,1 (CH3, NHAc), 40,2 (CH2), 54,3 (CH, C-5), 62,6 (CH2, C-6), 69,7 (CH), 69,8 (CH2), 70,8 (CH2), 71,40 (CH2), 71,47 (CH2), 71,54 (CH2), 70,6 (CH), 73,4 (CH, C-3), 76,7 (CH), 103,2 (CH, C-1), 112,0 (CH, Py), 113,1 (CH, Py), 139,4 (CH, Py) , 148,9 (C, Py), 160,2 (C, Py), 167,5 (C, CO), 174,2 (C, NHAc). HRMS (ESl): m/z calculado para C20H32N4O9 [M Na]+: 495,2067, encontrado: 495,2063.
El derivado de sal de diazonio 5 se obtuvo añadiendo HBF4 (1,1 eq) y tBuONO (1,1 eq) en agua ultrapura al aminoderivado G. Cinco minutos después de la mezcladura en vórtex, se confirmó la formación de la sal de diazonio usando una solución de 2-hidroxinaftol. La mezcla de una gota de cada solución da una coloración roja, permitiendo la formación de la sal de diazonio.
4.Síntesis del compuesto 6 (Invención)
A una solución de ácido 6-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-naftoico (210 mg, 0,644 mmol) en DCM seco (4,3 ml) y HOBt (87 mg, 0,644 mmol) se le añadió gota a gota, a 0°C, CID (90 ml, 0,738 mmol). Después de 15 minutos de agitación, se añadió gota a gota una solución de A (280 mg, 0,429 mmol) que contenía TEA (88 gl, 0,644 mmol). Después de 2 h de agitación a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se diluyó con DCM y se lavó con HCl 1 M y una solución acuosa saturada de NaHCO3. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con MgSO4 y la mezcla se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, AcOEt/MeOH: 95/5) para producir la amida H (94 mg, 0,120 mmol) como un sólido blanco. Rendimiento: 28%.
RMN 1H (300 MHz, CD3DO): 5 = 1,91 (s, 3H, AcO), 1,94 (s, 3H, AcO), 1,97 (s, 3H, AcO), 2,05 (s, 3H, NHAc), 3,53 3,91 (m, 13H), 4,00 (dd, 2H, = 4,0 Hz), 4,07 (dd, 1H, = 11,3 Hz, = 8,5 Hz), 4,42 (s, 2H, PhCH2), 4,48 (d, 1H, 71,2= 8,5 Hz, H-1), 5,00 (dd, 1H, 732= 11,3 Hz, 734= 3,4 Hz, H-3), 5,24 (dd, 1H, 743= 3,4 Hz, 745= 0,8 Hz, H-4), 6,73 (d, 1H, = 2,3 Hz), 7,06 (d, 1 H, 7= 8,9 Hz, = 2,3 Hz), 7,19-7,41 (m, 5H), 7,53 (d, 1H, = 8,9 Hz), 7,70 (m, 2H), 8,18 (d, 1H, = 1,8 Hz).
RMN 13C (100,6 MHz, CD3DO): 5 = 20,5 (CH3, AcO), 20,6 (2 x CH3, 2 x AcO), 22,9 (CH3, NHAc), 40,8 (CH2), 48,3 (CH2), 51,5 (CH, C-2), 61,7 (CH2, C-6), 68,1 (CH, C-4), 70,1 (CH2), 70,7 (CH2), 71,3 (CH2), 71,4 (CH2), 71,6 (CH2), 71,7 (CH), 72,2 (CH, C-3), 102,8 (CH, C-1), 104,3 (CH, Ar), 120,1 (CH, Ar), 125,2 (CH, Ar), 126,9 (CH, Ar), 127,3 (C, Ar), 127,9 (C, Ar), 128,0 (CH, Ar), 128,4 (2 X CH, Ar), 128,9 (CH, Ar), 129,5 (2 X CH, Ar), 130,9 (CH, Ar), 138,7 (C), 140,8 (C), 149,7 (C), 170,6 (C, AcO), 171,8 (C, AcO), 172,0 (2 x C, AcO, CO), 173,6 (C, NHAc). HRMS (ESI): m/z calculado para C39H48N3O14 [M H]+: 782,3136, encontrado: 782,3142.
El compuesto H (86 mg, 0,109 mmol) se disolvió en MeOH (2,2 ml) y se añadió resina básica (190 mg). La mezcla se agitó durante 2 h, se filtró y los disolventes se evaporaron hasta sequedad. El producto en bruto de la reacción se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una solución de azúcar desprotegido en bruto (0,109 mmol) en MeOH (4 ml) se le añadió Pd/C (17 mg, 20% en peso). La suspensión resultante se agitó bajo atmósfera de H2 (1 atm) durante 6 h. El Pd/C se retiró mediante filtración a través de Celite® y el filtrado se evaporó a presión reducida. El producto en bruto de la reacción se liofilizó para dar la anilina I (51 mg, 0,098 mmol) como un sólido blanco. Rendimiento: 90%.
