ES2964036T3

ES2964036T3 - Método para expandir la pluripotencialidad y la diferenciación potencial de células pluripotentes

Info

Publication number: ES2964036T3
Application number: ES18727784T
Authority: ES
Inventors: Marcos Malumbres; María Salazar-Roa; Marianna Trakala; Mónica Alvarez-Fernandez
Original assignee: Fundacion del Sector Publico Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas Carlos III FSP CNIO
Current assignee: Fundacion del Sector Publico Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas Carlos III FSP CNIO
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2024-04-03
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: EP3630954B1; EP3406712A1; CA3064330A1; WO2018215662A1; EP3630954A1; JP2020527050A

Abstract

Método para ampliar el potencial de potencia y diferenciación de células pluripotentes. La invención se basa en el hallazgo de que el aumento de los niveles de micro ARN-203 en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o células madre embrionarias (ESC) mejora la calidad del destino celular, el potencial y la capacidad de estas células para diferenciarse en múltiples linajes celulares y alcanzar una mayor maduración. propiedades sin interferir con sus propiedades de autorrenovación. Este efecto está mediado a través del control dependiente de mi R-203 de las ADN metiltransferasas de novo Dnmt3a y Dnmt3b, que a su vez regulan el panorama de metilación de las células pluripotentes. El efecto se puede lograr mediante la sobreexpresión de micro ARN-203 o agregando micro ARN-203 o análogos del mismo al medio de cultivo celular y se puede observar usando una variedad de modelos celulares e in vivo. Las células generadas son células pluripotentes vírgenes con una capacidad mejorada de diferenciación, que pueden usarse para obtener células maduras y diferenciadas más eficientemente, competentes para estrategias de medicina regenerativa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para expandir la pluripotencialidad y la diferenciación potencial de células pluripotentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para mejorar la potencialidad de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y células madre embrionarias (ESC). Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para aumentar la diferenciación potencial de dichas células.

Antecedentes de la invención

Las células madre pluripotentes proporcionan una promesa importante para la medicina regenerativa debido a su potencial de autorenovación y la capacidad para diferenciarse en múltiples líneas celulares.

La pluripotencia puede definirse como la capacidad a nivel celular individual de generar múltiples líneas celulares somáticas además de células germinales. En el embrión de preimplantación, la pluripotencia se establece en el epiblasto de la masa celular interna tardía (ICM), que contiene células que pueden desarrollarse en todos los tejidos distintos de la placenta. Estas células pueden capturarse y mantenerse en cultivo como células madre embrionarias (ESC). Tanto las células ICM como las ESC pueden contribuir a las quimeras y colonizar la reintroducción de la línea germinal al embrión, proporcionando una prueba funcional de su pluripotencia naive. Por el contrario, ni el epiblasto posimplantación ni las células madre pluripotentes activadas derivadas de este tejido tienen la capacidad de contribuir de forma eficaz a quimeras después de la integración en blastocistos. Por lo tanto, está bien establecido que pueden observarse dos estados pluripotentes distintos en células pluripotentes de ratones: el estado base o naive, ejemplificado por las células madre embrionarias de ratón (mESC), y el estado pluripotente activado representado por células madre de epiblasto posimplantación de ratón (mEpiSC). Las diferencias más claras entre los dos estados son: morfología de la colonia, (con forma de cúpula compacta en caso de las células naive y aplanada en el caso de las células activadas), requisito de factor de crecimiento para el mantenimiento del estado pluripotente (las células naive son dependientes de LIF mientras que las células activadas dependen de activina/FGF2), y contribución a quimeras y a la transmisión de la línea germinal (las células naive son capaces de contribuir a las quimeras mientras que las células activadas nunca lo haceK). La pluripotencia naive se pierde entonces en el embrión tras la diferenciación somática y solo puede restablecerse experimentalmente mediante estrategias de reprogramación.

La reprogramación es el proceso por el cual las células adultas se convierten en células que están en un estado parecido a células madre embrionarias. La reprogramación completa de las células puede considerarse estrechamente relacionada o como un sinónimo de funcionalidad mejorada y pluripotencia naive.

El protocolo original para reprogramar células somáticas a células pluripotentes inducidas (iPSC) se estableció en 2006 por Yamanaka y colaboradores (Takahashi y Yamanaka, 2006), razón por la cual se conoce normalmente como el protocolo original de Yamanaka, y se describió en la patente europea EP10970446. Permite la conversión de células somáticas diferenciadas a un estado pluripotente. El método original se basa en la introducción en las células adultas de ciertos genes importantes para el mantenimiento de las propiedades esenciales de células madre embrionarias (ESC), de manera que las células somáticas (fibroblastos de ratón en la primera descripción) están en contacto con un factor de reprogramación nuclear que comprende un producto génico de cada una de las siguientes familias: familia Oct, familia Klf y familia Myc y, preferiblemente, también un producto génico de la familia Sox. Una de las realizaciones usadas más habitualmente de dicho método implica el uso de los productos de los genes Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, que son también conocidos por los expertos en la técnica como los cuatro factores de Yamanaka. La abreviatura OSKM se usa a menudo para la combinación de dichos cuatro factores.

Las células obtenidas se denominan células madre pluripotentes inducidas (iPSC), porque su pluripotencia y capacidad de crecimiento se consideran similares a las de las células madre embrionarias (ESC).

Las iPSC han atraído mucha atención debido a su potencial utilidad como una herramienta para el desarrollo farmacológico, modelado de enfermedades y medicina de trasplantes. De interés, los problemas éticos asociados con la producción de ESC no se aplican a las iPSC, que ofrecen una estrategia no controvertida para generar líneas de células madre específicas para el paciente. Sin embargo, antes de que la reprogramación pueda considerarse de uso como una herramienta clínica, la eficacia del proceso debe mejorarse sustancialmente.

Por consiguiente, desde la primera descripción del método de reprogramación, se han enfocado múltiples esfuerzos en mejorarlo. Un problema muy importante ha sido aumentar la eficacia de la reprogramación celular, que es normalmente baja, de manera que se obtiene un bajo número de iPSC naive a partir de las células somáticas diferenciadas de partida. Añadir simplemente factores de transcripción a una población de células diferenciadas no garantiza la reprogramación: la baja eficacia de la reprogramaciónin vitrosugiere que son necesarios sucesos raros adicionales para generar iPSC naive, y la eficacia de la reprogramación disminuye incluso más con fibroblastos que se han cultivado durante largos periodos de tiempo. Además, la etapa de diferenciación de la célula de partida parece impactar directamente en la eficacia de reprogramación; las células madre hematopoyéticas y progenitoras de ratón dan lugar a iPSC naive hasta 300 veces más eficazmente que lo que lo hacen sus equivalentes de células B y T diferenciadas terminalmente.

Además, un punto importante es que las frecuencias de reprogramación presentadas se basan a menudo en criterios como la actividad de la fosfatasa alcalina y la activación de genes reporteros. Tanto las iPSC como las ESC naive demuestran importantes características de células madre pluripotentes, (que incluyen la expresión de marcadores de células madre y la formación de tumores que contienen tipos de células de las tres capas embrionarias primitivas). Sin embargo, la pluripotencia naive de las iPSC no está absolutamente clara ya que su eficacia en la producción de progenie que nazca viva es muy reducida en comparación con las ESC. Por lo tanto, la contribución a quimeras y la transmisión de la línea germinal sirven como demostración más rigurosa de la reprogramación eficaz, aunque la cuantificación de dichas cualidades es técnicamente difícil y no se usa frecuentemente (revisado por Bilic e Izpisua Belmonte, 2012).

Aumentar la seguridad del proceso disminuyendo el potencial de transformación de los factores de reprogramación y los vectores usados para su expresión ha sido también una causa principal de preocupación. Las estrategias para evitar el uso de transducción viral o integración genómica están bajo desarrollo activo para sustituir los vectores virales integrativos usados inicialmente para introducir los genes que codifican los factores de reprogramación en las células. Además, se han puesto muchos esfuerzos para mejorar las propiedades de pluripotencia de las iPSC expandiendo el potencial de diferenciación en una variedad más amplia de líneas celulares o mejorando las propiedades de maduración en tipos de células funcionales específicas (Li e Izpisua Belmonte, 2016).

Por todas estas razones, el protocolo original de reprogramación de células diferenciadas en iPSC ha sido el sujeto de muchas modificaciones, consistiendo la mayoría de ellas en la sustitución de diferentes compuestos para uno o más de los factores originales de Yamanaka o usando ARN adicionales que codifican proteínas adicionales a los factores originales. Por consiguiente, hay ahora muchas variantes del protocolo para iPS, que incluyen aquellos que usan microARN o inhibidores de moléculas pequeñas de modificadores epigenéticos.

Se ha encontrado que muchos inhibidores de moléculas pequeñas mejoran la eficacia de reprogramación, inhibiendo enzimas o rutas de señalización específicas. Este grupo incluye inhibidores de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), glicógeno sintasa quinasa 3 beta (GSK3b), factor de crecimiento transformador beta (TGF-b), HDACs que modifican la cromatina (histona desacetilasas) o DNMTs (ADN metiltransferasas), y muchos más que también pueden mejorar la eficacia de reprogramación en combinación con los factores de Yamanaka.

El uso del ARN de interferencia (ARNi) para regular de forma negativa la expresión de factores epigenéticos y supresores tumorales también promueve la reprogramación. Diversos estudios han mostrado que el uso de ARNip (ARN de interferencia pequeño) contra marcadores de líneas diferenciadas junto con inhibidores de ADN metiltransferasa (5-aza-citidina; AZA) ayuda a lograr la reprogramación completa de células parcialmente reprogramadas (Mikkelsen et al., 2008). La interferencia de ARN frente a la ADN metiltransferasa Dnmt1 también ayuda en la transición del estado parcialmente reprogramado al estado pluripotente y, de hecho, la memoria epigenética de las células pluripotentes es un factor conocido por actuar como una barrera en el establecimiento de células pluripotentes (Mikkelsen et al., 2008). Varios trabajos anteriores demuestran que las manipulaciones de la metilación del ADN, durante el proceso de reprogramación, influyen en el éxito de la reprogramación desde células somáticas a células pluripotentes: el uso de demetilasas durante la reprogramación puede potenciar la reprogramación a células pluripotentes, pero las células pluripotentes obtenidas no son útiles para aplicaciones, ya que la estrategia genética usada en esos casos es irreversible y las células pluripotentes necesitan re-metilar su ADN para la diferenciación, lo que hace a las células reprogramadas obtenidas inútiles para la medicina regenerativa (Papp y Plath, 2011).

La supresión mediada por ARNi de los supresores tumorales p53 y p21 también acelera el proceso de reprogramación aumentando la velocidad de división celular (Hanna et al., 2009).

Pero, más allá de su capacidad para promover la reprogramación eficaz, varios problemas relacionados con la seguridad de pequeñas moléculas necesitan abordarse cuidadosamente. Por ejemplo, AZA se conoce por inducir daño en el<a>D<n>y la muerte celular (Mikkelsen et al., 2008). Deberían evitarse las modificaciones permanentes (genómicas o epigenómicas), y hoy en día, no hay estudios que indiquen la optimización de la dosis o la duración del tratamiento quími

mencionadas anteriormente, además de diferentes estrategias para inhibir el estado diferenciado en la reprogramación celular, cuyas estrategias deberían mejorar, preferiblemente, la reprogramación total de células somáticas a iPSC naive.

Los microARN (frecuentemente abreviados como miARN, o miR cuando se acompaña de la identificación específica de uno de ellos) son pequeños (15-25 nucleótidos, muy a menudo 20-21-nt) ARN no codificantes que pueden modular la expresión de los ARN que codifican proteínas y juegan por consiguiente múltiples funciones en la célula (Ambros, 2004). Recientes evidencias sugieren que los miARN también están relacionados con la pluripotencia mediante el control de la expresión de los factores de transcripción de la pluripotencialidad, la trans-diferenciación epitelialmesenquimal, progresión del ciclo celular o el patrón epigenético de las células (Shenoy y Blelloch, 2014; Leonardo et al., 2012).

Por ejemplo, mir-302-367 están directamente relacionados con los niveles de los tres factores de transcripción Oct4, Sox2 y Nanog (Card et al., 2008; Marson et al., 2008). Se ha encontrado que un miARN particular, miR-302, que se expresa en abundancia en las ESC, es capaz de transformar las líneas celulares cancerígenas humanas que se parecen a las ESC (Lin et al., 2008). Otros grupos como miR-290-295 o miR-106-363 también están co-ocupados por promotores Oct4, Sox2 y Nanog (Marson et al., 2008).

Algunos métodos para producir células madre pluripotentes se basan en combinar la introducción de al menos un ARNm en una célula diana con la introducción de al menos un miARN en las células diana. La solicitud de patente de EE.UU. publicada como US20150232810A1, por ejemplo, describe la posibilidad de producir células madre pluripotentes usando miARN o miméticos de miARN en combinación con ARNm, definiendo un mimético de miARN como un miARN sintético que tiene estabilidad mejorada debido a nucleótidos modificados o modificaciones estructurales (p. ej. protuberancias o bucles) y también como pequeños ARN de doble cadena químicamente modificados que imitan a miARN endógenos y permiten un análisis funcional de miARN mediante la sobrerregulación de la actividad de miARN. El método descrito en el documento US20150232810A1 se refiere específicamente a la mejora de la reprogramación, ya que se dice que permite la generación de iPSC a partir de líneas celulares que son refractarias a métodos que implican ARNm solo de miARN solo.

Otros trabajos, relacionados con los miARN y la pluripotencialidad, se han enfocado en las firmas moleculares que caracterizan a la pluripotencialidad. Así, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. publicada como US20130345289A1 se basa en la identificación de firmas de miARN específicos de células madre que se expresan únicamente en células madre adultas y describe un método para identificar la presencia de células madre adultas clínicamente utilizables en una muestra biológica derivada de un sujeto adulto determinando el nivel de un producto génico miR en la muestra biológica, comparándolo con el nivel de un producto génico miR correspondiente en una muestra de control anatómicamente correcta y decidiendo que el sujeto porta dichas células madre adultas clínicamente utilizables cuando hay diferencias en el nivel de productos génicos específicos entre muestras. Uno de los posibles microARN útiles como marcadores para ese propósito es hsa-mir-203-precNo1, que se expresa en células diferenciadas pero no en la población de células madre. A partir del número de acceso incluido en el documento US20130345289A1 para hsa-mir-203-precNo1 y la comparación con la información disponible en la base de datos de miRbase (http://www.mirbase.org/) el 12 de marzo de 2017, se puede concluir que es hsa-miR203a-3p (SEQ ID NO:1, Acceso en miRbase MIMAT0000264), la secuencia madura principal generada por el gen de hsa-miR-203a humano (SEQ ID NO:2, Acceso en miRbase MI0000283). Una segunda secuencia madura puede generarse a partir de hsamiR-203a, hsa-miR-203a-5p* (SEQ ID NO:53, Acceso en miRbase MIMAT0031890).

Por consiguiente, como ocurre con muchos otros microARN, dos microARN maduros pueden originarse desde brazos contrarios del mismo pre-miARN, has-miR-203a, que se denotan con un sufijo -3p o -5p. Sin embargo, el microARN maduro encontrado de un brazo de la horquilla es normalmente mucho más abundante que el encontrado del otro brazo, en cuyo caso, un asterisco a continuación del nombre indica la especie madura encontrada a niveles bajos del brazo contrario de una horquilla. En el caso de miR-203, la forma madura más abundante es miR-203a-3p, mientras que la forma de poca abundancia se denomina miR-203a-5p*

El miR-203 humano se expresa desde el cromosoma 19. Su equivalente murino, mmu-miR-203 (SEQ ID NO:3, Acceso en miRbase MI0000246) se expresa desde el cromosoma 14 deMus musculus.La secuencia madura principal de mmu-miR-203, mmu-miR-203-3p (SEQ ID NO:4, Acceso en miRbase MIMAT0000236) parece ser idéntica a la de hsamiR203a-3p. Hay evidencias experimentales de una segunda secuencia madura, mmu-miR-203-5p* (SEQ ID NO:54, Acceso en miRbase MIMAT0004547), que es más corta que hsa-miR-203a-5p (22 nucleótidos en vez de 25) y difiere ligeramente de su equivalente humano en el resto de la secuencia (en la posición 11, G se sustituye por A en hsamiR203a-5p*).

El miR-203 es un microARN con cientos de dianas potenciales, actuando algunas de ellas en direcciones opuestas en sus rutas correspondientes, como puede encontrarse usando herramientas como TargetScan (http://www.targetscan.org) o MiRanda (versión de agosto de 2010 descargable, por ejemplo, desde http://www.microma.org/microrna/getDownloads.do). Se identificó inicialmente como un microARN específico de la piel, que forma un gradiente de expresión que define el límite entre progenitores basales epidérmicos proliferativos y células suprabasales que se diferencian de forma terminal, limitando así el potencial de pluripotencialidad en la piel (Yi et al., 2008). Se ha encontrado también sobrerregulado en la soriasis y expresado diferencialmente en algunos tipos de cáncer.

Al contrario que los microARN que se han asociado previamente con la reprogramación celular y/o adquisición de características de ESC, como miR-302 y aquellos de los grupos de genes miR-302-367, miR-290-295 o miR-106-363, miR-203 se considera un represor de la pluripotencialidad (Yi et al., 2008; Volinia et al., 2014), aunque su expresión durante el desarrollo temprano era desconocida hasta ahora.

Algunas revisiones en la regulación del microARN de las células madre (Huang et al., 2011) se refieren a miR-203 como un microARN que coopera con miR200c y miR-183 en la modulación de Sox2 y Klf4. De hecho, dicha afirmación se hace en referencia a un artículo de investigación (Wellner et al., 2009) donde miR-203 está cualificado como un inhibidor de la pluripotencialidad, pero no como un regulador de Sox2 o Klf4. Específicamente, Wellner et al. informaron que ZEB1 reprime la expresión de miR-203 que inhibe la pluripotencialidad y, además, que miR-200c, miR-203 y miR183 cooperan para suprimir la expresión de los factores de células madre en células cancerígenas y células madre (ES) embrionarias de ratón, como se demostró por el represor polycomb Bmi1.

El papel de miR-203 como un inhibidor de la pluripotencialidad de células pluripotentes también se ha sugerido en conexión con la diferenciación epitelial (Nissan et al., 2011) y, más específicamente, en conexión con la diferenciaciónin vitrode las hESC a queratinocitos, donde puede verse que la inducción de miR-203 durante la diferenciación epidérmica que se da desde las etapas más tempranas pero se vuelve relevante en la diferenciación del queratinocito después de tres días de tratamiento con BMP4, es decir: una vez que las hESC ya se han comprometido con la diferenciación epidérmica. De acuerdo con dichos resultados, miR-203 podría considerarse un factor crítico que previene la pluripotencialidad de las células pluripotentes induciendo la diferenciación epitelial.

También en esa línea, se ha informado (Kapinas et al., 2015) que la regulación selectiva de la expresión isoforma de la survivina mediante miR-203 contribuye a mecanismos relacionados con la pluripotencia de las células madre embrionarias humanas, específicamente reprimiendo la pluripotencia de las hESC. Los experimentos donde las hESC (H9) se transfectaron con un inhibidor de miR-203 mostraron mayores niveles de survivina nuclear, mientras que los ensayos donde se logró la sobreexpresión de miR-203 mediante la transfección de hESC con un precursor de miR-203 dieron por resultado una disminución en los niveles de survivina nuclear. Como puede leerse en el mencionado artículo, dichos resultados llevaron a Kapinas et al. a hipotetizar que miR-203 puede inhibir la pluripotencia regulando negativamente la expresión de survivina.

En las iPSC, se ha informado que miR-203 contribuye a un proceso contrario a la pluripotencialidad y que evita la función de las iPSC: la senescencia. Y dicho efecto se ejerce precisamente a través de la ruta de miR-203-survivinap21 (Xu et al., 2016).

El miR-203 se ha asociado con cáncer y se ha visto que presenta funciones supresoras del tumor en múltiples cánceres (Bueno et al., 2008; Michel y Malumbres, 2013). La importancia de la inactivación epigenética de miR-203 para el desarrollo de leucemias asociadas al cromosoma Filadelfia se ha tratado, además de la posibilidad de inyectar miR-203 como una terapia contra dichas leucemias, ya que la recuperación del nivel de miR-203 evita la producción de la proteína oncogénica BCR-ABL y, como consecuencia, la proliferación de células tumorales cesa, incluso en los casos de tumores resistentes a otras estrategias terapéuticas. Los tumores primarios con metástasis muestran la amplia represión de hsa-miR-203a, y se ha encontrado que la asimetría de hsa-miR-302 (alta)/hsa-miR-203a (baja) está asociada con marcadores de células madre, metástasis y menor supervivencia en el carcinoma ductal invasivo (Volinia et al., 2014).

El miR-203 también se considera uno de los microARN implicados en el control de componentes de la maquinaria epigenética. Los trabajos sobre la potencial asociación entre la expresión de los miembros de la familia miR-203, miR-26 y miR-29 y los genes Dnmt3a, Dnmt3b, Mecp2 y Ezh2 durante la transformación de las células han mostrado que dichos microARN y sus dianas validadas o predichas se expresan de forma inversa, indicando que estas moléculas están implicadas en la reprogramación epigenética. Por ejemplo, se ha informado que miR-203 regula a la baja a Dnmt3b en células de melanocitos de ratón (Gasque Schoof et al., 2015).

Desafortunadamente, y a pesar de todo el conocimiento adquirido sobre reprogramación y los marcadores y determinantes de pluripotencialidad y pluripotencia, muchas preguntas respecto al resultado de la diferenciación de células pluripotentes y cómo podrían tomarse esas decisiones permanecen sin resolver. Aunque los investigadores han empezado a identificar las numerosas rutas moleculares que están implicadas en la reprogramación de células somáticas, se necesitará mucha más investigación básica para identificar todo el espectro de eventos que hacen posible este proceso. Los detalles del proceso de reprogramación y sus cinéticas, y en particular la reprogramación epigenética, siguen sin entenderse completamente.

Finalmente, mientras la mayoría de estrategias se han diseñado para mejorar la eficacia de la reprogramación, muy pocas aplicaciones pretenden mejorar el potencial de diferenciación de las células pluripotentes ya establecidas. El mantenimiento de un potencial de diferenciación completo junto con la capacidad de auto-renovación es una propiedad principal de las células madre durante el desarrollo y la regeneración, pero las ESC o iPSC disponibles obtenidas después del proceso de reprogramación a menudo no tienen una calidad que facilite el posterior proceso de diferenciación. La baja calidad de las iPSC y las diferencias en calidad entre las iPSC que resultan del mismo proceso de reprogramación es particularmente importante para su uso en terapias regenerativas humanas. Las iPSC están consideradas por muchos autores un subconjunto de células madre pluripotentes que está influido por la célula somática de origen y las condiciones de cultivo celular, cuyo subconjunto muestra diferencias incluso entre las iPSC obtenidas en el curso del mismo proceso de reprogramación. Muchas iPSC muestran una reducida capacidad de diferenciación, que podría explicarse por una reprogramación genómica incompleta, que da lugar a iPSC que están más cerca del estado activado que del estado naive. Honda y colaboradores (Honda et al., 2013) informaron que la capacidad de diferenciación limitada de las iPSC podría mejorarse mediante el pase continuo y su conversión a un estado similar al naive, más inmaduro. La conversión en dicho estado similar al naive requiere la expresión de OCT3/4 desde un lentivirus, el pase de las iPSC a los fibroblastos embrionarios de ratón y el cultivo en un medio que incluye CHIR99021 (un inhibidor de GSK) y factor inhibidor de la leucemia. Dichas células mostraron una capacidad mejorada de diferenciación en oligodendrocitos maduros, lo que sugiere que la conversión similar a naive de las iPSC las dota de una mayor capacidad de diferenciación.

