ES2963482T3

ES2963482T3 - Usos de sustancias marcadoras

Info

Publication number: ES2963482T3
Application number: ES18190951T
Authority: ES
Inventors: Fritz Huber; Renate Kirchhöfer; Volker Pfahlert
Original assignee: Numares AG
Current assignee: Numares AG
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2011-10-05
Publication date: 2024-03-27
Anticipated expiration: 2031-10-05
Also published as: HUE064419T2; EP3438651B1; DE102010038014B4; EP2625511A1; US20200051669A1; EP3438651A2; DE102010038014A1; PL3438651T3; AU2011311596B2; CA2813863A1; WO2012045773A1; EP2625511B1; WO2012045773A9; AU2011311596A1; US20130289887A1; EP3438651A3; US10497465B2

Abstract

La invención se refiere a nuevos usos de una pluralidad de sustancias, concretamente para el uso de estas sustancias como marcador en un método para determinar el riesgo de rechazo renal en un individuo en el que se ha realizado un trasplante de riñón o para su uso como marcador en un método. para controlar la progresión de una terapia contra un tumor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Usos de sustancias marcadoras

La presente invención se refiere al uso de una sustancia.

De la técnica anterior, Se conocen diferentes métodos para analizar datos de medición, por ejemplo, datos obtenidos espectroscópicamente. En los métodos conocidos, en general, se analizan las señales individuales de una sustancia mediante el método de medición correspondiente. También es conocido agrupar diferentes señales individuales en categorías predeterminadas para lograr un tratamiento sencillo de los datos o una reducción de datos. En el caso de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (espectroscopia de RMN) como método de medición, las señales individuales de RMN se asignan periódicamente a las sustancias respectivas que provocan las señales antes de realizar un análisis adicional. También se conocen métodos estadísticos de RMN en los que no se realiza ninguna asignación previa de señales.

Para llegar a conclusiones más fiables, en el estado de la técnica es habitual utilizar una o varias señales de medición para un análisis posterior. Si, por ejemplo, se examina el líquido corporal de un individuo, esto tiene el inconveniente de que también se detectan variaciones en la composición del líquido corporal debidas, por ejemplo, al estado nutricional del individuo. Sin un conocimiento exacto del estado nutricional, se produce una corrupción de los resultados de medición, ya que también se detectan sustancias individuales con una concentración alta, aunque esto solo refleja un pico de concentración temporal que no es representativo del estado general del individuo.

Adicionalmente, en los métodos de análisis conocidos por el estado de la técnica resulta problemático que se trabaje con un número limitado de valores discretos, a partir de los cuales se llega a una conclusión sobre el estado del individuo examinado en cada caso. El artículo de Wishart D. S., "Metabolomics:The Principles and Potential Applications to Transplantation", American Journal of Transplantation 2005, 5, 2814-2820, describe el uso de biomarcadores en el trasplante renal y ofrece un compendio de mediciones metabolómicas y de metabolitos estadísticamente significativas relevantes para el trasplante de órganos o la disfunción de órganos. El artículo de Gillespie A.et al.,"Biomarkers in renal transplantation", Biomarkers Med. 2008, 2(6), 603-612, identifica biomarcadores en el trasplante renal, especialmente de cara al diagnóstico del rechazo.

Un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos usos de sustancias ya conocidas como marcadores en un método para determinar el riesgo de rechazo renal en un individuo al que se le ha realizado un trasplante de riñón.

Este objeto se consigue mediante los usos indicados en las reivindicaciones.

Por tanto, la invención se refiere al uso de determinadas sustancias como marcador para determinar el riesgo de rechazo renal en un individuo al que se le ha realizado un trasplante de riñón. Por consiguiente, las sustancias utilizadas como marcador, ya sea individualmente o en cualquier combinación arbitraria, son metilmalonato, lactato, succinato de metilo, p-cresol, 3-hidroxi-isovalerato, citrato, metilguanidina, malonato, taurina, fenilacetilglicina (ácido 2-(N-fenilacetil)amino acético), trigonelina, a-glucosa, acetil-carnitina, acetato de fenilo e hipurato.

También se aborda, pero no entra dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas, el uso de otras sustancias determinadas para controlar el curso de un tratamiento contra un tumor. Las sustancias que se utilizarán como tales marcadores, ya sea individualmente o en cualquier combinación arbitraria, son citrato, creatinina, malonato, metilmalonato, metilguanidina, succinato de dimetilo, hidroxi-isovalerato, tartrato, salicilato, hipoxantina, hidroxibutirato, alotreonina, 1-metil-urato, trimetilamina-n-óxido, glicolato, 5-hidroximetiluracilo, ácido 3-hexeno-diona, xantina, formiato, ácido graso (derivado), histamina, dimetilaminopurina y benzoato.

En este contexto, las sustancias exógenas (es decir, sustancias aplicadas externamente a un individuo examinado, por ejemplo, debido a un medicamento) como benzoato, salicilato y tartrato también son adecuadas como marcadores, ya que pueden metabolizarse en el cuerpo de un individuo de forma diferente o no metabolizarse en absoluto dependiendo del desarrollo de la enfermedad o del tratamiento, respectivamente.

En una realización de los usos divulgados, se prefiere el uso de al menos dos sustancias. Por consiguiente, preferentemente se utilizan sustancias interrelacionadas (como se puede ver en las tablas y figuras explicadas a continuación) conectadas entre sí.

De acuerdo con esta realización, como marcador para determinar el riesgo de rechazo renal se utiliza al menos uno de los siguientes pares de sustancias: lactato y taurina; lactato y acetato de fenilo; lactato y fenilacetilglicina; succinato de metilo y acetato de fenilo; succinato de metilo y fenilacetilglicina; 3-hidroxi-isovalerato y acetato de fenilo; 3-hidroxiisovalerato y fenilacetilglicina; trigonelina y malonato; taurina y malonato; taurina y citrato; acetato de fenilo y malonato; fenilacetilglicina y malonato; acetato de fenilo y p-cresol; fenilacetilglicina y p-cresol; malonato y p-cresol; malonato y metilmalonato; citrato y metilguanidina; p-cresol y metilmalonato; metilmalonato y metilguanidina.

En una realización, se utiliza como marcador al menos uno de los siguientes pares de sustancias: malonato y benzoato; malonato y ácido graso; succinato de dietilo y benzoato; succinato de dimetilo y 3-hidroxi-isovalerato; benzoato y ácido de 3-hexendiona; 3-hidroxi-isovalerato y salicilato; benzoato y 3-hidroxi-isovalerato; citrato e histamina; citrato y ácido graso; tartrato e histamina para controlar el curso de un tratamiento contra un tumor.