RMN 1H (300 MHz, CD3DO): 5 = 1,95 (s, 3H, NHAc), 3,43 (t, 2H, j= 5,4 Hz), 3,48-3,84 (m, 21 H), 3,92 (m, 2H), 4,38 (d, 1H, 71,2= 8,5 Hz, H-1), 6,97 (d, 1H, j= 2,2 Hz), 7,05 (dd, 1 H, j= 8,7 Hz, j= 2,2 Hz), 7,57 (d, 1 H, j= 8,7 Hz), 7,73 (m, 2H), 8,19 (d, 1H, j=1 ,8 Hz). RMN 13C (100,6 MHz, CD3DO): 5 = 23,1 (CH3, NHAc), 40,9 (CH2), 54,3 (CH, C-2), 62,5 (CH2, C-6), 69,68 (CH, C-4), 69,74 (CH2), 71,4 (CH2), 71,6 (2 X CH2), 73,5 (CH), 76,7 (CH, C-3), 103,1 (CH, C-1), 108,3 (CH, Ar), 120,4 (CH, Ar), 125,1 (CH, Ar), 127,7 (C, Ar), 128,3 (C, Ar), 128,9 (CH, Ar), 131,2 (CH, Ar), 138,4 (C), 149,2 (C), 170,7 (C, NHAc), 174,10 (C, CO). HRMS (ESI): m/z calculado para C25H35N3O9 [M Na]+: 544,2271, encontrado: 544,2270.
El derivado de sal de diazonio 6 se obtuvo añadiendo HBF4 (1,1 eq) y tBuONO (1,1 eq) en agua ultrapura al aminoderivado I. Cinco minutos después de la mezcladura en vórtex, se confirmó la formación de la sal de diazonio usando una solución de 2-hidroxinaftol. La mezcla de una gota de cada solución da una coloración roja, permitiendo la formación de la sal de diazonio.
5. Síntesis del compuesto 7 (Invención)
El compuesto J (1 eq, 1,38 mmol y 0,900 g) se solubilizó en DCM, se añadieron DMAP (3 eq, 4,14 mmol, 0,506 g) y cloruro de 4-nitrobenzoílo (3 eq, 4,14 mmol, 0,769 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución orgánica se lavó con HCl 1 M, agua y NaHCO3, se secó sobre MgSO4. Después de la concentración, el aceite naranja se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, AcOEt/MeOH: 85/15) para dar un sólido ligeramente amarillo K (0,270 g, 0,43 mmol). Rendimiento: 31,1%.
RMN 1H (300 MHz, CDCh): 5 (ppm) 8,27 (m, 2H), 7,99 (m, 2H), 7,19 (br s, 1H), 5,29 (m, 3H, H2, H3, H4), 4,86 (d, 1H, j=1 ,6 Hz, H-1), 4,25 (m, 1H, H-6), 4,07 (m, 2H), 3,87-3,66 (m, 13H, H-5, H-6, PEG), 2,15 (s, 3H, AcO), 2,09 (s, 3H, AcO), 2,03 (s, 3H, AcO), 1,98 (s, 3H, AcO). RMN 13C (75 MHz, CDCh): 5 (ppm) 170,86 (C, CO), 170,30 (2 x C, 2 X CO), 169,79 (C, CO), 165,66 (C, CO), 149,70 (C), 140,37 (C), 128,50 ( 2 x C, CH), 123,83 (2 x C, CH), 97,81 (CH, C-1), 70,78 (CH2), 70,43 (CH2), 70,14 (CH2), 69,81 (CH), 69,68 (CH), 68,71 (CH2), 67,48 (CH2), 66,23 (CH), 62,60 (CH2), 40,25 (CH2), 21,00 (CH3, AcO), 20,88 (CH3, AcO), 20,82 (2 x CH3, 2 x AcO). HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C27H36N2O15Na 651,2013, encontrado 651,2002.
El compuesto K (1 eq, 0,99 mmol, 625 mg) se solubilizó en una mezcla H2O/MeOH 1:1 y se añade resina básica Amberlist. La mezcla se agitó durante 2 horas hasta la desaparición de la materia prima. La resina se filtró y el filtrado se concentró al vacío para dar el producto L como un sólido blanco. (475 mg, 1 mmol, cuant. No seco).
RMN 1H (300 MHz, MeOD): 5 (ppm) 8,32 (m, 2H), 8,04 (m, 2H), 4,72 (d,1H , j= 1,72 Hz), 3,82 (m, 3H), 3,72-3,54 (m, 16H). RMN 13C (75 MHz, MeOD): 5 (ppm) 168,28 (C, CO), 151,05 (C), 141,43 (C), 129,75 (2 x CH, Ar), 124,62 (2 x CH, Ar), 101,74 ( C-1), 74,63, 72,58, 72,13, 71,61,71,42, 71,36, 70,47, 68,65, 67,68, 62,98, 41,22 (CH2). HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C19H27N2O11459,1615, encontrado 459,1611
A una solución de L (90 mg, 0,197 mmol) en MeOH (3 ml) se le añadió Pd/C (25 mg, 20% en peso). La suspensión resultante se agitó bajo atmósfera de H2 (1 atm) durante 4 h. El Pd/C se retiró mediante filtración a través de Celite® y el filtrado se evaporó a presión reducida. El producto en bruto de la reacción se liofilizó para dar la anilina M (69 mg, 0,160 mmol) como un sólido blanco. Rendimiento: 81%.