El mantenimiento de células pluripotentesin vitroen el estado naive (ya sea de ESC o de iPSC), constituye un desafío y ha sido también objeto de numerosos estudios, la mayoría de ellos enfocados en la adición de diferentes compuestos al medio de cultivo con el propósito de lograr el mantenimiento de la potencia de pluripotencia más amplia posible. Las ESC de ratón pueden mantenerse a largo plazo en el estado naive cuando se cultivan en presencia de suero más factor inhibidor de la leucemia (LIF) (Niwa et al., 2009). A tener en cuenta, LIF en solitario es en muchos casos incapaz de evitar la diferenciación de las mESC y es incluso más ineficaz con iPSC. Esta limitación se supera parcialmente mediante la adición de dos moléculas pequeñas inhibidoras de la quinasa denominadas “2i” con LIF. Los componentes de 2i incluyen un inhibidor específico de la ruta de transducción de la señal de quinasa regulada por señal extracelular (ERK1/2)/proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) (MEKi, DP0325901) y un inhibidor específico de glicógeno sintasa quinasa 3 beta (GSK3pi, CHIR99021) que puede proteger a las células pluripotentes de I<os>estímulos de pro diferenciación y seleccionarlas frente a las células que se diferencian (Ying et al., 2008). La solicitud internacional WO2012087965 describe un método similar para mantener o aumentar la potencia de las células en donde las células pluripotentes se cultivan en un entorno sin alimentador donde está presente al menos una pequeña molécula que se selecciona de I<os>inhibidores de TGF-p, GSK3, MEK<o>ROCK, cuyo método logra principalmente un aumento en la viabilidad y un aumento en la potencia, cuyo aumento en la potencia se caracteriza por una o más de las siguientes características: a) expresión de al menos un marcador de célula madre pluripotente seleccionado del grupo que consiste en Oct4, Nanog, SSEA4, Sox2, Klf4, Tral81 y Lin28, endógenos; b) morfología de célula madre pluripotente; c) capacidad para contribuir a la transmisión de la línea germinal; d) formación de teratoma; e) capacidad de diferenciarse o transdiferenciarse en una línea diferente de la línea de partida; y f) diferenciación trilinajein vitro,que pueden considerarse marcadores de estado naive de células madre pluripotentes.

Otros grupos de investigación se han enfocado en modificaciones del medio de cultivo de células iPS para mejorar la eficacia de diferenciación en líneas específicas y/o seleccionar células que sean más apropiadas para el proceso de diferenciación deseado. La mayoría de ellos están basados en la adición de compuestos como los mencionados anteriormente. Así, por ejemplo, WO2014201254A1 describe métodos que implican microARN para la derivación de cardiomiocitos a partir de iPSC o ESC, en donde los microARN de la familia let-7 se describen como microARN importantes para la maduración cardiacain vitro.EP249071A2 describe métodos y composiciones para la producción de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes en donde las células pluripotentes se diferencian en cardiomiocitos en presencia de inhibidores ROCK. WO2014200030A1 describe un método para obtener células madre hematopoyéticas y/o células precursoras hematopoyéticas a partir de células madre pluripotentes que comprende cultivar las células madre pluripotentes en presencia de IGF2 y la selección de células madre pluripotentes inducidas que tienen una alta capacidad para la diferenciación en células madre hematopoyéticas en base del nivel de expresión de uno o más genes. EP2646543A1 describe un método de generación de células de la córnea en donde las células pluripotentes humanas se cultivan en medio acondicionado para fibroblastos de la córnea en una superficie sólida que comprende un componente de matriz extracelular. KR2017011676A describe métodos para diferenciar células madre a hepatocitos usando una composición de cultivo que comprende un extracto de estructura de solubilización de biocompatibilidad derivado del tejido del órgano descelularizado. WO2017062374 describe composiciones y métodos para generar precursores del oligodendrocito a partir de células madre pluripotentes usando un sistema de cultivo tridimensional que comprende un polímero biocompatible y una combinación de al menos dos factores que promueven la diferenciación en oligodendrocitos seleccionados de un agonista de la ruta de señalización hedgehog Sonic, un agonista de la ruta de señalización wnt, ácido retinoico y un inhibidor de Smad dual.

Algún grupo ha informado de haber logrado mejoras en la diferenciación de células madre pluripotentes en múltiples líneas añadiendo una única molécula al medio de cultivo. Chetty et al., en 2013, describió mejoras en la competencia para la diferenciación dirigida en múltiples líneas en más de 25 líneas de células madre después de cultivar células madre pluripotentes en dimetilsulfóxido (DMSO), aumentando la proporción de células en la fase G1 temprana del ciclo celular y, en consecuencia, mejorando la competencia para la diferenciación dirigida e incluso promoviendo la diferenciación terminal en derivados funcionales. Sin embargo, ninguna de esas estrategias logra de forma apropiada el estado naive de las células pluripotentes obtenidas, ya que la capacidad de pluripotencialidad de esas células nunca se ha demostrado (ninguno de los rasgos descritos anteriormente característicos de células naive se examinan en esos casos), las mejoras de diferenciación no son sustanciales y en general los estudios anteriores carecen de ensayos rigurosos de pluripotencia como una complementación 4n o contribución a quimeras.

Por consiguiente, a pesar de las mejoras recientes en el cultivo de células pluripotentesin vitroañadiendo nuevas moléculas pequeñas (tal como LiF, 2¡, bFGF, TGFp, JNKi, p38¡, ROCKi, Activina A) y/o la expresión sostenida de factores de transcripción (tal como KLF4, KLF2, OCT4, SOX2, NANOG), mejorar el potencial de diferenciación de las células pluripotentes sigue siendo un asunto no resuelto y un objetivo importante a lograr, durante el protocolo de reprogramación o una vez que están establecidas las células pluripotentes. Antes de que las células pluripotentes cultivadas puedan considerarse para uso como una herramienta clínica, su eficacia en la generación de células diferenciadas deben mejorar sustancialmente: la aplicación clínica de células pluripotentes necesitará la generación segura y altamente eficaz de células madre que pueden diferenciarse en diversos tipos de células con un potencial para generar la sustitución de células en la investigación para reparar tejidos dañados. La mejora de la calidad de células pluripotentes es también importante para llegar a ser una herramienta de investigación útil para analizar los mecanismos que regulan las decisiones del destino de la célula, o para desarrollar modelos de enfermedad para explorar como se originan diversas enfermedades humanas como resultado de mutaciones y epimutaciones específicas y, con esa información, para desarrollar nuevos fármacos para curar o incluso prevenir dichas enfermedades.

Aunque el método para mejorar el potencial de diferenciación en base a la adición de DMSO constituye una estrategia prometedora, deberían desarrollarse preferiblemente métodos alternativos.

Por consiguiente, hay una necesidad de un método que mejore la calidad de células pluripotentes, particularmente las iPSC, aumentando sus propiedades de pluripotencialidad y/o potencial de diferenciación en diferentes tipos de células. Preferiblemente, el método debería ser fácil de realizar, sin requerir dispositivos complicados o productos muy caros y, si es posible, sería factible ponerlo en práctica con moléculas tan seguras como sea posible.

La presente invención proporciona una solución a dicho problema.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento, descrito en la presente solicitud, de que la expresión o aumento temporal de los niveles de un único microARN, microARN-203, puede mejorar la función de las iPSC o las ESC en diversos ensayos. El efecto de una exposición temporal a miR-203 es doble. Primero, los niveles aumentados de miR-203 en las iPSC inducen un perfil transcripcional más cercano a las células ES (un estado naive o similar al naive) que incluye la sobrerregulación de la firma de pluripotencialidad. Este aumento en las propiedades de pluripotencialidad también se observa cuando se usa un informado de la etapa similar a 2C, característico de células totipotentes en los embriones de 2 células. Segundo, la expresión temporal o aumentada de niveles de miR-203 en células pluripotentes da como resultado la diferenciación mejoradain vitroein vivoa múltiples linajes, que incluyen las tres capas embrionarias, como se muestra en los cuerpos embrioides generadosin vitroo en teratomas y estructuras similares a un embrión observadas después de la inyección de estas células en ratones. La exposición a miR-203 mejoró la generación de tejidos diferenciados inusuales, como páncreas, médula ósea o trofoblasto, incluso aunque estas estructuras se formaron muchas semanas después de la exposición temporal a miR-203 en células pluripotentes. La diferenciación específica en cardiomiocitos sugiere que la exposición de miR-203 no solo favorece la diferenciación sino también la maduración y funcionalidad en las células resultantes.

Por consiguiente, la presente invención, en un primer aspecto, se refiere a un método para potenciar la pluripotencialidad de las células pluripotentes, que comprende una etapa en donde las células están expuestas a niveles aumentados de microARN-203 o un análogo del mismo durante 3-5 días, y manteniéndolas en cultivo en un medio para células pluripotentes durante 15 a 30 días. Preferiblemente, las células pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en cultivo, pero también pueden ser células madre embrionarias (ESC) en cultivo. El aumento en los niveles de microARN-203 al que están expuestas las células puede lograrse transduciendo o transformando las células con un vector de expresión que expresa microARN-203 (e induciendo dicha expresión, si la expresión es inducible), o añadiendo microARN-203 o un análogo del mismo al medio de cultivo de las iPSC, si están en cultivo. Entre los posibles análogos, moléculas pequeñas de ARN con al menos un fragmento con un alto grado de homología con la secuencia de la forma madura del microARN-203 (SEQ ID NO:1) y, preferiblemente, con modificaciones químicas, son posibles realizaciones preferidas, incluyendo entre los análogos miméticos de ARN de doble cadena. Dicho método de la invención es compatible con haber obtenido las iPSC por cualquier método, como, por ejemplo, el método original de Yamanaka (poniendo en contacto células diferenciadas somáticas, preferiblemente fibroblastos, con un factor de reprogramación nuclear que comprende un producto génico de cada una de las siguientes familias: familia Oct, familia Klf, familia Myc y familia Sox) o variaciones del mismo.

Como se indica anteriormente, es una realización preferida del método de la presente invención, compatible con todas las demás realizaciones, que las células que están expuestas a niveles aumentados de microARN-203 o un análogo del mismo se expongan a al menos la forma madura de miR-203 que se origina a partir del brazo 3' o un análogo de la misma. Dicha forma madura puede ser la forma madura de miR-203 de cualquier especie de mamífero. Como las células pluripotentes que están expuestas a niveles aumentados de miR-203 son preferiblemente de origen humano o de ratón, la exposición a al menos hsa-miR-203a-3p (SEQ ID NO:1) o mmu-miR-203-3p (SEQ ID NO:4) o un análogo de los mismos se prefiere, que pueda estar solo o en combinación con otras formas de miR-203, que incluyen combinaciones de análogos de hsa-miR-203a-3p, y/o mmu-miR-203-3p, formas maduras de miR-203 que se originan del brazo 5' (como hsa-mir-203a-5p* y/o mmu-miR-203-5p*) o análogos de los mismos. Las células pueden exponerse a dichas formas maduras incluso cuando la molécula añadida es el pre-miARN de miR-203 o un análogo del mismo, debido al procesado de dicho pre-miARN en las células.

Como se comentó antes, miR-203 se expresain vivocomo un pre-miARN (que está representado por SEQ ID NO.2 en el caso de la molécula humana y por SEQ ID NO:3 en el caso de la molécula de ratón), cuyo pre-miARN puede dar lugar a dos formas maduras diferentes, una que se origina del brazo 5' del pre-miARN y la otra del brazo 3'. La forma madura que se origina del brazo 3' es la más abundante y, según uno de los ensayos del ejemplo 1, es la forma que es responsable, en un mayor grado, de los efectos de la presente invención, al menos aquellos relacionados con la formación del cuerpo del embrión. Como puede verse en la Fig. 10, la secuencia de miR-203 está altamente conservada entre diferentes especies de mamíferos, particularmente las regiones semilla relacionadas con Dnmt3a y Dnmt3b. Por consiguiente, para los fines de la presente invención, a menos que se especifique la referencia a una especie particular o a una forma particular del microARN, el término “miR-203” o “microARN-203” abarca el microARN-203 expresado por cualquier mamífero y cualquiera de sus formas posibles, es decir: el pre-miARN y/o las formas maduras originadas o del brazo 5' (representado por SEQ ID NO:53 en el caso de la molécula humana, hsa-miR-203a-5p, y por SEQ ID NO:54 en el caso de la molécula de ratón) o del brazo 3' (representado por la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:4, que son idénticas, para la molécula humana, hsa-miR-203a-3p, o para la molécula de ratón, mmu-miR-203-3p). La combinación de dos o más de dichas formas de miR-203, y muy especialmente la combinación de las dos formas maduras que se originan del brazo 5' y del brazo 3', como en la mayoría de los ejemplos de la presente solicitud, están también abarcadas por el término “miR-203” o “microARN-203”. El término “un análogo de miR-203” o, cuando los antecedentes lo justifican, “un análogo del mismo”, se considera que abarca una molécula o una mezcla de moléculas, cada una de ellas siendo un análogo de cualquiera de las moléculas abarcadas por el término “microARN-203” o “miR-203”; preferiblemente, la molécula o al menos una de las moléculas de la mezcla serán análogos o miméticos, como se define posteriormente, de una forma madura que se origina desde el brazo 3' de un pre-miARN-203; lo más preferiblemente, la molécula o al menos una de la mezcla de moléculas definidas por el término “análogo” será un análogo de hsa-miR-203a-3p (SEQ ID NO:1) o mmu-miR-203-3p (SEQ ID NO:4).

Otro posible aspecto de la invención son las células pluripotentes que se obtienen después de haber llevado a cabo el método de la invención, particularmente después de la exposición temporal a un nivel aumentado de miR-203, que son diferentes de las iPSC reprogramadas que se usan como material de partida. Cuando dichas células pluripotentes naive se someten a protocolos de diferenciación (tantoin vitrocomoin vivo),muestran un potencial de destino celular expandido, generando células caracterizadas por la expresión de Nanog, Oct y Sox2 (marcadores bien establecidos de pluripotencia), aunque las células que expresan Nestina, Gata4 o Cd34 (marcadores bien establecidos de diferenciación) parecen co-existir con ellos en la misma población de cultivo. Es importante también apuntar a que muestran señales de ser células similares a las naive, como la morfología celular característica de células naive, la capacidad de contribuir a quimeras y la transmisión de la línea germinal.

Las células pluripotentes naive resultantes del método de la invención muestran unos resultados de diferenciación y maduración mejorados, que pueden observarse particularmente, cuando se diferencian específicamente a cardiomiocitos. Teniendo esto en cuenta, otro aspecto de la invención es el uso de dichas células de la invención para obtener células diferenciadas como cardiomiocitos. Otras realizaciones posibles son: células del sistema nervioso (neuronas y células gliales, por ejemplo), condrocitos o células beta pancreáticas.

Por lo tanto, el método de la invención puede considerarse una estrategia para obtener células pluripotentes naive con capacidad de pluripotencialidad mejorada y potencial de diferenciación expandido además de células diferenciadas y/o maduras. Las células diferenciadas o maduras obtenidas por el método de la presente invención también están comprendidas dentro el alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Alelos de ratón generados para los ensayos. a, representación esquemática de los diferentes alelos generados en el locus mu-miR203 de ratón para esta solicitud. b, micrografías representativas que muestran la piel de la cola subdesarrollada en ratones miR-203(-/-). Tinción de hematoxilina y eosina; barras de escala, 50 pm. c, representación esquemática del modelo knockin inducible de miR-203 generado en este trabajo. En el modelo miR-203 KI [ColA1(miR-203/miR-203); Rosa26(rtTA/rtTA)], el transactivador inverso de tetraciclina se expresa desde el locus Rosa26, mientras que miR-203 está dirigido por el operador de tetraciclina “downstream” del locus ColAI. d, expresión del ARN miR-203, determinado mediante PCR cuantitativa, en MEFs WT, KO y KI para miR-203 (después de la inducción con doxiciclina; Dox) (panel izquierdo),o ESC y iPSC KI para miR-203 tratadas o no con doxiciclina (panel derecho). La expresión de ARN se normaliza por un miARN de control (miR-142). ***P < 0,001 (prueba t de Student).

Fig. 2. Efectos de inducción temporal de miR-203 en la pluripotencia de iPSC y ESC y potencial de diferenciación. a, protocolo para reprogramar los MEF mutantes por miR-203 en iPSC pluripotentes y posterior diferenciación en cuerpos embrioides. Los MEF tipo salvaje (WT), knockout (KO) y knockin (KI) se transdujeron con virus que expresan Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (OSKM). Las iPSC resultantes se trataron después con doxiciclina (Dox) 1 pg/ml durante 5 días. tKI indica la expresión de miR-203 temporal en las células knockin durante los 5 días indicados. Dox se eliminó durante 15-30 días antes de comenzar el protocolo de generación del cuerpo embrioide. Las muestras para la secuenciación de ARN se tomaron 30 días después de la retirada de Dox. b, análisis del componente principal de los datos de ARNsec de iPSC WT (n=3 clones), iPSC tKl (n=4) y ESC WT (n=3). c, agrupación imparcial de datos de ARNsec de todo el genoma (izquierda) y gráfico de mapa de calor que muestra la expresión comparativa de 450 genes asociados con la pluripotencia (firma de pluripotencialidad; 2 clones por muestra). El perfil de iPS tKl es similar al observado en las células ES, como demuestra el árbol jerárquico. d, imágenes representativas de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSC WT, KO y tKI después de 10 o 15 días de diferenciación. Barras de escala, 500 pm. El histograma medio muestra el número de EB generado a partir de los tres genotipos en el día 10 de la diferenciación. Los datos son media ± d.e. (n=9 experimentos independientes). El aumento en el tamaño de EB (respecto al día 0 de diferenciación) se muestra en el panel derecho. Los datos se representan como media ± d.e. (n=3 experimentos independientes). e, detección de inmunofluorescencia representativa de Cd34 (mesodermo; verde), Gata4 (endodermo; rojo) y Pax6 (ectodermo; azul) en EB derivados de iPSC de WT, KO y tKI. Barra de escala, 20 pm. f, detección inmunohistoquímica de Cd34 (mesodermo), Gata4 (endodermo) y Nestina (ectodermo) en EB tKI. Las barras de escala son 500 pm para las imágenes superiores y 100 m (Cd34, Gata4) o 50 pm (nestina) para las imágenes inferiores. g, imágenes representativas de EB derivadas de iPSC KI y ESC tratadas con vehículo (KI) o Dox (tKI) a diferentes puntos temporales durante la diferenciación. Barras de escala, 500 pm. h, cuantificación del porcentaje de EB que presentan largas cavidades internas y EB que laten durante el periodo de tiempo indicado. Los datos se representan como media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). i, análisis de inmunofluorescencia representativo de ESC que expresan de manera estable el reportero 2C::tdTomato, y transducidas temporalmente con virus GFP o miR-203-GFP. Barra de escala, 10 pm. El gráfico derecho muestra el porcentaje de células positivas en tdTomato del total de células positivas en GFP. Los datos se representan como media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). En d, h e i, *P<0,05; **P<0,01, ***P<0,001 (prueba t de Student).

Fig. 3. Generación mejorada de cuerpos embrioides después de la inducción genética temporal de miR-203 en iPSC. a, diseño experimental para generar cuerpos embrioides (EB) a partir de iPSC KI miR-203. Las células se trataron o no con doxiciclina (Dox) durante 5 días y después Dox se eliminó durante las siguientes 2 semanas antes de empezar los ensayos de formación de cuerpos embrioides. b, imágenes representativas de EB no inducidos (-Dox) o temporalmente inducidos (+Dox) derivados de cinco clones KI diferentes a diferentes puntos temporales del proceso de diferenciación. Barras de escala, 500 pm. c, cuantificación de EB con largas cavidades internas, EB que laten y tamaño de EB durante el proceso de diferenciación. Los datos son media ± e.e.m. (n=5 experimentos independientes). **P<0,01 (prueba t de Student). d, categorías principales en el análisis de la ontología génica de los genes significativamente sobrerregulados en iPSC KI inducidos frente a no inducidos (se analizaron 4 clones independientes). e, mapa de calor que muestra el perfil de expresión de genes incluidos en GO:0048513 (desarrollo de órgano) en iPSC no inducidas (KI) o inducidas temporalmente (tKI) además de en cuerpos embrioides (EB) no inducidos. Los perfiles observados para EB tKI y KI son más similares entre ellos que cuando se comparan con iPS KI de control. f, mapa de calor que muestra el perfil de expresión de genes incluidos en la firma de pluripotencialidad en las muestras indicadas. Solo las iPS tKI expresan altos niveles de los genes incluidos en esta firma.

Fig. 4. Formación del cuerpo embrioide mejorado después de la expresión exógena temporal de miR-203. a, representación esquemática del diseño experimental usado para generar cuerpos embrioides (EB) a partir de iPSC o<e>S<c tipo salvaje, o transducidos con retrovirus o transfectados con miméticos de miARN para la expresión temporal>de miR-203. b, expresión de ARN miR-203 en iPSC tipo salvaje transducidas con pMCSV o pMCSV-miR-203, o transfectadas con miméticos de control o miméticos de miR-203. La expresión de ARN se normaliza mediante un miARN de control (miR-142). ***P<0,001 (prueba t de Student). c, imágenes representativas de EB derivados de iPSC de tipo salvaje (izquierda) o ESC (derecha) transducidas con vector pMCSV vacío, pMCSV-miR-203 o transfectadas con miméticos de control o miméticos miR-203, en puntos temporales diferentes durante el proceso de diferenciación.<Barras de escala, 500 pm. d, cuantificación de>E<b con largas cavidades y EB que laten durante el proceso de>diferenciación. Los datos son media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). **P<0,01 (en células tanto iPS como ES; prueba t de Student). e, micrografías representativas de EB generadas en el protocolo anterior. Nótese la complejidad y formación de largas cavidades en las estructuras mostradas en los paneles inferiores. Barras de escala, 200 pm (panel superior) y 500 pm (paneles inferiores) o 50 pm (recuadros).

