BR112021007913A2 - dispositivos, sistemas e kits para eletroporação e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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BR112021007913A2
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BR
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electrode
electroporation
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electroporation zone
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BR112021007913-0A
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Paulo Garcia
Rameech MCCORMACK
Jessica SIDO
James Hemphill
Harrison BRALOWER
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Kytopen Corporation
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Abstract

DISPOSITIVOS, SISTEMAS E KITS PARA ELETROPORAÇÃO E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a dispositivos, sistemas e kits para eletroporação de célula. Um dispositivo inclui um primeiro ele-trodo, um segundo eletrodo e uma zona de eletroporação entre os mesmos, onde uma diferença de potencial elétrico aplicada ao primeiro e ao segundo eletrodos gera um campo elétrico na zona de eletro-poração suficiente para eletroporar pelo menos um subconjunto das células no caminho de fluxo. A presente invenção também se refere a métodos para introduzir uma composição em pelo menos uma porção de uma pluralidade de células usando os dispositivos, sistemas e kits da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPO- SITIVOS, SISTEMAS E KITS PARA ELETROPORAÇÃO E MÉTO- DOS DE USO DOS MESMOS".
DECLARAÇÃO DE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL
[001] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob a Fase I SBIR Grant No. 1747096 e Fase II SBIR Grant. No 1853194 da Natio- nal Science Foundation (NSF). O governo tem certos direitos sobre a invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A imunoterapia está atualmente na vanguarda tanto da pesquisa científica básica quanto da aplicação clínica conduzida por produtos farmacêuticos. Essa tendência se deve em parte aos avan- ços recentes na modificação de genes direcionados e ao uso expandi- do da edição do complexo CRISPR / Cas para o desenvolvimento te- rapêutico. A fim de identificar modificações genéticas de interesse te- rapêutico, as organizações de pesquisa geralmente precisam exami- nar milhares de variantes genéticas, que podem incluir a modificação de um gene endógeno ou a inserção de um gene modificado. Este processo de descoberta de drogas é trabalhoso, exigindo muito traba- lho manual dentro do laboratório, criando um gargalo em toda a indús- tria devido à falta de tecnologias adequadas de alto rendimento.
[003] As atividades de pesquisa e desenvolvimento em biotecno- logia e farmacêutica passaram a automatizar quase todas as etapas do processo. Os fluxos de trabalho incluem robôs de manipulação de líquidos, acionados por sofisticado software de gerenciamento de labo- ratório, para permitir a descoberta de alto rendimento. No entanto, as etapas de transfecção são limitadas a baixo rendimento, tecnologias de baixa eficiência e sistemas de uso intensivo que não podem ser au- tomatizados. Plataformas automatizadas para transfecção não apenas têm o potencial de reduzir substancialmente os custos do processo, mas também aumentar a viabilidade celular e a quantidade de células modificadas com sucesso, ao mesmo tempo em que reduzem o tempo de descoberta, que é crítico no espaço competitivo da imunoterapia.
[004] Uma força única da eletroporação é a distribuição de RNA. As técnicas virais existentes para distribuir DNA parecem equiparadas à eletroporação, mas faltam vírus de RNA não retrovirais de qualidade GMP. Portanto, empresas com plataformas de eletroporação têm sido alvo de colaborações e aquisições com o objetivo de distribuir mRNA nas células.
[005] Os métodos atuais de transferência de genes de alto ren- dimento normalmente requerem o uso de distribuição viral (por exem- plo, vetores lentivirais), em que as partículas virais infectam uma célula e transduzem a modificação genética de interesse. Embora uma me- todologia viral possa ser aplicada a sistemas automatizados de alto rendimento, há limitações na produção que estendem os prazos para os esforços de pesquisa: os vetores virais devem ser clonados, trans- fectados em uma linha de produção viral e, em seguida, as partículas virais devem ser purificadas. Esse processo pode levar meses para as organizações de pesquisa, afetando significativamente seus crono- gramas para o desenvolvimento da plataforma, ao mesmo tempo que aumenta o custo da descoberta de drogas. Além disso, o uso de transdução viral para transferência de genes não é passível de modifi- cação genética para todos os tipos de células, uma vez que algumas células (como subconjuntos de células imunes específicas) são resis- tentes à infecção viral. Portanto, dentro da indústria de biotecnologia, há uma necessidade não atendida de um sistema automatizado de alto rendimento para transferência de genes que não dependa de me- canismos de distribuição viral.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Um dispositivo para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido (por exemplo, um líquido fluindo através do dispositivo), o dispositivo incluindo um primeiro e segundo eletrodos e uma zona de eletroporação. O primeiro eletrodo inclui uma primeira entrada, uma primeira saída e um primeiro lúmen incluindo uma di- mensão transversal mínima e o segundo eletrodo inclui uma segunda entrada, uma segunda saída e um segundo lúmen incluindo uma di- mensão transversal mínima. A zona de eletroporação está disposta entre a primeira saída e a segunda entrada e tem uma dimensão transversal mínima que é maior que cerca de 100 µm (por exemplo, de 100 µm a 10 mm, de 150 µm a 15 mm, de 200 µm a 10 mm, de 250 µm a 5 mm, de 500 µm a 10 mm, de 1 mm a 10 mm, de 1 mm a 50 mm, de 5 mm a 25 mm, ou de 20 mm a 50 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 5 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm ou cerca de 50 mm), em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme. A primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica.
[007] Em algumas modalidades, uma seção transversal da zona de eletroporação é uma forma selecionada de um grupo que consiste em circular, disco, elíptico, polígono regular, polígono irregular, forma curvilínea, estrela, paralelogramo, trapezoidal e forma irregular (por exemplo, um forma com saliências, por exemplo, fendas ou ranhuras salientes, polígonos irregulares e / ou formas curvilíneas). Em algumas modalidades, a seção transversal da zona de eletroporação varia ao longo do comprimento (isto é, eixo longitudinal ou direção de fluxo) da zona de eletroporação). Em algumas modalidades, a forma é consis- tente ao longo do comprimento, mas varia em posição em relação ao eixo longitudinal central ao longo do comprimento da zona de eletropo- ração (por exemplo, a forma da seção transversal gira em torno do ei-
xo central de uma extremidade da zona de eletroporação para a outra, como uma hélice). Em modalidades particulares, a zona de eletropora- ção tem uma seção transversal substancialmente circular. Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem uma área transversal de entre cerca de 7.850 µm2 e cerca de 2.000 mm2 (por exemplo, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 1 mm2, entre cerca de 8,000 µm2 e cer- ca de 10 mm2, entre cerca de 8,000 µm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 9,000 µm2 e 5 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 3 mm2 e cerca de 20 mm2, entre cerca de 10 mm2 e cerca de 50 mm2, entre cerca de 25 mm2 e cerca de 75 mm2, entre cerca de 50 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 75 mm2 e cerca de 200 mm2, entre cerca de 100 mm2 e cerca de 350 mm2, entre cerca de 150 mm2 e cerca de 500 mm2, entre cerca de 300 mm2 e cerca de 750 mm2, entre cerca de 500 mm2 e cerca de 1,000 mm2, entre cerca de 750 mm2 e cerca de
1.500 mm2, or entre cerca de 950 mm2 e cerca de 2.000 mm2, por exemplo, cerca de 8.000 µm2, cerca de 9,000 µm2, cerca de 1 mm2, cerca de 5 mm2, cerca de 10 mm2, cerca de 15 mm2, cerca de 20 mm2, cerca de 25 mm2, cerca de 50 mm2, cerca de 60 mm2, cerca de 75 mm2, cerca de 80 mm2, cerca de 100 mm2, cerca de 150 mm2, cerca de 200 mm2, cerca de 250 mm2, cerca de 300 mm2, cerca de 350 mm2, cerca de 400 mm2, cerca de 450 mm2, cerca de 500 mm2, cerca de 600 mm2, cerca de 700 mm2, cerca de 800 mm2, cerca de 900 mm2, cerca de 1.000 mm2, cerca de 1.100 mm2, cerca de 1.200 mm2, cerca de 1.300 mm2, cerca de 1.400 mm2, cerca de 1.500 mm2, cerca de
1.600 mm2, cerca de 1.700 mm2, cerca de 1.800 mm2, cerca de 1.900 mm2, ou cerca de 2.000 mm2).
[008] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,005 mm e 25 mm, entre
0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,1 mm e 50 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 25 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 25 mm, entre 20 mm e 30 mm, entre 25 mm e 40, ou entre 30 mm e 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 20 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm). Em algumas modalida- des, a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 25 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 10 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 10 mm, entre 7 mm e 15 mm, entre 10 mm e 20 mm, ou entre 15 mm e 25 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 12 mm, cerca de 15 mm, cerca de 18 mm, cerca de 20 mm, cerca de 23 mm ou cerca de 25 mm).
[009] Em algumas modalidades, um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo tem uma dimensão trans- versal mínima de entre 0,01 mm e 500 mm (por exemplo, entre 0,01 mm e 0,1 mm, entre 0,01 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 10 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 50 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 30 mm e 300 mm, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, entre 50 mm e 500 mm, entre 75 mm e 150 mm, entre 75 mm e 300 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 100 mm e 500 mm, entre 150 mm e 300 mm, en- tre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cer- ca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm, cerca de 50 mm, cerca de 60 mm, cerca de 70 mm, cerca de 80 mm, cerca de 90 mm, cerca de 100 mm, cerca de 150 mm, cerca de 200 mm, cerca de 250 mm, cerca de 300 mm, cerca de 350 mm, cerca de 400 mm, cerca de 450 mm ou cerca de 500 mm).
[0010] Em algumas modalidades, uma razão da dimensão da se- ção transversal mínima de um lúmen do primeiro ou do segundo ele- trodo para a dimensão da seção transversal mínima da zona de ele- troporação está entre 1:10 e 10: 1 (por exemplo, entre 1: 10 e 1: 5, en- tre 1:10 e 1: 2, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 5: 1, entre 1: 2 e 2: 3, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 6: 1, entre 2: 3 e 2: 1, entre 2: 3 e 4: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 3: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 3: 2 e 3: 1, entre 3: 2 e 6: 1, entre 2: 1 e 3: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 5: 2 e 5: 1, entre 3: 1 e 4: 1, entre 7: 2 e 5: 1, entre 7: 2 e 10: 1, entre 4: 1 e 8: 1, entre 5: 1 e 10: 1, ou entre 7: 1 e 10: 1, por exemplo, cerca de 1:10, cerca de 1: 9, cerca de 1: 8, cerca de 1: 7, cerca de 1: 6, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 2: 3, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 9: 2, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1 ou cerca de 10:1).
[0011] Em algumas modalidades, uma razão da dimensão da se- ção transversal mínima da zona de eletroporação para o comprimento da zona de eletroporação está entre 1:100 e 100:1 (por exemplo, entre 1:100 e 1:50, entre 1:100 e 1:25, entre 1:100 e 1:10, entre 1: 100 e 1:1, entre 1:50 e 1:5, entre 1:50 e 1:2, entre 1:50 e 2:1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1:25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 10: 1, cerca de 20: 1, cerca de 30:1, cerca de 40: 1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1 ou cerca de 100:1).
[0012] Em algumas modalidades de qualquer um dos dispositivos anteriores, uma razão de uma área de seção transversal de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo para a área de seção transversal da zona de eletroporação está entre 1: 100 e 100: 1 (por exemplo, entre 1: 100 e 1:50, entre 1: 100 e 1:25, entre 1: 100 e 1:10, entre 1: 100 e 1: 1, entre 1:50 e 1: 5, entre 1:50 e 1: 2, en- tre 1:50 e 2: 1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1: 25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 2 e 1: 1,
entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 10: 1, cerca de 20: 1, cerca de 30: 1, cerca de 40: 1, cerca de 50: 1, cerca de 60: 1, cerca de 70: 1, cerca de 80: 1, cerca de 90: 1 ou cerca de 100: 1).
[0013] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um primeiro reservatório (por exemplo, um saco de amostra) em comuni- cação fluídica com a primeira entrada e / ou um segundo reservatório (por exemplo, um saco de coleta, por exemplo, um saco de recupera- ção) em comunicação fluídica com a segunda saída. Além disso, o dispositivo pode incluir um terceiro reservatório em comunicação fluí- dica com o primeiro lúmen ou o segundo lúmen. O terceiro reservatório pode conter um ou mais reagentes para transfecção, por exemplo, uma composição genética a ser distribuída às células. Em algumas modalidades, o primeiro eletrodo ou o segundo eletrodo tem uma en- trada ou saída adicional para comunicação fluídica com o terceiro re- servatório.
[0014] Em algumas modalidades, o primeiro eletrodo ou o segun- do eletrodo pode ser poroso ou um fluido condutivo (por exemplo, lí- quido condutivo).
[0015] Um dispositivo de qualquer uma das modalidades anterio- res pode incluir uma fonte de distribuição em comunicação fluídica com a primeira entrada. A fonte de distribuição pode ser configurada para fornecer o líquido e / ou a pluralidade de células em suspensão através do primeiro lúmen para a segunda saída. Uma fonte de distri-
buição também pode ser configurada para distribuir outros componen- tes, como material genético a ser introduzido nas células (por exemplo, como um reservatório de reagente de transfecção).
[0016] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda uma ou mais zonas de eletroporação adicionais (por exemplo, um, dois, três, quatro, seis, oito, dez, 11, 12, 24, 27, 36, 48, 64, 96, 384, 1536, ou mais) zonas de eletroporação adicionais, que podem ser configuradas em paralelo, em série ou uma combinação das mesmas. As uma ou mais zonas de eletroporação adicionais podem ter, cada uma, uma área transversal substancialmente uniforme.
[0017] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalida- des acima mencionadas, o dispositivo pode incluir ainda um alojamen- to configurado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação. O alojamento pode incluir uma primeira en- trada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma se- gunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo. Em algumas modalidades, o alojamento inclui ainda um controlador térmico configurado para aumentar a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o controlador térmico é um elemento de aquecimento selecionado de um grupo que consiste em um bloco de aquecimento, um fluxo de líquido, um aquecedor alimentado por bateria e um aquecedor de filme fino. Em algumas modalidades, o alojamento inclui ainda um controlador térmico configurado para diminuir a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado de um grupo que consiste em um fluxo de líquido, um resfriador evaporativo e um dispositivo Peltier. O alojamento pode ser integrado ou conectado de forma removível ao dispositivo.
[0018] Em outro aspecto, a invenção inclui um dispositivo para ele-
troporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, em que o dispositivo inclui um primeiro eletrodo incluindo uma primeira entra- da, uma primeira saída e um primeiro lúmen incluindo uma dimensão de seção transversal mínima; um segundo eletrodo incluindo uma se- gunda entrada, uma segunda saída e um segundo lúmen incluindo uma dimensão de seção transversal mínima; uma terceira entrada e uma terceira saída, em que a terceira entrada e a terceira saída estão em comunicação fluídica com o primeiro lúmen, em que a terceira en- trada e a terceira saída intersectam o primeiro eletrodo entre a primei- ra entrada e a primeira saída; uma quarta entrada e uma quarta saída, em que a quarta entrada e a quarta saída estão em comunicação fluí- dica com o segundo lúmen, em que a quarta entrada e a quarta saída interceptam o segundo eletrodo entre a segunda entrada e a segunda saída; e uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação inclui uma dimen- são transversal mínima maior que cerca de 100 µm (por exemplo, de 100 µm a 10 mm, de 150 µm a 15 mm, de 200 µm a 10 mm, de 250 µm a 5 mm, de 500 µm a 10 mm, de 1 mm a 10 mm, de 1 mm a 50 mm, de 5 mm a 25 mm, ou de 20 mm a 50 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 5 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm ou cerca de 50 mm), em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme.
A primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica.
A seção transversal da zona de eletroporação é uma forma selecionada de um grupo que consiste em circular, disco, elíptico, polígono regular, polígono irregular, forma curvilínea, estrela, paralelogramo, trapezoidal e forma irregular (por exemplo, um forma com saliências, por exemplo, fendas ou ranhuras salientes, polígonos irregulares e / ou formas curvi- líneas). Em algumas modalidades, a seção transversal da zona de ele-
troporação varia ao longo do comprimento (isto é, eixo longitudinal ou direção de fluxo) da zona de eletroporação). Em algumas modalida- des, a forma é consistente ao longo do comprimento, mas varia em posição em relação ao eixo longitudinal central ao longo do compri- mento da zona de eletroporação (por exemplo, a forma da seção transversal gira em torno do eixo central de uma extremidade da zona de eletroporação para a outra, como uma hélice). Em modalidades particulares, a zona de eletroporação tem uma seção transversal subs- tancialmente circular. Em algumas modalidades, a zona de eletropora- ção tem uma área transversal de entre cerca de 7850 µm2 e cerca de 2000 mm2 (por exemplo, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 1 mm2, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 9.000 µm2 e 5 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 3 mm2 e cerca de 20 mm2, entre cerca de 10 mm2 e cerca de 50 mm2, entre cerca de 25 mm2 e cerca de 75 mm2, entre cerca de 50 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 75 mm2 e cerca de 200 mm2, entre cerca de 100 mm2 e cerca de 350 mm2, entre cerca de 150 mm2 e cerca de 500 mm2, entre cerca de 300 mm2 e cer- ca de 750 mm2, entre cerca de 500 mm2 e cerca de 1,000 mm2, entre cerca de 750 mm2 e cerca de 1,500 mm2, ou entre cerca de 950 mm2 e cerca de 2,000 mm2, por exemplo, cerca de 8.000 µm2, cerca de 9,000 µm2, cerca de 1 mm2, cerca de 5 mm2, cerca de 10 mm2, cerca de 15 mm2, cerca de 20 mm2, cerca de 25 mm2, cerca de 50 mm2, cerca de 60 mm2, cerca de 75 mm2, cerca de 80 mm2, cerca de 100 mm2, cerca de 150 mm2, cerca de 200 mm2, cerca de 250 mm2, cerca de 300 mm2, cerca de 350 mm2, cerca de 400 mm2, cerca de 450 mm2, cerca de 500 mm2, cerca de 600 mm2, cerca de 700 mm2, cerca de 800 mm2, cerca de 900 mm2, cerca de 1.000 mm2, cerca de 1.100 mm2, cerca de
1.200 mm2, cerca de 1.300 mm2, cerca de 1.400 mm2, cerca de 1.500 mm2, cerca de 1.600 mm2, cerca de 1.700 mm2, cerca de 1.800 mm2, cerca de 1.900 mm2, ou cerca de 2.000 mm2).
[0019] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem uma dimensão transversal mínima de entre 0,1 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,1 mm e 0,5 mm, entre 0,1 mm e 1 mm, entre 0,1 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, en- tre 75 mm e 150 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 150 mm e 300 mm, entre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm).
[0020] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,005 mm e 25 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,1 mm e 50 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 25 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 25 mm, entre 20 mm e 30 mm, entre 25 mm e 40, ou entre 30 mm e 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 20 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm). Em algumas modalida- des, a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 25 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 10 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 10 mm, entre 7 mm e 15 mm, entre 10 mm e 20 mm, ou entre 15 mm e 25 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 12 mm, cerca de 15 mm, cerca de 18 mm, cerca de 20 mm, cerca de 23 mm ou cerca de 25 mm).
[0021] Em algumas modalidades, um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo tem uma dimensão trans- versal mínima de entre 0,01 mm e 500 mm (por exemplo, entre 0,01 mm e 0,1 mm, entre 0,01 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 10 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 50 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 30 mm e 300 mm, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, entre 50 mm e 500 mm, entre 75 mm e 150 mm, entre 75 mm e 300 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 100 mm e 500 mm, entre 150 mm e 300 mm, en- tre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm,
cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cer- ca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm, cerca de 50 mm, cerca de 60 mm, cerca de 70 mm, cerca de 80 mm, cerca de 90 mm, cerca de 100 mm, cerca de 150 mm, cerca de 200 mm, cerca de 250 mm, cerca de 300 mm, cerca de 350 mm, cerca de 400 mm, cerca de 450 mm ou cerca de 500 mm). Em algumas modalidades, uma razão da dimensão da seção transversal mínima de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo para a dimensão da seção transver- sal mínima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10: 1 (por exemplo, entre 1:10 e 1: 5, entre 1:10 e 1: 2, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1 : 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 5: 1, entre 1: 2 e 2: 3, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1 : 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 6: 1, entre 2: 3 e 2: 1, entre 2: 3 e 4: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 3: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 3: 2 e 3: 1, entre 3: 2 e 6: 1, entre 2: 1 e 3: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 5: 2 e 5: 1, entre 3: 1 e 4: 1, entre 7: 2 e 5: 1, entre 7: 2 e 10: 1, entre 4: 1 e 8: 1, entre 5: 1 e 10: 1 ou entre 7: 1 e 10: 1, por exemplo, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cer- ca de 1: 2, cerca de 2: 3, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5 : 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 9: 2, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1 ou cerca de 10: 1).
[0022] Em algumas modalidades, uma razão da dimensão da se- ção transversal mínima da zona de eletroporação para o comprimento da zona de eletroporação está entre 1:100 e 100:1 (por exemplo, entre 1:100 e 1:50, entre 1:100 e 1:25, entre 1:100 e 1:10, entre 1: 100 e 1:1, entre 1:50 e 1:5, entre 1:50 e 1:2, entre 1:50 e 2:1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1:25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1:
1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 10: 1, cerca de 20: 1, cerca de 30:1, cerca de 40: 1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1 ou cerca de 100:1). Em algumas modalidades, uma razão de uma área de seção transversal de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo para a área de seção transversal da zona de eletro- poração está entre 1: 100 e 100: 1 (por exemplo, entre 1: 100 e 1:50, entre 1: 100 e 1:25, entre 1: 100 e 1:10, entre 1: 100 e 1: 1, entre 1:50 e 1: 5, entre 1:50 e 1: 2, entre 1:50 e 2: 1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1: 25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 4: 1 e 25: 1, en- tre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 10: 1, cer- ca de 20: 1, cerca de 30: 1, cerca de 40: 1, cerca de 50: 1, cerca de 60: 1, cerca de 70: 1, cerca de 80: 1, cerca de 90: 1 ou cerca de 100: 1). Tanto o primeiro quanto o segundo eletrodo, ou ambos, podem ser porosos ou um fluido condutivo (por exemplo, líquido).
[0023] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um primeiro reservatório em comunicação fluídica com a primeira entrada. Em algumas modalidades, o ainda inclui um segundo reservatório em comunicação fluídica com a segunda saída. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um terceiro reservatório em comunicação flu- ídica com a terceira entrada e a terceira saída. Em algumas modalida- des, o dispositivo inclui ainda um quarto reservatório em comunicação fluídica com a quarta entrada e a quarta saída. Em algumas modalida- des, o dispositivo inclui ainda um quinto reservatório em comunicação fluídica com um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo ou do se- gundo eletrodo, em que qualquer um do primeiro eletrodo ou do se- gundo eletrodo tem pelo menos uma entrada adicional para comunica- ção fluídica com o quinto reservatório. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda uma fonte de distribuição de fluido em comuni- cação fluídica com a primeira entrada, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para distribuir o líquido e / ou a pluralidade de células em suspensão através do primeiro lúmen para a segunda saí- da. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda uma pluralida- de de zonas de eletroporação (por exemplo, dispostas em série, em paralelo ou uma combinação das mesmas). Cada uma da pluralidade de zonas de eletroporação pode ter uma área de seção transversal substancialmente uniforme.
[0024] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um alo- jamento incluindo um alojamento configurado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a pelo menos uma zona de eletropora- ção do dispositivo. O alojamento pode incluir uma primeira entrada elé- trica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo. Em algumas modalidades, o alojamento inclui ainda um controlador térmi- co configurado para aumentar a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o con- trolador térmico é um elemento de aquecimento selecionado de um grupo que consiste em um bloco de aquecimento, um fluxo de líquido, um aquecedor alimentado por bateria e um aquecedor de filme fino. Em algumas modalidades, o alojamento inclui ainda um controlador térmico configurado para diminuir a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado de um grupo que consiste em um fluxo de líquido, um resfriador evaporativo e um dispositivo Peltier. Em algumas modalidades, o alojamento é parte integrante do dispositivo ou conectado de forma removível ao disposi- tivo.
[0025] Em outro aspecto, a invenção inclui um sistema para ele- troporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, em que o sistema inclui qualquer uma das modalidades do dispositivo acima mencionadas.
[0026] Em outro aspecto, a invenção inclui um sistema para ele- troporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, incluin- do um dispositivo de poração de célula e uma fonte de potencial elétri- co. O dispositivo de poração celular inclui um primeiro eletrodo, um segundo eletrodo e uma zona de eletroporação. O primeiro eletrodo inclui uma primeira entrada, uma primeira saída e um primeiro lúmen incluindo uma dimensão transversal mínima; e o segundo eletrodo in- clui uma segunda entrada, uma segunda saída e um segundo lúmen incluindo uma dimensão transversal mínima. A zona de eletroporação está disposta entre a primeira saída e a segunda entrada e tem uma dimensão transversal mínima maior que cerca de 100 µm (por exem- plo, de 100 µm a 10 mm, de 150 µm a 15 mm, de 200 µm a 10 mm, de 250 µm a 5 mm, de 500 µm a 10 mm, de 1 mm a 10 mm, de 1 mm a 50 mm, de 5 mm a 25 mm, ou de 20 mm a 50 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 5 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm ou cerca de 50 mm). A zona de eletroporação tem uma área transversal subs- tancialmente uniforme. A primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica. O sistema inclui ain- da uma fonte de potencial elétrico, em que o primeiro eletrodo e o se- gundo eletrodo do dispositivo estão de forma liberável em contato ope- rativo com a fonte de potencial elétrico. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um primeiro reservatório em comunicação fluí- dica com a primeira entrada e / ou um segundo reservatório em comu- nicação fluídica com a segunda saída.
[0027] Em algumas modalidades do sistema, a seção transversal da zona de eletroporação é uma forma selecionada de um grupo que consiste em circular, disco, elíptico, polígono regular, polígono irregu- lar, forma curvilínea, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular. Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem uma seção trans- versal substancialmente circular. Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem uma dimensão transversal mínima de entre 0,1 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,1 mm e 0,5 mm, entre 0,1 mm e 1 mm, entre 0,1 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, entre 75 mm e 150 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 150 mm e 300 mm, entre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm,
cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm).
[0028] Em algumas modalidades dos sistemas da invenção, a zo- na de eletroporação tem uma área transversal de entre cerca de 7.850 µm2 e cerca de 2.000 mm2 (por exemplo, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 1 mm2, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 9.000 µm2 e 5 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 3 mm2 e cerca de 20 mm2, entre cerca de 10 mm2 e cerca de 50 mm2, entre cerca de 25 mm2 e cerca de 75 mm2, entre cerca de 50 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 75 mm2 e cerca de 200 mm2, entre cerca de 100 mm2 e cerca de 350 mm2, entre cerca de 150 mm2 e cerca de 500 mm2, entre cerca de 300 mm2 e cerca de 750 mm2, entre cerca de 500 mm2 e cerca de 1.000 mm2, entre cerca de 750 mm2 e cerca de 1,500 mm2, ou entre cerca de 950 mm2 e cerca de 2.000 mm2, por exemplo, cerca de 8.000 µm2, cerca de 9.000 µm2, cerca de 1 mm2, cerca de 5 mm2, cerca de 10 mm2, cerca de 15 mm2, cerca de 20 mm2, cerca de 25 mm2, cerca de 50 mm2, cerca de 60 mm2, cerca de 75 mm2, cerca de 80 mm2, cerca de 100 mm2, cerca de 150 mm2, cerca de 200 mm2, cerca de 250 mm2, cerca de 300 mm2, cerca de 350 mm2, cerca de 400 mm2, cerca de 450 mm2, cerca de 500 mm2, cerca de 600 mm2, cerca de 700 mm2, cerca de 800 mm2, cerca de 900 mm2, cerca de 1.000 mm2, cerca de
1.100 mm2, cerca de 1.200 mm2, cerca de 1.300 mm2, cerca de 1.400 mm2, cerca de 1.500 mm2, cerca de 1.600 mm2, cerca de 1.700 mm2, cerca de 1.800 mm2, cerca de 1.900 mm2, ou cerca de 2.000 mm2).
[0029] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,005 mm e 25 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre
0,1 mm e 50 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 25 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 25 mm, entre 20 mm e 30 mm, entre 25 mm e 40, ou entre 30 mm e 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 20 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm). Em algumas modalida- des dos sistemas, o comprimento da zona de eletroporação é entre 0,005 mm e 25 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 10 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 10 mm, entre 7 mm e 15 mm, entre 10 mm e 20 mm, ou entre 15 mm e 25 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 12 mm, cerca de 15 mm, cerca de 18 mm, cerca de 20 mm, cerca de 23 mm ou cerca de 25 mm).
[0030] Em algumas modalidades, um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo tem uma dimensão trans- versal mínima de entre 0,01 mm e 500 mm (por exemplo, entre 0,01 mm e 0,1 mm, entre 0,01 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 10 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 50 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 30 mm e 300 mm, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, entre 50 mm e 500 mm, entre 75 mm e 150 mm, entre 75 mm e 300 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 100 mm e 500 mm, entre 150 mm e 300 mm, en- tre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cer- ca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm, cerca de 50 mm, cerca de 60 mm, cerca de 70 mm, cerca de 80 mm, cerca de 90 mm, cerca de 100 mm, cerca de 150 mm, cerca de 200 mm, cerca de 250 mm, cerca de 300 mm, cerca de 350 mm, cerca de 400 mm, cerca de 450 mm ou cerca de 500 mm).
[0031] Em algumas modalidades dos sistemas da invenção, uma razão da dimensão da seção transversal mínima de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo para a di- mensão da seção transversal mínima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10: 1 (por exemplo, entre 1: 10 e 1: 5, entre 1:10 e 1: 2, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 5: 1, entre 1: 2 e 2: 3, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 6: 1, entre 2: 3 e 2: 1, entre 2: 3 e 4: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 3: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 3: 2 e 3: 1, entre 3: 2 e 6: 1, entre 2: 1 e 3: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 5: 2 e 5: 1, entre 3: 1 e 4: 1, entre 7: 2 e 5: 1, entre 7: 2 e 10: 1, entre 4: 1 e 8: 1, entre 5: 1 e 10: 1, ou entre 7: 1 e 10: 1, por exemplo, cerca de 1:10, cerca de 1: 9, cerca de 1: 8, cerca de 1: 7, cerca de 1: 6, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 2: 3, cerca de 1: 1, cerca de 3:
2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 9: 2, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1 ou cerca de 10:1). Em algumas modalidades, uma ra- zão da dimensão da seção transversal mínima da zona de eletropora- ção para o comprimento da zona de eletroporação está entre 1:100 e 100:1 (por exemplo, entre 1:100 e 1:50, entre 1:100 e 1:25, entre 1:100 e 1:10, entre 1: 100 e 1:1, entre 1:50 e 1:5, entre 1:50 e 1:2, entre 1:50 e 2:1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1:25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 10: 1, cerca de 20: 1, cerca de 30:1, cerca de 40: 1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1 ou cerca de 100:1).
[0032] Em algumas modalidades, uma razão de uma área de se- ção transversal de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo para a área de seção transversal da zona de eletroporação está entre 1: 100 e 100: 1 (por exemplo, entre 1: 100 e 1:50, entre 1: 100 e 1:25, entre 1: 100 e 1:10, entre 1: 100 e 1: 1, entre 1:50 e 1: 5, entre 1:50 e 1: 2, entre 1:50 e 2: 1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1:25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, en- tre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1:10 e 10: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 50: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 10: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1,
entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5 : 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 2: 1 e 50: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 3: 1 e 30: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5 : 1 e 10: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 100: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1, cerca de 10: 1, cerca de 15: 1, cerca de 20: 1, cerca de 25: 1, cerca de 30: 1, cerca de 40: 1, cerca de 50: 1, cerca de 60: 1, cerca de 70: 1, cerca de 80: 1, cerca de 90: 1 ou cerca de 100: 1). Qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo, ou ambos, pode ser poroso ou um fluido condutivo (por exemplo, líqui- do).
[0033] Em algumas modalidades, o sistema inclui um terceiro re- servatório em comunicação fluídica com um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo, em que qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo tem uma entrada adicional para comunicação fluídica com o terceiro reservatório. Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda uma fonte de distribuição de fluido em comunicação fluídica com a primeira entrada, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para distribuir o líquido e / ou a plu- ralidade de células em suspensão através do primeiro lúmen para a segunda saída.
[0034] Em algumas modalidades, o sistema da invenção inclui ainda um controlador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico para fornecer pulsos de voltagem para o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo, em que os pulsos de voltagem geram uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo, produzindo assim um campo elétrico na zona de eletroporação. Em algumas modalidades, o sistema inclui uma pluralidade de zonas de eletroporação (por exemplo, como parte de uma pluralidade de quais- quer modalidades dos dispositivos fornecidos neste documento). Cada uma da pluralidade de zonas de eletroporação pode ter uma área de seção transversal substancialmente uniforme ou não uniforme.
[0035] Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda uma estru- tura externa incluindo um alojamento configurado para envolver o pri- meiro eletrodo, o segundo eletrodo e a pelo menos uma zona de ele- troporação do dispositivo (por exemplo, em que a estrutura externa inclui ainda uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativamente aco- plada ao segundo eletrodo). O alojamento pode incluir um controlador térmico configurado para aumentar a temperatura do dispositivo e / ou do líquido no qual a pluralidade de células está suspensa. O controla- dor térmico pode ser um elemento de aquecimento selecionado de um grupo que consiste em um bloco de aquecimento, um fluxo de líquido, um aquecedor alimentado por bateria e um aquecedor de filme fino. Adicionalmente ou alternativamente, o controlador térmico pode ser configurado para diminuir a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado de um grupo que consiste em um fluxo de líquido, um resfriador evaporativo e um dispo- sitivo Peltier.
[0036] Em algumas modalidades dos sistemas da invenção, a fon- te de potencial elétrico é conectada de forma liberável à primeira e se- gunda entradas elétricas da estrutura externa. A conexão liberável en- tre a primeira ou a segunda entrada elétrica e a fonte de potencial elé- trico pode ser selecionada de um grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma escova de aço, conexão mecâ- nica, conexão indutivaou uma combinação dos mesmos. A estrutura externa pode ser integral ou conectada de forma removível ao disposi- tivo. Em algumas modalidades, um alojamento é configurado para energizar uma pluralidade de dispositivos em paralelo, em série ou deslocamento no tempo, em que o alojamento inclui ainda uma bande- ja que acomoda uma pluralidade de dispositivos de eletroporação, em que a bandeja é modificada com dois eletrodos de grade, em que um primeiro eletrodo de grade é eletricamente isolado de um segundo ele- trodo de grade, em que um exterior do primeiro eletrodo de cada um da pluralidade de dispositivos é liberável em contato operativo com qualquer de um primeiro eletrodo com mola, um primeiro eletrodo co- nectado mecanicamente, ou um primeiro eletrodo conectado indutiva- mente, em que um exterior do segundo eletrodo de cada um da plura- lidade de dispositivos é liberável em contato operativo com qualquer de um segundo eletrodo carregado por mola, um segundo eletrodo co- nectado mecanicamente ou um segundo eletrodo acoplado indutiva- mente, em que cada um da pluralidade de dispositivos entra de forma liberável no alojamento através de uma abertura nos eletrodos de gra- de, em que qualquer do primeiro eletrodo carregado por mola, primeiro eletrodo conectado mecanicamente ou primeiro eletrodo indutivamente conectado de cada dispositivo está em contato operativo com o primei- ro eletrodo de grade e qualquer do segundo eletrodo carregado por mola, segundo eletrodo mecanicamente conectado ou segundo eletro- do indutivamente conectado de cada dispositivo está em contato ope- rativo com o segundo eletrodo de grade, em que os eletrodos de grade estão conectados à fonte de potencial elétrico.
[0037] Em algumas modalidades do sistema, a fonte de potencial elétrico distribui pulsos de voltagem para os eletrodos de grade, em que o primeiro eletrodo de grade é energizado em uma voltagem apli- cada particular, enquanto o segundo eletrodo de grade é energizado a uma voltagem aplicada particular, em que cada um da pluralidade de dispositivos é energizado pelos eletrodos de grade com um pulso de voltagem aplicado idêntico, de modo que uma magnitude de um cam- po elétrico gerado dentro de cada uma das pelo menos uma zona de eletroporação de cada dispositivo seja substancialmente idêntico. Em algumas modalidades, a fonte de potencial elétrico inclui circuitos adi- cionais ou programação configurada para modular a distribuição de pulsos de voltagem para os eletrodos de grade, em que cada um da pluralidade de dispositivos pode receber uma voltagem diferente dos eletrodos de grade, em que um magnitude de um campo elétrico gera- do dentro de cada uma das pelo menos uma zona de eletroporação de cada dispositivo é diferente.
[0038] Em outro aspecto, a invenção fornece um sistema para ele- troporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, incluin- do: um dispositivo de poração de célula, incluindo um primeiro eletrodo incluindo uma primeira entrada, uma primeira saída e um primeiro lú- men; um segundo eletrodo incluindo uma segunda entrada, uma se- gunda saída e um segundo lúmen; uma terceira entrada e uma terceira saída, em que a terceira entrada e a terceira saída estão em comuni- cação fluídica com o primeiro lúmen, em que a terceira entrada e a terceira saída interceptam o primeiro eletrodo entre a primeira entrada e a primeira saída; uma quarta entrada e uma quarta saída, em que a quarta entrada e a quarta saída estão em comunicação fluídica com o segundo lúmen, em que a quarta entrada e a quarta saída interceptam o segundo eletrodo entre a segunda entrada e a segunda saída; e uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,005 mm e 25 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,1 mm e 50 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 25 mm, entre 1 mm e 5 mm, en-
tre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 25 mm, entre 20 mm e 30 mm, entre 25 mm e 40, ou entre 30 mm e 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 20 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm) e d inclui uma dimensão transversal míni- ma maior do que cerca de 100 µm (por exemplo, de 100 µm a 10 mm, de 150 µm a 15 mm, de 200 µm a 10 mm, de 250 µm a 5 mm, de 500 µm a 10 mm, de 1 mm a 10 mm, de 1 mm a 50 mm, de 5 mm a 25 mm, ou de 20 mm a 50 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 5 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm ou cerca de 50 mm), em que uma área de seção transversal da zona de eletroporação é substanci- almente uniforme; e em que uma razão de uma dimensão de seção transversal mínima do primeiro lúmen para a dimensão de seção transversal mínima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10: 1 (por exemplo, entre 1:10 e 1: 5, entre 1: 10 e 1: 2, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 5: 1, entre 1: 2 e 2: 3, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 6: 1, entre 2: 3 e 2: 1, entre 2: 3 e 4: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 3: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 3: 2 e 3: 1, entre 3: 2 e 6: 1, entre 2: 1 e 3: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 5: 2 e 5: 1, entre 3: 1 e 4: 1, entre 7: 2 e 5: 1, entre 7: 2 e 10: 1, entre 4: 1 e 8: 1, entre 5: 1 e 10: 1, ou entre 7: 1 e 10: 1, por exemplo, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 2: 3, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1,
cerca de 9: 2, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1 ou cerca de 10: 1), em que uma razão de uma dimensão da seção transversal mínima do segundo lúmen para a dimensão da seção transversal mínima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10: 1 (por exemplo, entre 1:10 e 1: 5, entre 1:10 e 1: 2, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 5: 1, entre 1: 2 e 2: 3, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 6: 1, entre 2: 3 e 2: 1, entre 2: 3 e 4: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 3: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 3: 2 e 3: 1, entre 3: 2 e 6: 1, entre 2: 1 e 3: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 5: 2 e 5: 1, entre 3: 1 e 4: 1, entre 7: 2 e 5: 1, entre 7: 2 e 10: 1, entre 4: 1 e 8: 1, entre 5: 1 e 10: 1, ou entre 7: 1 e 10: 1, por exemplo, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 2: 3, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 9: 2, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1, ou cerca de t 10: 1), e em que a primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica; e uma fonte de potencial elétrico, em que o primeiro e o segundo ele- trodos do dispositivo são liberáveis em contato operativo com a fonte de potencial elétrico. A seção transversal da zona de eletroporação é uma forma fechada selecionada de um grupo que consiste em circular, disco, elíptico, polígono regular, polígono irregular, forma curvilínea, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular. A zona de eletropora- ção pode ter uma seção transversal substancialmente circular.
[0039] Em algumas modalidades do sistema, a zona de eletropo- ração tem uma dimensão transversal mínima de entre 0,1 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,1 mm e 0,5 mm, entre 0,1 mm e 1 mm, entre 0,1 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e
100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, entre 75 mm e 150 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 150 mm e 300 mm, entre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm).
[0040] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem uma área transversal de entre cerca de 7.850 µm2 e cerca de 2.000 mm2 (por exemplo, entre cerca de 8.000 µm2 e cerca de 1 mm2, entre cerca de 8,000 µm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 8,000 µm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 9,000 µm2 e 5 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 10 mm2, entre cerca de 1 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 3 mm2 e cerca de 20 mm2, entre cerca de 10 mm2 e cerca de 50 mm2, entre cerca de 25 mm2 e cerca de 75 mm2, entre cerca de 50 mm2 e cerca de 100 mm2, entre cerca de 75 mm2 e cerca de 200 mm2, entre cerca de 100 mm2 e cerca de 350 mm2, entre cerca de 150 mm2 e cerca de 500 mm2, entre cerca de 300 mm2 e cerca de 750 mm2, entre cerca de 500 mm2 e cerca de 1,000 mm2, entre cerca de 750 mm2 e cerca de 1.500 mm2, or entre cerca de 950 mm2 e cerca de 2.000 mm2, por exemplo, cerca de 8.000 µm2, cerca de 9,000 µm2, cerca de 1 mm2, cerca de 5 mm2, cerca de 10 mm2, cerca de 15 mm2, cerca de 20 mm2, cerca de 25 mm2, cerca de 50 mm2, cerca de 60 mm2, cerca de 75 mm2, cerca de 80 mm2, cerca de 100 mm2, cerca de 150 mm2, cerca de 200 mm2, cerca de 250 mm2, cerca de 300 mm2, cerca de 350 mm2, cerca de 400 mm2, cerca de 450 mm2, cerca de 500 mm2, cerca de 600 mm2, cerca de 700 mm2, cerca de 800 mm2,
cerca de 900 mm2, cerca de 1.000 mm2, cerca de 1.100 mm2, cerca de
1.200 mm2, cerca de 1.300 mm2, cerca de 1.400 mm2, cerca de 1.500 mm2, cerca de 1.600 mm2, cerca de 1.700 mm2, cerca de 1.800 mm2, cerca de 1.900 mm2, ou cerca de 2.000 mm2).
[0041] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,005 mm e 50 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,005 mm e 25 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,1 mm e 50 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 25 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 25 mm, entre 20 mm e 30 mm, entre 25 mm e 40, ou entre 30 mm e 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 20 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm ou cerca de 50 mm). Em algumas modalida- des dos sistemas da invenção, o comprimento da zona de eletropora- ção é entre 0,005 mm e 25 mm (por exemplo, entre 0,005 mm e 0,05 mm, entre 0,005 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 1 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 10 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 10 mm, entre 7 mm e 15 mm, entre 10 mm e 20 mm, ou entre 15 mm e 25 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 12 mm, cerca de 15 mm, cerca de
18 mm, cerca de 20 mm, cerca de 23 mm ou cerca de 25 mm).
[0042] Em algumas modalidades, um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo tem uma dimensão trans- versal mínima de entre 0,01 mm e 500 mm (por exemplo, entre 0,01 mm e 0,1 mm, entre 0,01 mm e 0,5 mm, entre 0,01 mm e 10 mm, entre 0,05 mm e 5 mm, entre 0,1 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 50 mm, entre 1 mm e 5 mm, entre 1 mm e 10 mm, entre 1 mm e 25 mm, entre 3 mm e 15 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 10 mm e 20 mm, entre 10 mm e 100 mm, entre 15 mm e 30 mm, entre 20 mm e 40 mm, entre 20 mm e 200 mm, entre 30 mm e 50, entre 30 mm e 300 mm, entre 45 mm e 60 mm, entre 50 mm e 100 mm, entre 50 mm e 500 mm, entre 75 mm e 150 mm, entre 75 mm e 300 mm, entre 100 mm e 200 mm, entre 100 mm e 500 mm, entre 150 mm e 300 mm, en- tre 200 mm e 400 mm, entre 300 mm e 450 mm, ou entre 350 mm e 500 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cer- ca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm, cerca de 50 mm, cerca de 60 mm, cerca de 70 mm, cerca de 80 mm, cerca de 90 mm, cerca de 100 mm, cerca de 150 mm, cerca de 200 mm, cerca de 250 mm, cerca de 300 mm, cerca de 350 mm, cerca de 400 mm, cerca de 450 mm ou cerca de 500 mm).
