ES2964636T3 - Electroporación específica y lisis de células eucariotas - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método de electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas, en donde cada subgrupo tiene una susceptibilidad diferente a la electroporación y/o lisis en campos eléctricos, que comprende los siguientes pasos: transferir la muestra biológica en una cámara, exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa mayor que 3,9, y seleccionar los parámetros eléctricos del campo eléctrico tales como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda de modo que los subgrupos se vean afectados de manera diferente por dicho campo eléctrico para electroporación y/o lisis; así como dispositivos para dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Electroporación específica y lisis de células eucariotas
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el campo de la electroporación y lisis de células.
Antecedentes de la técnica
La electroporación, también conocida como electropermeabilización, se utiliza habitualmente para introducir compuestos, como sustancias químicas, fármacos o ADN, en células biológicas. Para ello, las células de una muestra biológica se exponen a un campo eléctrico generado por electrodos situados uno frente al otro. Si la intensidad del campo eléctrico aplicado es lo suficientemente alta, las membranas de las células se vuelven porosas y permiten que los compuestos atraviesen las membranas de las células. Si el compuesto es un ADN extraño y la célula es eucariota, este procedimiento también se conoce ampliamente como transfección.
Dependiendo de la intensidad del campo eléctrico, la electroporación puede ser un procedimiento reversible o irreversible. Si la intensidad del campo eléctrico se mantiene por debajo de un determinado umbral, la mayoría de las células siguen vivas tras la exposición al campo eléctrico, lo que significa que la electroporación es reversible. Por otra parte, si la intensidad del campo eléctrico supera un determinado valor, el procedimiento de electroporación conduce a la destrucción de las células y, por tanto, se vuelve irreversible. Mediante la electroporación irreversible se pueden liberar los elementos internos de las células. Este procedimiento también se conoce como lisis.
En comparación con los enfoques virales y químicos para la permeabilización y los enfoques térmicos o químicos para la lisis, la electroporación tiene varias ventajas, tal como un control superior sobre las variables relevantes, una alta tasa de transfección y la ausencia de contaminantes.
En la técnica anterior, se conocen la lisis y electroporación de células en muestras biológicas. Del documento WO 2015/044191 A1 se conoce la realización de lisis a células no patógenas en una suspensión de células para el posterior examen de células patógenas. En el documento WO 2015/044191 A1, las células no patógenas son células huésped eucariotas, mientras que las células patógenas son células extrañas, tal como bacterias, un hongo o protozoos. De este modo, la enseñanza del documento WO 2015/044191 A1 no permite distinguir entre células del mismo material huésped, en particular entre cuerpos celulares eucariotas del mismo material huésped.
Además, se sabe por el documento WO 2007/056027 A1 utilizar campos eléctricos en lugar de aplicar calor a líquidos para la reducción de células. Los electrodos utilizados en el documento WO 2007/056027 A1 están hechos de un material dieléctrico bastante grueso, que está recubierto de material conductor de la electricidad para su conexión a una fuente de alimentación.
Una desventaja del conjunto en WO 2007/056027 A1 es el requisito de diferencias de potencial relativamente altas entre los electrodos debido a la gran distancia entre los electrodos. La gran distancia entre los electrodos también provoca inhomogeneidades en los campos eléctricos aplicados, lo que conduce a una lisis irregular a lo largo de los electrodos. Además, el material dieléctrico constituye la parte principal del electrodo, ya que el material dieléctrico tiene que ser bastante grueso para poder recubrirlo con material conductor de la electricidad. Así, las aplicaciones microfluídicas, tales como una punta para una pipeta, no pueden realizarse con la enseñanza del documento WO 2007/056027 A1.
El documento CA 2 025 022 A1 describe procedimientos y dispositivos para el cultivo de células en superficies de electrodos, tales como cultivos de monocapas de células adherentes y el uso de electrodos transparentes de película fina.
Otra desventaja de los procedimientos conocidos es que las células más grandes se lisan más fácilmente que las células más pequeñas debido a su tamaño. Por lo tanto, si se desea lisar células pequeñas en una muestra biológica compuesta por células pequeñas y grandes, inevitablemente también se lisan las células más grandes.
En consecuencia, es un objetivo de la presente invención eliminar o al menos aliviar las desventajas de los procedimientos y dispositivos conocidos de la técnica anterior.
En particular, es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento de electroporación y/o lisis específica de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas para aplicaciones microfluídicas, procedimiento que permite la electroporación y/o lisis específica de un subgrupo, preferentemente de un solo subgrupo, de cuerpos celulares eucariotas en una muestra con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas.
Además, es un objetivo de la presente invención proporcionar un dispositivo para la electroporación y/o lisis específica de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica para aplicaciones microfluídicas. En otro aspecto es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para fabricar un dispositivo adecuado para la electroporación y/o lisis específica de cuerpos celulares en una muestra biológica. En otro aspecto es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para la electroporación y/o lisis específica de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica utilizando el dispositivo.
Sumario de la invención
La invención proporciona un procedimiento de electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas, en el que cada subgrupo tiene una susceptibilidad diferente a la electroporación y/o lisis en campos eléctricos, que comprende los siguientes pasos:
- transferencia de la muestra biológica en una cámara,
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3.9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los subgrupos se vean afectados de forma diferente por dicho campo eléctrico para la electroporación y/o lisis.
También se proporciona un procedimiento de electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
- transferencia de la muestra biológica en una cámara,
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3.9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad de campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los cuerpos celulares eucariotas de una muestra biológica se vean afectados por dicho campo eléctrico para la electroporación y/o lisis.
En otras palabras, la invención proporciona un procedimiento de electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos un primer y un segundo grupo o subgrupo de cuerpos celulares eucariotas, cada grupo o subgrupo que tiene una tasa de electroporación y/o lisis, en el que la muestra biológica se transfiere a una cámara y se expone a un campo eléctrico en la cámara que es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa mayor que 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que para aislar y/o administrar un compuesto a las células del primer grupo o subgrupo se eligen los parámetros eléctricos, tales como la intensidad de campo, la frecuencia o la forma de onda del campo eléctrico, para llevar a cabo la electroporación y/o lisis del primer grupo o subgrupo con una electroporación y/o una tasa de lisis diferentes de las del segundo grupo o subgrupo.
En otro aspecto, la invención proporciona un dispositivo, preferentemente portátil, adecuado para electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas, en el que los cuerpos celulares de cada subgrupo tienen una susceptibilidad diferente a la electroporación y/o lisis en campos eléctricos, que comprende al menos una cámara para recibir la muestra biológica y al menos dos electrodos para generar un campo eléctrico en la cámara, que los electrodos están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad mayor que 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm, en el que el dispositivo comprende además una unidad de ajuste que permite ajustar los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tales como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de manera que los subgrupos se vean afectados de manera diferente con la electroporación y/o la lisis.
En otras palabras, la invención proporciona un dispositivo, preferentemente portátil, para electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares que comprende una punta para una pipeta con al menos una cámara para recibir una muestra biológica y al menos dos electrodos para generar un campo eléctrico en la cámara, cuyos electrodos forman una superficie interior de la cámara y cuyos electrodos están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa mayor que 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm, en el que el dispositivo comprende además una unidad de ajuste que permite el ajuste de parámetros eléctricos del campo eléctrico tales como la intensidad de campo, la frecuencia o la forma de onda.
En otro aspecto, la invención proporciona un dispositivo que es una pipeta de desplazamiento de aire con un medio de succión y presión para crear una presión reducida en una cámara receptora, en la que la cámara receptora es adecuada para recibir una muestra biológica, en la que la cámara tiene al menos dos electrodos para generar un campo eléctrico en la cámara, cuyos electrodos están cada uno en una superficie interior de la cámara y cuyos electrodos están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa mayor que 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 |jm, más preferentemente inferior a 100 jm . Preferentemente, el dispositivo está conectado o comprende además una unidad de ajuste que permite ajustar los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo eléctrico, la frecuencia del impulso eléctrico o la forma de onda del impulso eléctrico del campo eléctrico.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares en una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
- accionar los medios de succión y presión de una pipeta de desplazamiento de aire, de forma que la muestra biológica se transfiera a una cámara situada dentro de una punta de la pipeta
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en donde la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 jm , más preferentemente inferior a 100 pm, y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los cuerpos celulares sean lisados y/o electroporados.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fabricar un dispositivo, preferentemente portátil, en particular una punta para una pipeta, para la electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas, en el que al menos dos electrodos están recubiertos con una capa de material dieléctrico con una permitividad superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que los electrodos están dispuestos de tal manera que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 jm , más preferentemente inferior a 100 jm .
El dispositivo además está conectado o comprende una unidad de ajuste que permite el ajuste de parámetros eléctricos del campo eléctrico tales como la intensidad del campo eléctrico, la frecuencia del impulso eléctrico o la forma de onda del impulso eléctrico del campo eléctrico. T
Todos los aspectos se relacionan entre sí y cualquier realización descrita para un aspecto se relaciona también proporcionalmente con todos los demás aspectos y realizaciones. Por ejemplo, la muestra biológica descrita para el procedimiento o los medios para el procedimiento pueden incluirse o pueden ser parte del dispositivo. El dispositivo o cualquier parte del mismo se puede utilizar en los procedimientos inventivos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento que permite la electroporación y/o lisis dirigida de un subgrupo de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas. En la presente divulgación, los cuerpos celulares eucariotas comprenden células eucariotas nucleadas, tal como los linfocitos, así como cuerpos no nucleados procedentes de células eucariotas, tal como los eritrocitos. Los términos alternativos para cuerpos celulares eucariotas son vasos celulares eucariotas o corpúsculos celulares eucariotas. Los cuerpos celulares eucariotas pueden proceder del mismo organismo, por ejemplo, mamíferos, humanos o animales. Los distintos tipos de cuerpos celulares eucariotas tienen en común que constan de una membrana celular eucariota que encierra una cavidad intracelular, generalmente llena de un medio acuoso. La membrana celular suele ser de una célula eucariota. El término cuerpos celulares eucariotas se asocia en el presente documento principalmente a células eucariotas, pero también incluye cuerpos sin núcleo, tal como los eritrocitos. Sin limitarse a una teoría en concreto, parece que la pared celular eucariota es específicamente susceptible de ser manipulada por los procedimientos de electroporación o lisis de la presente invención, es decir, induciendo la filtración o la ruptura de la membrana celular, respectivamente. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que, en una cámara con electrodos recubiertos de acuerdo con la invención, las células eucariotas y sus cuerpos celulares no nucleados tienen cada uno de ellos una susceptibilidad particular discernible a los parámetros eléctricos, de modo que se pueden orientar individualmente diferentes cuerpos celulares eucariotas sin afectar otros cuerpos celulares eucariotas. Esto permite tratamientos y manipulación específicos en un tipo seleccionado de células (subgrupos de la muestra). Particularmente sorprendente fue que el tamaño de los cuerpos celulares eucariotas no sea un factor relevante. En la técnica anterior, solo las células más grandes de una mezcla podían seleccionarse. De acuerdo con la invención también es posible dirigirse a los cuerpos celulares eucariotas más pequeños en una muestra de cuerpos celulares eucariotas más grandes, de modo que los más grandes no se vean afectados o se vean menos afectados. Las células que se pueden distinguir (es decir, que se ven afectadas de forma diferente por dicho campo eléctrico) son, por ejemplo, células tumorales y células no tumorales (cada una de las cuales forma un subgrupo diferente). Con un parámetro de campo eléctrico adecuado, también pueden distinguirse células dentro de estos grupos, tales como células de diferentes orígenes tisulares, tales como leucocitos, células hepáticas, células renales, eritrocitos, células neuronales, células adiposas, células óseas, células cartilaginosas, células cutáneas, células epiteliales, células musculares, etc. También pueden distinguirse los organismos, tales como animales, vertebrados y no vertebrados o mamíferos, peces, anfibios, aves, reptiles, insectos, etc., y bacterias. Preferentemente, las células de todos los subgrupos proceden de un animal o de un ser humano. Las células humanas son especialmente preferidas, por ejemplo, preferentemente las células tumorales de un ser humano se distinguen de las células no tumorales de un ser humano, por ejemplo, pero no necesariamente el ser mismo humano que proporciona las células tumorales.
Entre otras aplicaciones, el procedimiento inventivo o el dispositivo inventivo permiten el aislamiento de un subgrupo en una muestra biológica para su posterior examen. Si un subgrupo es lisado, mientras que otro subgrupo se mantiene entero, es decir, no afectado o menos afectado por la electroporación o la lisis, el ADN, el ARN, las proteínas, otras moléculas u orgánulos del subgrupo lisado o electroporado pueden recogerse específicamente para su posterior examen. A la luz de la divulgación, un subgrupo es un tipo de células u otros cuerpos celulares con esencialmente las mismas propiedades en vista de la susceptibilidad a la electroporación y/o lisis en un campo eléctrico, en particular, el subgrupo puede ser un tipo celular particular, tal como leucocitos o células tumorales, incluyendo células tumorales en suspensión o circulantes. Típicamente, un subgrupo comprende el mismo tipo de células u otros cuerpos celulares eucariotas en la muestra biológica, por ejemplo, leucocitos o eritrocitos. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, saliva, orina o cualquier otra muestra que contenga cuerpos celulares eucariotas.
De acuerdo con la presente invención, el procedimiento de electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica, preferentemente con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas, en el que cada subgrupo tiene una susceptibilidad diferente a la electroporación y/o lisis en campos eléctricos, comprende los siguientes pasos:
- transferencia de la muestra biológica en una cámara,
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los cuerpos celulares eucariotas sean electroporados o lisados, preferentemente de modo que los subgrupos se vean afectados de forma diferente por dicho campo eléctrico para la electroporación y/o lisis.
Basándose en el conocimiento de que cada subgrupo de cuerpos celulares eucariotas tiene diferentes susceptibilidades a la electroporación y/o lisis, la presente invención permite la lisis y/o electroporación específica de un subgrupo, incluso sólo un subgrupo, de cuerpos celulares eucariotas dentro de una muestra con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas. Como ya se ha mencionado anteriormente, las células o cuerpos celulares de un subgrupo tienen esencialmente la misma susceptibilidad a la electroporación y/o a la lisis. Así, un subgrupo suele referirse a células o cuerpos celulares del mismo tipo, por ejemplo, leucocitos o eritrocitos. Sin embargo, los subgrupos también pueden definirse como subtipos de células, por ejemplo, los linfocitos T y otros linfocitos, que pertenecen ambos a los leucocitos. En este caso, los linfocitos T representarían el primer subgrupo, mientras que los demás linfocitos representarían el segundo subgrupo. Por supuesto, el segundo subgrupo podría dividirse a su vez en varios subgrupos, si fuera necesario. De esto se puede concluir que la definición de los subgrupos depende en gran medida de la aplicación. Sorprendentemente, se ha descubierto que, seleccionando parámetros particulares de campo eléctrico, los cuerpos celulares eucariotas pueden ser específicamente electroporados o lisados en el conjunto de electrodos de la presente invención. En cualquier caso, es importante que los subgrupos puedan distinguirse por su susceptibilidad a la electroporación y/o a la lisis. Las diferentes susceptibilidades a la electroporación de las células dependen de los parámetros eléctricos del campo eléctrico aplicado, como la intensidad del campo, la frecuencia de impulsos del campo eléctrico, la forma de onda de los impulsos del campo eléctrico o el tiempo de exposición de los subgrupos al campo eléctrico. El campo eléctrico generado puede ser un campo eléctrico con una intensidad de campo constante en el tiempo. Sin embargo, en una realización preferida, el campo eléctrico cambia con el tiempo o se alterna en impulsos, en particular con una forma de onda determinada, por ejemplo, una forma de onda rectangular o sinusoidal de impulsos de campo eléctrico.