Fig. 5. Formación de cuerpo embrioide mejorado después de la expresión exógena temporal de miR-203a-3p frente a miR-203a-5p. Imágenes representativas de EB derivados de ESC de tipo salvaje transfectadas con miméticos de control, miméticos de miR-203a-3p o de miR-203a-5p, a diferentes puntos temporales durante el proceso de diferenciación. Barras de escala, 500 pm.

Fig. 6. La exposición temporal de iPSC a miR-203 da como resultado teratomas complejosin vivo.a, imágenes representativas de teratomas generados 20-25 días después de la inyección subcutánea de iPSC WT, KO y tKI (que expresan GFP). Barra de escala, 5 mm. Los dibujos de abajo muestran un ejemplo de una estructura similar a un embrión derivada de iPSC tKI, que expresa GFP. Barra de escala, 1 mm. El gráfico derecho muestra el volumen del tumor (mm3) medido al final del experimento. Los datos se representan como media ± e.e.m. (n=8 tumores por genotipo). b, incidencia de tejidos altamente diferenciados específicos en teratomas. El número de tumores incluidos en el análisis se indica en el panel. c, ejemplo representativo de un teratoma altamente diferenciado generado a partir de iPSC tKI después de la inyección i.p. en ratones desnudos. La mayoría de estos teratomas complejos se detectaron en la proximidad del útero o como quistes ováricos en los ratones huésped. El panel muestra mayores ampliaciones (tinción H y E) de varios tejidos y células diferenciadas observadas en el teratoma. Barras de escala, 1 mm (imagen central) o 50 pm (recuadros). d, detección inmunohistoquímica de marcadores de pluripotencia (Nanog, Oct4, Sox2), y marcadores de diferenciación a las tres capas germinales (Nestina, Gata4, CD34) en teratomas derivados de iPSC WT, KO y tKI. Barras de escala, 2000 pm y 100 pm para mayores ampliaciones. En a y b, **P<0,01; ***P<0,001 (prueba t de Student).

Fig. 7. Propiedades de diferenciación en teratomas generados a partir de iPSC tKI miR-203. a, ejemplos histopatológicos (tinción H y E) de tejidos específicos encontrados en teratomas derivados de iPSC tKI. Barras de escala, 100 pm. Una ampliación de trofoblastos teñidos con Lactogen-1 de placenta (PL-1) se muestra también (barra de escala, 50 pm). b, análisis de ontología génica de genes alterados significativamente en teratomas derivados de tKI miR-203 comparados con teratomas tipo salvaje. c, análisis inmunohistoquímico de teratomas derivados de iPSC de tipo salvaje, KO o tKI. Se usaron anticuerpos contra el marcador de proliferación Ki67 o los marcadores de diferenciación terminal a músculo liso o músculo esquelético (actina). Barras de escala, 2000 pm y 100 pm para mayores ampliaciones. d, inmunodetección de CD31 (médula ósea), CD73 (páncreas), colagenasa tipo I (cartílago) e insulina (células productoras de insulina) en teratomas generados a partir de iPSC tKI. Barras de escala, 20 pm.

Fig. 8. La exposición temporal a miR-203in vitroda como resultado estructuras parecidas al embrión en ratones huésped similares a las inducidas por iPSC generadasin vivo.a, Ejemplo representativo de E-L generados después de la inyección i.p. de las iPSC que expresan GFP tKI, H y E, hematoxilina y eosina. Los siguientes antígenos se detectaron por inmunohistoquímica: GFP, Sox2 (ectodermo), Cd34 (mesodermo), Gata4 (endodermo), AFP y CK8 (endodermo visceral del saco vitelino) y Ter119 (células eritroides nucleadas). Barras de escala, 500 pm y l0o pm para mayores ampliaciones. b, fotografía de un ejemplo representativo de un ratón con iPSC completas viable (negro) generado a partir de iPSC tKI en los ensayos de complementación tetraploide del embrión.

Fig. 9. Las ADN metiltransferasas 3a y 3b son dianas de miR-203 implicadas en el control de la pluripotencia y diferenciación. a, diagramas de Venn que representan los genes comunes subregulados en iPSC tKl frente a WT,<sobrerregulados en iPSC KO frente a>W<t>,<y predichos como dianas de miR-203 (mostrar la tabla 6 para una lista de>los 35 transcritos habituales (que incluyen Dnmt3a y Dnmt3b). b, c, unidades relativas de luciferasa (RLU; normalizado a luciferasa Renilla y respecto a la cantidad de ADN) en células 293T transfectadas con constructos de ADN que portan los 3'UTR tipo salvaje de los transcritos indicados (b) o las versiones mutadas de 3'UTR de Dnmt3a y Dnmt3b, más abajo del reportero de luciferasa (c). Las células se co-transfectaron con luciferasa Renilla como un control de transfección, y un plásmido que expresa GFP o miR-203-GFP. Los datos se representan como media ± d.e. (n=3 experimentos independientes). d, imágenes representativas de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSC tKI que se transdujeron temporalmente y simultáneamente con ADNc de Dnmt3a y Dnmt3b o vectores vacíos, y se trataron con vehículo o Dox según se indique. Barras de escala, 500 pm. Los histogramas muestran la cuantificación de EB con cavidades largas, EB que laten y tamaño de EB a diferentes puntos temporales. e, inmunodetección de GFP o tdTomato en ESC que expresan de manera estable el reportero 2C::tdTomato, y transducidas temporalmente con pMCSV-GFP, pMCSv-miR-203-GFP o pMCSV-miR-203-GFP ADNc de Dnmt3a/b. Barra de escala, 16 pm. La gráfica muestra el porcentaje de células positivas en Tomato del total de células positivas en GFP. Los datos se representan como media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). f, diagramas de Venn que representan los genes habituales subregulados en iPSC tKI, predichos como dianas de miR-203 y también implicados en la regulación epigenética de la transcripción génica (GO::0040029). g, análisis del componente principal a partir de los datos de ARNsec que incluyen los perfiles de las iPSC tipo salvaje, iPSC tKI e iPSC de tipo salvaje transfectadas con ARNip de control (Cip) o ARNip específico frente a Dnmt3a (Dnmt3aip), Dnmt3b (Dnmt3bip) o ambos (Dnmt3a/bip). h, imágenes representativas de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSC de tipo salvaje en que la expresión de Dnmt3a y Dnmt3b se reprimió temporalmente por los ARNip. Barras de escala, 500 pm. Los histogramas muestran que la cuantificación del tamaño de los EB y el porcentaje de EB con grandes cavidades o que laten en diferentes puntos temporales durante el proceso de diferenciación. i, detección de tdTomato y DAPI en ESC que expresan de forma estable el reportero 2C::tdTomato, y transfectadas temporalmente con miméticos de control, miméticos de miR-203, miméticos de miR-203 ADNc o ARNip de Dnmt3a y Dnmt3b frente a transcritos de Dnmt3a o Dnmt3b. Barra de escala, 50 pm. j, el histograma izquierdo muestra el porcentaje de células positivas en Tomato en los ensayos en el panel i) cinco días después de la transfección. El histograma derecho muestra el porcentaje de colonias positivas en Tomato en que Tomato se expresa solo en la periferia del clon (negro) o en la mayoría de las células que constituyen la colonia (gris). Los datos son media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes; 486 colonias para los miméticos de control, 504 colonias para los miméticos de miR-203, 515 colonias para los miméticos de miR-203 ADNc de Dnmt3a/3b y 449 colonias para ARNip de Dnmt3a/3b). k, expresión de miR-203, transcritos Dnmt3a y Dnmt3b en iPSC de tipo salvaje transfectadas temporalmente como se indica en (i). La expresión de ARN se midió 24 horas después de los protocolos de transfección y se normalizó mediante un ARNip de control (miR-142) o ARNm de GAPDH, respectivamente. En b-e, h, j, k, *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 (prueba t de Student).

Fig. 10. Alineamiento entre las secuencias 3'-UTR de miR-203 y Dnmta/b. a, alineamiento de 3'UTR de Dnmt3a y Dnmt3b en varias especies representativas (Hsa: Homo sapiens; Mmu: Mus musculus; Rno: Rattus norvegicus; Ocu: Oryctolagus cuniculus; Ptr: Pan troglodytes (chimpancé); Mml: Macaca mulatta; Oga: Otolemur gametti; Tbe: Tupaia belangeri; Eeu: Erinaceus europaeus; Cfa: Canis familiaris (perro); Eca: Equus caballus; Bta: Bos Taurus (vaca); Ete: Echinops telfairi; Fca: Felis catus (gato doméstico). La región semilla del sitio diana de miR-203 contenido en estas 3'-UTR se resalta en negrita y se alinea con la correspondiente secuencia semilla de miR-203. b, representación esquemática del reportero de luciferasa, que porta las 3'-UTR completas de Dnmt3a (izquierda) o Dnmt3b (derecha) de tipo salvaje o las correspondientes versiones mutadas, más abajo del gen de la luciferasa. Los residuos mutados se muestran subrayados.

Fig. 11. La expresión temporal de miR-203 induce la hipometilación en todo el genoma en las iPSC. a, diseño experimental para el análisis de la metilación del ADN de todo el genoma de iPSC WT y tKI y cuerpos embrioides (EB) derivados de ellas. Las células (dos clones tKI independientes y dos replicados técnicos de WT) se trataron temporalmente con Dox durante 5 días y luego se sometieron a la retirada de Dox durante 20 días adicionales antes de empezar el protocolo de formación de EB. Las muestras para el análisis de ADN y ARN se recogieron en los puntos temporales indicados antes de Dox (t=0), 5 días después de la retirada de Dox (t=10), 20 días después de la retirada de Dox (t=25) o 7 días después de empezar con el protocolo de generación de EB (t=32 días). b, datos de metilación del ADN en todo el genoma que muestran el número y tamaño de los valles de metilación del ADN (DMV) y los dominios parcialmente metilados (PMD). c, distribución de la metilación del ADN de las muestras indicadas, alisados sobre bloques de 100 kb. d, análisis del componente principal que muestra la distribución de los diferentes perfiles de metilación en las muestras indicadas (las muestras wt y tKI se agrupan de forma separada para aclarar), e, número de sitios CpG individuales metilados diferencialmente (DMP) y regiones metiladas diferencialmente (DMR) en las comparaciones indicadas. f, protocolo experimental seguido para probar el rescate de metilación de ADN mediante ADNc de Dnmt3a/b resistentes a miR-203. Las regiones metiladas diferencialmente (DMR) específicas en los loci Sirt6 y Elf5 se analizaron mediante amplificación por PCR y secuenciación de ADN modificado con bisulfito. La cuantificación de CpG metilados frente a no metilados se muestra en el histograma.

Fig. 12. Metilación en todo el genoma de iPSC o cuerpos embrioides después de la exposición temporal a miR-203. a, niveles de expresión, como se determina por PCR cuantitativo, o miR-203, y transcritos para las ADN metiltransferasas Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3a2 y Dnmt3l, o marcadores de pluripotencia (Dazl) y diferenciación (Gata6). Las iPSC KI tratadas o no con doxiciclina (Dox) y transducidas simultáneamente con ADNc de Dnmt3a/b o vector vacío se usaron como se muestra en la representación esquemática del diseño experimental. La primera sombra que comienza desde la izquierda (gris claro, rosa en el original) indica el lapso de tiempo en que las células se trataron o no con Dox y se transdujeron o no con ADNc de Dnmt3a/b. La segunda sombra desde la izquierda (gris oscuro, naranja en el original) indica el proceso de diferenciación a cuerpos embrioides. Los datos se representan como la media de tres replicados técnicos por experimento (n=2 experimentos independientes). b, región genómica representativa (telomérica al cromosoma 10) que muestra el patrón de metilación en iPSC tKI y cuerpos embrioides. Los tiempos se refieren al DMV, valle de metilación de ADN; PMD, dominio parcialmente metilado, de la Fig. 11a.

Fig. 13. Cambios en la metilación en todo el genoma y en la expresión génica en las iPSC y cuerpos embrioides. a, diagramas de Venn que representan los genes habituales sobrerregulados (datos de estudios de ARN sec) e hipometilados (datos de estudios de metilación en todo el genoma) en las iPSC tKI 20 días después de la retirada de Dox. Un total de 235 genes estuvieron tanto hipometilados en el ADN como sobrerregulados en dichas condiciones. El análisis de ontología génica de esta lista se presenta en el panel derecho. b, datos de metilación en la región genómica Elf5 en iPSC KI antes de la inducción (t=0, línea superior), 10 o 25 días después de la inducción temporal de miR-203 (señales más bajas) y en cuerpos embrioides (EB, t=32), siguiendo el diseño experimental mostrado en la Fig. 11a. Se muestran dos transcritos Elf5. c, diseño experimental usado para la validación de datos de metilación en la región metilada diferencialmente Elf5 indicada (DMR; caja en b y primera parte de la flecha que representa Elf5 en c). El ADN se aisló como se indica y se secuenció después de la modificación con bisulfito. Se secuenciaron de ocho a diez clones independientes por condición. Los histogramas muestran el porcentaje de metilación de ADN en la DMR Elf5 en las diferentes condiciones.

Fig. 14. La exposición temporal de las células progenitoras a miméticos de miR-203 potencia la diferenciación posterior a cardiomiocitos maduros. a, inmunofluorescencia representativa que muestra tinción de EdU (verde en el original) y núcleos (DAPI, azul en el original) de cardiomiocitos primarios extraídos al día 1 después del nacimiento y transfectados temporalmente con control o miméticos de miR-20324 horas después de la extracción. Las fotografías se tomaron tres días después de la transfección. Barra de escala, 60 pm. El histograma muestra el porcentaje de células positivas en EdU en diferentes días después de la transfección. Los datos son media ± d.e. (n=2 experimentos independientes con 6 replicados cada uno). b, expresión de ARN como se determina por PCR cuantitativo de miR-203 (24 horas después de la transfección) y transcritos Ccnb1, Myh6 y Myh7 (5 días después de la transfección). La relación de Myh6/Myh7 se calcula como un indicador de maduración de cardiomiocitos. Los datos son media ± d.e. (n=3 experimentos independientes). c, protocolo experimental seguido por la diferenciación de cardiomiocitos de las iPSC en ausencia o presencia de miméticos de miR-203 y ADNc de Dnmt3a/b. d, inmunofluorescencias representativas que muestran tinción de troponina T cardiaca (cTnT, verde en el original) y núcleos (DAPI azul en el original) de cardiomiocitos generadosin vitroderivados de iPSC WT transfectadas temporalmente con miméticos de control, miméticos de miR-203 o miméticos miR-203 ADNc de Dnmt3a/b. Las fotografías se tomaron en el día 15 de la diferenciación. Los paneles inferiores muestran un detalle de ampliación de tinción de cTnT en cada condición. Barras de escala, 68 pm (recuadros, 25 pm). El área positiva de cTnT en estos cardiomiocitos se muestra en el histograma derecho. Los datos se representan como media ± d.e. (n=2 experimentos independientes con 6 replicados cada uno). e, niveles de ARNip o ARNm como se determina mediante PCR cuantitativo de los transcritos indicados en diferentes puntos temporales durante la diferenciación de los cardiomiocitos en las muestras indicadas. Los datos se representan como media ± d.e. (n=2 experimentos independientes con 6 replicados cada uno). En a, b, d, e, *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 (prueba t de Student).

Fig. 15. Diferenciación y maduración de cardiomiocitos mejoradas después de la expresión temporal de miR-203. a, inmunofluorescencia representativa que muestra la fosfo-histona 3 (Ser-10; pH3) (en verde en el original), Troponina T cardiaca (cT nT, en rojo en el original) y Hoescht para la tinción de los núcleos (en azul en el original), como se indica en el lado izquierdo de las imágenes, en cardiomiocitos primarios extraídos el día 1 después del nacimiento y transfectados temporalmente con miméticos de control o de miR-20324 h después de la extracción. Las imágenes se tomaron tres días después de la transfección. Barras de escala, 64 pm. Las flechas blancas apuntan a cardiomiocitos positivos en pH3. El histograma medio muestra la velocidad de proliferación medida como el porcentaje de células positivas a pH3 respecto al número total de células positivas a cTnT en día 3 después de la transfección. Los datos son media ± d.e. (n=2 experimentos independientes). El gráfico de la derecha muestra el número total de células el día 3 después de la transfección. Los datos se representan como media ± d.e. (n=2 experimentos independientes). b, niveles de ARNm como se determinan por PCR cuantitativo de los transcritos indicados a diferentes puntos temporales antes y durante la diferenciación de los cardiomiocitos. Las iPSC se transfectaron con miméticos de control o miméticos de miR-203, se mantuvieron durante 15 días en cultivo y después se diferenciaronin vitro.c, paneles izquierdos:niveles de ARNm de los transcritos indicados a diferentes puntos temporales durante la diferenciación de los cardiomiocitos.

Panel derecho: la frecuencia de latidos (medida como el número de latidos en 5 segundos) de estos cardiomiocitos en el día 15 de diferenciación también se muestra (n=8 clones diferentes). En b-c, los datos se representan como media ± d.e. (n=2 experimentos independientes con 6 replicados cada uno). En a-c, *P<0,05, **P<0,01 (prueba t de Student).

Fig. 16. La exposición temporal a miR-203 potencia la diferenciación en cardiomiocitos maduros y mejora la regeneración cardiaca. a. imagen representativa de un corazón 8 días después del nacimiento, 7 días después de la criolesión. El área de criolesión está remarcada. b, imágenes representativas de secciones del corazón de ratones tratados con vehículo y con Dox teñidas con rojo sirio (barras de escala, 500 pm). Los detalles de ampliación muestran el área fibrótica en luz blanca (izquierda) y polarizada (derecha). Barras de escala en los recuadros, 100 pm. c, imágenes representativas “en blanco y negro” de las secciones de corazón teñidas con rojo sirio de ratones tratados con vehículo o Dox representativos, que muestran en blanco el área fibrótica 7 días después de la criolesión. Barra de escala, 250 pm. El histograma muestra la cuantificación del porcentaje de área fibrótica respecto al área total del corazón en n=15 ratones por condición, 7 días después de la criolesión. **P<0,01 (prueba t de Student). d, detección inmunohistoquímica de Cd34 (progenitores mesodérmicos) y tinción con rojo sirio de las secciones del corazón de ratones tratados con vehículo y Dox. Se muestran imágenes representativas de 3 ratones diferentes. Barras de escala, 100 pm. El área fibrótica está resaltada. e, cuantificación del porcentaje de crías vivas por camada un día después de la criolesión. Se probaron 5 camadas por condición. P= 0,053 (prueba t de Student).

Fig. 17. miR-203 se induce en la etapa 2C durante el desarrollo embrionario. La expresión de miR-203, como se determina por qPCR, en cinco etapas diferentes del desarrollo temprano normal: ovocito, embrión de 2 células, mórula, mórula compacta y blastocisto. El ARN se extrajo de 30 embriones diferentes y se agruparon en dos grupos independientes para el análisis por qPCR. La expresión de ARN se normaliza mediante un ARNip de control (miR-16). Los datos representan 6 medidas de qPCR diferentes. P=0,05 (prueba t de Student) que compara 2C/mórula frente a mórula compacta/blastocisto.

Fig. 18. La exposición temporal a miR-203 induce marcadores similares a 2 células. a. análisis de inmunofluorescencia representativa de colonias de ESC que expresan de forma estable el reportero 2C::tdTomato, y se transducen temporalmente con virus con GFP o miR-203-GFP. Barra de escala, 10 pm. El gráfico derecho muestra el porcentaje de colonias positivas en tdTomato del total de las colonias positivas en GFP, 24 h después de la transducción. Los datos se representan como media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). ***P<0,001 (prueba t de Student). b, expresión de ARN como se determina por la secuenciación de ARN de los transcritos indicados, conocidos por estar albergando un elemento MERVL situado más arriba en posición proximal (Tcstv3, Zfp352 y Cm12) o un elemento MERVL intrónico (Abcb5 y Chit1). Los datos muestran tres clones independientes de iPSC de tipo salvaje (azul) o iPSC tKI (rojo). *P<0,05; **P<0,01 (prueba t de Student). c, gráficos de enriquecimiento de la firma de 2 células de 282 genes (Biase et al., 2014) en las iPSC tKI 10 y 25 días después de la retirada de Dox. d, expresión, como se determina por la secuenciación de ARN, de los transcritos indicados incluidos en la firma 2C. Los datos son media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). *P<0,05; **P<0,01 (prueba t de Student). e, imágenes representativas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC) que expresan una repetición terminal larga (LTR7) de retrovirus endógeno HERVH etiquetado con GFP. Las células se transfectaron con miméticos de control (izquierda) o de miR-203 (derecha). Se muestran el campo blanco y la expresión de GFP para las mismas colonias. Barras de escala, 10 pm. f, el gráfico de la izquierda muestra el porcentaje de colonias positivas en HERVH-GFP en el ensayo descrito en el panel (E), cinco días después de la transfección con miARN. El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de colonias positivas en HERVH-GFP en que GFP se expresa solo en la periferia del clon (negro) o en la mayoría de las células que constituyen la colonia (gris). Los datos son media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes; como se indica, se contaron 508 colonias para miméticos de control y 575 colonias para miméticos de miR-203) ***P<0,001 (prueba t de Student). g, imágenes representativas de EB derivados de hiPSC de HERVH transfectadas temporalmente con miméticos de control (izquierda) o de miR-203 (derecha) como se indica en (E, F), en diferentes puntos temporales durante el<proceso de diferenciación. Barras de escala, 500 pm. h, cuantificación del tamaño de>E<b del panel g) y el porcentaje>de EB que presentan grandes cavidades internas durante el curso de tiempo indicado de diferenciación. Los datos son media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). ***P<0,001 (prueba t de Student).

Fig. 19. miR-203 induce la pluripotencia no preparada en células cultivadas en medio 2i/LIF. a, rutas de la base de datos de ontología génica desreguladas significativamente en iPSC tKI (iPSC inducidas por doxiciclina) frente a iPSC no inducidas, ambas cultivadas en condiciones 2i/L. b, imágenes representativas de EB derivados de iPSC no inducidas o iPSC inducidas por doxiciclina (iPSC tKI), cultivados en condiciones de 2i/L durante 10 pases, en diferentes puntos temporales del proceso de diferenciación. Las micrografías son representativas de tres experimentos diferentes. Barras de escala, 500 pm. c, cuantificación del tamaño de EB y el porcentaje de EB que presenta grandes cavidades internas o que laten procedentes de las mismas células usadas en los paneles a) y b). Los datos son media ± e.e.m. (n=3 experimentos independientes). **P<0,01 (prueba t de Student).