RMN 1H (400 MHz, CD3DO): 5 = 3,52-3,68 (m, 14H), 3,69-3,74 (2H, m), 3,78-3,85 (3H, m), 6,67 (d, 1 H, j= 8,8 Hz, Ar), 7,71 (d, 1H, j= 8,8 Hz, Ar). RMN 13C (100,6 MHz, CDCh): 5 = 40,7 (CH2), 62,9 (CH2, C-6), 68,6 (CH), 70,8 (CH2), 71,28 (CH2), 71,32 (CH2), 71,37(CH2), 71,5 (CH), 72,1 (CH), 72,6 (CH), 74,6 (CH), 101,7 (CH, C-1), 114,8 (2 x CH, Ar), 123,2 (C, Ar), 129,9 (2 x CH, Ar), 153,1 (C, Ar), 170,2 (C, amida). HRMS (ESI): m/z calculado para C19H30N2OeNa [M Na]+: 453,1849, encontrado: 453,1841.
El derivado de sal de diazonio 7 se obtuvo añadiendo HBF4 (1,1 eq) y tBuONO (1,1 eq) en agua ultrapura al aminoderivado M. Cinco minutos después de la mezcladura en vórtex, se confirmó la formación de la sal de diazonio usando una solución de 2-hidroxinaftol. La mezcla de una gota de cada solución da una coloración roja, permitiendo la formación de la sal de diazonio.
6. Síntesis del compuesto 8 (comparativo)
El compuesto J (1 eq, 0,3 mmol y 0,230 g) se solubilizó en DCM, se añadieron DMAP (3 eq, 0,9 mmol, 0,129 g) y cloruro de 4-nitrobenzoílo (3 eq, 0,9 mmol, 0,167 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución orgánica se lavó con HCl 1 M, agua y NaHCO3, se secó sobre MgSO4. Después de la concentración, el aceite naranja se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, AcOEt/MeOH: 85/15) para producir un sólido ligeramente amarillo N (70 mg, 0,1 mmol). Rendimiento: 34%.
RMN 1H (400 MHz, CD3DO): 5 (ppm) 7,82 (m, 2H), 7,49 (m, 3H), 5,26 (m, 3H, H2, H3, H4), 4,87 (d, J=1,36 Hz, 1H), 4,23 (dd, J=5 Hz, J=12,3 Hz, 1H, H6), 4,10 (m, 2H, H5, H6), 3,82 (m, 1H), 3,71-3,58 (m, 12H), 2,12 (s, 3H) , 2,05 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,95 (s, 3H). RMN 13C (100 MHz, CD3DO): 5 (ppm) 172,33 (C, CO), 171,55 (C, CO), 171,49 (C, CO), 171,47 (C, CO), 170,23 (C, CO), 135,69 (C), 132,62 (CH ), 129,53 (2 X CH), 128,29 (2 X CH), 98,95 (C-1), 71,59 (CH2), 71,33 (CH2), 71,18 (CH2), 70,74 (CH), 70,73 (CH), 70,63 (CH), 69,78 (C-5), 68,34 (CH2), 67,30 (CH2), 63,57 (CH2, C-6), 40,93 (CH2), 20,65 (CH3, AcO), 20,62 (CH3, AcO), 20,61 (CH3, AcO), 20,55 (CH3, AcO). HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C27H38N013584,2343, encontrado 584,2344
El compuesto N (1 eq, 0,1 mmol, 70 mg) se solubilizó en una mezcla H2O/MeOH 1:1 y se añadió resina básica Amberlist. La mezcla se agitó durante 2 horas hasta la desaparición de la materia prima. La resina se filtró y el filtrado se concentró al vacío para dar el producto 8 correspondiente como un sólido blanco (50 mg, 0,1 mmol, cuant.).
RMN 1H (400 MHz, D2O): 5 (ppm) 7,84 (m, 2H), 7,69 (m, 1H), 7,60 (m, 2H), 4,88 (d, J=1,68 Hz, 1H), 3,97 (m, 1H), 3,93-3,63 (m, 18H). RMN 13C (100 MHz, D2O): 5 (ppm) 171,11 (C, CO), 133,65 (C), 132,21 (CH, Ar), 128,83 (2 CH, Ar), 127,10 (2 CH, Ar), 99,93 (C-1), 72,74,70,54, 69,99, 69,66, 69,58, 68,89, 66,76, 66,37, 60,93, 39,57. HRMS: TOF (ESI+) m/z calculado para C19H29NO9Na 438,1740, encontrado 438,1730.