Es una ventaja de la presente invención que incluso un subgrupo de cuerpos celulares más pequeños puede ser electroporado y/o lisado mientras que otro subgrupo de cuerpos celulares más grandes está presente y permanece esencialmente no afectado. En la técnica anterior, sólo se podía conseguir la lisis de las células más grandes, ya que con los procedimientos conocidos las células más grandes se ven más afectadas que las más pequeñas. De este modo, antes no se podía conseguir la lisis y/o electroporación de cuerpos celulares de pequeño tamaño en presencia de cuerpos celulares de gran tamaño. La presente invención resuelve este problema y permite la selección de subgrupos independientemente del tamaño del cuerpo, es decir, los cuerpos más pequeños pueden ser el objetivo basándose en las propiedades de la membrana de estas células.
La naturaleza específica de los parámetros eléctricos (fuerza, potencial (voltaje), frecuencia del impulso, forma, duración, cantidad del impulso o energía ejercida sobre las células por el campo eléctrico) no solo depende del subgrupo de cuerpos que se ven afectados de manera diferente por el campo eléctrico. Los valores absolutos también dependen de la forma de la cámara, en concreto de la distancia de los electrodos, el espesor del material dieléctrico y el medio en el que están suspendidas las células. Las diferentes constantes dieléctricas del medio, los distintos tipos de sal, etc., afectan además a la eficiencia del campo eléctrico, por lo que es necesario ajustar los parámetros eléctricos. Sin embargo, es posible seleccionar un conjunto adecuado de parámetros dentro de la orientación proporcionada en el presente documento sin una carga excesiva debido a la facilidad de ajuste de las propiedades eléctricas y la facilidad de ensayo de las células. Los efectos de la electroporación y la lisis pueden controlarse fácilmente, por ejemplo, determinando la fuga de un marcador que sale o entra en las células cuando se aplica el campo eléctrico. La siguiente descripción de parámetros son parámetros preferidos dentro de los cuales normalmente se pueden distinguir los cuerpos celulares debido a su susceptibilidad al campo eléctrico.
En muchos casos, la electroporación de células u otros cuerpos celulares de un subgrupo depende de la intensidad del campo eléctrico aplicado, que en la presente invención se encuentra entre 50 V/cm y 50 kV/cm, preferentemente el campo eléctrico aplicado es de 100 V/cm a 30 kV/cm, de 500 V/cm a 20 kV/cm, o de 1 kV/cm a 10 kV/cm, preferentemente de 2 kV/cm a 5 kV/cm. Especialmente preferido es un intervalo de 5 kV/cm a 8 kV/cm o de 25 kV/cm a 50 kV/cm (en especial para la lisis). Se prefiere además un intervalo de 50 V/cm a 400 V/cm (especialmente para la electroporación reversible). Si el campo eléctrico es un campo periódico, los subgrupos también pueden distinguirse por su sensibilidad a la frecuencia o a la forma de onda del campo eléctrico aplicado. Los subgrupos también pueden distinguirse por su sensibilidad a la duración del tiempo de exposición al campo eléctrico. Por supuesto, se pueden utilizar combinaciones de estos parámetros eléctricos, por ejemplo, la intensidad del campo eléctrico, el tiempo de exposición y la frecuencia, para distinguir los subgrupos con mayor precisión. Estos intervalos divulgados para el campo eléctrico aplicado también pueden representar intervalos para el campo eléctrico en la muestra, especialmente células o cuerpos celulares en la muestra. La electroporación reversible puede utilizarse para transferir compuestos hacia el interior de las células, por ejemplo, la transfección.
La relación de la diferencia de potencial entre los electrodos y la distancia entre los electrodos también es importante y proporcional a la intensidad del campo eléctrico Esta relación está preferentemente en el intervalo de 500 V/cm a 50 kV/cm, especialmente preferido entre 50 V/cm y 50 kV/cm, preferentemente el campo eléctrico aplicado es de 100 V/cm a 30 kV/cm, de 500 V/cm a 20 kV/cm, o de 1 kV/cm a 10 kV/cm, preferentemente de 2 kV/cm a 5 kV/cm. Especialmente preferido es un intervalo de 5 kV/cm a 8 kV/cm o de 25 kV/cm a 50 kV/cm (en especial para la lisis). Se prefiere además un intervalo de 50 V/cm a 400 V/cm (especialmente para la electroporación reversible). Esta relación es más fácil de determinar que la intensidad de campo y cualquiera de ambas puede ser un parámetro preferido para caracterizar la invención.
De acuerdo con la invención, el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico eléctricamente no conductor. El recubrimiento cubre al menos la superficie de los electrodos orientada hacia al interior de la cámara. En consecuencia, protege del contacto con la muestra a la parte conductora del electrodo que se encuentra detrás del recubrimiento. El material dieléctrico es sólido. El recubrimiento dieléctrico se considera parte de los electrodos. Así, los electrodos comprenden una parte conductora de la electricidad, preferentemente metálica, y un recubrimiento dieléctrico. Así, las distancias entre los electrodos se refieren en realidad a la distancia entre los recubrimientos. Preferentemente, los electrodos forman parte de la periferia de la cámara. Los electrodos pueden ser parte o formar una superficie interior de la cámara, cuya superficie interior está en contacto con la muestra biológica. Los electrodos pueden ser fundamentalmente planos, estar enrasados con el resto de la superficie interior o formar una estructura de cualquier tipo. En otra realización, los electrodos sobresalen de la superficie interior de la cámara o forman un rebaje de la superficie interior de la cámara para proporcionar un campo eléctrico homogéneo entre los electrodos. Preferentemente, los electrodos son láminas paralelas entre sí. En otra realización, los electrodos están situados fuera de la cámara. Sin embargo, es importante que el campo eléctrico generado penetre en la cámara y, por tanto, en la muestra. De este modo, al menos dos electrodos reciben potenciales eléctricos diferentes. Preferentemente, los electrodos están dispuestos fundamentalmente opuestos entre sí. En una realización preferida, los electrodos son fundamentalmente planos y forman dos superficies interiores opuestas de la cámara. Para evitar o minimizar la aparición de una corriente eléctrica entre los electrodos y otras reacciones químicas desventajosas, los electrodos están recubiertos con el material dieléctrico, de tal manera que solo el material dieléctrico está en contacto con la muestra. El flujo de corriente eléctrica provocaría efectos secundarios desfavorables, tales como el calentamiento (julios) de la muestra, la electrolisis, cambios de pH o procedimientos electroquímicos que podrían influir negativamente en la muestra. Estos efectos secundarios interferirían con el procedimiento real de electroporación y/o lisis y, por tanto, agravarían la electroporación y/o lisis específica. Para reducir una caída de potencial no deseada en los recubrimientos, el material dieléctrico tiene una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente de 60 o más. En la bibliografía, este tipo de material dieléctrico se denomina material de alta k. Una permitividad relativa aún mayor es favorable, preferentemente de 80 y superior. En determinadas realizaciones preferidas, la permitividad es de 3,9 a 20000, preferentemente de 8 a 10000, en particular se prefiere de 10 a 5000, o de 50 a 1000, o incluso de 40 a 500. Como material dieléctrico puede utilizarse cualquier material dieléctrico adecuado, por ejemplo, dióxido de titanio (TO<2>), dióxido de silicio (SO<2>), titanato de bario, titanato de estroncio, óxido de aluminio o pentóxido de niobio, etc. Preferentemente, se utiliza un material dieléctrico con propiedades semiconductoras, para formar un diodo de Schottky entre la parte metálica del electrodo y el material dieléctrico. El dióxido de titanio, T O<2>, es un ejemplo de este tipo de material. Como los electrodos están recubiertos con el material dieléctrico, el material dieléctrico puede ser una capa fina sobre los electrodos. El material de los electrodos puede ser cobre, oro, plata, platino, titanio, aluminio, carbono o cualquier otro material conductor.
La cámara inventiva para recibir la muestra biológica puede ser una cavidad o una cámara de flujo continuo. Si la cámara es una cámara de flujo continuo, la cámara tiene al menos una entrada y una salida para la muestra. Así, la cámara puede denominarse canal. Por supuesto, se pueden proporcionar varias cámaras o canales. Si la cámara es un canal, la electroporación y/o la lisis pueden realizarse mientras la muestra fluye por el canal. Como ya se mencionó, la muestra biológica puede ser una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de orina o cualquier otra muestra que contenga cuerpos celulares eucariotas. Durante la electroporación y/o la lisis, pueden añadirse compuestos a la muestra biológica. Por ejemplo, un subgrupo puede cargarse con marcadores, tinciones o ADN mientras que otro subgrupo no se carga.
Con el fin de reducir aún más los efectos secundarios desfavorables en relación con los electrodos, resulta ventajoso que el material dieléctrico tenga un espesor inferior a 1 pm, preferentemente en el intervalo de 50 nm a 850 nm, más preferentemente en el intervalo de 100 nm a 750 nm o en el intervalo de 150 nm a 500 nm, especialmente preferido de 200 nm a 400 nm. También son posibles intervalos mayores, por ejemplo, de 600 nm a 2000 nm o de 700 nm a 1000 nm o de 750 nm a 800 nm. Debido al escaso espesor del material dieléctrico que recubre los electrodos, la caída de potencial a lo largo del material dieléctrico se mantiene baja. Así, se evita el uso de elevadas diferencias de potencial eléctrico, que conllevan efectos secundarios negativos. Además, todo el conjunto puede realizarse como una estructura microfluídica.
Para generar una alta intensidad del campo eléctrico con una diferencia de potencial relativamente pequeña entre los electrodos, la distancia entre los electrodos puede ser inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm o incluso inferior a 50 pm, pero superior a 5 pm. Preferentemente, la distancia entre los electrodos es de 5 pm a 1 mm, preferentemente de 10 pm a 800 pm, o de 20 pm a 700 pm, o de 30 pm a 600 pm, o de 40 pm a 550 pm, o de 50 pm a 90 pm o de 60 a 85 pm. Otras distancias preferidas entre los electrodos son de 120 pm a 2 mm, de 150 pm a 1750 pm, de 250 pm a 1500 pm, de 550 pm a 1200 pm, de 600 pm a 1 mm o cualquier combinación de estos intervalos. Esto facilita la aplicación del procedimiento de la invención en un dispositivo portátil, ya que se pueden conseguir fácilmente pequeñas diferencias de potencial mediante pilas. Además, debido a las pequeñas distancias entre los electrodos, la homogeneidad del campo eléctrico aumenta.
En una realización de la invención, la diferencia de potencial entre los electrodos está en el intervalo de 1 V a 100 V, preferentemente en el intervalo de 5 V a 80 V o incluso de 7 V a 70 V, más preferentemente en el intervalo de 10 V a 55 V, de 11,8 V a 45 V, de 12 V a 40 V, o incluso de 15 V a 35 V. Estas diferencias de potencial pueden ser fácilmente generadas por pilas, preferentemente en combinación con un transductor de voltaje, por ejemplo, un convertidor CC/CC.
Preferentemente, el campo eléctrico es un campo periódico con una frecuencia en el intervalo de 0,1 Hz a 10 kHz, preferentemente en el intervalo de 10 Hz a 1 kHz o incluso de 20 Hz a 1 kHz, especialmente de 50 Hz a 900 Hz, o de 100 Hz a 800 Hz, o de 150 Hz a 700 Hz o de 200 Hz a 600 Hz, en el que la forma de onda del campo eléctrico es preferentemente una onda cuadrada, una onda sinusoidal o al menos un impulso. Se prefieren especialmente las frecuencias en torno a 100 HZ, tales como de 80 Hz a 200 Hz. El campo periódico puede ser unipolar o bipolar. Además, el campo puede alternarse periódicamente. Los impulsos son preferentemente unipolares, con un tiempo de encendido y un tiempo de apagado determinados. En una realización, los impulsos son rectangulares. En otra realización, los impulsos son impulsos de decadencia exponencial, en el que el flanco ascendente tiene una forma escalonada, es decir, una pendiente vertical con un tiempo de subida muy corto, y el flanco descendente es exponencialmente descendente, es decir, tiene un tiempo de caída más largo que el tiempo de subida, tal como varias veces más largo, por ejemplo, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 100 veces o más o cualquier intervalo entre estos valores. Mediante impulsos de decadencia exponencial, se pueden evitar impulsos de corriente no deseados debidos a la descarga capacitiva en la muestra con el flanco descendente. La forma de onda también puede tener un desplazamiento positivo o negativo. La forma de onda también puede cortarse parcialmente. Se puede utilizar cualquier otro procedimiento para modelar la forma de onda, como la modulación por ancho de impulsos. Los experimentos han demostrado que las frecuencias superiores a 1 kHz pueden provocar un calentamiento no deseado de los electrodos debido a las corrientes capacitivas. Por ello, se prefieren frecuencias inferiores a 1 kHz. Las explicaciones anteriores son aplicables a la diferencia de potencial entre los electrodos y a la intensidad de campo eléctrico, ya que la diferencia de potencial está relacionada con la intensidad de campo eléctrico.
En otra realización, el tiempo de exposición de la muestra biológica está en el intervalo de 1 segundo a 20 segundos, preferentemente en el intervalo de 2 segundos a 12 segundos, más preferentemente de 3 a 7 segundos o esencialmente 6 segundos. Si se realiza la electroporación y el tiempo de exposición es demasiado largo, pueden morir demasiadas células durante el procedimiento.
En otra realización, el número de impulsos se mantiene en el intervalo de 1 a 40000 o de 10 a 30000, preferentemente en el intervalo de 50 a 20000, más preferentemente en el intervalo de 100 a 10000 o de 150 a 8000, en particular preferentemente en el intervalo de 200 a 8000 o de 400 a 7000. Otros intervalos favorables, particularmente para administrar compuestos a cuerpos celulares, son de 1 a 100 impulsos, de 1 a 70 impulsos, de 1 a 40 impulsos, de 1 a 15 impulsos o de 1 a 7 impulsos. Otros intervalos favorables son de 1000 a 20000 impulsos, de 1000 a 15000 impulsos, de 1000 a 10000 impulsos, de 1000 a 5000 impulsos o de 1000 a 3000 impulsos. De forma similar al tiempo de exposición, demasiados impulsos tienen un impacto negativo en la tasa de supervivencia de las células cuando se desea una electroporación reversible. La frecuencia a la que se aplica el número de impulsos mencionado anteriormente está en el intervalo de 10 Hz a 5 kHz, preferentemente de 100 Hz a 2 kHz, más preferentemente de 800 Hz a 1,5 kHz. "Impulso" se refiere a una excitación monopolar hasta un máximo (como en los potenciales/voltaje indicados analizados anteriormente) que cae hacia la excitación de línea de base, tal como un medio período sinusoide o un impulso cuadrado, o un impulso exponencialmente descendente.
Para un procesamiento adicional de la muestra biológica, la muestra se puede filtrar para concentrar los cuerpos celulares de un subgrupo después de la lisis y/o electroporación. Por ejemplo, la cámara puede comprender un filtro para concentrar y purificar partículas o células que no se vean afectadas por la electroporación y/o la lisis.
Dado que mediante la lisis se libera material de ADN o ARN del interior celular, en una realización preferida, tras la lisis de un subgrupo, se recogen orgánulos y/o biomoléculas de dicho subgrupo, preferentemente material genético como ADN o ARN o proteínas. Otras biomoléculas son los lípidos de las células lisadas.
La electroporación se puede utilizar para recolectar material del cuerpo celular o introducirlo en cuerpo celular. Dicho material puede componerse de la célula, tal como ARN o proteínas. El material introducido en las células suele ser nucleótidos, en especial ARN o ADN, o compuestos de molécula pequeña de un tamaño de hasta 1 kDa. Preferentemente, se introducen en la célula marcadores, detectores o colorantes, tales como radiomarcadores o marcadores fluorescentes.