El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma de próstata, cáncer de colon, cáncer de riñón.

También se divulga, pero queda fuera del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones, un método que tiene las siguientes etapas:

- proporcionar al menos un resultado de análisis que tenga una pluralidad de valores, en donde el resultado del análisis se generó mediante el análisis de una muestra mediante al menos un método de análisis,

- determinar el valor de al menos una relación matemática entre al menos dos valores de la pluralidad de valores, - generar un distintivo caracterizador de la muestra basándose en el valor de al menos una relación matemática.

Dicho de otro modo, se genera el denominado distintivo, pudiendo el distintivo caracterizar la muestra basándose en un resultado de medición obtenido previamente, en donde no se tienen en cuenta valores o señales individuales del resultado de la medición, pero siempre sobre el valor de una relación matemática entre al menos dos señales o valores de un resultado de análisis correspondiente. Por consiguiente, estas señales o valores son aquellas señales que son causadas por una o varias sustancias que están originalmente asignadas a la muestra analizada (por tanto, originalmente contenidas en la muestra) y no se agregan a la muestra tal vez con fines de normalización antes de realizarse el análisis.

Durante la ejecución de este método, no es necesario asignar primero las sustancias, mediante las que se originan los valores o las señales, a determinados valores o señales del resultado del análisis. Por tanto, No es necesario asignar una sustancia como quizás el lactato que produce una señal A a esta señal A. Más bien, es posible y está previsto realizar el método sin dicha asignación previa. Luego, la señal A se establece en una relación matemática con la señal B (cuya sustancia que la produce tampoco es necesario conocer), y el valor X de esta relación matemática se sigue procesando, aunque aún no esté claro qué sustancias han producido las señales A y B. De esta manera, es posible aprovechar una gran cantidad de información que se mide instantáneamente al mismo tiempo y también está disponible para su evaluación. Por tanto, el método de acuerdo con la invención permite una evaluación muy precisa del resultado del análisis, incluso sin correlación entre la sustancia y la señal correspondiente en el resultado del análisis. El resultado del análisis puede ser, por ejemplo, un espectro, un cromatograma o un resultado comparable.

Al recurrir a señales provocadas por sustancias desconocidas o al menos no definidas, también se consideran en el método los metabolitos o sustancias que no se han descrito en relación con una cuestión específica de caracterización. Por consiguiente, el valor informativo del distintivo obtenido y al final de toda la caracterización aumenta significativamente, porque si nos limitamos a sustancias conocidas o a señales asignadas a sustancias conocidas para la caracterización, posiblemente se ignoraría que una sustancia es igualmente buena o incluso más adecuada para caracterizarse. Por tanto, el método permite una caracterización fiable basándose en un recurso de datos ilimitado y, por tanto, imparcial, independiente del estado real de los conocimientos y la investigación.

En un ejemplo, la pluralidad de valores, a partir de la cual se seleccionan los valores para determinar el valor de la relación matemática, se originan exactamente a partir de un resultado de análisis (es decir, siempre, por ejemplo, 2 valores de un único resultado de análisis se relacionan entre sí). Es posible combinar valores de la relación matemática que se originan a partir de diferentes conjuntos de valores (es decir, de diferentes resultados de análisis) para generar un distintivo único.

En un ejemplo, el distintivo no se basa únicamente en líneas individuales o bandas de un espectro, sino en sustancias que producen esas líneas o bandas. Para concretar más, por "que se basa en sustancias" se entiende un parámetro que es proporcional a la concentración de la sustancia respectiva. Por ejemplo, un conjunto de líneas y sus correspondientes integrales podrían ser un parámetro en el que se podría basar un distintivo.

En una variante del método, se realiza una edición matemática del resultado del análisis para poder describirlo con una suma de funciones individuales. De esta manera, se genera una cartera continua de valores para que, a diferencia de la técnica anterior, no sea necesario recurrir a valores discretos del resultado del análisis. Al hacerlo, por ejemplo, se puede realizar una descomposición matemática iterativa del resultado del análisis obtenido en conjuntos de líneas que pueden reproducir el resultado del análisis original. Un método adecuado es la desconvolución espectral. Seguidamente, se puede generar entonces un conjunto superordinado de líneas a partir de todos los resultados del análisis para agruparlas en grupos y filtrar la información contenida en los diferentes resultados del análisis. Mediante una desconvolución de diferentes espectros, también es posible una reducción del ruido.

En una variante del método, la muestra que se analiza y caracteriza comprende un líquido corporal de un individuo, un medio de cultivo, semillas, un extracto vegetal o un alimento. En particular, la muestra representa una de las sustancias mencionadas anteriormente. Algunos ejemplos de líquidos corporales adecuados son sangre, orina, bilis, líquido intersticial, semen, linfa, saliva o líquido cefalorraquídeo. Algunos ejemplos de medio de cultivo son medios utilizados habitualmente para el cultivo de bacterias, medios que también pueden utilizarse en un fermentador. Algunos ejemplos de semillas son uno o varios granos de semillas, a partir de los cuales pueden originarse nuevas plantas. Algunos ejemplos de extractos vegetales son extractos, generados con un extractante adecuado, de partes de una planta viva o muerta, por ejemplo, extractos obtenidos de raíces, hojas, frutos, la corteza o una parte comparable de la planta. Además, como extractos de plantas en el sentido de la presente solicitud también deben entenderse los extractos obtenidos de semillas. Algunos ejemplos de alimentos son salchichas, productos cárnicos y lácteos, zumos de frutas o concentrados de zumos de frutas, vino, cerveza, otras bebidas alcohólicas y no alcohólicas, así como productos preparados.

En una variante del método, el método de análisis se selecciona del grupo que consiste en espectroscopia de RMN, espectrometría de masas, resonancia de espín electrónico, espectroscopia vibratoria, espectroscopia UV/VIS, espectroscopia de fluorescencia y espectroscopia de rayos X. Un ejemplo adecuado de espectroscopia vibratoria es la espectroscopia infrarroja, en la que, en particular, se utiliza radiación infrarroja del intervalo infrarrojo medio. Si se utiliza cualquiera de los métodos de análisis mencionados anteriormente en el método de caracterización, el resultado del análisis es un espectro. Sin embargo, cabe señalar que el uso de una sustancia de acuerdo con

la invención se basa en la espectroscopia de RMN, véase la reivindicación 1.