Fig. 20. miR-203 induce la hipometilación suave en genes improntados. Mapas de calor que representan los niveles de metilación en las principales regiones metiladas diferencialmente (DMR; n=100; panel izquierdo) o las regiones de control de improntación (ICR; n=103 loci de impronta diferentes; panel derecho) en las muestras indicadas. La escala de grises es aplicable a ambos mapas de calor. Panel izquierdo: en iPSC tKI, t=0 tiene un nivel de metilación cercano a 1,00, mientras que t=10 se reduce gradualmente y en t=25 el nivel de metilación es más cercano a 0,00. En las iPSC KI de control, los niveles de metilación están entre 0,75 y 1,00 en todos los puntos temporales indicados. Panel derecho: se observa una ligera hipometilación para los ICR en las iPSC tKI t=25, no comparable con el detectado en las DMR mostradas en el panel izquierdo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención, como se indica anteriormente, proporciona un método para mejorar la eficacia de las células pluripotentes, particularmente iPSC, y por lo tanto, generar células pluripotentes naive más adecuadas para estrategias terapéuticas, muy especialmente para su diferenciación y maduración en células diferenciadas útiles para fines regenerativos.

La invención se basa en los resultados de los ensayos descritos en los ejemplos de la presente solicitud, cuyos ensayos demuestran que solo una exposición temporal a las secuencias miR-203 fortalece el potencial de pluripotencialidad de las células pluripotentes y favorece la diferenciación.

En los ejemplos posteriores se muestra como la sobreexpresión temporal de un único microARN (miR-203), o un análogo del mismo, potencia la diferenciación de las células pluripotentes (tanto células madre embrionarias como células pluripotentes inducidas) manteniendo al mismo tiempo su capacidad de pluripotencialidad. miR-203 mejora significativamente no solo la expresión de marcadores de las células madre, la formación de teratomas que contienen tipos celulares de las tres capas embrionarias primitivas, y la eficacia de diferenciación a cualquier línea. De manera incluso más importante, la expresión temporal de miR-203 en iPSC favorece notablemente la capacidad de pluripotencialidad de esas células para producir progenies que nacen vivas, como hacen las ESC. Tanto la contribución a la quimera (de interés particular, en ensayos de complementación tetraploide) como la transmisión de la línea germinal se aumentan dramáticamente cuando las iPSC o las ESC se han expuesto a una inducción temporal del microARN. Por consiguiente, puede decirse que las células pluripotentes que resultan de aplicar el método de la presente invención a las iPSC (es decir, sometiendo a las iPSC a un nivel aumentado de miR-203 temporalmente) muestran propiedades que son propias de células pluripotentes en estado naive, de manera que las células resultantes pueden considerarse células pluripotentes naive. Estos resultados son coherentes con el estudio adicional llevado a cabo por los presentes inventores y descrito en la presente solicitud, donde miR-203 se identifica como un microARN expresado preferentemente en las etapas de 2C-mórula durante el desarrollo de la preimplantación en el embrión de ratón.

Es notable que los efectos mencionados, particularmente la expansión del potencial de diferenciación de las células pluripotentes y el fortalecimiento del potencial de pluripotencialidad, se logran aumentando el nivel de miR-203 al que están expuestas las células (mediante expresión temporal de un vector introducido anteriormente en la célula o mediante la adición de miR-203 al medio de cultivo de las células), porque miR-203 se consideró por algunos autores como un represor de la pluripotencialidad (véase Yi et al., 2008; Volinia et al., 2014) que limita el potencial de pluripotencialidad en la piel y se ha encontrado que la asimetría de hsa-miR-302 (alto)/has-miR-203a (bajo) está asociada con la pluripotencialidad. En la misma línea, a pesar de que un experto en la técnica había tenido conocimiento de la revisión de Huang et al. (Huang et al., 2011) y había leído que miR-203 modula de forma cooperativa Sox2 y Klf4 sin haber verificado que se comenta de hecho en la citada fuente de información para esa afirmación (Wellner et al., 2009, donde, como se comenta anteriormente, se dice que miR-203 coopera con miR-200c y miR-183 para suprimir los factores primordiales), ese experto en la técnica habría esperado que un aumento en miR-203 llevaría a una pluripotencialidad deficiente, porque miR-203 reprime las dianas. Puede decirse que toda la información en la técnica anterior llevaría a predecir que la expresión de miR-203, cualquiera que fuera el entorno o estado de diferenciación de la célula, reprimiría, y no potenciaría, el potencial de pluripotencialidad.

Por consiguiente, no era esperable que un aumento en los niveles de miR-203 llevara a una pluripotencialidad mejorada en las ESC o iPSC de manera que pudieran considerarse perfectamente pluripotentes y no habrían comenzado el proceso de compromiso a un tipo de célula o tejido diferenciado particular, como queratinocitos. En conexión con eso, es importante recalcar que los ensayos descritos en la presente solicitud y los resultados obtenidos son diferentes de los descritos por Nissan et al. (Nissan et al., 2011) y no interfieren con ellos, porque Nissan et al., como se trata anteriormente, informaron que miR-203 se vuelve relevante en la diferenciación del queratinocito una vez que las hESC ya se han comprometido con la diferenciación epidérmica mediante un tratamiento adicional (específicamente, el tratamiento con BMP4), que son condiciones en que miR-203 se vuelve un factor crítico implicado en el compromiso temprano del queratinocito y que puede considerarse ya conocido desde 2008 (véase Yi et al., 2008). Y esto es diferente de lo que se describe en la presente solicitud, donde se muestra que la inducción temporal de miR-203 es relevante para perseguir un estado naive pluripotente, que está derivando últimamente en el compromiso de diferenciación mejorado. Estos dos conceptos son completamente diferentes, además de sus implicaciones en la medicina regenerativa. En otras palabras: la expresión temporal de miR-203 actúa como un estimulador del potencial de pluripotencialidad de las células pluripotentes, cualquiera que sea su compromiso de diferenciación posterior. Esto se muestra, por ejemplo, en los ensayos de la presente solicitud relacionados con el cuerpo embrioide y el teratoma, donde puede observarse una capacidad de diferenciación mejorada a las tres capas germinales de esas células pluripotentes brevemente expuestas a miR-203, en comparación con sus equivalentes de control.

Además, los resultados de los ensayos descritos en la presente solicitud eran además difíciles de concebir teniendo conocimiento de las conclusiones logradas después de los estudios de la influencia de miR-203 en los niveles de survivina nuclear en hESC (Kapinas et al., 2015), cuyos estudios habían llevado a proponer a miR-203 como un inhibidor de la pluripotencia actuando mediante la regulación negativa de la expresión de survivina.

Es significativo que las ADN metiltransferasasde novojuegan probablemente un papel importante en los efectos observados después de la sobreexpresión temporal de miR-203. La mejora significativa de la eficacia de las células iPS en la generación de quimeras y ensayos de complementación tetraploide, que permiten formar a estas células teratomas complejos y estructuras similares al embriónin vivo,parecen estar mediadas, mecanísticamente, mediante la represión directa dependiente de miR-203 de las ADN metiltransferasasde novoDnmt3a y Dnmt3b, que lleva al borrado de la metilación de ADN global de las células pluripotentes.

Las dinámicas de metilación del ADN se han descrito anteriormente ampliamente, controlando los procesos tanto de pluripotencia como de diferenciación. La hipometilación general de ADN y mantenimiento de las improntas genómicas se sabe que son esenciales para asegurar la contribución quimérica y la transmisión de la línea germinal, como prueba de pluripotencia. Aunque el estado pluripotente naive se caracteriza por la hipometilación global del ADN, el estado de diferenciación está correlacionado con mayores niveles de metilación y sobrerregulación de las metiltranferasasde novoDnmt3a y Dnmt3b, además de su proteína contrarrestadora Dnmt3l.

De forma interesante, la subregulación de esas Dnmtde novose observa en células de epiblastos de preimplantación temprana, que acompañan la sobrerregulación de genes relacionados con la pluripotencia. Esas características se recapitulan en el estado naive, y pueden sostenersein vitrobajo ciertas condiciones. La derivación de células madre embrionariasin vitrocon improntas genómicas intactas, incluso en el contexto de hipometilación global de ADN, no es fácil de conseguir. La inestabilidad de la impronta se evalúa normalmente en algunas líneas y cultivos de ESC, y el patrón de metilación de ADN se altera normalmente, llevando a una eficacia de baja a media en la contribución a la quimera, transmisión de la línea germinal y diferenciación. Sin embargo, en nuestro sistema, se ha observado una hipometilación global de ADN en células pluripotentes que sobreexpresan temporalmente miR-203, mientras que las improntas genómicas permanecen inalteradas. Se ha descrito en detalle como miR-203 tiene como objetivo las metiltransferasasde novoDnmt3a y Dnmt3b, reduciendo la metilación global del ADN y favoreciendo por tanto la pluripotencia naive. Dnmt1 permanece sin afectar en estas condiciones, presumiblemente evitando el borrado de la metilación de ADN en las improntas genómicas. Esta es otra prueba de concepto del estado naive de las IPSC y ESC que sobreexpresan temporalmente miR-203.

Se sabe que la falta de estas ADN metiltransferasas en las ESC induce la hipometilación progresiva de la cromatina con los pases (Liao et al., 2015). La expresión de los ADNc de Dnmt3a y Dnmt3b resistentes a miR-203 rescata los fenotipos inducidos por miR-203 (Figs. 9-15). Digno de mención es que mientras la hipometilación severa e irreversible observada en las células knockout Dnmt3a/b bloquea la diferenciación (Jackson et al., 2004; Okano et al., 1999), el estado hipometilado inducido por miR-203 es reversible y la diferenciación es altamente eficaz y está acompañada de potente metilación de ADN (Fig. 7).

Por lo tanto, el método de la presente invención tiene varias diferencias importantes con los métodos conocidos anteriormente dirigidos a mejorar la calidad de las células pluripotentes cultivadas que pueden resumirse como sigue:

i) el método puede usarse en clones pluripotentes ya establecidos (iPSC y ESC) y es por lo tanto un procedimiento aditivo a los métodos descritos anteriormente, y combinable con ellos. Esta es una diferencia importante con respecto a la mayoría de variantes del protocolo original de Yamanaka, donde la eficacia o seguridad del método se están intentando aumentar sustituyendo algunos de los factores de Yamanaka originales por otros compuestos o añadiendo compuestos adicionales para llevar a cabo el proceso de reprogramación. En el presente caso, el compuesto adicional, miR-203, se añade a las iPSC o ESC ya establecidas.

ii) las células pluripotentes expuestas a miR-203 presentan una función mejorada tantoin vitrocomoin vivoen la generación de células diferenciadas y funcionales.

iii) el efecto de la exposición a células pluripotentes a niveles aumentados de miR-203 pueden lograrse además fácilmente usando moléculas de ARN pequeñas sintéticas que son análogas a miR-203, como miméticos específicos, que están disponibles comercialmente.

iv) mecanísticamente, se ha observado que miR-203 ejerce su efecto borrando la memoria epigenética de las células pluripotentes, un factor conocido por actuar como una barrera en el establecimiento de las células pluripotentes. Esta es otra diferencia importante con los métodos donde las desmetilasas, por ejemplo, se usan durante el proceso de reprogramación a células pluripotentes, porque esa desmetilación es irreversible o induce citotoxicidad, que hace a las células obtenidas inútiles para la medicina regenerativa. El presente método, que expone temporalmente a las iPSC o ESC ya establecidas a niveles aumentados de miR-203 (o a un análogo del mismo), provoca una hipometilación temporal en todo el genoma que mejora su pluripotencia y, como dicha hipometilación es temporal y reversible, también permite una expansión de su potencial de diferenciación. Por consiguiente, el presente método da lugar a células pluripotentes naive que serían útiles para obtener células diferenciadas de oro aplicables en medicina regenerativa.

v) la exposición de células pluripotentes ya obtenidas a niveles aumentados de miR-203 (o análogos del mismo) (por ejemplo, y preferiblemente, por expresión temporal) significa una alternativa más segura a algunos métodos conocidos, como los métodos donde se usan inhibidores de metilación de ADN como AZA durante la reprogramación, ya que AZA se conoce por inducir la muerte celular. En este sentido, debe también apuntarse que, diferencialmente a otros factores, miR-203 es un supresor tumoral bien establecido, cuyo uso también permite evitar las preocupaciones relacionadas con el uso de factores oncogénicos durante la reprogramación (Tapia et al., 2016).

Como puede verse en los ejemplos de más abajo, las células pluripotentes obtenidas después de llevar a cabo el método de la presente invención muestran potencial de pluripotencialidad mejorado, cuando se compara con sus equivalentes de control, que pueden observarse gracias a las siguientes características, que son características de células pluripotentes en un estado naive:

(i) la diferenciaciónin vitroa cuerpos embrioides (EB) se aumenta significativamente en comparación con las iPSC de control. Los EB generados a partir de las iPSC que han experimentado las etapas del método de la invención (específicamente, EB derivados de iPSC tKI) crecen más rápido, se diferencian mejor, muestran un mayor porcentaje y eficacia en el latido y muestran una arquitectura perfecta de las tres capas germinales. La diferenciación y funcionalidad de sus células se revela también por la formación de cavidades largas, lo que se encuentra raramente en EB derivados de iPSC de control;

(ii) la diferenciaciónin vivoa teratomas también se mejora dramáticamente cuando las iPSC que han experimentado las etapas del método de la invención (específicamente, las iPSC tKI) se inyectan en ratones, cuando se compara con sus controles respectivos. El nivel de diferenciación de las tres capas germinales es notorio, y algunos tejidos atípicos tal como páncreas, médula ósea, cartílago o incluso tejido extra-embrionario (placenta) se encuentran fácilmente en teratomas derivados de iPSC tKI. Cuando estas iPSC tKI se inyectan intraperitonealmente en ratones, son capaces de desarrollar estructuras complejas similares al embrión, nunca encontradas en inyecciones de iPSC tipo salvaje. Esas estructuras se caracterizan por la expresión de varios marcadores de desarrollo embrionario, las tres capas germinales y tejidos extra-embrionarios;

(iii) la expresión de marcadores de la etapa de 2 células embrionaria, como ciertos retrotransposones, es mayor en las iPSC tKI cuando se comparan con sus equivalentes WT. Además, el perfil transcriptómico de esas iPSC ilustra como las iPSC tKI activan un número de redes de señalización implicadas en el desarrollo, morfogénesis, mantenimiento de la pluripotencialidad, organización de cromatina y compromiso del destino de la célula, probando su estado naive. De interés, el análisis de componente principal, análisis de agrupamiento jerárquico y mapa de calor de las muestras de secuenciación de ARN demuestra la proximidad significativa entre iPSC tKi no preparadas y células ES, en comparación con iPSC WT. El ensayo de complementación tetraploide es el ensayo más estricto para probar el potencial de pluripotencia de las iPSC. Allí, se producen blastocistos tetraploides por medio de la fusión de embriones en la etapa de 2 células y son defectuosos desde el punto de vista del desarrollo formando solo tejidos extraembrionariosin vivo. Como se esperaba, las células ES con pluripotencia total compensan la deficiencia de desarrollo de los embriones tetraploides, y un organismo completo puede producirse a partir de ESC junto con tejidos extraembrionarios derivados de dichos embriones tetraploides. Cuando la eficacia para generar progenies nacidas vivas es alrededor del 20 % para las ESC en dichos ensayos, las iPSC normalmente no pasan esta estricta prueba y no mantienen ratones “de iPSC total”. Sin embargo, las iPSC que expresan temporalmente miR-203 generan correctamente crías nacidas vivas por complementación 4n, en un grado similar al logrado usando ESC WT. Aún más, las ESC que se han expuesto a inducción temporal de miR-203 muestran una competencia significativamente mayor en esta prueba cuando se compara con ESC WT. Los datos claramente afirman que miR-203 mejora la eficacia de la tecnología de iPSC.

(iv) la contribución de la quimera es definitivamente la mejor prueba de concepto para demostrar el valor de (células iPS o ES) pluripotentes. Los experimentos de agregación celular e incluso más importante, los ensayos de complementación tetraploide muestran como las iPSC tKI contribuyen a la generación de quimeras y transmisión de la línea germinal significativamente más que sus respectivas iPSC de control.

Los datos adicionales refuerzan el descubrimiento de que la exposición de iPSC o ESC a mayores niveles de miR-203 promueve la pluripotencia naive y que el método de la presente invención es ventajoso con respecto a otros métodos descritos anteriormente que aspiran a sostener la pluripotenciain vitroson los siguientes:

(i) picos de expresión de miR-203 en la etapa de 2 células y en la mórula, de acuerdo con los datos que muestran que este microARN favorecen la expresión de transcritos típicos de la etapa de 2 células. Esta observación respalda el hecho de que miR-203 es relevante para adquirir pluripotencia naivein vivo,y por consiguiente se usaría como una ventaja para estimular la pluripotencia naivein vitro.

(ii) la expresión de miR-203 en las PSC induce la expresión de genes típicamente expresados en la etapa embrionaria de 2 células. Además de un reportero específico de 2 células, la expresión de transcritos incluidos en el “transcriptoma de 2 células” se ha analizado en detalle. El hecho de que miR-203 induce 281 de los 282 genes principales incluidos en la firma de 2 células es un descubrimiento notable. De nuevo, estas observaciones refuerzan la idea de que miR-203 promueve la pluripotencia naive.

(iii) miR-203 también mejora significativamente el potencial de desarrollo en condiciones 2i/LIF, el primer patrón para mantener el potencial de pluripotencialidad. Además, el análisis de las regiones de control de improntas muestra que miR-203 tiene poco efecto en estas regiones en comparación con las condiciones 2i/L, explicando así la mejora significativa de las células tratadas con miR-203 en múltiples ensayosin vivo.Estos resultados respaldan el uso preferible de miR-203 sobre los métodos anteriores pretendidos para sostener la pluripotenciain vitro.

(iv) El efecto de miR-203 se ha probado también en células humanas, mostrando efectos similares en la expresión de marcadores de 2 células, y el potencial de diferenciación. Por consiguiente, las observaciones en células pluripotentes de ratón se extienden a células pluripotentes humanas.

(v) la importancia de Dnm3a/b como dianas relevantes se muestra mediante ensayos de rescate además de la atenuación de Dnmt3a/b en PSC WT, mimetizando así al miR-203. Estos datos refuerzan la identificación de ADN metiltransferasasde novocomo dianas de miR-203 responsables del fenotipo descrito.

Adicionalmente, las células pluripotentes expuestas a miR-203 presentaron un potencial de diferenciación y maduración mejorados, como se demuestra por los siguientes efectos encontrados:

(i) el número de tejidos y nivel de diferenciación se aumenta en células tKI (células pluripotentes que han experimentado las etapas del método de la presente invención), como se observa en los ensayos de diferenciación del cuerpo embrioide, la formación de teratomas complejos y estructuras similares al embrión que incluyen tejidos diferenciados no observados normalmente como médula ósea, tejidos de la placenta o páncreas exocrino. Además, los teratomas derivados de células tKI, pero no teratomas de control, contienen células positivas para la hormona insulina, sugiriendo la presencia de células beta pancreáticas diferenciadas, y que además ilustran la capacidad expandida de las células tKI en la diferenciación a múltiples líneas celulares.

(ii) la diferenciación y maduración de las iPSC en cardiomiocitos se mejora como se detecta por la expresión de marcadores de maduración además de ensayos funcionales.

(iii) la diferenciación de cardiomiocitos neonatales se mejora además del nivel de maduración que alcanzan después de la exposición a miR-203.

(iv) los ensayos de regeneración de tejido (ensayos que típicamente no se incluyen en informes de células pluripotentes mejoradas, dada la complicación para la células mejoradasin vitrode funcionar apropiadamente en ensayos de regeneración complejosin vivomuestran que la expresión de miR-203 potencia significativamente la regeneración cardiaca y la supervivencia global después de la lesión cardiaca, un resultado que fortalece la diferenciación potencial de las células pluripotentes sometidas a tratamiento con miR-203 y su funcionalidadin vivoy que sugiere la importancia de este microARN en la medicina regenerativa.

Es notable que el método de la presente invención difiere de los métodos y medios para derivar cardiomiocitos de iPSC o ESC descritos en la solicitud de patente internacional WO2014201254A1 en que los microARN de la familia let-7 son los únicos mencionados en dicha solicitud de patente internacional como microARN importantes para la maduración cardiacain vitroque parte de células pluripotentes y otros microARN no se mencionan. Entonces, la presente invención proporciona una alternativa y un método no sugerido anteriormente para la diferenciación de cardiomiocitos, partiendo de células pluripotentes que se han sometido previamente a un aumento temporal del nivel de miR-203 (o mediante expresión temporal en las células o exposición temporal de las células a miR-203 o un análogo de las mismas mediante adición a su medio de cultivo), cuyas células pluripotentes se someten posteriormente a diferenciación de cardiomiocitos logrando una mejora en la eficacia, ya que los cardiomiocitos resultantes son maduros y funcionales.

Dado su utilidad potencial para ocuparse de aplicaciones clínicas, puede considerarse que es una realización importante del método de la presente invención que una en donde la mejora de diferenciación potencial de las células se caracteriza por una mejora de eficacia de diferenciación, por ejemplo a cardiomiocitos, pero también a otras células diferenciadas, especialmente aquellas de interés clínico como células del sistema nervioso (neuronas y células gliales, por ejemplo), condrocitos, células beta pancreáticas....

miR-203 mejora el potencial de células ES e iPS ya establecidas para contribuir a múltiples líneas celulares. Por consiguiente, el método de la presente invención puede definirse también como un método para mejorar las propiedades de pluripotencialidad/potencial de células pluripotentes ya establecidas, (ya que funciona con células madre embrionarias y con células madre pluripotentes inducidas), y/o como método para mejorar el potencial de diferenciación y/o de maduración de células pluripotentes. Por consiguiente, las células pluripotentes que han experimentado mediante las etapas del método de la invención muestran a) mayor porcentaje, crecimiento más rápido, mejor diferenciación, mejor eficacia en el latido y mejor arquitectura de las tres capas germinales en comparación con las células de control cuando se diferencian a cuerpos embrioides; b) mejora de la diferenciaciónin vivode teratomas; y c) mayor expresión de marcadores de la etapa de 2 células. ahora, respecto a la mejora del potencial de diferenciación y/o de maduración, las células pluripotentes que han experimentado mediante las etapas del método de la invención muestran: a) un número aumentado de tejidos y mayor nivel de diferenciación comparado con el control, cuando se diferencia a cuerpos embrioides; b) formación de teratomas complejos y estructuras similares a embriones que incluyen tejidos diferenciados específicamente a cardiomiocitos, que incluye expresión más rápida y aumentada de marcadores de maduración y la adquisición más rápida de su funcionalidad.

Como se comenta anteriormente, los efectos de la exposición a niveles aumentados (por sobreexpresión o adición al medio de cultivo) de miR-203, o un análogo del mismo, pueden verse tanto en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) como en células madre embrionarias (ESC). Para los fines de la presente invención, tanto las iPSC como las ESC pueden ser células derivadas de cualquier mamífero. Las ESC humanas pueden excluirse opcionalmente. Cuando las ESC son ESC humanas, las ESC humanas usadas en el método de la invención se han obtenido por un método que no implica la destrucción de los embriones, como el método descrito en Chung et al., 2008. Pero, para sobrepasar las preocupaciones morales o legales relacionadas con el uso de ESC humanas y por razones de manejo, se prefiere que el método de la invención se lleve a cabo con iPSC. Por facilidad de generación y manejo, se prefiere particularmente que las iPSC estén en cultivo cuando el método de la invención se las aplique, y también se prefiere que la generación de dichas iPSC haya ocurridoin vitro,desde células diferenciadas cultivadas como fibroblastos, aunque el uso de iPSC generadasin vivo(Abad et al., 2013) es compatible con el método de la presente invención y puede considerarse incluido en su alcance. Para obtener iPSC generadasin vitro(en cultivo), puede usarse cualquiera de los procedimientos de reprogramación conocidos, incluyendo el método de Yamanaka original (poner en contacto células diferenciadas somáticas con un factor de reprogramación nuclear que comprende un producto génico de cada una de las siguientes familias: familia Oct, familia Klf, familia Myc y familia Sox) y cualquiera de sus variantes.