[0043] Em algumas modalidades, uma razão da dimensão da se- ção transversal mínima de um lúmen de qualquer um do primeiro ele- trodo ou do segundo eletrodo para a dimensão da seção transversal mínima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10: 1 (por exemplo, entre 1:10 e 1: 5, entre 1:10 e 1: 2, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1: 5 e 1 : 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1,
entre 1: 5 e 5: 1, entre 1: 2 e 2: 3, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1 : 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 6: 1, entre 2: 3 e 2: 1, entre 2: 3 e 4: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 3: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 3: 2 e 3: 1, entre 3: 2 e 6: 1, entre 2: 1 e 3: 1, entre 2: 1 e 5: 1, entre 5: 2 e 5: 1, entre 3: 1 e 4: 1, entre 7: 2 e 5: 1, entre 7: 2 e 10: 1, entre 4: 1 e 8: 1, entre 5: 1 e 10: 1 ou entre 7: 1 e 10: 1, por exemplo, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 2: 3, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5 : 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 9: 2, cer- ca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1 ou cerca de 10: 1). Em algumas modalidades, uma razão da dimensão da seção transversal mínima da zona de eletroporação para o compri- mento da zona de eletroporação está entre 1:100 e 100:1 (por exem- plo, entre 1: 100 e 1:50, entre 1: 100 e 1:25, entre 1: 100 e 1:10, entre 1: 100 e 1: 1, entre 1:50 e 1: 5, entre 1:50 e 1: 2, entre 1:50 e 2: 1, en- tre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1:25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1:10 e 10: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 50: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 10: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5 : 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 2: 1 e 50: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 3: 1 e 30: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5 : 1 e 10: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 100: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1, cerca de 10: 1, cer- ca de 15: 1, cerca de 20: 1, cerca de 25: 1, cerca de 30: 1, cerca de 40: 1, cerca de 50: 1, cerca de 60: 1, cerca de 70: 1, cerca de 80: 1, cerca de 90: 1 ou cerca de 100:1). Em algumas modalidades, uma ra-
zão de uma área de seção transversal de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e / ou do segundo eletrodo para a área de seção transversal da zona de eletroporação está entre 1: 100 e 100: 1 (por exemplo, entre 1: 100 e 1:50, entre 1: 100 e 1:25, entre 1: 100 e 1:10, entre 1: 100 e 1: 1, entre 1:50 e 1: 5, entre 1:50 e 1: 2, entre 1:50 e 2: 1, entre 1:25 e 1:10, entre 1:25 e 1: 5, entre 1:25 e 1: 1, entre 1:25 e 10: 1, entre 1:10 e 1: 1, entre 1:10 e 2: 1, entre 1:10 e 5: 1, entre 1:10 e 10: 1, entre 1: 5 e 1: 2, entre 1: 5 e 1: 1, entre 1: 5 e 2: 1, entre 1: 5 e 50: 1, entre 1: 2 e 1: 1, entre 1: 2 e 2: 1, entre 1: 2 e 10: 1, entre 1: 1 e 2: 1, entre 1: 1 e 5: 1, entre 1: 1 e 10: 1, entre 1: 1 e 50: 1, entre 1: 1 e 100: 1, entre 2: 1 e 5 : 1, entre 2: 1 e 20: 1, entre 2: 1 e 50: 1, entre 3: 1 e 10: 1, entre 3: 1 e 30: 1, entre 4: 1 e 25: 1, entre 5 : 1 e 10: 1, entre 5: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 50: 1, entre 10: 1 e 100: 1, entre 40: 1 e 80: 1, entre 50: 1 e 100: 1, ou entre 75: 1 e 90: 1, por exemplo, cerca de 1: 100, cerca de 1:75, cerca de 1:50, cerca de 1:25, cerca de 1:10, cerca de 1: 5, cerca de 1: 2, cerca de 1: 1, cerca de 3: 2, cerca de 2: 1, cerca de 5: 2, cerca de 3: 1, cerca de 7: 2, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1, cerca de 10: 1, cer- ca de 15: 1, cerca de 20: 1, cerca de 25: 1, cerca de 30: 1, cerca de 40: 1, cerca de 50: 1, cerca de 60: 1, cerca de 70: 1, cerca de 80: 1, cerca de 90: 1 ou cerca de 100: 1).
[0044] Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda um primei- ro reservatório em comunicação fluídica com a primeira entrada, um segundo reservatório em comunicação fluídica com a segunda saída, um terceiro reservatório em comunicação fluídica com a terceira entra- da e a terceira saída, um quarto reservatório em comunicação fluídica com a quarta entrada e a quarta saída e / ou um quinto reservatório em comunicação fluídica com um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo, por exemplo, em que qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo tem pelo menos uma entrada adicional para comunicação fluídica com o quinto reservatório. Em al- gumas modalidades, o sistema inclui ainda uma fonte de distribuição de fluido em comunicação fluídica com a primeira entrada, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para distribuir o líquido e / ou a pluralidade de células em suspensão através do primeiro lúmen para a segunda saída. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda uma pluralidade de zonas de eletroporação, por exemplo, em que cada uma da pluralidade de zonas de eletroporação tem uma área transversal substancialmente uniforme ou não uniforme.
[0045] O sistema pode incluir adicionalmente um controlador ope- rativamente acoplado à fonte de potencial elétrico para fornecer pulsos de voltagem ao primeiro e segundo eletrodos para gerar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos, produzin- do assim um campo elétrico na zona de eletroporação.
[0046] Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda uma estru- tura externa incluindo um alojamento configurado para envolver o pri- meiro eletrodo, o segundo eletrodo e a pelo menos uma zona de ele- troporação do dispositivo. O sistema pode incluir ainda uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletro- do. O alojamento pode incluir ainda um controlador térmico configura- do para aumentar a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o controlador tér- mico é um elemento de aquecimento selecionado de um grupo que consiste em um bloco de aquecimento, um fluxo de líquido, um aque- cedor alimentado por bateria e um aquecedor de filme fino. Adicional- mente ou alternativamente, o alojamento pode ainda incluir um contro- lador térmico configurado para diminuir a temperatura do dispositivo e / ou do líquido em que a pluralidade de células está suspensa, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado de um grupo que consiste em um fluxo de líquido, um resfriador evaporativo e um dispositivo Peltier. Em algumas modalidades, a fonte de potencial elétrico é conectada de forma liberável à primeira e segunda entradas elétricas da estrutura externa, por exemplo, em que a conexão liberá- vel entre a primeira ou a segunda entrada elétrica e a fonte de poten- cial elétrico é selecionada de um grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma escova de aço, conexão mecâ- nica, conexão indutivaou uma combinação das mesmas. A estrutura externa e / ou alojamento pode ser integral ou conectada de forma re- movível ao dispositivo.
[0047] Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda uma plura- lidade de dispositivos de poração de células, por exemplo, tendo uma pluralidade de estruturas externas. Em algumas modalidades, um alo- jamento é configurado para energizar uma pluralidade de dispositivos em paralelo, em série ou deslocamento no tempo, em que o alojamen- to inclui ainda uma bandeja que acomoda uma pluralidade de disposi- tivos de eletroporação, em que a bandeja é modificada com dois ele- trodos de grade, em que um primeiro eletrodo de grade é eletricamen- te isolado de um segundo eletrodo de grade, em que um exterior do primeiro eletrodo de cada um da pluralidade de dispositivos é liberável em contato operativo com qualquer de um primeiro eletrodo com mola, um primeiro eletrodo conectado mecanicamente, ou um primeiro ele- trodo conectado indutivamente, em que um exterior do segundo ele- trodo de cada um da pluralidade de dispositivos é liberável em contato operativo com qualquer de um segundo eletrodo carregado por mola, um segundo eletrodo conectado mecanicamente ou um segundo ele- trodo acoplado indutivamente, em que cada um da pluralidade de dis- positivos entra de forma liberável no alojamento através de uma aber- tura nos eletrodos de grade, em que qualquer do primeiro eletrodo car- regado por mola, primeiro eletrodo conectado mecanicamente ou pri-
meiro eletrodo indutivamente conectado de cada dispositivo está em contato operativo com o primeiro eletrodo de grade e qualquer do se- gundo eletrodo carregado por mola, segundo eletrodo mecanicamente conectado ou segundo eletrodo indutivamente conectado de cada dis- positivo está em contato operativo com o segundo eletrodo de grade, em que os eletrodos de grade estão conectados à fonte de potencial elétrico. Em algumas modalidades, a fonte de potencial elétrico distri- bui pulsos de voltagem para os eletrodos de grade, em que o primeiro eletrodo de grade é energizado em uma voltagem aplicada particular, enquanto o segundo eletrodo de grade é energizado a uma voltagem aplicada particular, em que cada um da pluralidade de dispositivos é energizado pelos eletrodos de grade com um pulso de voltagem apli- cado idêntico, de modo que uma magnitude de um campo elétrico ge- rado dentro de cada uma das pelo menos uma zona de eletroporação de cada dispositivo seja substancialmente idêntico. Em algumas mo- dalidades, a fonte de potencial elétrico inclui circuitos adicionais ou programação configurada para modular a distribuição de pulsos de vol- tagem para os eletrodos de grade, em que cada um da pluralidade de dispositivos pode receber uma voltagem diferente dos eletrodos de grade, em que um magnitude de um campo elétrico gerado dentro de cada uma das pelo menos uma zona de eletroporação de cada dispo- sitivo pode ser diferente.
[0048] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de intro- dução de uma composição em uma pluralidade de células suspensas em um líquido que flui usando qualquer um dos dispositivos ou siste- mas da invenção. Em particular, os métodos da invenção incluem for- necer um dispositivo incluindo um primeiro eletrodo incluindo uma pri- meira saída, uma primeira entrada e um primeiro lúmen incluindo uma dimensão de seção transversal mínima; um segundo eletrodo incluindo uma segunda saída, uma segunda entrada e um segundo lúmen inclu-
indo uma dimensão de seção transversal mínima; e uma zona de ele- troporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação inclui uma dimensão transversal mínima maior do que cerca de 100 µm (por exemplo, de 100 µm a 10 mm, de 150 µm a 15 mm, de 200 µm a 10 mm, de 250 µm a 5 mm, de 500 µm a 10 mm, de 1 mm a 10 mm, de 1 mm a 50 mm, de 5 mm a 25 mm, ou de 20 mm a 50 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 5 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm ou cerca de 50 mm), em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme; e em que a primeira saída, a zona de eletroporação e a se- gunda entrada estão em comunicação fluídica; aplicar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos, produzin- do assim um campo elétrico na zona de eletroporação; e passar a plu- ralidade de células e a composição através da zona de eletroporação, intensificando assim a permeabilidade da pluralidade de células e in- troduzindo a composição na pluralidade de células. Em algumas mo- dalidades, a passagem da pluralidade de células inclui aplicar uma pressão positiva acionada por fluido. Em algumas modalidades, ne- nhum do primeiro lúmen, segundo lúmen ou da zona de eletroporação tem uma dimensão de seção transversal mínima que faz uma dimen- são de seção transversal de qualquer da pluralidade de células sus- pensas no líquido ser comprimida temporariamente. A eletroporação pode ser eletroporação substancialmente não térmica reversível, ele- troporação substancialmente não térmica irreversível ou eletroporação substancialmente térmica irreversível. Em algumas modalidades, uma taxa de fluxo de um líquido e / ou a pluralidade de células em suspen- são distribuída a partir de uma fonte de distribuição de fluido do primei- ro lúmen para a zona de eletroporação está entre 0,001 mL / min e
1.000 mL min (por exemplo, entre 0,001 mL / min e 0,05 mL / min, en-
tre 0,001 mL / min e 0,1 mL / min, entre 0,001 mL / min e 1 mL / min, entre 0,05 mL / min e 0,5 mL / min, entre 0,05 mL / min e 5 mL / min, entre 0,1 mL / min e 1 mL / min, entre 0,5 mL / min e 2 mL / min, entre 1 mL / min e 5 mL / min, entre 1 mL / min e 10 mL / min, entre 1 mL / min e 100 mL / min, entre 5 mL / min e 25 mL / min, entre 5 mL / min e 150 mL / min, entre 10 mL / min e 100 mL / min, entre 15 mL / min e 150 mL / min, entre 25 mL / min e 100 mL / min, entre 25 mL / min e 200 mL / min, entre 50 mL / min e 150 mL / min, entre 50 mL / min e 250 mL / min, entre 75 mL / min e 200 mL / min, entre 75 mL / min e 350 mL / min, entre 100 mL / min e 250 mL / min, entre 100 mL / min e 400 mL / min, entre 150 mL / min e 450 m L / min, entre 200 mL / min e 500 mL / min, entre 250 mL / min e 700 mL / min, entre 300 mL / min e
1.000 mL / min, entre 400 mL / min e 750 mL / min, entre 500 mL / min e 1.000 mL / min, ou entre 750 mL / min e 1.000 mL / min, por exem- plo, cerca de 0,001 mL / min, cerca de 0,01 mL / min, cerca de 0,05 mL / min, cerca de 0,1 mL / min, cerca de 0,5 mL / min, cerca de 1 mL / min, cerca de 5 mL / min, cerca de 10 mL / min, cerca de 15 mL / min, cerca de 20 mL / min, cerca de 30 mL / min, cerca de 40 mL / min, cer- ca de 50 mL / min, cerca de 60 mL / min, cerca de 70 mL / min, cerca de 80 mL / min, cerca de 90 mL / min, cerca de 100 mL / min, cerca de 150 mL / min, cerca de 200 mL / min, cerca de 250 mL / min, cerca de 300 mL / min, cerca de 350 mL / min, cerca de 400 mL / min, cerca de 450 mL / min, cerca de 500 mL / min, cerca de 600 mL / min, cerca de 700 mL / min, cerca de 800 mL / min, cerca de 900 mL / min, ou cerca de 1.000 mL / min), em que a fonte de distribuição de fluido é configu- rada para distribuir o líquido e / ou a pluralidade de células em sus- pensão através do primeiro lúmen para a segunda saída.
[0049] Em algumas modalidades, um tempo de residência na zona de eletroporação de qualquer uma da pluralidade de células suspen- sas no líquido está entre 0,5 ms e 50 ms (por exemplo, entre 0,5 ms e
5 ms, entre 1 ms e 10 ms, entre 1 ms e 15 ms, entre 5 ms e 15 ms, entre 10 ms e 20 ms, entre 15 ms e 25 ms, entre 20 ms e 30 ms, entre 25 ms e 35 ms, entre 30 ms e 40 ms, entre 35 ms e 45 ms, ou entre 40 ms e 50 ms, por exemplo, cerca de 0,5 ms, cerca de 0,6 ms, cerca de 0,7 ms, cerca de 0,8 ms, cerca de 0,9 ms, cerca de 1 ms, cerca de 1,5 ms, cerca de 2 ms, cerca de 2,5 ms, cerca de 3 ms, cerca de 3,5 ms, cerca de 4 ms, cerca de 4,5 ms, cerca de 5 ms, cerca de 5,5 ms, cerca de 6 ms, cerca de 6,5 ms, cerca de 7 ms, cerca de 7,5 ms, cerca de 8 ms, cerca de 8,5 ms, cerca de 9 ms, cerca de 9,5 ms, cerca de 10 ms, cerca de 10,5 ms, cerca de 11 ms, cerca de 11,5 ms, cerca de 12 ms, cerca de 12,5 ms, cerca de 13 ms, cerca de 13,5 ms, cerca de 14 ms, cerca de 14,5 ms, cerca de 15 ms, cerca de 20 ms, cerca de 25 ms, cerca de 30 ms, cerca de 35 ms, cerca de 40 ms, cerca de 45 ms ou cerca de 50 ms). Em algumas modalidades, o tempo de residência é de 5-20 ms (por exemplo, de 6-18 ms, 8-15 ms ou 10-14 ms).
[0050] Em algumas modalidades, a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica (por exemplo, de cerca de 0% a cerca de 2,5%, de cerca de 1% a cerca de 5%, de cerca de 1% a cerca de 10%, de cerca de 5% a cerca de 15%, de cerca de 10% a cerca de 20%, de cerca de 15% a cerca de 25%, ou de cerca de 20% a cerca de 25%, por exemplo, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24% ou cerca de 25%) em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da segunda saída do dispositivo (por exemplo, dentro de 48 horas após sair da se- gunda saída, por exemplo, dentro de 24 horas após sair da segunda saída, por exemplo, entre 1 minuto e 24 horas, 5 minutos e 24 horas,
10 minutos e 24 horas, 30 minutos e 24 horas, 1 hora e 24 horas, ou 2 horas e 24 horas após a saída da segunda saída).
[0051] Em algumas modalidades, a pluralidade de células não tem alteração fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da segunda saída do dispositivo (por exemplo, dentro de 48 horas após sair da segunda saída, por exemplo, dentro de 24 horas após sair da segunda saída, por exemplo, entre 1 minuto e 24 horas, 5 minutos e 24 horas, 10 minutos e 24 horas, 30 minutos e 24 horas, 1 hora e 24 horas, ou 2 horas e 24 horas após sair da se- gunda saída).
[0052] Em algumas modalidades, o campo elétrico é produzido por pulsos de voltagem, em que os pulsos de voltagem energizam o pri- meiro eletrodo em uma voltagem específica aplicada, enquanto o se- gundo eletrodo é energizado em uma voltagem específica aplicada, aplicando assim uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos, em que os pulsos de voltagem têm, cada um, uma amplitude entre -3 kV e 3 kV (por exemplo, entre -3 kV e 1 kV, entre -3 kV e -1,5 kV, entre -2 kV e 2 kV, entre -1,5 kV e 1,5 kV, entre - 1,5 kV e 2,5 kV, entre -1 kV e 1 kV, entre -1 kV e 2 kV, entre -0,5 kV e 0,5 kV, entre -0,5 kV e 1,5 kV, entre -0,5 kV e 3 kV, entre -0,01 kV e 2 kV, entre 0 kV e 1 kV, entre 0 kV e 2 kV, entre 0 kV e 3 kV, entre 0,01 kV e 0,1 kV, entre 0,01 kV e 1 kV, entre 0,02 kV e 0,2 kV, entre 0,03 kV e 0,3 kV, entre 0,04 kV e 0,4 kV, entre 0,05 kV e 0,5 kV, entre 0,05 kV e 1,5 kV, entre 0,06 kV e 0,6 kV, entre 0,07 kV e 0,7 kV, entre 0,08 kV e 0,8 kV, entre 0,09 kV e 0,9 kV, entre 0,1 kV e 0,7 kV, entre 0,1 kV e 1 kV, entre 0,1 kV e 2 kV, entre 0,1 kV e 3 kV, entre 0,15 kV e 1,5 kV, entre 0,2 e 0,6 kV, entre 0,2 kV e 2 kV, entre 0,25 kV e 2,5 kV, en- tre 0,3 kV e 3 kV, entre 0,5 kV e 1 kV, entre 0,5 kV e 3 kV, entre 0,6 kV e 1,5 kV, entre 0,7 kV e 1,8 kV, entre 0,8 kV e 2 kV, entre 0,9 kV e 3 kV, entre 1 kV e 2 kV, entre 1,5 kV e 2,5 kV, or entre 2 kV e 3 kV, por exemplo, cerca de -3 kV, cerca de -2,5 kV, cerca de -2 kV, cerca de - 1,5 kV, cerca de -1 kV, cerca de -0,5 kV, cerca de -0,01 kV, cerca de 0 kV, cerca de 0,01 kV, cerca de 0,02 kV, cerca de 0,03 kV, cerca de 0,04 kV, cerca de 0,05 kV, cerca de 0,06 kV, cerca de 0,07 kV, cerca de 0,08 kV, cerca de 0,09 kV, cerca de 0,1 kV, cerca de 0,2 kV, cerca de 0,3 kV, cerca de 0,4 kV, cerca de 0,5 kV, cerca de 0,6 kV, cerca de 0,7 kV, cerca de 0,8 kV, cerca de 0,9 kV, cerca de 1 kV, cerca de 1,1 kV, cerca de 1,2 kV, cerca de 1,3 kV, cerca de 1,4 kV, cerca de 1,5 kV, cerca de 1,6 kV, cerca de 1,7 kV, cerca de 1,8 kV, cerca de 1,9 kV, cerca de 2 kV, cerca de 2,1 kV, cerca de 2,2 kV, cerca de 2,3 kV, cer- ca de 2,4 kV, cerca de 2,5 kV, cerca de 2,6 kV, cerca de 2,7 kV, cerca de 2,8 kV, cerca de 2,9 kV, ou cerca de 3 kV). Em algumas modalida- des, o primeiro eletrodo é energizado em uma voltagem aplicada parti- cular, enquanto o segundo eletrodo é mantido no solo (por exemplo, 0 kV), aplicando assim uma diferença de potencial elétrico entre o pri- meiro e o segundo eletrodos.
Em algumas modalidades, os pulsos de voltagem têm uma duração entre 0,01 ms e 1.000 ms (por exemplo, entre 0,01 ms e 0,1 ms, entre 0,01 ms e 1 ms, entre 0,01 ms e 10 ms, entre 0,05 ms e 0,5 ms, entre 0,05 ms e 1 ms, entre 0,1 ms e 1 ms, entre 0,1 ms e 5 ms, entre 0,1 ms e 500 ms, entre 0,5 ms e 2 ms, entre 1 ms e 5 ms, entre 1 ms e 10 ms, entre 1 ms e 25 ms, entre 1 ms e 100 ms, entre 1 ms e 1.000 ms, entre 5 ms e 25 ms, entre 5 ms e 150 ms, entre 10 ms e 100 ms, entre 15 ms e 150 ms, entre 25 ms e 100 ms, entre 25 ms e 200 ms, entre 50 ms e 150 ms, entre 50 ms e 250 ms, entre 75 ms e 200 ms, entre 75 ms e 350 ms, entre 100 ms e 250 ms, entre 100 ms e 400 ms, entre 150 ms e 450 ms, entre 200 ms e 500 ms, entre 250 ms e 700 ms, entre 300 ms e 1.000 ms, entre 400 ms e 750 ms, entre 500 ms e 1.000 ms, ou entre 750 ms e 1.000 ms, por exemplo, cerca de 0,01 ms, cerca de 0,05 ms, cerca de 0,1 ms, cerca de 0,5 ms, cerca de 1 ms, cerca de 5 ms, cerca de 10 ms, cerca de 15 ms, cerca de 20 ms, cerca de 30 ms, cerca de 40 ms, cerca de 50 ms, cerca de 60 ms, cerca de 70 ms, cerca de 80 ms, cerca de 90 ms, cerca de 100 ms, cerca de 150 ms, cerca de 200 ms, cerca de 250 ms, cerca de 300 ms, cerca de 350 ms, cerca de 400 ms, cerca de 450 ms, cerca de 500 ms, cerca de 600 ms, cerca de 700 ms, cerca de 800 ms, cerca de 900 ms ou cerca de 1.000 ms). Em algumas modalida- des, os pulsos de voltagem são aplicados ao primeiro e segundo ele- trodos a uma frequência entre 1 Hz e 50.000 Hz (por exemplo, entre 1 Hz e 10 Hz, entre 1 Hz e 100 Hz, entre 1 Hz e 1.000 Hz, entre 5 Hz e 20 Hz, entre 5 Hz e 2.000 Hz, entre 10 Hz e 50 Hz, entre 10 Hz e 100 Hz, entre 10 Hz e 1.000 Hz, entre 10 Hz e 10.000 Hz, entre 20 Hz e 50 Hz, entre 20 Hz e 100 Hz, entre 20 Hz e 2.000 Hz, entre 20 Hz e
20.000 Hz, entre 50 Hz e 500 Hz, entre 50 Hz e 1.000 Hz, entre 50 Hz e 50.000 Hz, entre 100 Hz e 200 Hz, entre 100 Hz e 500 Hz, entre 100 Hz e 1.000 Hz, entre 100 Hz e 10.000 Hz, entre 100 Hz e 50.000 Hz, entre 200 Hz e 400 Hz, entre 200 Hz e 750 Hz, entre 200 Hz e 2.000 Hz, entre 500 Hz e 1.000 Hz, entre 750 Hz e 1.500 Hz, entre 750 Hz e
10.000 Hz, entre 1.000 Hz e 2.000 Hz, entre 1.000 Hz e 5.000 Hz, en- tre 1.000 Hz e 10.000 Hz, entre 1.000 Hz e 50.000 H z, entre 5.000 Hz e 10.000 Hz, entre 5.000 Hz e 20.000 Hz, entre 5.000 Hz e 50.000 Hz, entre 10.000 Hz e 15.000 Hz, entre 10.000 Hz e 25.000 Hz, entre
10.000 Hz e 50.000 Hz, entre 20.000 Hz e 30.000 Hz, ou entre 20.000 e 50.000 Hz, por exemplo, cerca de 1 Hz, cerca de 5 Hz, cerca de 10 Hz, cerca de 20 Hz, cerca de 50 Hz, cerca de 75 Hz, cerca de 100 Hz, cerca de 150 Hz, cerca de 200 Hz, cerca de 300 Hz, cerca de 400 Hz, cerca de 500 Hz, cerca de 600 Hz, cerca de 700 Hz, cerca de 800 Hz, cerca de 900 Hz, cerca de 1.000 Hz, cerca de 2.000 Hz, cerca de
5.000 Hz, cerca de 10.000 Hz, cerca de 15.000 Hz, cerca de 20.000 Hz, cerca de 30.000 Hz, cerca de 40.000 Hz ou cerca de 50.000 Hz).
[0053] Em algumas modalidades, uma forma de onda do pulso de voltagem é selecionada de um grupo que consiste em DC, quadrado, pulso, bipolar, seno, rampa, bipolar assimétrico, arbitrário e qualquer superposição ou combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude entre 1 V / cm e 50.000 V / cm (por exemplo, entre 1 V / cm e 50 V / cm, entre 1 V / cm e 500 V / cm, entre 1 V / cm e 1.000 V / cm, entre 1 V / cm e 20.000 V / cm, entre 5 V / cm e 10.000 V / cm, entre 25 V / cm e 200 V / cm, entre 50 V / cm e 250 V / cm, entre 50 V / cm e 500 V / cm, entre 50 V / cm e 15.000 V / cm, entre 100 V / cm e 1.000 V / cm, entre 300 V / cm e 500 V / cm, entre 500 V / cm e 10.000 V / cm, entre 1000 V / cm e 25.000 V / cm, entre 5.000 V / cm e 25.000 V / cm, entre 10.000 V / cm e 20.000 V / cm, entre 10.000 V / cm e 50.000 V / cm, por exemplo, cerca de 1 V / cm, cerca de 2 V / cm, cerca de 3 V / cm, cerca de 4 V / cm, cerca de 5 V / cm, cerca de 6 V / cm, cerca de 7 V / cm, cerca de 8 V / cm, cerca de 9 V / cm, cerca de 10 V / cm, cerca de 20 V / cm, cerca de 30 V / cm, cerca de 40 V / cm, cerca de 50 V / cm, cerca de 60 V / cm, cerca de 70 V / cm, cerca de 80 V / cm, cerca de 90 V / cm, cerca de 100 V / cm, cerca de 150 V / cm, cerca de 200 V / cm, cerca de 250 V / cm, cerca de 300 V / cm, cerca de 350 V / cm, cerca de 400 V / cm, cerca de 450 V / cm, cerca de 500 V / cm, cerca de 550 V / cm, cerca de 600 V / cm, cerca de 650 V / cm, cerca de 700 V / cm, cerca de 750 V / cm, cerca de 800 V / cm, cerca de 900 V / cm, cerca de 1.000 V / cm, cerca de 2.000 V / cm, cerca de 3.000 V / cm, cerca de 4.000 V / cm, cerca de 5.000 V / cm, cerca de 6.000 V / cm, cerca de 7.000 V / cm, cerca de 8.000 V / cm, cerca de 9.000 V / cm, cerca de 10.000 V / cm, cerca de 15.000 V / cm, cerca de 20.000 V / cm, cerca de 25.000 V / cm, cerca de 30.000 V / cm, cerca de
35.000 V / cm, cerca de 40.000 V / cm, cerca de 45.000 V / cm ou cer- ca de 50.000 V / cm).
[0054] Em algumas modalidades, um ciclo de trabalho dos pulsos de voltagem está entre 0,001% e 100% (por exemplo, entre 0,001% e 0,1%, entre 0,001% e 10%, entre 0,01% e 1%, entre 0,01% a 100%, entre 0,1% e 5%, entre 0,1% e 99%, entre 1% e 10%, entre 1% e 97%, entre 2,5% e 20%, entre 5% e 25%, entre 5% e 40%, entre 10 % e 25%, entre 10% e 50%, entre 10% e 95%, entre 15% e 60%, entre 15% e 85%, entre 20% e 40%, entre 30% e 50%, entre 40% e 60%, entre 40% e 75%, entre 50% e 85%, entre 50% e 100%, entre 75% e 100%, ou entre 90% e 100%, por exemplo, cerca de 0,001%, cerca de 0,002%, cerca de 0,003%, cerca de 0,004%, cerca de 0,005%, cerca de 0,006%, cerca de 0,007%, cerca de 0,008%, cerca de 0,009%, cer- ca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06 %, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45 %, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cer- ca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100%).
[0055] Em algumas modalidades, o líquido tem uma condutividade entre 0,001 mS / cm e 500 mS / cm (por exemplo, entre 0,001 mS / cm e 0,05 mS / cm, entre 0,001 mS / cm e 0,1 mS / cm, entre 0,001 mS / cm e 1 mS / cm, entre 0,05 mS / cm e 0,5 mS / cm, entre 0,05 mS / cm e 5 mS / cm, entre 0,1 mS / cm e 1 mS / cm, entre 0,1 mS / cm e 100 mS / cm, entre 0,5 mS / cm e 2 mS / cm, entre 1 mS / cm e 5 mS / cm, entre 1 mS / cm e 10 mS / cm, entre 1 mS / cm e 100 mS / cm, entre 1 mS / cm e 500 mS / cm, entre 5 mS / cm e 25 mS / cm, entre 5 mS / cm e 150 mS / cm, entre 10 mS / cm e 100 mS / cm, entre 10 mS / cm e 250 mS / cm, entre 15 mS / cm e 150 mS / cm, entre 25 mS / cm e 100 mS / cm, entre 25 mS / cm e 200 mS / cm, entre 50 mS / cm e 150 mS / cm, entre 50 mS / cm e 250 mS / cm, entre 50 mS / cm e 500 mS / cm, entre 75 mS / cm e 200 mS / cm, entre 75 mS / cm e 350 mS / cm, entre 100 mS / cm e 250 mS / cm, entre 100 mS / cm e 400 mS / cm, entre 100 mS / cm e 500 mS / cm, entre 150 mS / cm e 450 mS / cm, entre 200 mS / cm e 500 mS / cm, entre 300 mS / cm e 500 mS / cm, por exemplo, cerca de 0,001 mS / cm, cerca de 0,01 mS / cm, cer- ca de 0,05 mS / cm, cerca de 0,1 mS / cm, cerca de 0,5 mS / cm, cer- ca de 1 mS / cm, cerca de 5 mS / cm, cerca de 10 mS / cm, cerca de 15 mS / cm, cerca de 20 mS / cm, cerca de 30 mS / cm, cerca de 40 mS / cm, cerca de 50 mS / cm, cerca de 60 mS / cm, cerca de 70 mS / cm, cerca de 80 mS / cm, cerca de 90 mS / cm, cerca de 100 mS / cm, cerca de 150 mS / cm, cerca de 200 mS / cm, cerca de 250 mS / cm, cerca de 300 mS / cm, cerca de 350 mS / cm, cerca de 400 mS / cm, cerca de 450 mS / cm ou cerca de 500 mS / cm).
[0056] Em algumas modalidades, uma temperatura da pluralidade de células suspensas no líquido está entre 0°C e 50°C (entre 0°C e 5°C, entre 2°C e 15°C, entre 3°C e 30°C C, entre 4°C e 10°C, entre 4°C e 25°C, entre 5°C e 30°C, entre 7°C e 35°C, entre 10°C e 25°C, entre 10°C C e 40°C, entre 15°C e 50°C, entre 20°C e 40°C, entre 25 ° e 50°C, ou entre 35°C e 45°C, por exemplo, cerca de 0°C, cerca de 1°C, cerca de 2°C, cerca de 3°C, cerca de 4°C, cerca de 5°C, cerca de 6°C, cerca de 7°C, cerca de 8°C, cerca de 9°C, cerca de 10°C, cerca de 11°C, cerca de 12°C, cerca de 13°C, cerca de 14°C, cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17°C, cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, cerca de 30°C cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de
38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C, cerca de 43°C, cerca de 44°C, cerca de 45°C, cerca de 46°C, cerca de 47°C, cerca de 48°C, cerca de 49°C, ou um cerca de 50°C).
[0057] Em algumas modalidades, o método inclui ainda armazenar a pluralidade de células suspensas no líquido em um tampão de recu- peração após a poração. Em algumas modalidades, as células têm uma viabilidade após a introdução da composição entre 0,1% e 99,9% (por exemplo, entre 0,1% e 5%, entre 1% e 10%, entre 2,5% e 20%, entre 5% e 40 %, entre 10% e 30%, entre 10% e 60%, entre 10% e 90%, entre 25% e 40%, entre 25% e 85%, entre 30% e 50%, entre 30% e 80%, entre 40% e 65%, entre 50% e 75%, entre 50% e 99,9%, entre 60% e 80%, entre 75% e 99,9%, ou entre 85% e 99,9%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75 %, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cer- ca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65 %, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, um cerca de 99% ou cerca de 99,9%).
[0058] Em algumas modalidades, a composição é introduzida em uma pluralidade de células com uma eficiência entre 0,1% e 99,9% (por exemplo, entre 0,1% e 5%, entre 1% e 10%, entre 2,5% e 20%, entre 5 % e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 60%, entre 10% e 90%, entre 25% e 40%, entre 25% e 85%, entre 30% e 50%, entre 30% e 80%, entre 40% e 65%, entre 50% e 75%, entre 50% e 99,9%, entre 60% e 80%, entre 75% e 99,9%, ou entre 85% e 99,9%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cer- ca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cer- ca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 99,9%).
[0059] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos da invenção produz um número de recuperação de células entre 104 célu- las e 1012 células (e.g., entre 104 células e 105 células, entre 104 célu- las e 106 células, entre 104 células e 107 células, entre 5x104 células e 5x105 células, entre 105 células e 106 células, entre 105 células e 107 células, entre 105 células e 1010 células, entre 2.5x105 células e 106 células, entre 5x105 células e 5x106 células, entre 106 células e 107 células, entre 106 células e 108 células, entre 106 células e 1012 célu- las, entre 5x106 células e 5x107 células, entre 107 células e 108 células, entre 107 células e 109 células, entre 107 células e 1012 células, entre 5x107 células e 5x108 células, entre 108 células e 109 células, entre 108 células e 1010 células, entre 108 células e 1012 células, entre 5x108 cé- lulas e 5x109 células, entre 109 células e 1010 células, entre 109 células e 1011 células, entre 1010 células e 1011 células, entre 1010 células e 1012 células, or entre 1011 células e 1012 células, e.g., cerca de 104 cé- lulas, cerca de 2.5x104 células, cerca de 5x104 células, cerca de 105 células, cerca de 2.5x105 células, cerca de 5x105 células, cerca de 106 células, cerca de 2.5x106 células, cerca de 5x106 células, cerca de 107 células, cerca de 2.5x107 células, cerca de 5x107 células, cerca de 108 células, cerca de 2.5x108 células, cerca de 5x108 células, cerca de 109 células, cerca de 2.5x109 células, cerca de 5x109 células, cerca de 1010 células, cerca de 5x1010 células, cerca de 1011 células, ou cerca de 1012 células).
[0060] Em algumas modalidades, o método produz uma taxa de recuperação de células entre 0,1% e 100% (por exemplo, entre 0,1% e 5%, entre 1% e 10%, entre 2,5% e 20%, entre 5% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 60%, entre 10% e 90%, entre 25% e 40%, entre 25% e 85%, entre 30% e 50%, entre 30% e 80%, entre 40 % e 65%, entre 50% e 75%, entre 50% e 100%, entre 60% e 80%, entre 75% e 100%, entre 85% e 100%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8 %, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70 %, cerca de 75%, cer- ca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100%). Em algumas modalidades, o método produz um rendimento de células modificadas vivas (por exemplo, um rendimento de recupera- ção) entre 0,1% e 500% (por exemplo, entre 0,1% e 5%, entre 1% e 10%, entre 2,5% e 20%, entre 5% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 60%, entre 10% e 90%, entre 25% e 40%, entre 25% e 85%, entre 30% e 50%, entre 30% e 80%, entre 40% e 65%, entre 50% e 75%, entre 50% e 100%, entre 60% e 80%, entre 60% e 150%, entre 75% e 100%, entre 75 % e 200%, entre 85% e 150%, entre 90% e 250%, en- tre 100% e 200%, entre 100% e 400%, entre 150% e 300%, entre
200% e 500%, ou entre 300 % e 500%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cer- ca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 210%, cerca de 220%, cerca de 230%, cerca de 240%, cerca de 250%, cerca de 260%, cerca de 270%, cerca de 280%, cerca de 290%, cerca de 300%, cerca de 310%, cerca de 320%, cerca de 330%, cerca de 340%, cerca de 350%, cerca de 360%, cerca de 370 %, cerca de 380%, cerca de 390%, cerca de 400%, cerca de 410%, cerca de 420%, cerca de 430%, cerca de 440%, cerca de 450%, cerca de 460%, cerca de 470%, cerca de 480%, cerca de 490%, ou cerca de 500%).
[0061] Em algumas modalidades, a composição inclui pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em agentes terapêu- ticos, vitaminas, nanopartículas, moléculas carregadas, moléculas não carregadas, nucleases modificadas, DNA, RNA, complexo CRISPR- Cas, nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TA- LENs), nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases homing, me- ganucleases (mns), megaTALs, enzimas, transposons, peptídeos, pro- teínas, vírus, polímeros, uma ribonucleoproteína (RNP) e polissacarí- deos. Em algumas modalidades, a composição tem uma concentração no líquido entre 0,0001 µg / mL e 1.000 µg / mL (por exemplo, de cerca de 0,0001 µg / mL a cerca de 0,001 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL a cerca de 0,01 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL a cerca de 5 µg / mL, cerca de 0,005 µg / mL a cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL a cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL a cerca de 1 µg / mL, cer- ca de 0,1 µg / mL a cerca de 1 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL a cerca de 5 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 10 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 2,5 µg / mL a cerca de 15 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 25 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 7,5 µg / mL a cerca de 75 µg / mL, cerca de 10 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 10 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 250 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 250 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 750 µg / mL, cerca de 100 µg / mL a cerca de 300 µg / mL, cerca de 100 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 200 µg / mL a cerca de 400 µg / mL, cerca de 250 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 350 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 400 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 500 µg / mL a cerca de 750 µg / mL, cerca de 650 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, ou cerca de 800 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, por exemplo, cerca de 0,0001 µg / mL, cerca de 0,0005 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL, cerca de 0,005 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL, cerca de 0,02 µg / mL, cerca de 0,03 µg / mL, cerca de 0,04 µg / mL, cerca de 0,05 µg / mL, cerca de 0,06 µg / mL, cerca de 0,07 µg / mL, cerca de 0,08 µg / mL, cerca de 0,09 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,2 µg / mL, cerca de 0,3 µg / mL, cerca de 0,4 µg / mL, cerca de 0,5 µg / mL, cerca de 0,6 µg / mL, cerca de 0,7 µg / mL, cerca de 0,8 µg / mL, cerca de 0,9 µg / mL, cerca de 1 µg / mL, cerca de 1,5 µg / mL, cerca de 2 µg / mL, cerca de 2,5 µg /
mL, cerca de 3 µg / mL, cerca de 3,5 µg / mL, cerca de 4 µg / mL, cer- ca de 4,5 µg / mL, cerca de 5 µg / mL, cerca de 5,5 µg / mL, cerca de 6 µg / mL, cerca de 6,5 µg / mL, cerca de 7 µg / mL, cerca de 7,5 µg / mL, cerca de 8 µg / mL, cerca de 8,5 µg / mL, cerca de 9 µg / mL, cer- ca de 9,5 µg / mL, cerca de 10 µg / mL, cerca de 15 µg / mL, cerca de 20 µg / mL, cerca de 25 µg / mL, cerca de 30 µg / mL, cerca de 35 µg / mL, cerca de 40 µg / mL, cerca de 45 µg / mL, cerca de 50 µg / mL, cerca de 55 µg / mL, cerca de 60 µg / mL, cerca de 65 µg / mL, cerca de 70 µg / mL, cerca de 75 µg / mL, cerca de 80 µg / mL, cerca de 85 µg / mL, cerca de 90 µg / mL, cerca de 95 µg / mL, cerca de 100 µg / mL, cerca de 200 µg / mL, cerca de 250 µg / mL, cerca de 300 µg / mL, cerca de 350 µg / mL, cerca de 400 µg / mL, cerca de 450 µg / mL, cerca de 500 µg / mL, cerca de 550 µg / mL, cerca de 600 µg / mL, cerca de 650 µg / mL, cerca de 700 µg / mL, cerca de 750 µg / mL, cerca de 800 µg / mL, cerca de 850 µg / mL, cerca de 900 µg / mL, cerca de 950 µg / mL ou cerca de 1.000 µg / mL).
[0062] Em algumas modalidades, a pluralidade de células suspen- sas no líquido inclui células eucarióticas (por exemplo, células animais, por exemplo, células humanas), células procarióticas (por exemplo, células bacterianas), células vegetais e / ou células sintéticas. As célu- las podem ser células primárias (por exemplo, células humanas primá- rias), células de uma linhagem celular (por exemplo, uma linhagem celular humana), células em suspensão, células aderentes, células- tronco, células sanguíneas (por exemplo, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)) e / ou células imunes (por exemplo, glóbu- los brancos (por exemplo, células imunes inatas ou células imunes adaptativas)). Em algumas modalidades, as células (por exemplo, cé- lulas imunes, por exemplo, células T, células B, células assassinas na- turais, macrófagos, monócitos ou células apresentadoras de antígeno) são células não estimuladas, células estimuladas ou células ativadas.
Em algumas modalidades, as células são células imunes adaptativas e / ou células imunes inatas. Em algumas modalidades, a pluralidade de células inclui células apresentadoras de antígeno (APCs), monócitos, células T, células B, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, célu- las NK, células Jurkat, células THP-1, células de rim embrionário hu- mano (HEK- 293), células de ovário de hamster chinês (por exemplo, CHO-K1), células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco mesen- quimais (MSCs) ou células-tronco hematopoiéticas (HSCs). Em algu- mas modalidades, as células podem ser células T humanas primárias, macrófagos humanos primários, monócitos humanos primários, células NK humanas primárias ou células-tronco pluripotentes induzidas por humanos primários (iPSCs). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o método inclui ainda arma- zenar a pluralidade de células suspensas no líquido em um tampão de recuperação após a poração.
[0063] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit incluindo qualquer um dos dispositivos ou sistemas aqui descritos. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um kit para eletroporação de uma pluralidade de células suspensas em um líquido, em que o kit inclui uma pluralidade de dispositivos de poração de célula, cada um da plu- ralidade de dispositivos de poração de célula incluindo: um primeiro eletrodo incluindo um primeiro saída, uma primeira entrada e um pri- meiro lúmen incluindo uma dimensão de seção transversal mínima; um segundo eletrodo incluindo uma segunda saída, uma segunda entrada e um segundo lúmen incluindo uma dimensão de seção transversal mínima; e uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação inclui uma di- mensão transversal mínima maior do que cerca de 100 µm (por exem- plo, de 100 µm a 10 mm, de 150 µm a 15 mm, de 200 µm a 10 mm, de 250 µm a 5 mm, de 500 µm a 10 mm, de 1 mm a 10 mm, de 1 mm a
50 mm, de 5 mm a 25 mm, ou de 20 mm a 50 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 5 mm, cerca de 7 mm, cerca de 10 mm, cerca de 15 mm, cerca de 25 mm ou cerca de 50 mm), em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme, em que a apli- cação de uma diferença de potencial elétrico ao primeiro e ao segundo eletrodos produz um campo elétrico na zona de eletroporação; e uma pluralidade de estruturas externas configuradas para envolver a plura- lidade de dispositivos de poração celular, em que cada uma da plurali- dade de estruturas externas inclui: um alojamento configurado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de eletropo- ração do pelo menos um dispositivo de poração celular ; uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo; e uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletro- do. Em algumas modalidades, a pluralidade de estruturas externas é parte integrante da pluralidade de dispositivos de poração celular. Em algumas modalidades, a pluralidade de estruturas externas é conecta- da de forma removível à pluralidade de dispositivos de poração celular. Em algumas modalidades, o alojamento inclui ainda um controlador térmico configurado para aumentar a temperatura de pelo menos um dispositivo de poração de célula, em que o controlador térmico é um elemento de aquecimento selecionado de um grupo que consiste em um bloco de aquecimento, um fluxo de líquido, um aquecedor alimen- tado por bateria e um aquecedor de filme fino. Em algumas modalida- des, o alojamento inclui ainda um controlador térmico configurado para diminuir a temperatura de pelo menos um dispositivo de poração de célula, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado de um grupo que consiste em um fluxo de líquido, um res- friador evaporativo e um dispositivo Peltier.
[0064] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit para eletropo-
rar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, incluindo: uma pluralidade de dispositivos de poração de célula, cada um da plu- ralidade de dispositivos de poração de célula incluindo um dispositivo das modalidades mencionadas acima; e uma pluralidade de estruturas externas configuradas para envolver a pluralidade de dispositivos de poração celular, em que cada uma da pluralidade de estruturas exter- nas inclui: um alojamento configurado para envolver o primeiro eletro- do, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do pelo menos um dispositivo de poração celular; uma primeira entrada elétrica operati- vamente acoplada ao primeiro eletrodo; e uma segunda entrada elétri- ca operativamente acoplada ao segundo eletrodo. Em algumas moda- lidades, a pluralidade de estruturas externas é parte integrante da plu- ralidade de dispositivos de poração celular. Em algumas modalidades, a pluralidade de estruturas externas é conectada de forma removível à pluralidade de dispositivos de poração celular. Em algumas modalida- des, o alojamento inclui ainda um controlador térmico configurado para aumentar a temperatura do pelo menos um dispositivo de poração de célula, em que o controlador térmico é um elemento de aquecimento selecionado de um grupo que consiste em um bloco de aquecimento, um fluxo de líquido, um aquecedor alimentado por bateria e um aque- cedor de filme fino. Em algumas modalidades, o alojamento inclui ain- da um controlador térmico configurado para diminuir a temperatura do pelo menos um dispositivo de poração de célula, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado de um grupo que consiste em um fluxo de líquido, um resfriador evaporativo e um dispo- sitivo Peltier.