A través de experimentos se ha demostrado que una conductividad eléctrica reducida en la muestra conduce a una reducción de la intensidad de campo requerida para la electroporación y/o la lisis cuando se utiliza la cámara de la invención. Por lo tanto, resulta favorable que, antes de exponer la muestra biológica al campo eléctrico, se lleve a cabo una reducción de la conductividad eléctrica de la muestra por debajo de 1 mS/cm, preferentemente en el intervalo de 10 pS/cm a 800 pS/cm o de 60 pS/cm a 560 pS/cm, mediante intercambio iónico, difusión transversal, filtrado, dilución, intercambio de tampones o separación electroforética. La reducción de la conductividad puede realizarse en un dispositivo separado o en el mismo dispositivo que el procedimiento de la invención. En los experimentos se pudo demostrar que mediante la reducción de la conductividad se podía aumentar la velocidad de electroporación y/o lisis. En la técnica anterior, normalmente se añade MgCh a la muestra para la electroporación. Según la invención, se prefieren añadir iones de metales alcalinos, en especial iones Li<+>o Na<+>o PO<43->, y así se podría mejorar la velocidad de lisis y/o electroporación. Preferentemente, los iones de metal alcalino están con un contraión halógeno, tal como Cl-. Preferentemente, la concentración de las moléculas o sales añadidas se encuentra en el intervalo de 0,001 mM a 100 mM, preferentemente de 0,01 mM a 50 mM, más preferentemente en el intervalo de 0,05 mM a 10 mM para Li, Na, tal como LiCl, NaCl, MgCh, H<x>PO<4>o combinaciones de los mismos. "mM" se refiere a la unidad milimolar. En el caso de las combinaciones, estas concentraciones indicadas se refieren a la concentración sumada de estos metales (alcalinos) combinados.
Con el fin de examinar células o cuerpos celulares, es ventajoso si antes y/o después de exponer la muestra biológica al campo eléctrico, se lleva a cabo una citometría de flujo. En las aplicaciones de citometría de flujo, las células son atravesadas por un potencial eléctrico o un haz de luz, lo que provoca diferentes efectos medibles en función del tamaño, la forma o el color de las células. En las realizaciones de citometría de flujo después de exponer la muestra al campo eléctrico, puede ser útil cargar las células de un determinado subgrupo de la muestra biológica con marcadores, tinciones u otros compuestos antes de la citometría de flujo. Por lo tanto, antes de la citometría de flujo, la muestra biológica puede exponerse al campo eléctrico en la cámara inventiva para electroporación y cargarse con marcadores, tinciones u otros compuestos. En las realizaciones de citometría de flujo antes de exponer la muestra al campo eléctrico, después de la citometría de flujo, la muestra biológica puede transferirse en la cámara inventiva para exponer la muestra biológica al campo eléctrico. Ambas modalidades (tratamiento con campo eléctrico antes y después de la citometría de flujo) pueden combinarse. En una realización preferida, se utilizan dos cámaras inventivas con electrodos, estando las cámaras en conexión fluida con la unidad de citometría de flujo. Una de las cámaras está dispuesta en posición anterior al dispositivo de citometría y la otra cámara está dispuesta en posición posterior al dispositivo de citometría. Esta disposición puede tener cabida en un único dispositivo o estar separadas entre sí. En esta realización preferida, la muestra se carga con marcadores, tinciones u otros compuestos en la primera cámara y, a continuación, se transfiere a la unidad de citometría de flujo a través de una conexión de fluidos. Después del análisis o la identificación de subgrupos específicos en la unidad de citometría de flujo, la muestra se transfiere a la segunda cámara mediante una conexión de fluido. Basándose en el análisis o la identificación de la unidad de citometría de flujo, los subgrupos identificados pueden electroporarse o lisarse en la segunda cámara.
En lo que sigue, se supone que la cámara comprende dos electrodos planos separados una distancia de 81,3 pm. Así, para una determinada intensidad de campo eléctrico generado, la diferencia de potencial puede calcularse multiplicando la distancia por la intensidad de campo eléctrico. Por otro lado, la intensidad del campo eléctrico puede calcularse a partir de la distancia y la diferencia de potencial entre los electrodos (diferencia de potencial dividida por la distancia). Así, con estos dos parámetros dados, se puede determinar la intensidad del campo eléctrico (despreciando por aproximación la caída de potencial en el recubrimiento de los electrodos). Por lo tanto, la intensidad del campo eléctrico puede intercambiarse inequívocamente con la especificación de la distancia entre los electrodos y la diferencia de potencial y viceversa sin ninguna restricción. Por supuesto, la distancia también podría ser mayor o menor que 81,3 pm, como se ha comentado anteriormente.
Para la lisis específica de eritrocitos y para el aislamiento de leucocitos en una muestra de sangre, es ventajoso si el campo eléctrico tiene una intensidad de campo de al menos 2,2 kV/cm, preferentemente de al menos 2,5 kV/cm, más preferentemente 3,0 kV/cm, pero no más de 6 kV/cm o incluso no más de 4,5 kV/cm. El campo eléctrico puede ser un campo periódico y la frecuencia puede estar en el intervalo de 10 Hz a 1 kHz, preferentemente 50 Hz a 200 Hz. En la realización más preferida, la forma de onda del campo eléctrico es una onda cuadrada alterna o impulsos rectangulares unipolares y la frecuencia es preferentemente de aproximadamente 100 Hz. El tiempo de exposición de la muestra en el campo eléctrico oscila entre 12 segundos y 0,5 segundos. Suponiendo que la distancia entre los electrodos sea de 81.3 pm, la diferencia de potencial correspondiente es de al menos aproximadamente 17,8 V, preferentemente de al menos aproximadamente 20 V, más preferentemente de aproximadamente 25 V, pero no superior a aproximadamente 50 V o incluso no superior a 36,6 V. Con los parámetros anteriores, los leucocitos pueden aislarse de los eritrocitos. De este modo, se lisan los eritrocitos.
Para la lisis específica de leucocitos y para el aislamiento de células madre hematopoyéticas, el campo eléctrico tiene una intensidad de campo de al menos esencialmente 3,0 kV/cm, preferentemente 4,5 kV/cm. El campo eléctrico puede ser un campo periódico y la frecuencia puede estar en el intervalo de 10 Hz a 500 Hz, preferentemente 100 Hz a 200 Hz. Preferentemente la forma de onda del campo eléctrico es una onda cuadrada alterna o impulsos rectangulares unipolares y la frecuencia es preferentemente de aproximadamente 100 Hz. El tiempo de exposición de la muestra en el campo eléctrico oscila entre 12 segundos y 0,5 segundos. Suponiendo que la distancia entre los electrodos sea de 81.3 pm, la diferencia de potencial correspondiente es al menos esencialmente de 25 V, preferentemente de 36,6 V, pero preferentemente no superior a 45 V. Con los parámetros anteriores, se pueden aislar células madre hematopoyéticas a partir de diferentes leucocitos. En este caso, los subgrupos son subtipos de leucocitos.
El paso de elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda es fácil dentro de los parámetros descritos anteriormente. Como se ha descubierto de acuerdo con la presente invención (véanse los ejemplos), estos parámetros pueden variarse para identificar una combinación de parámetros que sea capaz de lisar o electroporar células, en particular, de modo que subgrupos seleccionados de células se vean afectados de manera diferente por dicho campo eléctrico de electroporación y/o lisis. El paso de elección puede incluir un breve paso de cribado. Por ejemplo, es posible proporcionar dos subgrupos de células y seleccionar una forma de impulso y una frecuencia de impulso y una duración de tratamiento, por ejemplo, dentro de los intervalos descritos en el presente documento. A continuación, se varía un potencial, por ejemplo, dentro de los intervalos divulgados en el presente documento, para identificar un valor de susceptibilidad diferente entre los subgrupos de células. Si en la forma de impulso seleccionada y en la frecuencia de impulso y duración del tratamiento no se encuentra un potencial (voltaje) adecuado, entonces se variará la frecuencia de impulso y la duración del tratamiento y de nuevo se comprobará el voltaje para un valor de susceptibilidad diferente entre los subgrupos de células. Este sencillo procedimiento puede repetirse para todos los parámetros eléctricos del campo eléctrico descritos en el presente documento.
Para la lisis específica de células cancerosas y el aislamiento de células no cancerosas, preferentemente para la lisis específica de leucocitos cancerosos o células tumorales circulantes, preferentemente células de cáncer de mama, y el aislamiento de leucocitos sanos, el campo eléctrico tiene una intensidad de campo de al menos 1,8 kV/cm, preferentemente 2,4 kV/cm. El campo eléctrico puede ser un campo periódico y la frecuencia puede estar en el intervalo de 10 Hz a 1000 Hz, más preferentemente de 100 Hz a 200 Hz. Preferentemente la forma de onda del campo eléctrico es una onda cuadrada alterna o impulsos rectangulares unipolares y la frecuencia es preferentemente de aproximadamente 100 Hz. El tiempo de exposición de la muestra en el campo eléctrico oscila entre 12 segundos y 0,5 segundos. Suponiendo que la distancia entre los electrodos sea de 81,3 pm, la diferencia de potencial correspondiente es de al menos aproximadamente 14,6 V, preferentemente de al menos aproximadamente 20 V, más preferentemente de aproximadamente 19,6 V, pero preferentemente no superior a 45 V. Por ejemplo, los linfocitos T Jurkat pueden ser leucocitos cancerosos.
Alternativamente, el procedimiento anterior puede describirse como un procedimiento de electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos un primer y un segundo grupo o subgrupo de cuerpos celulares eucariotas, teniendo cada grupo o subgrupo una tasa de electroporación y/o lisis, en el que la muestra biológica se transfiere a una cámara y se expone a un campo eléctrico en la cámara que es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa mayor de 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que para aislar y/o administrar un compuesto a las células del primer grupo o subgrupo se eligen los parámetros eléctricos, tales como la intensidad de campo, la frecuencia o la forma de onda del campo eléctrico, para llevar a cabo la electroporación y/o lisis del primer grupo o subgrupo con una electroporación y/o una tasa de lisis diferentes de las del segundo grupo o subgrupo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un dispositivo, preferentemente portátil, para electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica, que comprende al menos una cámara para recibir la muestra biológica y al menos dos electrodos para generar un campo eléctrico en la cámara, cuyos electrodos están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en el que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm, pero superior a 5 pm, en el que el dispositivo comprende además una unidad de ajuste que permite el ajuste de parámetros eléctricos del campo eléctrico tales como la intensidad de campo, la frecuencia o la forma de onda.
Con el dispositivo inventivo, se puede llevar a cabo el procedimiento descrito anteriormente. De acuerdo con la invención, la distancia entre los electrodos se mantiene por debajo de 1 mm. Preferentemente, la distancia entre los electrodos es de 5 pm a 1 mm, preferentemente de 10 pm a 800 |jm, o de 20 pm a 700 |jm, o de 30 pm a 600 pm o de 40 pm a 550 pm, o de 50 pm a 90 pm o de 60 a 85 pm. Otras distancias preferidas entre los electrodos son de 120 pm a 2 mm, de 150 pm a 1750 pm, de 250 pm a 1500 pm, de 550 pm a 1200 pm, de 600 pm a 1 mm o cualquier combinación de estos intervalos. Así, la diferencia de potencial entre los electrodos puede mantenerse baja y se mejora la homogeneidad del campo eléctrico. La cámara puede ser una cavidad, así como una cámara de flujo continuo con una entrada y una salida. Si la cámara es de paso, también se denomina canal. Es importante señalar que las partes de los electrodos que están en contacto con la muestra biológica en el estado lleno de la cámara están recubiertas con el material dieléctrico eléctricamente no conductor. Como el dispositivo está destinado a aplicar el procedimiento descrito anteriormente, se hace referencia a las observaciones anteriores.
Con el fin de reducir aún más los efectos secundarios desfavorables en relación con los electrodos, resulta ventajoso que el material dieléctrico tenga un espesor inferior a 1 pm, preferentemente en el intervalo de 50 nm a 850 nm, más preferentemente en el intervalo de 100 nm a 750 nm o en el intervalo de 150 nm a 500 nm, especialmente preferido de 200 nm a 400 nm. También son posibles intervalos mayores, por ejemplo, de 600 nm a 2000 nm o de 700 nm a 1000 nm o de 750 nm a 800 nm.
Para utilizar eficazmente el dispositivo en un entorno de laboratorio, la cámara forma parte de una pipeta de desplazamiento de aire, en particular de una punta de dicha pipeta, en la que la pipeta tiene medios de succión y presión para crear una presión reducida dentro de la pipeta. Las pipetas de desplazamiento de aire también se conocen como micropipetas. Se considera que la punta forma parte de la pipeta, incluso cuando la punta es intercambiable. Los electrodos pueden disponerse en la dirección longitudinal de la punta. Mediante los medios de succión y presión, la muestra puede succionarse hacia la punta y, a continuación, exponerse al campo eléctrico dentro de la punta. De este modo, la presión reducida se genera directa o indirectamente en el interior de la punta. Los medios de succión y presión están formados preferentemente por un pistón, que puede accionarse a mano o mediante un actuador, tal como un actuador eléctrico. La cámara puede tener un tamaño en el intervalo de 0,001 a 30 ml, preferentemente de 0,01 a 25 ml, o de 0,1 ml a 20 ml, de 0,2 ml a 15 ml, de 0,5 ml a 12 ml, de 1 ml a 10 ml o de 1 ml a 5 ml. Una vez realizada la lisis y/o la electroporación, la muestra puede liberarse de nuevo mediante los medios de succión y presión. Es preferible que la punta sea desmontable de la pipeta y, por tanto, intercambiable. En una realización preferida, todas las unidades del dispositivo, incluyendo la unidad de ajuste y las pilas, están integradas en la pipeta. En una realización alternativa, la unidad de ajuste del dispositivo está separada de la pipeta. Los electrodos pueden conectarse a la unidad de ajuste mediante cables eléctricos.
Es favorable que los electrodos de la cámara formen una superficie interior de la cámara y estén opuestos entre sí. En otra realización, la cámara tiene una extensión longitudinal y los electrodos son electrodos anulares que rodean la cámara desde el exterior, en los que el campo eléctrico penetra en la cámara. En otra realización, el dispositivo es una pipeta de desplazamiento de aire con un medio de succión y presión para crear una presión reducida en una cámara receptora, en la que la cámara receptora es adecuada para recibir una muestra biológica, en la que la cámara tiene al menos dos electrodos para generar un campo eléctrico en la cámara, electrodos que están cada uno en una superficie interior de la cámara y electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en la que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm. Preferentemente, el dispositivo está conectado o comprende además una unidad de ajuste que permite ajustar los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo eléctrico, la frecuencia del impulso eléctrico o la forma de onda del impulso eléctrico del campo eléctrico.
Las pipetas de desplazamiento de aire también se conocen como micropipetas. Preferentemente, los medios de succión y presión están formados por un pistón, que puede accionarse a mano o mediante un actuador, tal como un actuador eléctrico. Preferentemente, la cámara se aloja dentro de una punta de la pipeta. Los electrodos pueden disponerse en la dirección longitudinal de la punta. La punta es preferentemente intercambiable. Se considera que la punta forma parte de la pipeta, incluso cuando la punta es intercambiable. Mediante los medios de succión y presión, la muestra puede succionarse hacia la punta y, a continuación, exponerse al campo eléctrico dentro de la punta. Una vez realizada la lisis y/o la electroporación, la muestra puede liberarse de nuevo mediante los medios de succión y presión. La cámara puede tener un tamaño en el intervalo de 0,001 a 30 ml, preferentemente de 0,01 a 25 ml, o de 0,1 ml a 20 ml, de 0,2 ml a 15 ml, de 0,5 ml a 12 ml, de 1 ml a 10 ml o de 1 ml a 5 ml.
En una realización preferida, todas las unidades del dispositivo están integradas en la pipeta. En este caso, la fuente de alimentación, por ejemplo, baterías, también puede estar integrada en el dispositivo. En una realización alternativa, la unidad de ajuste del dispositivo está separada de la pipeta. Los electrodos pueden conectarse a la unidad de ajuste mediante cables eléctricos. La unidad de ajuste suministra directamente voltaje a los electrodos para generar el campo eléctrico.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares en una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
- accionar los medios de succión y presión de una pipeta de desplazamiento de aire, de forma que la muestra biológica se transfiera a una cámara situada dentro de una punta de la pipeta
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en donde la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm, y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los cuerpos celulares sean lisados y/o electroporados.