Los ejemplos de la presente invención contenían algunos ensayos en donde los niveles aumentados de microARN-203 se obtienen gracias a su sobreexpresión inducida genéticamente en las células iPSC, debido al hecho de que dichas células se han reprogramadoin vitroa partir de células diferenciadas (fibroblastos) que se han extraído de un modelo de ratón en donde está incluido un casete inducible por doxicliclina para la expresión de miR-203. Entonces, en este caso, los niveles aumentados resultan directamente de la sobreexpresión intracelular de miR-203; dicho aumento ocurre temporalmente debido al hecho de que la doxiciclina se añade solo durante 3-5 días. Otros ensayos, como algunos de los ensayos descritos en el ejemplo 4, se han realizado con iPSC de tipo salvaje en cultivo y la exposición de las iPSC a los niveles/cantidades aumentadas de miR-203 se han logrado mediante la adición de un miR-203, específicamente un miR-203 bicatenario modificado químicamente, al medio de cultivo; los resultados obtenidos con este mimético de miR-203 natural muestran que la adición de miR-203 al medio de cultivo es una realización posible del método de la presente solicitud que además resuelve el mismo problema técnico. Como el miR-203 o su análogo o mimético tiene que entrar a la célula para ejercer su efecto, añadir a la cantidad de miR-203 endógeno (presente de forma natural en la célula) la cantidad de miR-203 resultante de la penetración del compuesto añadido desde el medio de cultivo, el resultado es análogo a que las células estén expuestas a un nivel aumentado de miR-203 (o un compuesto análogo con la misma clase de actividad). Por esa razón, la etapa que es necesario tomar para realizar el método de la presente invención se ha definido como exponer las células a niveles aumentados de miR-203. Incluso si el nivel de partida pudiera considerarse que es cero (0) (como sería el caso en el medio de cultivo o en algunos de los modelos usados en los posteriores ejemplos), podría considerarse un aumento en los niveles: de 0 a una cierta cantidad.

Dicho aumento de los niveles de miR-203 pueden lograrse mediante el uso de vectores de expresión bien conocidos en el estado de la técnica, a partir de los que puede expresarse miR-203, por ejemplo, debido a una secuencia de codificación de la forma progenitora inmadura (por ejemplo, hsa-miR203, representadas por SEQ ID NO:2, en el caso de seres humanos o mmu-miR-203, representado por SEQ ID NO:3, en el caso deMus musculus),cuya forma dará lugar a la correspondientes forma madura en la célula (hsa-miR-203a-3p, representada por SEQ ID NO:1, para seres humanos o mmu-miR-203-3p, representada por SEQ ID NO:4, paraMus musculus).Puede verse que las formas maduras del ser humano y del ratón son idénticas, por lo que el uso de formas precursoras y/o formas maduras de una especie que es diferente de las especies de origen de las células pluripotentes es compatible con el método de la invención y comprendido en su alcance, especialmente entre seres humanos, tanto cuando el microARN se añade directamente al medio de cultivo como cuando se produce desde o como un producto de expresión a partir de un vector.

También son posibles aquellas realizaciones que comienzan con una célula diferenciada mutada que ha insertado en su genoma un casete de expresión a partir del cual se expresa el microARN o su precursor, como en algunos ejemplos de la presente invención.

Como se prefiere una expresión temporal (por ejemplo, 3-5 días), es preferible que la secuencia de codificación que da lugar al microARN o su precursor esté bajo el control de un promotor inducible, como el promotor inducible por tetraciclina (inducible, por ejemplo, por doxiciclina) usado en los ejemplos de la presente solicitud, de manera que el tiempo de expresión sea fácilmente controlable y parable eliminando el compuesto inducible. También es posible, y puede considerarse otra posible realización, que el vector de expresión sea un plásmido o un vector derivado de virus no integrable, como aquellos derivados de virus como adenovirus o virus adeno-asociados, que facilita una expresión temporal por sí mismos sin control adicional.

El producto de la expresión puede ser un ARNm que muestra una parte que corresponde a la molécula del miARN y una secuencia de codificación de una etiqueta o una proteína utilizable, por ejemplo, como marcador.

Otra posible realización, que es una de las preferidas, es añadir miR-203, o un análogo del mismo, al medio de cultivo de las células pluripotentes ya generadas y, cuando se desea la exposición temporal, eliminarlo del medio de cultivo cuando se completa el tiempo de exposición deseado (3-5 días, como se comenta anteriormente). La transfección temporal de dicho mimético de microARN permite la exposición temporal de 3-5 días, como se comenta anteriormente. En ese caso, pueden añadirse tanto la molécula madura como la precursora de miR-203. Como se indica anteriormente, en el caso de miR-203, la forma madura más abundante es la que se origina del brazo 3' del pre-miARN (hsa-miR-203a-3p en seres humanos y mmu-miR-203-3p en ratones), que es la forma responsable, al menos en un alto nivel, de los efectos descritos en la presente solicitud; por lo tanto, es la forma usada preferentemente en el presente método, es una posible realización del presente método someter a las células pluripotentes a una mezcla de ambas formas maduras, la que se origina del brazo 3' y la que se origina del brazo 5', como en algunos ensayos de la presente solicitud, de manera que el escenario endógeno en las células está fielmente mimetizado).

El uso de compuestos sintéticos en vez de la molécula natural de miR-203 es posible, como se demuestra en algunos ejemplos de la presente invención. Se considera particularmente el uso de “análogos”. Los análogos de ARN son moléculas que son similares a los microARN naturales, pero que contienen al menos una modificación que los hacer diferentes y distintos. Se incluyen en la definición de análogos de ARN a aquellas moléculas de ARN donde al menos un nucleótido se sustituye por otro: dado que la complementariedad entre un microARN y el fragmento del 3'UTR de ARNm con el que se emparejan las bases casi nunca es completa (100 %), los cambios en la secuencia del microARN son admisibles, con tal que aún hay emparejamiento de bases, de manera que el análogo de ARN puede ser al menos 50-60 % similar al microARN natural, con tal que su función aún se logre. Para este objetivo, debe tenerse en cuenta que hay siempre una región de 6-8 nucleótidos, conocida como región semilla, donde la complementariedad entre microARN y 3'UTR de ARNm es completa (100 %) o casi completa (véase la Fig. 10 para la región semilla con respecto a 3'UTR de Dnmt3a y Dnmt3b), de manera que es aconsejable no modificar los nucleótidos de la región semilla.

Más frecuentemente, pero compatible con las modificaciones anteriores, hay modificaciones químicas en los nucleótidos (las unidades del microARN), que dan lugar a análogos de nucleótidos. Dichas modificaciones se hacen normalmente para aumentar la estabilidad y/o resistencia a las nucleasas, facilitar la entrada a la célula, aumentar la fuerza de la interacción entre microARN y ARNm, aumentar la actividad deseada del microARN y/o influir en el procesado del microARN a través de una ruta celular particular (como RISC, el complejo silenciador inducido por ARN, que incorpora una hebra de un pequeño ARN de interferencia o un microARN, lo usa como una plantilla para reconocer el ARNm complementario y, después, activar la RNasa y escindir el ARN). Dichas modificaciones están normalmente en el resto de azúcar y/o en el enlace fosfato, e incluyen la adición de uno o más restos no nucleótidos. Algunas modificaciones normales son: los enlaces fosforotioato usados normalmente en vez de los enlaces fosfato; modificaciones en la posición 2' del resto azúcar como modificaciones 2'-O-metilo o 2'-O-metoxietilo; modificaciones donde la ribosa muestra una unión que conecta el oxígeno en 2' con el carbono en 4', bloqueando así la ribosa en la conformación3'-endo(LNA: ácidos nucleicos bloqueados) o ácidos nucleicos con puente etileno 2'-O, 4'-C (ENA); la sustitución de la estructura de azúcar por una estructura que contiene amida como una estructura aminoetilglicina, como en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA); el uso de PMO (ácidos nucleicos donde el resto ribosa se sustituye por un grupo morfolino); y otras modificaciones bien conocidas por los expertos en la técnica que pueden encontrarse revisadas, por ejemplo, por Kole et al. (2012). Como las bases nitrogenadas son el elemento menos habitualmente modificado en los análogos de nucleótidos, la comparación de su homología o identidad con respecto al fragmento o la secuencia entera de los oligonucleótidos o polinucleótidos naturales se hace de forma más apropiada con respecto a la secuencia de bases de nitrógeno. Las modificaciones en al menos uno de los extremos de la hebra, como la adición de una o más unidades de restos de compuestos como colesterol, colestanol, estigmastrol, ácido colánico y ergosterol y, también opcional y adicionalmente, un resto conector que una el resto conjugado a la hebra, también son habituales, especialmente para facilitar la entrada del análogo de microARN a la célula.

También se incluyen en los análogos de microARN, como se usa el término en la presente solicitud, son los miméticos de ARN, específicamente miméticos de microARN (mimético de miARN). Un mimético de ARN, como se comenta anteriormente con respecto al documento US20130345289A1, es un miARN sintético que tiene estabilidad aumentada debido a nucleótidos modificados o modificaciones estructurales (p. ej., protuberancias o bucles), y también aquellos pequeños ARN de doble cadena, modificados químicamente, que mimetizan el miARN endógenos y son capaces del análisis funcional de miARN mediante sobrerregulación de la actividad del miARN. Los miméticos de microARN añadidos al medio de cultivo son incorporados por las células y actúan directamente como moléculas bicatenarias (no se requiere la expresión celular) que imitan fielmente a su respectivo microARN, miR-203 en el presente caso. El método donde se añaden miméticos de miR-203 (solo uno o una mezcla de los mismos) al medio de cultivo de las iPSC, como en algunos ejemplos de la presente invención (como el ejemplo 4), es una realización preferida de la presente invención, especialmente cuando el mimético se caracteriza por:

a. ser una molécula modificada por ARN en donde al menos uno de los nucleótidos se sustituye por un nucleótido químicamente modificado, en donde la modificación química se selecciona del grupo de:

i. sustitución de uno o más enlaces fosfato por enlaces fosforotioato,

ii. una o más modificaciones en la posición 2' del resto azúcar seleccionada de las modificaciones 2'-O-metilo o 2'-O-metoxietilo; y/o

iii. una o más modificaciones en el resto ribosa seleccionada del grupo de: las que dan lugar a una unión que conecta el oxígeno en 2' con el carbono en 4', bloqueando así la ribosa en la conformación 3'-endo (LNA: ácidos nucleicos bloqueados) o ácidos nucleicos con puente de etileno 2'-O, 4'-C (ENA); la sustitución de la estructura azúcar por una estructura que contiene amida como una estructura de aminoetilglicina, como en ácidos nucleico peptídicos (PNA); y el uso de PMO (ácidos nucleicos donde el resto de ribosa se sustituye por un grupo morfolino), y combinaciones de las mismas;

b. ser una molécula bicatenaria con una región dúplex de entre 16 y 31 nucleótidos de longitud y que contiene un fragmento que es al menos idéntico al 50 % en su secuencia a la secuencia de bases de nitrógeno de la molécula de ARN representada por SEQ ID NO:1 (hsa-miR-203a-3p) o SEQ ID NO:4 (mmu-miR-203-3p), y

c. opcionalmente, que comprende adicionalmente en al menos un extremo de al menos una de la hebras un resto conjugado que comprende una o más unidades de colesterol, colestanol, estigmastrol, ácido colánico y ergosterol y, también opcionalmente y adicionalmente, un resto conector que une el resto conjugado a la hebra, y

d. también opcionalmente y adicionalmente, que presenta uno o más desapareamientos entre las dos hebras.

Ejemplos de miméticos específicos de microARN pueden encontrarse también, por ejemplo, en las solicitudes de patente de Estados Unidos US 2009/0209626 y US 2011/0263675, ambos de Dharmacon, Inc., donde los miméticos son casos específicos de los miméticos descritos anteriormente. Son muy preferidos los miméticos de microARN como los miméticos de miR-203 de la serie miRIDIAN de Dharmacon (http://dharmacon.gelifesciences.com/rnai-and-customrna-synthesis/microma/miridian-microma-mimics/) usados en ensayos de la presente solicitud que comercializa miméticos de miR-203 deHomo sapiens, Mus musculusy otras especies comoRattus norvegicus.Los miméticos miRIDIAN están mejorados químicamente con el patrón de modificación EN LA DIANA para programar preferentemente RISC con la hebra activa de microARN. Esta modificación incluye un ARN donde el primer y segundo nucleótido de la región sentido tiene cada uno un resto 2'-O-metilo, y la hebra antisentido está fosforilada en su extremo 5', en donde dicha modificación en la diana también se refiere a una modificación propietaria acuñada On-TargetTM (Dharmacon, Inc.). En cualquier caso, las modificaciones en la diana pueden usarse para ayudar a reducir los efectos fuera de la diana bloqueando la hebra sentido (pasajero) de estar comprometida por el proceso RISC. En cualquier caso, otros ejemplos de miméticos de microARN pueden encontrarse por ejemplo en Sigma Aldrich, que comercializa también miméticos hsa-miR-203a (HMI0357).

Las células pluripotentes naive que resultan de poner en práctica el método de la invención partiendo de iPSC son diferentes de dichas iPSC de partida, como puede verse en la tabla 3. Las células pluripotentes naive obtenidas, cuando se someten a protocolos de diferenciación bien establecidos, continúan expresando marcadores de pluripotencia como Nanog, Oct y Sox2, mientras co-existen con células que expresan marcadores de diferenciación como Nestina, Gata4 y CD34. Por consiguiente, la población resultante de células se caracteriza expresando tanto marcadores de pluripotencia como marcadores de diferenciación son también un objetivo de la presente invención, particularmente las obtenidas por el método de la presente invención.

Los ensayos descritos en los ejemplos posteriores muestran que controlando la expresión temporal de miR-203 en las iPSC y también en las ESC mejora la capacidad de estas células para diferenciarse en múltiples líneas celulares y alcanzar más propiedades de maduración sin interferir con las propiedades de auto-renovación. Por consiguiente, el método de la presente invención y las células madre pluripotentes obtenidas de él abren nuevas posibilidades para la aplicación clínica de las células madre pluripotentes y resolver algunas de las dificultades que permanecían sin resolver para pensar y planificar seriamente su uso con propósitos clínicos.

Las células madre pluripotentes tienen el potencial de llegar a ser herramientas de investigación y clínicas para entender y modelar enfermedades, desarrollar y cribar fármacos candidato, y administrar terapia de sustitución celular para ayudar a la medicina regenerativa. La tecnología de reprogramación ofrece el potencial para tratar muchas enfermedades, que incluyen enfermedades neurodegenerativas, enfermedad cardiovascular, diabetes, y esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En teoría, los tipos de células fácilmente accesibles (como fibroblastos de la piel) podrían biopsiarse de un paciente y reprogramarse, resumiendo de forma eficaz la enfermedad del paciente en una placa de cultivo. Dichas células podrían servir entonces como la base de terapia de sustitución celular autóloga. Debido a que las células fuente se originan en el paciente, el rechazo inmune de los derivados diferenciados se minimizaría. Aunque las iPSC tienen gran potencial como fuentes de células maduras adultas, queda mucho por aprender sobre los procesos por lo que estas células se diferencian. El método de la presente invención y las células pluripotentes obtenidas de él pueden verse como una nueva y mejorada herramienta de investigación que puede ser de uso para entender el proceso por el cual las células pluripotentes se diferencian y, además, una mejora útil que facilita y hace más factible la aplicación clínica de dichas células, después de su diferenciación, especialmente para la medicina regenerativa. Por lo tanto, el uso de las células pluripotentes de la presente invención para obtener células diferenciadas, los métodos para obtener células diferenciadas que usen como material de partida las células pluripotentes de la presente invención, además de los métodos de obtención de células diferenciadas a partir de iPSC que comprenden una etapa como la etapa de caracterización del método de la presente invención (la exposición de las células a un nivel aumentado de miR-203) están comprendido en el alcance de la presente invención.

Los usos posibles de la presente tecnología, (los métodos de la presente invención y las células obtenidas de ellos), incluyen:

- El campo de la regeneración cardiaca. Las iPSC creadas a partir de fibroblastos humanos y murinos pueden dar lugar a cardiomiocitos funcionales que presentan potenciales de acción cardiaca distintivos. Sin embargo, el proceso de maduración en cardiomiocitos se altera cuando las iPSC se usan - el desarrollo cardiaco de las iPSC se retrasa en comparación con el visto con cardiomiocitos derivados de ESC o tejido fetal. Además, existe variación en la expresión de marcadores genéticos en las células cardiacas derivadas de iPSC en comparación con la vista en cardiomiocitos derivados de ESC. Por lo tanto, los cardiomiocitos derivados de iPSC demuestran un compromiso normal pero maduración alterada, y no está claro si los defectos observados son debido a barreras técnicas (p. ej., reprogramación incompleta de iPSC) o biológicas (p. ej., alteración funcional debido a factores genéticos).

- Regeneración neural, que incluye el modelado y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica o atrofia muscular espinal. Las iPSC derivadas del paciente pueden devanarse hasta los subtipos neuronales afectados por medio de la diferenciaciónin vitroo células iPS reparadas usando direccionamiento génico para reparar la mutación que provoca la enfermedad. Aún, los protocolos para aplicar la regeneración basada en IPSC en trastornos neurodegenerativos están lejos de la realidad. Además, se ha hecho un progreso mayor en generar poblaciones maduras de neuronas y glías distintas con el fin del cribado de fármacos y terapia de sustitución. Sin embargo, estas células pueden no reflejar realmente las respuestas celulares a compuestos que el cuerpo tendría a nivel fisiológico. Finalmente, los investigadores aún se enfrentan a los problemas de conversión de baja eficacia y laboriosos de llevar a cabo. La eficacia de conversión media de dichos métodos es menor de 1 %, que restringe además el uso extensivo de la tecnología.

- Remodelación en un sistema de regeneración de cartílago. Como el cartílago articular no se restaura por curación natural, se han hecho muchos intentos de mejorar la calidad de esta reparación tisular. El trasplante de condrocitos autólogo ha cambiado el paradigma del tratamiento de los defectos del cartílago de la reparación a la regeneración, y esto se ha demostrado en ensayos aleatorizados que prueban el concepto de tejido de regeneración en una estrategia de terapia basado en célula. En este escenario, los actuales inventores especulan que el tratamiento de miR-203 en condrocitos autólogos antes del trasplante que facilitarían la remodelación del tejido dañado y su total regeneración.

Dado que el control de la expresión temporal de miR-203 en las iPSC y también en las ESC mejora la capacidad de estas células de diferenciarse en múltiples líneas celulares (en particular, los cardiomiocitos) y de alcanzar propiedades de maduración adicionales sin interferir con sus propiedades de auto-renovación, el método de la presente invención significa una mejora importante para la generación de células diferenciadas aplicable en los campos mencionados anteriormente. Por consiguiente, el uso de las células pluripotentes obtenidas por el método de la presente invención para obtener células diferenciadas aplicables a los campos mencionados anteriormente (regeneración cardiaca, regeneración neural y regeneración de cartílago) es decir, cardiomiocitos, células neurales o gliales, condrocitos y células productoras de insulina, es una realización preferida del uso de las células pluripotentes de la presente invención.

Debe apuntarse a que la exposición temporal a secuencias de miR-203 mejora tanto la diferenciación funcional como la maduración, como se muestra en los ejemplos de la presente solicitud, especialmente en el ejemplo 4, relacionado con la diferenciación y maduración de los cardiomiocitos. Por lo tanto, los posibles usos terapéuticos de este microARN en medicina regenerativa, como regeneración neural, regeneración del cartílago, sustitución de células productoras de insulina y, muy especialmente, regeneración cardiaca, están apoyados por los ensayos descritos en la presente solicitud.

En conjunto, puede concluirse que la modulación del patrón de metilación del ADN de células pluripotentes por exposición a pequeños miméticos de microARN pueden potenciar el rendimiento de estas células en múltiples ensayos funcionales, incluyendo la diferenciación y maduración de múltiples líneas celulares de interés en medicina regenerativa.

La presente invención se explicará en más detalle por medio de los ejemplos y las figuras descritas a continuación.

Ejemplos

Resumen del procedimiento experimental

Los presentes inventores han generado un modelo de ratón en que la expresión de miR-203 puede modularse mediante tratamiento con doxiciclina (DOX). Su modelo animal knock in (ColA_miR203; Rosa 26_rtTA) permite una sobreexpresión de más de 100 veces de este microARN cada vez que el animal - o las células derivadas del animal - se exponen al tratamiento con doxiciclina. Su primera estrategia fue extraer los fibroblastos embrionarios del ratón de esos ratones, reprogramarlosin vitrousando los factores de Yamanaka y generar células pluripotentes inducibles miR-203 knock in (iPSC miR-203 KI). Esas iPSC se trataron después con DOX durante 3 a 5 días, y después se expusieron a la retirada de DOX durante varios pases. Esas iPSC se han denominado como “iPSC KI temporales (tKI)” para simplificar. Después, se analizaron varias lecturas para demostrar como esas iPSC tKI muestran un potencial de pluripotencialidad mejorado, cuando se compara con sus equivalentes de control (el mismo clon de iPSC tratados con vehículo): (i) la diferenciaciónin vitroa cuerpos embrioides (EB) se aumenta significativamente en tKI comparado con las iPSC de control. Los EB derivados de iPSC tKI crecen más rápido, se diferencian mejor, muestran un mayor porcentaje y eficacia de latido y muestran una arquitectura perfecta de las tres capas germinales. La diferenciación y funcionalidad de sus células también se revela por la formación de largas cavidades, que se encuentra raramente en los EB derivados de iPSC de control; (ii) la diferenciaciónin vivode teratomas también se mejora dramáticamente cuando se inyectan las iPSC tKI en ratones, cuando se compara con sus respectivos controles. El nivel de diferenciación de las tres capas germinales es notorio, y algunos tejidos atípicos como páncreas, médula ósea, cartílago e incluso tejido extra-embrionario (placenta) se encuentran fácilmente en teratomas derivados de iPSC tKI. Cuando estas iPSC tKI se inyectaron intraperitonealmente en ratones, fueron capaces de desarrollar estructuras complejas parecidas a embriones, nunca encontradas en inyecciones con iPSC WT. Esas estructuras se caracterizan por la expresión de varios marcadores de desarrollo embrionario, las tres capas germinales y tejidos extra embrionarios, (iii) la expresión de marcadores de la etapa de 2 células, como ciertos retrotransposones, es mayor en iPSC tKI cuando se compara con sus equivalentes WT. Además, el perfil transcriptómico de esas células iPS ilustra como las iPSC tKI activan un número de redes de señalización implicadas en el desarrollo, morfogénesis, mantenimiento de pluripotencialidad, organización de la cromatina y compromiso con el destino celular, probando su estado naive. De interés, el análisis de componente principal, análisis de agrupamiento jerárquico y mapa de calor de las muestras de secuenciación de ARN demostraron la proximidad significativa entre células iPS tKI y ES, comparado con las iPSC WT; (iv) la contribución a la quimera es definitivamente la mejor prueba de concepto para demostrar el valor de las células iPS o ES. Los experimentos proporcionados de agregación celular e incluso más importante, los ensayos de complementación tetraploide mostraron como las iPSC tKI contribuyen a la generación de quimeras y la transmisión de la línea germinal más significativamente que sus respectivas iPSC de control.