La espectroscopia de RMN es particularmente adecuada como método de análisis. Es posible trabajar en un intervalo de medición muy amplio mediante espectroscopia de RMN, es decir, en más de seis órdenes de magnitud (concentración de la sustancia en la muestra de análisis de aproximadamente 1 pmol/l a 1 mol/l). Asimismo, en una sola medición, se detectan en paralelo cientos de sustancias y concentraciones de sustancias. Por consiguiente, la exactitud es mejor que el 1 % en todo el intervalo de medición. Es especialmente favorable que también se detecten componentes inesperados de la muestra, de modo que no sea necesario saber antes del análisis qué sustancias se quieren detectar. En el caso de una muestra de orina humana, se pueden extraer más de 1500 señales únicas mediante un análisis espectroscópico de RMN, señales que en cada caso representan condiciones únicas, puras y cuantificables.

Para permitir una caracterización particularmente precisa de la muestra, la muestra se analiza en una variante del método mediante al menos dos métodos de análisis. Esto significa que la muestra se analiza inicialmente mediante un método de análisis, por ejemplo, mediante espectroscopia de RMN. Seguidamente, la muestra se analiza entonces mediante un método de análisis adicional, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Por consiguiente, la muestra analizada puede ser exactamente la misma muestra en cada caso o una alícuota diferente de la misma muestra en cada caso. Siempre que la muestra o su composición no se vean comprometidas por el primer método de análisis, es posible llegar mediante ambos cursos de acción al mismo resultado.

En otra variante del método, de hecho, la muestra se analiza mediante el mismo método de medición biofísica (es decir, se utiliza exactamente un método de análisis), pero los parámetros en este método de análisis son variados. Es decir, se produce una variación de las condiciones de medición o del curso de medición. Por tanto, una muestra (o una alícuota de una muestra) puede someterse, por ejemplo, a un primer análisis espectroscópico de RMN con un primer conjunto de parámetros de medición, para ser seguidamente sometida a un segundo análisis espectroscópico de RMN con un segundo conjunto de parámetros de medida. De esta manera, también es posible extraer con un único método de análisis diferentes contenidos de información de una misma muestra (o diferentes alícuotas de la misma muestra). Por ejemplo, de este modo se puede obtener información detallada sobre la distribución del tamaño de las lipoproteínas en el suero (el llamado perfil de lipoproteínas), en particular, mediante espectroscopia de RMN. Asimismo, también son posibles análisis de ácidos grasos insaturados y otros componentes lipídicos, así como de fosfolípidos. Por lo general, el método de análisis se puede ajustar mediante diferentes parámetros de medición para una detección más sensible de moléculas grandes o pequeñas en cada caso.

Para aprovechar al máximo la información contenida generalmente en una muestra, además, en otra variante del método, es posible proporcionar varias muestras y someter estas muestras a diferentes etapas de preparación. Es decir, se produce una variación de la preparación de la muestra. De esta manera, ciertos componentes de las muestras pueden enriquecerse de la manera deseada, dependiendo de la etapa de preparación o procesamiento, en las muestras parciales tratadas de forma diferente en cada caso. Seguidamente, mediante la elección adecuada de uno o varios métodos de análisis (opcionalmente variando los parámetros de medición) se puede conseguir un resultado de análisis adaptado a las necesidades respectivas.

Para aumentar aún más el valor informativo de la caracterización, en una variante del método, se determinan varios valores de la relación matemática entre dos valores del resultado del análisis. Es decir, en cada caso, dos valores de los resultados del análisis se relacionan matemáticamente entre sí. El resultado es un valor de esta relación matemática. Cuantos más pares de dos valores del resultado del análisis se utilicen, más valores de la relación matemática correspondiente se obtendrán. Mediante tal correlación aumentada de los valores del resultado del análisis, se puede obtener información adicional que de otro modo no se consideraría del resultado del análisis.

En otra variante del método, cada valor del resultado del análisis se correlaciona con cada otro valor del resultado del análisis para obtener de esta manera una pluralidad de valores de una relación matemática entre dos valores en cada caso. De esta manera, por ejemplo, se puede generar una matriz de 2x2, una matriz de 3x3, una matriz de 4x4, una matriz de 5x5, etc. a partir de los valores de la relación matemática. El tamaño de la matriz depende del número de valores considerados del resultado del análisis. Por consiguiente, por ejemplo, se puede dar un valor umbral que determine si una señal del resultado del análisis, que se va a detectar en números, también se considera valor. Por tanto, un valor umbral de este tipo puede controlar en cuántos valores a considerar conste el resultado del análisis.

La ventaja de este procedimiento dimensionado para una correlación de valores lo más completa posible es que se extrae la máxima información posible del resultado del análisis. Sin embargo, esto está relacionado con un mayor esfuerzo de cálculo. Si el esfuerzo de cálculo debe mantenerse bajo, es aconsejable trabajar solo con un subconjunto de todos los valores posibles de la relación matemática entre los valores respectivos del resultado del análisis. Por tanto, en una variante del método, se selecciona un subconjunto de la pluralidad de valores de la relación matemática que luego se utiliza para generar el distintivo caracterizador.

En otra variante del método, la relación matemática es la relación de los valores respectivos entre sí. El valor de la relación matemática es en este caso el valor del cociente. Por consiguiente, se puede conseguir de una manera especialmente sencilla que las diferencias de concentración de sustancias individuales provocadas, por ejemplo, por un estado nutricional diferente u otras circunstancias físicas de los respectivos individuos, de quién proceden las muestras, se eliminan. En particular, este es el caso cuando diferentes estados nutricionales u otras circunstancias físicas tienen efectos iguales o al menos equiparables sobre las concentraciones de al menos dos sustancias (y con ello también sobre las señales que provocan en el resultado del análisis). Por tanto, mediante el acoplamiento de sustancias que se ven afectadas por una influencia externa o interna de la misma manera, aunque deban asignarse a vías metabólicas diferentes y deban comportarse, por tanto, de forma independiente entre sí, se eliminan los efectos estadísticos que, de lo contrario, se observarían. Asimismo, en el ámbito del diagnóstico se puede lograr una especificidad significativamente superior a la posible hasta ahora mediante esta generación de un cociente de una manera especialmente sencilla.

Posteriormente, puede generarse un distintivo caracterizador basándose en varios valores de tales proporciones (pero también basándose en varios valores de otras relaciones matemáticas), distintivo que seguidamente permite, por ejemplo, en comparación con al menos un único distintivo adicional ya existente, una clasificación del individuo, del que procede la muestra, en un grupo determinado, como por ejemplo "normal" o "patológico". Por tanto, mediante una comparación con colectivos que muestran una respuesta pronunciada a un determinado problema, se puede realizar una asignación de una muestra a uno de esos colectivos basándose en el distintivo caracterizador.