[0065] Em outro aspecto, a invenção fornece um dispositivo para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um fluido, onde o dispositivo inclui: um primeiro eletrodo tendo uma primeira entrada e uma primeira saída, onde um lúmen do primeiro eletrodo define uma zona de entrada; um segundo eletrodo tendo uma segunda entrada e uma segunda saída, onde um lúmen do segundo eletrodo define uma zona de recuperação; e uma zona de eletroporação, onde a zona de eletroporação está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletrodo e à segunda entrada do segundo eletrodo, onde a zona de eletroporação tem uma dimensão de seção transversal substancial- mente uniforme e onde a aplicação de uma diferença de potencial elé- trico ao primeiro e segundo eletrodos produz um campo elétrico na zo- na de eletroporação. No dispositivo, a pluralidade de células suspen- sas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[0066] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um ou mais reservatórios, por exemplo, um primeiro reservatório e um se- gundo reservatório, fluidamente conectado a uma zona, por exemplo, a zona de entrada ou zona de recuperação do dispositivo. Por exem- plo, um primeiro reservatório pode ser conectado de forma fluida à zo- na de entrada e um segundo reservatório pode ser conectado de for- ma fluida à zona de recuperação.
[0067] Em certas modalidades, a seção transversal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em cilíndrico, elip- soidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[0068] Em alguns casos, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recupera- ção está entre 0,01% a 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Por exemplo, a dimensão da seção trans- versal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zo- na de recuperação pode ser cerca de 0,01% a cerca de 1000% da di- mensão da seção transversal da zona de eletroporação, por exemplo, cerca de 0,01% a cerca de 1 %, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 1000%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 25% a cerca de 750%, ou cerca de 50% a cerca de 1000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Alternativamente, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recuperação pode ser de cerca de 100% a cer- ca de 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletro- poração, por exemplo, cerca de 100% a cerca de 1000%, cerca de 500% a cerca de 5.000%, cerca de 1.000% a cerca de 10.000%, cerca de 5.000% a cerca de 25.000%, cerca de 10.000% a cerca de
50.000%, cerca de 25.000% a cerca de 75.000%, ou cerca de
50.000% a cerca de 100.000 % da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[0069] Em algumas modalidades, a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em algu- mas modalidades, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em modalidades particulares, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 25 mm. Em algumas modalidades, a dimensão da seção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 500 mm. Em modalidades particulares, nenhuma zona de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma dimensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido, por exemplo, as células podem passar através do dispositivo sem deformação.
[0070] Em algumas modalidades, a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletroporação. Em algumas modalidades, a pluralidade de células não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação.
[0071] Em outras modalidades, o dispositivo inclui uma estrutura externa com um alojamento configurado para envolver o primeiro ele-
trodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do dispositivo. Em algumas modalidades, a estrutura externa é parte integrante do dispositivo. Em certas modalidades, a estrutura externa é conectada de forma removível ao dispositivo.
[0072] Em outro aspecto, a invenção fornece um dispositivo para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um fluido, onde o dispositivo inclui: um primeiro eletrodo tendo uma primeira entrada e uma primeira saída, onde um lúmen do primeiro eletrodo define uma zona de entrada; um segundo eletrodo tendo uma segunda entrada e uma segunda saída, onde um lúmen do segundo eletrodo define uma zona de recuperação; uma terceira entrada e uma terceira saída, onde a terceira entrada e a terceira saída interceptam o primeiro eletrodo entre a primeira entrada e a primeira saída; uma quarta entrada e uma quarta saída, onde a quarta entrada e a quarta saída interceptam o segundo eletrodo entre a segunda entrada e a segunda saída; e uma zona de eletroporação, onde a zona de eletroporação está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletrodo e à segunda entrada do segundo eletrodo, onde a zona de eletroporação tem uma dimen- são de seção transversal substancialmente uniforme e onde a aplica- ção de uma diferença de potencial elétrico ao primeiro e segundo ele- trodos produz um campo elétrico na zona de eletroporação. No dispo- sitivo, a pluralidade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[0073] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um ou mais reservatórios, por exemplo, um primeiro reservatório e um se- gundo reservatório, fluidamente conectado a uma zona, por exemplo, a zona de entrada ou zona de recuperação de um dispositivo. Por exemplo, um primeiro reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de entrada e um segundo reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de recuperação. Em modalidades particulares, o dispositivo inclui um terceiro reservatório conectado de forma fluida à terceira entrada e à terceira saída e um quarto reservatório conectado de forma fluida à quarta entrada e à quarta saída.
[0074] Em certas modalidades, a seção transversal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em cilíndrico, elip- soidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[0075] Em alguns casos, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recupera- ção está entre 0,01% a 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Por exemplo, a dimensão da seção trans- versal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zo- na de recuperação pode ser cerca de 0,01% a cerca de 1.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação, por exem- plo, cerca de 0,01% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 1.000%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 25% a cerca de 750%, ou cerca de 50% a cerca de 100% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Alternativamente, a di- mensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recuperação pode ser de cerca de 100% a cerca de 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação, por exemplo, cerca de 100% a cerca de 1000%, cerca de 500% a cerca de 5.000%, cerca de 1.000% a cerca de 10.000%, cerca de 5.000% a cerca de 25.000%, cerca de 10.000% a cerca de
50.000%, cerca de 25.000% a cerca de 75.000%, ou cerca de
50.000% a cerca de 100.000 % da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[0076] Em algumas modalidades, a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em algu- mas modalidades, o comprimento da zona de eletroporação está entre
0,005 mm e 50 mm. Em modalidades particulares, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 25 mm. Em algumas modalidades, a dimensão da seção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 500 mm. Em modalidades particulares, nenhuma zona de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma dimensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido, por exemplo, as células podem passar através do dispositivo sem deformação.
[0077] Em modalidades particulares, o primeiro e / ou segundo eletrodos são porosos ou um fluido condutivo (por exemplo, líquido).
[0078] Em algumas modalidades, a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletroporação. Em algumas modalidades, a pluralidade de células não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação.
[0079] Em outras modalidades, o dispositivo inclui uma estrutura externa com um alojamento configurado para envolver o primeiro ele- trodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do dispositivo. Em algumas modalidades, a estrutura externa é parte integrante do dispositivo. Em certas modalidades, a estrutura externa é conectada de forma removível ao dispositivo.
[0080] Em outro aspecto, a invenção fornece um sistema para ele- troporar uma pluralidade de células suspensas em um fluido, o sistema incluindo um dispositivo de poração celular que inclui: um primeiro ele- trodo tendo uma primeira entrada e uma primeira saída, onde um lú- men do primeiro eletrodo define uma zona de entrada; um segundo eletrodo tendo uma segunda entrada e uma segunda saída, onde um lúmen do segundo eletrodo define uma zona de recuperação; e uma zona de eletroporação, onde a zona de eletroporação está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletrodo e à segunda entrada do segundo eletrodo, onde a zona de eletroporação tem uma dimen- são de seção transversal substancialmente uniforme e onde a aplica- ção de uma diferença de potencial elétrico ao primeiro e segundo ele- trodos produz um campo elétrico na zona de eletroporação. O sistema inclui ainda fonte de potencial elétrico, onde o primeiro e o segundo eletrodos do dispositivo são conectados de forma liberável à fonte de potencial elétrico. No sistema, a pluralidade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[0081] Em algumas modalidades, 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo ce- lular ao sair da zona de eletroporação. Em algumas modalidades, a pluralidade de células não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação.
[0082] Em outras modalidades, o dispositivo inclui uma estrutura externa com um alojamento configurado para envolver o primeiro ele- trodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do dispositivo. Em algumas modalidades, a estrutura externa inclui uma primeira en- trada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma se- gunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo. Em algumas modalidades, a conexão liberável entre a primeira ou a segunda entrada elétrica e a fonte de potencial elétrico é selecionada do grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bai- nha, uma escova de aço, conexão mecânica, conexão indutiva ou uma combinação dos mesmos.
[0083] Em algumas modalidades, a estrutura externa é parte inte- grante do dispositivo. Em certas modalidades, a estrutura externa é conectada de forma removível ao dispositivo.
[0084] Em alguns casos, o sistema induz eletroporação reversível ou irreversível. Em modalidades particulares, a eletroporação é eletro-
poração substancialmente não térmica reversível, eletroporação subs- tancialmente não térmica irreversível ou eletroporação substancial- mente térmica irreversível.
[0085] Em algumas modalidades, a conexão liberável entre o dis- positivo e a fonte de potencial elétrico é selecionada do grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma esco- va de aço, conexão mecânica, conexão indutiva ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, a conexão liberável entre o dispositivo e a fonte de potencial elétrico é uma mola.
[0086] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um ou mais reservatórios, por exemplo, um primeiro reservatório e um se- gundo reservatório, fluidamente conectado a uma zona, por exemplo, a zona de entrada ou zona de recuperação de um dispositivo. Por exemplo, um primeiro reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de entrada e um segundo reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de recuperação.
[0087] Em certas modalidades, a seção transversal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em cilíndrico, elip- soidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[0088] Em alguns casos, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recupera- ção está entre 0,01% e 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Por exemplo, a dimensão da seção trans- versal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zo- na de recuperação pode ser cerca de 0,01% a cerca de 1000% da di- mensão da seção transversal da zona de eletroporação, por exemplo, cerca de 0,01% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 1.000%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 25% a cer- ca de 750%, ou cerca de 50% a cerca de 100% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Alternativamente, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recuperação pode ser de cerca de 100% a cer- ca de 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletro- poração, por exemplo, cerca de 100% a cerca de 1000%, cerca de 500% a cerca de 5.000%, cerca de 1.000% a cerca de 10.000%, cerca de 5.000% a cerca de 25.000%, cerca de 10.000% a cerca de
50.000%, cerca de 25.000% a cerca de 75.000%, ou cerca de
50.000% a cerca de 100.000 % da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[0089] Em algumas modalidades, a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em algu- mas modalidades, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em modalidades particulares, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 25 mm. Em algumas modalidades, a dimensão da seção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 500 mm. Em modalidades particulares, nenhuma zona de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma dimensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido, por exemplo, as células podem passar através do dispositivo sem deformação.
[0090] Em outras modalidades, o sistema inclui uma fonte de dis- tribuição de fluido conectada fluidamente à zona de entrada, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para fornecer a pluralidade de células suspensas no fluido através da zona de entrada para a zo- na de recuperação. Em algumas modalidades, a taxa de distribuição da fonte de distribuição de fluido está entre 0,001 mL / min a 1.000 mL / min, por exemplo, 25 mL / min. Em certas modalidades, o tempo de residência de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0,5 ms a 50 ms. Em algumas modalidades, a conduti- vidade do fluido está entre 0,001 mS / cm a 500 mS / cm, por exemplo, 1-20 mS / cm.
[0091] Em outras modalidades, o sistema inclui um controlador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico para fornecer pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo eletrodo para gerar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos. Em algumas modalidades, os pulsos de voltagem têm uma amplitude de -3 kV a 3 kV, por exemplo, 0,01 kV a 3 kV, por exemplo, 0,2-0,6 kV. Em alguns casos, o ciclo de trabalho da eletroporação está entre 0,001% a 100%, por exemplo, 10-95%. Em algumas modalida- des, os pulsos de voltagem têm uma duração de entre 0,01 ms a 1.000 ms, por exemplo, 1-10 ms. Em certas modalidades, os pulsos de vol- tagem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma fre- quência entre 1 Hz a 50.000 Hz, por exemplo, 100-500 Hz. A forma de onda do pulso de voltagem pode ser DC, quadrada, pulso, bipolar, se- noidal, rampa, bipolar assimétrica, arbitrária ou qualquer superposição ou combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude de entre 1 V / cm a 50.000 V / cm, por exemplo, 100-1.000 V / cm.
[0092] Em outras modalidades, o sistema inclui um alojamento (por exemplo, uma estrutura de alojamento) configurado para alojar o dispositivo de eletroporação aqui descrito. Em outros casos, o aloja- mento (por exemplo, estrutura de alojamento) inclui um controlador térmico configurado para aumentar ou diminuir a temperatura do alo- jamento ou qualquer componente do sistema do mesmo. Em algumas modalidades, o controlador térmico é um elemento de aquecimento, por exemplo, um bloco de aquecimento, fluxo de líquido, aquecedor alimentado por bateria ou um aquecedor de filme fino. Em outras mo- dalidades, o controlador térmico é um elemento de resfriamento, por exemplo, fluxo de líquido, resfriador evaporativo ou um termoelétrico, por exemplo, um dispositivo Peltier.
[0093] Em outras modalidades, o sistema inclui uma pluralidade de dispositivos de poração de células, por exemplo, em série ou em para- lelo. Em modalidades particulares, o sistema inclui uma pluralidade de estruturas externas para a pluralidade de dispositivos de poração de células.
[0094] Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um siste- ma para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um flui- do, o sistema incluindo um dispositivo de poração celular que inclui: um primeiro eletrodo tendo uma primeira entrada e uma primeira saí- da, onde um lúmen do primeiro eletrodo define uma zona de entrada; um segundo eletrodo tendo uma segunda entrada e uma segunda saí- da, onde um lúmen do segundo eletrodo define uma zona de recupe- ração; uma terceira entrada e uma terceira saída, onde a terceira en- trada e a terceira saída interceptam o primeiro eletrodo entre a primei- ra entrada e a primeira saída; uma quarta entrada e uma quarta saída, onde a quarta entrada e a quarta saída interceptam o segundo eletro- do entre a segunda entrada e a segunda saída; e uma zona de eletro- poração, onde a zona de eletroporação está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletrodo e à segunda entrada do segundo eletrodo, onde a zona de eletroporação tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme e onde a aplicação de uma di- ferença de potencial elétrico ao primeiro e segundo eletrodos produz um campo elétrico na zona de eletroporação. No dispositivo, a plurali- dade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[0095] Em algumas modalidades, a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletroporação.
Em algumas modalidades, a pluralidade de células não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação.
[0096] Em outras modalidades, o dispositivo inclui uma estrutura externa com um alojamento (por exemplo, uma estrutura de alojamen- to) configurado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do dispositivo. Em algumas modalidades, a estrutura externa inclui uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operati- vamente acoplada ao segundo eletrodo. Em algumas modalidades, a conexão liberável entre a primeira ou a segunda entrada elétrica e a fonte de potencial elétrico é selecionada do grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma escova de aço, cone- xão mecânica, conexão indutiva ou uma combinação dos mesmos.
[0097] Em algumas modalidades, a estrutura externa é parte inte- grante do dispositivo. Em certas modalidades, a estrutura externa é conectada de forma removível ao dispositivo.
[0098] Em alguns casos, o sistema induz eletroporação reversível ou irreversível. Em modalidades particulares, a eletroporação é eletro- poração substancialmente não térmica reversível, eletroporação subs- tancialmente não térmica irreversível ou eletroporação substancial- mente térmica irreversível.
[0099] Em algumas modalidades, a conexão liberável entre o dis- positivo e a fonte de potencial elétrico é selecionada do grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma esco- va de aço, conexão mecânica, conexão indutiva ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, a conexão liberável entre o dispositivo e a fonte de potencial elétrico é uma mola.
[00100] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um ou mais reservatórios, por exemplo, um primeiro reservatório e um se- gundo reservatório, fluidamente conectado a uma zona, por exemplo,
a zona de entrada ou zona de recuperação de um dispositivo. Por exemplo, um primeiro reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de entrada e um segundo reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de recuperação.
[00101] Em certas modalidades, a seção transversal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em cilíndrico, elip- soidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[00102] Em alguns casos, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recupera- ção está entre 0,01% a 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Por exemplo, a dimensão da seção trans- versal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zo- na de recuperação pode ser cerca de 0,01% a cerca de 1000% da di- mensão da seção transversal da zona de eletroporação, por exemplo, cerca de 0,01% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 1.000%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 25% a cer- ca de 750%, ou cerca de 50% a cerca de 100% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Alternativamente, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recuperação pode ser de cerca de 100% a cer- ca de 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletro- poração, por exemplo, cerca de 100% a cerca de 1000%, cerca de 500% a cerca de 5.000%, cerca de 1.000% a cerca de 10.000%, cerca de 5.000% a cerca de 25.000%, cerca de 10.000% a cerca de
50.000%, cerca de 25.000% a cerca de 75.000%, ou cerca de
50.000% a cerca de 100.000 % da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[00103] Em algumas modalidades, a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em algu-
mas modalidades, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em modalidades particulares, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 25 mm. Em algumas modalidades, a dimensão da seção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,01 mm e 500 mm. Em modalidades particulares, nenhuma das zonas de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduzem uma dimen- são de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido, por exemplo, as células podem passar através do dispositivo sem deformação.
[00104] Em outras modalidades, o sistema inclui uma fonte de dis- tribuição de fluido conectada fluidamente à zona de entrada, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para fornecer a pluralidade de células suspensas no fluido através da zona de entrada para a zo- na de recuperação. Em algumas modalidades, a taxa de distribuição da fonte de distribuição de fluido está entre 0,001 mL / min e 1.000 mL / min, por exemplo, 25 mL / min. Em certas modalidades, o tempo de residência de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0,5 ms e 50 ms. Em algumas modalidades, a conduti- vidade do fluido está entre 0,001 mS / cm e 500 mS / cm, por exemplo, entre 1 mS / cm e 20 mS / cm.
[00105] Em outras modalidades, o sistema inclui um controlador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico para fornecer pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo eletrodo para gerar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos. Em algumas modalidades, os pulsos de voltagem têm uma amplitude de -3 kV a 3 kV, por exemplo, 0,01 kV a 3 kV, por exemplo, 0,2-0,6 kV. Em alguns casos, o ciclo de trabalho da eletroporação está entre 0,001% a 100%, por exemplo, 10-95%. Em algumas modalida- des, os pulsos de voltagem têm uma duração de entre 0,01 ms a 1.000 ms, por exemplo, 1-10 ms. Em certas modalidades, os pulsos de vol- tagem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma fre- quência entre 1 Hz a 50.000 Hz, por exemplo, 100-500 Hz. A forma de onda do pulso de voltagem pode ser DC, quadrada, pulso, bipolar, se- noidal, rampa, bipolar assimétrica, arbitrária ou qualquer superposição ou combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude entre 1 V / cm e 50.000 V / cm, por exemplo, entre 100 V / cm e 1.000 V / cm.
[00106] Em outras modalidades, o sistema inclui um alojamento (por exemplo, uma estrutura de alojamento) configurado para alojar o dispositivo de eletroporação aqui descrito. Em outros casos, a estrutu- ra de alojamento inclui um controlador térmico configurado para au- mentar ou diminuir a temperatura da estrutura de alojamento ou qual- quer componente do sistema da mesma. Em algumas modalidades, o controlador térmico é um elemento de aquecimento, por exemplo, um bloco de aquecimento, fluxo de líquido, aquecedor alimentado por ba- teria ou um aquecedor de filme fino. Em outras modalidades, o contro- lador térmico é um elemento de resfriamento, por exemplo, fluxo de líquido, resfriador evaporativo ou um termoelétrico, por exemplo, um dispositivo Peltier.
[00107] Em outras modalidades, o sistema inclui uma pluralidade de dispositivos de poração de células, por exemplo, em série ou em para- lelo. Em modalidades particulares, o sistema inclui uma pluralidade de estruturas externas para a pluralidade de dispositivos de poração de células.
[00108] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de introdu- ção de uma composição em pelo menos uma porção de uma plurali- dade de células suspensas em um fluido, o método incluindo as eta- pas de: a. fornecer um dispositivo incluindo: um primeiro eletrodo ten-
do uma primeira entrada e uma primeira saída, onde um lúmen do primeiro eletrodo define uma zona de entrada; um segundo eletrodo tendo uma segunda entrada e uma segunda saída, onde um lúmen do segundo eletrodo define uma zona de recuperação; e uma zona de eletroporação, em que a zona de eletroporação está fluidamente co- nectada à primeira saída do primeiro eletrodo e à segunda entrada do segundo eletrodo, e onde a aplicação de uma diferença de potencial elétrico para o primeiro e segundo eletrodos produz um campo elétrico na zona de eletroporação; b. energizar o primeiro e o segundo eletro- dos para produzir uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos, produzindo assim um campo elétrico na zona de eletroporação; e c. passar a pluralidade de células suspensas no fluido com a composição através do campo elétrico na zona de eletro- poração do dispositivo. No método, o fluxo da pluralidade de células suspensas em fluido com a composição através do campo elétrico na zona de eletroporação intensifica a permeabilidade temporária da plu- ralidade de células, introduzindo assim a composição em pelo menos uma porção da pluralidade de células.
[00109] Em outras modalidades, o método inclui avaliar a saúde de uma porção da pluralidade de células suspensas no fluido. Em certas modalidades, a avaliação inclui medir a viabilidade da porção da plura- lidade de células suspensas no fluido. Em algumas modalidades, a avaliação inclui medir a eficiência de transfecção da porção da plurali- dade de células suspensas no fluido. Em algumas modalidades, a ava- liação inclui medir a taxa de recuperação de células da porção da plu- ralidade de células suspensas no fluido. Em certas modalidades, a avaliação inclui a análise de citometria de fluxo da expressão do mar- cador de superfície celular.
[00110] Em alguns casos, a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletroporação do dispositivo. Em alguns casos, a pluralidade de células não tem altera- ção fenotípica ao sair da zona de eletroporação do dispositivo.
[00111] Em alguns casos, o método induz eletroporação reversível ou irreversível. Em modalidades particulares, a eletroporação é eletro- poração substancialmente não térmica reversível, eletroporação subs- tancialmente não térmica irreversível ou eletroporação substancial- mente térmica irreversível.
[00112] Em algumas modalidades, as células suspensas no fluido com a composição são passadas através do campo elétrico na zona de eletroporação do dispositivo pela aplicação de uma pressão positi- va, por exemplo, uma bomba, por exemplo, uma bomba de seringa ou bomba peristáltica.
[00113] Em certas modalidades, as células na pluralidade de célu- las na amostra podem ser células de mamíferos, eucariotas, células humanas, células animais, células vegetais, células sintéticas, células primárias, linhagens celulares, células em suspensão, células aderen- tes, células não estimuladas, células estimuladas, células ativadas, células imunes, células-tronco, células sanguíneas, glóbulos verme- lhos, células T, células B, neutrófilos, células dendríticas, células apre- sentadoras de antígenos (APCs), células assassinas naturais (NK), monócitos, macrófagos ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), células renais embrionárias humanas, por exemplo, células HEK-293 ou células de ovário de hamster chinês (CHO). Em modali- dades particulares, a pluralidade de células inclui células Jurkat. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui células T hu- manas primárias. Em modalidades particulares, a pluralidade de célu- las inclui células THP-1. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui macrófagos humanos primários. Em modalidades particu- lares, a pluralidade de células inclui monócitos humanos primários. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui células assas- sinas naturais (NK). Em modalidades particulares, a pluralidade de cé- lulas inclui células de ovário de hamster chinês. Em modalidades parti- culares, a pluralidade de células inclui células renais embrionárias hu- manas. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui células B. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui células T humanas primárias. Em modalidades particulares, a plurali- dade de células inclui monócitos humanos primários. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui macrófagos humanos pri- mários. Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco mesenquimais (MSCs) ou células-tronco hematopoiéticas (HSCs). Em modalidades particulares, a pluralidade de células inclui células-tronco pluripotentes induzidas por humanos primários (iPSCs).
[00114] Em alguns casos, a composição inclui pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em agentes terapêuticos, vitaminas, nanopartículas, agentes terapêuticos carregados, nanopar- tículas, moléculas carregadas, por exemplo, íons em solução, molécu- las não carregadas, ácidos nucleicos, por exemplo, DNA ou RNA, complexos CRISPR-Cas, proteínas, polímeros, ribonucleoproteínas (RNPs), nucleases modificadas, nucleases efetoras semelhantes a ati- vadores de transcrição (TALENs), nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases homing, meganucleases (MNs), megaTALs, enzimas, pep- tídeos, transposons ou polissacarídeos, por exemplo, dextrano, por exemplo, sulfato de dextrano. As composições que podem ser distribu- ídas às células em uma suspensão incluem ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos, mRNA ou DNA), anticorpos (ou um frag- mento de anticorpo, por exemplo, um fragmento biespecífico, um fra- gmento trispecífico, Fab, F(ab')2, ou um fragmento variável de cadeia única (scFv)), aminoácidos, polipeptídeos (por exemplo, peptídeos ou proteínas), células, bactérias, terapia de gene, terapia de modificação de genoma, terapia de modificação de epigenoma, carboidratos, dro- gas químicas, agentes de contraste, partículas magnéticas, grânulos de polímero, nanopartículas de metal, micropartículas de metal, pontos quânticos, antioxidantes, agentes antibióticos, hormônios, nucleoprote- ínas, polissacarídeos, glicoproteínas, lipoproteínas, esteroides, anal- gésicos, anestésicos locais, agentes anti-inflamatórios, agentes anti- microbianos, agentes quimioterápicos, exossomos, externos vesículas de membrana, vacinas, vírus, bacteriófagos, adjuvantes, vitaminas, minerais, organelas e combinações dos mesmos. Em certas modali- dades, a composição é um ácido nucleico (por exemplo, um oligonu- cleotídeo, mRNA ou DNA). Em certas modalidades, a composição é um anticorpo. Em certas modalidades, a composição é um polipeptí- deo (por exemplo, um peptídeo ou uma proteína).
[00115] Em certas modalidades, a composição tem uma concentra- ção no fluido entre 0,0001 µg / mL e 1.000 µg / mL (por exemplo, de cerca de 0,0001 µg / mL a cerca de 0,001 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL a cerca de 0,01 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL a cerca de 5 µg / mL, cerca de 0,005 µg / mL a cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL a cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL a cerca de 1 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL a cerca de 1 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL a cer- ca de 5 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 10 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 2,5 µg / mL a cerca de 15 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 25 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 7,5 µg / mL a cerca de 75 µg / mL, cerca de 10 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 10 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 250 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 100 µg /
mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 250 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 750 µg / mL, cerca de 100 µg / mL a cerca de 300 µg / mL, cerca de 100 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 200 µg / mL a cerca de 400 µg / mL, cerca de 250 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 350 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 400 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 500 µg / mL a cerca de 750 µg / mL, cerca de 650 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, ou cerca de 800 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, por exemplo, cerca de 0,0001 µg / mL, cerca de 0,0005 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL, cerca de 0,005 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL, cerca de 0,02 µg / mL, cerca de 0,03 µg / mL, cerca de 0,04 µg / mL, cerca de 0,05 µg / mL, cerca de 0,06 µg / mL, cerca de 0,07 µg / mL, cerca de 0,08 µg / mL, cerca de 0,09 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,2 µg / mL, cerca de 0,3 µg / mL, cerca de 0,4 µg / mL, cerca de 0,5 µg / mL, cerca de 0,6 µg / mL, cerca de 0,7 µg / mL, cerca de 0,8 µg / mL, cerca de 0,9 µg / mL, cerca de 1 µg / mL, cerca de 1,5 µg / mL, cerca de 2 µg / mL, cerca de 2,5 µg / mL, cerca de 3 µg / mL, cerca de 3,5 µg / mL, cerca de 4 µg / mL, cer- ca de 4,5 µg / mL, cerca de 5 µg / mL, cerca de 5,5 µg / mL, cerca de 6 µg / mL, cerca de 6,5 µg / mL, cerca de 7 µg / mL, cerca de 7,5 µg / mL, cerca de 8 µg / mL, cerca de 8,5 µg / mL, cerca de 9 µg / mL, cer- ca de 9,5 µg / mL, cerca de 10 µg / mL, cerca de 15 µg / mL, cerca de 20 µg / mL, cerca de 25 µg / mL, cerca de 30 µg / mL, cerca de 35 µg / mL, cerca de 40 µg / mL, cerca de 45 µg / mL, cerca de 50 µg / mL, cerca de 55 µg / mL, cerca de 60 µg / mL, cerca de 65 µg / mL, cerca de 70 µg / mL, cerca de 75 µg / mL, cerca de 80 µg / mL, cerca de 85 µg / mL, cerca de 90 µg / mL, cerca de 95 µg / mL, cerca de 100 µg / mL, cerca de 200 µg / mL, cerca de 250 µg / mL, cerca de 300 µg / mL, cerca de 350 µg / mL, cerca de 400 µg / mL, cerca de 450 µg / mL, cerca de 500 µg / mL, cerca de 550 µg / mL, cerca de 600 µg / mL, cerca de 650 µg / mL, cerca de 700 µg / mL, cerca de 750 µg / mL,
cerca de 800 µg / mL, cerca de 850 µg / mL, cerca de 900 µg / mL, cerca de 950 µg / mL ou cerca de 1.000 µg / mL).
[00116] Em algumas modalidades, o dispositivo inclui ainda um ou mais reservatórios, por exemplo, um primeiro reservatório e um se- gundo reservatório, fluidamente conectado a uma zona, por exemplo, a zona de entrada ou zona de recuperação de um dispositivo. Por exemplo, um primeiro reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de entrada e um segundo reservatório pode ser conectado de forma fluida à zona de recuperação.
[00117] Em algumas modalidades, a zona de eletroporação do dis- positivo tem uma dimensão transversal uniforme. Em outras modalida- des, a zona de eletroporação do dispositivo tem uma dimensão trans- versal não uniforme. Em outras modalidades, o dispositivo compreen- de ainda uma pluralidade de zonas de eletroporação, onde cada uma da pluralidade de zonas de eletroporação pode ter uma seção trans- versal uniforme ou uma seção transversal não uniforme. Em certas modalidades, a seção transversal da zona de eletroporação é selecio- nada do grupo que consiste em cilíndrico, elipsoidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[00118] Em alguns casos, a dimensão da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recupera- ção está entre 0,01% a 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação. Por exemplo, a dimensão da seção trans- versal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zo- na de recuperação pode ser cerca de 0,01% a cerca de 100% da di- mensão da seção transversal da zona de eletroporação, por exemplo, cerca de 0,01% a cerca de 1 %, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 25% a cerca de 75%, ou cerca de 50% a cerca de 100% da dimensão da se- ção transversal da zona de eletroporação. Alternativamente, a dimen-
são da seção transversal da zona de entrada ou a dimensão da seção transversal da zona de recuperação pode ser de cerca de 100% a cer- ca de 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletro- poração, por exemplo, cerca de 100% a cerca de 1000%, cerca de 500% a cerca de 5.000%, cerca de 1.000% a cerca de 10.000%, cerca de 5.000% a cerca de 25.000%, cerca de 10.000% a cerca de
50.000%, cerca de 25.000% a cerca de 75.000%, ou cerca de
50.000% a cerca de 100.000 % da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[00119] Em algumas modalidades, a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em algu- mas modalidades, o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm. Em algumas modalidades, o comprimento da zo- na de eletroporação está entre 0,005 mm e 25 mm. Em algumas mo- dalidades, a dimensão da seção transversal de qualquer um do primei- ro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 500 mm. Em modalidades particulares, nenhuma zona de entrada, zona de recupe- ração ou zona de eletroporação reduz uma dimensão de seção trans- versal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido, por exemplo, as células podem passar através do dispositivo sem de- formação.
[00120] Em outras modalidades, o dispositivo inclui uma estrutura externa com um alojamento configurado para envolver o primeiro ele- trodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do dispositivo. Em algumas modalidades, a estrutura externa inclui uma primeira en- trada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo e uma se- gunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo. Em algumas modalidades, a estrutura externa é parte integrante do dispositivo. Em certas modalidades, a estrutura externa é conectada de forma removível ao dispositivo.
[00121] Em algumas modalidades, a taxa de distribuição da fonte de distribuição de fluido está entre 0,001 mL / min a 1.000 mL / min, por exemplo, 20-30 mL / min, por exemplo, 25 mL / min. Em certas modalidades, o tempo de residência de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0,5 ms e 50 ms. Em algumas modalidades, a condutividade do fluido está entre 0,001 mS / cm a 500 mS / cm, por exemplo, 1-20 mS / cm.
[00122] Em outras modalidades, o método inclui um controlador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico para fornecer pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo eletrodo para gerar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos. Em algumas modalidades, os pulsos de voltagem têm uma amplitude de -3 kV a 3 kV, por exemplo, 0,2-0,6 kV. Em alguns casos, o ciclo de trabalho da eletroporação está entre 0,001% e 100%, por exemplo, entre 10% e 95%. Em algumas modalidades, os pulsos de voltagem têm uma duração de entre 0,01 ms e 1.000 ms, por exemplo, entre 1 ms e 10 ms. Em certas modalidades, os pulsos de voltagem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma frequência entre 1 Hz a 50.000 Hz, por exemplo, 100-500 Hz. A forma de onda do pulso de voltagem pode ser DC, quadrada, pulso, bipolar, senoidal, rampa, bipolar assimétrica, arbitrária ou qualquer superposição ou combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, o campo elé- trico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude entre 1 V / cm e 50.000 V / cm, por exemplo, entre 100 V / cm e 1.000 V / cm.
[00123] Em outras modalidades, o método inclui uma estrutura de alojamento configurada para alojar o dispositivo de eletroporação aqui descrito. Em outros casos, a estrutura de alojamento inclui um contro- lador térmico configurado para aumentar ou diminuir a temperatura do alojamento ou qualquer componente do sistema da mesma. Em algu-
mas modalidades, o controlador térmico é um elemento de aquecimen- to, por exemplo, um bloco de aquecimento, fluxo de líquido, aquecedor alimentado por bateria ou um aquecedor de filme fino. Em outras mo- dalidades, o controlador térmico é um elemento de resfriamento, por exemplo, fluxo de líquido, resfriador evaporativo ou um termoelétrico, por exemplo, dispositivo Peltier. Em certas modalidades, a temperatu- ra da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0°C e 50°C.
[00124] Em outras modalidades, o dispositivo inclui uma pluralidade de dispositivos de poração de células, por exemplo, em série ou em paralelo. Em modalidades particulares, o dispositivo inclui uma plurali- dade de estruturas externas para a pluralidade de dispositivos.
[00125] Em alguns casos, o método inclui ainda armazenar a plura- lidade de células suspensas no fluido em um tampão de recuperação após a poração. Em certas modalidades, as células eletroporadas têm uma viabilidade após a introdução da composição entre 0,1% e 99,9%, por exemplo, 25% e 85%. Em outras modalidades, a eficiência da in- trodução da composição nas células está entre 0,1 e 99,9%, por exemplo, entre 25% e 85%. Em certas modalidades, a taxa de recupe- ração celular está entre 0,1% e 100%. Em modalidades particulares, o rendimento de recuperação celular está entre 0,1% e 500%. Em algu- mas modalidades, o número de células recuperadas (por exemplo, cé- lulas vivas) está entre 104 e 1012.
[00126] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit para eletropo- rar uma pluralidade de células suspensas em um fluido, o kit incluindo uma pluralidade de dispositivos de poração celular como aqui descrito, uma pluralidade de estruturas externas como aqui descrito e um tam- pão de transfecção.
[00127] Em algumas modalidades, as estruturas externas são par- tes integrantes da pluralidade de dispositivos de poração celular. Em certas modalidades, as estruturas externas são conectadas de forma removível à pluralidade de dispositivos de poração celular.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00128] Este arquivo de pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desse pedido de patente com desenhos co- loridos serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação do paga- mento da taxa necessária.
[00129] As Figs. 1A-1C são esquemas de uma modalidade de um único dispositivo de eletroporação da invenção. A Fig. 1A mostra um esquema da operação do dispositivo da invenção. A Fig. 1B mostra um esquema dos componentes da invenção. A Fig. 1C mostra uma fotografia da modalidade do dispositivo da invenção mostrado na Fig. 1B.
[00130] As Figs. 2A-2B são exemplos esquemáticos de um aloja- mento para distribuição paralela de energia elétrica para modalidades de dispositivos de eletroporação da invenção. A Fig. 2A mostra uma vista isométrica do alojamento com o conceito de redes elétricas a ser usado para energizar 96 dispositivos de eletroporação da invenção em paralelo. A Fig. 2B mostra uma vista ampliada da interface de um úni- co dispositivo de eletroporação da invenção e o alojamento com gra- des elétricas usando eletrodos carregados por mola para segurar com segurança o primeiro e o segundo eletrodos de cada dispositivo de eletroporação contra as grades elétricas do alojamento.
[00131] As Figs. 3A-3B são gráficos de barras da otimização da ta- xa de fluxo de fluido (mL / min) para a eletroporação de células Jurkat (1x107células/mL) usando dispositivos da invenção. As células em re- cuperação foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 3A mostra a viabilidade de células Jurkat avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 3B mostra a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a expressão de GFP.
[00132] Figs. 4A-4D são ilustrações de simulação de taxa de fluxo ao longo de uma zona ativa de um dispositivo. A Fig. 4A é um modelo 3D que representa uma taxa de fluxo volumétrico líquido de 10 mL por minuto. A Fig. 4C é um modelo 3D que representa uma taxa de fluxo volumétrico líquido de 100 mL por minuto. As Figs. 4B e 4D são mode- los 2D correspondentes às Figs. 4A e 4C, respectivamente.
[00133] As Figs. 5A-5B são gráficos de barras para a otimização do campo elétrico na zona de eletroporação de dispositivos da invenção para a eletroporação de células Jurkat. As células em recuperação fo- ram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 5A mostra a viabilidade de células Jurkat avaliada usando o co- rante de exclusão 7-AAD. A Fig. 5B mostra a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a expressão de GFP.
[00134] As Figs. 6A-6B são gráficos de barras que mostram os efei- tos da temperatura na transfecção de células Jurkat usando os dispo- sitivos da invenção. "RT" nas figuras significa temperatura ambiente. As células em recuperação foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 6A mostra a viabilidade de células Jurkat avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 6B mostra a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a ex- pressão de GFP.
[00135] As Figs. 7A-7D são ilustrações de simulação que mostram distribuições de campo elétrico ao longo de uma zona ativa de um dis- positivo. A Fig. 7A mostra um mapa de distribuição de campo elétrico de um dispositivo com uma voltagem aplicada de 225 V. A Fig. 7B é um modelo 2D em seção transversal longitudinal da Fig. 7A. A Fig. 7C mostra um mapa de distribuição de campo elétrico de um dispositivo com uma voltagem aplicada de 275 V. A Fig. 7D é uma seção trans- versal longitudinal do modelo 2D da Fig. 7C.
[00136] As Figs. 8A-8D são ilustrações de simulação que mostram os efeitos das distribuições de temperatura ao longo de uma zona ati- va de um dispositivo. A Fig. 8A mostra um mapa de distribuição de temperatura do líquido em uma zona ativa do dispositivo no tempo = 0 ms; a Fig. 8B mostra um mapa de distribuição de temperatura do líqui- do em uma zona ativa do dispositivo no tempo = 100 ms; a Fig. 8C mostra um mapa de distribuição de temperatura do líquido em uma zona ativa do dispositivo no tempo = 200 ms; e a Fig. 8D mostra um mapa de distribuição de temperatura do líquido em uma zona ativa do dispositivo no tempo = 300 ms.
[00137] As Figs. 9A-9B são gráficos de barras que mostram a otimi- zação da duração do pulso de voltagem e o número de pulsos para a eletroporação de células Jurkat usando dispositivos da invenção. As células em recuperação foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 8A mostra a viabilidade de células Jur- kat avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 9B mostra a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a ex- pressão de GFP.
[00138] As Figs. 10A-10B são gráficos de barras que mostram a otimização do volume da amostra para a eletroporação de células Jur- kat usando dispositivos da invenção. As células em recuperação foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 10A mostra a viabilidade de células Jurkat avaliada usando o co- rante de exclusão 7-AAD. A Fig. 10B mostra a eficiência de transfec- ção das células Jurkat avaliadas usando a expressão de GFP.
[00139] As Figs. 11A-11B são gráficos de barras que mostram a otimização do diâmetro da zona de eletroporação para a eletroporação de células Jurkat usando dispositivos da invenção. As eletroporações foram realizadas em uma voltagem fixa com taxas de fluxo variáveis para corresponder substancialmente ao tempo de residência total da célula através das diferentes dimensões do canal. As células em recu- peração foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 11A mostra a viabilidade de células Jurkat avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 11B mostra a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a expressão de GFP.
[00140] As Figs. 12A-12L mostram gráficos de barras que mostram o efeito de selecionar formas de onda de pulso de voltagem para a ele- troporação de células Jurkat usando dispositivos da invenção e formas de onda exemplificativas. As células em recuperação foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 12A mostra a viabilidade de células Jurkat avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 12B mostra a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a expressão de GFP. A Fig. 12C mos- tra uma corrente contínua (CC) sempre na forma de onda. A Fig. 12D mostra uma forma de onda quadrada com um ciclo de trabalho de 50% incluindo um deslocamento. A Fig. 12E mostra uma forma de onda de rampa assimétrica de 75%. A Fig. 12F mostra uma forma de onda de pulso com um ciclo de trabalho de 95%. A Fig. 12G mostra uma forma de onda quadrada com um ciclo de trabalho de 75% incluindo um des- locamento. A Fig. 12H mostra uma forma de onda sinusoidal. A Fig. 12I mostra uma forma de onda de rampa assimétrica de 25%. A Fig. 12J mostra uma forma de onda quadrada com um ciclo de trabalho de 25% incluindo um deslocamento. A Fig. 12K mostra uma forma de on-
da quadrada bipolar sem deslocamento. A Fig. 12L mostra uma forma de onda de rampa simétrica.
[00141] As Figs. 13A-13B são gráficos de barras que comparam a eficiência de transfecção e a viabilidade celular resultante para células Jurkat usando um dispositivo da invenção e um instrumento de trans- fecção de células disponível comercialmente. A viabilidade de células Jurkat avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD e a eficiência de transfecção das células Jurkat avaliadas usando a expressão de GFP. A Fig 13A mostra resultados de experiências de transfecção realizadas usando parâmetros publicados para transfecção de células Jurkat (amostra em uma ponta de 100 µL; 3 pulsos / 10 ms / 450 V / cm). A Fig. 13B é uma experiência duplicada da Fig. 13A que mostra a repro- dutibilidade em experiências realizadas usando parâmetros otimizados para os dispositivos da invenção em comparação com parâmetros pu- blicados para a transfecção de células Jurkat. A Fig. 13C mostra um fluxo de trabalho esquemático de uma triagem de biblioteca de ribonu- cleoproteínas Cas9 em arranjo usando uma biblioteca de sgRNA de fita simples em arranjo disponível comercialmente para recozer a pro- teína Cas9 purificada para formar uma biblioteca de ribonucleoproteí- nas Cas9 em arranjo. Usando um dispositivo da invenção, a triagem da biblioteca de ribonucleoproteínas Cas9 em arranjo resultará na identificação de alvos de genes para pesquisas imunoterapêuticas fu- turas usando análise baseada em placa. Além disso, a seleção da bi- blioteca de ribonucleoproteínas Cas9 em arranjo pode ser usada para realizar os ensaios necessários para identificar alvos genéticos para terapias futuras.
[00142] As Figs. 14A-14B são gráficos de barras que mostram a viabilidade e eficiência da distribuição de FITC dextrano em células T humanas primárias usando dispositivos da invenção, usando políme- ros de dextrano de peso molecular variável para avaliar quaisquer res-
trições de tamanho para distribuição de dextrano. As células em recu- peração foram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig 14A mostra a viabilidade de células T humanas pri- márias avaliadas usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 14B mostra a eficiência de transfecção das células T humanas primárias avaliadas usando a expressão de GFP.
[00143] As Figs. 15A-15B são gráficos de barras que comparam a eficiência de transfecção e a viabilidade em monócitos THP-1 usando dispositivos da invenção e um instrumento de transfecção de células comercialmente disponível (NEON®) usando protocolos de transfec- ção publicados para monócitos THP-1. As células em recuperação fo- ram cultivadas por 24 horas em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 15A mostra a viabilidade de monócitos THP-1 avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 15B mostra a eficiência de trans- fecção dos monócitos THP-1 avaliada usando a expressão de GFP.
[00144] As Figs. 16A-16B são gráficos de barras que comparam a eficiência de transfecção e a viabilidade em monócitos humanos pri- mários usando dispositivos da invenção e um instrumento de transfec- ção de células disponível comercialmente usando protocolos de trans- fecção publicados para monócitos humanos primários. Os monócitos humanos primários foram isolados do sangue periférico usando sele- ção negativa. As células em recuperação foram cultivadas por 24 ho- ras em RPMI com FBS a 10% a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando LSR II HTS (BD Bioscience). A Fig. 16A mostra a viabili- dade de monócitos humanos primários avaliados usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 16B mostra a eficiência de transfecção dos monócitos humanos primários avaliados usando a expressão de GFP.
[00145] As Figs. 17A-17B são gráficos de barras que comparam a eficiência de transfecção e a viabilidade na linhagem de células NK-92 usando dispositivos da invenção e um instrumento de transfecção de células disponível comercialmente usando protocolos de transfecção publicados para a linhagem de células NK-92. Após a eletroporação, as células foram cultivadas por 24 horas em aMEM completo (aMEM com 25% de soro 0,2 mM inositol 0,02 ácido fólico 0,1 mM mercaptoe- tanol) a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando o iQue (Intellicyt). A Fig. 17A mostra a viabilidade avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 17B mostra a eficiência de transfecção ava- liada pela expressão de GFP.
[00146] As Figs. 18A-18B são gráficos de barras que comparam a eficiência de transfecção e a viabilidade na linhagem de células NK- 92MI usando dispositivos da invenção e um instrumento de transfec- ção de células disponível comercialmente usando protocolos de trans- fecção publicados para a linhagem de células NK-92MI. Após a eletro- poração, as células foram cultivadas por 24 horas em aMEM completo (aMEM com 25% de soro 0,2 mM inositol 0,02 ácido fólico 0,1 mM mercaptoetanol) a 37°C antes da análise de citômetro de fluxo usando o iQue (Intellicyt). A Fig. 18A mostra a viabilidade avaliada usando o corante de exclusão 7-AAD. A Fig. 18B mostra a eficiência de trans- fecção avaliada pela expressão de GFP.