Este procedimiento puede utilizarse para la lisis de células o la transfección. Para ello, la muestra biológica se transfiere a la punta de la pipeta y los parámetros se eligen de forma que las células sigan vivas tras la exposición al campo (electroporación reversible). Durante el procedimiento, se transfiere a las células material o un componente que puede añadirse a la muestra biológica. Por supuesto, con el procedimiento anterior también se puede realizar la lisis. En una realización preferida, los medios de succión y presión están formados por un pistón, que puede ser accionado a mano o por un actuador, tal como un actuador eléctrico. La cámara puede tener un tamaño en el intervalo de 0,001 a 30 ml, preferentemente de 0,01 a 25 ml, o de 0,1 ml a 20 ml, de 0,2 ml a 15 ml, de 0,5 ml a 12 ml, de 1 ml a 10 ml o de 1 ml a 5 ml. Como el procedimiento está destinado a ser aplicado por el dispositivo mencionado, se hace referencia a las observaciones anteriores.
Preferentemente, los electrodos son láminas planas o material metálico (con una capa de pasivación como se ha descrito anteriormente). La superficie orientada hacia la cámara que puede estar en contacto con la muestra en la cámara es preferentemente de 50 mm2 a 1000 mm2, especialmente preferida de 75 mm2 a 750 mm2, de 100 mm2 a 300 mm2. De acuerdo con todas las realizaciones de la invención, preferentemente la punta de pipeta o la cámara no tiene más de dos electrodos para el tratamiento de la muestra. La cámara es preferentemente rectangular con los electrodos dispuestos en paralelo en su interior, formando el espacio rectangular. Los electrodos de este tamaño están preferentemente adaptados para voltaje más pequeñas, tal como de 1 V a 45 V o preferentemente de 5 V a 40 V. En particular, en el caso de una punta de pipeta, los electrodos están preferentemente espaciados de forma que cubran toda la cámara. En relación con ello, para que toda la muestra en la punta de la pipeta sea tratada, preferentemente el volumen de la cámara entre los electrodos es sustancialmente igual o mayor que el volumen aspirado en la punta de la pipeta y/o el volumen del pistón de la pipeta que define dicho volumen de aspiración por punta. Preferentemente, los electrodos se extienden sustancialmente hasta la abertura de la cámara en la punta de la pipeta.
A continuación, se dan ejemplos ilustrativos, a los que no se limitará la invención. En los ejemplos, la distancia entre los electrodos es de 81,3 pm. Por supuesto, esta distancia puede variar. Para mantener la misma intensidad de campo electromagnético, el potencial (voltaje) puede adaptarse igualmente de acuerdo con la expresión intensidad de campo eléctrico = potencial/distancia. Además, se supone que el término "pasivación" equivale a recubrimiento y que "estar pasivado" significa estar recubierto de material dieléctrico.
Figuras:
La Fig. 1 muestra una comparación de las curvas de lisis de sangre total diluida y suspensión de leucocitos. La Fig. 2 se refiere al enriquecimiento de leucocitos en una dilución de sangre total enriquecida con leucocitos. La Fig. 3 muestra imágenes de microscopía de sangre diluida con leucocitos antes y después de la aplicación de un campo eléctrico.
La Fig. 4 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo para leucocitos aislados sin campo (imágenes A a D) y tras ondas cuadradas de 40 V aplicadas a 100 Hz (imágenes E a H). Los histogramas muestran la viabilidad celular mediante fluorescencia Calceína-AM (imágenes A, E), la fluorescencia CD45 muestra células distintas de los eritrocitos (imágenes B, F) y las células teñidas para CD34 representan la fracción de CEH (imágenes C, G). Las imágenes D y H se refieren a las estadísticas y la lógica de las puertas. La Fig. 5 muestra la dependencia del voltaje de las células de linfocitos T Jurkat y la lisis de leucocitos sanos. Los puntos de datos representan la media de cuatro réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar.
La Fig. 6 muestra la viabilidad dependiente de la frecuencia de los leucocitos (imagen A) y los linfocitos T Jurkat (imagen B). Los valores de conductividad se refieren a las mediciones realizadas antes y después del experimento. Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar.
La Fig. 7 se refiere a la eliminación selectiva de la población de linfocitos T Jurkat en suspensión de linfocitos. Los linfocitos T Jurkat se incubaron con Calceína-AM antes de la adquisición de datos y presentan una alta fluorescencia FITC. La imagen A muestra la población celular mixta sin aplicación de campo eléctrico. La imagen B muestra la población celular mixta tras la aplicación de impulsos de onda cuadrada de 20 V a 50 Hz. La imagen C muestra las estadísticas de sucesos con el porcentaje de sucesos respectivos. Conductividad: 97 pS/cm. Eventos: 10000; N = 3.
La Fig. 8 muestra la viabilidad dependiente del voltaje de las células de cáncer de mama MCF-7 y la lisis de leucocitos sanos. Los puntos de datos representan la media de cuatro réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar.
La Fig. 9 se refiere a la viabilidad dependiente de la frecuencia de los leucocitos (imagen A) y de las células de cáncer de mama MCF-7 (imagen B). Los valores de conductividad se refieren a las mediciones realizadas antes y después del experimento. Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar.
La Fig. 10 se refiere a la eliminación selectiva de las células MCF-7 teñidas con anticuerpos FITC en suspensión de leucocitos. Se añadió la tinción de viabilidad Hoechst 33342 antes de la adquisición de datos de citometría de flujo. La imagen A muestra una población celular mixta sin campo eléctrico. La imagen B muestra la suspensión de células mezcladas tras la aplicación de 30 V a 100 Hz. La imagen C se refiere a las estadísticas de viabilidad tras la aplicación sobre el terreno. Conductividad: 100-103 pS/cm. Eventos: 10 000. N = 2.
La Fig. 11 muestra el dispositivo inventivo. La imagen A muestra una pipeta multifuncional como dispositivo inventivo con una punta de pipeta acoplada que incluye electrodos. La imagen B muestra una punta de pipeta conectada a una pipeta de 20 pl con conexión de circuito eléctrico. La imagen C muestra una versión transparente de la punta de pipeta que muestra las propiedades microfluídicas. La imagen D muestra un corte transversal de la cámara. La imagen D muestra una sección transversal de la cámara en una realización alternativa, en la que 8 electrodos están situados en la superficie circunferencial de la cámara.
La Fig. 12: La imagen A muestra las eficiencias de lisis de las células 293T utilizando electrodos recubiertos y tampones con diferentes conductividades (60, 160 y 260 pS/cm). Las células se expusieron a 6 segundos de impulsos de onda cuadrada de CA a una frecuencia de 1 kHz (n = 3). La imagen b muestra la eficiencia de lisis de diferentes números de impulsos a 1 kHz. La imagen C muestra la dependencia de la frecuencia a igual número de impulsos. En las imágenes A a D, la forma de onda se refiere a ondas cuadradas completas. Las conductividades oscilan entre 160-170 pS/cm, n = 3. La imagen D se refiere a la medición del ADN libre después de la lisis de células HEK en la punta de una pipeta. La imagen E se refiere a la medición del ARN libre de células después de la lisis de células HEK en la punta de la pipeta.
La Fig. 13 se refiere a la lisis y permeabilización de células 293T después de la exposición a un campo eléctrico. La imagen A muestra la lisis y la permeabilización de células 293T tras la exposición a un número decreciente de impulsos de ondas cuadradas de 40 V, la imagen B muestra 5 impulsos de ondas cuadradas de voltaje creciente. La imagen C muestra un número creciente de impulsos de onda cuadrada de 15 V. (D) Repeticiones técnicas de la transfección de 293T con el plásmido pTurboRFP tras la exposición a 10 impulsos de decadencia exponencial de 40 V a 50 Hz y 1000 impulsos de transferencia de decadencia exponencial de 15 V a 50 Hz. Las barras muestran el porcentaje de células que expresan RFP 48 horas después del tratamiento, detectado mediante microscopía de fluorescencia.
La Fig. 14 muestra una aplicación de citometría de flujo en relación con el procedimiento y dispositivo de la invención para la electroporación y/o la lisis específicas.
La Fig. 15 muestra la lisis de sangre total dependiente de la conductividad en un prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio. Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas, las barras de error indican la desviación estándar
La Fig. 16 muestra: (a) Prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio con electrodos de titanio oxidado anódicamente. (b) Gráfico I/V durante la aplicación de una onda cuadrada de 8 V y 50 Hz. (c) Eficacia de lisis de células de sangre total al aplicar una onda cuadrada de 8 V y 50 Hz con 100 pl/min a una dilución de sangre total 1:100.
La Fig. 17 muestra: (a) La comparación de las curvas de lisis de la sangre total diluida y de las suspensiones de leucocitos muestra un comportamiento diferente en el campo eléctrico. Dependencia de la frecuencia de células sanguíneas enteras (principalmente eritrocitos) a 18 V (b) y lisis de leucocitos a 40 V (c). Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar. a es la conductividad de la suspensión.
La Fig. 18 muestra el enriquecimiento de leucocitos (Hoechst+) en una dilución de sangre total enriquecida con leucocitos. Las células porosas (PI+/Hoechst+) representan células que han perdido la integridad de la membrana. Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar.
La Fig. 19 muestra: (a) La comparación de las curvas de lisis de las suspensiones de células leucocitarias y de células T Jurkat muestra un comportamiento diferente en el campo eléctrico. Lisis dependiente de la frecuencia de leucocitos a 40 V (b) y de células Jurkat a 18 V (c). Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar. a es la conductividad de la suspensión.
La Fig. 20 muestra:(a-d) Los datos de citometría de flujo de 10.000 eventos muestran la eliminación de la población distintiva de linfocitos T Jurkat tras la aplicación de un campo eléctrico (20 V, 50 Hz, sqAC). (a) Suspensión de linfocitos T Jurkat con los linfocitos T Jurkat teñidos con Calceína-AM mostrados en azul. (b) Suspensión de leucocitos sin tinción con los leucocitos en magenta. (c) Suspensión de leucocitos Jurkat sin aplicación de campo eléctrico. (d) Suspensión de leucocitos Jurkat tras la aplicación del campo eléctrico. SSC: dispersión lateral, FITC-A: Isotiocianato de fluoresceína, señal fluorescente. (e) Lisis específica de linfocitos T Jurkat teñidos con Calceína-AM en una suspensión de leucocitos Jurkat. Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar. a es la conductividad de la suspensión. (f) Sección de una imagen de microscopía de contraste de fase que muestra fantasmas de linfocitos T Jurkat.
La Fig. 21 muestra: Comparación de las curvas de lisis de suspensiones celulares de leucocitos y de células MCF-7 en función de la intensidad del campo eléctrico. Lisis dependiente de la frecuencia de leucocitos a 40 V (b) y de células MCF-7 a 20 V (c). Los puntos de datos representan la media de tres réplicas técnicas; las barras de error indican la desviación estándar.
La Fig. 22 muestra: Eliminación selectiva de las células MCF-7 teñidas con anticuerpos FITC en una suspensión de leucocitos. Se añadió la tinción de viabilidad Hoechst 33342 antes de la adquisición de datos de citometría de flujo. (a) Población celular mixta sin campo eléctrico. (b) Suspensión de células mixtas tras la aplicación de 25 V a 1 kHz. (c) Suspensión de células mixtas tras la aplicación de 30 V a 100 Hz. (d) Estadísticas de viabilidad tras la aplicación sobre el terreno. Conductividad: 100-103 pS/cm. Eventos: 10000. N = 2
La Fig. 23 muestra: Histogramas de citometría de flujo de una primera investigación en la que se utilizaron campos eléctricos para el enriquecimiento de células madre hematopoyéticas (CD45+CD34+) a partir de una suspensión de células leucocitarias. (a) Muestra tras pasar por el prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio sin campo eléctrico aplicado. (b) Muestra tras pasar por el prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio con 40 V 100 Hz aplicados.
La Fig. 24 muestra: Comparación de la permeabilización y la lisis inducida por campo eléctrico de células HEK (riñón embrionario humano) utilizando un sistema comercial de electroporación clásico basado en cubetas (a) y la punta de pipeta de electroporación desarrollada (b).
La Fig. 25 muestra: Ocurrencia de permeabilización celular utilizando un gran número de impulsos a bajo voltaje, denominado "Modo de baja energía" (a) y sólo 5 impulsos a potenciales eléctricos más altos, denominado "Modo de alta energía" (b).
La Fig. 26 muestra: Cambio de la configuración de impulsos utilizada para el transporte de colorante mostrando descarga eléctrica (a) a impulsos de decadencia exponencial para inducir un movimiento electroforético neto de moléculas de ADN (b) .
La Fig. 27 muestra: Eficacia de transfección de plásmidos de células HEK 293T en tampones de electroporación de concentración creciente de MgCh .
La Fig. 28 muestra: (a) Lisis inducida por campo eléctrico de células HEK en función de tampones con diferente composición iónica a conductividades iguales. (b) Eficacia de transfección de células HEK 293T en tampón MgCh y LiCl utilizando impulsos de decadencia exponencial y en tampón LiCl utilizando impulsos de onda cuadrada.
La Fig. 29 muestra: Lisis celular inducida por campos eléctricos de diferentes líneas celulares cultivadas con un número de células y una conductividad tampón normalizados.
La Fig. 30 muestra: Investigación de la lisis inducida por campo eléctrico dependiente del tamaño celular mediante la alteración del tamaño celular a través de la regulación osmótica. El tamaño celular se presenta como dispersión arbitraria hacia delante (FSC, azul) y el porcentaje de lisis celular a 30 V 6000 impulsos se muestra en rojo.
La Fig. 31 muestra: Caracterización eléctrica. (a) Corriente de fuga de prototipos de flujo continuo a escala de laboratorio rellenos con diferentes soluciones conductoras medida aplicando una corriente continua al voltaje indicado. (b) Medidas de las características del diodo utilizando 4 electrodos pasivados de alto k diferentes (PEPP1-PEPP4).
La Fig. 32 muestra un diagrama I/V de electrodos de titanio no pasivados (hash gris) y pasivados térmicamente (TiO<2>, círculos rojos y triángulos azules). TiO<2>(descomposición) en triángulos azules muestra un ejemplo de deficiencia de pasivación y descomposición dieléctrica.
Ejemplos
Ejemplo 1: lisis específica de eritrocitos para el aislamiento de leucocitos
La Fig. 1 muestra una comparación de curvas de lisis de sangre total diluida y suspensión de leucocitos. La abscisa es la diferencia de potencial entre los electrodos, la ordenada es la viabilidad en porcentaje.
La Fig. 1 se refiere a la determinación de los parámetros de lisis de poblaciones eritrocitarias y leucocitarias preparadas por separado a partir de sangre total. El campo eléctrico tiene una frecuencia de 100 Hz y la forma de onda es una señal de corriente alterna cuadrada. En la elución de 18 V se observa un efecto de campo específico que actúa sobre los eritrocitos, con una reducción de la viabilidad celular del 77,9 %. A 20 V, sólo el 2,8% de los eritrocitos permanecen intactos, mientras que la población de leucocitos no se ve afectada, con una viabilidad del 95,6%. La lisis eritrocitaria completa se consigue a 25 V (0,6 % viable). Dado que se trata de una dilución de sangre total, también contiene una población restante de leucocitos. Esto también puede explicar por qué un aumento adicional del campo a 30 V no cambia significativamente la viabilidad de las células restantes (0,5 % viables). La tasa de lisis leucocitaria con este ajuste es del 88,3% de promedio, con una desviación estándar del 15,2%. Con el aumento de la intensidad de campo, la viabilidad de la elución de leucocitos aislados disminuye hasta el 22,9 % a 40 V aplicados. En conjunto, estos datos de viabilidad revelan una amplia ventana de oportunidades para el aislamiento selectivo de leucocitos.