Dicho de otro modo, el distintivo caracterizador se basa en una relación matemática de valores de un resultado de análisis (como intensidades de señal de RMN o integrales). El distintivo caracterizador se puede representar como una matriz. Preferentemente, la mayoría de los valores de la matriz tienen el valor cero. Un distintivo caracterizador se diferencia de otro distintivo caracterizador, por un lado, por el patrón de valores que difieren de cero y, por otro lado, por el valor cuantitativo (numérico) específico de esos valores que difieren de cero. Existen diferentes posibilidades para generar el distintivo caracterizador. A continuación, se explica una posibilidad ilustrativa en relación con ejemplos de realización. Debe entenderse que las técnicas divulgadas para generar el distintivo caracterizador no se limitan a las realizaciones ilustrativas específicas, sino que pueden aplicarse en general a todos los problemas examinados.

Como ya se ha mencionado, no es necesario asignar las sustancias que producen los valores del resultado del análisis a aquellos valores del resultado del análisis que se utilizan para generar el distintivo caracterizador. Para expresarlo en otras palabras, es posible trabajar a ciegas. Es decir, es posible generar los distintivos caracterizadores sin saber qué sustancias son las generadoras de las señales observadas y finalmente encontrar una expresión en el distintivo caracterizador. Por tanto, la lógica subyacente a la generación de distintivos puede basarse en variables de medición no denominadas o no determinadas que se encuentran, sin embargo, sujetas al metabolismo del individuo examinado. Mediante la generación de distintivos sin asignación de sustancias, se pueden reconocer determinadas condiciones del individuo examinado incluso sin una divulgación completa de las relaciones sujetas a las vías metabólicas. Esto produce un amplio espectro de aplicación casi ilimitado del presente método. En una variante del método, se abstiene intencionalmente de asignar sustancias a señales o valores del resultado del análisis. Esto reduce enormemente el esfuerzo de todo el análisis y suprime los trabajos laboriosos que son necesarios para tal tarea. Aunque la correlación entre sustancias y las señales generadas por ellas en el resultado de un análisis puede resultar de interés desde un punto de vista científico o académico, tal correlación no es necesaria para el presente método. A pesar de ello, el método también se puede llevar a cabo si ya se ha realizado una asignación correspondiente de sustancias a las señales correspondientes.

También se divulga, pero queda fuera del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones, un método para caracterizar un sistema que tiene las siguientes etapas:

- proporcionar al menos una muestra tomada de un sistema,

- analizar la muestra mediante al menos un método de análisis para generar al menos un resultado de análisis,

- llevar a cabo un método de acuerdo con las explicaciones anteriores sobre la muestra extraída, para generar un distintivo caracterizador de la muestra,

- comparar el distintivo caracterizador de la muestra con al menos un distintivo comparativo que se generó como distintivo de una muestra comparativa,

- determinar una desviación entre el distintivo de la muestra y el al menos un distintivo comparativo y

- asignar el distintivo y la desviación determinada al sistema.

Esto implica que, al comparar el distintivo de la muestra con el distintivo comparativo de una muestra comparativa se puede caracterizar un sistema completo con este método, por ejemplo, clasificándolo en un grupo determinado. Las etapas del método para caracterizar una muestra explicadas anteriormente son, por tanto, componentes inherentes del método para caracterizar un sistema. Por consiguiente, en particular, también el distintivo de la muestra comparativa se determina con un método para caracterizar una muestra de acuerdo con las explicaciones anteriores.

Por "caracterización" se entiende, en particular, la determinación del estado de salud de un individuo, la determinación del riesgo de rechazo de un órgano después de un trasplante, la determinación de la función del órgano después de un trasplante de órgano o de un órgano dañado, la eficiencia de una instalación, un control de calidad, una prueba de pureza, una determinación de la idoneidad en el marco del desarrollo de un agente activo, una optimización con fines de cultivo, una clarificación de origen o garantía de la calidad. Los órganos adecuados para las posibilidades de caracterización mencionadas anteriormente son, por ejemplo, el hígado, riñón, bazo, pulmón y corazón, en particular, el riñón.

El estado de salud de un individuo puede ser, por ejemplo, el desarrollo de una enfermedad, en particular, si el individuo es sometido a un tratamiento. Por tanto, se puede controlar la eficacia del tratamiento. En una realización, la enfermedad es una enfermedad asociada a tumores como el carcinoma de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y cáncer de estómago.

En el marco del control de calidad, en particular, de un control de calidad de las materias primas, por ejemplo, es posible aclarar la cuestión de si determinados ingredientes vegetales están presentes en cantidad y calidad suficientes también después de un almacenamiento prolongado.

En el marco de las pruebas de pureza, por ejemplo, puede realizarse una diferenciación entre sustancias con potencial alergénico o examinar si tal diferenciación es posible.

En el marco del desarrollo de un agente activo, se puede examinar qué agentes vegetales podrían ser interesantes para los productos farmacéuticos y cómo pueden actuar sobre el metabolismo humano.

En el marco de una optimización con fines de cultivo, se puede examinar qué plantas o qué semillas se deben utilizar en el cultivo de una forma específica en relación con los ingredientes deseados.

En el marco de una clarificación de origen o de control de calidad, se puede, por ejemplo, determinar si las semillas han sido declaradas correctamente, si la variedad indicada está presente y si hay impurezas en la muestra examinada.

También se puede utilizar un distintivo caracterizador para una cuantificación total automática de un espectro, en la medida en que una cantidad conocida o predeterminada de un patrón esté presente en la muestra examinada. En el caso de la espectroscopia de RMN como método de análisis, una señal de altura definida es producida por la cantidad predeterminada del patrón (u otra sustancia), correspondiendo la señal a una determinada cantidad o número de protones. Cuando haya otra sustancia conocida presente en la muestra, también se podrá determinar su cantidad, ya que el número de protones de una molécula de esta sustancia se puede saber si se conoce la sustancia como tal y su estructura química. En consecuencia, las sustancias conocidas contenidas en la muestra se pueden cuantificar midiendo conjuntamente un patrón.

Para permitir la clasificación anteriormente mencionada de la muestra en un grupo determinado, en una variante, el método presenta una etapa adicional en la que se realiza la clasificación del sistema en una categoría predeterminada en función de la desviación entre el distintivo y el distintivo comparativo. Una clasificación de este tipo puede realizarse, por ejemplo, mediante una máquina de vectores de soporte, en donde preferentemente no se utiliza ningún algoritmo digital, sino un algoritmo analógico para poder detectar condiciones intermedias entre categorías individuales.