[00147] As Figs. 19A-19F são gráficos de barras que comparam células T (Figs. 19A-19C) com monócitos humanos primários (Figs 19D-19F) eletroporados e transfectados com mRNA personalizado SIRPalpha usando dispositivos da invenção em comparação com célu- las não eletroporadas. As células T expandidas do dia 11 foram trans- fectadas com 20 µg de mRNA de SIRPalpha e avaliadas quanto à su- perexpressão em 24 horas. Gráficos representativos para A) viabilida- de medida como células negativas 7AAD, B) eficiência de transfecção medida como células SIRPalpha positivas, e C) expressão de SIRPal-
pha medida como intensidade fluorescente média (MFI). Monócitos isolados de PBMC foram transfectados com 20 µg de mRNA de SIR- Palpha e avaliados quanto à superexpressão em 24 horas. Gráficos representativos para D) viabilidade medida como células negativas 7AAD, E) eficiência de transfecção medida como células SIRPalpha positivas e F) expressão de SIRPalpha medida como intensidade fluo- rescente média (MFI). Os gráficos são Média±SEM.
[00148] As Figs. 20A-20D são gráficos de barras que mostram a distribuição de GFP nRMA a células T primárias humanas nativas. A Fig. 20A mostra as células recuperadas, a Fig. 20B mostra a eficiência das células T naive, a Fig. 20C mostra a viabilidade das células T nai- ve e a Fig. 20D mostra o rendimento total. As células T naive foram transfectadas com 10 µg de mRNA de GFP comercial e avaliadas quanto à expressão em 24 horas. Gráficos representativos para conta- gens, viabilidade, eficiência e rendimento são mostrados. Os gráficos são Média±SEM.
[00149] As Figs. 21A-21B são gráficos FACS que mostram que a eletroporação não altera o fenótipo de células T naive humanas primá- rias. A Fig. 21A mostra células não tratadas e a Fig. 21B mostra célu- las eletroporadas. As células T naive foram transfectadas com 10 µg de mRNA de GFP comercial e, em seguida, coradas para CD45RA e CD45RO em 24 horas, como mostrado nos gráficos de pontos. Os fe- nótipos CD45RA / CD45RO são equivalentes entre células T naive ele- troporadas não tratadas e Flowfect™.
[00150] A Fig. 22 é um gráfico cinético que mostra a expansão de células T naive usando um dispositivo da invenção em comparação com células não tratadas. A eletroporação não altera a expansão das células T naive humanas primárias. As células T naive foram transfec- tadas com 10 µg de mRNA de GFP comercial e depois expandidas com ativadores CD3 / CD28 solúveis. As contagens de células foram feitas 1, 4 e 6 dias após a ativação. As taxas de expansão são equiva- lentes entre células T naive não tratadas e eletroporadas.
[00151] As Figs 23A-23F mostram modalidades exemplificativas de dispositivos de eletroporação da invenção integrados em um dispositi- vo de descarga eletrônico configurado para energizar e eletroporar uma pluralidade de amostras de células simultaneamente. A Fig. 23A mostra uma vista isométrica superior de um dispositivo de descarga eletrônico. A Fig. 23B mostra a vista lateral de um dispositivo da in- venção instalado em um dispositivo de descarga eletrônica, mostrando como o contato elétrico é feito no sistema usando contatos elétricos do tipo pino de pogo. A Fig. 23C mostra uma vista lateral de um dispositi- vo de descarga eletrônico completo. A Fig. 23D mostra uma vista iso- métrica de topo de uma modalidade alternativa de um dispositivo de descarga eletrônico. A Fig. 23E mostra uma vista lateral de um dispo- sitivo da invenção instalado em um dispositivo de descarga eletrônica, mostrando como o contato elétrico é feito no sistema usando contatos elétricos do tipo mola flexível. A Fig. 23F mostra uma vista aérea de um dispositivo de descarga eletrônico configurado para energizar e eletroporar uma pluralidade de amostras de células simultaneamente.
[00152] As Figs. 24A-24B mostram modalidades de um dispositivo de eletroporação de temperatura controlada usando um líquido térmico para controle de temperatura. A Fig. 24A mostra um esquema dos componentes do dispositivo de eletroporação de temperatura controla- da. A Fig. 24B mostra uma vista lateral do dispositivo de eletroporação de temperatura controlada mostrando o dispositivo em uma estrutura externa.
[00153] As Figs. 25A-25B mostram modalidades de um dispositivo de eletroporação com base em chip fluídico configurado para aceitar pontas de pipeta padrão da indústria para introdução de amostra. A Fig. 25A mostra uma modalidade de um chip fluídico incorporando ele-
trodos embutidos e canais fluídicos. A Fig. 25B mostra um esquema dos componentes do dispositivo de eletroporação à base de chip fluí- dico.
[00154] As Figs. 26A-26B mostram modalidades de um dispositivo de eletroporação de fluxo contínuo. A Fig. 26A mostra um esquema em corte dos componentes de um dispositivo de eletroporação de flu- xo contínuo. A Fig. 26B mostra uma vista externa com transparência para mostrar os componentes do dispositivo de eletroporação de fluxo contínuo.
[00155] As Figs. 27A-27F mostram o campo elétrico simulado gera- do usando modelagem computacional de uma modalidade de um ele- trodo helicoidal. A Fig. 27A mostra o campo elétrico simulado de um eletrodo helicoidal mostrado ao longo de todos os três eixos Cartesia- nos. A Fig. 27B mostra o campo elétrico simulado de um eletrodo heli- coidal mostrado a partir de uma seção transversal ao longo do eixo Z. As Figs. 27C-27F mostram o campo elétrico simulado de um eletrodo helicoidal ao longo do eixo X-Y mostrado a partir de quatro posições diferentes ao longo do eixo Z.
[00156] As Figs. 28A-28C mostram modalidades de um dispositivo de eletroporação de duas partes da invenção configurado para escala- bilidade de fabricação. A Fig. 28A mostra uma renderização 3D isomé- trica de topo de uma modalidade de um dispositivo de eletroporação de duas partes da invenção. A Fig. 28B mostra uma seção transversal vertical da modalidade representada na Fig. 28A mostrando como os dois componentes se unem. A Fig. 28C mostra uma vista idêntica da modalidade representada na Fig. 28B com dimensões (em mm) do dispositivo sobreposto.
[00157] As Figs. 29A-29B mostram uma modalidade de um disposi- tivo de eletroporação de duas partes da invenção que inclui eletrodos embutidos com uma interface para uma cânula de manipulação de lí-
quido. A Fig. 29A mostra uma renderização 3D isométrica de topo de uma modalidade de um dispositivo de eletroporação de duas partes da invenção com eletrodos embutidos. A Fig. 29B mostra um corte trans- versal vertical da modalidade representada na Fig. 29A mostrando a localização dos eletrodos embutidos em relação à zona de eletropora- ção do dispositivo da invenção.
[00158] As Figs. 30A-30B mostram modalidades de um alojamento externo da invenção configurado para alojar uma pluralidade de dispo- sitivos da invenção, componentes de manipulação de líquidos, contro- ladores e quaisquer componentes elétricos. A Fig. 30A mostra uma modalidade de um alojamento externo da invenção com uma interface de usuário. A Fig. 30B mostra uma modalidade de dispositivos da in- venção conectados a um distribuidor de distribuição de líquido e uma placa de amostra.
[00159] A Fig. 31 mostra uma comparação entre a estratégia de controle de citometria de fluxo tradicional (usando um sistema de ele- troporação Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM comercialmente disponível, inferior) e adotada (usando os dispositivos e sistemas da invenção, superior) para análise pós-transfecção para contagem de células, via- bilidade, eficiência de transfecção e detecção de marcadores de su- perfície / intracelulares.
[00160] As Figs. 32A-32B são gráficos de barras que mostram a viabilidade e eficiência da distribuição de DNA de plasmídeo que codi- fica GFP em células CHO-K1 usando dispositivos da invenção 24 ho- ras após a eletroporação. A Fig 32A mostra a viabilidade das células CHO-K1. A Fig. 32B mostra a eficiência de transfecção das células CHO-K1 avaliadas usando a expressão de GFP.
[00161] As Figs. 33A-33D são gráficos de barras que mostram a viabilidade e eficiência da distribuição de DNA de plasmídeo que codi- fica GFP em células HEK-293T usando dispositivos da invenção 24 e
48 horas após a eletroporação. A Fig 33A mostra a viabilidade de célu- las HEK-293T 24 horas após a eletroporação. A Fig. 33B mostra a efi- ciência de transfecção das células HEK-293T avaliadas usando a ex- pressão de GFP 24 horas após a eletroporação. A Fig 33C mostra a viabilidade de células HEK-293T 48 horas após a eletroporação. A Fig. 33D mostra a eficiência de transfecção das células HEK-293T avalia- das usando a expressão de GFP 48 horas após a eletroporação.
[00162] As Figs. 34A-34B mostram os sinais de fluorescência de GFP coletados de células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) an- tes (Fig. 34A) e depois (Fig. 34B) da eletroporação usando dispositivos e sistemas da invenção. As imagens de fluorescência GFP foram cap- turadas usando um microscópio ECHO Revolve equipado com uma objetiva de 10x.
[00163] As Figs. 35A-35B mostram os sinais de fluorescência GFP coletados de células HEK-293T antes (Fig. 35A) e depois (Fig. 35B) da eletroporação usando dispositivos e sistemas da invenção. As ima- gens de fluorescência GFP foram capturadas usando um microscópio ECHO Revolve equipado com uma objetiva de 10x.
[00164] As Figs. 36A-36D são gráficos de barras que mostram as contagens de células totais pós-eletroporação, viabilidade, eficiência e células transfectadas positivamente vivas relativas para distribuição de dextrano FITC de 40 kD a células T humanas primárias usando um sistema de transfecção NEON® comercialmente disponível e dispositi- vos da invenção. A Fig. 36A mostra a contagem total de células após a eletroporação. A Fig. 36B mostra a viabilidade das células T humanas primárias. A Fig. 36C mostra a eficiência da distribuição em células T humanas primárias. A Fig. 36D mostra a população de células trans- fectadas positivamente vivas relativas.
[00165] A Fig. 37 é um gráfico de barras que mostra uma compara- ção entre o sistema de transfecção NEON® e os dispositivos da in-
venção para a população de células transfectadas positivamente vivas relativas após a distribuição do plasmídeo GFP a células T humanas primárias.
[00166] As Figs. 38A-38D são gráficos de barras que mostram a recuperação, viabilidade, eficiência e rendimento da distribuição de mRNA em células T humanas primárias aos 9 dias de idade. A eletro- poração foi realizada usando dois sistemas de transfecção disponíveis comercialmente (Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM e Thermo Fisher NE- ON®) e dispositivos da invenção. Tanto 1 milhão (106 células/mL) ou 5 milhões (5x106 células/mL) foram eletroporados em 100 μL com 10 μg de mRNA que codifica EGFP. A análise por citometria de fluxo foi rea- lizada 24 horas após a eletroporação. As contagens de células são normalizadas para 1 milhão de entradas de células e o rendimento é normalizado para os resultados coletados usando os dispositivos da invenção. A Fig. 38A mostra a recuperação em ambas as densidades celulares. A Fig. 38B mostra a viabilidade em ambas as densidades celulares. A Fig. 38C mostra a eficiência em ambas as densidades ce- lulares. A Fig. 38D mostra o rendimento em ambas as densidades ce- lulares.
[00167] As Figs. 39A-39D são gráficos de linha que mostram a re- cuperação, viabilidade, eficiência e MFI da distribuição de complexos de ribonucleoproteína Cas9 (RNPs) direcionados a CXCR3 em células T humanas primárias. Cas9 RNPs foram formulados com proteína Cas9 comercialmente disponível e duas fontes comerciais de sgRNA. A análise por citometria de fluxo foi realizada 24-72 horas após a ele- troporação. A Fig. 39A mostra a recuperação da célula. A Fig. 39B mostra a viabilidade. A Fig. 39C mostra a eficiência. A Fig. 39D mostra o rendimento total de células alvo KO expandidas para 72 horas após a eletroporação.
[00168] As Figs 40A-40B são gráficos de barras que mostram as contagens de células vivas para a expressão de GFP a partir de célu- las THP-1 e distribuição de dextrano marcado com FITC para células NK-92MI para eletroporação usando um sistema comercial de trans- fecção NEON® e dispositivos da invenção. A Fig. 40A mostra as con- tagens de células vivas para a expressão de GFP em células THP-1. A Fig. 40B mostra as contagens de células vivas para a distribuição de dextrano marcado com FITC às células NK-92MI.
[00169] As Figs. 41A-41B são gráficos de barras que mostram uma comparação da viabilidade e eficiência resultantes da distribuição de mRNA de GFP em monócitos THP-1 usando um sistema comercial de transfecção NEON® e dispositivos da invenção. A Fig 41A mostra a viabilidade de monócitos THP-1 avaliada 24 horas após a transfecção. A Fig. 41B mostra a eficiência de transfecção de monócitos THP-1 avaliada usando a expressão de GFP 24 horas após a eletroporação.
[00170] As Figs. 42A-42C são gráficos de barras que mostram a viabilidade, eficiência e rendimento da distribuição de mRNA de GFP em monócitos THP-1 usando dispositivos da invenção com uma amos- tra de controle de células não eletroporadas. A Figura 42A mostra a viabilidade das células transfectadas avaliadas 24-72 horas após a eletroporação. A Figura 42B mostra a eficiência da captação de mRNA de GFP avaliada 24-72 horas após a eletroporação. A Figura 42C mostra o rendimento das células transfectadas avaliadas 24-72 horas após a eletroporação.
[00171] As Figs 43A-43B são gráficos de barras que mostram a vi- abilidade e eficiência da distribuição de mRNA de GFP a células THP- 1 ativadas por LPS usando dispositivos da invenção. A Fig 43A mostra a viabilidade de células THP-1 ativadas por LPS avaliadas 24 horas após a transfecção. A Fig. 43B mostra a eficiência de transfecção de células THP-1 ativadas por LPS avaliadas usando a expressão de GFP 24 horas após a eletroporação.
[00172] As Figs. 44A-4D são gráficos de barras que mostram a via- bilidade e eficiência da distribuição de dextrano FITC de 40 kD e mRNA de GFP em monócitos de sangue periférico primário usando dispositivos da invenção. A Fig. 44A mostra a viabilidade de monócitos de sangue periférico primário transfectados com dextrano FITC. A Fig. 44B mostra a eficiência de transfecção dos monócitos primários do sangue periférico transfectados com dextrano FITC. A Fig. 44C mostra a viabilidade de monócitos de sangue periférico primário transfectados com mRNA de GFP. A Fig. 44B mostra a eficiência de transfecção dos monócitos do sangue periférico primário transfectados com mRNA de GFP.
[00173] As Figs. 45A-45B são gráficos de barras que mostram a expressão de CD80 e CD86 em monócitos de sangue periférico primá- rio que foram transfectados com GFP com estimulação LPS usando dispositivos da invenção. A expressão de CD80 e CD86 foi medida 24 horas e 96 horas após a eletroporação. A Fig. 45A mostra a expressão do marcador de ativação CD80. A Fig. 45B mostra a expressão do marcador de linhagem CD86.
[00174] As Figs. 46A-46C são gráficos de barras que mostram o fenótipo de macrófago, viabilidade e expressão de GFP de monócitos de sangue periférico primário transfectados com mRNA de GFP usan- do dispositivos da invenção que se diferenciaram em macrófagos ao longo de 4-8 dias. A Fig. 46A mostra o fenótipo de macrófago avaliado por meio de análise de citometria de fluxo de FSC e SSC. A Fig. 46B mostra a viabilidade dos macrófagos transfectados. A Fig. 46C mostra a expressão percentual de GFP dos macrófagos transfectados.
[00175] As Fig. 47A-47D são gráficos de barras que mostram a via- bilidade e eficiência da distribuição de dextrano FITC de 40 kD e mRNA de GFP em macrófagos diferenciados de sangue periférico usando dispositivos da invenção. A Fig. 47A mostra a viabilidade de macrófagos diferenciados de sangue periférico transfectados com dex- trano FITC. A Fig. 47B mostra a eficiência de transfecção de macrófa- gos diferenciados de sangue periférico transfectados com dextrano FITC. A Fig. 47C mostra a viabilidade de macrófagos diferenciados de sangue periférico transfectados com mRNA de GFP. A Fig. 47D mos- tra a eficiência de transfecção de macrófagos diferenciados de sangue periférico transfectados com mRNA de GFP.
[00176] As Figs. 48A-48B são gráficos de barras que mostram a capacidade de macrófagos diferenciados de sangue periférico para polarizar em macrófagos M1 e M2 após a transfecção com mRNA de GFP usando dispositivos da invenção. A Fig. 48A mostra macrófagos polarizados M1, onde a polarização M1 com estimulação de IFNg + LPS foi indicada por expressão elevada de CD86. A Fig. 48B mostra macrófagos polarizados M2 onde a polarização M2, a estimulação IL- 4, foi indicada pela expressão de CD206.
[00177] As Figs 49A-49C são gráficos de barras que mostram a vi- abilidade, eficiência e contagem de células vivas de monócitos huma- nos primários transfectados com dextrano FITC usando um sistema comercial de transfecção NEON® e dispositivos da invenção. A Fig. 49A mostra a viabilidade dos monócitos humanos primários. A Fig. 49B mostra a eficiência da distribuição de dextrano FITC em monóci- tos humanos primários. A Fig. 49C mostra a contagem de células vivas dos monócitos humanos primários transfectados.
[00178] As Figs. 50A-50D são gráficos de barras que comparam a recuperação, viabilidade, eficiência e rendimento da transfecção de DNA em células Jurkat de densidades celulares variáveis usando dis- positivos de canal único e de fluxo contínuo da invenção. A Fig. 50A mostra a recuperação das células Jurkat transfectadas. A Fig. 50B mostra a viabilidade das células Jurkat transfectadas. A Fig. 50C mos- tra a eficiência da transfecção de DNA em células Jurkat. A Fig. 50D mostra o rendimento das células Jurkat transfectadas.
[00179] As Figs. 51A-51B são gráficos de barras que comparam o rendimento de GFP e FITC de células Jurkat transfectadas usando dispositivos de canal único e de fluxo contínuo da invenção. A Fig. 51A mostra o rendimento de GFP para células Jurkat transfectadas. A Fig. 51B mostra o rendimento de FITC para células Jurkat transfectadas.
[00180] As Figs. 52A-52D são gráficos de barras que mostram a distribuição de FITC dextrano em suspensões de alta densidade celu- lar usando dispositivos de fluxo contínuo da invenção. A análise por citometria de fluxo foi realizada 24 horas após a eletroporação. A Fig. 52A mostra a contagem total de células recuperadas em relação a 1 milhão de entradas de células. A Fig. 52B mostra a viabilidade das cé- lulas Jurkat transfectadas. A Fig. 52C mostra a eficiência da transfec- ção de dextrano FITC em células Jurkat. A Fig. 52D mostra o rendi- mento FITC das células Jurkat transfectadas.
[00181] As Fig. 53A-53D são gráficos de barras que mostram a re- cuperação, viabilidade, eficiência e rendimento da transfecção de mRNA em células Jurkat em um número de células de 100 milhões de células usando quantidades variáveis de mRNA e concentrações celu- lares variáveis em dispositivos de fluxo contínuo da invenção. A análi- se por citometria de fluxo foi realizada 24 horas após a eletroporação. A Fig. 53A mostra o número de células Jurkat recuperadas em diferen- tes concentrações de mRNA e concentrações de células. A Fig. 53B mostra a viabilidade das células Jurkat transfectadas em diferentes concentrações de mRNA e concentrações de células. A Fig. 53C mos- tra a eficiência da transfecção de mRNA em células Jurkat em diferen- tes concentrações de mRNA e concentrações celulares. A Fig. 53D mostra ao rendimento das células Jurkat transfectadas em diferentes concentrações de mRNA e concentrações de células.
[00182] A Fig. 54 mostra a análise de citometria de fluxo de células
T não tratadas e células T eletroporadas comparando o sistema co- mercial de transfecção Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM e os dispositi- vos da invenção. O painel superior mostra os gráficos de células totais FSC / SSC e o painel inferior mostra a coloração de viabilidade. As populações de células mortas são indicadas com setas vermelhas e caixas vermelhas. Há também uma mudança na morfologia das célu- las transfectadas com o Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM em 24h em comparação com as células não tratadas, indicando que mudanças fenotípicas ocorrem durante a eletroporação com a plataforma Lonza.
[00183] A Fig. 55 mostra um gráfico de barras do rendimento total de células a partir da eletroporação de 50 milhões de células T primá- rias com FITC-dextrano ou mRNA de EGFP usando o sistema comer- cial de transfecção Lonza LV e um dispositivo de fluxo contínuo da in- venção.
[00184] As Figs. 56A-56B são gráficos de barras que mostram a viabilidade e eficiência da distribuição de FITC dextrano em uma sus- pensão de 1 bilhão de células THP-1 usando um dispositivo de fluxo contínuo da invenção por um período de até 72 horas após a eletropo- ração. A Fig. 56A mostra a viabilidade das células THP-1. A Fig. 56B mostra a eficiência da distribuição de FITC dextrano nas células THP-
1.
[00185] A Fig. 57 é um gráfico de barras que mostra o rendimento de células FITC transfectadas com dextrano recuperáveis vivas a partir de uma suspensão de 1 bilhão de células THP-1 usando um dispositi- vo de fluxo contínuo da invenção. O rendimento foi rastreado por um período de até 72 horas após a cultura de eletroporação e representa aproximadamente 50% do número de entrada de células. A análise por citometria de fluxo foi realizada em 4 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas após a eletroporação.
[00186] As Figs. 58A-58D são gráficos de barras que comparam a forma da forma de onda e a voltagem da forma de onda nas contagens de células totais, viabilidade, eficiência e rendimento da transfecção de dextrano FITC em células Jurkat usando dispositivos da invenção. A Fig. 58A mostra o número de células Jurkat recuperadas em diferentes formas de onda e voltagens. A Fig. 58B mostra a viabilidade das célu- las Jurkat transfectadas em diferentes formas de onda e voltagens. A Fig. 58C mostra a eficiência da transfecção de dextrano FITC em célu- las Jurkat em diferentes formas de onda e voltagens. A Fig. 58D mos- tra o rendimento das células Jurkat transfectadas em diferentes formas de onda e voltagens.
[00187] As Figs. 59A-59D são gráficos de barras que comparam as voltagens máximas da forma de onda e os ciclos de trabalho nas con- tagens de células totais, viabilidade, eficiência e rendimento da trans- fecção de dextrano FITC em células T primárias usando dispositivos da invenção. A Fig. 59A mostra o número de células T primárias recu- peradas em diferentes voltagens máximas de forma de onda e ciclos de trabalho. A Fig. 59B mostra a viabilidade das células T primárias transfectadas em diferentes voltagens máximas de forma de onda e ciclos de trabalho. A Fig. 59C mostra a eficiência da transfecção de dextrano FITC em células T primárias em voltagens máximas de forma de onda e ciclos de trabalho diferentes. A Fig. 59D mostra o rendimen- to das células T primárias transfectadas em diferentes voltagens má- ximas de forma de onda e ciclos de trabalho.
[00188] As Figs. 60A-60D são gráficos de barras que comparam as voltagens máximas da forma de onda e os ciclos de trabalho nas con- tagens de células totais, viabilidade, eficiência e rendimento da trans- fecção de mRNA em células T primárias usando dispositivos da inven- ção. A Fig. 60A mostra o número de células T primárias recuperadas em diferentes voltagens máximas de forma de onda e ciclos de traba- lho. A Fig. 60B mostra a viabilidade das células T primárias transfecta-
das em diferentes voltagens máximas de forma de onda e ciclos de trabalho. A Fig. 60C mostra a eficiência da transfecção de mRNA em células T primárias em voltagens máximas de forma de onda e ciclos de trabalho diferentes. A Fig. 60D mostra o rendimento das células T primárias transfectadas em diferentes voltagens máximas de forma de onda e ciclos de trabalho.
[00189] A Fig. 61 é um gráfico de barras que mostra a eficiência da distribuição de Dynabeads CD3 / CD28 em uma suspensão de 1 mi- lhão de células T humanas primárias usando os dispositivos da inven- ção. A eletroporação foi realizada com e sem Dynabeads, com a in- corporação de Dynabead ocorrendo por 5 minutos ou durante a noite. A análise por citometria de fluxo foi realizada 24 horas após a eletropo- ração.
[00190] As Figs. 62A-62B mostram uma modalidade de uma estru- tura externa que é configurada para envolver os eletrodos de dispositi- vos da invenção. A Fig. 62A mostra a estrutura externa configurada com um trinco e uma dobradiça do tipo concha para envolver um dis- positivo da invenção. A Fig. 62B mostra a estrutura externa da Fig. 62A com um dispositivo da invenção repousando dentro dos corres- pondentes recessos internos da estrutura externa.
[00191] As Figs. 63A-63B são gráficos de barras que mostram a viabilidade e eficiência da distribuição de dextrano FITC em monócitos THP-1 usando dispositivos da invenção, com e sem uma estrutura ex- terna cobrindo os eletrodos do dispositivo. A análise por citometria de fluxo foi realizada 24 hs após a eletroporação. A Fig. 63A mostra a vi- abilidade dos monócitos THP-1. A Fig. 63B mostra a eficiência da transfecção dos monócitos THP-1.
[00192] As Figs. 64A-64B são gráficos de barras que mostram a viabilidade e eficiência da distribuição de dextrano FITC em monócitos THP-1 usando dispositivos da invenção fabricados a partir de diferen-
tes resinas de polímero. A Fig. 64A mostra a viabilidade dos monócitos THP-1 transfectados. A Fig. 64B mostra a eficiência da transfecção do dextrano FITC nos monócitos THP-1.
[00193] As Figs. 65A-65B são gráficos de barras que comparam a viabilidade e eficiência da distribuição de DNA e mRNA que codifica GFP em células Jurkat usando dispositivos da invenção operados ma- nualmente ou com uma plataforma de manipulação de fluido automati- zada. A Fig. 65A mostra a viabilidade das células Jurkat transfectadas. A Fig. 65B mostra a eficiência da transfecção de DNA e mRNA que codifica GFP nas células Jurkat.
[00194] As Figs. 66A-66E são gráficos de barras e gráficos de pon- tos comparando a viabilidade e eficiência da distribuição de múltiplos mRNAs que codificam GFP e mCherry em células T em paralelo (mesmo dia) ou série (2 dias de intervalo) usando dispositivos da in- venção operados manualmente ou com uma plataforma automatizada de manipulação de fluidos. A Fig. 66A mostra a viabilidade das células T 24 horas após a eletroporação da distribuição de múltiplos mRNAs que codificam mCherry. A Fig. 66B mostra a eficiência de GFP 24 ho- ras após a eletroporação. A Fig. 66C mostra a eficiência do mCherry 24 horas após a eletroporação. A Fig. 66D mostra a eficiência de GFP e mCherry dupla 24 horas após a eletroporação. A Fig. 66E mostra os gráficos de pontos da expressão de GFP (eixo x) e mCherry (eixo y) em 24 horas.
[00195] As Figs. 67A-67B são gráficos de barras que demonstram a eficiência de distribuição de mRNA em células mononucleares de san- gue periférico (PBMCs) usando dispositivos da invenção. Esses expe- rimentos foram realizados com um mRNA de origem comercial que codifica GFP, seguido por coloração de fenótipo de receptores de su- perfície para identificar populações de células específicas. A Fig. 67A mostra a eficiência em subpopulações de células T e a Fig. 67B mos-
tra a eficiência em populações de células não T de PBMCs. A análise por citometria de fluxo foi realizada 24 horas após a eletroporação.
[00196] A Fig. 68 é uma fotografia de uma modalidade de um sis- tema da invenção tendo um reservatório (uma bolsa) em comunicação de fluido com a primeira entrada e um reservatório (bolsa) em comuni- cação de fluido com a segunda saída.
[00197] A Fig. 69A é um conjunto de fotomicrografias mostrando a expressão de eGFP-mRNA usando dispositivos da invenção vs. con- troles não tratados. As Figs. 69B e 69C são gráficos de barras que mostram porcentagens de células vivas (Fig. 69B) e porcentagens de células GFP+ (Fig. 69C).
[00198] As Figs. 70A-70D são gráficos de barras que mostram a recuperação total de células NK (Fig. 70A), viabilidade (Fig. 70B), efi- ciência de transfecção (Fig. 70C) e rendimento de células GFP+ (Fig. 70D).
[00199] Onde os valores são descritos como faixas, será entendido que tal divulgação inclui a divulgação de todas as subfaixas possíveis dentro de tais faixas, bem como valores numéricos específicos que caem dentro de tais faixas, independentemente de ser um valor numé- rico específico ou subfaixa específica é expressamente declarado.
[00200] O termo "cerca de", como utilizado neste documento, refe- re-se a +/- 10% de um valor recitado.
[00201] O termo "pluralidade", como utilizado neste documento, re- fere-se a mais de um.
[00202] O termo "substancialmente uniforme", como utilizado neste documento, refere-se a +/- 5% de variação.
[00203] O termo "dimensão de seção transversal mínima", como utilizado neste documento, refere-se a um comprimento mínimo de uma linha reta que passa pelo centro geométrico de uma seção trans- versal de um lúmen e cruza uma parede interna do lúmen duas vezes no mesmo plano da seção transversal. O termo "área da seção trans- versal", a menos que especificado de outra forma, refere-se à área da seção transversal (por exemplo, ao longo do plano perpendicular ao eixo longitudinal ou direção do fluxo).
[00204] O termo "conectado de forma fluida", como utilizado neste documento, refere-se a uma conexão direta entre pelo menos dois elementos de dispositivo, por exemplo, um dispositivo de eletropora- ção, um reservatório, etc., que permite que o fluido se mova entre tais elementos de dispositivo sem passar por um elemento intermediário.
[00205] O termo "comunicação fluídica", como utilizado neste do- cumento, refere-se a uma conexão indireta entre pelo menos dois elementos de dispositivo, por exemplo, uma zona de eletroporação, um reservatório, etc., que permite que o fluido se mova entre tais ele- mentos de dispositivo, por exemplo, através de um elemento interme- diário, (por exemplo, através de tubulação intermediária, um canal in- termediário, etc.). Por exemplo, em modalidades nas quais um fluido flui de um lúmen do primeiro eletrodo, através de uma zona de eletro- poração, para um lúmen de um segundo eletrodo, o primeiro eletrodo está em comunicação fluídica com o segundo eletrodo.
[00206] O termo "lúmen", como utilizado neste documento, refere- se a uma cavidade interna de um eletrodo dos dispositivos da inven- ção que permite a passagem do fluido. Parte ou todo o lúmen de um eletrodo pode ser condutivo ou não condutivo. Por exemplo, um lúmen de um eletrodo pode envolver um elemento condutivo em forma de C que não circunda completamente o perímetro do lúmen. Em outras modalidades, o eletrodo é substancialmente inteiramente composto do material condutivo que transmite a corrente. Quando uma diferença de potencial elétrico é aplicada a um primeiro e segundo eletrodos dos dispositivos da invenção, um campo elétrico que pode ser gerado em um lúmen de qualquer um do primeiro ou segundo eletrodos não é alto o suficiente para fazer com que a eletroporação da célula ocorra den- tro do lúmen.
[00207] O termo "zona de entrada", como utilizado neste documen- to, compreende um lúmen de um primeiro eletrodo dos dispositivos da invenção através dos quais um fluido e uma pluralidade de células suspensas no fluido podem passar antes da eletroporação. Uma zona de entrada pode compreender ainda um reservatório adicional em co- municação fluídica com um lúmen de um primeiro eletrodo dos disposi- tivos da invenção. Quando uma diferença de potencial elétrico é apli- cada a um primeiro e segundo eletrodos dos dispositivos da invenção, o campo elétrico que pode ser gerado dentro de uma zona de entrada dos dispositivos da invenção não é alto o suficiente para causar a ele- troporação celular.
[00208] O termo "zona de recuperação", como utilizado neste do- cumento, compreende um lúmen de um segundo eletrodo dos disposi- tivos da invenção através dos quais um fluido e uma pluralidade de células suspensas no fluido podem passar após a eletroporação. Uma zona de recuperação pode compreender ainda um reservatório adicio- nal em comunicação fluídica com um lúmen de um segundo eletrodo dos dispositivos da invenção. Quando uma diferença de potencial elé- trico é aplicada a um primeiro e segundo eletrodos dos dispositivos da invenção, o campo elétrico que pode ser gerado dentro de uma zona de recuperação dos dispositivos da invenção não é alto o suficiente para causar a eletroporação celular.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00209] A presente invenção fornece dispositivos, sistemas e méto- dos para a transfecção de células, por exemplo, células T primárias, por eletroporação em volumes maiores, maior eficiência de transfec- ção, maior rendimento, maior taxa de recuperação, maior rendimento e maior viabilidade celular em comparação com as abordagens tradicio-
nais de eletroporação com base em cubetas ou instrumentos de ele- troporação disponíveis comercialmente. Em particular, são fornecidos sistemas e métodos que podem realizar a eletroporação em uma ma- neira de fluxo direto, uma maneira contínua, ou usando uma pluralida- de de dispositivos de eletroporação da invenção para intensificar o rendimento e o número de células. Dispositivos
[00210] Em geral, os dispositivos da presente invenção são configu- rados para fluir através de dispositivos que podem fazer interface com a manipulação de líquidos, bombas ou aparelhos de transporte de flui- do existentes, tais como robôs de ponta de pipeta convencionais ou sistemas de manipulação de líquidos em grande escala, para fornecer eletroporação contínua de células suspensas em um fluido. Dispositi- vos da invenção tipicamente apresentam três regiões distintas: um primeiro eletrodo tendo uma primeira entrada e uma primeira saída, onde um lúmen do primeiro eletrodo define uma zona de entrada; um segundo eletrodo tendo uma segunda entrada e uma segunda saída, onde um lúmen do segundo eletrodo define uma zona de recuperação; e zona de eletroporação que está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletrodo e à segunda entrada do segundo eletrodo. Um exemplo de uma modalidade do dispositivo da invenção é mostra- do na Fig. 1A, com o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo fluida- mente conectados por uma zona de eletroporação entre os mesmos. Quando uma diferença de potencial elétrico é aplicada ao primeiro e ao segundo eletrodos, um campo elétrico localizado se desenvolve no espaço entre os dois eletrodos, por exemplo, a zona de eletroporação, e as células expostas ao campo elétrico são eletroporadas. Um dispo- sitivo individual da invenção pode incluir dois eletrodos, como mostra- do nas Figs. 1A-1C; alternativamente, os dispositivos individuais da invenção podem incluir três ou mais eletrodos que definem uma plura-
lidade de zonas de eletroporação, permitindo assim uma pluralidade de eletroporações nas células suspensas em um fluido. Os dispositi- vos da invenção podem incluir uma pluralidade de zonas de eletropo- ração entre o primeiro e o segundo eletrodos, permitindo que as célu- las experimentem diferentes campos elétricos, por exemplo, desenvol- vidos por diferentes geometrias de cada uma da pluralidade de zonas de eletroporação, enquanto fluem em um único dispositivo ou uma plu- ralidade de dispositivos.
[00211] Em alguns casos, o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo podem ser fios eletricamente condutivos, cilindros ocos, filmes finos eletricamente condutivos, espumas de metal, eletrodos de malha, membranas difusíveis de líquido, líquidos condutores ou qualquer combinação dos mesmos pode ser incluída no dispositivo. Os eletro- dos podem ser alinhados paralelamente ao eixo de fluxo de fluido do dispositivo ou podem ser alinhados ortogonalmente ao eixo de fluxo de fluido do dispositivo. Por exemplo, o primeiro e o segundo eletrodos podem ser eletrodos cilíndricos ocos dispostos em paralelo com o eixo de fluxo de fluido dentro do dispositivo, tal como no dispositivo das Figs. 1A-1C, de modo que o fluido flua através dos eletrodos. Em um exemplo alternativo, o primeiro e / ou segundo eletrodos podem ser feitos de um condutor poroso, por exemplo, uma malha de metal, com poros que estão alinhados ao eixo de fluxo de fluido do dispositivo. Em um exemplo alternativo, o primeiro e / ou segundo eletrodos podem ser um fluido condutivo, por exemplo, líquido. Em alguns casos, o pri- meiro e o segundo eletrodos podem ser configurados como uma héli- ce, por exemplo, uma hélice dupla, feita de um condutor sólido, por exemplo, um fio, em torno da zona de eletroporação. Nesta configura- ção, a dimensão da seção transversal da zona de eletroporação per- manece substancialmente uniforme, mas o primeiro e o segundo ele- trodos mudam de posição ao longo do comprimento da zona de ele-
troporação. O primeiro e o segundo eletrodos estão em comunicação de fluido com a zona de eletroporação, mas o campo elétrico gerado quando uma diferença de potencial elétrico é aplicada aos eletrodos gira conforme as células suspensas no fluido se deslocam através do dispositivo da invenção. Em certas modalidades, o primeiro e o segun- do eletrodos são incorporados ao dispositivo da invenção e têm área ativa disposta em ou perto das conexões fluídicas para a zona de ele- troporação, de modo que o fluido que transporta as células em sus- pensão entre em contato com uma porção do eletrodo, com o campo elétrico gerado na zona de eletroporação.
[00212] Quando configurados para serem eletrodos cilíndricos ocos, o diâmetro do eletrodo pode ser de cerca de 0,1 mm a cerca de 5 mm, por exemplo, de cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mm, de cerca de 0,5 mm a cerca de 1,5 mm, de cerca de 1 mm a cerca de 2 mm, de cerca de 1,5 mm a cerca de 2,5 mm, cerca de 2 mm a cerca de 3 mm, de cerca de 2,5 mm a cerca de 3,5 mm, cerca de 3 mm a cerca de 4 mm, de cerca de 3,5 mm a cerca de 4,5 mm, ou cerca de 4 mm a cerca de 5 mm, por exemplo, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,2 mm, cerca de 0,3 mm, cerca de 0,4 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 0,6 mm, cerca de 0,7 mm, cerca de 0,8 mm, cerca de 0,9 mm, cerca de 1 mm, cerca de 1,1 mm, cerca de 1,2 mm, cerca de 1,3 mm, cerca de 1,4 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 1,6 mm, cerca de 1,7 mm, cerca de 1,8 mm, cer- ca de 1,9 mm, cerca de 2 mm, cerca de 2,1 mm, cerca de 2,2 mm, cerca de 2,3 mm, cerca de 2,4 mm, cerca de 2,5 mm, cerca de 2,6 mm, cerca de 2,7 mm, cerca de 2,8 mm, cerca de 2,9 mm, cerca de 3 mm, cerca de 3,1 mm, cerca de 3,2 mm, cerca de 3,3 mm, cerca de 3,4 mm, cerca de 3,5 mm, cerca de 3,6 mm, cerca de 3,7 mm, cerca de 3,8 mm, cerca de 3,9 mm, cerca de 4 mm, cerca de 4,1 mm, cerca de 4,2 mm, cerca de 4,3 mm, cerca de 4,4 mm, cerca de 4,5 mm, cer- ca de 4,6 mm, cerca de 4,7 mm, cerca de 4,8 mm, cerca de 4,9 mm ou cerca de 5 mm. Um diâmetro externo de eletrodo exemplificativo é de 1,3 mm, correspondendo a um eletrodo de calibre 16.
[00213] Em algumas modalidades, quando um dispositivo da inven- ção é configurado para incluir eletrodos cilíndricos ocos, um lúmen de um eletrodo, por exemplo, o primeiro ou segundo eletrodo, pode incluir uma zona, por exemplo, uma zona de entrada ou uma zona de recupe- ração, que não é sujeita ao campo elétrico da zona de eletroporação. Como é mostrado na Fig. 1A, a zona de entrada pode ser o lúmen do primeiro eletrodo diretamente antes de uma entrada para a zona de eletroporação onde as células na suspensão que devem ser eletropo- radas juntamente com uma composição a ser distribuída nas células estão localizadas. A zona de recuperação pode ser o lúmen do segun- do eletrodo diretamente após uma saída para a zona de eletroporação, onde as células que tiveram uma composição distribuída são movidas para que os poros nas membranas celulares possam fechar, garantin- do assim que a composição distribuída permaneça dentro da célula. Nesta configuração, conforme as células passam através do lúmen do primeiro eletrodo e em direção ao lúmen do segundo eletrodo, o pri- meiro eletrodo é energizado e o segundo eletrodo é mantido no solo, criando o campo elétrico localizado na zona de eletroporação, eletro- porando assim as células que passam pelo dispositivo.
[00214] A zona de eletroporação conecta fluidamente o primeiro e o segundo eletrodos dos dispositivos da invenção e, quando os eletro- dos são energizados, experimenta um campo elétrico localizado entre os mesmos. A forma da seção transversal da zona de eletroporação pode ser de qualquer forma adequada que permite que as células passem pela zona de eletroporação e o campo elétrico dentro da zona de eletroporação. A forma da seção transversal pode ser, por exemplo, circular, elipsoidal ou poligonal, por exemplo, quadrada, retangular, triangular, n-gon (por exemplo, um polígono regular ou irregular tendo
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais lados), estrela, paralelogramo, trapezoidal ou irregular, por exemplo, forma oval ou curvilínea.
Em alguns casos, a zona de eletroporação é um canal que tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme ao longo de seu comprimento, por exemplo, a zona de eletroporação pode ter uma seção transversal circular, onde o diâmetro é constante desde a conexão fluídica até a zona de entrada para a conexão fluídica da zona de recuperação.
Nes- ta configuração, o campo elétrico resultante é mais uniforme, permitin- do assim uma exposição mais previsível ao campo elétrico das células suspensas em um fluido.
Alternativamente, a dimensão da seção transversal da zona de eletroporação pode ser variada ao longo de seu comprimento.
Por exemplo, a dimensão da seção transversal da zona de eletroporação pode aumentar ou diminuir ao longo de seu comprimento, ou pode ter mais de uma mudança de dimensão ao lon- go de seu comprimento, por exemplo, a dimensão da seção transver- sal, por exemplo, o diâmetro, pode aumentar ou diminuir em pelo me- nos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, ou no máximo 1%, 5%, 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. Nesta configuração, a zona de eletroporação po- de ter uma seção transversal cônica truncada, com o diâmetro aumen- tando da abertura superior para a abertura inferior ou diminuindo da abertura superior para a abertura inferior.
Em alguns casos, os disposi- tivos da invenção podem incluir uma pluralidade de zonas de eletropo- ração fluidamente conectadas em série, com cada zona de eletropora- ção tendo uma seção transversal uniforme ou não uniforme e cada uma pode ter uma forma de seção transversal diferente.
Como um exemplo não limitativo, um dispositivo da invenção pode incluir uma pluralidade de zonas de eletroporação conectadas em série, cada uma da pluralidade de zonas de eletroporação tendo uma seção transversal cilíndrica de uma dimensão de seção transversal diferente, por exem-
plo, cada uma tem um diâmetro diferente.
[00215] Em algumas modalidades, a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação pode ser de cerca de 0,005 mm a cerca de 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm a cerca de 0,05 mm, cer- ca de 0,01 mm a cerca de 0,1 mm, cerca de 0,05 mm a cerca de 0,5 mm, cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mm, de cerca de 0,5 mm a cerca de 2 mm, cerca de 1 mm a cerca de 5 mm, cerca de 3 mm a cerca de 7 mm, cerca de 5 mm a cerca de 10 mm, cerca de 7 mm a cerca de 12 mm, cerca de 10 mm a cerca de 15 mm, cerca de 13 mm a cerca de 18 mm, cerca de 15 mm a cerca de 20 mm, cerca de 22 mm a cerca de 30 mm cerca de 25 mm a cerca de 35 mm, cerca de 30 mm a cerca de 40 mm, cerca de 35 mm a cerca de 45 mm, ou cerca de 40 mm a cerca de 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,006, cerca de 0,007 mm, cerca de 0,008 mm, cerca de 0,009 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,02 mm, cerca de 0,03 mm, cerca de 0,04 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,06 mm, cerca de 0,07 mm, cerca de 0,08 mm, cerca de 0,09 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,2 mm, cerca de 0,3 mm, cerca de 0,4 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 0,6 mm, cer- ca de 0,7 mm, cerca de 0,8 mm, cerca de 0,9 mm, cerca de 1 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 11 mm, cerca de 12 mm, cerca de 13 mm, cerca de 14 mm, cerca de 15 mm, cerca de 16 mm, cerca de 17 mm, cerca de 18 mm, cerca de 19 mm, cerca de 20 mm, cerca de 21 mm, cerca de 22 mm, cerca de 23 mm, cerca de 24 mm, cerca de 25 mm, cerca de 26 mm, cerca de 27 mm, cerca de 28 mm, cerca de 29 mm, cerca de 30 mm, cerca de 31 mm, cerca de 32 mm, cerca de 33 mm, cerca de 34 mm, cerca de 35 mm, cerca de 36 mm, cerca de 37 mm, cerca de 38 mm, cerca de 39 mm, cerca de 40 mm, cerca de 41 mm, cerca de 42 mm, cerca de 43 mm, cerca de 44 mm, cerca de 45 mm, cerca de 46 mm, cerca de 47 mm, cerca de 48 mm, cerca de 49 mm ou cerca de 50 mm. Em geral, o diâmetro da zona de eletroporação é dimensiona- do de modo que não tenha uma constrição que entre em contato com as células para deformar as membranas celulares com as paredes do canal, por exemplo, a poração das células não é induzida por defor- mação mecânica devido à compressão celular, - por exemplo, as célu- las podem passar livremente pela zona de eletroporação.