7. Síntesis del compuesto 11 (comparativo)
Una mezcla de compuesto O (550 mg, 0,917 mmol) y Pd al 20% sobre carbono (110 mg) en acetato de etilo (9,2 ml) se agitó en una atmósfera de hidrógeno (1 atm) a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y el disolvente se evaporó al vacío para dar el producto hidrogenado como un sólido amarillo amorfo, usado sin purificación adicional.
A una solución de CDI (149 mg, 0,917 mmol) en THF seco (9,2 ml) se le añadió carbazato de etilo (95 mg, 0,917 mmol) y se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 15 min. A continuación, el producto en bruto (0,917 mmol, disuelto en 4 ml de THF) se añadió gota a gota y se continuó la agitación durante la noche. La mezcla se diluyó con AcOEt y se lavó con una solución acuosa de HCl 0,5 M. La fase orgánica se secó y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO2, EtOAc-MeOH, 90:10) para dar P (311 g, 0,541 mmol) como un sólido blanco. Rendimiento: 59%.
RMN 1H (300 MHz, CDCta): 5 = 1,25 (t, 3H, j= 7,1 Hz, CH3CH2O), 1,88 (s, 3H, AcO), 1,92 (s, 3H, AcO), 2,03 (s, 3H, AcO), 2,09 (s, 3H, NHAc), 3,59-4,10 (m, 16H), 4,16 ( re, 2H, j= 7,1 Hz, CH3CH2O), 4,73 (d, 1H, j= 8,6 Hz, H-1), 5,05 (dd, 1H, j32= 11,2 Hz, j34= 3,3 Hz, H-3), 5,26 (bd, 1H, j43= 3,3 Hz, H-4), 6,78 (d, 3H, j= 9,0 Hz, Ph, NH), 7,16 (s, 1H, NH), 7,22 (s, 1 H, NH), 7,24 (d, 2H, j= 9,0 Hz, Ph), 7,67 (s, 1H, NH). RMN 13C (100,6 MHz, CDCta): 5 = 14,4 (CH3, CH3CH2O), 20,7 (3 x CH3, 3 x AcO), 23,0 (CH3, NHAc), 50,4 (CH, C-5), 61,6 (CH2, C-6), 62,3 (CH2, CH3CH2O), 66,7 (CH, C-4), 67,6 (CH2), 68,6 (CH2), 69,9 (CH2), 70,5 (CH,CH2), 70,83 (CH), 70,86 (CH2), 71,2 (CH2), 101,9 (CH, C-1), 114,9 (2 x CH, Ph), 121,7 (2 x CH, Ph), 131,5 (C, Ph), 154,8 (C), 156,4 (C), 157,5 (C) , 170,4 (C, AcO), 170,5 (C, AcO), 170,7 (<c>, AcO), 171,1 (C, NHAc). HRMS (ESI): m/z calculado para C30H44N4O15Na [M Na]+: 723,2701, encontrado: 723,2700.
El compuesto P (286 mg, 0,497 mmol) se disolvió en MeOH seco (10 ml) y se añadió metóxido de sodio (149 pl de solución 1 M en MeOH, 0,149 mmol). La mezcla se agitó durante 4 h, se añadió K2CO3 (137 mg, 0,994 mmol) y la mezcla resultante se agitó a 75°C durante 1,5 h (gW, 50 W). La mezcla se diluyó con 10 ml de H2O, se neutralizó con Amberlite IR120 (H), se filtró y los disolventes se evaporaron hasta sequedad. El sustrato se disolvió en agua y se sometió a liofilización para dar 11 (226 mg, 0,427 mmol) en forma de un sólido de color marrón. Rendimiento: 86%.
RMN 1H (300 MHz, MeOD): 5 = 1,97 (s, 3H, NHAc), 3,45 (ddd, 1H, j=6,5 Hz, j=5,3 Hz, j= 1,0 Hz, H-5), 3,53 (dd, 1H, j3,2= 10,7 Hz, j3,4= 3,3 Hz, H-3), 3,62-3,79 (m, 10H), 3,86-3,97 (m, 4H), 4,19 (m, 2H), 4,44 (d, 1H, ji,2= 8,4 Hz, H-1), 6,78 (d, 3H, j=9,0 Hz, Ph, NH), 7,24 (d, 1H, j=9,1 Hz, Ph), 7,35 (d, 1H, j=9,1 Hz, Ph). RMN 13C (100,6 MHz, CDCb): 5 = 23,0 (CH3, NHAc), 54,4 (CH, C-5), 62,6 (CH2, C-6), 68,9 (CH2), 69,7 (CH), 70,8 (CH2), 71,6 (CH2), 71,7 (CH2), 71,8 (CH2), 73,6 (CH), 76,7 (CH), 103,1 (CH, C-1), 116,2 (2 x CH, Ph), 125,6 (C, Ph), 129,0 (2 x CH, Ph), 156,1 (2 X C, Urazol), 160,1 (C, Ph), 174,2 (C, NHAc). HRMS (ESI): m/z calculado para C22H31N4O11 [M - H]+: 527,1989, encontrado: 527,1974.