En otra variante del método, para clasificar el sistema, se utiliza al menos otro parámetro del sistema subyacente al distintivo comparativo. Este parámetro adicional también puede denominarse parámetro externo. Algunos ejemplos de parámetros adicionales de este tipo son, por ejemplo, las propiedades "saludable" o "patológico" o (en particular en el caso de una planta de biogás como sistema que se ha de analizar) "planta eficiente" o "instalación no eficiente". Al conocerse dicho parámetro adicional del sistema comparativo, para el que se generó el distintivo comparativo, es posible asignar el sistema realmente analizado basándose en su distintivo también a la categoría, clase o grupo del sistema comparativo o a otro grupo, clase o categoría. Por tanto, se puede estimar a partir de, por ejemplo, la desviación representada vectorialmente del distintivo con respecto al distintivo comparativo, con qué fuerza y en qué dirección se desvía el distintivo del distintivo comparativo para poder realizar luego una clasificación ajustada correspondiente.

En otra variante del método, el sistema caracterizador es un sistema biológico o un sistema industrial que representa un proceso biológico o una sustancia resultante de un sistema biológico. Algunos ejemplos de sistema biológico son un animal multicelular, en particular, un mamífero como un ser humano o un mamífero no humano, más células individuales o criaturas monocelulares como bacterias, más virus, hongos y plantas. Algunos ejemplos de sistemas industriales que representan un proceso biológico son una planta de tratamiento de aguas residuales, una planta de biogás, un proceso técnico de fermentación y una planta biotecnológica. Algunos ejemplos de sustancias resultantes de un sistema biológico son semillas, alimentos de origen natural como zumos de frutas, productos lácteos, así como productos cárnicos y embutidos o productos preparados.

Para lograr una caracterización particularmente ventajosa desde el punto de vista cualitativo de un sistema, diferentes muestras de un sistema son, en una variante del método, analizadas individualmente o combinadas entre sí. Por ejemplo, como muestras diferentes de un sistema pueden servir diferentes líquidos corporales de un individuo o también muestras acondicionadas de forma diferente del mismo líquido corporal de un individuo. Por supuesto, también se pueden procesar o analizar diferentes líquidos corporales de diferentes maneras en cada caso para representar así diferentes muestras de un sistema. Por tanto, En esta variante está previsto que, por ejemplo, una muestra de sangre y una muestra de orina de un individuo se examinen mediante el mismo método de análisis o mediante métodos de análisis diferentes. Por consiguiente, la muestra de sangre y la muestra de orina se pueden tomar del individuo, por ejemplo, al mismo tiempo o con un pequeño espacio temporal para representar esencialmente la misma condición del individuo.

Para diseñar la caracterización del sistema de otra manera aún más precisa y, en particular, para poder clasificar el sistema de forma más sencilla en una categoría predeterminada, se utiliza adicionalmente un parámetro suplementario del sistema en una variante del método para generar el distintivo de la muestra. Un parámetro suplementario de este tipo puede ser, por ejemplo, un parámetro fisiológico del individuo del que procede la muestra. Algunos ejemplos de tales parámetros fisiológicos son la presión arterial del individuo examinado o su índice de masa corporal. Por tanto, se trata de un parámetro externo. Un parámetro externo de este tipo es una variable que no ha sido determinada por la técnica subyacente al método de análisis u otra técnica comparable, sino que caracteriza al sistema o individuo independientemente de la muestra.

También es materia objeto de la divulgación, pero quedando fuera del alcance de la invención, el uso de la técnica de distintivos descrita para controlar la progresión de una enfermedad, en particular si el individuo que padece la enfermedad es sometido a un tratamiento contra la enfermedad.

Además es materia objeto de la divulgación, pero quedando fuera del alcance de la invención, un producto de programa informático que tiene un programa informático que tiene un código de programa para llevar a cabo cualquiera de los métodos explicados anteriormente, si el programa informático se ejecuta en un ordenador.

Por tanto, en particular, si la relación matemática, en cuyo valor se basa la generación del distintivo caracterizador, se selecciona de modo que las diferencias de concentración de sustancias individuales se compensen entre sí, entonces, es posible trabajar independientemente de la concentración, tal producto de programa informático permite realizar una determinación adicional de la concentración de las sustancias en la muestra que se va a analizar. Este es particularmente el caso si la relación matemática es una división para establecer la relación entre dos valores del resultado del análisis. Al hacerlo, el esfuerzo a escala de laboratorio para caracterizar la muestra o el sistema se reduce significativamente, de este modo se puede ahorrar, por un lado, tiempo y, por otro, costes. Además, la cantidad de datos para el análisis posterior se reduce al generarse el valor de la relación matemática entre al menos dos valores del resultado del análisis, de modo que las etapas posteriores del método se puedan realizar con un esfuerzo de cálculo significativamente menor que sin un cálculo correspondiente del valor de una relación matemática. Mediante estos efectos técnicos específicos, el producto de programa informático correspondiente puede hacer aplicables los métodos explicados anteriormente con más detalle de una manera muy atractiva.

Otra materia objeto es unsoftwarepara llevar a cabo cualquiera de los métodos explicados anteriormente. Unsoftwarede este tipo permite la ejecución automatizada de los métodos explicados. Puede utilizarse para analizar datos de medición obtenidos previamente o también para interactuar con un dispositivo de medición como un espectrómetro a fin de ayudar en la medición de datos.

Los métodos divulgados no solo son adecuados para establecer conclusiones positivas (como "Este distintivo indica que la muestra pertenece al grupo A"), sino también conclusiones negativas (como "Este distintivo indica que la muestra no pertenece al grupo A, B, C, D"). Mientras que se pueden sacar conclusiones positivas específicamente en problemas 1 a 1, las conclusiones negativas son útiles en problemas de 1 a n (siendo n un número mayor que 1).