[00216] Em alguns casos, o comprimento da zona de eletroporação pode ser de cerca de 0,005 mm a cerca de 50 mm, por exemplo, cerca de 0,005 mm a cerca de 0,05 mm, cerca de 0,01 mm a cerca de 0,1 mm, cerca de 0,05 mm a cerca de 0,5 mm, cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mm, de cerca de 0,5 mm a cerca de 2 mm, cerca de 1 mm a cer- ca de 5 mm, cerca de 3 mm a cerca de 7 mm, cerca de 5 mm a cerca de 10 mm, cerca de 7 mm a cerca de 12 mm, cerca de 10 mm a cerca de 15 mm, cerca de 13 mm a cerca de 18 mm, cerca de 15 mm a cer- ca de 20 mm, cerca de 22 mm a cerca de 30 mm cerca de 25 mm a cerca de 35 mm, cerca de 30 mm a cerca de 40 mm, cerca de 35 mm a cerca de 45 mm, ou cerca de 40 mm a cerca de 50 mm, por exem- plo, cerca de 0,005 mm, cerca de 0,006, cerca de 0,007 mm, cerca de 0,008 mm, cerca de 0,009 mm, cerca de 0,01 mm, cerca de 0,02 mm, cerca de 0,03 mm, cerca de 0,04 mm, cerca de 0,05 mm, cerca de 0,06 mm, cerca de 0,07 mm, cerca de 0,08 mm, cerca de 0,09 mm, cerca de 0,1 mm, cerca de 0,2 mm, cerca de 0,3 mm, cerca de 0,4 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 0,6 mm, cerca de 0,7 mm, cerca de 0,8 mm, cerca de 0,9 mm, cerca de 1 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, cerca de 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm, cerca de 11 mm, cerca de 12 mm, cerca de 13 mm, cerca de 14 mm, cerca de 15 mm, cerca de 16 mm, cerca de 17 mm, cerca de 18 mm, cerca de 19 mm, cerca de 20 mm, cerca de 21 mm, cerca de 22 mm, cerca de 23 mm,
cerca de 24 mm, cerca de 25 mm, cerca de 26 mm, cerca de 27 mm, cerca de 28 mm, cerca de 29 mm, cerca de 30 mm, cerca de 31 mm, cerca de 32 mm, cerca de 33 mm, cerca de 34 mm, cerca de 35 mm, cerca de 36 mm, cerca de 37 mm, cerca de 38 mm, cerca de 39 mm, cerca de 40 mm, cerca de 41 mm, cerca de 42 mm, cerca de 43 mm, cerca de 44 mm, cerca de 45 mm, cerca de 46 mm, cerca de 47 mm, cerca de 48 mm, cerca de 49 mm ou cerca de 50 mm.
[00217] A dimensão da seção transversal da zona de entrada e / ou da zona de recuperação pode ser independentemente substancial- mente a mesma que a dimensão da seção transversal da zona de ele- troporação. Alternativamente, a zona de entrada e / ou a zona de re- cuperação pode ser independentemente menor ou maior do que a di- mensão da seção transversal da zona de eletroporação. Por exemplo, quando a dimensão da seção transversal da zona de entrada e / ou da zona de recuperação é configurada independentemente para ser me- nor que a dimensão da seção transversal da zona de eletroporação, a dimensão da seção transversal da zona de entrada e / ou da zona de recuperação pode ser de cerca de 0,01% a cerca de 100% da dimen- são da seção transversal da zona de eletroporação, cerca de 0,01% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 25% a cerca de 75%, ou cerca de 50% a cerca de 100%, por exemplo, cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cer- ca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90 %, cerca de 95% ou cerca de 100%.
[00218] Alternativamente, quando a dimensão da seção transversal da zona de entrada e / ou da zona de recuperação é configurada inde- pendentemente para ser maior do que a dimensão da seção transver- sal da zona de eletroporação, a dimensão da seção transversal da zo- na de entrada e / ou da zona de recuperação pode ser de cerca de 100% a cerca de 100.000% da dimensão da seção transversal da zo- na de eletroporação, por exemplo, cerca de 100% a cerca de 1000%, cerca de 500% a cerca de 5.000%, cerca de 1.000% a cerca de
10.000%, cerca de 5.000% a cerca de 25.000%, cerca de 10.000% a cerca de 50.000%, cerca de 25.000% a cerca de 75.000%, ou cerca de 50.000% a cerca de 100.000%, por exemplo, cerca de 100%, cerca de 200%, cerca de 300%, cerca de 400%, cerca de 500 %, cerca de 600%, cerca de 700%, cerca de 800%, cerca de 900%, cerca de
1.000%, cerca de 2.000%, cerca de 3.000%, cerca de 4.000%, cerca de 5.000%, cerca de 6.000%, cerca de 7.000%, cerca de 8.000%, cer- ca de 9.000%, cerca de 10.000%, cerca de 15.000%, cerca de
20.000%, cerca de 25.000%, cerca de 30.000%, cerca de 35.000%, cerca de 40.000%, cerca de 45.000%, cerca de 50.000%, cerca de
55.000%, cerca de 60.000%, cerca de 65.000%, cerca de 70.000%, cerca de 75.000%, cerca de 80.000%, cerca de 85.000%, cerca de
90.000%, cerca de 95.000% ou cerca de 100.000%.
[00219] Os dispositivos da invenção também podem incluir um ou mais reservatórios para reagentes fluidos, por exemplo, uma solução tampão ou amostras, por exemplo, uma suspensão de células e uma composição a ser introduzida nas células. Por exemplo, os dispositivos da invenção podem incluir um reservatório para as células suspensas no fluido para fluir no primeiro eletrodo para a zona de eletroporação e / ou um reservatório para conter as células que foram eletroporadas. Da mesma forma, um reservatório para líquidos fluírem em componen- tes adicionais de um dispositivo, como entradas adicionais que cruzam o primeiro ou o segundo eletrodos, pode estar presente. Um único re- servatório também pode ser conectado a vários dispositivos da inven- ção, por exemplo, quando o mesmo líquido deve ser introduzido em dois ou mais dispositivos individuais da invenção configurados para eletroporar células em paralelo ou em série. Alternativamente, os dis- positivos da invenção podem ser configurados para coincidir com fon- tes de líquidos, que podem ser reservatórios externos, como frascos, tubos ou bolsas. Da mesma forma, o dispositivo pode ser configurado para combinar com um componente separado que aloja os reservató- rios. Os reservatórios podem ser de qualquer tamanho apropriado, por exemplo, para conter 10 mL a 5000 mL, por exemplo, 10 mL a 3000 mL, 25 mL a 100 mL, 100 mL a 1000 mL, 40 mL a 300 mL, 1 mL a 100 mL, ou 10 mL a 500 mL. Quando vários reservatórios estão presentes, cada reservatório pode ter o mesmo ou um tamanho diferente.
[00220] Além dos componentes discutidos acima, os dispositivos da invenção podem incluir componentes adicionais. Por exemplo, o pri- meiro e o segundo eletrodos dos dispositivos da invenção podem in- cluir uma ou mais entradas de fluido adicionais para permitir a introdu- ção de fluidos que não sejam de amostra, por exemplo, soluções tam- pão, na região apropriada do dispositivo. Por exemplo, uma zona de recuperação de um dispositivo da invenção pode incluir uma entrada e saída adicionais para circular um tampão de recuperação para auxiliar no fechamento dos poros abertos nas membranas celulares do pro- cesso de eletroporação. Sistemas e kits
[00221] Um ou mais dispositivos de eletroporação da invenção po- dem ser combinados com vários componentes externos, por exemplo, fontes de alimentação, bombas, reservatórios (por exemplo, bolsas), controladores, reagentes, líquidos e / ou amostras na forma de um sis- tema. Em algumas modalidades, um sistema da invenção inclui uma pluralidade de dispositivos da invenção e uma fonte de potencial elétri- co que é conectada de forma liberável ao primeiro e segundo eletrodos do(s) dispositivo(s) da invenção. Nesta configuração, o(s) dispositi- vo(s) da invenção são conectados à fonte de potencial elétrico e o pri- meiro eletrodo é energizado e o segundo eletrodo é mantido no solo. Isso cria um campo elétrico localizado na zona de eletroporação, ele- troporando assim as células que passam através do(s) dispositivo(s). Os sistemas de eletroporação que incorporam dispositivos da inven- ção podem induzir eletroporação reversível ou irreversível para as cé- lulas que passam através do dispositivo e sistema da invenção. Por exemplo, os dispositivos e sistemas da invenção podem induzir eletro- poração substancialmente não térmica reversível, eletroporação subs- tancialmente não térmica irreversível ou eletroporação substancial- mente térmica irreversível nas células suspensas no fluido.
[00222] Em alguns casos, a conexão liberável para o primeiro e se- gundo eletrodos pode incluir qualquer conexão eletromecânica prática que pode manter contato elétrico consistente entre a fonte de potencial elétrico e o primeiro e o segundo eletrodos. Exemplos de conexões elétricas incluem, mas não estão limitados a grampos, clipes, por exemplo, clipes de crocodilo, molas, por exemplo, uma mola de lâmi- na, uma bainha externa ou luva, escovas de arame, condutores flexí- veis, pinos de pogo, conexões mecânicas, conexões indutivas, ou uma combinação dos mesmos. Outros tipos de conexões elétricas são co- nhecidos na técnica. Por exemplo, um eletrodo do tipo mola pode ser integrado em uma plataforma condutiva, como aquela mostrada nas
Figs. 2A-2B. Na modalidade mostrada nas Figs. 2A-2B, um dispositivo da invenção é inserido em um alojamento que incorpora duas grades condutora eletricamente isoladas uma da outra em uma base que con- tém aberturas individuais para aceitar dispositivos da invenção. Um dispositivo da invenção pode ser instalado em uma abertura na grade condutora de modo que o primeiro e o segundo eletrodos do dispositi- vo possam entrar em contato com a grade condutora. Em particular, a grade condutora inclui eletrodos carregados por mola, por exemplo, eletrodos conectados a uma mola, de modo que quando um dispositi- vo da invenção é instalado em uma abertura da grade condutora, os eletrodos carregados por mola deslocam e comprimem a mola (que ainda fornece uma força restauradora contra o primeiro e o segundo eletrodos do dispositivo da invenção), garantindo assim o contato elé- trico entre o dispositivo da invenção e a fonte de potencial elétrico.
[00223] A fonte de potencial elétrico é configurada para fornecer uma voltagem aplicada a um ou mais eletrodos, a fim de fornecer uma diferença de potencial elétrico entre os eletrodos e, assim, estabelecer um campo elétrico uniforme na zona de eletroporação. Em alguns ca- sos, como em um circuito de eletroporação de dois eletrodos, a volta- gem aplicada é fornecida a um primeiro eletrodo e o segundo eletrodo é mantido no solo. Sem desejar estar limitado por qualquer teoria par- ticular, uma voltagem aplicada distribuída ao eletrodo é distribuída em uma amplitude particular, uma frequência particular, uma forma de pulso particular, uma duração particular, um número particular de pul- sos aplicados e um ciclo de trabalho particular. Esses parâmetros, acoplados à geometria da zona de eletroporação, fornecerão um cam- po elétrico específico dentro da zona de eletroporação que será expe- rimentado pelas células suspensas em um fluido. Os parâmetros elé- tricos descritos neste documento podem ser otimizados para uma linha celular particular e / ou composição sendo distribuída a uma linhagem celular particular. A aplicação do potencial elétrico aos eletrodos do(s) dispositivo(s) da invenção pode ser iniciada e / ou controlada por um controlador, por exemplo, um computador com programação, operati- vamente acoplado à fonte de potencial elétrico.
[00224] Junto com os parâmetros de potencial elétrico descritos neste documento, a geometria dos dispositivos da invenção, por exemplo, a forma e as dimensões da seção transversal da zona de eletroporação, controla a forma e a intensidade do campo elétrico re- sultante dentro da zona de eletroporação. Normalmente, um dispositi- vo com uma zona de eletroporação que tem uma seção transversal uniforme exibirá um campo elétrico uniforme ao longo de seu compri- mento. A fim de modular o campo elétrico resultante na zona de ele- troporação, a zona de eletroporação pode incluir uma pluralidade de diferentes dimensões de seção transversal e / ou diferentes formas de seção transversal ao longo de seu comprimento. Como um exemplo não limitativo, um dispositivo da invenção pode incluir uma pluralidade de zonas de eletroporação conectadas em série, cada uma da plurali- dade de zonas de eletroporação tendo uma seção transversal circular de uma dimensão de seção transversal diferente, por exemplo, cada uma tem um diâmetro diferente. Nesta configuração, as seções trans- versais circulares de diferentes diâmetros da zona de eletroporação atuam cada uma como uma zona de eletroporação independente e cada uma irá induzir um campo elétrico diferente em cada mudança de dimensão com uma voltagem aplicada idêntica, por exemplo, uma vol- tagem CC constante.
[00225] Em alguns casos, os dispositivos da invenção podem incluir uma pluralidade de zonas de eletroporação fluidamente conectadas em série, com cada zona de eletroporação tendo uma seção transver- sal uniforme ou não uniforme e cada uma pode ter uma forma de se- ção transversal diferente. Alternativamente, um sistema da invenção pode incluir uma pluralidade de dispositivos da invenção em uma con- figuração paralela, com cada dispositivo operando independentemente um do outro para aumentar o rendimento geral da eletroporação.
[00226] Em alguns casos, a amplitude da voltagem aplicada é de cerca de -3 kV a 3 kV, por exemplo, 0,01 kV a cerca de 3 kV, por exemplo, cerca de 0,01 kV a cerca de 0,1 kV, cerca de 0,02 kV a cerca de 0,2 kV, cerca de 0,03 kV a cerca de 0,3 kV, cerca de 0,04 kV a cer- ca de 0,4 kV, cerca de 0,05 kV a cerca de 0,5 kV, cerca de 0,06 kV a cerca de 0,6 kV, cerca de 0,07 kV a cerca de 0,7 kV, cerca de 0,08 kV a cerca de 0,8 kV, cerca de 0,09 kV a cerca de 0,9 kV, cerca de 0,1 kV a cerca de 1 kV, cerca de 0,15 kV a cerca de 1,5 kV, cerca de 0,2 kV a cerca de 2 kV, cerca de 0,25 kV a cerca de 2,5 kV, ou cerca de 0,3 kV a cerca de 3 kV, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 1 kV, cerca de 0,1 kV a cerca de 0,7 kV, ou cerca de 0,2 a cerca de 0,6 kV, por exemplo, cerca de 0,01 kV, cerca de 0,02 kV, cerca de 0,03 kV, cerca de 0,04 kV, cerca de 0,05 kV, cerca de 0,06 kV, cerca de 0,07 kV, cer- ca de 0,08 kV, cerca de 0,09 kV, cerca de 0,1 kV, cerca de 0,2 kV, cerca de 0,3 kV, cerca de 0,4 kV, cerca de 0,5 kV, cerca de 0,6 kV, cerca de 0,7 kV, cerca de 0,8 kV, cerca de 0,9 kV, cerca de 1 kV, cer- ca de 1,1 kV, cerca de 1,2 kV, cerca de 1,3 kV, cerca de 1,4 kV, cerca de 1,5 kV, cerca de 1,6 kV, cerca de 1,7 kV, cerca de 1,8 kV, cerca de 1,9 kV, cerca de 2 kV, cerca de 2,1 kV, cerca de 2,2 kV, cerca de 2,3 kV, cerca de 2,4 kV, cerca de 2,5 kV, cerca de 2,6 kV, cerca de 2,7 kV, cerca de 2,8 kV, cerca de 2,9 kV, ou cerca de 3 kV.
[00227] Em alguns casos, a frequência da voltagem aplicada é de cerca de 1 Hz a cerca de 50.000 Hz, por exemplo, de cerca de 1 Hz a cerca de 1.000 Hz, cerca de 100 Hz a cerca de 5.000 Hz, cerca de 500 Hz a cerca de 10.000 Hz, cerca de 1000 Hz a cerca de 25.000 Hz, ou de cerca de 5.000 Hz a cerca de 50.000 Hz, por exemplo, de cerca de 10 Hz a cerca de 1000 Hz, cerca de 500 Hz a cerca de 750 Hz, ou cerca de 100 Hz a cerca de 500 Hz, por exemplo, de cerca de 1 Hz, cerca de 2 Hz, cerca de 3 Hz, cerca de 4 Hz, cerca de 5 Hz, cerca de 6 Hz, cerca de 7 Hz, cerca de 8 Hz, cerca de 9 Hz, cerca de 10 Hz, cer- ca de 20 Hz, cerca de 30 Hz, cerca de 40 Hz, cerca de 50 Hz, cerca de 60 Hz, cerca de 70 Hz, cerca de 80 Hz, cerca de 90 Hz, cerca de 100 Hz, cerca de 200 Hz, cerca de 300 Hz, cerca de 400 Hz, cerca de 500 Hz, cerca de 600 Hz, cerca de 700 Hz, cerca de 800 Hz, cerca de 900 Hz, cerca de 1.000 Hz, cerca de 2.000 Hz, cerca de 3.000 Hz, cerca de 4.000 Hz, cerca de 5.000 Hz, cerca de 6.000 Hz, cerca de 7.000 Hz, cerca de 8.000 Hz, cerca de 9.000 Hz, cerca de 10.000 Hz, cerca de 15.000 Hz, cerca de 20.000 Hz, cerca de 25.000 Hz, cerca de
30.000 Hz, cerca de 35.000 Hz, cerca de 40.000 Hz, abo ut 45.000 Hz, ou cerca de 50.000 Hz.
[00228] Em algumas modalidades, a forma do pulso aplicado, por exemplo, forma de onda, pode ser uma onda quadrada, pulso, uma onda bipolar, uma onda senoidal, uma rampa, uma onda bipolar assi- métrica ou arbitrária. Outras formas de onda de voltagem são conheci- das na técnica. A forma de onda escolhida pode ser aplicada em qual- quer padrão prático de voltagem, incluindo, mas não se limitando a, alta voltagem-baixa voltagem, baixa voltagem-alta voltagem, corrente contínua (CC), corrente alternada (CA), unipolar, polaridade positiva (+) apenas, polaridade negativa (-) apenas, polaridade (+) / (-), polari- dade (-) / (+) ou qualquer superposição ou combinação das mesmas. Um versado na técnica pode apreciar que esses parâmetros de pulso dependerão da linhagem celular de quaisquer características elétricas da composição sendo distribuída à célula.
[00229] Pulsos de voltagem aplicada podem ser distribuídos à zona de eletroporação com durações de cerca de 0,01 ms a cerca de 1.000 ms, por exemplo, de cerca de 0,01 ms a cerca de 1 ms, cerca de 0,1 ms a cerca de 10 ms, cerca de 1 ms a cerca de 50 ms, cerca de 10 ms a cerca de 100 ms, cerca de 25 ms a cerca de 200 ms, cerca de 50 ms a cerca de 400 ms, cerca de 100 ms a cerca de 600 ms, cerca de 300 ms a cerca de 800 ms, ou cerca de 500 ms a cerca de 1.000 ms, por exemplo, cerca de 0,01 ms a 100 ms, cerca de 0,1 ms a cerca de 50 ms, ou cerca de 1 ms a cerca de 10 ms, por exemplo, cerca de 0,01 ms, cerca de 0,02 ms, cerca de 0,03 ms, cerca de 0,04 ms, cerca de 0,05 ms, cerca de 0,06 ms, cerca de 0,07 ms, cerca de 0,08 ms, cerca de 0,09 ms, cerca de 0,1 ms, cerca de 0,2 ms, cerca de 0,3 ms, cerca de 0,4 ms, cerca de 0,5 ms, cerca de 0,6 ms, cerca de 0,7 ms, cerca de 0,8 ms, cerca de 0,9 ms, cerca de 1 ms, cerca de 2 ms, cerca de 3 ms, cerca de 4 ms, cerca de 5 ms, cerca de 6 ms, cerca de 7 ms, cer- ca de 8 ms, cerca de 9 ms, cerca de 10 ms, cerca de 20 ms, cerca de 30 ms, cerca de 40 ms, cerca de 50 ms, cerca de 60 ms, cerca de 70 ms, cerca de 80 ms, cerca de 90 ms, cerca de 100 ms, cerca de 150 m s, cerca de 200 ms, cerca de 250 ms, cerca de 300 ms, cerca de 350 ms, cerca de 400 ms, cerca de 450 ms, cerca de 500 ms, cerca de 550 ms, cerca de 600 ms, cerca de 650 ms, cerca de 700 ms, cerca de 750 ms, cerca de 800 ms, cerca de 850 ms, cerca de 900 ms, cerca de 950 ms ou cerca de 1.000 ms.
[00230] Em alguns casos, o número de pulsos de voltagem aplica- dos distribuídos pode ser de 0 a cerca de 1000, ou mais, por exemplo, 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, ou 100 ou mais, por exemplo, 1-4, 2-5, 3-6, 4-7, 5-8, 6-9 ou 7-10, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 1.000, por exemplo, de cerca de 0,01 a cerca de 1, cerca de 0,1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 50, cerca de 10 a cerca de 100, cerca de 25 a cerca de 200, cerca de 50 a cerca de 400, cerca de 100 a cerca de 600, cerca de 300 a cerca de 800 ou cerca de 500 a cerca de 1.000, por exemplo, cerca de 0,01 a 100, cerca de 0,1 a cerca de 50 ou cerca de 1 a cerca de 10, por exemplo, cerca de 0,01, cerca de 0,02, cerca de 0,03, cerca de 0,04,
cerca de 0,05, cerca de 0,06, cerca de 0,07, cerca de 0,07, cerca de 0,08, cerca de 0,09, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,3, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500, cerca de 550, cerca de 600, cerca de 650, cerca de 700, cerca de 750, cerca de 800, cerca de 850, cerca de 900, cerca de 950 ou cerca de 1.000.
[00231] Os pulsos de voltagem aplicada podem, em alguns casos, ser entregues em um ciclo de trabalho de cerca de 0,001% a cerca de 100%, por exemplo, de cerca de 0,001% a cerca de 0,1%, cerca de 0,01% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 2,5% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 80%, ou cerca de 50% a cerca de 100 %, por exemplo, cerca de 0,01% a 100%, cerca de 0,1% a cerca de 99%, cerca de 1% a cerca de 97%, ou cerca de 10% a cerca de 95%, por exemplo, cerca de 0,001%, cer- ca de 0,002%, cerca de 0,003%, cerca de 0,004%, cerca de 0,005%, cerca de 0,006%, cerca de 0,007%, cerca de 0,008%, cerca de 0,009%, cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07 %, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cer- ca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cer- ca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30 %, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de
50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cer- ca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100%.
[00232] Dispositivo(s) da invenção, quando os eletrodos são conec- tados à fonte de potencial elétrico e energizados, geram um campo elétrico localizado na zona de eletroporação que eletroporam as célu- las que passam. Em alguns casos, o campo elétrico gerado na zona de eletroporação tem uma magnitude de cerca de 2 V / cm a cerca de
50.000 V / cm, por exemplo, cerca de 2 V / cm a cerca de 1.000 V / cm, cerca de 100 V / cm a cerca de 5.000 V / cm, cerca de 500 V / cm a cerca de 10.000 V / cm, cerca de 1000 V / cm a cerca de 25.000 V / cm, ou de cerca de 5.000 V / cm a cerca de 50.000 V / cm, por exem- plo, de cerca de 2 V / cm a cerca de 20.000 V / cm, cerca de 5 V / cm a cerca de 10.000 V / cm, ou cerca de 100 V / cm a cerca de 1.000 V / cm, por exemplo, de cerca de 2 V / cm, cerca de 3 V / cm, cerca de 4 V / cm, cerca de 5 V / cm, cerca de 6 V / cm, cerca de 7 V / cm, cerca de 8 V / cm, cerca de 9 V / cm, cerca de 10 V / cm, cerca de 20 V / cm, cerca de 30 V / cm, cerca de 40 V / cm, cerca de 50 V / cm, cerca de 60 V / cm, cerca de 70 V / cm, cerca de 80 V / cm, cerca de 90 V / cm, cerca de 100 V / cm, cerca de 200 V / cm, cerca de 300 V / cm, cerca de 400 V / cm, cerca de 500 V / cm, cerca de 600 V / cm, cerca de 700 V / cm, cerca de 800 V / cm, cerca de 900 V / cm, cerca de 1.000 V / cm, cerca de 2.000 V / cm, cerca de 3.000 V / cm, cerca de 4.000 V / cm, cerca de 5.000 V / cm, cerca de 6.000 V / cm, cerca de 7.000 V / cm, cerca de 8.000 V / cm, cerca de 9.000 V / cm, cerca de 10.000 V / cm, cerca de 15.000 V / cm, cerca de 20.000 V / cm, cerca de 25.000 V / cm, cerca de 30.000 V / cm, cerca de 35.000 V / cm, cerca de
40.000 V / cm, cerca de 45.000 V / cm ou cerca de 50.000 V / cm.
[00233] Os sistemas da invenção incluem tipicamente uma fonte de distribuição de fluido que é configurada para fornecer a pluralidade de células suspensas no fluido através do primeiro eletrodo, por exemplo, a zona de entrada, para o segundo eletrodo, por exemplo, a zona de recuperação. Fontes de distribuição de fluido normalmente incluem bombas, incluindo, mas não se limitando a, bombas de seringa, micro- bombas ou bombas peristálticas. Alternativamente, os fluidos podem ser fornecidos pelo deslocamento de um fluido de trabalho contra um reservatório do fluido a ser distribuído ou por deslocamento de ar. Ou- tras fontes de distribuição de fluido são conhecidas na técnica. Em al- guns casos, a fonte de distribuição de fluido é configurada para células de fluxo suspensas em um fluido pela aplicação de uma pressão posi- tiva. Sem desejar estar limitado por qualquer teoria particular, a taxa de fluxo na qual as células em uma suspensão fluem através dos dis- positivos da invenção e a geometria específica da zona de eletropora- ção dos dispositivos da invenção irão determinar o tempo de residên- cia das células no campo elétrico na zona de eletroporação.
[00234] Em alguns casos, a taxa de fluxo volumétrico de fluido dis- tribuído de uma fonte de distribuição de fluido tem uma taxa de fluxo volumétrico de cerca de 0,001 mL / min a cerca de 1.000 mL / min, por exemplo, de cerca de 0,001 mL / min a cerca de 0,1 mL / min, cerca de 0,01 mL / min a cerca de 1 mL / min, cerca de 0,1 mL / min a cerca de 10 mL / min, cerca de 1 mL / min a cerca de 50 mL / min, cerca de 10 mL / min a cerca de 100 mL / min, cerca de 25 mL / min a cerca de 200 mL / min, cerca de 50 mL / min a cerca de 400 mL / min, cerca de 100 mL / min a cerca de 600 mL / min, cerca de 300 mL / min a cerca de 800 mL / min, ou cerca de 500 mL / min a cerca de 1.000 mL / min, por exemplo, cerca de 0,001 mL / min, cerca de 0,002 mL / min, cerca de 0,003 mL / min, cerca de 0,004 mL / min, cerca de 0,005 mL / min, cerca de 0,006 mL / min, cerca de 0,007 mL / min, cerca de 0,008 mL / min, cerca de 0,009 mL / min, cerca de 0,01 mL / min, cerca de 0,02 mL / min, cerca de 0,03 mL / min, cerca de 0,04 mL / min, cerca de
0,05 mL / min, cerca de 0,06 mL / min, cerca de 0,07 mL / min, cerca de 0,08 mL / min, cerca de 0,09 mL / min, cerca de 0,1 mL / min, cerca de 0,2 mL / min, cerca de 0,3 mL / min, cerca de 0,4 mL / min, cerca de 0,5 mL / min, abo ut 0,6 mL / min, cerca de 0,7 mL / min, cerca de 0,8 mL / min, cerca de 0,9 mL / min, cerca de 1 mL / min, cerca de 2 mL / min, cerca de 3 mL / min, cerca de 4 mL / min, cerca de 5 mL / min, cerca de 6 mL / min, cerca de 7 mL / min, cerca de 8 mL / min, cerca de 9 mL / min, cerca de 10 mL / min, cerca de 15 mL / min, cerca de 20 mL / min, cerca de 25 mL / min, cerca de 30 mL / min, cerca de 35 mL / min, cerca de 40 mL / min, cerca de 45 mL / min, cerca de 50 mL / min, cerca de 55 mL / min, cerca de 60 mL / min, cerca de 65 mL / min, cerca de 70 mL / min, cerca de 75 mL / min, cerca de 80 mL / min, cerca de 85 mL / min, cerca de 90 mL / min, cerca de 95 mL / min, cerca de 100 mL / min, cerca de 150 mL / min, cerca de 200 mL / min, cerca de 250 mL / min, cerca de 300 mL / min, cerca de 350 mL / min, cerca de 400 mL / min, cerca de 450 mL / min, cerca de 500 mL / min, cerca de 550 mL / min, cerca de 600 mL / min, cerca de 650 mL / min, cerca de 700 mL / min, cerca de 750 mL / min, cerca de 800 mL / min, cerca de 850 mL / min, cerca de 900 mL / min, cerca de 950 mL / min, ou cerca de 1.000 mL / min. Em modalidades particulares, a taxa de fluxo é de 10 mL / min a cerca de 100 mL / min, por exemplo, cerca de 10 mL / min, 20 mL / min, 30 mL / min, 40 mL / min, 50 mL / min, 60 mL / min, 70 mL / min, 80 mL / min, 90 mL / min ou 100 mL / min.
[00235] O tempo de residência das células na zona de eletropora- ção dos dispositivos da invenção pode ser de cerca de 0,5 ms a cerca de 50 ms, por exemplo, de cerca de 0,5 ms a cerca de 5 ms, cerca de 1 ms a cerca de 10 ms, cerca de 5 ms a cerca de 15 ms, cerca de 10 ms a cerca de 20 ms, cerca de 15 ms a cerca de 25 ms, cerca de 20 ms a cerca de 30 ms, cerca de 25 ms a cerca de 35 ms, cerca de 30 ms a cerca de 40 ms, cerca de 35 ms a cerca de 45 ms, ou cerca de
40 ms a cerca de 50 ms, por exemplo, cerca de 0,5 ms, cerca de 0,6 ms, cerca de 0,7 ms, cerca de 0,8 ms, cerca de 0,9 ms, cerca de 1 ms, cerca de 1,5 ms, cerca de 2 ms, cerca de 2,5 ms, cerca de 3 ms, cerca de 3,5 ms, cerca de 4 ms, cerca de 4,5 ms, cerca de 5 ms, cerca de 5,5 ms, cerca de 6 ms, cerca de 6,5 ms, cerca de 7 ms, cerca de 7,5 ms, cerca de 8 ms, cerca de 8,5 ms, cerca de 9 ms, cerca de 9,5 ms, cerca de 10 ms, cerca de 10,5 ms, cerca de 11 ms, cerca de 11,5 ms, cerca de 12 ms, cerca de 12,5 ms, cerca de 13 ms, cerca de 13,5 ms, cerca de 14 ms, cerca de 14,5 ms, cerca de 15 ms, cerca de 20 ms, cerca de 25 ms, cerca de 30 ms, cerca de 35 ms, cerca de 40 ms, cer- ca de 45 ms ou cerca de 50 ms. Em algumas modalidades, o tempo de residência é de 5-20 ms (por exemplo, de 6-18 ms, 8-15 ms ou 5-14 ms).
[00236] Os sistemas da invenção tipicamente apresentam um alo- jamento que contém e suporta o(s) dispositivo(s) da invenção e quais- quer conexões elétricas necessárias, por exemplo, conexões de ele- trodo. O alojamento pode ser configurado para reter e energizar um único dispositivo da invenção ou, alternativamente, pode ser configu- rado para reter e simultaneamente energizar uma pluralidade de dis- positivos da invenção. Por exemplo, na modalidade de um sistema da invenção mostrado nas Figs. 2A-2B, o alojamento é configurado como um rack que pode aceitar e simultaneamente energizar 96 dispositivos individuais da invenção operando em paralelo. O alojamento pode in- cluir um controlador térmico que é capaz de regular a temperatura dos dispositivos da invenção ou regular termicamente um componente do sistema, por exemplo, um fluido, por exemplo, um tampão ou suspen- são contendo células, durante a eletroporação. O controlador térmico pode ser configurado para aquecer os dispositivos da invenção, ou um componente de um sistema dos mesmos, resfriar os dispositivos da invenção ou um componente de um sistema dos mesmos, ou executar ambas as operações. Quando configurados para aquecer os dispositi- vos da invenção, ou um componente de um sistema do mesmo, os controladores térmicos adequados incluem, mas não estão limitados a, blocos de aquecimento ou mantos, aquecimento de líquido, por exem- plo, banhos de fluido de imersão ou de circulação, aquecedores ope- rados por bateria ou aquecedores resistivos, por exemplo, aquecedo- res de filme fino, por exemplo, fita térmica. Quando configurados para resfriar os dispositivos da invenção, ou um componente de um sistema do mesmo, os controladores térmicos adequados incluem, mas não estão limitados a, resfriamento de líquido, por exemplo, banhos de flu- ido de imersão ou circulação, resfriadores evaporativos ou termoelétri- cos, por exemplo, resfriadores Peltier. Por exemplo, quando implemen- tado com resfriamento de líquido, um dispositivo da invenção ou um alojamento configurado para conter dispositivos da invenção pode es- tar em contato direto com a tubulação que circula um fluido resfriado ou rodeado por uma camisa de resfriamento incluindo tubulação que circula um fluido resfriado. Outros elementos de aquecimento e resfri- amento são conhecidos na técnica.
[00237] Os sistemas da invenção podem incluir uma ou mais estru- turas externas que são configuradas para cobrir os eletrodos de um ou mais dispositivos da invenção, por exemplo, para reduzir a exposição do usuário final a conexões elétricas ativas. Normalmente, um disposi- tivo da invenção (por exemplo, um dispositivo FlowfectTM) incluirá uma estrutura externa que cobre seus eletrodos e zona de eletroporação. A estrutura externa pode ser um material não condutivo, por exemplo, um polímero não condutivo, que inclui características estruturais para engatar eletromecanicamente as partes do dispositivo, por exemplo, os eletrodos ou a zona de eletroporação. A estrutura externa pode in- cluir um ou mais recessos, recortes ou aberturas semelhantes dentro da estrutura para acomodar o dispositivo. A estrutura externa pode ser configurada para ser um componente que pode ser removido do dis- positivo. Por exemplo, a estrutura externa pode incluir dois componen- tes separados conectados por uma dobradiça, por exemplo, uma do- bradiça viva, de modo que possa ser dobrada sobre o dispositivo da invenção. Alternativamente, a estrutura externa pode ser uma ou mais peças separadas que podem ser conectadas entre si usando recursos de acoplamento adequados para formar uma única estrutura. Nessas modalidades, a estrutura externa pode ser fixada ao dispositivo da in- venção usando qualquer fixador adequado, por exemplo, fechos, tra- vas, botão ou clipes, que podem ser integrados na estrutura externa ou externamente conectados à estrutura externa. Outros tipos de fixa- dores adequados são conhecidos na técnica. Em algumas modalida- des, a estrutura externa inclui um ou mais recursos de alinhamento, por exemplo, pinos, divots, ranhuras ou abas, que garantem o alinha- mento correto de uma ou mais peças da estrutura externa. Em alguns casos, a estrutura externa é configurada para ser permanentemente conectada aos dispositivos da invenção.
[00238] Em qualquer uma das modalidades da estrutura externa aqui descrita, a estrutura externa fornece conexão elétrica entre uma fonte externa de potencial elétrico e os eletrodos dos dispositivos da invenção. Por exemplo, a estrutura externa pode incluir uma ou mais entradas elétricas para conexões elétricas, por exemplo, pás, plugues banana ou baioneta, por exemplo, BNC, conectores, que facilitam a conexão elétrica entre a fonte de potencial elétrico e os eletrodos dos dispositivos da invenção dentro da estrutura externa.
[00239] Dispositivos e estruturas externas da invenção podem ser combinados com componentes externos adicionais, tais como reagen- tes, por exemplo, tampões, por exemplo, transfecção ou tampões de recuperação e / ou amostras, em um kit. Em alguns casos, um tampão de transfecção inclui uma composição apropriada para eletroporação celular. Em alguns casos, o tampão de transfecção inclui uma concen- tração adequada de um ou mais sais (por exemplo, cloreto de potás- sio, cloreto de sódio, fosfato de potássio, di-hidrogenofosfato de potás- sio) ou açúcares (por exemplo, dextrose ou mio-inositol), ou qualquer combinação dos mesmos, em uma concentração de 0,1 a 200 mM (por exemplo, de 0,1 a 1,0 mM, de 1,0 mM a 10 mM, ou de 10 mM a 100 mM). Métodos
[00240] A invenção apresenta métodos de introdução de uma com- posição, por exemplo, transfecção, em pelo menos uma porção de uma pluralidade de células suspensas em um fluido, usando os dispo- sitivos de eletroporação aqui descritos. Os métodos descritos neste documento podem ser usados para aumentar significativamente o ren- dimento da distribuição de composições em tipos de células, muitas vezes considerado um gargalo nos campos de pesquisa de modifica- ção genética e campos terapêuticos de terapias celulares modificadas por genes. Em particular, os métodos descritos neste documento au- mentaram significativamente o número de células recuperadas, a efici- ência de transfecção e a viabilidade celular após a transfecção com aplicações para mais tipos de células do que os métodos típicos de transfecção, por exemplo, transfecção lentviral ou instrumentos de transfecção de células comercialmente disponíveis, por exemplo, o NEON® Transfection System (Thermo Fisher, Carlsbad, CA) ou o NU- CLEOFECTOR 4D (Lonza, Suíça).
[00241] Uma composição é introduzida em pelo menos uma porção de uma pluralidade de células suspensas em um fluido, passando o fluido com as células suspensas, também contendo a composição a ser introduzida nas células, através de um dispositivo da invenção, por exemplo, um dispositivo de eletroporação, conforme descrito aqui. A composição e as células suspensas no fluido podem ser distribuídas através do dispositivo da invenção pela aplicação de uma pressão po- sitiva, por exemplo, de uma bomba conectada a uma fonte de fluido, por exemplo, uma bomba peristáltica, uma pipeta digital ou fonte de manipulação de líquidos automatizada. A composição e as células suspensas no fluido passam do primeiro eletrodo, por exemplo, inclu- indo e zona de entrada, para uma zona de eletroporação fluidamente conectada ao primeiro eletrodo e, em seguida, para a zona de recupe- ração, que está fluidamente conectada à zona de eletroporação. À medida que a composição e as células suspensas no fluido fluem atra- vés do primeiro eletrodo para a zona de eletroporação, uma diferença de potencial é aplicada ao primeiro e ao segundo eletrodos, produzin- do e, assim, expondo as células a um campo elétrico na zona de ele- troporação. A exposição das células ao campo elétrico gerado intensi- fica a permeabilidade temporária da pluralidade de células, introduzin- do assim a composição em pelo menos uma porção da pluralidade de células.
[00242] Em alguns casos dos métodos, o fenótipo das células pode ou não ser alterado em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletroporação dos dispositivos da invenção. Em alguns casos, o fenótipo das células é alterado de 0% a cerca de 25% em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletroporação dos dispositivos da invenção, por exemplo, de cerca de 0% a cerca de 2,5%, de cerca de 1% a cerca de 5%, de cerca de 1% a cerca de 10%, de cerca de 5% a cerca de 15%, de cerca de 10% a cerca de 20%, de cerca de 15% a cerca de 25%, ou de cerca de 20% a cerca de 25%, por exemplo, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cer-
ca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, ou cerca de 25%. Em casos particulares, a pluralidade de células não tem altera- ção fenotípica ao sair da zona de eletroporação. Por exemplo, uma linha de base ou medição de controle para estabelecer o fenótipo celu- lar pode ser a medição da expressão de um marcador de superfície celular em células que não foram transfectadas usando dispositivos da invenção. Uma medição idêntica correspondente da expressão do mesmo marcador de célula em células que foram transfectadas usan- do dispositivos da invenção pode ser usada para avaliar mudanças no fenótipo celular. O fenótipo celular é avaliado por meio de análise de citometria de fluxo da expressão do marcador de superfície celular pa- ra garantir que o fenótipo celular seja minimamente alterado ou inalte- rado após a eletroporação. Exemplos de marcadores de superfície ce- lular a serem avaliados incluem, mas não estão limitados a, CD3, CD4, CD8, CD19, CD45RA, CD45RO, CD28, CD44, CD69, CD80, CD86, CD206, receptor IL-2, CTLA4, OX40, PD -1 e TIM3. A morfologia celu- lar é avaliada usando campo claro ou microscopia fluorescente para confirmar a falta de alterações fenotípicas após a eletroporação.
[00243] Em alguns casos, após a introdução da composição em pe- lo menos uma porção da pluralidade de células, a pluralidade de célu- las é armazenada em um tampão de recuperação. O tampão de recu- peração é configurado para promover o fechamento final dos poros que se formaram na pluralidade de células. Os tampões de recupera- ção normalmente incluem meios de cultura de células que podem in- cluir outros ingredientes para nutrição e crescimento celular, por exemplo, soro, minerais, etc. Um versado na técnica pode apreciar que a escolha do tampão de recuperação dependerá do tipo de célula submetida à eletroporação.
[00244] Em algumas modalidades do método aqui descrito, o volu- me de fluido com as células suspensas e a composição a ser introdu-
zida nas células que fluem através da zona de eletroporação dos dis- positivos da invenção podem ser de cerca de 0,001 mL a cerca de 2000 mL, cerca de 0,001 mL a cerca de 1000 mL, por exemplo, 0,001 mL a cerca de 1000 mL, por exemplo, de cerca de 0,001 mL a cerca de 0,1 mL, cerca de 0,01 mL a cerca de 1 mL, cerca de 0,1 mL a cerca de 5 mL, cerca de 1 mL a cerca de 10 mL, cerca de 2,5 mL a cerca de 20 mL, cerca de 5 mL a cerca de 40 mL, cerca de 10 mL a cerca de 60 mL, cerca de 30 mL a cerca de 80 mL, cerca de 50 mL a cerca de 200 mL, cerca de 100 mL a cerca de 500 mL, ou 250 mL a cerca de 750 mL, ou cerca de 500 mL a cerca de 1000 mL, por exemplo, cerca de 0,01 mL a 100 mL, cerca de 0,1 mL a cerca de 99 mL, cerca de 1 mL a cerca de 97 mL, ou cerca de 10 mL a cerca de 95 mL, por exemplo, cerca de 0,0025 mL a cerca de 10 mL, cerca de 0,01 mL a cerca de 1 mL, ou cerca de 0,025 mL a cerca de 0,1 mL, por exemplo, cerca de 0,001 mL, cerca de 0,0025 mL, cerca de 0,005 mL, cerca de 0,0075 mL, cerca de 0,01 mL, cerca de 0,025 mL, cerca de 0,05 mL, cerca de 0,075 mL, cerca de 0,1 mL, cerca de 0,25 mL, cerca de 0,5 mL, cerca de 0,75 mL, cerca de 1 mL, cerca de 2 mL, cerca de 3 mL, cerca de 4 mL, cerca de 5 mL, cerca de 6 mL, cerca de 7 mL, cerca de 8 mL, cer- ca de 9 mL, cerca de 10 mL, cerca de 15 mL, cerca de 20 mL, cerca de 25 mL, cerca de 30 mL, cerca de 35 mL, cerca de 40 mL, cerca de 45 mL, cerca de 50 mL, cerca de 55 mL, cerca de 60 mL, cerca de 65 mL, cerca de 70 mL, cerca de 75 mL, cerca de 80 mL, cerca de 85 mL, cerca de 90 mL, cerca de 95 mL, cerca de 100 mL, cerca de 150 mL, cerca de 200 mL, cerca de 250 mL, cerca de 300 mL, cerca de 350 mL, cerca de 400 mL, cerca de 450 mL, cerca de 500 mL, cerca de 550 mL, cerca de 600 mL, cerca de 650 mL, cerca de 700 mL, cerca de 750 mL, cerca de 800 mL, cerca de 850 mL, cerca de 900 mL, cer- ca de 950 mL ou cerca de 1.000 m.
[00245] Em certos aspectos, a condutividade elétrica do fluido onde as células estão suspensas pode afetar a eletroporação e, assim, a distribuição de uma composição às células na suspensão. A condutivi- dade do fluido com as células suspensas pode ser de cerca de 0,001 mS a cerca de 500 mS, por exemplo, de cerca de 0,001 mS a cerca de 0,1 mS, cerca de 0,01 mS a cerca de 1 mS, cerca de 0,1 mS a cerca de 10 mS, cerca de 1 mS a cerca de 50 mS, cerca de 10 mS a cerca de 100 mS, cerca de 25 mS a cerca de 200 mS, cerca de 50 mS a cerca de 400 mS, ou cerca de 100 mS a cerca de 500 mS, por exem- plo, cerca de 0,01 mS a cerca de 100 mS, cerca de 0,1 mS a cerca de 50 mS, ou cerca de 1 a 20 mS, por exemplo, cerca de 0,001 mS, cerca de 0,002 mS, cerca de 0,003 mS, cerca de 0,004 mS, cerca de 0,005 mS, cerca de 0,006 mS, cerca de 0,007 mS, cerca de 0,008 mS, cerca de 0,009 mS, cerca de 0,01 mS, cerca de 0,02 mS, cerca de 0,03 mS, cerca de 0,04 mS, cerca de 0,05 mS, cerca de 0,06 mS, cerca de 0,07 mS, cerca de 0,08 mS, cerca de 0,09 mS, cerca de 0,1 mS, cerca de 0,2 mS, cerca de 0,3 mS, cerca de 0,4 mS, cerca de 0,5 mS, cerca de 0,6 mS, cerca de 0,7 mS, cerca de 0,8 mS, cerca de 0,9 mS, cerca de 1 mS, cerca de 2 mS, cerca de 3 mS, cerca de 4 mS, cerca de 5 mS, cerca de 6 mS, cerca de 7 mS, cerca de 8 mS, cerca de 9 mS, cerca de 10 mS, cerca de 15 mS, cerca de 20 mS, cerca de 25 mS, um cer- ca de 30 mS, cerca de 35 mS, cerca de 40 mS, cerca de 45 mS, cerca de 50 mS, cerca de 55 mS, cerca de 60 mS, cerca de 65 mS, cerca de 70 mS, cerca de 75 mS, cerca de 80 mS, cerca de 85 mS, cerca de 90 mS, cerca de 95 mS, cerca de 100 mS, cerca de 150 mS, cerca de 200 mS, cerca de 250 mS, cerca de 300 mS, cerca de 350 mS, cerca de 400 mS, cerca de 450 mS ou cerca de 500 mS.