8. Síntesis del compuesto 12 (Invención)
El compuesto 12 se obtuvo después de la oxidación del compuesto 11 en presencia de 1,1 eq de hidantoína en acetonitrilo. Una coloración roja de la solución confirmaba la formación del derivado de PTAD 12.
3. Preparación de AAV modificado químicamente.
- Producción y purificación de AAV2 y AAV8.
Los vectores AAV2 se produjeron a partir de dos plásmidos: pHelper, PDP2-KANA que codifica AAV Rep2-Cap2 y genes auxiliares adenovirales (E2A, VA RNA y E4) y pVector ss-CAG-LuceGFP o pVector ss-CAG-eGFP. Los vectores AAV8 se produjeron a partir de dos plásmidos: pHelper, PDP8-KANA que codifica AAV Rep2-Cap8 y genes auxiliares adenovirales (E2A, VA RNA y E4) pVector ss-CAG-eGFP. Todos los vectores se produjeron mediante transfección transitoria de células HEK293 con el método de fosfato cálcico-HeBS. Las células productoras de vectores se recogieron 48 horas después de la transfección. Para la extracción de partículas de AAV2, las células se trataron en primer lugar con Triton-1% y benzonasa (25 U/ml) durante 1 hora a 37°C. Esta etapa se omitía para los vectores AAV8 pero las etapas posteriores eran idénticas. La masa se centrifugó a 2000 rpm durante 20 minutos y se sometió a ciclos de congelación-descongelación para liberar partículas de vector. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación a 2500 rpm durante 15 min. Los lisados celulares se precipitaron con PEG durante la noche y se clarificaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 1 hora. A continuación, los precipitados se incubaron con benzonasa durante 30 min a 37°C y se recogieron después de centrifugación a 10.000 g durante 10 min a 4 °C. Los vectores se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente doble de cloruro de cesio (CsCl). A continuación, la suspensión viral se sometió a cuatro rondas sucesivas de diálisis con ligera agitación en un casete Slide-a-Lyzer (Pierce) contra dPBS (que contiene Ca++y Mg++).
- Acoplamiento y purificación
Se obtuvieron los derivados de sal de diazonio 2, 5, 6 y 7 añadiendo HBF4 (1,1 eq) y tBuONO (1,1 eq) en agua ultrapura a los correspondientes aminocompuestos. Cinco minutos después de la mezcladura en vórtex, se confirmó la formación de la sal de diazonio usando una solución de 2-hidroxinaftol. La mezcla de una gota de cada solución da una coloración roja, permitiendo la formación de la sal de diazonio. A continuación, se añadieron AAV2-GFP-Luc, AAV2-GFP o AAV8-GFP (1E12 vg, 2,49 nmol) a una solución de tampón de TRIS pH = 9,3 que contenía 2 (invención), 3 (comparativo), 4 (comparativo), 5 (invención), 6 (invención), 7 (invención) u 8 (comparativo) en una relación molar de 3E5 o 3E6 equivalentes y se incubaron durante 4 h a 20°C. A continuación, las soluciones que contenían los vectores se dializaron contra dPBS Pluronic al 0,001% para retirar las moléculas libres que no estaban acopladas a la cápside de AAV.
Para la modificación del grupo amino de la cápside de AAV2 con compuesto 9 y 10, el procedimiento se describe en Chemical Science, 2020, 11, 1122-1131.
Para la doble modificación de la tirosina y el grupo amino de AAV2-GFP, el acoplamiento se realizó en primer lugar con 2 y el procedimiento de modificación de tirosina y, cinco minutos después, con el procedimiento de modificación del grupo amino usando el compuesto 10 a una relación molar de 3E5 equivalentes y se incubaron durante 4 h a 20°C. A continuación, las soluciones que contenían los vectores se dializaron contra dPBS Pluronic al 0,001% para retirar las moléculas libres que no estaban acopladas a la cápside de AAV.
Para el derivado de PTAD 12 (invención, 3E6 eq) y el derivado de urazol 11 (comparativo, 3E6 eq), los compuestos se añadieron en pequeñas porciones al AAV2-GFP en tampón de TBS. Cinco minutos después de la adición, las soluciones que contenían los vectores se dializaron a continuación contra dPBS Pluronic al 0,001% para retirar las moléculas libres que no estaban acopladas a la cápside de AAV.
4. Caracterización de AAV modificados químicamente (invención y comparativos)
Material y métodos
- Extracción del genoma viral.
Se trataron 3 pl de AAV2, AAV8 o AAV2 o AAV8 modificados químicamente con 20 unidades de ADNasa I (Roche n.° 04716728001) a 37°C durante 45 minutos para retirar el ADN residual en muestras de vector. Después del tratamiento con ADNasa I, se añadieron 20 pl de proteinasa K 20 mg/ml (MACHEREY-NAGEL n° 740506) y se incubaron a 70°C durante 20 min. A continuación, se usó una columna de extracción (NucleoSpin®RNA Virus) para extraer ADN de vectores AAV purificados.
- Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real
La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se realizó con un StepOnePlus™ Real-Time PCR System Upgrade (Life Technologies). Todas las PCR se realizaron en una PCR de volumen final de 20 pl que incluía cebadores, sonda, mezcla madre de PCR (TaKaRa) y 5 pl de ADN de plantilla (estándar de plásmido o ADN de muestra). La qPCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial a 95°C durante 20 segundos, seguida de 45 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 segundo y reasociación/extensión a 56°C durante 20 segundos. El estándar de plásmido se generó con siete diluciones en serie (que contenían 108 a 102 copias de plásmido) de un plásmido pTR-UF-11 (ATCC®MBA-331™) linealizado mediante la enzima de restricción Sca-I.
- Inmunoelectrotransferencia
Todos los vectores se desnaturalizaron a 100°C usando tampón de muestra de Laemmli durante 5 minutos y se separaron mediante geles de poliacrilamida en presencia de Tris-glicina al 10% para SDS-PAGE (Life Technologies). Se utilizó Precision plus Protein All Blue Standards (BioRad) como marcador de tamaño de peso molecular. Después de transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa usando un tampón de transferencia (tris 25 mM/glicina 192 mM/SDS 0,1 (p/v)/MeOH al 20%) durante 1 hora a 150 mA en una celda de transferencia semiseca Trans-Blot SD (Bio- Rad), la membrana se saturó con leche semidesnatada al 5% en PBS-Tween (0,1%) o con gelatina al 1%, Igepal al 0,1% en PBS-Tween (0,01%) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la saturación, la membrana se sondeó con antisueros contra AAV2 y AAV2 (policlonal o monoclonal B1) modificado químicamente, con FITC-aglutinina de soja o FITC-concanavalina A durante la noche a 4°C. Se realizaron tres lavados entre cada fase para retirar los reactivos no unidos con PBS-Tween (0,1%) durante 15 min a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron mediante quimioluminiscencia usando anticuerpos secundarios conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano picante (HRP) y se capturaron en una película de rayos X.
- Inmunotransferencia por puntos
Se depositaron AAV2 o AAV8 no desnaturalizados y AAV2 o AAV8 modificados químicamente sobre un papel de nitrocelulosa empapado brevemente en PBS antes de ensamblar el colector de transferencia por puntos (Bio-Rad). La membrana de nitrocelulosa se trató como para inmunoelectrotransferencia. Para visualizar la cápside ensamblada, la membrana se sondeó con antisueros contra la cápside de AAV2 (anticuerpo A20) o antisueros contra AAV8 (anticuerpo ADK8).
- Infectividad por análisis de FACS.
Se sembraron células HEK293 y HUH7 en una placa de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 2,5x105 células/pocillo en 2 ml de medio de crecimiento de DMEM. A continuación, las células se incubaron durante la noche a 37°C para alcanzar una confluencia del 50% a 37°C y CO2 al 5%. Las células se transdujeron a una MOI de 1E4 y 1E5 con vectores de AAV2 o AAV2 modificado químicamente en medio de cultivo. Todos los vectores de AAV codificaban GFP. El porcentaje de células positivas a GFP se midió mediante análisis de FACS 48 h después de la transducción. Las células se disociaron con tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich), se fijaron con paraformaldehído al 4% y se analizaron en un citómetro de flujo BD-LSRII (BD Bioscience). Todos los datos fueron procesados por FlowJo (V10; Flowjo LLC, Ashland, OR).
- Resultados
Los resultados se muestran en las Figuras 1-11.
Para evaluar la pureza e integridad de estos GalNAc-AAV2 y GalNAc-AAV8, se realizó tinción con plata de las diferentes muestras. Como se muestra en las Fig. 1-A, Fig. 4-C, Fig. 6-C y Fig. 8-C y como se esperaba, la relación VP 1 :VP2:VP3 permanecía intacta después de someterse a la reacción y posterior diálisis. Para evaluar la pureza e integridad de Man-AAV2, se llevó a cabo una tinción con plata de las muestras. Como se muestra en la Fig. 7-C y como se esperaba, la relación VP1:VP2:VP3 permanecía intacta después de someterse a la reacción y posterior diálisis. Para GalNAc-AAV2, GalNAc-AAV8 y Man-AAV2, el peso molecular de cada VP aumentaba con el acoplamiento de los ligandos 2, 6 y 7.