Las estrategias secundarias de los inventores para validar adicionalmente los datos se dirigieron a reproducir esas pruebas de concepto en algunos otros modelos diferentes. Por consiguiente, se demostró que se observaron los mismos efectos cuando el miR-203 se sobreexpresó temporalmente en un número de clones de las IPSC WT o ESC WT. La calidad de las células pluripotentes de miR-203 temporales (o iPSC o ESC) fue en todos los casos mejor que sus equivalentes de control. La sobreexpresión se reprodujo también usando retrovirus (pMCSV) que se silencian en las células pluripotentes después de unos días desde la transducción, permitiendo una expresión temporal del microARN. Finalmente, y muy importante, los datos se reprodujeron transfectando el miR-203 usando miméticos de microARN y métodos ordinarios de transfección de ARN, como Lippofectamine RNAi Max (Invitrogen) o Dharmafect (Dharmacon).

Los ensayos de los ejemplos descritos a continuación se realizaron con los siguientes materiales y metodologías:

- Modelos animales y procedimientos

El modelo knockout condicional de miR-203 se generó flanqueando el locus mmu-mir203 con sitios loxP recombinación ET; Genebridges, Heidelberg, Alemania) usando recombinación homóloga en células ES (Fig. 1a). Se usó un casete resistente a la neomicina para la selección de clones recombinantes. La recombinación de sitios frt se logró usando transgénicos CAG-Flpe (Rodríguez et al., 2000) y los sitios loxP se recombinaron usando un transgén Ella-Cre (Schwenk et al., 1995) dando por resultando el alelo miR-203(-/-) (Fig. 1a). El modelo inducible de miR-203 se generó clonando una secuencia genómica de mmu-mir203 (chr12: 112130880-112130955; liberación de la base de datos miRBase 21.0.) en el vector pBS31 para la recombinación en el locus ColA1 en las células ES siguiendo la estrategia presentada anteriormente (Beard et al., 2006). El alelo knockin resultante [ColA1(miR-203)] se combinó con un alelo Rosa26-M2rtTa [Rosa26(rtTA)] para la inducción dependiente de doxiciclina como se describe anteriormente (Beard et al., 2006) (véase la Fig. 1c para detalles). Estos animales se mantuvieron en un fondo genético C57BL6/J x 129 x CD1 mezclado.

La experimentación animal se realizó según los protocolos aprobados por el comité de ética para la investigación y el bienestar animal del CNIO-ISCIII (CEIyBA).

Para teratomas subcutáneos, se tripsinizaron las iPSC y se suspendieron 2-3 millones de células en 100 pl de PBS suplementado con 0,1 % de glucosa y se inyectaron subcutáneamente en ambos flancos de ratones desnudos atímicos Crl:NU(NCr)-Foxn1nu (proporcionados por Charles River). Los teratomas se controlaron diariamente y se midieron mediante un calibrador y finalmente se aislaron cuando sus diámetros alcanzaron los 1,5 cm. Se hizo la eutanasia a los animales en ese punto y los teratomas se pesaron y se procesaron para la extracción de ARN o análisis histopatológico.

Para las inyecciones intraperitoneales, se inyectaron ratones atímicos tipo salvaje con 4-5 x 105 iPSC resuspendidas en 100 pl de PBS suplementado con 0,1 % de glucosa. Los ratones se supervisaron diariamente desde el día de la inyección. Normalmente, 30 o 40 días después de la inyección se hizo la eutanasia a los ratones y los teratomas viscerales y estructuras similares a embriones se aislaron y se procesaron, para extracción de ARN o para análisis histopatológico.

Para la generación de quimeras, se microinyectaron iPSC o ESC (5-7 células por embrión, 10 pases) en blastocistos C57BL/6J-Tyrc-2J/J y se transfectaron a hembras pseudo-preñadas Crl:CD1 (ICR).

Para estudios de complementación tetraploide, se cultivaron cigotos durante la noche hasta que alcanzaron la etapa de 2 células, o los embriones Hsd:ICR(CD-1) en la etapa de 2 células se recogieron de las hembras preñadas a E1.5 y se electrofusionaron, en cuyo momento se electrofusionaron en manitol 0,3 M usando un instrumento de fusión celular BLS CF-150/B con una cámara de electrodo de 250 pm. Las condiciones de pulso eléctrico fueron 30 V de amplitud, 31 ps de anchura y 1,5 de voltaje AC. Una hora más tarde, los embriones de 1 célula (tetraploides) se identificaron cuidadosamente y se separaron de los embriones que no se habían fusionado, se cultivaron en KSOM durante otros 1 o 2 días, al siguiente día se seleccionaron embriones en la etapa de 4 células y se agregaron con ESC o iPSC. Los embriones agregados se inyectaron entonces a hembras pseudo-preñadas 24 horas más tarde.

Para estudiar la contribución a la línea germinal, se cruzaron ratones ES-iPS negros (de ensayos de complementación tetraploide) o quimeras (de microinyección Es-iPS de embriones diploides) con hembras Albino B6 o C57BL/6J-Tyrc-2J/J y se probó el color de la progenie.

Cultivo celular y expresión génica

Se obtuvieron fibroblastos embrionarios de ratón primarios (MEF) a partir de embriones a E13.5 y se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % de FBS y penicilina/estreptomicina. Los cultivos se probaron de forma rutinaria para micoplasma. Se indujo la reprogramación en estos cultivos de MEF mediante transducción lentiviral Oct4-Sox2-Klf4-cMyc (OSKM) (Takahasi y Yamanaka, 2006). Para la transducción lentiviral, se transfectaron células HEK293T con Tet-O-FUW-OSKM (Addgene núm. 20321) y vectores de empaquetamiento usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes virales se recogieron dos veces al día en dos días consecutivos empezando 24 h después de la transfección y se usaron para infectar los MEF, puestos en placas previamente a una densidad de 250000 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Antes de la infección, se añadió polibreno a los sobrenadantes virales a una concentración de 2 pg/ml. Los MEF infectados se cultivaron entonces en medio IPSC, que contenía KO-DMEM (Gibco), 2-mercaptoetanol 50 mM (Invitrogen), aminoácidos no esenciales MEM NEAA (invitrogen), penicilina y estreptomicina (5000 pg/ml, Invitrogen), LIF (factor inhibidor de leucemia, ESGRO, Millipore) y 20 % de sustitución de suero knock-out (KSR, Invitrogen). El medio se cambió cada 24 h y se tiñeron las placas para la actividad de fosfatasa alcalina para asegurar la eficacia de la reprogramación (kit de detección de AP, Sigma-Aldrich). Una vez que se recogieron las colonias, se cultivaron IPSC en medio de IPSC sobre células alimentadoras inactivas de mitomicina C (Roche). Se cultivaron ESC G4 sobre alimentadores inactivados de mitomicina C y en presencia de medio de ESC que contenía KO-DMEM, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, glutamax, penicilina y estreptomicina, LIF y 10 % de suero de ternera fetal (Hyclone). Cuando se indicó, el medio de cultivo para células pluripotentes incluyó factores 2i (inhibidor de MEK PD0325901 1 pM, inhibidor de Gsk3 CHIR99021 3 pM) y LIF de ratón (como antes) en medio N2B27, como se describe anteriormente (Ying et al., 2008).

Para inducir la sobreexpresión de miR-203 temporal en células miR-203 KI, los cultivos de iPSC o ESC (ColA1(miR-203/miR-203), Rosa26(rt-TA/rt/TA) se trataron con doxiciclina (1 pg/ml; Invitrogen) durante 5 días. Después de eso, se estandarizó la retirada de doxiciclina para los cultivos durante los siguientes varios pases (15-30 días). El tratamiento de doxiciclina se aplicó también a ESC o iPSC tipo salvaje para evaluar el efecto del tratamiento en sí mismo.

Para los experimentos de sobreexpresión, se subclonó ADNc de miR-203 y de longitud completa de Dnmt3a y Dnmt3b en el vector retroviral pMCSV-PIG (disponible mediante el plásmido de Addgene 21654: https://www.addgene.org/21654/) (Abad et al., 2013) mediante subclonado dirigido por restricción, usando los plásmidos pCMV-Sport6-mDnmt3a (clon de MGC: 5662) y attB-mCh-mDnmt3b-Poly (A)-NeoR (plásmido de Addgene 65553) como plantillas, respectivamente. Cuando se transdujeron con estos vectores retrovirales las células tanto ESC como iPSC se clasificaron mediante FACS y las células positivas por GFP se seleccionaron para cultivos y análisis posteriores.

Para la transducción retroviral, se transfectaron células HEK293T con el vector pMCSV-PIG respectivo (Abad et al., Nature 2013) que expresa un reportero GFP (incluyendo cualquiera de solo GFP; miR-203-GFP, Dnmt3a-GFP o Dnmt3b-GFP) y el vector de empaquetamiento pCL-ECO, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes virales se recogieron dos veces al día en dos días consecutivos comenzando 24 h después de la transfección y se usaron para infectar ESC o IPSC, que se pusieron en placas previamente sobre alimentadores en placas de 6 pocillos. Precediendo a la infección, se añadió polibreno a los sobrenadantes virales a una concentración de 2 pg/ml.

Para la transfección con miméticos, los presentes inventores usaron los miméticos humanos hsa-miR-203a-5p (C-302893-00)/hsa-miR-203-3p (C-300562-03) de microARN miRIDIAN o control de transfección mimético con Dy547 (CP-004500-01), de Dharmacon, de manera que las células se sometieron a una mezcla de análogos/miméticos de ambas formas maduras de microARN-203, para mimetizar fielmente el escenario endógeno en las células. Se realizó la transfección usando reactivo de transfección Dharmafect (Dharmacon) o Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La eficacia de transfección se evaluó 24 horas después de la transfección mediante fluorescencia de Dy547, y los experimentos se realizaron después como se indica en las figuras.

Para los ensayos de interferencia de ARN, se usaron ON-TARGET plus SMART pool para ARNip de control no dirigido (D-001810-01,02, 03, 04), ARNip de Dnmt3a (J-065433-09, 10, 11, 12) y ARNip de Dnmt3b (J-044164-05, 06, 07, 08) de Dharmacon. Se realizó la transfección usando reactivo de transfección Darmafect (Dharmacon) siguiendo las instrucciones del fabricante. La eficacia de transfección se evaluó 24 horas después de la transfección por pPCR, usando los cebadores indicados en la tabla 2.

Los ensayos informados con luciferasa se realizaron en células HEK293T. En pocas palabras, se sembraron 200.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos y el día después, las células se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las regiones 3'UTR de los genes murinos Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l y Dnmt1 se amplificaron por PCR con cebadores específicos (Dnmt3a_EcoRI-Fw: 5'-GAATTCAGGGACATGGGGGCAAACTGAA-3' (SEQ ID NO:55); Dnmt3a Ndel-Rv: 5'-CATATGCTGAGGCAGTCATTTTAGATTCAT-3' (SEQ ID NO:56); Dnmt3b EcoRI-Fw: 5'-GAATTCTTTTAGCTCACCTGTGTGGGG-3' (SEQ ID NO:57); Dnmt3b Ndel-Rv: 5'-CATATGCCAGAAAGGTAAACTCTGGGCA-3' (SEQ ID NO:58), Dnmt3l EcoRI-Fw: 5'-GAATTCGAAATGAATCACCATAAGATGAAAG-3' (SEQ ID NO:59); Dnmt3l Ndel-Rv: 5'-CATATGAACAATCCTATGATATATTTGAAAAA-3 ' (SEQ ID NO:60); Dnmt1_EcoRI-Fw: 5'-GAATTCGTGCTCTCACCCAGAGCCCCA-3' (SEQ ID NO:61; Dnmt1_Ndel-Rv: 5'-CATATGGCTTGACAGAAGCGCTTTATTTTG-3' (SEQ ID NO:62) usando clones de ADNc (pCMV-Sport6-mDnmt3a, clon de ADNc MGC:5662; pBluescript-mDnmt3l, clon RIKEN: 2410006021; pYX-Asc-mDnmt1, clon MGC: 62302) o ADNc de ratón (en el caso de Dnmt3b). Los productos de PCR se verificaron por secuenciación y se ligaron en el vector pGL3-Control (Promega), más abajo del gen reportero de luciferasa. Las mutaciones en los sitios de unión de miR-203 (Fig. 10) se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio y se verificaron posteriormente por secuenciación. Las transfecciones se realizaron con vectores pMCSV-GFP o mMCSV-miR-203-GFP, en combinación con los vectores derivados de pGL3, y Renilla como control. La medida de la luciferasa se logró 48 horas después de la transfección usando un lector de microplaca de luminiscencia (Biotek). Finalmente, se cultivaron las células ES que expresan el reportero 2C::tdTomato para detectar la expresión endógena del retrotransposón de la etapa de 2C MuERV-L en medio 2i sobre alimentadores como se informó anteriormente (Macfarlan et al., 2012). Este retrotransposón se induce específicamente en blastómeros de 2 células totipotentes. La expresión de MERVL puede detectarse raramente en células madre pluripotentes en cultivo, pero solo en proporciones muy bajas (menos de 0,5 % del cultivo).

Las iPSC humanas que expresan la repetición terminal larga (LTR7) de los retrovirus endógenos HERVH fusionados con el reportero de GFP (Wang et al., 2016) se cultivaron en medio mTeSRTM1 (Stem Cell Technologies) sobre una base de Matrigel (Corning). La experimentación con células humanas se realizó según los protocolos aprobados por el comité de ética para la investigación del ISCIII (CEI; número PI 61_2017).

- Generación de cuerpo embrioide

En pocas palabras, cuando se usaron iPSC o ESC tipo salvaje, se transdujeron previamente con retrovirus que expresan miR-203 (pMSCV-miR-203) o se transfectaron con miméticos de miARN para la expresión temporal de miR-203, como puede verse en la representación esquemática de la Fig. 4a. Las iPSC o ESC se tripsinizaron y suspendieron de nuevo a una concentración de 200.000 células/ml en presencia de medio de crecimiento completo que carece del factor inhibidor de leucemia (LIF). Pequeñas gotas de esta suspensión (~25 pl) se recogieron y sembraron en la tapa de una placa de 10 mm, generando gotas colgantes de aproximadamente 5000 células por gota. Después de 4 días, los agregados estaban ya visibles en el fondo de las gotas y se recogieron y se transfirieron a una placa no adherente, que contenía DMEM y 10 % de suero de ternera fetal. Allí se mantuvieron en suspensión durante los tiempos indicados y se evaluaron el latido, tamaño y formación de cavidades como se describe en las figuras. En pocas palabras, los cuerpos embrioides se observaron cada cinco días y se midieron por tamaño, latido y formación de cavidad. Entre 20 y 30 EB se analizaron por condición y los porcentajes de “EB que late” o “EB con cavidades” se calcularon para cada punto temporal. El tamaño de los EB se midió usando el software Image J.

- Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

Las células previamente sembradas en cubreobjetos se fijaron en 4 % de paraformaldehído durante 15 min, se permeabilizaron usando PBS al 0,1 % Tritón X-100 durante 15 min y se bloquearon en BSA durante 1 h a temperatura ambiente. La incubación de anticuerpo primario se realizó durante la noche a 4 °C en todos los casos, seguido por incubación de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. La tinción nuclear se incluyó en el último lavado con PBS, usando Hoescht o DAPI. Los anticuerpos primarios usados en este estudio eran contra Cd34 (Abcam), Gata4 (Santa Cruz), Pax6 (Abcam), Nestina (Millipore), cTnT (Abcam) y fosfo-histona H3 (Millipore). La tabla 1 posterior muestra información detallada sobre dichos anticuerpos y otros anticuerpos usados en los ensayos de la presente solicitud. Las células se examinaron bajo un microscopio Leica SP5 equipado con láser de luz blanca y detección híbrida.

Para la inmunohistoquímica, se fijaron muestras de tejido en formalina al 10 %, integrada en parafina y cortada en secciones de 3 pm, que se montaron en portaobjetos super-frost-plus y se rehidrataron. Se tiñeron secciones consecutivas con hematoxilina y eosina (H y E) o se sometieron a inmunohistoquímica usando plataformas de inmunotinción automatizada (Ventana Discovery XT, Roche o Autostainer Plus Link 48). La recuperación de antígeno se realizó primero con tampón a pH alto o bajo dependiendo del anticuerpo primario (CC1m, Roche o tampón de recuperación de antígeno a pH bajo, Dako), la peroxidasa endógena se bloqueó (peróxido de hidrógeno a 3 %) y se incubaron portaobjetos con anticuerpos primarios frente a Nanog (Cell Signaling Biotechnology, 8822), citoqueratina 8 (CK8; Unidad del núcleo de anticuerpos monoclonal del CNIO, A<m>-TROMA I), GFP (Roche, 11814460001), Sox2 (Cell Signaling Technology, 3728), alfa-fetoproteína (AFP; R&D Systems, AF5369), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, sc-9081), KI-67 (Master Diagnostica, 0003110QD), Nestina (Millipore MAB353), Cd31 (Abcam), Cd34 (ABCAM ab8158), Cd73 (Cell Signaling Technology), colagenasa tipo I (Rockland), Gata4 (Santa Cruz Biotechnology, sc-1237), insulina (Dako A0564), actina de músculo liso (Thermo Scientific RB-9010-PO), actina esquelética (Dako, M0635) y Ter119 (LY-76; BD Bioscience, 550565) se usaron. Se puede encontrar también información detallada sobre ellos en la Tabla 1 posterior. Los portaobjetos se incubaron entonces con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (OmniRabbit Ventana, Roche) y la reacción inmunohistoquímica se desarrolló usando tetrahidrocloruro de 3,30-diaminobencinida (DAB) como un cromógeno (Chromomap DAB, Ventana, Roche o disolución DAB, Dako) y los núcleos se tiñeron por contraste con hematoxilina de Carazzi. Finalmente, los portaobjetos se deshidrataron, se limpiaron y se montaron con un medio de montaje permanente para la evaluación microscópica. Para la tinción de rojo sirio, la hematoxilina de Weigert se incubó durante 8 min y picro/rojo sirio durante 1 h, seguido por un lavado (10 min) con agua. Las imágenes se adquirieron con un escáner de portaobjetos (AxioScan z1, Zeiss). La tinción rojo sirio se midió usando luces tanto de campo brillante como polarizadas. Las imágenes se capturaron y cuantificaron usaron el Zen Software (Zeiss).

Tabla 1 - anticuerpos usados en los ensayos de la presente solicitud

- Análisis de niveles de ARNm y microARN

Se extrajo ARN de muestras celulares o tisulares con Trizol (Invitrogen) o usando el kit de aislamiento de miARN miRVana (Thermo Fisher), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La retrotranscripción en ADNc se realizó usando transcriptasa inversa M-MLV (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. El PCR cuantitativo a tiempo real se realizó usando mezcla maestra para PCR de energía verde Syber (Applied Biosystems) en un termociclador ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). El gen constitutivo Gapdh se usó para la normalización. Los cebadores de oligonucleótidos usados en los ensayos de la presente solicitud se enumeran en la tabla 2 posterior.

Tabla 2 - Oligonucleótidos usados como cebadores

Para la transcripción inversa de microARN, se usó el ensayo “Taqman small RNA assay” (ThermoFisher Scientific, 4366596), que incluye los oligonucleótidos comerciales específicos para mmu-miR-203-5p y 3p (ThermoFisher Scientific, 002580 y 000507) y los ARN constitutivos sno-202 o sno-142 (ThermoFisher Scientific). Las condiciones para la amplificación de miARN fueron como sigue: 30 minutos a 16 °C; 30 minutos a 42 °C y una etapa final de 5 minutos a 85 °C. Después se realizó la PCR cuantitativa a tiempo real usando la mezcla maestra para PCR universal Taqman (434437) siguiendo las instrucciones del fabricante en un termociclador ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems).

Para ARNsec, se extrajo el ARN total usando el kit de aislamiento de miARN miRVana (ThermoFisher), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se extrajeron entre 0,8 y 1 pg de ARN total de iPSC, ESC o teratomas, con números RIN (número de integridad de ARN) en el intervalo 7 a 10 (Bioanalizador Agilent 2100). Las fracciones de poli A+ se purificaron y se fragmentaron aleatoriamente, se convirtieron a ADNc bicatenarias y se procesaron usando el kit “preparación de muestra de ARNm con hebras TruSeq parte núm. 15031047 Rev. D” de Illumina. La biblioteca ligada al adaptador se completó por PCR con cebadores Illumina PE (8-11 ciclos) y las bibliotecas de ADNc direccional resultantes se secuenciaron para 50 bases en un formato de lectura sencilla (Illumina HiSeq2000) y se analizaron con nextpresso (disponible en http://bioinfo.cnio.es/nextpresso/) (Graña et al., 2017). Las lecturas se comprobaron por calidad con FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) y se alinearon al genoma de ratón (GRCm38/mm10) con TopHat-2.0.10 (disponible a https://ccb.jhu.edu/software/tophat/) (Trapnell et al., 2012), usando Bowtie 1.0.0 (descargable desde diferentes fuentes de internet, como https://slackbuilds.org/repository/14.2/academic/bowtie/) (Langmead et al., 2009) y Samtools 0.1.19 (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/0.1.19/) (Li et al., 2009), permitiendo dos disparidades y cinco éxitos múltiples. El montaje de transcritos, la estimación de sus abundancias y la expresión diferencial se calcularon con Cufflinks 2.2.1 (disponible en http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/releases/v2.2.1/) (Trapnell et al., 2012), usando el conjunto de datos de anotación del genoma de ratón GRCm38/mm10 del UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) (Rosembloom et al., 2015). Se usó una falsa tasa de descubrimiento (FDR) de 0,05 como umbral para la significancia en expresión diferencial. Los mapas de calor se construyeron después usando GENE-E (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/index.html). Los datos de ARNsec se han depositado en el repositorio GEO (número de acceso GSE81571).