[00246] Os métodos da invenção podem fornecer composições a uma variedade de tipos de células, incluindo, mas não se limitando a, células de mamíferos, eucariotas, procariotas, células sintéticas, célu- las humanas, células animais, células vegetais, células primárias, li-
nhagens celulares, células em suspensão, células aderentes, células não estimuladas, células estimuladas ou células ativadas, células imu- nes, células-tronco (por exemplo, células-tronco pluripotentes induzi- das por humanos primários, por exemplo, iPSCs, células-tronco em- brionárias, por exemplo, ESCs, células-tronco mesenquimais, por exemplo, MSCs ou células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, HSCs), células sanguíneas (por exemplo, glóbulos vermelhos), células T (por exemplo, células T humanas primárias), células B, células apre- sentadoras de antígenos (APCs), células assassinas naturais (NK) (por exemplo, células NK humanas primárias), monócitos (por exem- plo, monócitos humanos primários), macrófagos (por exemplo, macró- fagos humanos primários) e células mononucleares do sangue perifé- rico (PBMCs), neutrófilos, células dendríticas, células de rim embrioná- rio humano (por exemplo, HEK-293) ou células de ovário de hamster Chinês (por exemplo, CHO-K1). Os números de células típicas que podem ser eletroporadas podem ser de cerca de 104 células a cerca de 1012 células, (e.g., cerca de 104 células a cerca de 105 células, cer- ca de 104 células a cerca de 106 células, cerca de 104 células a cerca de 107 células, cerca de 5x104 células a cerca de 5x105 células, cerca de 105 células a cerca de 106 células, cerca de 105 células a cerca de 107 células, cerca de 2,5x105 células a cerca de 106 células, cerca de 5x105 células a cerca de 5x106 células, cerca de 106 células a cerca de 107 células, cerca de 106 células a cerca de 108 células, cerca de 106 células a cerca de 1012 células, cerca de 5x106 células a cerca de 5x107 células, cerca de 107 células a cerca de 108 células, cerca de 107 células a cerca de 109 células, cerca de 107 células a cerca de 1012 células, cerca de 5x107 células a cerca de 5x108 células, cerca de 108 células a cerca de 109 células, cerca de 108 células a cerca de 1010 células, cerca de 108 células a cerca de 1012 células, cerca de 5x108 células a cerca de 5x109 células, cerca de 109 células a cerca de 1010 células, cerca de 109 células a cerca de 1011 células, cerca de 1010 cé- lulas a cerca de 1011 células, cerca de 1010 células a cerca de 1012 cé- lulas, ou cerca de 1011 células a cerca de 1012 células, e.g., cerca de 104 células, cerca de 2,5x104 células, cerca de 5x104 células, cerca de 105 células, cerca de 2,5x105 células, cerca de 5x105 células, cerca de 106 células, cerca de 2,5x106 células, cerca de 5x106 células, cerca de 107 células, cerca de 2,5x107 células, cerca de 5x107 células, cerca de 108 células, cerca de 2,5x108 células, cerca de 5x108 células, cerca de 109 células, cerca de 2,5x109 células, cerca de 5x109 células, cerca de 1010 células, cerca de 5x1010 células, cerca de 1011 células, ou cerca de 1012 células).
[00247] As concentrações celulares, ou seja, o número de células por mL de fluido, para atingir números de poração celular de cerca de 104 células a cerca de 1012 células tipicamente varia de cerca de 103 células/mL a cerca de 1011 células/mL, por exemplo, cerca de 103 célu- las/mL a cerca de 104 células/mL, cerca de 5x103 células/mL a cerca de 5x104 células/mL, cerca de 105 células/mL a cerca de 105 célu- las/mL, cerca de 5x105 células/mL a cerca de 5x106 células/mL, cerca de 106 células/mL a cerca de 107 células/mL, cerca de 5x106 célu- las/mL a cerca de 5x107 células/mL, cerca de 107 células/mL a cerca de 108 células/mL, cerca de 5x107 células/mL a cerca de 5x108 célu- las/mL, cerca de 108 células/mL a cerca de 109 células/mL, cerca de 5x108 células/mL a cerca de 5x109 células/mL, cerca de 109 células/mL a cerca de 109 células/mL, cerca de 5x109 células/mL a cerca de 5x1010 células/mL, ou cerca de 1010 células/mL a cerca de 1011 célu- las/mL, por exemplo, cerca de 103 células/mL, cerca de 5x103 célu- las/mL, cerca de 104 células/mL, cerca de 5x104 células/mL, cerca de 105 células/mL, cerca de 5x105 células/mL, cerca de 106 células/mL, cerca de 5x106 células/mL, cerca de 107 células/mL, cerca de 5x107 células/mL, cerca de 108 células/mL, cerca de 5x108 células/mL, cerca de 109 células/mL, cerca de 5x109 células/mL, cerca de 1010 célu- las/mL, cerca de 5x1010 células/mL, ou cerca de 1011 células/mL.
[00248] Os métodos da invenção aqui descritos podem fornecer qualquer composição às células suspensas no fluido. As composições que podem ser distribuídas às células incluem, mas não estão limita- das a, agentes terapêuticos, vitaminas, nanopartículas, moléculas car- regadas, por exemplo, íons em solução, moléculas não carregadas, ácidos nucleicos, por exemplo, DNA ou RNA, complexo CRISPR-Cas, proteínas, polímeros, uma ribonucleoproteína (RNP), nucleases modi- ficadas, nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs), nucleases dedo de zinco (ZFNs), nucleases homing, me- ganucleases (MNs), megaTALs, enzimas, peptídeos, transposons ou polissacarídeos, dextrano, por exemplo, sulfato de dextrano. Composi- ções exemplificativas que podem ser distribuídas às células em uma suspensão incluem ácidos nucleicos, oligonucleotídeos, anticorpos (ou um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento biespecífico, um fragmento triespecífico, Fab, F(ab')2, ou um fragmento variável de cadeia única (scFv)), aminoácidos, peptídeos, proteínas, terapia de gene, terapia de modificação de genoma, terapia de modificação de epigenoma, carboidratos, drogas químicas, agentes de contraste, par- tículas magnéticas, grânulos de polímero, nanopartículas de metal, micropartículas de metal, pontos quânticos, antioxidantes, agentes an- tibióticos, hormônios, nucleoproteínas, polissacarídeos, glicoproteínas, lipoproteínas, esteroides, agentes anti-inflamatórios, agentes antimi- crobianos, agentes quimioterápicos, exossomos, vesículas de mem- brana externa, vacinas, vírus, bacteriófagos, adjuvantes, minerais e combinações dos mesmos. Uma composição a ser distribuída pode incluir um único composto, como os compostos aqui descritos. Alterna- tivamente, a composição a ser distribuída pode incluir uma pluralidade de compostos ou componentes direcionados a genes diferentes.
[00249] As concentrações típicas da composição no fluido podem ser de cerca de 0,0001 µg / mL a cerca de 1000 µg / mL, (por exemplo, de cerca de 0,0001 µg / mL a cerca de 0,001 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL a cerca de 0,01 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL a cerca de 5 µg / mL, cerca de 0,005 µg / mL a cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL a cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL a cerca de 1 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL a cerca de 1 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL a cerca de 5 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 10 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 1 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 2,5 µg / mL a cerca de 15 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 25 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 5 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 7,5 µg / mL a cerca de 75 µg / mL, cerca de 10 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 10 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 50 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 250 µg / mL, cerca de 25 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 100 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 250 µg / mL, cerca de 50 µg / mL a cerca de 750 µg / mL, cerca de 100 µg / mL a cerca de 300 µg / mL, cerca de 100 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 200 µg / mL a cerca de 400 µg / mL, cerca de 250 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 350 µg / mL a cerca de 500 µg / mL, cerca de 400 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, cerca de 500 µg / mL a cerca de 750 µg / mL, cerca de 650 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, ou cerca de 800 µg / mL a cerca de 1.000 µg / mL, por exemplo, cerca de 0,0001 µg / mL, cerca de 0,0005 µg / mL, cerca de 0,001 µg / mL, cerca de 0,005 µg / mL, cerca de 0,01 µg / mL, cerca de 0,02 µg / mL, cerca de 0,03 µg / mL, cerca de 0,04 µg / mL, cerca de 0,05 µg / mL, cerca de 0,06 µg / mL, cerca de 0,07 µg / mL, cerca de 0,08 µg / mL, cerca de 0,09 µg / mL, cerca de 0,1 µg / mL, cerca de 0,2 µg / mL, cerca de 0,3 µg / mL, cerca de 0,4 µg / mL, cerca de 0,5 µg / mL, cerca de 0,6 µg / mL, cerca de 0,7 µg / mL, cerca de 0,8 µg / mL, cerca de 0,9 µg / mL, cerca de 1 µg / mL, cerca de 1,5 µg / mL, cerca de 2 µg / mL, cerca de 2,5 µg / mL, cerca de 3 µg / mL, cerca de 3,5 µg / mL, cerca de 4 µg / mL, cer- ca de 4,5 µg / mL, cerca de 5 µg / mL, cerca de 5,5 µg / mL, cerca de 6 µg / mL, cerca de 6,5 µg / mL, cerca de 7 µg / mL, cerca de 7,5 µg / mL, cerca de 8 µg / mL, cerca de 8,5 µg / mL, cerca de 9 µg / mL, cer- ca de 9,5 µg / mL, cerca de 10 µg / mL, cerca de 15 µg / mL, cerca de 20 µg / mL, cerca de 25 µg / mL, cerca de 30 µg / mL, cerca de 35 µg / mL, cerca de 40 µg / mL, cerca de 45 µg / mL, cerca de 50 µg / mL, cerca de 55 µg / mL, cerca de 60 µg / mL, cerca de 65 µg / mL, cerca de 70 µg / mL, cerca de 75 µg / mL, cerca de 80 µg / mL, cerca de 85 µg / mL, cerca de 90 µg / mL, cerca de 95 µg / mL, cerca de 100 µg / mL, cerca de 200 µg / mL, cerca de 250 µg / mL, cerca de 300 µg / mL, cerca de 350 µg / mL, cerca de 400 µg / mL, cerca de 450 µg / mL, cerca de 500 µg / mL, cerca de 550 µg / mL, cerca de 600 µg / mL, cerca de 650 µg / mL, cerca de 700 µg / mL, cerca de 750 µg / mL, cerca de 800 µg / mL, cerca de 850 µg / mL, cerca de 900 µg / mL, cerca de 950 µg / mL ou cerca de 1.000 µg / mL).
[00250] Em alguns casos, a temperatura do fluido com as células suspensas e a composição é controlada usando um controlador térmi- co que é incorporado em um alojamento que suporta o(s)dispositivo (s)da invenção. A temperatura do fluido é controlada para reduzir os efeitos do aquecimento Joule originado do campo elétrico gerado na zona de eletroporação, pois uma temperatura muito alta pode com- prometer a viabilidade celular pós-eletroporação. A temperatura do flu- ido pode ser de cerca de 0°C a cerca de 50°C, por exemplo, de cerca de 0°C a cerca de 10°C, cerca de 1°C a cerca de 5°C, cerca de 2°C a cerca de 15°C, cerca de 3°C a cerca de 20°C, cerca de 4°C a cerca de 25°C, cerca de 5°C a cerca de 30°C, cerca de 7°C a cerca de 35°C, cerca de 9°C a cerca de 40°C, cerca de 10°C a cerca de 43°C, cerca de 15°C a cerca de 50°C, cerca de 20°C a cerca de 40°C, cerca de 25°C a cerca de 50°C, ou cerca de 35°C a cerca de 45°C, por exem- plo, cerca de 0°C, cerca de 1°C, cerca de 2°C, cerca de 3°C, cerca de 4°C, cerca de 5°C, cerca de 6°C, cerca de 7°C, cerca de 8°C, cerca de 9°C, cerca de 10°C, cerca de 11°C, cerca de 12°C, cerca de 13°C, cerca de 14°C, cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17°C, cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, cerca de 30°C cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C, cerca de 43°C, cerca de 44°C, cerca de 45°C, cerca de 46°C, cerca de 47°C, cerca de 48°C, cerca de 49°C, ou cerca de 50°C.
[00251] As células transfectadas usando os métodos da invenção são transfectadas de forma mais eficiente e têm maior viabilidade do que usando métodos típicos de transfecção, por exemplo, transfecção lentiviral ou instrumentos de transfecção de células disponíveis comer- cialmente, por exemplo, o NEON® Transfection System (Thermo Fis- her, Carlsbad, CA) ou NUCLEOFECTOR 4D (Lonza, Suíça). Por exemplo, a eficiência de transfecção, ou seja, a eficiência de distribuir com sucesso uma composição a uma célula, para os métodos aqui descritos, pode ser de cerca de 0,1% a cerca de 99,9%, por exemplo, de cerca de 0,1% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 2,5% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 80%, ou cerca de 50% a cerca de 99,9%, por exemplo, de cerca de 10% a cerca de 90%, de cerca de 25% a cerca de 85%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de
0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cer- ca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99,9%.
[00252] A viabilidade celular, ou seja, o número ou porcentagem de células que sobreviveram à eletroporação, das células suspensas no fluido após ter uma composição introduzida usando métodos da inven- ção aqui descritos pode ser de cerca de 0,1% a cerca de 99,9%, por exemplo, de cerca de 0,1% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 2,5% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 80%, ou cer- ca de 50% a cerca de 99,9%, por exemplo, de cerca de 10% a cerca de 90%, de cerca de 25% a cerca de 85%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cer- ca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99,9%.
[00253] O número de células recuperadas, isto é, o número de célu-
las vivas coletadas após a eletroporação, pode ser de cerca de 104 células a cerca de 1012 células, por exemplo, cerca de 104 células a cerca de 105 células, cerca de 104 células a cerca de 106 células, cerca de 104 células a cerca de 107 células, cerca de 5x104 células a cerca de 5x105 células, cerca de 105 células a cerca de 106 células, cerca de 105 células a cerca de 107 células, cerca de 2,5x105 células a cerca de 106 células, cerca de 5x105 células a cerca de 5x106 células, cerca de 106 células a cerca de 107 células, cerca de 106 células a cerca de 108 células, cerca de 106 células a cerca de 1012 células, cerca de 5x106 células a cerca de 5x107 células, cerca de 107 células a cerca de 108 células, cerca de 107 células a cerca de 109 células, cerca de 107 célu- las a cerca de 1012 células, cerca de 5x107 células a cerca de 5x108 células, cerca de 108 células a cerca de 109 células, cerca de 108 célu- las a cerca de 1010 células, cerca de 108 células a cerca de 1012 célu- las, cerca de 5x108 células a cerca de 5x109 células, cerca de 109 célu- las a cerca de 1010 células, cerca de 109 células a cerca de 1011 célu- las, cerca de 1010 células a cerca de 1011 células, cerca de 1010 células a cerca de 1012 células, ou cerca de 1011 células a cerca de 1012 célu- las, por exemplo, cerca de 104 células, cerca de 2,5x104 células, cerca de 5x104 células, cerca de 105 células, cerca de 2,5x105 células, cerca de 5x105 células, cerca de 106 células, cerca de 2,5x106 células, cerca de 5x106 células, cerca de 107 células, cerca de 2,5x107 células, cerca de 5x107 células, cerca de 108 células, cerca de 2,5x108 células, cerca de 5x108 células, cerca de 109 células, cerca de 2,5x109 células, cerca de 5x109 células, cerca de 1010 células, cerca de 5x1010 células, cerca de 1011 células, ou cerca de 1012 células.
[00254] O rendimento de recuperação, ou seja, a porcentagem de células vivas modificadas coletadas após a eletroporação, pode ser de cerca de 0,1% a cerca de 500%, por exemplo, de cerca de 0,1% a cer- ca de 5%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 2,5% a cerca de
20%, cerca de 5% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 80%, cerca de 50% a cerca de 99,9%, de cerca de 75% a cerca de 150%, de cerca de 100% a cerca de 200%, de cerca de 150% a cerca de 250%, de cerca de 200% a cerca de 300%, de cerca de 250% a cerca de 350%, de cerca de 300% a cerca de 400%, de cerca de 350% a cerca de 450%, ou de cerca de 400% a cerca de 500%, por exemplo, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,35%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cer- ca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60 %, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cer- ca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99,9%, cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150%, cerca de 160%, cerca de 170%, cerca de 180%, cerca de 190%, cerca de 200%, cerca de 210%, cerca de 220%, cerca de 230%, cerca de 240%, cerca de 250%, cerca de 260 %, cerca de 270%, cerca de 280%, cerca de 290%, cerca de 300%, cerca de 310%, cerca de 320%, cerca de 330%, cerca de 340%, cerca de 350%, cerca de 360%, cerca de 370%, cerca de 380%, cerca de 390%, cerca de 400%, cerca de 410%, cerca de 420%, cerca de 430%, cerca de 440%, cerca de 450%, cerca de 460%, cerca de 470%, cerca de 480%, cerca de 490% ou cerca de 500%.
[00255] Um versado na técnica apreciará que as condições ideais podem variar dependendo do tipo de célula ou outros fatores. Para ca- da novo tipo de célula, os seguintes parâmetros podem ser ajustados conforme necessário: forma de onda, campo elétrico, duração do pul- so, tempo de exposição do tampão, temperaturas do tampão e condi- ções pós-eletroporação.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Dispositivos e sistemas
[00256] Um dispositivo de eletroporação de fluxo contínuo e siste- ma relacionado foram projetados e fabricados para permitir que uma pluralidade de dispositivos sejam usados em paralelo para intensificar ou maximizar o número de eventos de eletroporação de células que ocorrem em uma janela de tempo fixo, desse modo intensificando ou maximizando o rendimento da modificação de células e / ou aceleran- do a descoberta biológica. O dispositivo de eletroporação é configura- do para ser compatível com os atuais sistemas automatizados de ma- nipulação de fluidos, por exemplo, distribuidores baseados em pontei- ras de pipeta, bombas robóticas de fluido, etc.
[00257] A FIG. 1A mostra um esquema de uma modalidade exem- plificativa de um dispositivo de eletroporação mostrado, nesta configu- ração, como uma ponta de pipeta. A FIG. 1A mostra uma vista de per- to de uma área ativa do dispositivo, incluindo uma zona de eletropora- ção. Este dispositivo fornece manipulação genética de fluxo contínuo de células eucarióticas e procarióticas em uma plataforma que pode ser facilmente automatizada por meio da integração com robôs de ma- nipulação de líquidos. No dispositivo das FIGS. 1A-1C, a área ativa do dispositivo inclui três zonas distintas: a zona de entrada, a zona de ele- troporação e a zona de recuperação. Na modalidade mostrada nas FIGS. 1A-1C, uma composição a ser introduzida nas células e as célu- las a serem transfectadas são colocadas na zona de entrada. As célu- las e a composição são passadas através da zona de eletroporação e as células transfectadas são dispensadas em um tampão para arma- zenamento na zona de recuperação. Assim, o espaço entre as zonas de entrada e recuperação é a zona de eletroporação e todas as três zonas estão em comunicação de fluido (por exemplo, conectadas de forma fluida), de modo que haja um caminho de fluxo através do dis- positivo.
[00258] Na modalidade mostrada na FIG. 1A, a zona de entrada e a zona de recuperação são fabricadas a partir de eletrodos ocos feitos de um material adequado, por exemplo, aço inoxidável, com o eletrodo da zona de entrada atuando como o eletrodo energizado e o eletrodo da zona de recuperação atuando como o eletrodo aterrado, comple- tando assim o circuito enquanto permite que um campo elétrico se de- senvolva entre os dois eletrodos (em combinação com a condutividade do fluido que transporta as células e a composição).
[00259] Os dispositivos de eletroporação da invenção foram proje- tados para atender aos requisitos de injeção e técnicas de fabricação de moldagem por inserção, ambas as quais são escaláveis por nature- za, e são mostradas nas FIGS. 1B e 1C. Nas FIGS. 1B e 1C, o corpo do dispositivo se integra com a zona de eletroporação, que está locali- zada entre os eletrodos de aço inoxidável comerciais, onde o campo elétrico está ativo. A geometria da zona de eletroporação foi modifica- da para exibir uma seção transversal substancialmente uniforme, re- sultando em uma exposição de campo elétrico mais previsível durante o tempo de residência da amostra de eletroporação. Usando os méto- dos de produção atuais, por exemplo, impressão 3D, cerca de 100 dispositivos por dia podem ser fabricados; isso é escalonável para mais de 10.000 dispositivos por dia usando métodos de produção em larga escala mais robustos, por exemplo, injeção e moldagem por in- serção.
[00260] Um alojamento pode ser configurado para energizar uma pluralidade de dispositivos de eletroporação, por exemplo, 96 disposi- tivos de eletroporação em paralelo em uma bandeja de ponta de pipe-
ta de 96 poços padrão da indústria com eletrodos de grade, para ener- gizar todos os dispositivos de eletroporação simultaneamente com um pulso de voltagem aplicada idêntico de modo que o campo elétrico dentro de cada dispositivo de eletroporação seja idêntico. Uma única fonte de alimentação pode ser usada para distribuir energia elétrica. Assim, pode ser necessário um mecanismo para distribuir a energia para cada dispositivo de eletroporação. Um método para implementar isso é mostrado na FIG. 2A, com uma vista explodida na FIG. 2B. Este projeto apresenta eletrodos com mola nos quais os 96 dispositivos de eletroporação individuais entram no alojamento, onde o primeiro e o segundo eletrodos de cada dispositivo de eletroporação fazem contato físico com as grades elétricas do alojamento. Os eletrodos com mola são conectados em paralelo às grades elétricas do alojamento, que por sua vez é conectado à fonte de alimentação por um único conjunto de condutores. O alojamento é reutilizável para que, uma vez conecta- do à fonte de alimentação, possa facilitar a modificação genética de até 96 amostras distintas simultaneamente. A fonte de alimentação pode incluir circuitos adicionais ou programação configurada para mo- dular a distribuição de pulso de modo que cada dispositivo individual da invenção, por exemplo, 96 dispositivos individuais, receba uma ten- são diferente ou uma forma de onda diferente. Exemplo 2 - Desenvolvimento inicial de parâmetros experimentais para transfecção ideal
[00261] Experimentos foram conduzidos para estudar os parâme- tros físicos e biológicos que influenciam a eletroporação da linhagem de células T imortalizadas Jurkat usando dispositivos da presente in- venção. Usando métodos de citometria de fluxo padrão da indústria, a viabilidade celular (medida pela exclusão de corante 7AAD) e a efici- ência de transfecção (medida pela expressão de GFP) de células Jur- kat projetadas foram avaliadas usando os dispositivos da presente in-
venção, sendo que ambas são medidas comuns de sucesso de eletro- poração no campo da distribuição genética.
A menos que especificado de outra forma, os resultados experimentais mostrados abaixo foram gerados por eletroporação de uma população de células Jurkat a uma concentração de 1x106 células em 100 L de tampão com 5 g de plasmídeo (por exemplo, plasmídeo de expressão GFP). Os experi- mentos de eletroporação foram realizados a 100 Hz com formas de onda quadradas e uma duração de pulso de 9,5 ms.
Após a incubação de 24 horas, as células foram coradas com coloração 7-AAD e anali- sadas por meio de citometria de fluxo para medir células viáveis e cé- lulas vivas que expressam GFP.
Os experimentos foram realizados em triplicata, com barras de erro representando o erro padrão da média (SEM). A Tabela 1 abaixo apresenta um sumário dos parâmetros usa- dos para transfecção usando dispositivos da invenção.
Tabela 1. Parâmetros experimentais usados na presente inven- ção.
Parâmetro [unidades] Valor Mí- Valor Ope- Valor Má- nimo racional ximo Amostras em paralelo 1, 4, 8, 12, 96 384, 1.536 24, 48 Amostras em série 1 8 12 Número do eletrodo 1 2 3+ Medidor de eletrodo 6 16 34 Diâmetro do canal [mm] 0,005 0,5 - 1,0 50 Comprimento do canal [mm] 0,005 4,0 - 8,0 50 Taxa de fluxo [mL/min] 0,001 25 1.000 Frequência [Hz] 1 100-500 50.000 Ciclo de Trabalho [%] 0,001 10-95 100 Número de pulso 1 10 1.000+ Duração do Pulso [ms] 0,01 1-10 1.000 Campo elétrico [V/cm] 2,0 100-1.000 50.000 Voltagem Aplicada [V] 10 200-600 3.000
Parâmetro [unidades] Valor Mí- Valor Ope- Valor Má- nimo racional ximo Condutividade elétrica 0,001 1-20 500 [mS/cm] Temperatura da amostra [C] 1,0 4,0-37 50 Volume da amostra [mL] 0,001 0,025-0,10 2.000.000 Número Celular 1,0E4 21E5 - 100,0E10 10E6 Células recuperadas após EP 1,0E4 1,0E6 - 100,0E10 10E6 Concentração celular [células 1,0E3 1,0E7 1,0E11 / mL] Concentração de carga útil 0,01 1-10 1.000 [g/mL] Células recuperadas [%] 0,1 50 99,9 Viabilidade celular [%] 0,1 50 99,9 Eficiência de transfecção [%] 0,1 50 99,9 Rendimento das células de 0,1 99,9 500 entrada [%] Forma de onda / forma de pul- Quadrado, Pulso, Bipolar, Senoidal, so Rampa, Bipolar Assimétrico, Alta Voltagem - Baixa Voltagem, Baixa Voltagem - Alta Voltagem, Corrente Contínua (CC), Unipolar, polaridade (+) SOMENTE, polaridade (-) SO- MENTE, Polaridade (+) / (-), Polari- dade (-) / (+) Carga útil Moléculas carregadas, moléculas não carregadas, DNA, RNA, CRISPR-Cas9, proteínas, políme- ros, ribonucleoproteína (RNP), dex- trano Material de eletrodo Aço inoxidável 304, aço inoxidável 316, ouro, platina, carbono, líquido condutivo, solução condutiva
Exemplo 3 - Dados de transfecção usando dispositivos da invenção
[00262] Os dispositivos da invenção mostram o desempenho de transfecção de pico quando a taxa de fluxo é maximizada através do canal de eletroporação (FIGS. 3A e 3B). A taxa de fluxo desejada foi alcançada utilizando uma pipeta de taxa de distribuição controlada pa- ra aumentar a viabilidade e eficiência, correspondendo a um tempo de residência de ~ 6,5 ms da amostra de célula dentro do campo elétrico. A viabilidade celular máxima de 54% foi alcançada, com eficiência de transfecção de 65%, demonstrando um avanço significativo na trans- fecção de células imunes humanas com os dispositivos da invenção.
[00263] As FIGS. 4A-4D ilustram a simulação de taxa de fluxo ao longo de uma zona ativa exemplificativa do dispositivo (isto é, de um primeiro lúmen do eletrodo, através da zona de eletroporação e para o segundo lúmen do eletrodo). Nesta modalidade, um meio contém célu- las biológicas que fluem. A partir do fluxo de fluido simulado a 10 mL / min e 100 mL / min, a velocidade linear média das amostras que pas- sam pela zona de eletroporação é determinada. A taxa de fluxo inferior de 10 mL / min resulta em uma velocidade linear média de 324 mm / s. A taxa de fluxo mais alta de 100 mL / min resulta em uma velocidade linear média de 2.990 mm / s. As duas velocidades lineares podem ser correlacionadas ao tempo de residência estimado (res) de 12,35 ms e 1,34 ms, respectivamente. Esses dispositivos forneceram uma taxa de fluxo de 16 mL por minuto. Notavelmente, para que os sistemas co- merciais resultem em eficiência de transfecção equivalente, exposi- ções de cerca de 30 ms ou mais são necessárias sob exposição de campo elétrico semelhante. Isto demonstra que a combinação de ta- xas de fluxo elevadas e campo elétrico resulta na distribuição melho- rada de material genético em células biológicas usando dispositivos da presente invenção.
[00264] A eficiência de transfecção usando dispositivos da invenção é influenciada pela intensidade do campo elétrico. As FIGS. 5A e 5B mostram a viabilidade celular e a eficiência de transfecção, respecti- vamente, que resultam de várias intensidades de campo elétrico. Uma eficiência de transfecção de 86% e uma viabilidade de 77% foram al- cançadas.
[00265] Os dispositivos da invenção mostraram aumentos de ~ 20% na viabilidade celular e na eficiência de transfecção pelo resfriamento da amostra em gelo para minimizar quaisquer efeitos térmicos deleté- rios potenciais que podem afetar a viabilidade celular devido ao au- mento da temperatura durante a eletroporação (FIGS. 6A e 6B). A mo- delagem numérica no COMSOL Multiphysics acoplando o campo elé- trico, fluxo de fluido e efeitos térmicos também foi desenvolvida para melhor compreender o impacto da temperatura da amostra no disposi- tivo da invenção, usando uma voltagem aplicada, neste modelo, de 225 V ou 275 V. Resultados, mostrados nas FIGS. 7A-7D, mostram um campo elétrico substancialmente uniforme na zona de eletropora- ção. As FIGS. 8A-8D mostram as distribuições de temperatura no dis- positivo ao longo do tempo.
[00266] A eletroporação usando dispositivos da invenção não mos- trou mudanças significativas no desempenho quando a eletroporação foi realizada em uma faixa de durações de pulso com frequências cor- respondentes (FIGS. 9A e 9B). Ao variar o número de pulsos dentro de uma duração de 9,5 ms de 1 a 5, nenhuma mudança significativa foi observada na viabilidade ou eficiência, demonstrando a flexibilidade da forma de onda para eletroporação usando dispositivos da invenção. Nesta experiência, um pico de viabilidade celular de 83% foi alcança- do, com uma eficiência de transfecção de 88%.
[00267] A eletroporação usando dispositivos da invenção não mos- trou mudanças significativas no desempenho quando a eletroporação foi realizada em uma faixa de volumes e densidades celulares (FIGS.
10A e 10B). Ao variar o número de células em uma faixa de volumes de 25 a 100 L, nenhuma mudança significativa foi observada na viabi- lidade ou eficiência, demonstrando a flexibilidade da reação física para eletroporação usando dispositivos da invenção. Nesta experiência, um pico de viabilidade celular de 83% foi alcançado, com uma eficiência de transfecção de 86%.
[00268] A eletroporação usando dispositivos da invenção não mos- trou mudanças significativas no desempenho quando a eletroporação foi realizada em uma faixa de dimensões da seção transversal da zona de eletroporação (FIGS. 11A e 11B). Ao variar as dimensões da seção transversal da zona de eletroporação de 500 a 900 m, viabilidades semelhantes foram observadas, sem mudanças significativas na efici- ência quando as taxas de fluxo foram modificadas para coincidir com o tempo de residência total dentro da zona de eletroporação, demons- trando a flexibilidade da dimensão da seção transversal para eletropo- ração usando dispositivos da invenção. Nesta experiência, um pico de viabilidade celular de 51% foi alcançado, com uma eficiência de trans- fecção de 67%.
[00269] A viabilidade e a eficiência dependiam das formas de onda do pulso de voltagem, como mostrado nas FIGS. 12A e 12B. Ao alterar a forma da onda, o tempo e a intensidade da corrente elétrica à qual cada célula Jurkat é exposta foram ajustados, alterando assim a viabi- lidade ou eficiência. Neste experimento, alta viabilidade celular foi ob- servada em combinação com alta eficiência de transfecção (acima de 50%) usando formas de onda quadrada, senoidal e rampa. Formas de onda exemplificativas úteis para dispositivos da invenção são mostra- das nas FIGS. 12C-12L.
[00270] As FIGS. 13A e 13B mostram a viabilidade e eficiência dos dispositivos da invenção, utilizando uma taxa de fluxo de 10-25 mL por minuto com um campo elétrico de 400-700 V / cm em condições de refrigeração. Todas as otimizações realizadas permitem a distribuição de ácidos nucleicos com uma eficiência mais alta em comparação com o sistema de transfecção NEON® de última geração disponível comer- cialmente em vários experimentos independentes (FIGS. 13A e 13B). Exemplo 4 - Aplicações dos dispositivos da invenção à modificação genética
[00271] A aplicação terapêutica de células T humanas primárias tem mostrado um avanço significativo no campo da imuno-oncologia ao direcionar o sistema imunológico do paciente para ser eficaz no combate ao câncer. Uma série de tecnologias, incluindo receptores de antígenos quiméricos e receptores de células T modificados, mostra- ram sucesso clínico nos últimos anos. No entanto, as aplicações de modificação genética do sistema imunológico do paciente permane- cem um tanto limitadas ao tratamento de cânceres do sangue, uma vez que o microambiente tumoral de tumores sólidos inibe a função das células T no local do tumor. Para superar alguns dos desafios bio- lógicos da supressão do microambiente tumoral, há um desejo de mo- dificar ainda mais as células T para serem mais eficazes, eliminando genes que expressam ligandos regulatórios na superfície das células T. A identificação desses genes é frequentemente alcançada por meio de telas CRISPR, nas quais Cas9 e bibliotecas de RNA guia são dis- tribuídos nas células T para nocautear uma ampla faixa de genes en- dógenos para alcançar intensificações funcionais contra tumores es- pecíficos. No entanto, a distribuição dessas bibliotecas continua sendo um obstáculo para a identificação de genes em tipos de células "difí- ceis de transfectar", como células T primárias e células assassinas na- turais. Normalmente, nesses casos, as bibliotecas CRISPR são distri- buídas como partículas lentivirais que infectarão as células e transdu- zirão as sequências Cas9 / RNA guia para o genoma celular, que irá então nocautear o gene de interesse de uma maneira específica para a sequência. A produção dessas bibliotecas é muito trabalhosa, exi- gindo a clonagem de plasmídeos de expressão viral e a purificação das partículas virais para distribuição. Além disso, esta metodologia deixa a "bagagem" indesejada de sequências de RNA de Cas9 / guia geneticamente incorporadas em sítios de inserção genômica aleató- rios, que podem interromper outros genes funcionais. O uso de distri- buição não viral para complexos de ribonucleoproteína Cas9 é um mé- todo atraente para superar esses obstáculos, permitindo aos pesqui- sadores rastrear um grande número de nocautes na ausência de in- corporação viral usando uma distribuição transitória de proteína Cas9 complexada com as moléculas de RNA guia.
[00272] A FIG. 13C é um fluxograma de um método para distribuir complexos de ribonucleoproteína Cas9 a células usando dispositivos da invenção. A distribuição de complexos de ribonucleoproteína Cas9 a células com eletroporação permite a análise de alto rendimento de nocautes CRISPR direcionados de uma maneira altamente eficiente, transformando o processo de descoberta de novos alvos de genes pa- ra aplicação terapêutica. Os estudos utilizam um subconjunto de ge- nes de 200-1.000 ou mais, por exemplo, 25.000, de bibliotecas de re- ceptores de superfície celular disponíveis comercialmente para identi- ficar genes que inibem a supressão do microambiente tumoral da so- brevida e persistência das células T. Exemplo 5 - Eletroporação de células humanas
[00273] As FIGS. 14A e 14B mostram dados de viabilidade e efici- ência para a eletroporação de células T humanas primárias usando dois pesos moleculares diferentes de moléculas de dextrano fluores- centes em uma intensidade de campo elétrico de 700 V / cm. Nesta experiência, um pico de viabilidade celular de 30% foi alcançado, com eficiência de transfecção de 67%, demonstrando um avanço significa- tivo na transfecção de células imunes humanas primárias usando dis-
positivos da invenção.
[00274] Em um experimento relacionado, a eletroporação usando dispositivos da invenção mostra um desempenho significativamente aumentado em comparação com NEON® na linhagem celular de mo- nócitos THP-1 (ATCC número TIB-202) usando protocolos de eletropo- ração de monócitos do sistema de transfecção NEON® publicados (FIGS. 15A e 15B). Neste experimento, a viabilidade celular aumenta- da de 56,4% foi observada usando os dispositivos da invenção, em comparação com 23,4% com o sistema de transfecção NEON®, en- quanto a eficiência de transfecção foi mantida em 6%.
[00275] A eletroporação usando dispositivos da invenção mostrou desempenho aumentado em comparação com o sistema de transfec- ção NEON® em monócitos humanos primários usando protocolos de eletroporação de monócitos do sistema de transfectação NEON® (FIGS. 16A e 16B). Neste experimento, a viabilidade celular aumenta- da de 22,3% foi observada usando dispositivos da invenção, em com- paração com 16,6% observada com o sistema de transfecção NEON®, e a eficiência de transfecção aumentada de 21,6% foi observada usando dispositivos da invenção em comparação com 4,7% observada com o sistema de transfecção NEON®.
[00276] A eletroporação usando dispositivos da invenção mostrou desempenho aumentado em comparação com o sistema de transfec- ção NEON® em experimentos independentes e para a distribuição bem-sucedida de moléculas de dextrano de 40 kDa em linhagens de células assassinas naturais do NK-92 (ATCC) (FIGS. 17A e 17B) e NK -92MI (ATCC) (FIGS. 18A e 18B). Estes resultados confirmam a capa- cidade dos dispositivos da invenção para distribuir moléculas fora do espaço do ácido nucleico com viabilidade celular comparável e eficiên- cia de transfecção melhorada para plataformas não escalonáveis co- mercialmente disponíveis.
Distribuição de mRNA de SIRPalfa para monócitos primários
[00277] Em outro estudo, a expressão transitória de SIRPalfa em monócitos humanos primários foi alcançada usando os dispositivos da invenção (FIGS. 19A-19F). Esta distribuição de um mRNA não GFP em monócitos humanos primários mostra ainda a capacidade do dis- positivo desta plataforma de transfecção de funcionar nesta população de células imunes historicamente "difícil de transfectar". Como um con- trole para esta demonstração de superexpressão, foram utilizadas cé- lulas T primárias, que são amplamente SIRPalfa negativas (apenas 3,4% das células T vivas foram positivas para o marcador de superfí- cie; FIG. 19B). Após a transfecção, 86,9% das células T vivas foram positivas para o marcador de superfície SIRPalfa (FIG. 19B). Em mo- nócitos primários, que têm uma linha de base elevada (86,5% positivos para o marcador de superfície (FIG. 19A)), a intensidade média de flu- orescência (MFI) foi quantificada para determinar se a densidade de expressão do receptor aumentou após a transfecção. Um aumento de 1,8 vezes sobre a linha de base da célula de controle na expressão de SIRPalfa foi observado 24 horas após a distribuição de mRNA (FIG. 19F). Distribuição de Cas9-RNP direcionada a CXCR4 para macrófagos primários
[00278] Cas9-RNP marcado com eGFP também foi distribuído com sucesso a macrófagos humanos derivados de monócitos usando dis- positivos da invenção. A distribuição de Cas9-RNP marcado com eGFP ao núcleo foi confirmada por microscopia e citometria de fluxo. A expressão de eGFP foi observada em até 21,4% dos macrófagos dife- renciados 24 horas após a transfecção, que caiu para 5,1% em cinco dias. Enquanto nenhuma edição de gene foi observada no ponto de tempo de 24 horas, em 48 horas, uma eficiência KO de 13,9% foi ob- servada. A eficiência de nocaute, conforme determinada por citometria de fluxo, aumentou para 16,5% no quinto dia. Modificação de células T naive com distribuição de mRNA
[00279] Células T naive isoladas (CD45RA+/CD45RO-) foram ele- troporadas com mRNA que codifica GFP usando o dispositivo da in- venção. Após 24 horas, as células foram analisadas quanto às métri- cas de viabilidade e eficiência. As contagens de células naïve e viabili- dades para células eletroporadas foram equivalentes às células não tratadas e foi observada eficiência de distribuição de ~ 40% (FIGS. 20A-20D). Além disso, as células foram coradas para marcadores de células T naive CD45RA e CD45RO. Esta coloração demonstrou que não houve mudança no fenótipo para as células eletroporadas e que as células mantiveram seu estado CD45RA+/CD45RO- naive; (FIGS. 21A e 21B). Por último, as células T naive foram expandidas com rea- gentes de ativação CD3 / CD28. Neste experimento, as taxas de cres- cimento das células eletroporadas foram equivalentes às células não tratadas em até seis dias após a ativação (FIG. 22). Exemplo 6 - Dispositivos para energizar uma pluralidade de dispositi- vos da invenção
[00280] As FIGS. 23A-23F mostram modalidades exemplificativas de dispositivos de eletroporação da invenção integrados em um dispo- sitivo externo que pode ser ainda integrado em um sistema de manipu- lação de líquidos para energizar os dispositivos da invenção e comple- tar o processo de eletroporação em uma plataforma de manipulação de líquidos automatizada. O dispositivo externo, denominado máquina de descarga eletrônica (EDM), é usado para energizar os dispositivos da invenção durante o processo de eletroporação. No dispositivo mos- trado nas FIGS. 23B, 23C e 23E, 23.1 estão feixes paralelos que se integram a trilhos de suporte. Esses feixes são intercambiáveis e per- mitem a mudança nos estilos / mecanismos de contato elétrico. Além disso, o feixe permite o posicionamento final dos contatos elétricos.
23.2 são contatos elétricos mecanicamente retráteis.
Os eletrodos usam um mecanismo em forma de mola para permitir que diferentes regiões do dispositivo deslizem por todo o EDM, enquanto mantêm contato com o corpo do dispositivo de eletroporação.
Este elemento pode ser comutado para outros contatos elétricos que são mais flexí- veis, por exemplo, feixes de mola como as mostradas na FIG. 23E ou eletrodos do tipo escova de aço. 23.3 é um reservatório do dispositivo de eletroporação da invenção. 23.4 é um trilho de suporte oscilante que permite a deflexão adicional do eletrodo, se necessário.
Este re- curso de trilho usa um mecanismo semelhante a uma mola para girar e permitir mais deflexão do contato elétrico enquanto o dispositivo de eletroporação é colocado em posição por um operador ou sistema au- tomatizado, por exemplo, um braço robótico. 23.5 é um trilho deslizan- te que permite a translação linear de uma placa de retenção de amos- tra, como a placa de amostra mostrada em 23.6. 23.7 é um sistema de alinhamento que fornece o posicionamento adequado do dispositivo de eletroporação sobre a placa de amostra.
O sistema de alinhamento é usado como um indicador visual quando não há recursos de alinha- mento automatizado, por exemplo, não há controle robótico aplicado ao EDM.
Com a aplicação de alguma forma de dispositivo de tradução linear, o sistema tem a capacidade de completar 1 ou mais amostras em qualquer formato de arranjo. 23.8 é a zona de eletroporação dos dispositivos da invenção e está fluidamente conectada à zona de en- trada 23.9 e à zona de recuperação 23.10. 23.11 é um trilho de supor- te que suporta os contatos elétricos retráteis mecanicamente (23.2). O trilho de suporte 23.11 pode ser eletricamente condutivo de modo que todos os contatos elétricos retráteis mecanicamente (23.2) possam ser energizados para um experimento de eletroporação simultâneo.
Alter- nativamente, o trilho de suporte 23.11 pode ser um material não con- dutivo que isola os contatos elétricos retráteis mecanicamente (23.2)
de modo que experimentos de eletroporação individuais possam ser realizados.
[00281] Quando configurada como um sistema automatizado, a amostra do espécime de interesse é aspirada em outro local na plata- forma de manipulação de líquidos pelos dispositivos da invenção. A amostra é então transportada para o EDM, onde os contatos do ele- trodo são suspensos sobre a superfície da placa de amostra. Os dis- positivos da invenção são então baixados para dentro do dispositivo a fim de estabelecer contato com os contatos de eletrodo do EDM. O mecanismo representado nas FIGS. 23A-23C usa uma conexão de pino pogo para fechar o circuito enquanto a modalidade das FIGS. 23D-23F usa mola flexível, por exemplo, eletrodos de feixe de mola para fechar o circuito. Métodos alternativos de conexão dos circuitos incluem o uso de fluidos condutivos ou eletrólitos, diafragmas conduti- vos que se expandiram para fazer contato ou outros materiais flexíveis condutivos que têm uma constante de mola suficiente para desviar du- rante o processo de inserção. Isto permite que o EDM seja adequado ao uso de uma variedade de dispositivos de diferentes tamanhos da invenção. O sistema pode ser usado para eletroporar uma ou mais amostras independentemente ou simultaneamente, dependendo dos objetivos experimentais. Essa tecnologia pode ser ampliada para au- mentar completamente. Por exemplo, o EDM pode ser usado com uma pluralidade de dispositivos de eletroporação da invenção ou, alternati- vamente, com um único dispositivo da invenção em um experimento de amostra única ou experimento de múltiplas amostras pela adição de dois mecanismos de tradução linear.