La presente invención se explicará con más detalle con ayuda de las figuras y los ejemplos siguientes. En las figuras:

la Fig. 1 muestra una representación esquemática de un muestreo ilustrativo de un sistema biológico;

la Fig. 2 muestra una representación esquemática de posibles variaciones en el procesamiento de muestras; la Fig. 3 muestra una representación esquemática de una posible adquisición de datos de un sistema biológico; la Fig. 4A muestra una primera descripción general para generar un distintivo caracterizador;

la Fig. 4B muestra una segunda descripción general para generar un distintivo caracterizador;

la Fig. 5 muestra un espectro de RMN de una muestra de orina humana;

la Fig. 6 muestra una representación gráfica de sumas normalizadas de señales de RMN de muestras de orina de diferentes personas;

la Fig. 7 muestra una representación esquemática de una red metabólica de sustancias que desempeñan un papel en la evaluación del rechazo renal;

la Fig. 8 muestra una representación esquemática de la clasificación de un distintivo medido utilizando distintivos ya existentes;

la Fig. 9 muestra una representación esquemática de la clasificación de diferentes distintivos medidos utilizando distintivos ya existentes;

la Fig. 10 muestra otra representación esquemática de la clasificación de diferentes distintivos medidos utilizando distintivos ya existentes;

la Fig. 11 muestra una comparación esquemática de los hallazgos de diagnóstico clínico y un pronóstico para un cuadro clínico generado por distintivos de RMN;

la Fig. 12 muestra espectros de RMN de café con cafeína y café descafeinado;

la Fig. 13 muestra un espectro de RMN medido de café y un espectro de RMN sintético de café;

la Fig. 14 muestra una correlación gráfica de diferentes tipos de café con su contenido de cafeína;

la Fig. 15 representa esquemáticamente un método de simplificación de la información;

la Fig. 16 representa esquemáticamente una separación de cafés muy tostados de cafés poco tostados basándose en una regla de separación aprendida;

la Fig. 17 muestra un espectro de la diferencia entre el espectro promedio de cafés muy tostados y el espectro promedio de cafés poco tostados;

la Fig. 18 muestra un espectro de RMN del extracto de semilla de mostaza;

la Fig. 19 muestra un extracto de un espectro de RMN original de extracto de semilla de mostaza junto con su espectro sintético;

la Fig. 20 muestra una representación esquemática de una red metabólica para sustancias que desempeñan un papel en el metabolismo tumoral;

la Fig. 21 es una representación esquemática de un sistema informático;

la Fig. 22 es un diagrama de flujo esquemático de una realización de un sistema para caracterizar una muestra y la Fig. 23 es un diagrama de flujo esquemático de una realización de un sistema para caracterizar un sistema.

La figura 1 muestra una representación esquemática del muestreo de un sistema biológico 100. El objetivo del muestreo es caracterizar el sistema biológico 100 y evaluarlo de manera estacionaria. Por consiguiente, la caracterización puede estar dirigida al estado real del sistema biológico 100 con respecto a una pregunta dada. La cuestión puede ser, por ejemplo, si las semillas proceden de una variedad A o de una variedad B. Otra cuestión podría ser, por ejemplo, si el sistema biológico 100 funciona sin problemas en el momento de la toma de la muestra (esto es especialmente interesante en el caso de una planta de biogás).

La pregunta también puede centrarse en el estado futuro del sistema biológico 100. La caracterización del sistema biológico 100 puede tener como objetivo, por ejemplo, determinar si el rechazo de un órgano trasplantado es probable o no. Otra posible pregunta es si un paciente padecerá diabetes o una enfermedad cardiovascular con mayor o menor probabilidad. Otra posible pregunta más es si la administración o dosificación prevista del fármaco será eficaz o no en un paciente.

Como se representa en la figura 1, una primera muestra 10, una segunda muestra 20 y una tercera muestra 30 se toman del sistema biológico 100. Por consiguiente, el número de muestras es generalmente arbitrario y no se limita a lo anterior. La primera muestra 10 puede ser, por ejemplo, orina, la segunda muestra 20, por ejemplo, plasma sanguíneo y, la tercera muestra 30, otro líquido corporal.

Además, los resultados de medición externos 40 como, por ejemplo, la presión arterial o el índice de masa corporal de un paciente pueden tomarse del sistema biológico 100. Los resultados de medición externos 40 son, por tanto, resultados de medición que se han obtenido mediante métodos distintos de aquellos que se utilizan para caracterizar la primera muestra 10, la segunda muestra 20 y la tercera muestra 30.

En el marco de la caracterización del sistema biológico 100, el muestreo del sistema biológico 100 representa el primer nivel.

En el segundo nivel de la caracterización, puede tener lugar una variación del procesamiento de la muestra, si fuese necesario. Se pueden medir, por ejemplo, muestras que consistan en plasma sanguíneo o suero sin ningún procesamiento adicional, por tanto, en la forma en que se han extraído del cuerpo. Por consiguiente, por ejemplo, también es posible determinar la distribución de tamaños de las lipoproteínas contenidas en el plasma sanguíneo o en el suero mediante espectroscopia de RMN.

Las lipoproteínas presentes en las muestras correspondientes también pueden escindirse mediante la adición de detergentes. Al hacerlo, existe la posibilidad de medir las composiciones de los lípidos presentes en la sangre mediante espectroscopia de RMN.

En la figura 2, se muestra una posible variación del procesamiento de muestras. Por tanto, aquí se indica a modo de ejemplo cómo se transfiere la segunda muestra 20 una vez sin tratamiento adicional (flecha superior) para la medición de las lipoproteínas contenidas en la segunda muestra 20. En la figura 2, se representa además que, como alternativa, se puede añadir un detergente 50 a la segunda muestra 20, dando lugar, por tanto, a una segunda muestra 25 tratada. La segunda muestra 25 tratada puede usarse entonces para medir los lípidos contenidos en la misma.

Como tercer nivel en la caracterización del sistema biológico 100, puede producirse una posible variación en los métodos de medición. Los diferentes métodos de medición tienen diferentes puntos fuertes, fuentes de error y áreas dinámicas. Por tanto, por ejemplo, la espectroscopia de masas es notablemente más sensible que la espectroscopia de RMN. Por otro lado, es más difícil trabajar cuantitativamente con espectroscopia de masas. Mediante una combinación de diferentes métodos es posible adquirir cada vez más datos significativos que con un único método de medición.

De acuerdo con las preguntas y las sustancias que se van a examinar en las muestras, por tanto, es posible pensar en una combinación diferente de diferentes métodos de medición.

Como cuarto nivel en la caracterización del sistema biológico 100, además se puede efectuar una variación en la realización de las tecnologías. Por ejemplo, las muestras de plasma sanguíneo y de suero se pueden examinar con diferentes programas de pulsos de RMN. Además, los espectros editados en gradiente permiten medir la información sobre proteínas y lipoproteínas (por lo tanto, compuestos de alto peso molecular), mientras que se suprimen los metabolitos que tienen un peso molecular más bajo.