- Conversión de bisulfito, metilación de ADN en todo el genoma y validación de DMR

Se prepararon muestras de ADN para la secuenciación de bisulfito del genoma completo usando el kit de genoma completo TrueMethyl® (CEGX®) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, se rompieron 200 ng de ADN genómico a 800 bp usando M220 Focused-ultrasonicator™ (Covaris®). Después el ADN fragmentado se desnaturalizó y se oxidó mediante un oxidante químico para convertir 5-hidroximetilcitosina a 5-formilcitosina (5fC). El propósito de la oxidación era asegurar que se capturó puramente la información para la metilación de 5' metilcitosina y no una combinación de patrón indistinguible de 5' metilcitosina y 5' hidroximetilcitosina. Después de la oxidación, el ADN se sometió a conversión con bisulfito para la desaminación de citosinas y 5fC a uracilos. El ADN convertido por bisulfito se desulfonó y se purificó para luego seguir como la preparación de una biblioteca. En este método de preparación de la biblioteca de “conversión posterior a bisulfito”, el ADN convertido con bisulfito monocatenario fragmentado se adaptó con adaptadores de secuenciación en el extremo 3' seguido por una etapa de extensión y finalmente la unión de los adaptadores al extremo 5' de las moléculas. Finalmente, las bibliotecas se indexaron y se amplificaron. La PCR se realizó durante 10 ciclos seguidos por purificación con base de perlas. Una etapa adicional de purificación y selección de tamaños usando perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, cat: A63881) se realizó para eliminar los dímeros del adaptador. La biblioteca purificada se eluyó en un volumen final de 14 pl de agua pura. La calidad de la biblioteca obtenida se comprobó usando el chip de alta sensibilidad de ADN en el bioanalizador Agilent. La biblioteca se cuantificó usando el kit de cuantificación de biblioteca Qubit y KAPA Biosystems (núm. KK4824) según las instrucciones del fabricante. Un total de 12pMol de bibliotecas multiplexadas se cargaron en un proceso rápido de PE de 125 bp en Illumina HiSeq2500. Las secuencias del adaptador se eliminaron usando cutadapt versión 1.9.1 (Martin, 2011) en modo final emparejado con los parámetros “-m 15 -u 6 -U 6”. Después se usó Bwameth (Pedersen et al., 2014) para alinear las lecturas a mm10 usando parámetros predeterminados. Los duplicados de PCR se eliminaron usando Picard v1.91 (http://broadinstitute.github.io/picard). Se construyeron tablas de conteo del número de bases metiladas y no metiladas secuenciadas en cada sitio CpG en el genoma usando el módulo “tabulador” de bwa-meth y BisSNP-0.82.2 (Liu et al., 2012) con parámetros predeterminados. Todas las bibliotecas pasaron las comprobaciones de control de calidad básicas con un mínimo de 82,7 % de alineación de pares de lectura de forma única. Las DMR se nombraron usando el módulo WGBS de DMRcate (Peters et al., 2015) con parámetros lambda=1000 y C=50, los DMP se nombraron usando DSS (Feng et al., 2014), los PMD, LMR y UMR se nombraron usando MethylSeekR (Burger et al., 2013) y los PMD se nombraron usando el paquete R “aaRon” (https://github.com/astatham/aaRon).

Para la validación de DMR, la secuenciación con bisulfito clonal se realizó en dos loci particulares: las regiones promotoras Elf5 (chr2: 103, 423, 778-103, 424, 180) y Sirt6 (chr10: 81, 624, 595-81, 625, 547) (Genome Browser: Ratón mm10 Diciembre de 2011. Genome Reference Consortium GRCm38). Se trataron con bisulfito 100 ng de ADN usando el kit EZ DNA-Methylation-LightingTM (Zymo Research) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN convertido con bisulfito se analizó después mediante análisis de PCR con bisulfito. Las ampliaciones de PCR por triplicado se realizaron usando cebadores específicos para la conversión con bisulfito semi-anidado enumerados en la última parte de la tabla 2 (“Análisis de metilación del ADN (genes de ratón)”), siguiendo las condiciones de PCR descritas anteriormente para Elf5 (Lee et al., 2011) o usando el siguiente protocolo: 95 °C 4 min; 5 ciclos (95 °C 45 s, 54 °C, 1,5 min, 72 °C 2 min); 25 ciclos (95 °C 45 s, 54 °C 1,5 min; 72 °C 1,5 min) y extensión final a 72 °C 4 min, para Sirt6. El estado de metilación de los amplicones de PCR se determinó mediante secuenciación clonal de Sanger de los productos de PCR acumulados para asegurar el análisis clonal representativo usando entre 8-10 clones por muestra. El análisis del estado de metilación de los clones se realizó usando el Analizador BiQ (Bock et al., 2005).

- Estudios de aislamiento y diferenciación del cardiomiocitos neonatales

Se prepararon cardiomiocitos de ratón y rata neonatales como se describe anteriormente (Huang et al., 2015). En pocas palabras, los cardiomiocitos neonatales se aislaron por disociación enzimática de corazones de ratón o rata neonatales de 1 día de edad con el sistema de aislamiento de cardiomiocitos neonatales (Cellutron Life Technology). Los cardiomiocitos se pusieron en placas por adelantado durante 2 horas para eliminar los fibroblastos. Las células se pusieron entonces en una placa en placas recubiertas con 1 % de gelatina en medio que contiene 10 % de suero de caballo y 5 % de suero de ternera fetal. Dieciocho horas después de poner en la placa, las células se cambiaron a medio libre de suero y luego se transfectaron con miméticos de miR-203a-3p y miR-203a-5p 50 nM o miméticos de control (todos ellos de Dharmacon) usando agente de transfección Lipofectamine RNAiMAX, siguiendo las instrucciones del fabricante. Seis horas más tarde, los medios con reactivo de transfección se eliminaron y se sustituyeron por medios que contenían 1 % de suero. Se recogieron en diferentes puntos temporales (como se indica en la Fig. 13a: 1, 3, o 5 días después de la transfección) para la posterior extracción de ARN y la tinción de EdU/inmunofluorescencia. Para la tinción de EdU, se usaron el kit de tinción de EdU Click-iT (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de eso, se realizó a inmunofluorescencia de marcadores de cardiomiocitos (troponina T) y se usó finalmente Hoescht para la tinción de núcleos.

Para la diferenciaciónin vitrode iPSC de ratón a cardiomiocitos, se transfectaron iPSC de ratón tipo salvaje con miméticos de control o miR-203a-3p/-5p antes de la diferenciación. En algunos experimentos, adicionalmente se transdujeron temporalmente pMCSV-Dnmt3a y 3b o el vector mMCSV vacío, 24 horas después de la transfección de miméticos. Las iPSC se mantuvieron entonces en cultivo bajo las condiciones estándar (en medio 2i/LIF) durante 15 días, antes de que comenzara la diferenciación. Después, las células se pusieron en placas en placas de 56 pocillos pre-recubiertas con Matrigel. Una vez que se volvieron confluentes, el medio se cambió a medio RPMI 1640/B27 (Thermo Fisher Scientific, 61870127 para el medio RPMI 1640 y A1895601 para B27) con CHIR99021 5 pM (Stem Cell Technologies, 72054). Después de dos días, las células se lavaron y se añadió medio sin CHIR99021. En el día 3 de la diferenciación, el medio se suplementó con IWR1 5 pM (Stem Cell Technologies, 72564) y se mantuvo en estas condiciones durante 2 días más. En el día 7 de la diferenciación, el medio se cambió a RPMI 1640/B27 más insulina. Después, del día 9 al día 15, las células se cultivaron en RPMI 1640/B27 y el medio se cambió cada 2 días. Desde el día 16 al día 18 de diferenciación, las células se cultivaron en DMEM sin glucosa y con lactato 4 mM. Del día 18 al día 21, el medio se cambió a RPMI 1640B27 y se cambió cada día. Finalmente, del día 22 al día 28, las células monocapa pueden aislarse a agrupaciones celulares y mantenerse en baja unión durante otra semana.

- Criolesión cardiaca en ratones neonatales

Se realizaron experimentos de criolesión cardiaca en ratón neonatal como se describe anteriormente (Polizzotti et al., 2016). En pocas palabras, el día 1 después del nacimiento, los neonatos se colocaron en un conjunto de manta de agua caliente a 37 °C y se cubrieron con material de cama del nido de la madre. Después se anestesiaron poniendo a las crías en un baño de agua helada durante 3 minutos. Después de eso, las crías se secaron usando una almohadilla de gasa estéril y se pusieron en el área quirúrgica en la posición supina, se inmovilizaron en los brazos, piernas y cola. Se hizo una incisión transversal en la piel a través del pecho usando un par de micro-tijeras y después cuidadosamente, se realizó una toracotomía lateral, haciendo una pequeña incisión en el cuarto o quinto espacio intercostal. El saco del pericardio se eliminó después cuidadosamente y el corazón se exteriorizó presionando suavemente el abdomen. El ventrículo izquierdo se identificó y después se aplicó una criosonda pre-enfriada en la superficie del ventrículo durante solo 2 segundos. Para cerrar la pared del pecho se usaron suturas de Proleno no absorbibles 8-0 y para cerrar la piel, se usaron suturas Webglue. Después del cierre, el área quirúrgica se lavó con gasas húmedas para eliminar cualquier sangre residual. Rápidamente, la cría se calentó durante varios minutos, se devolvió a la manta calentadora con las demás crías y se cubrió con material de cama de la jaula de la madre. Una vez que todas las crías se habían recuperado totalmente de la cirugía, se cambiaron a la jaula de la madre. Siete días después de la criolesión, se hizo la eutanasia a las crías por decapitación y se recogieron los corazones y se fijaron en formaldehído. Los corazones se procesaron después normalmente incrustándolos en parafina como se indica anteriormente.

- Estadísticas

La distribución normal y la varianza igual se confirmaron antes de usar la prueba t de Student (dos colas, desapareado) para estimar la significancia estadística. Para las tablas de contingencia, se usó la prueba exacta de Fisher. El análisis estadístico se realizó usando Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Ejemplo 1. miR-203 mejora la función de las células pluripotentesin vitro

Para estudiar miR-203in vivo,los inventores primero generaron un modelo de ratón knockout condicional en que el gen que codifica miR-203 podría eliminarse después de la expresión de Cre recombinasa (véase la Fig. 1a). La ablación genética de miR-203 en el ratón no dio por resultado anomalías principales aunque los ratones sin miR-203 [miR-203(-/-); KO] presentaron defectos suaves de desarrollo en la piel (Fig. 1b).

Un modelo inducible knockin (KI:ColA_MiR203; Rosa26_rtTA) también se generó, donde la secuencia que codifica miR-203 se insertó más abajo del gen del colágeno tipo I bajo el control de las secuencias que responden a la tetraciclina [ColA1 (miR-203/miR-203)] en presencia de transactivador inverso de tetraciclina expresado desde el locus Rosa26 [Rosa26(rtTA/rtTA)] (Fig. 1 c). Por consiguiente, el modelo KI permite una sobreexpresión de más de 100 veces de miR-203 cuando el animal - o las células derivadas del animal - se exponen a tratamiento con doxiciclina.

La primera estrategia fue extraer los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de esos ratones (KO y KI), reprogramándolos in vitro usando la versión viral de los factores de Yamanaka y generando células pluripotentes inducibles Knock in en miR-203 (iPSC KI miR-203).

El tratamiento de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) aislados de estos ratones con doxiciclina llevó a una inducción de 1000 veces en los niveles de miR-203 (Fig. 1d).

Para estudiar directamente el efecto de la expresión de miR-203 en células pluripotentes, se generaron iPSC de MEF aislados a partir de estos modelos KO y KI de miR-203. Se transdujeron MEF de tipo salvaje, KO y KI no inducidos con vectores lentivirales que expresan Oct4, Sox2, Klf4 y Myc para generar iPSC, y los cultivos KI se trataron más tarde con doxiciclina (DOX) durante 3-5 días, y después se expusieron a la retirada de DOX durante varios pases, obteniendo así iPSC que se llamaron KI inducidos temporalmente o, en forma abreviada, iPSC tKI (véase la Fig. 2a para la representación esquemática del protocolo usado).

Aunque se propuso anteriormente que miR-203 evita el potencial de pluripotencialidad de los progenitores de la piel (Yi et al., 2008), la secuenciación del ARN de estos clones de iPSC además de células ES tipo salvaje (ESC) reveló inesperadamente que las células tKI estaban transcripcionalmente más cerca de las ESC que de las iPSC WT (Fig. 2b), ambas al nivel del genoma completo y cuando se considera una firma de pluripotencia no preparada definida anteriormente (Chung et al., 2012) (Fig. 2c).

Para estudiar el potencial de diferenciación de las iPSC mutantes, se probaron las iPSC tipo salvaje y mutantes (KO y tKI) en el ensayo de formación del cuerpo embrioidein vitro.Se observó que la diferenciaciónin vitroa cuerpos embrioides (EB) se aumenta significativamente en tKI en comparación con las iPSC de control y, además, que los EB derivados de iPSC tKI crecen más rápido, se diferencian mejor, muestran un mayor porcentaje y eficacia en el latido y muestran una arquitectura perfecta de las tres capas germinales. Por consiguiente, mientras que la falta de miR-203 dio por resultado en una formación deficiente de cuerpos embrioides, la inducción temporal de miR-203 durante 5 días, 2 semanas antes de este ensayo, dio por resultado un número y volumen significativamente mayores de cuerpos embrioides (Fig. 2d). Los cuerpos embrioides tKI presentaron una organización compleja con alta expresión de marcadores primitivos de endodermo (Gata4), mesodermo (Cd34) y ectodermo (Pax6) o neuroectodermo (Nestina) (Fig. 2e,f). Se encontraron resultados similares cuando se comparan los mismos clones de iPS ColA1(miR-203/miR-203); Rosa26(rtTA/rtTA) no tratados (KI) o inducidos transitoriamente con doxiciclina (tKI; Fig. 3a). También en este caso, la inducción temporal de miR-203 dio por resultado una formación más eficaz de cuerpos embrioides mayores con largas cavidades, y frecuencia de latido mejorada (Fig. 3b,c). Una comparación de los perfiles de expresión en tKI frente a clones KI no inducidos en el día 30 después de la retirada de doxiciclina sugirió una mayor expresión de genes relacionados con la morfogénesis tisular y el desarrollo embrionario en esos clones en que miR-203 se había inducido temporalmente (Fig. 3d,e). La tabla 3 muestra el análisis de ontología génica de genes sobrerregulados en iPSC tKI (5 días en presencia de doxiciclina y 30 días después de la retirada de doxiciclina) frente a iPSC KI (no tratadas).

Tabla 3. Análisis de ontología génica de genes sobrerregulados en iPSC tKI frente a iPSC KI

De forma interesante, la sobrerregulación de las rutas de desarrollo y morfogénesis se acompañó también por la expresión mejorada de genes de pluripotencia después de la inducción temporal de miR-203 en estas iPSC (Fig. 3f).

Los inventores después probaron si miR-203 tenía un efecto similar en las células ES. Las células ES se generaron a partir de ratones ColA1(miR-203/miR-203); Rosa26(rtTA/rtTA) y estas células se dejaron sin tratar (KI) o se trataron con doxiciclina temporalmente durante 5 días (tKI), 2 semanas antes de realizar los ensayos del cuerpo embrioide. Como se muestra en la Fig. 2g,h, la inducción temporal de miR-203 en las ESC dio por resultado unos cuerpos embrioides más grandes que mostraron latidos con mayor eficacia y en puntos temporales más tempranos que las ESC no tratadas. De forma interesante, la expresión temporal de miR-203 ectópico usando un vector retroviral conducido por CMV o miméticos de ARN también dio por resultado la formación mejorada del cuerpo embrioide en las iPSC o ESC tipo salvaje (Fig. 4a-e), indicando que estos efectos no fueron únicos al modelo genético inducible. Como se representa en la Fig. 4, se usaron ambos miR-203a-3p/-5p en estos ensayos, pretendiendo mimetizar fielmente el escenario endógeno en que ambas formas maduras se expresan. Sin embargo, la forma más abundante (miR-203a-3p) es responsable de los efectos observados en la presente invención (Fig. 5). Finalmente, la expresión temporal de miR-203-GFP en células ES tipo salvaje aumentó significativamente el número de células similares a 2C (embrión de 2 células) como se determina por la expresión del retrovirus endógeno murino con cebador de ARNt de leucina (MuERV-L; reportero 2C::tdTomato) (Macfarlan et al., 2012) (Fig. 2i).

Juntos, estos resultados sugieren que la inducción temporal de las secuencias de miR-203 mejora la pluripotencia en iPSC y ESC favoreciendo la diferenciación de estas células a múltiples líneasin vitro.

Ejemplo 2. miR-203 mejora la función pluripotente de las células iPSin vivo

Se probó entonces el potencial de las iPSC tKI (en que la expresión de miR-203 solo se había inducido durante 5 díasin vitro)después de la inyección subcutánea en ratones. Y se encontró que la diferenciaciónin vivoa teratomas se mejora también dramáticamente cuando se inyectan IP tKI en ratones cuando se compara con sus controles respectivos.

Mientras se redujo la formación de teratomas en células KO miR-203, las iPSC tKI formaron tumores significativamente mayores en estos ensayos (Fig. 6a). De forma interesante, estos teratomas no fueron solo mayores, sino que también el nivel de diferenciación de las tres capas germinales en ellos fue notorio y contuvieron tejidos que no se encuentran típicamente en los teratomas inducidos por iPSC de control, como médula ósea, cartílago o páncreas, células positivas a la insulina (indicativas de células beta pancreáticas) además de trofoblastos (indicativas de tejido extraembrionario, placenta) como se confirma por la expresión de PL-1 (Fig. 6b,c y Fig. 7a,d).

Los estudios transcriptómicos en estos teratomas sugirieron sobrerregulación de los genes implicados en el desarrollo embrionario y morfogénesis de órganos cuando se derivan de iPSC tKI (Fig. 7b). Los estudios de inmunohistoquímica mostraron una elevada expresión de múltiples marcadores de diferenciación que representaban el ectodermo, mesodermo y endodermo en teratomas tKI (Fig. 6d y Fig. 7c). De forma interesante, también expresaron niveles elevados de marcadores de pluripotencia como Nanog, Oct4 o Sox2in vivo(Fig. 6d), sugiriendo que estas estructuras contenían una mezcla compleja de células no diferenciadas y diferenciadas.

Se ha informado recientemente que las iPSC generadasin vivoa partir de un transgén OSKM son capaces de formar pequeñas estructuras similares a embriones, que contienen tejidos derivados de las tres capas germinales, cuando se inoculan intraperitonealmente (Abad et al., 2013). En ensayos anteriores llevados a cabo por el grupo de los presentes inventores, las iPSC tipo salvaje generadasin vivofueron capaces de formar estructuras similares a embriones en el 11 % de los ratones inyectados, una eficacia similar a la presentada anteriormente (Abad et al., 2013). Sin embargo, las iPSC tKI generadasin vitrofueron mucho más eficaces con el 83 % de ratones inyectados mostrando estructuras similares a embriones, incluso estructuras complejas similares a embriones nunca encontradas después de las inyecciones en iPSC WT, caracterizadas por la expresión de diversos marcadores de desarrollo embrionario, las tres capas germinales y tejidos extra-embrionarios (véase la Fig. 8a, donde puede verse que las estructuras similares al embrión tKI fueron positivas para marcadores específicos de las tres capas embrionarias, como en el caso de las iPSC formadasin vivo). La tabla 4 posterior muestra la frecuencia de ratones desnudos con estructuras similares a embriones (E-Ls) en su cavidad abdominal 20-30 días después de la inyección intraperitoneal (i.p.) de 400000-500000 iPSC WT o iKI o iPSC WT generadasin vivo(iv). El número de clones independientes probados por condición se indican en el panel (cada animal se inoculó con un clon diferente).

Tabla 4. Estructuras similares a embriones (E-Ls) en la cavidad abdominal después de la inyección i.p. de iPSC

Después se probó si miR-203 podría también influir en el potencial de las células pluripotentes en la formación de quimeras. La tabla 5 muestra la frecuencia de la contribución quimérica mostrada por las iPSC KI y las ESC, tratadas temporalmentein vitrocon vehículo (KI) o Dox (tKI) como se indica (2 clones independientes se analizaron por condición) y resume los resultados obtenidos. A partir de dicha tabla 5, se puede ver que las células ES tKI mostraron un 27,5 % de éxito en la formación de quimeras con 100 % de quimerismo (como se determina por el color de recubrimiento) frente al 11,8 % en células ES KI no inducidas de control. Además, las iPSC tKI mostraron un 5,8 % de éxito en la generación del 100 % de quimeras, mientras que las iPSC no inducidas de control mostraron 1,5 % de éxito en estos ensayos. Todas las quimeras generadas en estos experimentos contribuyeron a la transmisión de la línea germinal.

Tabla 5 - Frecuencia de la contribución quimérica mostrada por iPSC y ESC KI

Finalmente, el rendimiento de las iPSC tKI se probó en el ensayo de complementación tetraploide con iPSC WT o tKI o ESC WT (n=3 clones por condición). La complementación de embriones tetraploides representa la prueba más estricta para la pluripotencia y potencia del desarrollo. Las iPSC son muy ineficaces en este ensayo en que cualquier animal nacido vivo viable se desarrolla únicamente a expensas de las células iPS (o ES) diploides inyectadas en un blastocisto tetraploide. Como puede verse en la tabla 6, no se obtuvieron crías viables en las iPSC de control, mientras que las iPSC tKI fueron capaces de formar quimeras completas (una de ellas se muestra en la Fig. 8b) con una tasa de éxito de 2,8 %, más cercano al 11,9 % logrado con las ESC de control.

Tabla 6 - resultados de los ensayos de complementación tetraploide de embriones

Ejemplo 3. Los efectos de miR-203 en la pluripotencia son dependientes de Dnmt3a/b

Para identificar las posibles dianas de miR-203 implicadas en el control de la pluripotencia, los inventores buscaron dianas miR-203 predichas entre los transcritos sobrerregulados en las iPSC sin miR-203 (más o igual que 2 veces de aumento respecto a las iPSC tipo salvaje) y subregulados en el modelo inducible tKI de miR-203 (más o igual que 2 veces de disminución respecto a la situación de tipo salvaje).

Se encontraron 678 transcritos sobrerregulados en iPSC sin miR-203 y subregulados en iPSC tKI miR-203, y 35 de esos se predijeron como dianas de miR-203 (Fig. 9a), como puede verse en la tabla 7a posterior (las predicciones computacionales se basaron en las bases de datos miRanda, TargetScan y MicroTar).

Cuando la búsqueda se restringió a identificar dianas de miR-203 predichas entre los transcritos subregulados en las iPSC tKI (Fig. 9f). La selección de esa lista de esos genes implicó una regulación epigenética de expresión (GO0040029) que dio por resultado 18 transcritos GO0040029 subregulados en las ípSc tKI que eran dianas predichas de miR-203 según los mismos algoritmos de predicción de diana de microARN usados para la tabla 7a. La lista de dichos 18 transcritos se muestra en la tabla 7b posterior.