[00282] As FIGS. 24A e 24B fornecem modalidades de exemplo de um alojamento configurado para energizar dispositivos condutivos da invenção de uma maneira controlada por temperatura. No dispositivo da FIG. 24A, 24.1 são eletrodos ocos que são configurados para se-
rem conectados a um distribuição de manipulação de líquidos. Os ele- trodos podem ainda incorporar um colar de interação para reduzir a tensão no material do eletrodo induzida pelo atrito gerado pela cone- xão ao distribuição de manipulação de líquido. 24.2 é um canal de co- nexão que é conectado de forma fluida aos eletrodos ocos e configu- rado para amplificar o campo elétrico gerado ao energizar os eletro- dos. O canal de conexão atua ainda como uma barreira para confinar o fluxo de fluido a fim de aumentar e controlar o pulso elétrico que a amostra experimenta. 24.3 é um eletrodo de base condutivo que se conecta ao canal de conexão 24.2. 24.4 é uma base de suporte confi- gurada para conter o eletrodo oco 24.1, o canal de conexão 24.2 e o eletrodo de base condutiva 24.3. 24.5 é uma base condutiva que su- porta o eletrodo oco 24.1, conectando o canal 24.2, o eletrodo de base condutiva 24.3 e a base de suporte 24.4 e conecta eletricamente ao eletrodo de base condutiva 24.3 para completar o circuito de eletropo- ração. A base condutiva 24.5 inclui conexões de fluido 24.6 para fluir o fluido de aquecimento ou resfriamento através da base condutiva 24.5 para regular a temperatura do processo de eletroporação. Na FIG. 24B, 24.7 é uma estrutura externa que suporta os outros componen- tes.
[00283] No dispositivo, as FIGS. 24A e 24B, conforme o fluido flui do eletrodo oco 24.1, a condutividade do fluido de amostra forma um circuito fechado após a interação com a superfície dos eletrodos de base 24.3. Os eletrodos de base 24.3 podem ser de qualquer forma que permita uma exposição sistemática e controlável ao campo elétri- co que as células experimentam que induzem a eletroporação. A posi- ção dos eletrodos ocos 24.1 pode ser manipulada na coordenada Z a partir da base de suporte 24.4 a fim de limitar a exposição das células ao campo elétrico. Nesta configuração, o eletrodo de base 24.3 é ele- vado da parte inferior da base de suporte 24.4 para uma posição que fica acima de um limite de coleta de volume especificado. A célula ele- troporada experimentará um campo elétrico finito em toda a amostra (exceto para fechar o circuito de eletroporação). Este projeto reduz os efeitos de cisalhamento nas células da amostra e aumenta a uniformi- dade do fluxo na região onde ocorre a eletroporação. Além disso, para criar um campo elétrico estável ou para manipular ainda mais o campo elétrico, o canal de conexão 24.2 é adicionado à extremidade do ele- trodo oco 24.1, permitindo ao operador amplificar e controlar o pulso elétrico e, portanto, o campo elétrico, experimentado pelo espécime. Além disso, a configuração do eletrodo neste sistema usa uma confi- guração de eletrodo não paralela onde a cânula é circular e paralela ao eixo dos espécimes que fluem, mas a superfície do eletrodo de ba- se 24.3 está em algum ângulo maior que 0 grau em relação ao eixo da cânula. Uma variação desse projeto é o uso de um eletrodo suspenso que paira sobre a placa do poço. Conforme a amostra flui através da superfície do eletrodo de base 24.3 e é eletroporada, a amostra cai no poço. Nesta configuração, os eletrodos não são fisicamente fixados à placa do poço. Exemplo 7 - Dispositivos de eletroporação com base em chip fluídico
[00284] As FIGS. 25A-25B mostram modalidades exemplificativas de um dispositivo de eletroporação com base em chip fluídico que está configurado para aceitar pontas de pipeta convencionais de 1-5.000 µL padrão da indústria para introduzir amostras no dispositivo. No disposi- tivo das FIGS. 25A, 25.1 e 25.2 são eletrodos que estão fluida e eletri- camente conectados por uma zona de eletroporação. 25.3 é uma regi- ão de inserção de ponta de pipeta fluidamente conectada à zona de eletroporação e 25.4 é um reservatório de coleta. Os eletrodos 25.1 e
25.2 do dispositivo de eletroporação com base em chip fluídico são energizados por uma fonte de alimentação externa. Na vista explodida da FIG. 25B, 25.5 são pontas de pipeta, 25.6 é o dispositivo de eletro-
poração à base de chip fluídico da FIG. 25A e 25.7 mostram uma pla- ca de coleta para conter as espécies após a eletroporação.
[00285] As pontas de pipeta 25,5 pairam sobre a superfície de um dispositivo de eletroporação baseado em chip fluídico 25.6. O disposi- tivo de eletroporação com base em chip fluídico inclui dois componen- tes: uma placa de eletroporação contém um arranjo encapsulado de eletrodos e uma placa de cobertura que tem canais microfluídicos in- corporados que permitem ao usuário modular o pulso do campo elétri- co que é distribuídos às células. A placa de eletroporação permite o fluxo através da eletroporação de várias amostras simultaneamente ou individualmente, se desejado. Após a eletroporação da amostra ocor- rer na placa de eletroporação, a amostra flui em direção ao fundo da placa de coleta 25.7. Este sistema usa componentes de manipulação de líquidos padrão da indústria, por exemplo, ponteiras de pipeta de 1-
5.000 µL, facilitando a integração em distribuidores de manipulação de líquidos padrão da indústria. Exemplo 8 - Dispositivo de eletroporação de fluxo contínuo de grande volume (escalonável)
[00286] As FIGS. 26A-26B mostram modalidades exemplificativas de dispositivos de eletroporação de fluxo contínuo projetados para uso com fabricação de células de grande volume. Na modalidade mostrada na FIG. 26A, 26.1 e 26.2 são uma entrada e uma saída, respectiva- mente, para a circulação de um fluido, por exemplo, uma solução tam- pão. 26.3 é um alojamento externo que contém o dispositivo de eletro- poração. 26.4 é a zona de eletroporação e está fluidamente conectada à entrada de fluido 26.5 e à saída de fluido 26.9. Após a entrada 26,5 e antes da saída 26,9 estão os eletrodos cilíndricos 26,7 e 26,8 que pos- suem poros 26,6 em sua superfície. 26.10 é um reservatório para con- ter um fluido, por exemplo, um meio de crescimento.
[00287] Os eletrodos cilíndricos 26.7 e 26.8 nesta modalidade são feitos de material poroso condutivo que permite que o fluido se deslo- que através de seus poros 26.6 para a cavidade do dispositivo. Os po- ros 26.6 no eletrodo cilíndrico 26.7, 26.8 permitem uma solução tam- pão estabilizar as reações químicas na superfície dos eletrodos cilín- dricos 26.7, 26.8 e minimizar a transição de pH observada devido à aplicação de um potencial elétrico durante o processo de eletropora- ção. O tampão introduzido pelos eletrodos cilíndricos porosos 26.7,
26.8 permite uma mudança no fluxo de fluido para criar um fluxo de "lubrificação" ou de revestimento na superfície interna dos eletrodos cilíndricos 26.7, 26.8 ou para induzir outros elementos de dinâmica de fluidos ao processo de eletroporação (como a rotação da suspensão com células), pois é eletroporado. A redução da transição do pH reduz os efeitos negativos de grandes variações no pH dos espécimes sus- pensos usados durante a eletroporação. Eletrodos cilíndricos 26.7 e
26.8 completam os requisitos do circuito externo e permitem que o sis- tema seja energizado usando uma fonte de alimentação externa. Em uma modalidade alternativa, a saída 26.2 do dispositivo de eletropora- ção pode ser usada para remover um tampão altamente condutivo, por exemplo, um meio de crescimento ou PBS, e a entrada 26.1 pode ser usada para introduzir o tampão de baixa condutividade elétrica para minimizar o aquecimento da amostra líquida à medida que ele flui através da zona de eletroporação 26.4. Esta troca de tampão resultará em uma maior viabilidade celular e maior eficiência de transfecção que, em última análise, irá gerar um maior número de células modifi- cadas com sucesso. O tampão de baixa condutividade pode então ser extraído na saída após a zona de eletroporação e suplementado com meio de crescimento após o contato com a entrada após a zona de eletroporação. Exemplo 9 - Modelagem de campos elétricos em um novo eletrodo he- licoidal
[00288] Um dispositivo Flowfect com uma configuração de eletrodo particular para ajudar a aumentar a eficiência de transformação / trans- fecção de células em fluxo foi projetado e modelado computacional- mente. A FIG. 27A demonstra a natureza helicoidal da configuração do eletrodo que é responsável por girar o campo elétrico conforme as cé- lulas fluem através da região de eletroporação. Sem estar limitado pela teoria, esta configuração permite que uma fração maior da superfície da célula seja eletroporada e, portanto, requer campos elétricos mais baixos para obter efeitos equivalentes. As FIGS. 27B-27F mostram a área da seção transversal da região de eletroporação, vista de diferen- tes eixos. Os eletrodos energizados e aterrados são perpendiculares à direção do fluxo, em oposição à direção paralela, por exemplo, como nas FIGS. 1A-1C. Este projeto permite menor volume de amostra e voltagem aplicada reduzida, o que é desejável, por exemplo, em apli- cações como eletroporação de células humanas primárias (por exem- plo, células imunes ou células-tronco), em que o número de células é limitado. Em outra modalidade, os eletrodos helicoidais não estão em contato de fluido com a zona de eletroporação; o uso de pulsos de alta frequência pode induzir um campo elétrico dentro da zona de eletropo- ração (por exemplo, através de um meio intermediário) para distribuir a composição nas células. Exemplo 10 - Dispositivos de duas partes da invenção para escalabili- dade de fabricação
[00289] As FIGS. 28A-28C mostram uma modalidade de um dispo- sitivo da invenção que é configurado para ser fabricado em dois com- ponentes separados que se combinam para formar um dispositivo completo que é capaz de ser usado com sistemas de manipulação de líquidos disponíveis comercialmente. Nesta configuração, os eletrodos moldados por inserção, mostrados como pequenos pontos próximos à junção dos dois componentes nas Figs. 28A-28B serão então soldados juntos por meio de processos industriais estabelecidos (por exemplo, soldagem por rotação, sônica, por exemplo, ultrassônica, soldagem térmica, por exemplo, uma placa quente ou laser). Neste projeto, o flu- xo de fluido de uma amostra, por exemplo, uma amostra de DNA de célula, através do dispositivo é desacoplado da exposição ao campo elétrico necessária para a eletroporação.
[00290] As FIGS. 29A e 29B mostram o dispositivo representado nas FIGS. 28A-28C, por exemplo, dimensões internas idênticas, com 4 mm de distância entre os eletrodos moldados por inserção acima e abaixo de uma zona de eletroporação de 700 µm de diâmetro. A dife- rença entre esta modalidade do dispositivo da invenção e a modalida- de mostrada nas Figs. 28A-28C é que, neste conceito, o controle de fluxo de fluido é acoplado à exposição de campo elétrico. Especifica- mente, a cânula (mostrada no topo do dispositivo das Figs. 29A-29B) é a interface entre o sistema de manipulação de líquido e o dispositivo de eletroporação da invenção. Uma vez que o dispositivo de eletropo- ração da invenção entreliga na cânula, os eletrodos embutidos (mos- trados em vermelho no dispositivo das FIGS. 29A e 29B) estarão em conexão elétrica com a fonte de alimentação para distribuição de pulso de voltagem. Na modalidade mostrada nas FIGS. 29A-29B, uma única cânula é mostrada, mas pode ser aumentada em um sistema da in- venção para incluir uma pluralidade de dispositivos de eletroporação da invenção, por exemplo, um sistema contendo 96 ou 384 dispositi- vos de eletroporação da invenção configurados para eletroporar célu- las suspensas em um fluido em paralelo. Exemplo 11 - Exemplos de alojamento e interfaces
[00291] As FIGS. 30A e 30B fornecem modalidades exemplificati- vas de dispositivos da invenção que mostram um alojamento externo incluindo uma interface de usuário (FIG. 30A) e uma pluralidade de dispositivos da invenção fluidamente conectados a um distribuidor de distribuição de líquido e uma placa de amostra (FIG. 30B).
[00292] A FIG. 30A é uma modalidade do sistema de transfecção / transformação de fluxo contínuo. O modelo 3D mostra um sistema de eletroporação autônomo que contém uma interface de usuário com tela de toque (30.1) ou outra(s) interface(s) de usuário alternativa que permite ao usuário selecionar parâmetros como taxa de fluxo, formas de onda, potencial aplicado, volume para eletroporar, atraso de tempo, recursos de resfriamento, recursos de aquecimento, status de eletro- poração, progresso e outros parâmetros usados para otimizar o proto- colo de eletroporação. A interface também contém seleções de parâ- metros pré-formulados que permitem ao usuário operar o sistema em condições padrão que foram previamente validadas pelo usuário ou conforme recomendado pelos fabricantes. A interface pode ser conec- tada a uma programação que permite a execução automatizada do sistema e / ou a execução de um algoritmo para otimizar a eletropora- ção para uma determinada amostra de um tipo de célula conhecido. O dispositivo também contém um cartucho (30.2) que encapsula uma ou mais das invenções declaradas anteriormente ou outros dispositivos de eletroporação usados para eletroporação de fluxo contínuo. O dis- positivo também contém uma área / alojamento de resfriamento / aquecimento (30.3) para armazenamento de células / tampão durante, antes e após a eletroporação da amostra. O sistema é alimentado ex- ternamente. O sistema também contém algoritmos que têm a capaci- dade de ajustar os parâmetros de forma independente / autônoma se o usuário selecionar esta funcionalidade. Isso permite o ajuste contínuo dos parâmetros usados no processo de eletroporação que podem de- pender do tipo de célula, condutividade, volume de suspensões, visco- sidade, vida útil do cartucho de eletroporação, o estado físico da sus- pensão ou o estado do dispositivo de eletroporação.
[00293] A FIG. 30B mostra um arranjo de dispositivos de eletropo-
ração anteriormente descrito no documento. 30.4 é o coletor de mani- pulação de líquidos que transporta a invenção através da plataforma de manipulação de líquidos e permite que o dispositivo aspire o fluido.
30.5 é o dispositivo mostrado nas FIGS. 1A-1C. 30.6 é uma placa de poço usada para armazenar a amostra antes, durante e / ou após a transferência da amostra. Exemplo 12 - Estratégias de passagem para citometria de fluxo para otimizar os parâmetros de eletroporação
[00294] A FIG. 31 fornece um exemplo comparando duas estraté- gias de bloqueio. Historicamente, os desenvolvedores de tecnologia de eletroporação têm usado um pré-bloqueio canônico de "linfócitos", que ignora as células que não estão dentro da população de "linfócitos", como aquelas com uma morfologia alterada ou em apoptose. Como mostrado na FIG. 31, isso aumenta artificialmente as métricas de viabi- lidade ao selecionar uma subpopulação específica de células para análise. Um pré-bloqueio de "célula total" é uma representação mais precisa dos resultados experimentais da eletroporação. Portanto, as viabilidades relatadas mostradas na tabela abaixo podem parecer me- nores do que o esperado no campo, mas os dados foram processados para se concentrar em métricas de desempenho que representam o impacto dos dispositivos de eletroporação da invenção em todas as células de entrada. Na FIG. 31, FSC representa Forward Scatter e SSC é Side Scindicando como os dados de morfologia celular são co- letados durante a análise de citometria de fluxo.
[00295] Usando a estratégia de bloqueio aqui descrita, os dados de desempenho para células Jurkat, células T humanas primárias ativa- das, monócitos THP-1, monócitos humanos primários e macrófagos humanos primários diferenciados são mostrados abaixo na Tabela 2. Na Tabela 2, o rendimento representa a razão entre o número de célu- las que são viáveis e expressam a carga útil de interesse e o número de entrada de células que entraram no processo. Por exemplo, rendi- mento de 0,5X significa que metade das células de entrada são viáveis e expressam a carga útil desejada no momento da análise. Para uma perspectiva, um produto de terapia celular é administrado a um pacien- te se o rendimento com a distribuição viral for maior do que aproxima- damente 0,1X no momento da colheita. Tabela 2. Métricas de desempenho representativas obtidas com dispositivos da invenção em diferentes células primárias e linha- gens celulares com uma ampla variedade de cargas úteis. Entrada Métricas de desempenho de pico Tipo de célula Carga útil Viabilidade Eficiência Rendimen- to Linhagem de célu- dextrano 75-80% 55-60% 0,3X las Jurkat pDNA 70-75% 55-60% 0,2X mRNA 75-80% 90-95% 0,6X Células T humanas dextrano 75-80% 85-90% 0,5X primárias (ativadas) mRNA 75-80% 90-95% 0,6X THP-1 dextrano 65-70% 85-90% 0,5X ⧧ Monócitos humanos dextrano 45-50% 85-90% 0,3X ⧧ primários mRNA 55-60% 80-85% 0,4X ⧧ Macrófagos huma- dextrano 70-75% 70-75% 0,4X ⧧ nos primários (dife- mRNA 45-50% 75-80% 0,2X ⧧ renciados) ⧧ Representa o rendimento com base em contagens de controle sem eletroporação não tratadas Exemplo 13 - Eletroporação em células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) e células de rim embrionário humano (HEK-293T)
[00296] A eletroporação das linhagens de células CHO-K1 (células de ovário de hamster chinês) e HEK-293T (células de rim embrionário humano) foi conduzida. Os dispositivos da invenção podem ser usados para eletroporação de células aderentes que foram levantadas e res- suspensas em um tampão de eletroporação. As células CHO-K1 (FIG.
32A e 32B) e HEK-293T (FIGS. 33A-33D) podem ser transfectadas com sucesso com DNA de plasmídeo GFP usando os dispositivos da invenção. A eficiência máxima de transfecção em células HEK-293T foi observada após uma cultura de 48 horas, pós eletroporação. Sem estar limitado pela teoria, a viabilidade celular reduzida pode ser devi- do ao levantamento das células aderentes e colocá-las em suspensão para análise via citômetro de fluxo, enquanto os métodos de microsco- pia mostraram células GFP + saudáveis com morfologia normal (FIGS. 34A, 34B, 35A e 35B). Exemplo 14 - Transfecção de células T primárias
[00297] Estudos em células T primárias foram conduzidos. Repórte- res fluorescentes que foram utilizados principalmente para análise de eficiência de eletroporação incluem pequenas moléculas fluorescentes (por exemplo, dextrano marcado com FITC), genes expressos de DNA de plasmídeo (por exemplo, GFP) e genes expressos de mRNA (por exemplo, GFP). A distribuição e a expressão desses repórteres são determinadas usando citometria de fluxo, em que as células vivas são pré-bloqueadas usando a estratégia de bloqueio, conforme descrito neste documento, para determinar a detecção fluorescente em uma base de célula única. Esses ensaios demonstram a detecção intercelu- lar do repórter fluorescente e, em alguns casos, a distribuição nuclear direta. Devido à natureza suave das eletroporações realizadas com os dispositivos da invenção, contagens de células mais altas são obtidas após a transfecção em comparação com sistemas comerciais, por exemplo, o sistema Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM ou o sistema de transfecção NEON® (Thermo Fisher, Carlsbad, CA). a. Demonstrações expandidas de células T
[00298] A transfecção usando dispositivos da invenção para distri- buir moléculas de dextrano marcadas com fluorescência (FITC) (40 kDa) em células T humanas primárias (começando na densidade celu-
lar de 106 células / condição experimental) foi realizada e a análise de quatro métricas contra um dispositivo de eletroporação de bancada disponível comercialmente (por exemplo, um sistema de transfecção Thermo Fisher NEON®) foi conduzida: contagem total de células (pós EP), viabilidade celular, eficiência de transfecção e número total de células vivas transfectadas. Os resultados são mostrados nas FIGS. 36A-36D. Além dos dados mostrados nas FIGS. 36A-36D usando mo- léculas marcadas com fluorescência, a distribuição de DNA de plasmí- deo que codifica GFP (3,5 kB) em células T humanas primárias (a uma densidade celular de 106 células / condição experimental) foi testada usando dispositivos da invenção. Estas experiências demonstraram novamente superioridade em relação ao sistema de transfecção NE- ON®, mostrado como o número total de células T que expressam GFP após uma incubação de 24 horas representada na FIG. 37. É impor- tante ressaltar que a expressão de GFP do plasmídeo de DNA tam- bém demonstrou distribuição eficaz de informação genética (ou seja, ácidos nucleicos) para o núcleo, onde o DNA é transcrito em RNA an- tes da tradução na proteína GFP final. b. Distribuição de mRNA com comparação de plataforma
[00299] A distribuição de mRNA às células também foi demonstrada usando os dispositivos da invenção. Esses experimentos foram reali- zados com um mRNA de origem comercial em duas densidades de células operacionais. As experiências foram então concluídas em dois sistemas disponíveis comercialmente (Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM e Sistema de Transfecção Thermo Fisher NEON®) e os dispositivos da invenção para comparação como mostrado nas FIGS. 38A-38D). Os dispositivos da invenção superaram os sistemas disponíveis co- mercialmente em termos de viabilidade, eficiência e rendimento. Além disso, o desempenho dos dispositivos da invenção era independente da concentração de células, ao contrário dos sistemas disponíveis co-
mercialmente, conforme indicado pelos resultados experimentais apre- sentados nas FIGS. 38A-38D. Exemplo 15 - Distribuição de uma carga útil não transitória
[00300] Cada uma das cargas úteis descritas nos Exemplos 13 e 14 são transitórias no momento da distribuição. Para demonstrar a modi- ficação do genoma estável de distribuição de reagentes (ou seja, no- caute do gene CRISPR), os experimentos foram realizados com com- plexos de ribonucleoproteína Cas9 (RNPs) para o nocaute de CRISPR em células primárias. Como é mostrado nas FIGS. 39A-39D, o nocau- te de um gene endógeno em células T primárias, conforme confirmado por meio de coloração de receptor de superfície em uma base de célu- la única, foi bem-sucedido usando dispositivos da invenção e confir- mado usando citometria de fluxo. Os dispositivos da invenção também podem ser usados para integração CRISPR simultânea de um gene exógeno para demonstrar integração genômica estável por meio de eletroporação de RNPs Cas9. Exemplo 16 - Transfecção de linhagem celular de monócitos (THP-1) e assassinas naturais (NK-92MI)
[00301] As FIGS. 40A e 40B mostram gráficos de barras compa- rando a distribuição de plasmídeo GFP e dextrano marcado com FITC para células THP-1 e NK-92MI, respectivamente, usando dispositivos da invenção e um sistema de transfecção NEON® comercial. Como é visto nas FIGS. 40A e 40B, a eletroporação usando dispositivos da in- venção supera consistentemente o NEON® para a produção de célu- las transfectadas viáveis de qualquer tipo com qualquer carga útil. Como um exemplo comparativo adicional, as FIGS. 41A e 41B mos- tram viabilidade celular aumentada e eficiência de transfecção em amostras contendo monócitos THP-1, onde o mRNA de GFP foi distri- buído usando dispositivos da invenção em comparação com o sistema de transfecção NEON®.
[00302] THP-1, uma linhagem celular de monócitos imortalizada, foi posteriormente usada para estudos de comparação com monócitos e macrófagos. A ativação de células THP-1 com endotoxina LPS (lipopo- lissacarídeo) induz células imortalizadas THP1-Mac semelhantes a macrófagos. Como mostrado nas FIGS. 42A-42C e FIGS. 43A e 43B, ambas as células THP-1 (FIGS. 42A-42C) e THP1-Mac (FIGS. 43A e 43B) foram transfectadas com sucesso com mRNA de GFP usando dispositivos da invenção. Exemplo 17 - Transfecção de monócitos primários e macrófagos dife- renciados
[00303] As células primárias de monócitos humanos, um tipo de cé- lula notoriamente desafiador para transfectar através de meios con- vencionais, foram transfectadas com sucesso usando os dispositivos da invenção. Como é mostrado nas FIGS. 44A-44D, monócitos huma- nos primários, isolados de sangue periférico, foram transfectados com sucesso com moléculas de dextrano marcadas com FITC e mRNA de GFP usando dispositivos da invenção.
[00304] As FIGS. 45A e 45B mostram a expressão de marcadores específicos em monócitos de sangue periférico primário transfectados com mRNA de GFP usando dispositivos da invenção. Como é mostra- do nas FIGS. 45A e 45B, a capacidade dos monócitos CD86+ (blo- queados em células GFP+ viáveis) de se tornarem ativados (represen- tados aqui como expressão de CD80) após a estimulação de LPS foi mantida por 96 horas, indicando que a eletroporação não impacta ne- gativamente a expressão do marcador de ativação CD80 (FIG. 45A) ou marcador de linhagem CD86 (FIG. 45B).
[00305] Além disso, os monócitos primários eletroporados usando dispositivos da invenção retiveram a capacidade de se diferenciar em macrófagos, como mostrado nas FIGS. 46A-46C, que indica que as células retêm sua função após a eletroporação. Como mostrado nas
FIGS. 47A-47D, macrófagos humanos diferenciados foram transfecta- dos com sucesso com moléculas de dextrano marcadas com FITC (FIGS. 47A-47B) e mRNA de GFP (FIGS. 47C-47D) usando dispositi- vos da invenção. Macrófagos eletroporados usando dispositivos da invenção polarizados em fenótipos M1 ou M2 (como mostrado nas FIGS. 48A-48B), sugerindo que a saúde e a função celular são retidas após eletroporação usando dispositivos da invenção. Macrófagos ele- troporados foram polarizados em fenótipos M1 (FIG. 48A) ou M2 (FIG. 48B) e retêm a expressão de mRNA de GFP até 72 horas após a ele- troporação usando dispositivos da invenção.
[00306] Os dispositivos da invenção podem superar o sistema de transfecção comercial para a eletroporação de monócitos primários. Como mostrado nas FIGS. 49A-49C, a distribuição de dextrano mar- cado com FITC em monócitos primários usando dispositivos da inven- ção excede o desempenho do sistema de transfecção NEON® para células humanas primárias, com um aumento marcado no número total de células vivas de saída que são transfectadas com sucesso. Exemplo 18 - Dispositivos de fluxo contínuo da invenção: fabricação de células de grande volume e alto número de células
[00307] Os dispositivos da invenção podem ser usados para a ele- troporação de grandes volumes e suspensões de alto número de célu- las de uma maneira de fluxo verdadeiramente contínuo. As tecnologias existentes, como a Unidade Lonza 4D-NUCLEOFECTORTM LV e os Sistemas de Transfecção Escaláveis Maxcyte (STX, VLX ou GT) de- pendem do fluxo de fluido para carregar as amostras em seu cartucho NUCLEOCUVETTETM ou conjunto de processamento, respectivamen- te. No entanto, durante a distribuição de pulso elétrico, as suspensões de célula e carga útil são estacionárias. Os sistemas de eletroporação comercialmente disponíveis tratam suspensões de células estáticas ou estacionárias, o que é uma diferença crítica em relação aos dispositi-
vos da invenção. Os dispositivos da invenção permitem o fluxo contí- nuo da célula e a suspensão da carga útil durante a exposição aos campos elétricos. Especificamente, as células de fluxo rápido são ex- postas a campo elétrico suficiente para romper a membrana celular e internalizar a carga genética de interesse, mas são imediatamente dis- tribuídas em seus meios de crescimento para recuperação celular. Além disso, qualquer calor gerado durante o processo de eletropora- ção é dissipado devido à transferência de calor por convecção, que é facilitada pelo fluxo de amostras diretamente para o meio de recupera- ção. Este estudo expande significativamente os dados gerados, tanto no tipo de célula quanto na escala das eletroporações. a. Demonstração inicial em células Jurkat
[00308] Uma faixa de densidades celulares e volumes de eletropora- ção foram usados para demonstrar a escalabilidade de uma plataforma de fluxo contínuo em relação a uma plataforma de dispositivo único usando dispositivos da invenção. Nessas experiências, é demonstrado que a plataforma escalável da invenção opera em uma ampla faixa de densidades de células Jurkat, mostradas nas FIGS. 50A-50D. b. Estudos de comparabilidade entre as plataformas da invenção
[00309] Experimentos de acompanhamento foram realizados para comparar o desempenho de eletroporação dos dispositivos da inven- ção e a plataforma de eletroporação de fluxo contínuo da invenção usando as mesmas condições de distribuição para ambas as células Jurkat e T primárias. Nessas experiências comparativas, 5 milhões de células foram processadas através da plataforma de fluxo contínuo, mostrando resultados comparáveis aos dispositivos de canal único da invenção para células Jurkat e células T primárias, como mostrado nas FIGS. 51A e 51B. c. Escala aumentada de eletroporação de células T
[00310] Para testar se a eletroporação era dependente da densida-
de celular, os experimentos de eletroporação descritos nas FIGS. 51A e 51B foram expandidos para suspensões de células contendo até 100 milhões de células T primárias. No primeiro experimento, um número crescente de células T foi processado na mesma densidade celular, aumentando a escala de 5 milhões (como mostrado na FIG. 51B) até 100 milhões de células T (como mostrado nas FIGS. 52A-52D), sem uma perda de rendimento. A densidade celular desejada foi então ava- liada, mostrando que as células T podem ser processadas através da plataforma escalonável da invenção em até 100x106 células/mL, como mostrado nas FIGS. 53A-53D. É importante ressaltar que o processa- mento de 100 milhões de células T foi bem-sucedido com quantidades 5 vezes menores de mRNA em comparação com células T processa- das na densidade celular mais baixa, demonstrando um custo poten- cial de economia de bens para cargas distribuídas em densidades ce- lulares altas. O tempo total de processamento para os 100 milhões de células T neste experimento variou de 2,4 a 24 segundos. d. Estudo de comparabilidade com o sistema Lonza de grande volume (LV)
[00311] Realizou-se uma comparação da plataforma escalável da invenção com o sistema Lonza 4D LV usando células T primárias com cargas úteis de mRNA de FITC-dextrano e EGFP. Os experimentos foram realizados com 50 milhões de células T. Às 24 horas, a colora- ção das células revelou que a morfologia e o fenótipo das células tra- tadas com Lonza diferiam significativamente das células não tratadas (mostrado nos gráficos de citometria de fluxo da FIG. 54). Além disso, havia populações de células mortas significativas observadas com as células tratadas com Lonza LV. Estes resultados não ocorreram nas células T eletroporadas com a plataforma de fluxo contínuo da inven- ção, indicando que a plataforma de fluxo contínuo da invenção mante- ve a morfologia das células T através do processo de eletroporação.
Como é mostrado na FIG. 55, o rendimento total de células usando a plataforma de fluxo contínuo da invenção é maior do que o sistema Lonza 4D LV, independente da carga útil sendo distribuída, por exem- plo, dextrano marcado com FITC ou mRNA de GFP.
[00312] A plataforma de fluxo contínuo da invenção mostrou eletro- poração bem-sucedida de cargas úteis em densidade muito alta, por exemplo, suspensões de 1 bilhão de células. Como mostrado nas FIGS. 56A e 56B, 1 bilhão de células THP-1 em um volume de 10 mL (concentração de 100×106 células / mL) foram transfectadas com su- cesso com moléculas de dextrano marcadas com FITC de 40 kDa usando a plataforma de fluxo contínuo da invenção. A FIG. 57 mostra o rendimento, representado como a contagem de células FITC vivas, para a experiência mostrada nas FIGS. 56A e 56B, medidos até 72 horas após a eletroporação. Neste ponto, o número de células FITC positivas era de aproximadamente 500 milhões, resultante de uma contagem de células de entrada de 1 bilhão, indicando a capacidade da plataforma de fluxo contínuo da invenção para fornecer 1 em cada 2 células de entrada como produtos celulares modificados às 72 horas. Exemplo 19 - Formas de onda pulsadas, voltagem CC, combinação de alta voltagem-baixa voltagem e combinações dos mesmos
[00313] Os dispositivos da invenção foram testados com fontes de energia de pulso e de corrente contínua (CC), como mostrado nas FIGS. 58A-58D. Nas voltagens mais altas testadas, ambas as fontes de alimentação mostraram eficiência de distribuição semelhante de FITC-dextrano em células Jurkat. Além disso, eletroporações iniciais com combinações de alta e baixa voltagem foram testadas para o mesmo sistema. Como mostrado nas FIGS. 59A-59D, analisou-se o uso de formas de onda modificadas para intensificação de eletropora- ção usando dispositivos da invenção com combinações de alta e baixa voltagem para otimização da distribuição de células T humanas primá-
rias, inicialmente com FITC-dextrano. O experimento das FIGS. 59A- 59D foi repetido para a distribuição de uma carga útil de mRNA dispo- nível comercialmente que codifica a proteína repórter fluorescente eGFP, mostrada nas FIGS. 60A-60D. Exemplo 20 - Eletroporação Dynabead
[00314] Para demonstrar a compatibilidade dos dispositivos da in- venção com certos protocolos de expansão de células T, as células T que foram expandidas com Dynabeads CD3 / CD28 foram eletropora- das usando dispositivos da invenção. A eletroporação de amostras ex- pandidas de Dynabead foi realizada com adição imediata de esferas (5 min antes da eletroporação) à suspensão de 1 milhão de células T humanas primárias ou após um tratamento durante a noite (OVN), com ambos os períodos de tempo demonstrando resultados de eficiência equivalentes quando as esferas magnéticas estavam presentes até quando os grânulos não estavam presentes (FIG. 61). Exemplo 21 - Estrutura externa para dispositivos de energização da invenção
[00315] A invenção fornece uma estrutura externa que se ajusta e fixa aos dispositivos da invenção, projetada para aumentar a facilidade de uso, a eficiência e a segurança durante a eletroporação com os dispositivos da invenção. A estrutura externa é feita de polímeros não condutivos nas superfícies externas que protegem os usuários de ex- posições de alta voltagem e minimizam o risco de choque elétrico para o usuário durante o fluxo de trabalho de eletroporação. A estrutura ex- terna acomoda o projeto atual dos dispositivos da invenção e pode ser modificada para aceitar variações de projetos futuros dos dispositivos da invenção. A estrutura externa aceita o sinal elétrico fornecido por uma fonte de alimentação ou amplificador de alta voltagem e redistri- bui o sinal para os eletrodos dos dispositivos da invenção, encapsu- lando o dispositivo dentro da estrutura externa. O encapsulamento do eletrodo dos dispositivos da invenção cria um ambiente de trabalho mais seguro para o usuário dos dispositivos, minimizando as superfí- cies de alta voltagem que são expostas. A estrutura externa também torna mais fácil fazer experimentos repetidamente sem a remoção das conexões elétricas. Uma modalidade de uma estrutura externa da in- venção apresentando uma dobradiça e fecho em forma de concha é mostrada nas FIGS. 62A e 62B. Na FIG. 62A, 62.1 é um eletrodo posi- tivo / negativo através do orifício para conexões com a fonte de ali- mentação.
[00316] 62.2 é um segundo eletrodo positivo / negativo através do orifício para conexões com a fonte de alimentação. 62.3 é a dobradiça tipo concha. Por exemplo, a dobradiça pode ser uma dobradiça viva, permitindo assim que a estrutura externa se feche sobre si mesma e engate o mecanismo de travamento. Este mecanismo de fechamento permite que a estrutura externa envolva os eletrodos do dispositivo da invenção, garantindo o contato elétrico entre ambos os dispositivos.
62.4 é uma trava ou outro fixador mecânico usado para garantir o fe- chamento da estrutura externa durante a eletroporação. Este projeto também permite que a estrutura externa seja reutilizável, tornando o mecanismo de travamento temporariamente engatado. 62.5 é um pino de alinhamento que garante que as estruturas externas se dobrem com o alinhamento correto para minimizar quaisquer deslocamentos que distorcem as conexões de eletrodo entre a estrutura externa e os dispositivos da invenção. 62.6 são recessos para os eletrodos do dis- positivo da invenção. 62.7 e 62.8 são o corpo de um dispositivo da in- venção e o primeiro e segundo eletrodos definindo a zona de eletropo- ração do dispositivo da invenção, respectivamente.
[00317] Em uso, a estrutura externa conectada aos dispositivos da invenção não mostrou nenhuma perda significativa na eficiência de transfecção ou viabilidade ao realizar a eletroporação usando disposi-
tivos da invenção sem a estrutura externa. Como mostrado nas FIGS. 63A-63B, a viabilidade e eficiência de monócitos THP-1 transfectados com dextrano marcado com FITC foi aproximadamente a mesma usando dispositivos da invenção com ou sem a estrutura externa sobre os eletrodos do dispositivo. Exemplo 22 – Material de fabricação para dispositivos descartáveis
[00318] Os dispositivos da invenção são construídos a partir de formulações de resina produzidas e vendidas pela Formlabs (Somervil- le, MA USA). Em particular, os dispositivos da invenção são fabricados a partir da "resina transparente" ou da "resina durável" comercializada pela Formlabs. A principal diferença entre as resinas Durable e Clear são as propriedades mecânicas. A resina Clear é mais frágil em ter- mos de comportamento mecânico e a resina Durable tem maior ducti- lidade na medida em que o desempenho mecânico é mais semelhante ao do polipropileno, material com o qual são fabricadas as ponteiras convencionais.
[00319] Os dispositivos da invenção são impressos em 3D usando tecnologia de estereolitografia para fins de prototipagem. Para proces- samento em grande escala, tal como moldagem por injeção, o disposi- tivo da invenção será fabricado a partir de outras resinas, como a resi- na Durável que simula de perto as propriedades mecânicas do poli- propileno. Para examinar se o material de resina impacta a eletropora- ção, as FIGS. 64A e 64B mostram a distribuição de dextrano marcado com FITC em monócitos THP-1 usando dispositivos da invenção fabri- cados a partir de resina transparente e resinas duráveis da Formlabs. A escolha do material não resultou em nenhuma mudança significativa no desempenho dos dispositivos da invenção. Exemplo 23 - Transfecção automatizada vs. condução de amostra manual (eletrônica)
[00320] Os dispositivos da invenção permitiram a modificação rápi-
da, de alto rendimento e automatizada de células humanas. As aplica- ções dessa tecnologia são amplamente difundidas, abrangendo desde pesquisas fundamentais em fisiologia celular até a descoberta de no- vos alvos para terapias celulares. As aplicações em terapias celulares por si só podem contribuir para uma indústria crescente de bilhões de dólares. O atual estado da técnica em manipulação genética em esca- la de pesquisa é manualmente intensivo e difícil de incorporar a siste- mas automatizados de manipulação de líquidos. Os dispositivos da invenção podem ser facilmente incorporados em uma variedade de plataformas de manipulação de líquidos. Essa integração permitirá que pesquisadores na academia e na indústria explorem rapidamente uma ampla faixa de questões relacionadas à genética. Os dispositivos da invenção têm o potencial de facilitar a modificação celular em escala de pesquisa milhares de vezes mais rápido do que o estado da técnica atual, levando a descobertas de mudança de vida na área da saúde e nas ciências biológicas fundamentais.
[00321] As experiências em células T aqui descritas foram original- mente conduzidas com dispositivos de uso único da invenção. Com o sistema automatizado incorporando dispositivos da invenção, a trans- fecção pode ser simplificada e configurada de uma maneira de alto rendimento. Oito seringas controladas independentemente foram pro- gramadas para conduzir a suspensão de células em dispositivos de uso único da invenção. Amostras de 100 µL foram aspiradas acima da zona de eletroporação de cada dispositivo e foram energizadas duran- te a distribuição ativa no meio de crescimento de recuperação. Três métodos automatizados de transfecção que usaram deslocamento de ar (pipeta eletrônica manual) ou deslocamento de fluido (sistema au- tomatizado) para conduzir as amostras foram comparados. A viabilida- de resultante permaneceu em níveis elevados (> 90%) ao usar a me- todologia de bloqueio de linfócitos para os 3 sistemas avaliados (mos-
trado nas FIGS. 65A e 65B). No entanto, ao olhar para a eficiência de transfecção, é claro que o sistema automatizado, que emprega tecno- logia de deslocamento de fluido para controlar com precisão a taxa de fluxo, é superior ao manual. Exemplo 24 - Codistribuição de reagente de mRNA em células T pri- márias
[00322] A codistribuição de dois tipos de mRNA em células T foi avaliada usando dispositivos da invenção. Esses experimentos foram realizados com dois mRNAs de origem comercial que codificam GFP ou mCherry. Os experimentos foram concluídos em paralelo (mesmo dia) ou em série (dois dias de intervalo). Os dispositivos da invenção foram capazes de distribuir ambos os mRNAs, conforme demonstrado pela expressão de GFP e mCherry observada nas FIGS. 66A-66E. Exemplo 25 - Transfecções de células mononucleares de sangue peri- férico de população mista
[00323] A distribuição de mRNA em populações de células huma- nas mistas primárias (isto é, PBMCs) também foi demonstrada usando dispositivos da invenção. Esses experimentos foram realizados com um mRNA de origem comercial que codifica GFP, seguido por colora- ção de fenótipo de receptores de superfície para identificar populações de células específicas. A distribuição de mRNA para células T naive (CD45RA+) e de memória (CD45RO+) foi alcançada, como mostrado na FIG. 67A. Além disso, a distribuição de mRNA para células B (CD19+) e células NK assassinas naturais (CD56+) da população mis- ta foi alcançada, como mostrado na FIG. 67B. Exemplo 26 - transfecção de mRNA de iPSCs aderentes primários
[00324] Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram trans- fectadas com eGFP-mRNA, em suspensão, usando um dispositivo da invenção (FLOWFECTTM). As células foram avaliadas 24 horas após a transfecção para indicação de transfecção positiva usando microsco-
pia fluorescente. As imagens são representadas como uma imagem de sobreposição de GFP e campo claro para capturar aderência, morfolo- gia celular e expressão de eGFP-mRNA (imagens representativas mostradas com ampliação de 10x; Fig. 69A). As células também foram avaliadas 96 horas após a transfecção via citômetro de fluxo para a proporção de células viáveis (7AAD-) e transfectadas positivamente (GFP+7AAD-) (dados representativos mostrados como Média ± SEM; Figs. 69B e 69C). Exemplo 27 - transfecção de mRNA de células assassinas naturais humanas primárias
[00325] Células NK isoladas (CD56+) foram eletroporadas com mRNA que codifica GFP. Após 24 horas, as células foram analisadas quanto à viabilidade e eficiência. As contagens NK e viabilidades são mostradas nas FIGS. 70A-70B. Os dispositivos da invenção foram ca- pazes de distribuir mRNAs com sucesso, como demonstrado pela ex- pressão de ~ 95% GFP observada na FIG. 70C. O rendimento total de células GFP+ vivas em comparação com células vivas não tratadas em 24 horas foi de ~ 57%, como mostrado na FIG. 70D. Modalidades Numeradas
[00326] Algumas modalidades da tecnologia aqui descrita podem ser definidas de acordo com qualquer um dos seguintes parágrafos numerados:
[00327] 1. Um dispositivo para eletroporar uma pluralidade de célu- las suspensas em um fluido, compreendendo: a. um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira en- trada e uma primeira saída, em que um lúmen do primeiro eletrodo compreende uma zona de entrada; b. um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada e uma segunda saída, em que um lúmen do segundo eletrodo compreende uma zona de recuperação; e c. uma zona de eletroporação, em que a zona de eletropo- ração está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletro- do e à se-gunda entrada do segundo eletrodo, em que a zona de ele- troporação tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme e em que a aplicação de uma diferença de potencial elétrico para o primeiro e o segundo eletrodos produzem um campo elétrico na zona de eletropora-ção, em que a pluralidade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[00328] 2. O dispositivo do parágrafo 1, compreendendo ainda um pri-meiro reservatório conectado de forma fluida à zona de entrada.
[00329] 3. O dispositivo do parágrafo 1, compreendendo ainda um se-gundo reservatório conectado de forma fluida à zona de recupera- ção.
[00330] 4. O dispositivo do parágrafo 1, em que a seção transversal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em cir- cular, cilíndrico, elipsoidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoi- dal e irre-gular.
[00331] 5. O dispositivo do parágrafo 1, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de entrada está entre 0,01% a 100.000% da dimen-são da seção transversal da zona de eletroporação.
[00332] 6. O dispositivo do parágrafo 1, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de recuperação está entre 0,01% a 100.000% da maior dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[00333] 7. O dispositivo do parágrafo 1, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00334] 8. O dispositivo do parágrafo 1, em que o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00335] 9. O dispositivo do parágrafo 1, em que a dimensão da se-
ção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,01 mm a 500 mm.
[00336] 10. O dispositivo do parágrafo 1, em que nenhuma das zo- nas de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma di-mensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido.
[00337] 11. O dispositivo do parágrafo 1, em que a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletropo-ração.
[00338] 12. O dispositivo do parágrafo 1, a pluralidade de células não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação
[00339] 13. O dispositivo do parágrafo 1, compreendendo ainda uma es-trutura externa que compreende um alojamento configurado para envol-ver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de ele- troporação do dispositivo.
[00340] 14. O dispositivo do parágrafo 13, em que a estrutura ex- terna compreende uma primeira entrada elétrica operativamente aco- plada ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativa- mente aco-plada ao segundo eletrodo.
[00341] 15. O dispositivo do parágrafo 13 ou 14, em que a estrutura ex-terna é parte integrante do dispositivo.
[00342] 16. O dispositivo do parágrafo 13 ou 14, em que a estrutura ex-terna é conectada de forma removível ao dispositivo.
[00343] 17. Um dispositivo para eletroporar uma pluralidade de cé- lulas suspensas em um fluido, compreendendo: a. um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira en- trada e uma primeira saída, em que um lúmen do primeiro eletrodo compreende uma zona de entrada; b. um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en-
trada e uma segunda saída, em que um lúmen do segundo eletrodo compreende uma zona de recuperação, c. uma terceira entrada e uma terceira saída, em que a ter- ceira entrada e a terceira saída interceptam o primeiro eletrodo entre a primei-ra entrada e a primeira saída; d. uma quarta entrada e uma quarta saída, em que a quarta en-trada e a quarta saída interceptam o segundo eletrodo entre a se- gunda entrada e a segunda saída; e. uma zona de eletroporação, em que a zona de eletropo- ração está fluidamente conectada à primeira saída da zona de entrada e à se-gunda entrada da zona de recuperação, em que a zona de ele- troporação tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme e em que a aplicação de uma diferença de potencial elétrico entre o pri-meiro e o segundo eletrodos produz um campo elétrico na zona de ele-troporação, em que a pluralidade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[00344] 18. O dispositivo do parágrafo 17, compreendendo ainda um pri-meiro reservatório conectado de forma fluida à zona de entrada.