En referencia a la Fig. 2 y Fig. 3, procedemos a abordar la integridad de la membrana de las células viables restantes para evaluar la viabilidad de utilizar este procedimiento para el aislamiento selectivo de leucocitos intactos. Para ello, se preparó una suspensión en aumento de sangre total y leucocitos aislados para obtener una ración celular final de1:1.La conductividad se ajustó a 220 pS/cm y el voltaje se fijó en 25 V, sin modificar los demás parámetros. Se utilizó una tinción doble de yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33342 para evaluar cualquier cambio en la integridad de la membrana de la población leucocitaria restante. Ambos colorantes se unen al ADN y, como tales, sólo visualizarán el núcleo de los leucocitos. Dado que el PI es impermeable a las membranas intactas a la concentración utilizada, la población positiva representa leucocitos con membranas comprometidas. A continuación, se añade Hoechst 33342 para distinguir claramente los leucocitos de los eritrocitos. En la muestra de control no sometida a campo eléctrico, el 20% del total del 50% de leucocitos son PI positivos, lo que indica algún tipo de aberración de membrana debida al protocolo estándar de varios pasos para el aislamiento de leucocitos. Tras la aplicación sobre el terreno y la lisis eritrocitaria selectiva, la fracción de leucocitos intactos se mantiene igual (40 % del 100 %). Esto indica que el campo aplicado no tiene ningún impacto sobre la integridad de la membrana en la población superviviente.
Las imágenes de microscopía B a D muestran sangre diluida con leucocitos antes (0V) y después de la aplicación de un campo eléctrico (25V, 100 Hz, onda cuadrada AC). B muestra una fusión de la fluorescencia y la imagen de campo claro. Los leucocitos teñidos con Hoechst en suspensión no tratada aparecen de color azul, los eritrocitos y otras células de la sangre aparecen de color naranja translúcido. La imagen C muestra el enriquecimiento de leucocitos tras la aplicación de campo. La imagen D muestra leucocitos Hoechst-positivos en el canal de fluorescencia azul. En la imagen E, las células Pl-positivas son visibles en el canal verde fluorescente. La conductividad a era de 220 - 230 pS/cm.
Ejemplo 2: La lisis de subpoblaciones de leucocitos conduce al enriquecimiento de células CD34 positivas
Se considera que las células madre hematopoyéticas (HSC) se encuentran entre la población de células sanguíneas más pequeñas, con diámetros del orden de 6-8 pm. Dado que los campos eléctricos imponen sus efectos de membrana de una manera específica de acuerdo con el tamaño de acuerdo con la ecuación de Schwan, es factible suponer que las CEH deberían ser más resistentes a impulsos de magnitud creciente que los leucocitos diferenciados de mayor tamaño. La Fig. 4 muestra los efectos de aplicar impulsos de onda cuadrada de alta energía de 40 V a 100 Hz a leucocitos aislados con respecto a la fracción de HSC CD34. La Calceína-AM se utiliza para determinar la viabilidad celular y el CD45, también denominado antígeno común leucocitario, debe expresarse en todos los leucocitos. En el control 0 V, el 0,16 % de los leucocitos viables expresan CD34 (Fig. 4 C, D), lo que concuerda con la bibliografía actual en la que se demuestra que las CEH CD34+ constituyen el 0,19 % de las células de sangre periférica (Bender et al. 1991). Tras la aplicación de impulsos de onda cuadrada de 40 V, con los que se espera eliminar el 77,9 % de los leucocitos (Fig. 1), la cantidad de leucocitos viables con fluorescencia CD34 aumenta hasta el 2,34 % (Fig. 3 G, H), lo que corresponde a un enriquecimiento por un factor de 14.
Materiales y procedimientos
Preparación de soluciones de trabajo
Se donó sangre entera de voluntarios sanos utilizando tubos de recogida K3-EDTA (Vacuette, Greiner Bio One, Austria), se almacenó inmediatamente a 4 °C y se conservó durante un máximo de 3 días. El tampón de lisis eritrocitaria (ELB) contiene 155 mM NH4Cl, 10mM KHCO3 y 0,1 mM EDTA y se esteriliza por filtración (filtro PVDF de 0,22 pm). Todas las diluciones se prepararon con una solución de sacarosa 250mM. La conductividad se mide utilizando un conductímetro (B-771 LAQUAtwin, HORIBA Advanced Techno).
Aislamiento de leucocitos
Se añaden 10 ml de ELB a 1ml de sangre entera, se incuba 10min TA y se invierte repetidamente. La suspensión se centrifuga a 500 g durante 10 min (Eppendorf 5430; Rotor: F-35-6-30). Estos pasos se repiten hasta que el sedimento celular esté blanco (sin eritrocitos). A continuación, se lava dos veces con una solución de sacarosa PBS ajustada a 100pS/cm, se cuenta y se vuelve a suspender para obtener una concentración de 5x105 células/ml. La viabilidad se evalúa mediante tinción con Hoechst 33342. Los preparados con una viabilidad inferior al 80% se descartan.
Aplicación del campo eléctrico
Se transfirió 1 ml de las respectivas suspensiones celulares a una jeringa de 1 ml (Omnifix-F, Braun, Alemania) y se inyectó en la ECLU mediante una bomba de jeringa (Fusion 200 Touch, KR Analytical Ltd, Reino Unido) ajustada a un caudal de 100 pl/min. Para discriminar entre parámetros, se dejó pasar a través del dispositivo al menos 5 veces el volumen de la cámara ECLU de 10 pl después de cualquier cambio de parámetro y antes de recoger una alícuota para su posterior análisis. Los campos eléctricos se indujeron aplicando las formas de onda de voltaje correspondientes mediante un generador de funciones (DG4102, Rigol) conectado a un amplificador de voltaje (Falco WMA-300, Falco Systems, Países Bajos). El voltaje y la corriente (a través de una resistencia de 20) se controlaron con un osciloscopio (DS1104B, Rigol).
Adquisición y análisis de datos
El enriquecimiento en precursores leucocitarios se evaluó mediante la tinción conjunta de las muestras con Ca-AM, anticuerpo monoclonal CD45R (B220) conjugado con Alexa Fluor 700 (RA3-6B2, Thermo Fischer, 56-0452-82) y anticuerpo monoclonal CD34 conjugado con PE (4H11, Thermo Fischer, 12-0349-42) durante 30 min TA en la oscuridad tras la aplicación del campo ECLU. Cuando fue posible, se registraron 50.000 eventos con el citómetro de flujo CytoFLEX (Beckmann Coulter) utilizando los canales FSC, SSC, FITC, APC-A750 y PE. La compensación de anticuerpos se realizó con perlas de captura de anticuerpos VersaComp (Beckmann Coulter, B22804) y el Ca-AM se compensó con células 293<t>teñidas (suministradas por el Department of Nanobiotechnology of the University of Natural Resources and Life Sciences, Viena). La sincronización y el análisis se realizaron con el software de análisis Kaluza (Beckmann Coulter).
Ejemplo 3: Ablación celular específica de la leucemia en una mezcla de células sanguíneas sanas
La Fig. 5 muestra la viabilidad de linfocitos T Jurkat, un modelo celular de leucemia, y Leucocitos de un voluntario sano cuando se someten a impulsos de onda cuadrada de magnitud creciente. Los linfocitos T Jurkat muestran la mayor susceptibilidad a la lisis dependiente del voltaje. Los impulsos de onda cuadrada de 15 V reducen la viabilidad celular de las células Jurkat al 22,6 %.
La Fig. 6 A y B muestra la dependencia de frecuencia de los mismos tipos celulares a la respectiva magnitud de campo.
Todos los datos de viabilidad anteriores se recogieron por separado en poblaciones celulares individuales. Para comprobar si estas tendencias fuesen aplicables en una suspensión de población mixta, se realizaron experimentos de aumento en mezclas de linfocitos T Jurkat con aislados leucocitarios. La Fig. 7 A, B muestra los datos de citometría de flujo con y sin aplicación de campo a una mezcla 1:1 de suspensiones de linfocitos T Jurkat y leucocitos en tampón igualmente equilibrado. En la población mixta sin aplicación de campo, el 31,6 % de los eventos contados son linfocitos T Jurkat Calceína-AM positivos y el 41,7 % se identifican como leucocitos por su perfil SSC (Fig. 7 A). Tras la aplicación de impulsos de onda cuadrada de 20 V a 50 Hz, <0,1 % de los eventos siguen siendo linfocitos T Jurkat Calceína-AM positivos, mientras que los leucocitos constituyen el 50,7 % de los eventos (Fig. 7 B). Los restos celulares aumentan del 11,4 % al 26,5 % con la aplicación en campo (Fig. 7 B, C). La afirmación de que los linfocitos T Jurkat se someten a lisis en lugar de perder fluorescencia de Calceína-AM se ve respaldada mediante activación de SSC y experimentos de lisis previos. La Fig. 7 C muestra el recuento promedio de eventos para tres réplicas técnicas con desviación estándar.
La lisis selectiva de poblaciones de células tumorales se ha demostrado anteriormente con electrodos no pasivados (Eppich et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18.8:882-87. doi: 10.1038/78504). Las células de cultivo de tumores CMK se enriquecieron con PBMC y mostraron una mayor susceptibilidad a los campos eléctricos. Sin embargo, estos experimentos conducen a resultados con intervalos de confianza del 67% en 7 repeticiones. En nuestro caso de tripletes con recuentos de eventos muy bajos para linfocitos T Jurkat, el intervalo de confianza no representa la fiabilidad del procedimiento de lisis. La desviación estándar para el recuento de eventos de linfocitos T Jurkat vivos de 0,063 % es de 0,038 %. Esto significa que el número de eventos atribuidos a células Jurkat vivas fue inferior al 0,1 % en las tres repeticiones.
Además, se demostró que los ajustes de campo del documento existente que disminuían la viabilidad de las células CMK por debajo del 2 % en promedio mataban más del 80 % de los monocitos y al menos el 20 % de los linfocitos (Eppich et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18.8:882-87. doi: 10.1038/78504). La pasivación dieléctrica de alta k es capaz de reducir de forma fiable el recuento de células tumorales manteniendo intactas las poblaciones de leucocitos. En el caso de los experimentos selectivos en aumento de linfocitos T Jurkat, el recuento de leucocitos prácticamente no se ve modificado por el campo eléctrico aplicado. La reducción de los efectos secundarios inespecíficos como resultado de la pasivación de alta k permite este aumento de la especificidad celular.
Ejemplo 4: Ablación celular específica del cáncer de mama en una mezcla de células sanguíneas sanas
La Fig. 8 muestra la viabilidad de MCF-7 y Leucocitos cuando se someten a impulsos de onda cuadrada de magnitud creciente. MCF-7 es una línea celular de cáncer de mama ampliamente utilizada como modelo de células tumorales circulantes en investigación. Los impulsos de onda cuadrada de 15 V reducen la viabilidad celular de MCF-7 a un 30,7 % en promedio. En particular, esto significa que ambos modelos de cáncer (Ejemplo 1 y 2) muestran una susceptibilidad de campo mayor que los eritrocitos a la misma intensidad de campo y conductividad (Fig. 1, 74,3 % viable).
Las Fig. 9 A y B muestran la dependencia de frecuencia de los mismos tipos celulares a la respectiva magnitud de campo.
La Fig. 10 A-B muestra los datos de citometría de flujo con y sin aplicación de campo a una mezcla 1:1 de poblaciones de MCF-7 y leucocitos en tampón. Las células MCF-7 se tiñen con un anticuerpo conjugado con FITC para su identificación. La viabilidad se evalúa mediante tinción con Hoechst 33342 antes de la adquisición de datos. En la población mixta sin aplicación de campo, el 69,8 % de las células MCF-7 marcadas son viables y el 91,7 % de los leucocitos permanecen intactos (Fig. 10 A, C). La aplicación de impulsos de onda cuadrada de 30 V a 100 Hz reduce la viabilidad de la población MCF-7 al 2,1 %, mientras que el 68,5 % de los leucocitos permanecen viables (Fig. 10 B, C). La Fig. 10 C muestra los recuentos promedio de población para dos réplicas técnicas con desviación estándar.
Materiales y procedimientos
Preparación de soluciones de trabajo
La preparación del tampón de electroporación (EPB) se realiza mediante la adición incremental de PBS a una solución autoclave de 250mM de sacarosa hasta que la conductividad alcance 100 pS/cm. La sangre total se diluye directamente en sacarosa 250 mM sin manipulación de la conductividad. La conductividad se mide utilizando un conductímetro (B-771 LAQUAtwin, HORIBA Advanced Techno). La sangre total fue donada por voluntarios sanos utilizando tubos de recogida K3-EDTA (Vacuette, Greiner Bio One, Austria), almacenados inmediatamente a 4 °C y conservados durante un máximo de 3 días. Todas las diluciones se prepararon con una solución de sacarosa 250mM. El tampón de lisis eritrocitaria (ELB) contiene 155 mM NH4Cl, 10mM KHCO3 y 0,1 mM EDTA y se esteriliza por filtración (filtro PVDF de 0,22 pm).
Cultivo celular
Se cultivaron linfocitos T Jurkat (suministrados por el Department of Nanobiotechnology of the University of Natural Resources and Life Sciences, Viena) a 37 °C y 5 % de CO2 en RPMI (Thermo Fisher, 21875091) suplementado con 10 % de FBS (Thermo Fisher, 10500) y antibiótico-antimicótico pen/estreptocócico al 1 % (Thermo Fisher, 15240) Jurkat son pasados por centrifugación durante 5 min a 400 g (Rt , Eppendorf 5430; Rotor: F-35-6-30). MCF-7 se cultivaron a 37 °C y 5% CO2 en MEM (Thermo Fisher, 21875091) suplementado con 10 % de FBS (Thermo Fisher, 10500), 2 % de L-glutamina (Thermo Fisher, 25030081), 1 % de aminoácidos no esenciales (Thermo Fisher, 11140050) y 1 % de antimicótico-antimicótico Pen/Strep (Thermo Fisher, 15240). Los MCF-7 se pasan por lavado con PBS (1 vez de solución madre: Thermo Fisher, 70011044), seguido de tripsinización (0,25 %, Thermo Fisher, 25200) durante 5 min a 37 °C. Todos los protocolos estériles se procesaron en cabinas de seguridad biológica (Herasafe KS, clase II, Thermo Fisher, 51022488).
Aislamiento de leucocitos
Se añaden 10 ml de ELB a 1ml de sangre entera, se incuba 10min TA y se invierte repetidamente. La suspensión se centrifuga a 500 g durante 10 min (Eppendorf 5430; Rotor: F-35-6-30). Estos pasos se repiten hasta que el sedimento celular esté blanco (sin eritrocitos). A continuación, se lava dos veces con una solución de sacarosa PBS ajustada a 100pS/cm, se cuenta y se vuelve a suspender para obtener una concentración de 1x106 células/ml. La viabilidad se evalúa mediante tinción con Hoechst 33342. Los preparados con una viabilidad inferior al 80% se descartan. 2.4 Preparación de linfocitos T Jurkat y suspensión células de cultivo MCF-7 linfocitos T Jurkat se centrifuga a 350 g durante 5 min y se aspira el exceso de medio. Las células se vuelven a suspender en 5 ml de EPB (100pS/cm). Este paso se repite tres veces. Durante el último paso de centrifugación, se cuenta una alícuota de células y se vuelve a suspender en la cantidad de EPB necesaria para obtener una concentración celular final de 1x106 células/ml. Se registra la conductividad precisa de la suspensión. Las células MCF-7 adherentes se lavan con PBS, se tripsinizan durante 5 min a 37°C y se vuelven a suspender en medio de cultivo. Los siguientes pasos de preparación se realizan de forma análoga a la preparación de Jurkat
Preparación de suspensiones en aumento
Para la suspensión de leucocitos enriquecida con linfocitos T Jurkat, ambas poblaciones se prepararon como se describe en las secciones 2.3 y 2.4. Los linfocitos Jurkat-T en EPB se tiñeron con una solución de Calceína-AM 10nM (Thermo Fischer, C3100MP) durante 60min a 37°C para permitir el seguimiento de la población en citometría de flujo. Se reservó una alícuota de células sin teñir para los controles negativos de citometría de flujo. Los linfocitos T Jurkat teñidos se mezclan 1:1 para concentraciones finales de 5x105 cada uno antes de la aplicación del impulso. Para la suspensión de leucocitos MCF-7, ambas poblaciones se prepararon como se ha descrito anteriormente. Las células MCF-7 en EPB se tiñeron con el anticuerpo CD326-FITC (1:20) durante 30 minutos a 4 °C para permitir el seguimiento de la población en la citometría de flujo. Se reservó una alícuota de células sin teñir para los controles negativos de citometría de flujo. Los MCF-7 teñidos se mezclan 1:1 para concentraciones finales de 5x105 cada uno antes de la aplicación del impulso. La discriminación vivo-muerto de la población MCF-7 no fue posible basándose únicamente en la fluorescencia FITC. Todas las muestras aumentadas se tiñeron con 1pg/ml de solución Hoechst 33342 y se incubaron 5 min TA antes de la adquisición de datos.