Por el contrario, los espectros de RMN CPMG (CPMG indica Carr Purcell Meiboom Gill; la RMN CPMG es un método de medición de difusión por relajación de RMN) indican solo componentes de bajo peso molecular (normalmente metabolitos de bajo peso molecular), mientras que los compuestos de alto peso molecular se suprimen. Dependiendo del problema, se puede realizar, por tanto, una variación en la realización de la técnica adaptada a las necesidades individuales.

Esto es posible en cualquier combinación deseada para la primera muestra 10, la segunda muestra 20 y la tercera muestra 30. Por tanto, para cada una de estas muestras, por ejemplo, se puede adquirir un espectro de RMN editado en gradiente para compuestos de alto peso molecular y/o un espectro de RMN CPMG para compuestos de bajo peso molecular.

La adquisición de datos realizada en el marco de la caracterización del sistema biológico 100 se representa esquemáticamente en la figura 3. Por tanto, en el primer nivel I, la primera muestra 10, la segunda muestra 20 y la tercera muestra 30 se toman del sistema biológico 100 en el marco del muestreo. Asimismo, se extraen los resultados de medición externos 40 (en este sentido, véase también la figura 1).

En el segundo nivel II, se produce una variación del procesamiento de muestras. A partir de la primera muestra 10, se pueden obtener, por tanto, una primera muestra 10 sin tratar, una primera muestra 15 tratada mediante un primer método y una primera muestra 16 tratada mediante un segundo método mediante diferentes técnicas de procesamiento de muestras. Asimismo, a partir de la segunda muestra 20, se puede obtener una segunda muestra 20 sin tratar sin el procesamiento adicional de la muestra. A partir de la tercera muestra 30, además, puede surgir una tercera muestra 30 no tratada, así como una tercera muestra 35 tratada mediante un procesamiento de muestra correspondiente.

En el tercer nivel III, finalmente se produce una variación del método de medición. Por tanto, por ejemplo, cada una de las muestras o muestras parciales obtenidas en el segundo nivel II puede someterse a diferentes métodos de medición como espectroscopia de RMN y espectroscopia de masas (MS).

En el cuarto nivel IV, finalmente puede tener lugar una variación de los métodos de medición, que se representa en la figura 3 solo a modo de ejemplo para la espectroscopia de RMN. Por tanto, aquí, en el cuarto nivel IV, se proporciona la adquisición de espectros de RMN NOESY y RMN de gradiente.

En la figura 4A se muestra una descripción general de la primera etapa para generar un distintivo caracterizador. Por tanto, la primera muestra 10 se mide mediante un primer método 51, dando lugar a un conjunto de primeros valores. Este conjunto de primeros valores está representado por los números 1, 2, 3 en un borde en forma de semicírculo. Asimismo, se mide una segunda muestra tratada 25 mediante un segundo método 52, dando lugar a un segundo conjunto de valores. Este segundo conjunto de valores está representado por los números 1, 2 en forma de rombo que se encuentra en el vértice.

Asimismo, la tercera muestra 30 se mide mediante un tercer método 53 dando como resultado un tercer conjunto de valores. Este tercer conjunto de valores está representado por los números 1, 2 en una elipse.

Además, de los resultados de medición externos 40 se puede extraer el cuarto valor ajustado, representado con el número 1 en un rombo lateral.

La figura 4B ofrece ahora una descripción general de la segunda etapa de la generación de distintivos. Con este fin, los valores obtenidos en la primera etapa representada en la figura 4A están correlacionados entre sí. Esto se representa en la figura 4B mediante una matriz. En este contexto, los números 1, 2, 3 y las diferentes formas geométricas indican los valores del primer al cuarto conjunto de valores de la figura 4A. Es decir, un "1" en un rombo que se encuentra en el vértice denota un valor 1 obtenido mediante el segundo método de medición 52. Un "2" en una forma semicircular indica el valor 2 de la medición realizada mediante el primer método 51. En cada caso, se representa un círculo en la intersección entre los valores individuales, el círculo que representa una conexión matemática entre los valores individuales. En el presente caso, la conexión o relación matemática es una relación entre estos valores. Por consiguiente, los valores indicados en la línea se considerarán dividendos y los valores indicados en la columna se considerarán divisores. En consecuencia, los círculos de la matriz de la figura 4B representan los valores de la relación matemática entre los valores individuales obtenidos de las mediciones. Mediante estos valores, se puede generar el distintivo correspondiente para caracterizar el sistema biológico 100.

Para simplificar la representación en la figura 4B, solo un único valor 60 está provisto de un signo de referencia correspondiente. Este valor 60 de la relación matemática entre el valor 1 obtenido con el segundo método 52 y el valor 2 obtenido con el primer método 51 representa, por tanto, el valor de la relación matemática entre esos dos valores (valor 1/valor 2) y sirve, como también sirven los otros valores de las respectivas relaciones matemáticas entre los valores de medición individuales, para generar el distintivo.

Las figuras 5 a 11 se explicarán más detalladamente con ayuda del primer ejemplo de realización que se describe a continuación.

Primera realización ilustrativa: Prueba de rechazo renal

Se añadieron 200 pl de una solución tampón a 500 pl de orina humana. Esta solución tampón consiste en un tampón de fosfato de sodio que tiene una concentración de 800 mmol por litro y un valor de pH de 7,4, 300 pmol por litro de propionato de trimetilsililo (TSP) de sodio y 15 % de D<2>O, en donde el valor de pH nominal se midió antes de la adición de D<2>O. La orina y el tampón se mezclaron en un tubo Eppendorf y se centrifugaron durante 15 minutos a 4 °C y 17.900 rpm. Se transfirieron 500 pl del sobrenadante a un tubo de muestra de RMN de 5 mm. Seguidamente, se realizó una medición de RMN.

Para la medición de RMN se utilizó un espectrómetro de RMN del tipo Advance II 600 con un cabezal de muestra TXI. La altura del tubo de muestra en el centrifugador fue de 20 mm y la temperatura real ajustada de 24,85 °C (298 K). El tiempo máximo de almacenamiento de la muestra a temperatura ambiente/de medición fue de cuatro horas. La medición se inició cuando estaba presente un equilibrio de temperatura suficiente; este fue el caso si la fluctuación de temperatura de la muestra estaba dentro de ± 0,2 °C (± 0,2 K) de la temperatura nominal.

Para la medición de RMN real se utilizó un conjunto de parámetros que se muestra en la siguiente tabla 1. Mediante una medición de RMN con los parámetros correspondientes se obtuvo un espectro procesado automáticamente para cada muestra. Durante el tratamiento automático se efectuaron una corrección de fase, una corrección del valor basal y una referenciación.