[00345] 19. O dispositivo do parágrafo 17, compreendendo ainda um se-gundo reservatório conectado de forma fluida à zona de recupe- ração.
[00346] 20. O dispositivo do parágrafo 17, compreendendo ainda um ter-ceiro reservatório conectado de forma fluida à terceira entrada e à tercei-ra saída.
[00347] 21. O dispositivo do parágrafo 17, compreendendo ainda um quarto reservatório conectado de forma fluida à quarta entrada e à quar-ta saída.
[00348] 22. O dispositivo do parágrafo 17, em que a seção trans- versal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em circular, elipsoidal, poligonal (por exemplo, polígono regular, polí- gono irregular), estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[00349] 23. O dispositivo do parágrafo 17, em que a dimensão da seção transversal da zona de entrada está entre 0,01% a 100.000% da dimen-são da seção transversal da zona de eletroporação.
[00350] 24. O dispositivo do parágrafo 17, em que a dimensão da seção transversal da zona de recuperação está entre 0,01% a
100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[00351] 25. O dispositivo do parágrafo 17, em que a dimensão da seção transversal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00352] 26. O dispositivo do parágrafo 17, em que o comprimento da zo-na de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00353] 27. O dispositivo do parágrafo 17, em que a dimensão da seção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 5 mm.
[00354] 28. O dispositivo do parágrafo 17, em que qualquer um do pri-meiro eletrodo ou do segundo eletrodo é poroso.
[00355] 29. O dispositivo do parágrafo 17, em que nenhuma das zonas de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação re- duz uma dimensão de seção transversal de qualquer uma da plurali- dade de célu-las suspensas no fluido.
[00356] 30. O dispositivo do parágrafo 17, em que a pluralidade de célu-las tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletropo-ração.
[00357] 31. O dispositivo do parágrafo 17, em que a pluralidade de célu-las não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação.
[00358] 32. O dispositivo do parágrafo 17, compreendendo ainda uma estrutura externa que compreende um alojamento configurado para en-volver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de ele- troporação do dispositivo.
[00359] 33. O dispositivo do parágrafo 32, em que a estrutura ex- terna compreende uma primeira entrada elétrica operativamente aco- plada ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativa- mente aco-plada ao segundo eletrodo.
[00360] 34. O dispositivo do parágrafo 32 ou 33, em que a estrutura ex-terna é parte integrante do dispositivo.
[00361] 35. O dispositivo do parágrafo 32 ou 33, em que a estrutura ex-terna é conectada de forma removível ao dispositivo.
[00362] 36. Um sistema para eletroporar uma pluralidade de células sus-pensas em um fluido, compreendendo: a. um dispositivo de poração de célula, compreendendo: i. um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira entra- da e uma primeira saída, em que um lúmen do primeiro eletrodo com- preende uma zona de entrada; ii. um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada e uma segunda saída, em que um lúmen do segundo eletrodo compreende uma zona de recuperação; e iii. uma zona de eletroporação, em que a zona de eletropo- ração está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletro- do e à se-gunda entrada do segundo eletrodo, em que a zona de ele- troporação tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme e em que a aplicação de uma diferença de potencial elétrico para o primeiro e o segundo eletrodos produzem um campo elétrico na zona de eletropora-ção; b. uma fonte de potencial elétrico, em que o primeiro e o segun-do eletrodos do dispositivo são conectados de forma liberável à fonte de potencial elétrico, em que a pluralidade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[00363] 37. O sistema do parágrafo 36, em que a pluralidade de cé- lulas tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletropo-ração do dispositivo.
[00364] 38. O sistema do parágrafo 36, em que a pluralidade de cé- lulas não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação
[00365] 39. O sistema do parágrafo 36, em que o dispositivo com- preende ainda uma estrutura externa que compreende um alojamento configurado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de eletro-poração do dispositivo.
[00366] 40. O sistema do parágrafo 36, em que a estrutura externa com-preende uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao pri-meiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo.
[00367] 41. O sistema do parágrafo 40, em que a fonte de potencial elé-trico é conectada de forma liberável à primeira e à segunda entra- das elé-tricas da estrutura externa.
[00368] 42. O sistema do parágrafo 41, em que a conexão liberável entre a primeira ou segunda entradas elétricas e a fonte de potencial elétrico é selecionada do grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma escova de aço ou uma combinação dos mesmos.
[00369] 43. O sistema do parágrafo 36, em que a estrutura externa é par-te integrante do dispositivo.
[00370] 44. O sistema do parágrafo 36, em que a estrutura externa é co-nectada de forma liberável ao dispositivo.
[00371] 45. O sistema do parágrafo 36, em que a eletroporação é eletroporação reversível substancialmente não térmica.
[00372] 45. O sistema do parágrafo 36, em que a eletroporação é eletro-poração irreversível substancialmente não térmica.
[00373] 46. O sistema do parágrafo 36, em que a eletroporação é eletro-poração substancialmente irreversível térmica.
[00374] 47. O sistema do parágrafo 36, em que a conexão liberável entre o dispositivo e a fonte de potencial elétrico é selecionada do gru- po que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma escova de aço ou uma combinação dos mesmos.
[00375] 48. O sistema do parágrafo 48, em que a conexão liberável entre o dispositivo e a fonte de potencial elétrico é uma mola.
[00376] 49. O sistema do parágrafo 36, compreendendo ainda um primei-ro reservatório conectado de forma fluida à zona de entrada.
[00377] 50. O sistema do parágrafo 36, compreendendo ainda um segun-do reservatório conectado de forma fluida à zona de recupera- ção.
[00378] 51. O sistema do parágrafo 36, em que a seção transversal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em cir- cular, elipsoidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregu- lar.
[00379] 52. O sistema do parágrafo 36, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de entrada está entre 0,01% a 100.000% da dimen-são da seção transversal da zona de eletroporação.
[00380] 53. O sistema do parágrafo 36, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de recuperação está entre 0,01% a 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[00381] 54. O sistema do parágrafo 36, em que nenhuma das zonas de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma di-mensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas em um fluido.
[00382] 55. O sistema do parágrafo 36, em que o ciclo de trabalho da eletroporação está entre 0,001% a 100%.
[00383] 56. O sistema do parágrafo 36, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00384] 57. O sistema do parágrafo 36, em que o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00385] 58. O sistema do parágrafo 36, em que a dimensão da se- ção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 5 mm.
[00386] 59. O sistema do parágrafo 36, compreendendo ainda uma fonte de distribuição de fluido conectada fluidamente à zona de entra- da, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para forne- cer a plura-lidade de células suspensas no fluido através da zona de entrada para a zona de recuperação.
[00387] 60. O sistema do parágrafo 59, em que a taxa de distribui- ção da fonte de distribuição de fluido está entre 0,001 mL / min a 1.000 mL / min.
[00388] 61. O sistema do parágrafo 36, em que o tempo de resi- dência de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0,5 ms a 50 ms.
[00389] 62. O sistema do parágrafo 36, compreendendo ainda um contro-lador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico pa- ra fornecer pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo ele- trodo para ge-rar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo ele-trodos.
[00390] 63. O sistema do parágrafo 62, em que os pulsos de volta- gem têm uma amplitude entre 0,01 kV a 3 kV.
[00391] 64. O sistema do parágrafo 62, em que os pulsos de volta- gem têm uma duração de entre 0,01 ms a 1.000 ms.
[00392] 65. O sistema do parágrafo 62, em que os pulsos de volta- gem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma frequên-
cia en-tre 1 Hz a 50.000 Hz.
[00393] 66. O sistema do parágrafo 62, em que a forma de onda do pulso de voltagem é selecionada do grupo que consiste em CC, qua- drado, pulso, bipolar, seno, rampa, bipolar assimétrico, arbitrário e qualquer superposição ou combinações dos mesmos.
[00394] 67. O sistema do parágrafo 62, em que o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude de entre 1 V / cm a 50.000 V / cm.
[00395] 68. O sistema de qualquer um dos parágrafos 36-67, em que o fluido tem uma condutividade entre 0,001 mS / cm a 500 mS / cm.
[00396] 69. O sistema de qualquer um dos parágrafos 36-68, com- preen-dendo ainda um alojamento configurado para alojar o dispositi- vo.
[00397] 70. O sistema do parágrafo 69, em que o alojamento com- preende ainda um controlador térmico configurado para aumentar ou diminuir a temperatura do alojamento.
[00398] 71. O sistema do parágrafo 70, em que o controlador térmi- co é um elemento de aquecimento selecionado do grupo que consiste em um bloco de aquecimento, fluxo de líquido, aquecedor alimentado por bateria e um aquecedor de filme fino.
[00399] 72. O sistema do parágrafo 70, em que o controlador térmi- co é um elemento de resfriamento selecionado do grupo que consiste em um fluxo de líquido, resfriador evaporativo e um dispositivo Peltier.
[00400] 73. O sistema de qualquer um dos parágrafos 36-72, com- preen-dendo ainda uma pluralidade de dispositivos de poração celular.
[00401] 74. O sistema do parágrafo 73, compreendendo ainda uma plura-lidade de estruturas externas.
[00402] 75. Um sistema para eletroporar uma pluralidade de células sus-pensas em um fluido, compreendendo:
a. um dispositivo de poração de célula, compreendendo: i. um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira entra- da e uma primeira saída, em que um lúmen do primeiro eletrodo com- preende uma zona de entrada; ii. um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada e uma segunda saída, em que um lúmen do segundo eletrodo compreende uma zona de recuperação, iii. uma terceira entrada e uma terceira saída, em que a ter- ceira entrada e a terceira saída interceptam o primeiro eletrodo entre a primei-ra entrada e a primeira saída; iv. uma quarta entrada e uma quarta saída, em que a quar- ta en-trada e a quarta saída interceptam o segundo eletrodo entre a segunda entrada e a segunda saída; v. uma zona de eletroporação, em que a zona de eletropo- ração está fluidamente conectada à primeira saída da zona de entrada e à se-gunda entrada da zona de recuperação, em que a zona de ele- troporação tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme e em que a aplicação de uma diferença de potencial elétrico para o primei-ro e o segundo eletrodos produz um campo elétrico na zona de eletropo-ração; e b. uma fonte de potencial elétrico, em que o primeiro e o segun-do eletrodos do dispositivo são conectados de forma liberável à fonte de potencial elétrico, em que a pluralidade de células suspensas no fluido são eletroporadas ao entrar na zona de eletroporação.
[00403] 76. O sistema do parágrafo 75, em que a pluralidade de cé- lulas tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletropo-ração do dispositivo.
[00404] 77. O sistema do parágrafo 75, em que a pluralidade de cé-
lulas não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação.
[00405] 78. O sistema do parágrafo 75, em que o dispositivo com- preende ainda uma estrutura externa que compreende um alojamento configurado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de eletro-poração do dispositivo.
[00406] 79. O sistema do parágrafo 75, em que a estrutura externa com-preende uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao pri-meiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo.
[00407] 80. O sistema do parágrafo 75, em que a fonte de potencial elé-trico é conectada de forma liberável à primeira e à segunda entra- das elé-tricas da estrutura externa.
[00408] 81. O sistema do parágrafo 80, em que a conexão liberável entre a primeira ou segunda entradas elétricas e a fonte de potencial elétrico é selecionada do grupo que consiste em um grampo, um clipe, uma mola, uma bainha, uma escova de aço ou uma combinação dos mesmos.
[00409] 82. O sistema do parágrafo 78, em que a estrutura externa é par-te integrante do dispositivo.
[00410] 83. O sistema do parágrafo 78, em que a estrutura externa é co-nectada de forma liberável ao dispositivo.
[00411] 84. O sistema do parágrafo 75, em que a eletroporação é eletro-poração reversível substancialmente não térmica.
[00412] 85. O sistema do parágrafo 75, em que a eletroporação é eletro-poração irreversível substancialmente não térmica.
[00413] 86. O sistema do parágrafo 75, em que a eletroporação é eletro-poração substancialmente irreversível térmica.
[00414] 87. O sistema do parágrafo 75, compreendendo ainda um primei-ro reservatório conectado de forma fluida à zona de entrada.
[00415] 88. O sistema do parágrafo 75, compreendendo ainda um segun-do reservatório conectado de forma fluida à zona de recupera- ção.
[00416] 89. O sistema do parágrafo 75, compreendendo ainda um tercei-ro reservatório conectado de forma fluida à terceira entrada e à terceira saída.
[00417] 90. O sistema do parágrafo 75, compreendendo ainda um quarto reservatório conectado de forma fluida à quarta entrada e à quarta saída.
[00418] 91. O dispositivo do parágrafo 75, em que a seção trans- versal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em circular, elipsoidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irregular.
[00419] 92. O sistema do parágrafo 75, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de entrada está entre 0,01% a 100.000% da dimen-são da seção transversal da zona de eletroporação.
[00420] 93. O sistema do parágrafo 75, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de recuperação está entre 0,01% a 100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletroporação.
[00421] 94. O sistema do parágrafo 75, em que nenhuma das zonas de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma di-mensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas em um fluido.
[00422] 95. O sistema do parágrafo 75, em que o ciclo de trabalho da eletroporação está entre 0,001% a 100%.
[00423] 96. O sistema do parágrafo 75, em que a dimensão da se- ção transversal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00424] 97. O sistema do parágrafo 75, em que o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00425] 98. O sistema do parágrafo 75, em que a dimensão da se-
ção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 5 mm.
[00426] 99. O sistema do parágrafo 75, compreendendo ainda uma fonte de distribuição de fluido conectada fluidamente à zona de entra- da, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para forne- cer a plura-lidade de células suspensas no fluido através da zona de entrada para a zona de recuperação.
[00427] 100. O sistema do parágrafo 99, em que a taxa de distribui- ção da fonte de distribuição de fluido está entre 0,001 mL / min a 1.000 mL / min.
[00428] 101. O sistema do parágrafo 75, em que o tempo de resi- dência de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0,5 ms a 50 ms.
[00429] 102. O sistema do parágrafo 75, compreendendo ainda um contro-lador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico pa- ra fornecer pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo ele- trodo para ge-rar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo ele-trodos.
[00430] 103. O sistema do parágrafo 102, em que os pulsos de vol- tagem têm uma amplitude entre 0,01 kV a 3 kV.
[00431] 104. O sistema do parágrafo 102, em que os pulsos de vol- tagem têm uma duração de entre 0,01 ms a 1.000 ms.
[00432] 105. O sistema do parágrafo 102, em que os pulsos de vol- tagem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma fre- quência en-tre 1 Hz a 50.000 Hz.
[00433] 106. O sistema do parágrafo 102, em que a forma de onda do pul-so de voltagem é selecionada do grupo que consiste em CC, quadrado, pulso, bipolar, seno, rampa, bipolar assimétrico, arbitrário e qualquer superposição ou combinações dos mesmos.
[00434] 107. O sistema do parágrafo 102, em que o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude de entre 1 V / cm a 50.000 V / cm.
[00435] 108. O sistema do parágrafo 75, em que o fluido tem uma conduti-vidade de entre 0,001 mS / cm a 500 mS / cm.
[00436] 109. O sistema de qualquer um dos parágrafos 75-108, compre-endendo ainda uma pluralidade de dispositivos de poração celular.
[00437] 110. O sistema do parágrafo 109, compreendendo ainda uma plu-ralidade de estruturas externas.
[00438] 111. Um método de introdução de uma composição em pe- lo me-nos uma porção de uma pluralidade de células suspensas em um fluido, o método compreendendo: a. fornecer um dispositivo que compreende: i. um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira entra- da e uma primeira saída, em que um lúmen do primeiro eletrodo com- preende uma zona de entrada; ii. um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada e uma segunda saída, em que um lúmen do segundo eletrodo compreende uma zona de recuperação; e iii. uma zona de eletroporação, em que a zona de eletropo- ração está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletro- do e à se-gunda entrada do segundo eletrodo, e em que a aplicação de uma dife-rença de potencial elétrico para o primeiro e o segundo eletrodos produ-zem um campo elétrico na zona de eletroporação, b. energizar o primeiro e o segundo eletrodos para produzir uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo ele- trodos, produzindo assim um campo elétrico na zona de eletroporação; e c. passar a pluralidade de células suspensas no fluido com a composição através do campo elétrico na zona de eletroporação do dis-positivo; em que o fluxo da pluralidade de células suspensas em flu- ido com a composição através do campo elétrico na zona de eletropo- ração intensi-fica a permeabilidade temporária da pluralidade de célu- las, introduzindo assim a composição em pelo menos uma porção da pluralidade de célu-las.
[00439] 112. O método do parágrafo 111, compreendendo ainda avaliar a saúde de uma porção da pluralidade de células suspensas no fluido.
[00440] 113. O método do parágrafo 112, em que a avaliação com- preende medir a viabilidade da porção da pluralidade de células sus- pensas no fluido.
[00441] 114. O método do parágrafo 112, em que a avaliação com- preende medir a eficiência de transfecção da porção da pluralidade de células suspensas no fluido.
[00442] 115. O método do parágrafo 112, em que a avaliação com- preende medir a taxa de recuperação celular da porção da pluralidade de células suspensas no fluido.
[00443] 116. O método do parágrafo 112, em que a avaliação com- preende a análise de citometria de fluxo da expressão do marcador de superfície celular.
[00444] 117. O método do parágrafo 111, em que a pluralidade de células tem de 0% a cerca de 25% de mudança fenotípica em relação a uma medição de linha de base do fenótipo celular ao sair da zona de eletropo-ração do dispositivo.
[00445] 118. O método do parágrafo 111, em que a pluralidade de células não tem alteração fenotípica ao sair da zona de eletroporação do disposi-tivo.
[00446] 119. O método do parágrafo 111, em que a eletroporação é eletro-poração reversível substancialmente não térmica.
[00447] 120. O método do parágrafo 111, em que a eletroporação é eletro-poração irreversível substancialmente não térmica.
[00448] 121. O método do parágrafo 111, em que a eletroporação é eletro-poração irreversível substancialmente térmica.
[00449] 122. O método do parágrafo 111, em que a zona de eletro- poração do dispositivo tem uma dimensão transversal uniforme.
[00450] 123. O método do parágrafo 111, em que a zona de eletro- poração do dispositivo tem uma dimensão transversal não uniforme.
[00451] 124. O método do parágrafo 111, em que o dispositivo compreen-de ainda uma pluralidade de zonas de eletroporação.
[00452] 125. O método do parágrafo 124, em que cada uma da plu- ralidade de zonas de eletroporação tem uma seção transversal unifor- me.
[00453] 126. O método do parágrafo 124, em que cada uma da plu- ralidade de zonas de eletroporação tem uma seção transversal não uniforme.
[00454] 127. O método do parágrafo 111, em que a parte c) ocorre pela aplicação de uma pressão positiva.
[00455] 128. O método do parágrafo 111, em que as células na plu- ralidade de células na amostra são selecionadas do grupo que consis- te em célu-las de mamífero, eucariotas, células sintéticas, células hu- manas, células animais, células vegetais, células primárias, linhagens celulares, células em suspensão, células aderentes, células imunes, células-tronco, célu-las sanguíneas, células vermelhas do sangue, cé- lulas T, células B, neu-trófilos, células dendríticas, células apresenta- doras de antígenos (APCs), células assassinas naturais (NK), monóci- tos, macrófagos, célu-las mononucleares do sangue periférico (PBMCs), células de rim embri-onário humano (HEK-293) ou células de ovário de hamster chinês (CHO).
[00456] 129. O método do parágrafo 128, em que as células com-
preendem células Jurkat.
[00457] 130. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem células T humanas primárias.
[00458] 131. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem células THP-1.
[00459] 132. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem macrófagos humanos primários.
[00460] 133. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem monócitos humanos primários.
[00461] 134. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem células assassinas naturais.
[00462] 135. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem células renais embrionárias humanas.
[00463] 136. O método do parágrafo 128, em que as células com- preendem células B.
[00464] 137. O método do parágrafo 111, em que a composição compre-ende pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em agentes terapêuticos, vitaminas, nanopartículas, molécu- las carregadas, moléculas não carregadas, DNA, RNA, complexo CRISPR-Cas, proteí-nas, vírus, polímeros, uma ribonucleoproteína (RNP) e polissacarídeos.
[00465] 138. O método do parágrafo 111, em que a composição tem uma concentração no fluido de entre 0,0001 µg / mL a 1000 µg / mL.
[00466] 139. O método do parágrafo 111, compreendendo ainda um pri-meiro reservatório conectado de forma fluida à zona de entrada.
[00467] 140. O método do parágrafo 111, compreendendo ainda um se-gundo reservatório conectado de forma fluida à zona de recupera- ção.
[00468] 141. O método do parágrafo 111, em que a seção transver-
sal da zona de eletroporação é selecionada do grupo que consiste em circular, elipsoidal, poligonal, estrela, paralelogramo, trapezoidal e irre- gular.
[00469] 142. O método do parágrafo 111, em que a dimensão da seção transversal da zona de entrada está entre 0,01% a 100.000% da dimen-são da seção transversal da zona de eletroporação.
[00470] 143. O método do parágrafo 111, em que a dimensão da seção transversal da zona de recuperação está entre 0,01% a
100.000% da dimensão da seção transversal da zona de eletropora- ção.
[00471] 144. O método do parágrafo 111, em que nenhuma das zo- nas de entrada, zona de recuperação ou zona de eletroporação reduz uma di-mensão de seção transversal de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido.
[00472] 145. O método do parágrafo 111, em que o ciclo de traba- lho da eletroporação está entre 0,001% a 100%.
[00473] 146. O método do parágrafo 111, em que a maior dimensão da seção transversal da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00474] 147. O método do parágrafo 111, em que o comprimento da zona de eletroporação está entre 0,005 mm e 50 mm.
[00475] 148. O método do parágrafo 111, em que a dimensão da seção transversal de qualquer um do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo está entre 0,1 mm a 5 mm.
[00476] 149. O método do parágrafo 111, em que o dispositivo compreen-de ainda uma estrutura externa que compreende um aloja- mento configu-rado para envolver o primeiro eletrodo, o segundo ele- trodo e a zona de eletroporação do dispositivo.
[00477] 150. O método do parágrafo 149, em que a estrutura exter- na compreende uma primeira entrada elétrica operativamente acopla-
da ao primeiro eletrodo e uma segunda entrada elétrica operativamen- te aco-plada ao segundo eletrodo.
[00478] 151. O método do parágrafo 149, em que a estrutura exter- na é parte integrante do dispositivo.
[00479] 152. O método do parágrafo 149, em que a estrutura exter- na é conectada de forma liberável ao dispositivo.
[00480] 153. O método do parágrafo 111, em que a taxa de distri- buição da etapa c) está entre 0,001 mL / min a 1.000 mL / min.
[00481] 154. O método do parágrafo 111, em que o tempo de resi- dência de qualquer uma da pluralidade de células suspensas no fluido está en-tre 0,5 ms a 50 ms.
[00482] 155. O método do parágrafo 111, compreendendo ainda um con-trolador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico pa- ra for-necer pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo ele- trodo para gerar uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o se-gundo eletrodos.
[00483] 156. O método do parágrafo 155, em que os pulsos de vol- tagem têm uma amplitude entre 0,01 kV a 3 kV.
[00484] 157. O método do parágrafo 155, em que os pulsos de vol- tagem têm uma duração de entre 0,01 ms a 1.000 ms.
[00485] 158. O método do parágrafo 155, em que os pulsos de vol- tagem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma fre- quência en-tre 1 Hz a 50.000 Hz.
[00486] 159. O método do parágrafo 155, em que a forma de onda do pul-so de voltagem é selecionada do grupo que consiste em CC, quadrado, pulso, bipolar, seno, rampa, bipolar assimétrico, arbitrário e qualquer superposição e combinaçãodos mesmos.
[00487] 160. O método do parágrafo 155, em que o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude de entre 1 V / cm a 50.000 V / cm.
[00488] 161. O método do parágrafo 111, em que o fluido tem uma condu-tividade de entre 0,001 mS / cm a 500 mS / cm.
[00489] 162. O método do parágrafo 111, compreendendo ainda um aloja-mento configurado para alojar o dispositivo.
[00490] 163. O método do parágrafo 162, em que o alojamento compreen-de ainda um controlador térmico configurado para aumentar ou diminuir a temperatura do alojamento.
[00491] 164. O método do parágrafo 163, em que o controlador térmico é um elemento de aquecimento selecionado do grupo que consiste em um bloco de aquecimento, fluxo de líquido, aquecedor alimentado por bateria e um aquecedor de filme fino.
[00492] 165. O método do parágrafo 163, em que o controlador térmico é um elemento de resfriamento selecionado do grupo que con- siste em um fluxo de líquido, resfriador evaporativo e um dispositivo Peltier.
[00493] 166. O método de qualquer um dos parágrafos 112-166, em que a temperatura da pluralidade de células suspensas no fluido está entre 0°C a 50°C.
[00494] 167. O método de qualquer um dos parágrafos 111-166, em que o dispositivo compreende uma pluralidade de dispositivos de po- ração de células.
[00495] 168. O método do parágrafo 167, em que o dispositivo compreen-de uma pluralidade de estruturas externas.
[00496] 169. O método de qualquer um dos parágrafos 111-168, compre-endendo ainda o armazenamento da pluralidade de células suspensas no fluido em um tampão de recuperação após a poração.
[00497] 170. O método de qualquer um dos parágrafos 111-169, em que as células eletroporadas têm uma viabilidade após a introdução da com-posição entre 0,1 a 99,9%.
[00498] 171. O método de qualquer um dos parágrafos 111-170, em que a eficiência da introdução da composição nas células está entre 0,1 a 99,9%.
[00499] 172. O método de qualquer um dos parágrafos 111-171, em que o número de células recuperadas está entre 104 células a 1012 células.
[00500] 173. O método de qualquer um dos parágrafos 111-172, em que o rendimento da célula viva modificada está entre 0,1 a 500%.
[00501] 174. Um kit para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um fluido, compreendendo: a. uma pluralidade de dispositivos de poração celular, cada um da pluralidade de dispositivos de poração de célula compreenden- do: i. um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira entra- da e uma primeira saída, em que um lúmen do primeiro eletrodo com- preende uma zona de entrada; ii. um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada e uma segunda saída, em que um lúmen do segundo eletrodo compreende uma zona de recuperação; e iii. uma zona de eletroporação, em que a zona de eletropo- ração está fluidamente conectada à primeira saída do primeiro eletro- do e à se-gunda entrada do segundo eletrodo, em que a zona de ele- troporação tem uma dimensão de seção transversal substancialmente uniforme e em que a aplicação de uma diferença de potencial elétrico para o primeiro e o segundo eletrodos produzem um campo elétrico na zona de eletropora-ção; b. uma pluralidade de estruturas externas configuradas pa- ra envolver a pluralidade de dispositivos de poração de célula, em que cada uma da pluralidade de estruturas externas compreende: i. um alojamento configurado para engatar eletromecanica- men-te o primeiro eletrodo, o segundo eletrodo e a zona de eletropo-
ração do pelo menos um dispositivo de poração de célula; ii. uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo; e iii. uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo; e c. um tampão de transfecção para eletroporar a pluralidade de células suspensas no fluido.
[00502] 175. O kit do parágrafo 174, em que as estruturas externas são parte integrante da pluralidade de dispositivos de poração celular.
[00503] 176. O kit do parágrafo 174, em que as estruturas externas são conectadas de forma liberável à pluralidade de dispositivos de po- ração celular. Outras Modalidades
[00504] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são incorporados aqui por referência na mesma extensão como se cada publicação independente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. No caso de uma definição conflitante entre esta e qualquer referência incorporada neste documento, a definição fornecida neste documento se aplica.
[00505] Embora a divulgação tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será entendido que ela é capaz de modificações adicionais e este pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da divulgação seguindo, em geral, os princípios da divulgação e incluindo tais desvios da presente divulga- ção que vêm dentro da prática conhecida ou costumeira dentro da téc- nica à qual a divulgação pertence e podem ser aplicados às caracterís- ticas essenciais aqui estabelecidas, e segue no escopo das reivindica- ções.
[00506] Outras modalidades estão dentro das reivindicações.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Dispositivo para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira en- trada, uma primeira saída e um primeiro lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; (b) um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada, uma segunda saída e um segundo lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; e (c) uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação compre- ende uma dimensão de seção transversal mínima maior que cerca de 100 µm, em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme; em que a primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica.
    2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que uma seção transversal da zona de eletroporação é uma forma selecionada de um grupo que consiste em circular, disco, elíptica, polígono regular, polígono irregular, forma curvilínea, estrela, paralelograma, trapezoidal e irregular.
    3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a zona de eletroporação tem uma seção transversal substancialmente circular.
    4. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a zona de eletroporação tem uma dimensão de seção transversal mínima entre 0,1 mm e 50 mm.
    5. Dispositivo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal entre cerca de 7.850 µm2 e cerca de 2.000 mm2.
    6. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,1 mm e 50 mm.
    7. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que um lúmen de qualquer do primeiro eletrodo e/ou do segundo eletrodo tem uma dimensão de se- ção transversal mínima entre 0,01 mm e 500 mm.
    8. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma razão da dimensão de seção transversal mínima de um lúmen de qualquer do primeiro ou do segundo eletrodos para a dimensão de seção transversal mínima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10:1.
    9. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a razão da dimensão de se- ção transversal mínima da zona de eletroporação para o comprimento da zona de eletroporação está entre 1:100 e 100:1.
    10. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a razão de uma área de seção transversal de um lúmen de qualquer um do primeiro eletrodo e/ou do segundo eletrodo para a área de seção transversal da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10:1.
    11. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um primeiro reservatório em comunicação fluídica com a primeira entrada e/ou um segundo reservatório em comunicação de fluido com a se- gunda saída.
    12. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um terceiro reservatório em comunicação fluídica com o primeiro lúmen ou o segundo lúmen.
    13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, caracte- rizado pelo fato de que qualquer do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo tem uma entrada ou saída adicional para comunicação fluídi- ca com o terceiro reservatório.
    14. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreen- de ainda uma ou mais zonas de eletroporação adicionais.
    15. Sistema para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um dispositivo de poração de célula, compreendendo: (i) um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira en- trada, uma primeira saída e um primeiro lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; (ii) um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada, uma segunda saída e um segundo lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; e (iii) uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação compre- ende uma dimensão de seção transversal mínima maior que cerca de 100 µm, em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme; em que a primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica; e (b) uma fonte de potencial elétrico, em que o primeiro ele- trodo e o segundo eletrodo do dispositivo estão liberavelmente em contato operativo com a fonte de potencial elétrico.
    16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda um primeiro reservatório em comunicação fluídica com a primeira entrada.
    17. Sistema, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, ca- racterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo reservató- rio em comunicação fluídica com a segunda saída.
    18. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um terceiro reservatório em comunicação fluídica com um lúmen de qual- quer do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo, em que qualquer do primeiro eletrodo ou do segundo eletrodo tem uma entrada adicional para comunicação fluídica com o terceiro reservatório.
    19. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma fonte de distribuição de fluido em comunicação fluídica com a primeira entrada, em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para distribuir o líquido e/ou a pluralidade de células em suspensão através do primeiro lúmen para a segunda saída.
    20. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um controlador operativamente acoplado à fonte de potencial elétrico para distribuir pulsos de voltagem ao primeiro eletrodo e ao segundo eletro- do, em que os pulsos de voltagem geram uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo, assim produ- zindo um campo elétrico na zona de eletroporação.
    21. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 20, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende ainda uma ou mais zonas de eletroporação adicionais.
    22. Sistema, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda um alojamento configurado para energizar as zonas de eletroporação paralelas, em série ou des- viadas em tempo, em que o alojamento compreende ainda uma ban-
    deja que acomoda uma pluralidade de dispositivos de eletroporação, em que a bandeja é modificada com dois eletrodos de grade, em que um primeiro eletrodo de grade é eletricamente isolado de um segundo eletrodo de grade, em que um exterior do primeiro eletrodo de cada um da pluralidade de dispositivos é liberável em contato operativo com qualquer de um primeiro eletrodo com mola, um primeiro eletrodo co- nectado mecanicamente, ou um primeiro eletrodo conectado indutiva- mente, em que um exterior do segundo eletrodo de cada um da plura- lidade de dispositivos é liberável em contato operativo com qualquer de um segundo eletrodo carregado por mola, um segundo eletrodo co- nectado mecanicamente ou um segundo eletrodo acoplado indutiva- mente, em que cada um da pluralidade de dispositivos entra de forma liberável no alojamento através de uma abertura nos eletrodos de gra- de, em que qualquer do primeiro eletrodo carregado por mola, primeiro eletrodo conectado mecanicamente ou primeiro eletrodo indutivamente conectado de cada dispositivo está em contato operativo com o primei- ro eletrodo de grade e qualquer do segundo eletrodo carregado por mola, segundo eletrodo mecanicamente conectado ou segundo eletro- do indutivamente conectado de cada dispositivo está em contato ope- rativo com o segundo eletrodo de grade, em que os eletrodos de grade estão conectados à fonte de potencial elétrico.
    23. Sistema, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que a fonte de potencial elétrico distribui pulsos de voltagem para os eletrodos de grade, em que o primeiro eletrodo de grade é energizado em uma voltagem aplicada particular, enquanto o segundo eletrodo de grade é energizado a uma voltagem aplicada par- ticular, em que cada um da pluralidade de dispositivos é energizado pelos eletrodos de grade com um pulso de voltagem aplicado idêntico, de modo que uma magnitude de um campo elétrico gerado dentro de cada uma das pelo menos uma zona de eletroporação de cada dispo-
    sitivo seja substancialmente idêntico.
    24. Sistema, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que a fonte de potencial elétrico inclui circuitos adici- onais ou programação configurada para modular a distribuição de pul- sos de voltagem para os eletrodos de grade, em que cada um da plu- ralidade de dispositivos recebe uma voltagem diferente dos eletrodos de grade, em que um magnitude de um campo elétrico gerado dentro de cada uma das pelo menos uma zona de eletroporação de cada dis- positivo é diferente.
    25. Sistema para eletroporar uma pluralidade de células suspensas em um líquido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um dispositivo de poração de célula, compreendendo: (i) um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira en- trada, uma primeira saída e um primeiro lúmen; (ii) um segundo eletrodo compreendendo uma segunda en- trada, uma segunda saída e um segundo lúmen; (iii) uma terceira entrada e uma terceira saída, em que a terceira entrada e a terceira saída estão em comunicação fluídica com o primeiro lúmen, em que a terceira entrada e a terceira saída inter- ceptam o primeiro eletrodo entre a primeira entrada e a primeira saída; (iv) uma quarta entrada e uma quarta saída, em que a quar- ta entrada e a quarta saída estão em comunicação fluídica com o se- gundo lúmen, em que a quarta entrada e a quarta saída interceptam o segundo eletrodo entre a segunda entrada e a segunda saída; e (v) uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação tem um comprimento entre 0,1 mm e 50 mm e compreende uma dimensão de seção transversal mínima maior que cerca de 100 µm, em que uma seção transversal a área da zona de eletroporação é substancialmente uniforme;
    em que uma razão de uma dimensão de seção transversal mínima do primeiro lúmen para a dimensão de seção transversal mí- nima da zona de eletroporação está entre 1:10 e 10:1, em que uma razão de uma dimensão de seção transversal mínima do segundo lú- men para a dimensão de seção transversal mínima da zona de eletro- poração está entre 1:10 e 10:1, e em que a primeira saída, a zona de eletroporação e a segunda entrada estão em comunicação fluídica; e (b) uma fonte de potencial elétrico, em que o primeiro e o segundo eletrodos do dispositivo estão liberavelmente em contato ope- rativo com a fonte de potencial elétrico.
    26. Método para introduzir uma composição em uma plura- lidade de células suspensas em um líquido fluindo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um dispositivo compreendendo: (i) um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira saí- da, uma primeira entrada e um primeiro lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; (ii) um segundo eletrodo compreendendo uma segunda sa- ída, uma segunda entrada e um segundo lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; e (iii) uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda saída, em que a zona de eletroporação compreen- de uma dimensão de seção transversal mínima maior que cerca de 100 µm, em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme; e em que a primeira saída, a zona de eletroporação e a se- gunda entrada estão em comunicação fluídica; (b) aplicar uma diferença de potencial elétrico entre o pri- meiro e o segundo eletrodos, desse modo produzindo um campo elé- trico na zona de eletroporação; e
    (c) passar a pluralidade de células e a composição através da zona de eletroporação, desse modo aumentando a permeabilidade da pluralidade de células e introduzindo a composição na pluralidade de células.
    27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que a pluralidade de células está em um líquido sepa- rado da composição antes da etapa (b).
    28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, carac- terizado pelo fato de que a etapa (b) compreende aplicar uma pressão positiva acionada por fluido.
    29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 28, caracterizado pelo fato de que nenhum do primeiro lú- men, segundo lúmen ou da zona de eletroporação tem uma dimensão de seção transversal mínima que faz uma dimensão de seção trans- versal de qualquer da pluralidade de células suspensas no líquido ser comprimida temporariamente.
    30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 29, caracterizado pelo fato de que uma taxa de fluxo de um líquido e/ou da pluralidade de células em suspensão distribuídas de uma fonte de distribuição de fluido do primeiro lúmen para a zona de eletroporação está entre 0,001 mL/min. e 1.000 mL/min., em que a fonte de distribuição de fluido é configurada para distribuir o líquido e/ou a pluralidade de células em suspensão através do primeiro lúmen para a segunda saída.
    31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 30, caracterizado pelo fato de que um tempo de residência na zona de eletroporação da pluralidade de células suspensas no lí- quido está entre 0,5 ms e 50 ms.
    32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 31, caracterizado pelo fato de que o campo elétrico é produ-
    zido por pulsos de voltagem.
    33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que os pulsos de voltagem energizam o primeiro ele- trodo em uma voltagem aplicada particular, enquanto o segundo ele- trodo é energizado em uma voltagem aplicada particular, aplicando assim uma diferença de potencial elétrico entre o primeiro e o segundo eletrodos.
    34. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, carac- terizado pelo fato de que cada um dos pulsos de voltagem tem uma amplitude entre -3 kV e 3 kV.
    35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 34, caracterizado pelo fato de que os pulsos de voltagem têm uma duração entre 0,01 ms e 1.000 ms.
    36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 35, caracterizado pelo fato de que os pulsos de voltagem são aplicados ao primeiro e ao segundo eletrodos a uma frequência entre 1 Hz e 50.000 Hz.
    37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 36, caracterizado pelo fato de que o pulso de voltagem compreende uma forma de onda selecionada de um grupo que consis- te em CC, quadrada, pulso, bipolar, seno, rampa, bipolar assimétrica, arbitrária e qualquer superposição ou combinação das mesmas.
    38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 37, caracterizado pelo fato de que o campo elétrico gerado a partir dos pulsos de voltagem tem uma magnitude entre 1 V/cm e
    50.000 V/cm.
    39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 38, caracterizado pelo fato de que um ciclo de trabalho dos pulsos de voltagem está entre 0,001% e 100%.
    40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
    ções 26 a 39, caracterizado pelo fato de que o líquido tem uma condu- tividade entre 0,001 mS/cm e 500 mS/cm.
    41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 40, caracterizado pelo fato de que uma temperatura da plu- ralidade de células suspensas no líquido está entre 0°C e 50°C.
    42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda arma- zenar a pluralidade de células suspensas no líquido em um tampão de recuperação após poração.
    43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 42, caracterizado pelo fato de que a composição compreen- de pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em agentes terapêuticos, vitaminas, nanopartículas, moléculas carrega- das, moléculas não carregadas, DNA, RNA, complexo CRISPR-Cas, proteínas , enzimas, peptídeos, vírus, polímeros, uma ribonucleoprote- ína, polissacarídeos, nucleases modificadas, nucleases efetoras tipo ativadores de transcrição (TALENs), nucleases dedo de zinco (ZFNs), nucleases homing, meganucleases (MNs), megaTALs e transposons.
    44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 43, caracterizado pelo fato de que a composição tem uma concentração no líquido entre 0,0001 µg/mL e 1.000 µg/mL.
    45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 44, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de células suspensas no líquido compreende células eucarióticas, células de planta, células procarióticas ou células sintéticas.
    46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que a pluralidade de células compreende células hu- manas ou células animais.
    47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 46, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de células compreende células primárias, células de uma linhagem de células, células aderentes, células não estimuladas, células estimuladas, célu- las ativadas, células tronco, células sanguíneas, células de ovário de hamster chinês (CHO), células imunes, glóbulos vermelhos ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
    48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a pluralidade de células compreende células imu- nes adaptativas e/ou células imunes inatas.
    49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 48, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de células compreende células apresentadoras de antígeno (APCs), monócitos, células T, células B, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, célu- las assassinas naturais (NK), células Jurkat, células THP-1, células de rim embrionário humano (HEK-293) ou células tronco embrionárias (ESCs), células tronco mesenquimais (MSCs) ou células tronco hema- topoiéticas (HSCs).
    50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 47, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de células compreende células NK humanas primárias, células tronco pluripoten- tes induzidas por humanos primárias (iPSCs), macrófagos humanos primários ou monócitos humanos primários.
    51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 50, caracterizado pelo fato de que compreende ainda arma- zenar a pluralidade de células suspensas no líquido em um tampão de recuperação após poração.
    52. Kit para eletroporar uma pluralidade de células suspen- sas em um líquido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma pluralidade de dispositivos de poração celular, cada um da pluralidade de dispositivos de poração de célula compreenden- do:
    (i) um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira saí- da, uma primeira entrada e um primeiro lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; (ii) um segundo eletrodo compreendendo uma segunda sa- ída, uma segunda entrada e um segundo lúmen compreendendo uma dimensão de seção transversal mínima; e (iii) uma zona de eletroporação disposta entre a primeira saída e a segunda entrada, em que a zona de eletroporação compre- ende uma dimensão de seção transversal mínima maior que cerca de 100 µm, em que a zona de eletroporação tem uma área de seção transversal substancialmente uniforme; e em que a aplicação de uma diferença de potencial elétrico ao primeiro e ao segundo eletrodos produz um campo elétrico na zona de eletroporação; e (b) uma pluralidade de estruturas externas configuradas para encerrar a pluralidade de dispositivos de poração de célula, em que cada uma da pluralidade de estruturas externas compreende: (i) um alojamento configurado para envolver o primeiro ele- trodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do pelo menos um dispositivo de poração de célula; (ii) uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo; e (iii) uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo.
    53. Kit para eletroporar uma pluralidade de células suspen- sas em um líquido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma pluralidade de dispositivos de poração de célula, cada um da pluralidade de dispositivos de poração de célula compre- endendo um dispositivo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 48; e
    (b) uma pluralidade de estruturas externas configuradas para encerrar a pluralidade de dispositivos de poração de célula, em que cada uma da pluralidade de estruturas externas compreende: (i) um alojamento configurado para envolver o primeiro ele- trodo, o segundo eletrodo e a zona de eletroporação do pelo menos um dispositivo de poração de célula; (ii) uma primeira entrada elétrica operativamente acoplada ao primeiro eletrodo; e (iii) uma segunda entrada elétrica operativamente acoplada ao segundo eletrodo.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220347468A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 Kytopen Corporation Methods for electro-mechanical transfection
WO2024015072A1 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Cell porating and optically detecting microfluidic devices

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2019758C (en) * 1990-06-25 2001-09-04 Kevin L. Firth Improved electroporation device and method
US6593130B1 (en) * 1999-04-16 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for ex vivo and in vivo cellular electroporation of gene protein or drug therapy
DK1456345T3 (en) * 2001-08-22 2016-09-26 Maxcyte Inc Apparatus and method for electroporation of biological samples
EP1620537B1 (en) * 2003-03-14 2012-10-24 Cellectis SA Large volume ex vivo electroporation method
US6897069B1 (en) * 2004-06-08 2005-05-24 Ambion, Inc. System and method for electroporating a sample
US20070105206A1 (en) * 2005-10-19 2007-05-10 Chang Lu Fluidic device
SI22368A (sl) * 2006-10-25 2008-04-30 Univerza V Ljubljani Fakulteta Za Elektrotehniko Konicasta komora z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo manjsega volumna, za elektrofuzijo in gensko transfekcijo
ES2534579T3 (es) * 2007-02-23 2015-04-24 Lonza Cologne Gmbh Dispositivo y procedimiento para estabilizar el flujo a través de una cámara
EP2432412A2 (en) * 2009-05-20 2012-03-28 Herlev Hospital Electroporation device with improved tip and electrode support
EP2338356A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-29 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Reactor system for electroporation
PT2768942T (pt) * 2011-10-17 2020-01-21 Massachusetts Inst Technology Entrega intracelular
US10947526B2 (en) * 2014-07-03 2021-03-16 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic assay for rapid optimization of cell electroporation
KR20180042422A (ko) * 2015-09-04 2018-04-25 룻거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴저지 단일 세포로의 효율적인 분자 전달을 위한 고효율, 피드백-제어된 전기천공 마이크로디바이스
US20190136224A1 (en) * 2016-05-31 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Hydrodynamically Controlled Electric Fields for High Throughput Transformation & High Throughput Parallel Transformation Platform
CN108325063B (zh) * 2017-12-22 2023-12-15 广州析芒医疗科技有限公司 带有电刺激微针尖阵列结构的装置

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