Aplicación del campo eléctrico
Se transfirió 1 ml de las respectivas suspensiones celulares a una jeringa de 1 ml (Omnifix-F, Braun, Alemania) y se inyectó en la ECLU mediante una bomba de jeringa (Fusion 200 Touch, KR Analytical Ltd, Reino Unido) ajustada a un caudal de 100 pl/min. Para discriminar entre parámetros, se dejó pasar a través del dispositivo al menos 5 veces el volumen de la cámara ECLU de 10 pl después de cualquier cambio de parámetro y antes de recoger una alícuota para su posterior análisis. Los campos eléctricos se indujeron aplicando las formas de onda de voltaje correspondientes mediante un generador de funciones (DG4102, Rigol) conectado a un amplificador de voltaje (Falco WMA-300, Falco Systems, Países Bajos). El voltaje y la corriente (a través de una resistencia de 20) se controlaron con un osciloscopio (DS1104B, Rigol).
Adquisición y análisis de datos
La adquisición de datos de citometría de flujo se realizó con BD FACSCanto II. Se fijaron umbrales de dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) para eliminar los restos celulares de la lectura final. 10.000 eventos se registraron para cada parámetro. Los parámetros Ca-AM y CD326-FITC se registraron en el canal FITC, la tinción Hoechst 33342 se registra en el canal Azul Pacífico. No se incluye ningún control de compensación debido a la falta de solapamiento de la fluorescencia. Los datos se registraron en el software de análisis Kaluza (Beckmann Coulter) y los resultados se representaron gráficamente en Graphpad Prism 7.
Ejemplo 5: Dispositivo para la electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas
La Fig. 11 muestra el dispositivo inventivo para electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas como una pipeta. La cámara está situada dentro de la punta de la pipeta, como puede verse en la Fig. 11 B. la Fig. 11 D y la Fig. 11 E muestran dos realizaciones diferentes de la cámara en una vista en sección transversal. 1 se refiere a los electrodos, mientras que 2 se refiere a la carcasa, que no es conductora.
En la Fig. 11 D, dos electrodos 1 esencialmente planos forman parte de una superficie interior de la cámara. Los electrodos son esencialmente opuestos y por lo tanto se enfrentan entre sí. Entre los electrodos se genera el campo eléctrico. La forma de la cámara de la Fig. 11 D es rectangular.
En la Fig. 11 E, la forma de la cámara es circular, y en la carcasa interior circunferencial se encuentran varios electrodos 1.
Ejemplo 6: Lisis celular a bajo voltaje para el aislamiento de ADN, ARN o proteínas
Los experimentos que se describen a continuación tienen como objetivo demostrar la lisis celular controlable de bajo voltaje en una punta de pipeta. La Fig. 12 A muestra las curvas de lisis de células 293T para diferentes conductividades al aplicar campos eléctricos con acoplamiento capacitivo con una señal de CA de onda cuadrada de 1 kHz durante 6 segundos. Para una conductividad de 60 pS/cm, la lisis comienza a los 10 V y alcanza una meseta a los 25 V. Al aumentar la conductividad a 160 pS/cm, se observó que la lisis comenzaba por debajo de 15 V y alcanza su máximo a 25 V. Con 260 pS/cm, el inicio de la lisis se produce a 20 V y alcanzó su máximo en torno a 30 V. El intervalo dinámico para las tres conductividades abarca 10 V, lo que corresponde a 1,2 kV/cm. Se demostró que la eficiencia de lisis de las células 293T es inversamente proporcional a la conductividad del tampón. Esta tendencia es muy reproducible y las curvas de lisis se distinguen claramente con pequeños cambios en la composición del tampón.
La Fig. 12 B muestra experimentos con el número de impulsos como única variable. La intensidad de campo se ajustó en 3,6 kV/cm y la frecuencia en 1 kHz. Como resultado, la eficiencia de lisis aumenta constantemente con el número de periodos hasta 2000 periodos, alcanzando una meseta de máxima eficiencia en torno al 90 % de lisis y una desviación estándar mínima para una conductividad dada.
La Fig. 12 C muestra la lisis de células 293T tras la exposición a 2000 impulsos a diferentes frecuencias. Aunque el tiempo total de exposición es significativamente diferente, el ajuste al umbral previamente determinado de 2000 impulsos da como resultado una eficiencia de lisis equivalente, independientemente de la frecuencia.
La Fig. 12 D muestra la concentración de ADN libre de células después de la lisis de células 293T con voltaje aplicadas crecientes.
La Fig. 12 E muestra la concentración de ARN libre de células después de la lisis de células 293T con voltaje aplicadas crecientes.
La Fig. 12 F muestra la extracción de proteínas citosólicas en su forma nativa de las células después de la lisis a través de campos eléctricos acoplados capacitivos utilizando la punta de la pipeta. (en Arbeit)
Ejemplo 7: Entrega de carga a transfección celular
El experimento descrito a continuación pretende demostrar la entrega controlable de carga a las células mediante la aplicación de voltajes bajos a la punta de la pipeta. La Fig. 13 A muestra la lisis y la administración de yoduro de propidio (PI) en células 293T cuando se exponen a un número decreciente de pulsos de onda cuadrada de alto voltaje. Cincuenta impulsos de 40 V provocaron la lisis del 48,5 % de las células, mientras que el PI fue captado por el 78,8 % de las células viables restantes. Disminuyendo aún más el número de impulsos se obtiene una mayor viabilidad, mientras que la fracción de células vivas permeables al PI se mantiene similar. Tras la exposición a 5 impulsos de onda cuadrada de 40 V, el 5,6 % de las células 293T son lisadas por el campo eléctrico, mientras que el 82,8 % son viables y positivas a PI.
La Fig. 13 B muestra una mayor optimización del transporte de PI cambiando el voltaje aplicado. Las células se sometieron a 5 impulsos de onda cuadrada a una frecuencia de repetición de 1 kHz. La viabilidad permanece prácticamente inalterada por la magnitud del campo en este intervalo de impulsos. La viabilidad de las células 293T disminuye en un 2,5 % con la aplicación de cinco impulsos de 25 V, mientras que cinco impulsos de 40 V reducen la viabilidad en un 1,8 %.
La Fig.13 B muestra además una correlación entre la intensidad de campo y la fracción de células permeables al PI, obteniéndose un 22,4%, un 66,7%, un 82,3%, un 80,5% y un 81,1 % para 25 V, 30 V, 35 V, 40 V y 45 V respectivamente.
La Fig. 13 C demuestra que la permeabilización al PI está fuertemente correlacionada con el número de impulsos al mismo voltaje. Mil pulsos de onda cuadrada producen un 48,4 % de células 293T viables positivas a PI, aumentando hasta un 85,0 % a 3000 impulsos con una mínima pérdida de viabilidad.
La Fig. 13 D muestra células 293T que expresan RFP 48 horas después de la electrotransfección con el plásmido pTurboRFP-N mediante la aplicación de impulsos de decadencia exponencial de 40 V a la punta de la pipeta.
Materiales y procedimientos
Producción de prototipos recubiertos de óxido de titanio.
Se cortó una lámina de titanio de grado 2 (titanio comercialmente puro, cpTi, 99,2 % de pureza) en dimensiones de 60 x 10 mm. Se utilizó un espesor promedio de capa de óxido de 500-600 nm. Los depósitos de electroporación se montaron utilizando cinta adhesiva de doble cara de 81,3 pm de espesor (Adhesive Research, Arcare 90445) separadas 2,5 mm entre sí para formar un canal de 12,15 pl. Se cortaron los 5 mm superiores de una punta de pipeta estándar de 200 pl y se realizó una incisión corta de 90° en el extremo estrecho resultante. El montaje de la punta de electroporación se realizó introduciendo el canal flanqueado por el electrodo en la incisión y sellando herméticamente los bordes con adhesivo epoxídico de dos componentes (UHU plus Endfest 300, 45640). Las puntas resultantes pueden utilizarse con cualquier pipeta de 20 pl ajustada a un volumen de 10 pl.
Cultivo celular
Las células de riñón embrionario humano 293T (suministradas por el Department of Nanobiotechnology of the University of Natural Resources and Life Sciences, Viena) se cultivaron a 37 °C y un 5% de CO2 en DMEM (Thermo Fisher, 41965) suplementado con FBS al 10% (Thermo Fisher, 10500) y antibiótico antimicótico de penicilina/estreptomicina al 1 % (Thermo Fisher, 15240). Las células se hicieron pasar lavándolas con PBS (1x a partir de la solución madre: Thermo Fisher, 70011044), seguido de tripsinización (0,25 %, Thermo Fisher, 25200) durante 5 min a 37 °C. Todos los protocolos estériles se procesaron en cabinas de seguridad biológica (Herasafe KS, clase II, Thermo Fisher, 51022488).
Preparación de las muestras
Las células se lavaron con PBS, se separaron por tripsinización y se resuspendieron en medio DMEM suplementado. El tampón de electroporación (EPB) se preparó a partir de una solución de sacarosa 250 mM esterilizada en autoclave. Se añadió PBS para ajustar las conductividades de muestra deseadas. La conductividad se midió con un conductímetro (B-771 LAQUAtwin, HORIBA Advanced Techno). Las células se centrifugaron durante 5 min a 400 g (TA), se descartó el sobrenadante y se volvieron a suspender con EPB. Tras dos lavados, se contaron las células y se ajustaron a 1 * 10A6/ml con la siguiente reconstitución. Se registró la conductividad final. Si la suspensión se desvía más de 10 pS/cm del EPB calibrado, se repite la etapa de lavado hasta que la conductividad se encuentre dentro de este intervalo. También se evaluó la muerte celular derivada de la preparación de las muestras. Solo se utilizaron para los experimentos las muestras que contenían más del 90 % de células vivas, según lo determinado por la tinción Hoechst 33342.
Lisis celular eléctrica y formación de imágenes
La lisis de células 293T se utiliza como lectura indirecta para analizar el impacto biológico de los campos eléctricos con acoplamiento capacitivo a través de una gama de parámetros. Las células en tampón EP se transfirieron a una película de parafina hidrófoba en gotas de 10 pl y se aspiraron con el prototipo de punta de electroporación. Los campos eléctricos se indujeron aplicando las formas de onda de voltaje correspondientes mediante un generador de funciones (DG4102, Rigol) conectado a un amplificador de voltaje (Falco WMA-300, Falco Systems, Países Bajos). El voltaje y la corriente (a través de una resistencia de 20) se controlaron con un osciloscopio (DS1104B, Rigol). Las células se expulsaron sobre la película de parafina y se mezclaron con una solución madre de 10 ug/ml (10x) en PBS para obtener una concentración final de 1 |jg/ml. La muestra se transfirió a un hemocitómetro (Thoma, Optik Labor) y se tomaron imágenes con una cámara digital (Prosilica GT, Allied Vision) montada en un microscopio invertido (CKX41 Fluo V2, Olympus). Se registraron imágenes de campo claro para el recuento total de células. Para identificar las células lisadas, se excitó el colorante de viabilidad Hoechst 33342 a 360 nm utilizando una fuente de luz UV (X-Cite 120Q, Excelitas Technologies) y se tomaron imágenes de la emisión por encima de 420 nm para su posterior análisis.
Permeabilización eléctrica de células y formación de imágenes
El colorante de permeabilización yoduro de propidio (PI) se preparó a partir de la dilución de una solución madre de 1 mg/ml con tampón de electroporación para limitar cualquier cambio de conductividad. Las células en tampón EP se transfirieron a película de parafina hidrófoba en gotas de 9 j l y se mezclaron 1:10 con una solución de 30 pg/pl de PI. La mezcla se aspira con el prototipo de punta de electroporación. Los campos eléctricos se indujeron aplicando las formas de onda de voltaje correspondientes mediante un generador de funciones (DG4102, Rigol) conectado a un amplificador de voltaje (Falco w MA-300, Falco Systems, Países Bajos). El voltaje y la corriente (a través de una resistencia de 20) se controlaron con un osciloscopio (DS1104B, Rigol). La muestra se expulsa a un hemocitómetro (Thoma, Optik Labor) y se toma una imagen mediante una cámara digital (Prosilica GT, Allied Vision) montada en un microscopio invertido (CKX41 Fluo V2, Olympus). Para identificar las células permeabilizadas, el PI impermeable a la membrana se excitó de 480-550 nm utilizando una fuente de luz UV (X-Cite 120Q, Excelitas Technologies) y se tomaron imágenes de la emisión por encima de 590 nm para su posterior análisis.
Análisis de los datos
Las imágenes de la lisis se analizaron en Fiji (Schindelinet al.,2012) ajustando el umbral para incluir solo las células positivas, aislando las células vivas de alto contraste en las imágenes de campo claro y las células muertas teñidas en las imágenes de fluorescencia. Tras convertir las imágenes a código binario, se realizó el recuento celular mediante la función de análisis de partículas. Los resultados se muestran como porcentaje lisado, excluyendo la fracción de células muertas de la preparación de la muestra, lo que significa que el control siempre se muestra como cero por ciento de lisis. Las células positivas a PI se contaron manualmente a partir de una superposición de campo claro y fluorescencia roja. Los controles se sobreexpusieron hasta el punto en que las células negativas a PI permanecen invisibles. A continuación, este ajuste se aplica a muestras sometidas a campos eléctricos. Las células muertas muestran una alta fluorescencia de PI, parecen visiblemente muertas en campo claro y se calculan igual que en los experimentos de lisis. Las células permeabilizadas se muestran como la fracción de células visiblemente vivas con alguna fluorescencia PI.
Transfección
Las células preparadas como en la sección Preparación de la muestra se mantuvieron en un entorno de trabajo estéril. Se colocaron 9 j l sobre una película de parafina hidrófoba y se mezclaron con 1 j l de solución madre de vector para obtener una concentración final de trabajo de 25 ng/ml de pTurboRFP-N (Evrogen, FP232) y 0,5 mM de MgCl2. La suspensión se aspiró hacia la punta de electroporación y se expuso a 10 impulsos de decadencia exponencial de 40 V a 1 kHz seguidos de 1000 impulsos de transferencia de decadencia exponencial de 15 V a 50 Hz. Se expulsaron hacia un portaobjetos j de 8 pocillos (Ibidi, 80826) y se dejaron reposar durante 5 minutos. Se añadieron 250 j l de OptiMEM (Thermo Fischer,31985062) y se resuspendieron suavemente. Las células transfectadas se cultivaron a 37 °C y un 5 % de CO2 durante 48 horas y se tomaron imágenes con una cámara digital (Prosilica GT, Allied Vision) montada en un microscopio invertido (CKX41 Fluo V2, Olympus). La fracción de células que expresan RFP se evaluó a partir del recuento manual de superposiciones de campo claro y fluorescencia roja de al menos 5 imágenes de posiciones aleatorias en cada pocillo respectivo.