La reacción de acoplamiento del azúcar en la superficie del AAV se estudió más a fondo mediante análisis de transferencia por puntos usando lectina de soja y la lectina concanavalina A que se une selectivamente a los residuos de GalNAc y manosa, respectivamente. También se realizaron, respectivamente, inmunotinción con el anticuerpo A20 que reconoce la cápside de AAV2 ensamblada y el anticuerpo ADK8 que se une a la cápside de AAV8 ensamblada. Los puntos positivos con el anticuerpo A20 y con el anticuerpo ADK8 indicaban que AAV2 y AAV8 permanecían intactos después del procedimiento de acoplamiento con los compuestos 2, 4, 6, 7, 8, 910, 11 y 12 y la diálisis posterior (Fig. 2-A, Fig. 5-A, Fig. 6-A, Fig. 7-A, Fig. 8-A y Fig. 9-A).
Las señales positivas con la lectina de soja solo se observaron cuando el AAV2 se coincubaba con los compuestos de diazonio 2 y 6 y el derivado de PTAD 12 y cuando el AAV8 se coincubaba con el compuesto 2, revelando la eficaz reacción de clic de tirosina sobre la cápside de AAV2 y AAV8 (Fig. 2-B, Fig. 6-B, Fig. 8-B y Fig. 9-B). De hecho, no se observaba ninguna detección con los compuestos 4 carente del grupo diazonio y 11 carente del grupo PTAD, los que demuestra que los compuesto 2, 6 y 12 (invención) estaban ligados covalentemente, y no adsorbidos físicamente, a la cápside de Aa V2 y AAV8.
Se observó una señal positiva con la lectina concanavalina A que se une a manosa, cuando se coincubaba AAV2 con el compuesto 7 (invención), revelando la eficaz reacción de clic de tirosina sobre el AAV2 (Fig. 7-B). De hecho, no se observó ninguna detección con el compuesto 8 (comparativo) carente del grupo diazonio, lo que demuestra que el compuesto 7 estaba ligado covalentemente, y no adsorbido físicamente, a AAV2.
Para la doble modificación de los grupos tirosina y amino de la cápside de AAV2, la coincubación con 2 y 10 secuencialmente mostraba puntos positivos con las lectinas concanavalina A y de soja, lo que revela la eficaz reacción de clic de la tirosina y la modificación del grupo amino sobre el AAV2 (Fig. 5-B).
Para los análisis de inmunoelectrotransferencia, el uso de un anticuerpo policlonal específico de la cápside indicaba que las subunidades de la cápside VP permanecían intactas independientemente del proceso químico para AAV2-Luc y AAV2-GFP (Fig. 3-A, Fig. 4-A). Es importante destacar que la banda detectada con la lectina mostraba claramente que el compuesto 2 (invención) está ligado covalentemente a las VP para AAV2-Luc y AAV2-GFP (Fig. 3-B, C, Fig. 4-B).
Por el contrario, las subunidades de la cápside de AAV2-Luc y AAV2-GFP incubadas con 3 y 4 (comparativo) en la misma relación no daba bandas positivas después de la incubación con la lectina específica, lo que indica que no se producía ningún acoplamiento sin la función diazonio (Figura 3-B, C, Fig. 4-B).
Se evaluó el impacto del acoplamiento químico con el compuesto 2 (invención), que soporta el resto GalNAC, sobre la infectividad de los vectores AAV2-GFP.
La infectividad se evaluó mediante análisis de FACS en células HEK293 y HuH7. Se midió tanto el % de células que expresaban GFP como la intensidad de GFP. Según se muestra en las Fig. 10 y Fig. 11 las partículas GalNAC-AAV2-GFP son infecciosas sobre las dos líneas celulares. La modificación química de estas partículas tiene un impacto importante sobre las eficacias de transducción y las propiedades de desorientación. Cuando se usaba una línea celular hepática HuH7, las partículas virales modificadas químicamente con el compuesto 2 mostraban un mayor nivel de transducción que el obtenido cuando se usaba la línea celular no hepática HEK293.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un virus adenoasociado (AAV) que tiene al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en su cápside, donde dicho residuo de tirosina modificado químicamente tiene la fórmula (I):
    en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en:
    - Ar es un resto arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.
  2. 2. El AAV según la reivindicación 1, en el que el al menos un residuo de tirosina modificado químicamente tiene la fórmula (Ia):
    donde - X1 y Ar son como se definen en la reivindicación 1, - el espaciador es un grupo para ligar el grupo "Ar" al resto funcional "M", que comprende preferiblemente hasta 1000 átomos de carbono y que está preferiblemente en forma de una cadena química que comprende opcionalmente heteroátomos y/o restos cíclicos, - n es 0 o 1, y - M es un resto funcional que comprende un agente protector estérico, un agente marcador, un ligando específico para el tipo de célula o un resto farmacológico.
  3. 3. El AAV según la reivindicación 2, en el que Xi es
    y/o "Ar" se selecciona entre fenilo, piridilo, naftilo y antracenilo sustituidos o no sustituidos.