Tabla 7a - Lista de dianas predichas de miR-203 enMus musculusentre los transcritos subregulados en iPSC tKI miR-203 y sobrerregulados en iPSC sin miR-203

Tabla 7b - Lista de dianas predichas de miR-203 enMus musculusentre los transcritos subregulados en tKI miR-203 e implicados en la regulación epigenética de la expresión génica (GO0040029)

Entre los transcritos desregulados en estos dos análisis, los inventores decidieron enfocarse en las ADN metiltransferasasde novoDnmt3a (ADN metiltransferasa 3 alfa, número_EC 2.1.1.37; Gen humano HGNC: 2978, Ensembl: ENSG00000119772, NCBI gene: 1788, número de acceso de NCBI: NM_022552 versión NM_022552.4 7 de octubre de 2016); gen deMus musculusMGI: 1261827, Ensembl: ENSMUSG00000020661; NCBI Gene: 13435, número de acceso NCBI: NM_001271753 versión NM_001271753.1 15 de febrero de 2015) y Dnmt3b (ADN metiltransferasa 3 beta número_EC 2.1.1.37; Gen humano HGNC: 2979, Ensembl: ENSG00000088305 versión ENSG00000088305.18; NCBI gene: 1789, número de acceso NCBI: NM_006892 versión NM_006892.3 3 de noviembre de 2016; gen deMus musculusMGI: 1261819, Ensembl ENSMUSG00000027478 versión ENSMUSG00000027478.15, NCBI gene 13436, número de acceso NCBI: NM_001003961 versión NM_001003961 15 de febrero de 2015) (datos basados en las siguientes bases de datos: comité de nomenclatura génica HUGO (http://www.genenames.org/); MGI Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.iax.org/) descargada el 13 de marzo de 2017; Ensembl (www.ensembl.org) edición 87, diciembre de 2016). La decisión se basó en la relevancia de las modificaciones de la cromatina en la pluripotencia, y el efecto a largo plazo que resulta de la expresión temporal de miR-203 sugestivo de una alteración epigenética. Además, estos dos transcritos están también significativamente subregulados después de la expresión de los miméticos de miR-203 en las iPSC tipo salvaje (log2 cambio de veces = -0,24 para el transcrito Dnmt3a y -0,22 para el transcrito Dnmt3b). Se ha mostrado anteriormente que los transcritos miR-203 y DNMT3a/b humanos presentan perfiles de expresión inversa en células cancerígenas Sandhu et al., 2012; Gasque Schoof et al., 2015) y se mostró recientemente que DNMT3b era una diana de miR-203 directa en las células de cáncer de colon humano (To et al., 2016).

Los transcritos tanto Dnmt3a como Dnmt3b contienen sitios de miR-203 conservados en sus 3'-UTR (Fig. 10a) (Dnmt3a: SEQ ID NO:49; Dnmt3b: SEQ ID NO:51) y la expresión exógena de miR-203 lleva a la señal disminuida de un constructo de luciferasa fusionado a estas secuencias, pero no a secuencias 3'-UTR de los genes relacionados Dnmt3l o Dnmt1 (Fig. 9b,c). Esta regulación se eliminó (Fig. 9c) cuando los sitios de unión a miR-203 putativos se mutaron y el constructo de luciferasa se fusionó a las secuencias mutadas 3'-UTR de Dnmt3a (SEQ ID NO:50) o Dnmt3b (SEQ ID NO:52) (Fig. 10b) indicando un control directo de estos transcritos por miR-203. De manera notable, la sobreexpresión de los ADNc de Dnmt3a y Dnmt3b resistentes a miR-203, de forma simultánea al tratamiento temporal con doxiciclina, evitó el sobrecrecimiento de los correspondientes cuerpos embrioides (Fig. 9d), además del aumento en las células parecidas a 2C inducidas por la expresión retroviral de miR-203 en las ESC tipo salvaje (Fig. 9e).

Para probar en que grado podría la subregulación de Dnmt3a/b mimetizar el efecto de miR-203, los inventores atenuaron estas ADN metiltransferasasde novopor medios de interferencia de ARN (Dnmt3a/bip). La secuenciación del ARN de estas muestras reveló que las iPSC de Dnmt3a/bip mostraban un perfil transcriptómico más cercano a las iPSC tKI (Fig. 9g). Además, la subregulación de Dnmt3a/b indujo el crecimiento, formación de cavidades largas y aumentó el latido de los EB en un grado similar al observado en los EB derivados de las iPSC tKI (Fig. 9h), mientras que la atenuación individual de estos transcritos presentó efectos parciales (cuantificado en la Fig. 9h).

La atenuación de Dnmt3a/b también aumentó la población parecida a 2C en las ESC tipo salvaje como se evaluó por la expresión del elemento MERVL (Fig. 9i,j,k), aunque en menor grado que miR-203. Si estas diferencias son debidas a eficacias variables en el control de la expresión génica de dianas adicionales de miR-203 no está claro en la actualidad. Además, la expresión de ADNc de Dnmt3a/b resistente a miR-203 evitó significativamente la expresión del marcador relacionado con 2C (Fig. 9i,j), sugiriendo así que las metiltransferasasde novode Dnmt3a/b son dianas críticas de miR-203 en la inducción de la pluripotencia no preparada.

Como Dnmt3a/b son metiltransferasasde novoimplicadas en la metilación del ADN, los inventores después analizaron el perfil de metilación en todo el genoma de las iPSC tipo salvaje y tKI (antes y después de la inducción con doxiciclina) además de los cuerpos embrioides derivados de ellas (Fig. 11a). Las iPSC tipo salvaje y tKI presentaron niveles similares de metilación antes de Dox y las células de tipo salvaje no estuvieron afectadas por este tratamiento. En contraste, la inducción temporal de miR-203 durante 5 días dio por resultado una hipometilación en todo el genoma en las iPSC tKI, que sorprendentemente se redujo incluso más 20 días después de la retirada de Dox (t=25; Fig. 11 b e), un punto temporal en que los niveles del transcrito Dnmt3a/b se habían recuperado ya después de su represión en presencia de Dox (Fig. 12a). De forma notable, el número de valles de metilación de ADN (DMV; (Xie et al., 2013)) y los dominios parcialmente metilados (PMD; (Lister et al., 2009)) eran cada vez mayores en las iPSC tKI con el tiempo (Fig. 11b y fig. 12b); por ejemplo, se encontraron 131 PMD en t=0 mientras que se encontraron 548 y 6.555 PMD en t=10 y t=25, respectivamente. La comparación de la metilación de ADN entre grupos mostró que 128 regiones metiladas diferencialmente (DMR) de 131 DMR totales (97,7 %; t=10 frente a t=0) y 12.542 de 12.549 (99,9 %; t=25 frente a t=0) DMR estaban hipometiladas en las iPSC tKI como consecuencia de la exposición previa a miR-203 (Fig. 11e y Fig. 12b). El análisis transcripcional de estas muestras sugirió que los genes desregulados con DMR afectadas estaban enriquecidos significativamente en reguladores de cromatina, o los genes implicados en la replicación de ADN y la división celular o morfogénesis embrionaria entre otras rutas (Fig. 13a).

Como validación de estas observaciones, la modificación con bisulfito seguido por secuenciación confirmó la hipometilación dependiente de miR-203 del locus que codifica el factor de transcripción 5 de ETS similar a E74 (Elf5), una proteína implicada en la diferenciación de las células epiteliales y renovación y diferenciación de las células madre del trofoblasto (Fig. 13b,c). De manera interesante, los cuerpos embrioides derivados de las iPSC tKI presentaron mayor metilación de ADN en todo el genoma (Fig. 11b,c) de acuerdo con la sobrerregulación de los transcritos Dnmt3a y Dnmt3b (Fig. 12a). Como también se observó a escala de todo el genoma, la DMR de Elf5 estaba hipermetilada en los cuerpos embrioides generados a partir de iPSC tKI cuando se compara con las estructuras derivadas del tipo salvaje (Fig. 13b,c).

Los datos anteriores sugieren que la interferencia con la expresión o actividad de la ADN metiltransferasa da por resultado la hipometilación general en el genoma (Blattler et al., 2014; Liao et al., 2015; Mikkelsen et al., 2008). Para analizar adicionalmente si los cambios en la metilación en las iPSC tKI estaban relacionados con la represión mediada por miR-203 de Dnmt3a/b, los autores estudiaron los cambios en la metilación de DMR después de la sobreexpresión de la forma resistente a miR-203 de estas ADN metiltransferasas en las iPSC tKI. Como se representa en la Fig. 11f, la expresión de Dnmt3a/b exógeno rescató la hipometilación observada después de la inducción de miR-203 tanto en las DMR de Elf5 como en una DMR situada cerca del gen de histona desacetilasa Sirt6, sugiriendo que estas ADN metiltransferasasde novoson objetivos críticos de miR-203 en la inducción de la hipometilación en todo el genoma.

Ejemplo 4. La expresión temporal de miR-203 mejora la diferenciación y la maduración en los cardiomiocitos

Como la expresión temporal de miR-203 mejora la función de las células pluripotentes en varios ensayos (Figs. 2-8), se decidió probar directamente el efecto de la expresión de este miARN durante la diferenciación de cardiomiocitos. El efecto de miR-203 se probó primero en cardiomiocitos primarios aislados de ratas neonatales (P1) que experimentan más expansión y diferenciación cuando se cultivanin vitro.Los miméticos de miR-203 desencadenaron una explosión temporal de proliferación celular como se midió por la incorporación del análogo de nucleótido EdU (Fig. 14a) y marcadores mitóticos como ciclina B1 (Fig. 14b). De manera importante, este aumento en la proliferación se dio en células positivas a troponina T (cTnT) cardiaca (Fig. 15a) y dio por resultado células con una relación aumentada de los genes de cadena pesada de miosina Myh6 frente a Myh7 (Fig. 14b), un interruptor regulado mediante el desarrollo que correlaciona con la maduración de los cardiomiocitos y el funcionamiento cardiaco (Miyata et al., 2000).

Los inventores también probaron un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos de las iPSC tipo salvaje (Kattman et al., 2011). Las iPSC de ratón se transfectaron temporalmente con miméticos de miR-203 o de control y 15 días después se diferenciaron en cardiomiocitos usando medios y condiciones de cultivo específicos (véase Métodos). Esta diferenciación fue acompañada por la expresión aumentada de transcritos de diferenciación de cardiomiocitos como la cadena pesada de miosina (Myh), péptido natriurético atrial (Nppa), troponina T cardiaca (codificada por el gen Tnnt2), marcadores para los progenitores cardiacos como el factor de transcripción potenciador del gen de la insulina Isl1 y Tbx5 en las iPSC tratadas previamente con miméticos de miR-203 (Fig. 15b). De manera importante, la exposición temporal a miR-203 dio por resultado una mayor expresión no solo de los marcadores de diferenciación sino también de los de maduración como los componentes de canal de potasio codificados por los genes Kcnh2, Hcn1 y Kcna4 (Otsuji et al., 2010), que solo fueron mínimamente inducidos en células tratadas con ARN miméticos de control (Fig. 15c). En línea con estos datos, la frecuencia de latido en los cardiomiocitos derivados de iPSC tratadas con miR-203 fue significativamente mayor sugiriendo una funcionalidad aumentada (Fig. 15d). La expresión de formas resistentes a miR-203 de Dnmt3a y Dnmt3b en paralelo a miR-203 (Fig. 14c) previno la sobrerregulación de estos marcadores de diferenciación y maduración (Fig. 14d,e), sugiriendo la importancia del eje miR-203-Dnmt3a/b en la diferenciación y maduración funcional de los cardiomiocitos procedentes de células pluripotentes.

El hecho de que miR-203 dé iPSC más no preparadas y aumente su potencia y plasticidad para diferenciarse, inspiró a los inventores para probar el efecto de miR-203 en la regeneración cardiaca después de una lesión. La criolesión cardiaca de ratón neonatal permite probar las intervenciones moleculares para estimular la regeneración, en un modelo con características similares a las observadas en la enfermedad cardiaca pediátrica (Polizzotti et al., 2016). Se indujo la muerte celular del músculo cardiaco mediante criolesión en ratones ColA1(miR-203/miR-203); Rosa26(rtTA/rtTA) el día 1 después del nacimiento (Fig. 16a), y los neonatos se trataron con vehículo (control) o Dox (para inducir la expresión de miR-203) durante siete días. Después de 1 semana de recuperación, las crías de control presentaron áreas fibróticas significativamente mayores en el corazón, mientras que la curación de la herida se mejoró significativamente en los neonatos tratados con Dox (Fig. 16b,c). La identificación de progenitores cardiacos positivos en CD34 concomitante con la tinción con rojo sirio reveló una acumulación de progenitores no diferenciados en la cicatriz de los corazones de control. El tratamiento con doxiciclina, sin embargo, llevó a una reducción significativa de fibrosis acompañada por la presencia reducida de estos progenitores en el área lesionada y una mejor recuperación del tejido normal (Fig. 16d). De interés, el porcentaje de crías vivas en las camadas operadas fue mayor en el grupo tratado con Dox en comparación con los controles (Fig. 16e), sugiriendo el efecto terapéutico de inducir a miR-203 durante la regeneración cardiaca y la posible relevancia de este microARN en la medicina regenerativa.

Ejemplo 5. miR-203 induce un estado naive basein vitro

Para ser capaces de comparar apropiadamente las propiedades de las células pluripotentes obtenidas después de la exposición temporal a niveles aumentados de miR-203 con los de células naturales en un estado base, se realizó el análisis de PCR cuantitativa en embriones de ratón aislados en diferentes etapas. Los resultados (Fig. 17) muestran que la expresión de miR-203 fue baja en los ovocitos, estaba significativamente inducida en la etapa de 2 células y presentó una reducción gradual en mórulas y blastocistos.

La expresión de miR-203 en la etapa de 2 células inspiró a los inventores para analizar la expresión de marcadores 2C en las PSC de ratón tKI cultivadas. La expresión temporal de miR-203-GFP en células ES tipo salvaje aumentó significativamente el número de células similares a 2C como se determina por la expresión del retrovirus endógeno murino con cebador de ARNt de leucina (MuERV-L; reportero 2C::tdTomato) (Macfarlan et al., 2012) (Fig. 18a). En línea con estas observaciones, la exposición a miR-203 indujo la expresión de genes que albergan un elemento MERVL más arriba proximal o intrónico (Fig. 18b). Además, la exposición a miR-203 indujo la expresión de un número significativo de genes característicos de blastómeros 2C totipotentes (Biase et al., 2014) (Fig. 18c,d). Dramáticamente, casi todos los transcritos incluidos en la firma de 282 genes de células 2C se indujo por miR-203 diez días después de la retirada de Dox, y su expresión se redujo gradualmente con el tiempo (Fig. 18c). De interés, la exposición temporal a miméticos de miR-203 volvió también a las células pluripotentes humanas a un estado naive base (Fig. 18e,f), como se midió por la expresión de la familia HERVH de retrovirus endógenos humanos (HERV) implicados en el mantenimiento de la pluripotencia no preparada humana (Wang et al., 2016). Los miméticos de miR-203 indujeron la expresión del reportero HERVH-GFP en un número significativo de colonias, en muchos casos no solo en la periferia sino en casi la totalidad de las células de la colonia. Cuando el potencial de diferenciación de estos cultivos se probó, las iPSC tKI humanas generaron EB significativamente mayores con cavidades internas mayores que los equivalentes de control (Fig. 18g,h). Después, los resultados indican que las observaciones en células pluripotentes de ratón podrían extenderse a células pluripotentes humanas.

Ejemplo 6. miR-203 induce la pluripotencia no preparada en células cultivadas en medio 2i/LIF

Como la combinación del inhibidor MEK PD0325901 y el inhibidor GSK3 CHIR99021 con LIF (condiciones de 2i/L) se ha mostrado anteriormente que vuelve a las iPSC más próximas a ESC (Ying et al., 2008), de manera que puede considerarse el patrón anterior para el mantenimiento del potencial de pluripotencialidad, también se decidió probar el efecto de miR-203 en condiciones de 2i/L.

Se observó que las iPSC tKI cultivadas en 2i/L también presentaron un enriquecimiento en la transcripción de factores de pluripotencialidad y rutas de desarrollo cuando se compara con las iPSC de tipo salvaje cultivadas en las mismas condiciones (Fig. 19a). Además, el pretratamiento con Dox durante 5 días, 2 semanas antes de los ensayos de EB, de las iPSC tKI cultivadas en condiciones de 2i/L promovió un aumento significativo en el tamaño de EB, la formación de grandes cavidades internas además de latido (Fig. 19b,c), sugiriendo un efecto adicional de miR-203 sobre las condiciones de 2i/L.

Ejemplo 7. miR-203 tiene poco efecto en las regiones ICR en comparación con las condiciones de 2i/L

Dados los recientes descubrimientos que muestran que una pérdida amplia de la metilación en los cultivos de PSC podría ser dañina cuando se acompaña del borrado masivo de improntas genómicas (Choi et al., 2017; Yagi et al., 2017), los inventores decidieron probar los niveles de metilación en 103 regiones de control de improntación (ICR) diferentes en las iPSC tKI.

Mientras las iPSC tKI presentaron una desmetilación progresiva de los genes (señal más oscura, rojo en el original, a t=10 y t=25 en la Fig. 20; panel izquierdo), la desmetilación de las ICR estuvo muy limitado a t=10 y moderado a t=25 en las mismas muestras (panel derecho). De manera importante, la desmetilación se recuperó completamente en todos los casos tras la diferenciación (EB derivados de iPSC tKI; Fig. 20), sugiriendo que la desmetilación de las iPSC tKI, tanto en DMR como en ICR, es manejable y reversible, y no compromete ni a la calidad de las iPSC ni a su competencia para diferenciarse.

Por consiguiente, puede verse que miR-203 tiene poco efecto en las regiones ICR en comparación con las condiciones de 2i/L, lo que explica por consiguiente la mejora significativa de las células tratadas con miR-203 en múltiples ensayosin vivo.

Conclusión

En conclusión, se ha descrito y demostrado en la presente memoria, usando una variedad de modelos celulares ein vivo,que controlar la expresión temporal de miR-203 en células madre pluripotentes inducidas (iPS) o células madre embrionarias (ES) mejora la capacidad de estas células para diferenciarse en múltiples líneas celulares y alcanzar propiedades de maduración adicionales sin interferir con sus propiedades de autorenovación. Este efecto está mediado a través del control dependiente de miR-203 de ADN metiltransferasasde novoDnmt3a y Dnmt3b, que a su vez regulan el escenario de metilación de las células pluripotentes.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar la pluripotencialidad de las células pluripotentes que comprende una etapa donde las células se exponen a la expresión o adición temporal de microARN-203 o un análogo del mismo durante 3-5 días, y se mantienen en cultivo en un medio de células pluripotentes durante 15 a 30 días, en donde el análogo de microARN-203 es un mimético de ARN caracterizado por:

a. ser una molécula modificada de ARN en donde al menos uno de los nucleótidos se sustituye por un nucleótido modificado químicamente, en donde la modificación química se selecciona del grupo de:

1. sustitución de uno o más enlaces fosfato por enlaces fosforotioato,

ii. una o más modificaciones en la posición 2' del resto azúcar seleccionado de modificaciones 2'-O-metilo o 2'-O-metoxietilo; y/o

iii. una o más modificaciones en el resto ribosa seleccionadas del grupo de: aquellas que dan lugar a una unión que conecta el oxígeno en 2' con el carbono en 4', bloqueando así la ribosa en la conformación 3'-endo (LNA: ácidos nucleicos bloqueados) o ácidos nucleicos con puente de etileno 2'-O, 4'-C (ENA); la sustitución de la estructura de azúcar por una estructura que contiene amida como una estructura aminoetilglicina, como en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA); y el uso de PMO (ácidos nucleicos donde el resto ribosa se sustituye por un grupo morfolino) b. ser una molécula de doble cadena con una región dúplex de entre 16 y 31 nucleótidos de longitud y que contiene un fragmento que es al menos idéntico al 50 % en su secuencia a la secuencia de bases nitrogenadas de la molécula de ARN representada por SEQ ID NO:1, y

c. opcionalmente, que comprende adicionalmente en al menos un extremo de al menos una de las hebras un resto conjugado que comprende una o más unidades de colesterol, colestanol, estigmastrol, ácido colánico y ergosterol y, además opcional y adicionalmente, que comprende un resto conector que une el resto conjugado a la hebra, y d. también opcional y adicionalmente, que presenta uno o más desapareamientos entre las dos hebras.

2. El método según la reivindicación 1, en donde las células son células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o células madre embrionarias (ESC) en cultivo.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células se transducen con un vector de expresión, que expresa microARN-203.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el microARN-203 o el análogo del mismo se añade al medio de cultivo de las iPSC o ESC.

5. El método según la reivindicación 4, en donde al menos hsa-miR-203a-3p (SEQ ID NO:1), mmu-miR-203-5p o un análogo de los mismos se añade al medio de cultivo de las iPSC o ESC.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células pluripotentes son iPSC que se han obtenido poniendo en contacto células diferenciadas somáticas con un factor de reprogramación nuclear que comprende un producto génico de cada una de las siguientes familias: familia Oct, familia Klf, familia Myc y familia Sox.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células pluripotentes son iPSC y dichas células adquirieron un estado similar a naive después de haber sido expuestas a la expresión o adición temporal de microARN-203 o a un análogo del mismo.

8. Un método para obtener cardiomiocitos, que comprende las etapas del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y que comprende además:

a. transfectar iPSC con miR-203,

b. mantenerlas en cultivo en un medio para células pluripotentes durante 15 días antes de comenzar la diferenciación, c. sembrar las células en placas en una placa recubierta con una mezcla de proteínas que parece una matriz de membrana de base,

d. cultivar las células en RPMI con un suplemento B27 (RPMI/B27) y con un inhibidor GSK-3 durante dos días, e. lavar las células y añadir un medio RPMI/B27 sin inhibidor GSK-3,

f. suplementar el medio con un antagonista para la ruta de señalización “Wingless-Integrated” (WNT) en el día 3 de diferenciación y mantener dichas condiciones durante 2 días más,

g. cambiar el medio a RPMI/B27 más insulina en el día 7 de diferenciación,

h. cultivar las células en un medio RPMI/B27 desde el día 9 al 15, cambiando el medio cada 2 días,

i. cultivar las células en DMEM sin glucosa y con lactato desde el día 16 al día 18 de diferenciación,

j. cultivar las células en RPMI/B27 desde el día 18 al día 21 de diferenciación, cambiando el medio cada día, k. aislar las células en un agrupamiento celular desde el día 22 al día 28 y mantenerlas en baja unión durante otra semana.

9. Las células pluripotentes obtenidas por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. El uso de las células pluripotentes según la reivindicación 9 para obtener células diferenciadas y/o maduras.

11. El uso de las células pluripotentes según la reivindicación 9 para obtener células diferenciadas y/o maduras, en donde las células diferenciadas son cardiomiocitos, células neurales o gliales, condrocitos, hepatocitos o células epidérmicas.