Aislamiento del ADN
Para cada ajuste de lisis, se colocaron 10 j l de células 293T (1x106 células/ml) preparadas como en la sección 3.3 sobre película de parafina hidrófoba y se aspiraron a la punta de electroporación. Se aplican 6000 impulsos de onda cuadrada del voltaje respectivo, se expulsan a la película de parafina y se transfieren a tubos de ensayo individuales de 1,5 ml. Una vez recogidos todos los parámetros, se centrifugan (1000 rfc, 5 min, TA) para eliminar las células supervivientes y los restos de gran tamaño. Se extraen cuidadosamente 5 j l de sobrenadante y se transfieren a tubos de ensayo PCR para su almacenamiento. Las mediciones de Picoverde mediante Nanogota fueron precedidas por la obtención de una curva estándar en el intervalo de 0,8 - 0,01 ng/jl. Los resultados muestran el rendimiento de ADN de 10000 células 293T tras la exposición al campo eléctrico.
Ejemplo 8: Dispositivo de electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas para citometría de flujo
La Fig. 14 muestra dos cámaras 1 y 3 con electrodos en combinación con una unidad de citometría de flujo. La unidad de citometría de flujo está en conexión fluida con las cámaras 1 y 3, de modo que la muestra biológica puede fluir desde las cámaras 1, 3 a la unidad de citometría de flujo y/o viceversa. Para controlar la unidad de citometría de flujo y analizar la muestra, puede utilizarse una unidad de control 5. Para ajustar los parámetros eléctricos de los electrodos de las cámaras 1 y 3, las unidades de ajuste 2 y 4 están conectadas a los electrodos de las cámaras. Por supuesto, sólo puede utilizarse una unidad de ajuste que regule el campo eléctrico en ambas cámaras 1 y 3 independientemente una de otra. Para la transferencia de datos, la unidad de control 5 puede conectarse a las unidades de ajuste 2 y 4. En la cámara 1, la muestra biológica, en la Fig. 14 denominada suspensión celular, puede mezclarse con una solución de tinción.
La Fig. 15 representa la lisis de células sanguíneas dependiente de la conductividad. Como se ha demostrado, la lisis de células con campos eléctricos acoplados capacitivos es eficaz utilizando una dilución 1:10 de sangre en sacarosa. Dado que la lisis completa de las células inducida por el campo eléctrico se produce en menos de 6 segundos, un prototipo con un volumen de 1 ml podría procesar y aislar patógenos de los 7 ml de sangre total necesarios en menos de 10 minutos.
Se desarrollaron varios diseños y se construyeron prototipos centrándose en la fabricación industrial rentable. En la figura 37, se muestra un diseño prototipo que se asemeja a un condensador de tipo rodillo con capacidad para 1 ml de muestra. Dado que el recubrimiento completo y homogéneo de los electrodos por una fina película de material de alto k es la base fundamental de los efectos físicos puros y específicos del campo eléctrico sobre las células, los defectos en el recubrimiento dan lugar a una transferencia de carga entre el electrodo y la muestra biológica cuando se aplica un voltaje a los electrodos y, por tanto, dan lugar a efectos electroquímicos superpuestos. La aparición de defectos en la película de pasivación se observó durante las pruebas mediante una configuración de medición eléctrica.
Para resolver el problema de la generación de capas de pasivación defectuosas, se exploraron procedimientos alternativos a la oxidación térmica establecida. La oxidación anódica de metales se consideró la más prometedora por su bajo coste, su control preciso y su amplio uso industrial.
Con láminas de titanio oxidadas anódicamente, se construyó un prototipo a escala de laboratorio con el que se realizaron prometedores experimentos de lisis de células de sangre total con campo eléctrico (Fig. 16 a, b, c).
Ejemplo 9: Aplicación del enriquecimiento de leucocitos a partir de muestras de sangre humana
Para investigar otras posibilidades de aplicación, se investigó la especificidad celular dentro de los tipos de células humanas. En primer lugar, se aislaron leucocitos de la sangre y se expusieron a diferentes voltajes y frecuencias de onda cuadrada en el prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio (Fig. 17).
Como puede verse en la figura 17, puede observarse un comportamiento de lisis celular sorprendentemente discreto entre los leucocitos (magenta) y las células de sangre entera (rojo, >99% eritrocitos) dependiente de la amplitud del voltaje (Fig. 17 a) así como de una manera dependiente de la frecuencia (Fig. 17 b, c).
Para confirmar si la tecnología desarrollada podría utilizarse como un sustituto atractivo de los engorrosos y largos procedimientos del estado de la técnica para el aislamiento de leucocitos a partir de sangre total (es decir, centrifugación en gradiente o una serie de pasos de incubación en tampón de lisis eritrocitaria y centrifugación), se realizaron varios experimentos en aumento con sangre total y leucocitos en una relación de 1:2. Tras la aplicación de parámetros de lisis selectiva (25 V, 100 Hz sqAC), se comparó el número relativo de células leucocitarias y su viabilidad con un control no tratado. Los leucocitos se diferenciaron de los eritrocitos utilizando un colorante fluorescente permeable a las células (Hoechst), que intercala el ADN y tiñe el núcleo de las células.
Como puede observarse en la figura 18, partiendo de un 50% de células de origen leucocitario (Hoechst+) en el control sin campo, tras el tratamiento de la muestra en el prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio, la población leucocitaria se enriqueció eficazmente. La doble tinción con un colorante no permeable (yoduro de propidio, PI) se utilizó para evaluar cualquier cambio en la integridad de la membrana de la población de leucocitos. Tras la aplicación del campo eléctrico y la lisis selectiva de los eritrocitos, la fracción de leucocitos intactos se mantiene igual en comparación con el control, lo que indica que los parámetros del campo aplicado no influyen en la integridad de la membrana.
Ejemplo 10: Ablación específica de células cancerosas en poblaciones celulares mixtas
La biopsia líquida comprende el aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) a partir de muestras de sangre para la investigación básica del cáncer y el tratamiento dirigido de pacientes con cáncer. Dado que la concentración de células cancerosas circulantes en sangre es relativamente baja (1-10 CTC en 10 ml de sangre), el enriquecimiento de CTC se considera actualmente uno de los mayores cuellos de botella. Los procedimientos anteriores se centran predominantemente en el aislamiento de CTC utilizando anticuerpos anti-EPCAM. La estrategia de utilizar un marcador epitelial en la superficie celular de las CTC conlleva la restricción de omitir las células cancerosas que han sufrido una transición epitelial a mesenquimal. Así pues, la siguiente oportunidad de aplicación que nos interesaba era transferir la estrategia de uso de campos eléctricos para el aislamiento de patógenos al aislamiento de CTC a partir de sangre. Para realizar los primeros experimentos de prueba de principio, se utilizaron dos destacadas líneas celulares modelo de cáncer. Células Jurkat como modelo para la leucemia de células T humanas (EPCAM negativas) y células de cáncer de mama MCF-7, un modelo ampliamente utilizado para las CTC EPCAM positivas.
Como puede verse en la figura 19, de nuevo puede observarse un comportamiento discreto de lisis celular entre leucocitos sanos (magenta) y células T leucémicas (azul, Jurkat) dependiente de la amplitud del voltaje (Fig. 19 a) así como diferentes respuestas de frecuencia (Fig. 19 b, c).
Para confirmar la lisis célula-específica de células leucémicas en una mezcla con leucocitos sanos, se diseñó otro experimento en aumento. Para ello, la población leucémica se tiñó con un marcador fluorescente (Calceína AM) y se mezcló con leucocitos sanos no teñidos en una relación de 1:2, la suspensión celular se hizo pasar por un prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio sin campo aplicado (sin control de campo) y con 20 V a una frecuencia de C<a>cuadrada de 50 Hz. El análisis se realizó con un citómetro de flujo.
En la figura 20, se representan los resultados del experimento en aumento para la ablación de células específicas de leucemia en una mezcla con leucocitos sanos. Las figuras 20 a y b muestran la citometría de flujo de control leída de células Jurkat marcadas con fluorescencia (azul) y de leucocitos sanos solamente (magenta), respectivamente. La Figura 20 c muestra la suspensión celular mezclada después de pasar por un prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio sin campo eléctrico aplicado. Claramente, ambas poblaciones celulares pueden discriminarse. Tras la aplicación de 20 V a 50 Hz sqAC, la población de células Jurkat se reduce específicamente y se observa un aumento de los restos celulares (negro). La figura 20 e representa el número relativo de eventos de citometría de flujo de tres experimentos individuales. Sin campo eléctrico, el 30% de los eventos pueden asignarse a leucocitos leucémicos marcados con fluorescencia (células Jurkat). Tras la aplicación del campo eléctrico, el número de eventos asignados a restos celulares (baja dispersión lateral) se duplicó con creces en comparación con el control sin campo. La figura 20 f es una micrografía representativa de células Jurkat lisadas mediante la aplicación de 20 V 50 Hz sqAC, que muestra células lisadas que aparecen como cáscaras celulares vacías, denominadas "fantasmas", que se agrupan como restos en la lectura de citometría de flujo.
El hecho de que los leucocitos leucémicos sean más susceptibles a los campos eléctricos fue un hallazgo sorprendente. En primer lugar, se observó que las células Jurkat eran más pequeñas que la mayoría de las células de la muestra de leucocitos sanos, lo que contradiría el paradigma actual en el área de investigación de las aplicaciones de campos eléctricos pulsados en biología de que la susceptibilidad del campo eléctrico escala con el tamaño celular. En segundo lugar, se ha informado de que las células cancerosas tienen una mayor concentración de proteínas transmembrana, lo que se estimó que reduce el potencial transmembrana inducido por el campo eléctrico. Para investigar más a fondo el comportamiento de las células cancerosas en campos eléctricos, se repitió el diseño experimental Jurkat utilizando células de cáncer de mama MCF-7, una línea celular modelo CTC del estado de la técnica
Como en el caso de las células Jurkat, también se observó que las células MCF-7 eran más susceptibles a los campos eléctricos que las células sanguíneas de un donante sano (Fig. 21). Curiosamente, la tasa de lisis en función del voltaje y la frecuencia también es diferente a la de las células Jurkat, lo que resulta en una ventana de oportunidad menor para discriminar entre leucocitos sanos y células de cáncer de mama MCF-7 utilizando campos eléctricos en el espectro de parámetros investigado. Además, las células MCF-7 mostraron un comportamiento de lisis explícitamente diferente. En lugar de una ruptura celular completa o la aparición de fantasmas celulares vacíos, como se observa con los tipos celulares investigados durante el proyecto (eritrocitos, leucocitos, Jurkat, CHO, HEK, 293T, NIH-3T3 y otros), las células MCF-7 lisadas conservaron su granularidad intracelular.
Para demostrar la ablación específica de células tumorales a través de campos eléctricos en una suspensión celular mixta, de nuevo se realizó un experimento en aumento. En la figura 22 a-c se muestran los gráficos de puntos de la lectura de citometría de flujo para ningún campo aplicado, 25 V aplicados a 1 kHz sqAC y 30 V aplicados a 100 Hz sqAC, respectivamente. La figura 22 e resume los resultados de dos experimentos individuales. Los resultados del experimento en aumento demuestran la viabilidad de una ablación altamente eficaz de células tumorales en una suspensión celular mixta utilizando campos eléctricos. Sin embargo, también puede observarse un cierto grado de perforación inducida por el campo eléctrico de los leucocitos sanos con los parámetros de campo eléctrico utilizados en estos experimentos, como muestra la migración hacia arriba de la población de leucocitos en los gráficos de puntos (Fig. 22 a-c), así como el aumento del número de leucocitos no viables en comparación con el control sin campo. Para evitarlo, futuros experimentos pueden optimizar aún más la especificidad celular del campo eléctrico cambiando la frecuencia y/o el potencial eléctrico aplicado.
Ejemplo11:Aplicación del enriquecimiento de células madre a partir de muestras de sangre humana
Para buscar otras posibilidades de aplicación de alto potencial del sistema de lisis celular de campo eléctrico acoplado capacitivo desarrollado, se realizaron experimentos para investigar la posibilidad de aislar células madre hematopoyéticas (HSC) a partir de células sanguíneas. Las HSC tienen un enorme potencial para el tratamiento de diversas enfermedades tales como el cáncer, la leucemia, el linfoma, la insuficiencia cardiaca, los trastornos neurales, las enfermedades autoinmunes, las inmunodeficiencias y los trastornos metabólicos o genéticos. Además de los retos que supone explicar y controlar los mecanismos de diferenciación y desarrollo hacia un tipo celular específico necesario para tratar la enfermedad, es importante obtener un número suficiente del tipo celular deseado a partir de una muestra de donantes. Como ocurre con la mayoría de los procedimientos de aislamiento celular, el estado actual de la técnica está dominado por los aislamientos mediados por anticuerpos. En la actualidad, las HSC se aíslan principalmente de la médula ósea, ya que la concentración de HSC es mayor en la médula ósea que en la sangre. Permitir un aislamiento eficaz de las HSC a partir de la sangre sería, por tanto, una alternativa muy atractiva desde el punto de vista clínico. Para los primeros experimentos de prueba de principio, se aislaron leucocitos de la sangre de un voluntario sano y se expusieron a campos eléctricos mediante la aplicación de 40 V a 100 Hz sqAC en el prototipo de flujo continuo a escala de laboratorio. Las muestras de control se hicieron pasar por el prototipo sin aplicar un campo eléctrico. A continuación, las muestras se tiñeron con anticuerpos antiCD45 y antiCD34 marcados con fluorescencia y se analizaron en un citómetro de flujo.
La figura 23 muestra el resultado de un estudio preliminar sobre la posibilidad de utilizar campos eléctricos para el aislamiento de las HSC. Como puede observarse en la figura 23 a, el 0,25% de la suspensión total de células de la muestra de control son eventos CD45 y CD34 positivos y, por tanto, representan h Sc . Este valor se sitúa en el intervalo esperado para la frecuencia de las HSC en la sangre. Tras la aplicación de 40 V a 100 Hz sqAC, el número de eventos CD45 y CD34 positivos se multiplica aproximadamente por 10 hasta alcanzar el 2,2% del total de eventos. Así pues, los resultados sugieren que podría ser factible un enriquecimiento de las HSC a partir de la sangre mediante la explotación de las diferentes susceptibilidades de las células madre hematopoyéticas y los leucocitos. Hay que indicar, sin embargo, que estos resultados incluirán diferentes conjuntos de anticuerpos antiCD45. Dado que las muestras de partida de los experimentos eran leucocitos aislados (por definición CD45 positivos), la aparición de una población<c>D45 negativa (75,4% en el control y 5,1% en la muestra tratada, véanse los paneles de la Fig. 23 a,b) sugiere una mala calidad de los anticuerpos.
Ejemplo 12: Diseño de electrodos para la transferencia de genes
Además de la lisis celular a través de campos eléctricos, denominada electroporación irreversible, otro efecto muy interesante de los campos eléctricos es la generación de poros temporales en la membrana celular inducida a través de un campo eléctrico, denominada electroporación reversible. Estos poros temporales se utilizan ampliamente para introducir moléculas extrañas en las células, principalmente plásmidos de ADN para la manipulación genética de las células, es decir, la transfección de células eucariotas. Aunque existen tecnologías de transfección vírica, química y física, la electroporación ofrece potencialmente ventajas únicas, tal como su bajo coste, alto rendimiento, especificidad y controlabilidad. Sin embargo, los principales retos a los que se enfrentan los productos de electroporación actuales son la complejidad tecnológica y operativa, la escalabilidad del sistema, la viabilidad celular y la reproducibilidad. Para hacer frente a estos retos, otro objetivo del proyecto ECLS era investigar si la reducción de los efectos electroquímicos mediante campos eléctricos acoplados capacitivos daría lugar a una electroporación reversible superior. Además del prototipo de flujo continuo desarrollado, que sería de interés para su aplicación a escala industrial en biotecnología, la combinación con el diseño microfluídico y el bajo voltaje requerido permitiría también la realización de dispositivos portátiles alimentados por batería. Para generar un dispositivo se incluye un dispositivo de flujo en una punta de pipeta para aplicaciones de campo eléctrico en un entorno de laboratorio (Fig. 11).