  4. 4. El AAV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la al menos una tirosina modificada químicamente tiene la fórmula (Ic):
    donde: - X2 es -C(=O)-NH, -C(=O)-O, -C(=O)-O-C(=O)-, O-(C=O)-, NH-C(=O)- , NH-C(=O)-NH, -O-C=O-O-, O, NH, -NH(C=S)-, o -(C=S)-NH-, preferiblemente -(C=O)-NH - o -(C=O)-O-- X2 está en la posición para, meta u orto, preferiblemente en la posición para del grupo fenilo, el espaciador, n y M son como se definen en la reivindicación 2.
  5. 5. El AAV según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que: - el “espaciador”, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste en cadenas hidrocarbonadas C2-C40 saturadas o insaturadas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímeros de alquildiaminas y combinaciones de los mismos, y/o - "M"" comprende, o consiste en, un ligando dirigido al tipo de célula, preferiblemente seleccionado entre un mono- o un polisacárido, una hormona, incluyendo una hormona esteroidea, un péptido tal como el péptido RGD, un péptido dirigido al músculo (MTP) o angiopep-2, una proteína o un fragmento de la misma, un receptor membranario o un fragmento del mismo, un aptámero, un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo de cadena pesada y fragmentos del mismo tales como Fab, Fab' y VHH, un ScFv, un Spiegelmer, un aptámero peptídico, vitaminas y fármacos tales como ligandos CB1 y/o CB2.
  6. 6. El AAV según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que: el “espaciador” (cuando está presente) se selecciona del grupo que consiste en cadenas alquílicas C2-C20 lineales o ramificadas, polietilenglicol, polipropilenglicol, pHPMA, PLGA, polímero de alquildiamina y combinaciones de los mismos, teniendo dichos polímeros de 2 a 20 monómeros y/o "M" comprende, o consiste en, un ligando específico para el tipo de célula derivado de una proteína seleccionada entre transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico PFGF, un mono- o un polisacárido que comprende uno o varios de galactosas, manosa, residuos de N-acetilgalactosamina, GalNac puenteada o manosa-6-fosfato, MTP seleccionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 7, y vitaminas tales como ácido fólico.
  7. 7. El AAV según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que: - M es un ligando específico para el tipo de célula para dirigirse específicamente a hepatocitos y comprende al menos un resto de fórmula (III):
    el espaciador es una cadena de polietilenglicol que comprende de 2 a 10 monómeros.
  8. 8. El AAV según la reivindicación 7, en el que la al menos una tirosina modificada químicamente tiene la fórmula (II):
  9. 9. El AAV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además tiene al menos un residuo de aminoácido modificado químicamente adicional en la cápside, que es diferente de un residuo de tirosina, soportando dicho residuo de aminoácido preferiblemente un grupo amino modificado químicamente con un grupo de fórmula (V):
    donde: - N* es el nitrógeno del grupo amino de un residuo de aminoácido, por ejemplo de un residuo de lisina o de un residuo de arginina, - Ar, el espaciador, n y M tienen la misma definición que Ar, el espaciador, n y M de fórmula (II) según la reivindicación 2.
  10. 10. El AAV según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el AAV es un AAV recombinante, preferiblemente seleccionado entre AAV que tiene una cápside silvestre, AAV de serotipo natural, AAV variante, AAV seudotipado, AAV con cápsides híbridas o mutadas y a Av autocomplementario.
  11. 11. Un método para modificar químicamente la cápside de un AAV, más precisamente para modificar químicamente al menos un residuo de tirosina en la cápside de un AAV, que comprende incubar dicho AAV con un reactivo químico que soporta un grupo reactivo seleccionado entre un arildiazonio y un resto 4-fenil-1,2,4-triazol-3,5-diona (PTAD) en condiciones propicias para hacer reaccionar dicho grupo reactivo con un residuo de tirosina presente en la cápside del AAV a fin de formar un enlace covalente.
  12. 12. El método según la reivindicación 11, que comprende incubar el AAV con un reactivo químico de fórmula (VId)
    a fin de obtener al menos un residuo de tirosina modificado químicamente en la cápside de fórmula (Ic):
    donde: - X2 es -C(=O)-NH, -C(=O)-O, -C(=O)-O-C(=O)-, O-(C=O)-, NH-C(=O)-, NH-C(=O)-NH, -O-C=O-O-, O, NH, -C=S-NH, o NH-C=S- preferiblemente -(C=O)-NH- o -(C= O)-O-- X2 está en la posición para, meta u orto, preferiblemente en la posición para del grupo fenilo, - el espaciador es un grupo hidrocarbonado que comprende de 2 a 400 átomos de carbono, - n es 0 o 1, y - M es un resto químico que comprende un agente protector estérico, un agente marcador, un ligando específico para el tipo de célula o un resto farmacológico.
  13. 13. Una composición farmacéutica que comprende un AAV según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. Un AAV según las reivindicaciones 1-10, o una composición farmacéutica según la reivindicación 13, para el uso como agente de diagnóstico o como fármacoin vivo,preferiblemente en terapia génica.
  15. 15. Uso de un AAV según las reivindicaciones 1-10, o una composición farmacéutica según la reivindicación 13, como agente de diagnóstico y como vector génicoex vivooin vitro.
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