Utilizando un dispositivo comercial de electroporación, se pueden mostrar las limitaciones actuales. En primer lugar, debido a que la distancia entre electrodos en la cubeta de electroporación es de 4 mm, la exposición no homogénea al campo eléctrico conduce a una baja eficacia de la permeabilización celular inducida por el campo eléctrico, así como a un equilibrio entre la electroporación y la lisis celular, que se supone que se debe a la aparición de efectos electroquímicos cerca de la superficie no pasivada del electrodo. Además, los campos eléctricos aplicados de 0,875 a 1,25 kV/cm se traducen en potenciales eléctricos aplicados en el intervalo de 350 a 500 V. Por el contrario, el concepto de utilizar campos eléctricos acoplados capacitivos con un dispositivo microfluídico dio como resultado una captación de IP altamente eficiente a bajas tasas de lisis con sólo 30 a 45 V aplicados. Además, se demostró que se producen dos modos de permeabilización celular temporal inducida por el campo eléctrico, que se denominan modo de baja y de alta energía (Fig. 25).
Como la permeabilización temporal, y por tanto la electroporación reversible, se demostró con éxito mediante la captación de colorantes fluorescentes, el siguiente objetivo era transferir ADN a las células. Así, se realizaron experimentos utilizando un plásmido portador de un gen para un reportero fluorescente (proteína roja fluorescente, RFP). Estos experimentos fueron muy instructivos con respecto a los requisitos previos de la transferencia de ADN. En nuestro enfoque, la transferencia de ADN a las células sólo pudo demostrarse con la aplicación de impulsos de decadencia exponencial (Fig. 26). Esto reduce la descarga capacitiva repentina de los electrodos y, por tanto, se supone que permite un movimiento electroforético neto de la molécula de ADN cargada.
Aunque la transferencia exitosa del plásmido se observó mediante microscopía de fluorescencia 24 a 48 horas después de los experimentos de electroporación a través de la producción de RFP por las células transfectadas, la eficiencia de transfección fue baja, produciendo 5-10% de células RFP positivas. Así, se investigó la teoría común de que la carga negativa del ADN debe neutralizarse añadiendo iones cargados positivamente para que el ADN entre en contacto con la membrana celular cargada negativamente.
Sorprendentemente, la adición de MgCh, que es el principal componente iónico en los tampones de electroporación del estado de la técnica, se correlacionó positivamente con la eficiencia de transfección sólo hasta una cierta concentración umbral. El aumento de la concentración hasta el intervalo recomendado (>0,5 mM), provocó una caída repentina de la eficiencia de transfección (Fig. 29).
Como puede verse en la figura 28 a, el MgCh resultó en una reducción pronunciada de la tasa de lisis, la adición de fosfato resultó en una meseta de la tasa de lisis y el uso de un tampón de LiCl con la misma conductividad mejoró significativamente el efecto del campo eléctrico comparado con el MgCl2. Para comprobar si la adición de LiCl al tampón de electroporación también aumenta la eficacia de la transfección, se realizó la transfección de pRFP en comparación con los tampones que contienen MgCl2. Como se observa en la figura 28 b, la eficacia de transfección se duplicó con creces utilizando LiCl como componente tampón en comparación con MgCl2. Dado que el LiCl no aumentó la eficacia de transfección cuando se utilizaron impulsos de onda cuadrada estándar, sigue siendo probable un efecto combinatorio entre la permeabilización del campo eléctrico y la actuación electroforética del plásmido. Sin embargo, para explotar el uso de campos eléctricos capacitivos acoplados como tecnología de transfección novedosa y mejorada, es necesario aumentar aún más la eficacia. Esto puede lograrse ampliando la comprensión de los procedimientos detallados del transporte de ADN a través de una membrana celular porosa y el papel de los suplementos iónicos. Cabe destacar que ni la contribución significativa de determinadas especies iónicas a la lisis celular inducida por campos eléctricos ni la mejora de la eficacia de la transfección mediante el cambio de la composición iónica a LiCl se recogen en la bibliografía correlacionada. Además, se investigó el uso de dicha punta de pipeta para recuperar contenidos celulares de forma no desnaturalizante. Se verificó el aislamiento de ADN, ARN y proteínas. Es posible el aislamiento de proteínas específicas de compartimento (proteínas totales, proteínas citosólicas y proteínas de fracción de membrana) a diferentes parámetros de campo eléctrico.
Ejemplo 13: Investigación del modo de acción del campo eléctrico en diferentes células
Durante el procedimiento de investigación de la electroporación reversible, también se investigó el efecto del campo eléctrico en otros tipos de células de cultivo. Al igual que con las muestras de células humanas, también se observaron diferentes susceptibilidades al campo eléctrico de las líneas celulares cultivadas mediante la realización de lecturas de lisis celular (Fig. 29). Se investigó el inicio de la electroporación reversible y se siguieron las tendencias de la lisis celular inducida por el campo eléctrico. Además, se investigaron factores tal como el número de pases celulares, el ciclo celular y la inanición.
Como lo indican los experimentos de lisis utilizando células sanguíneas, también las células cultivadas exhiben diferentes comportamientos de lisis. Cabe destacar que los índices de lisis no se correlacionaron con los valores bibliográficos del tamaño celular respectivo ni con la capacitancia de la membrana celular, dos de los factores más dominantes en la teoría actual de la acción de los campos eléctricos sobre las células.
Para estudiar más a fondo la dependencia del tamaño celular, se alteró el tamaño de las células de los mismos tipos celulares mediante la inducción de la regulación osmótica a través de diferentes tampones de azúcar osmolar. El tamaño de las células se verificó mediante los valores de dispersión hacia delante de la citometría de flujo y los experimentos de lisis celular inducida por campos eléctricos realizados (Fig. 30) .
Como se muestra en la figura 30, los tampones de azúcar de osmolaridad más alta resultaron en un cambio de la dispersión hacia adelante de las células, que se correlaciona con el tamaño celular. Aunque el tamaño celular cambió debido a las diferentes osmolaridades, como era de esperar, la eficacia de la lisis inducida por el campo eléctrico no disminuyó significativamente. Este hallazgo es de crucial importancia, ya que la teoría actual sugiere fuertemente el tamaño de las células como el factor influyente más dominante para el efecto de los campos eléctricos externos aplicados.
Ejemplo 14: Caracterización física
El concepto de utilizar un enfoque microfluídico junto con electrodos pasivados de alta k para el acoplamiento capacitivo de campos eléctricos es, hasta donde sabemos, un enfoque único. En combinación con los significativos efectos específicos del campo eléctrico observados y los resultados que, en algunos aspectos, contradicen los teoremas actuales en el campo de la investigación, es de suma importancia una mejor caracterización física y comprensión del sistema global.
Para ello, se examinaron prototipos y electrodos individuales en términos de su comportamiento eléctrico, algunos resultados representativos se mostrarán aquí.
Visto en la figura 31 a, la corriente de fuga a través de la solución cuando se aplica una corriente continua está en el intervalo bajo pA. En comparación con prototipos idénticos con electrodos no pasivados, los valores son un factor 104 más bajos. Estos resultados fueron informativos en cuanto a la propagación del campo eléctrico. Además, las propiedades semiconductoras de tipo n de la capa de pasivación de TiO<2>de alto k se confirmaron mediante mediciones (Fig. 31 b). Dado que el prototipo construido estaría compuesto por dos diodos schottky opuestos, se realizaron nuevas investigaciones.
A continuación, el circuito equivalente se transfirió a un programa de diseño y simulación de circuitos eléctricos. Se introdujeron varios parámetros eléctricos en el circuito equivalente para observar las caídas temporales de potencial en los distintos elementos del circuito, tal como el electrolito. Utilizando el modelo de circuito, se compararon los ajustes eléctricos de los experimentos de lisis celular realizados para añadir parámetros eléctricos detallados a un conjunto de datos profundo de más de 700 puntos de datos individuales de lisis celular HEK.
Con la finalización de un conjunto de datos tan grande relativo a un único tipo celular, quedó claro que los factores físicos/eléctricos más determinantes responsables de la lisis celular, así como sus interdependencias, se derivan mediante un enfoque de aprendizaje automático. Si tiene éxito, el cambio de tipo celular permitiría además recuperar factores biológicos específicos de cada tipo celular.
Para extraer los tornillos de presión más significativos que determinan los efectos del campo eléctrico sobre las células, se derivó así un modelo estadístico para las tasas de lisis utilizando un modelo de regresión logística multinomial.
A partir de los datos experimentales, el modelo podría predecir de forma plausible las tasas de lisis si se dan diferentes soluciones conductoras. Además, se realizaron cuatro experimentos independientes de lisis a diferentes voltajes, frecuencias y tiempos de exposición y se compararon con la predicción del modelo.
Ejemplo 15: Cámara con electrodos de características semiconductoras.
El óxido de titanio generado térmicamente se investigó para determinar su comportamiento aislante o semiconductor de tipo n. Se realizó un escaneo I/V para electrodos no pasivados y pasivados. Por lo tanto, los electrodos se pusieron en contacto a través del metal base y a través de una pasta de contacto de plata que cubría una superficie de 90 mm2 La corriente se midió con los correspondientes voltajes continuos aplicados.
Como puede verse en la Figura 32, los electrodos de titanio sin oxidación térmica muestran un aumento lineal de la corriente con el voltaje continuo aplicada independiente de la polaridad, representando así un elemento resistivo. Por el contrario, los electrodos de titanio pasivado muestran un comportamiento de bloqueo de corriente al aplicar potenciales negativos, actuando así con características semiconductoras de tipo n. Un electrodo de titanio con una capa de pasivación deficiente muestra ruptura dieléctrica cuando se aplican voltajes superiores a 12 V. Como tal, la capa de TiO<2>sobre el electrodo representa un diodo, bloqueando la corriente en una dirección.
Con respecto a la configuración ensamblada, esto sugiere que ambos electrodos representan dos diodos en direcciones opuestas, bloqueando la corriente óhmica global independientemente de la polaridad del voltaje. Las medidas de baja corriente de fuga, el experimento realizado con un colorante indicador de pH a corriente continua que no muestra claramente ninguna reacción electroquímica, así como los experimentos de lisis que no muestran ningún efecto en soluciones altamente conductoras favorecen este modelo. Así, como una capa de pasivación actúa como elemento de alta resistividad y la otra como elemento de baja resistividad, lo que se invierte cuando se invierte el potencial eléctrico, sólo el elemento de alta resistividad experimenta una caída de potencial significativa. Esto permite que una mayor relación del potencial caiga en el fluido, por lo tanto, un campo eléctrico más alto, pero aún proporcionando un desacoplamiento capacitivo del material del electrodo con la muestra líquida.
Claims (15)
1. Un procedimiento de electroporación y/o lisis dirigida de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica con al menos dos subgrupos de cuerpos celulares eucariotas, en el que cada subgrupo tiene una susceptibilidad diferente a la electroporación y/o lisis en campos eléctricos, que comprende los siguientes pasos:
-transferencia de la muestra biológica en una cámara,
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los subgrupos se vean afectados de forma diferente por dicho campo eléctrico para la electroporación y/o lisis.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el material dieléctrico tiene un espesor inferior a 1 |jm, preferentemente en el intervalo de 50 nm a 650 nm, más preferentemente en el intervalo de 100 nm a 500 nm.
3. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 jm , más preferentemente inferior a 100 jm o incluso inferior a 50 jm , pero superior a 5 jm , y/o la intensidad del campo eléctrico está en el intervalo de 500 V/cm a kV/cm, preferentemente 1 kV/cm a 10 kV/cm, más preferentemente 2 kV/cm a 5 kV/cm.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, en el que la diferencia de potencial entre los electrodos está en el intervalo de 1 V a 100 V, preferentemente en el intervalo de 5 V a 80 V o incluso de 7 V a 70 V, más preferentemente en el intervalo de 10 V a 45 V o incluso 15 V a 35 V.
5. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el campo eléctrico es un campo periódico con una frecuencia en el intervalo de 0,1 Hz a 10 kHz, preferentemente en el intervalo de 10 Hz a 1 kHz o incluso de 50 Hz a 1 kHz, en el que la forma de onda del campo eléctrico es preferentemente una onda cuadrada, una onda sinusoidal o al menos un impulso por período.
6. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra se filtra para concentrar cuerpos celulares de un subgrupo después de la lisis y/o electroporación.
7. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que, tras la lisis de un subgrupo, se recogen orgánulos, proteínas y/o biomoléculas de dicho subgrupo lisado, preferentemente materiales genéticos como ADN o ARN.
8. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que antes de exponer la muestra biológica al campo eléctrico, se realiza una reducción de la conductividad eléctrica de la muestra por debajo de 1 mS/cm, preferentemente en el intervalo de 10 pS/cm a 800 pS/cm o 60 pS/cm a 560 pS/cm, mediante dilución, tampón o intercambio iónico, se realiza difusión transversal, filtración o separación electroforética.
9. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en el que para la lisis específica de eritrocitos y para el aislamiento de leucocitos, el campo eléctrico tiene una intensidad de campo de al menos 2,2 kV/cm, preferentemente de al menos 2,5 kV/cm, más preferentemente 3,0 kV/cm, pero no más de 6 kV/cm o incluso no más de 4,5 kV/cm.
10. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, en el que para la lisis específica de leucocitos y para el aislamiento de células madre hematopoyéticas, el campo eléctrico tiene una intensidad de campo de al menos esencialmente 3,0 kV/cm, preferentemente de al menos 4,5 kV/cm.
11. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, en el que, para la lisis específica de células cancerosas y el aislamiento de células no cancerosas, preferentemente para la lisis específica de leucocitos cancerosos o células tumorales circulantes, preferentemente células de cáncer de mama, y el aislamiento de leucocitos sanos, el campo eléctrico tiene una intensidad de campo de al menos 1,8 kV/cm, preferentemente 2,4 kV/cm.
12. Dispositivo, preferentemente portátil, adecuado para la electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas en una muestra biológica, que comprende al menos una cámara para recibir la muestra biológica y al menos dos electrodos para generar un campo eléctrico en la cámara, cuyos electrodos están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad mayor que 1, preferentemente mayor que 3,9, más preferentemente 60 o más, en donde la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 jm , más preferentemente inferior a 100 jm , pero mayor de 5 jm , en el que el dispositivo comprende además una unidad de ajuste que permite el ajuste de parámetros eléctricos del campo eléctrico tales como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda.
13. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la cámara forma una parte de una pipeta de desplazamiento de aire, particularmente una parte de una punta de dicha pipeta, en la que la pipeta tiene medios de succión y presión para crear una presión reducida dentro de la pipeta tal que la muestra biológica se transfiere a la pipeta.
14. Procedimiento de electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares en una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
- accionar un pistón de una pipeta de desplazamiento neumático de forma que la muestra biológica se transfiera a una cámara situada dentro de una punta de la pipeta
- exponer la muestra biológica a un campo eléctrico en la cámara, en donde el campo eléctrico es generado por al menos dos electrodos que están recubiertos con un material dieléctrico con una permitividad relativa superior a 3,9, preferentemente superior a 9, más preferentemente 60 o más, en donde la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm, pero superior a 5 pm y
- elegir los parámetros eléctricos del campo eléctrico, tal como la intensidad del campo, la frecuencia o la forma de onda, de modo que los cuerpos celulares sean lisados y/o electroporados.
15. Procedimiento para fabricar un dispositivo, preferentemente portátil, en particular una pipeta de desplazamiento de aire, para electroporación dirigida y/o lisis de cuerpos celulares eucariotas, en el que al menos dos electrodos están recubiertos con una capa de material dieléctrico con una permitividad superior a 1, preferentemente superior a 39, más preferentemente 60 o más, en el que los electrodos están dispuestos de tal manera que la distancia entre los electrodos es inferior a 1 mm, preferentemente inferior a 550 pm, más preferentemente inferior a 100 pm, pero superior a 5 pm, en el que el dispositivo comprende además una unidad de ajuste que permite el ajuste de parámetros eléctricos del campo eléctrico tales como la intensidad de campo, la frecuencia o la forma de onda.
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