Tabla 1: Descripción general de los parámetros utilizados durante la medición de RMNAdquisición (variable) Adquisición (invariable) Procesamiento

(invariable)

p1 ~10 ps PI1: 0dB SI: 262144 (256k)

pl9: 60 dB TD: 98304 (96k) WDW: EM

o1: 2852,20 NS: 64 LB[Hz]: 0,3 Hz

DS:4 PHC1: 0,0

D1: 4 s PH_mod: pk

AQ+D1: 8,09 s

RG: 16

SWH: 12019,23 Hz

SW: (20 ppm) LOCNUC: 2H

El espectro de RMN procesado respectivo se representa en la figura 5. Por consiguiente, la intensidad en el eje y se representa en unidades arbitrarias con respecto al cambio químico en ppm en el eje x. Se suprimen las señales que se encuentran en el intervalo de resonancias del agua. El intervalo correspondiente está marcado con un recuadro en la figura 5.

El espectro de RMN ahora estaba desconvolucionado, eso significa transferido a las líneas de Lorentz y Gauss.

Seguidamente, el espectro se representó en forma vectorizada para que la ubicación de la línea (de la señal), el ancho de la línea, la integral y la configuración sean accesibles.

Este método de procesamiento de muestras, la medición por RMN y el procesamiento de datos de medición se repitieron para numerosas muestras de orina adicionales de otras personas. Como resultado, estaban presentes numerosos espectros de RMN procesados de diferentes personas. Las personas cuya orina se eligió para la medición de RMN pudieron ser asignadas a dos grupos. Por un lado, hubo personas que mostraron rechazo de riñón después del trasplante de riñón. Por otro lado, se utilizó orina de personas que no presentaron rechazo renal después del trasplante de riñón.

Para generar ahora un distintivo caracterizador, a fin de caracterizar el grupo "con rechazo renal" del grupo "sin rechazo renal" basándose en los espectros de RMN obtenidos, por un lado se formó una suma normalizada de señales de aproximadamente 50 personas con rechazo renal y una suma normalizada de señales de aproximadamente 50 personas sin rechazo renal. Asimismo, se determinó la diferencia de las sumas normalizadas de ambos grupos. El resultado de este cálculo se muestra en la figura 6. Por consiguiente, las sumas de señales representadas en líneas finas representan el grupo de personas con rechazo renal y las sumas de señales de personas sin rechazo renal. Las líneas gruesas representan la diferencia entre ambos grupos. La distribución de frecuencia porcentual entre las sumas de señales individuales proporciona una clara indicación de qué señales en los respectivos grupos podrían ser significativas para la generación de distintivos.

Se caracterizaron las veinte señales más peculiares según su posición en el espectro y su integral, y se transfirieron a una lista. Esta lista se muestra en la siguiente tabla 2.

Tabla 2: Lista de veinte señales peculiares.

Número Posición de la señal

[PPm]

1 1,174

2 1,310

3 2,132

4 2,198

5 2,330

6 2,513

7 2,767

8 3,096

9 3,105

10 3,222

11 3,378

12 3,394

13 3,779

14 4,386

15 5,223

16 5,601

17 7,335

18 7,396

19 7,551

20 7,828

Seguidamente, se generó una matriz para cada espectro de RMN (tanto para el grupo de personas con rechazo renal como para las personas sin rechazo renal), en cuya matriz se correlacionaron en cada caso entre sí los veinte valores peculiares previamente determinados. Todos los elementos de las matrices generadas se agregaron seguidamente por separado y se normalizaron para el grupo de personas con rechazo renal y el grupo de personas sin rechazo renal. Como consecuencia, se obtuvieron dos matrices, una de las cuales representa el distintivo del grupo de personas con rechazo renal y el otro el distintivo de personas sin rechazo renal. En la siguiente tabla 3, se representa a modo de ejemplo una matriz de correlación agregada y normalizada correspondiente para el grupo de personas con rechazo renal.

La mayoría de los 400 valores de la matriz de 20x20 tienen un valor informativo bajo o nulo. Por lo tanto, ahora se seleccionaron aquellos elementos de la matriz que contribuían esencialmente a la distinción de ambos grupos. Esta elección se realizó calculando en primer lugar una puntuación según el procedimiento explicado a continuación para cada señal de las matrices previamente agregadas. Seguidamente, uno de los 400 valores de la matriz a la vez se eliminó sucesivamente de la matriz respectiva y luego se volvió a calcular la puntuación de la matriz o distintivo respectivo en cada caso. Antes de eliminar otro valor, el valor previamente eliminado se agregó una vez más al distintivo analizado de modo que el distintivo analizado consistía siempre en cada etapa de validación de 399 elementos. Si esta eliminación no tuvo ningún efecto o solo tuvo un efecto muy pequeño en la puntuación, el valor cero se asignó al valor de la matriz eliminado en esta etapa de validación. Cuando la eliminación tenía un efecto mayor en la puntuación, se asignaba un valor más alto al valor de la matriz correspondiente. Una posibilidad adecuada para asignar un determinado valor a una celda de la matriz se explicará con respecto a la tercera realización ilustrativa con más detalle. Seguidamente, se realizó una suma de los valores asignados a los valores de matriz individuales y una asignación de dichos valores de suma a los valores de la matriz representada en la figura 3. Estos valores de suma asignados se muestran en la siguiente tabla 4. Los valores de suma asignados o ponderados de los elementos significativos de la matriz están marcados con un fondo sombreado.

Durante todas las etapas del método que se han explicado anteriormente, todavía no se ha realizado ninguna asignación entre las señales peculiares y determinados metabolitos o sustancias causantes de dichas señales. Tal asignación (como ya se ha explicado anteriormente en detalle) no es necesaria para la generación de distintivos. A pesar de ello, tal asignación puede ser de interés científico, por lo que actualmente se llevó a cabo. En la siguiente tabla 5, se representa una asignación de sustancias a las señales peculiares, siendo realizada la asignación a partir de los espectros de RMN obtenidos y de espectros comparativos. Las sustancias marcadas con un signo de interrogación indican que, en este caso, la asignación todavía no se puede realizar de forma inequívoca.

Tabla 5: Asignación de sustancias a las señales peculiares.

Número Posición de la señal Asignación (sustancia)

[PPm]

1 1,174 metilmalonato (?)

2 1,310 lactato

3 2,132 succinato de metilo

4 2,198 p-cresol

5 2,330 3-hidroxi-isovalerato

6 2,513 citrato

7 2,767 metilguanidina

8 3,096 malonato

9 3,105 malonato

10 3,222 taurina

11 3,378 metilguanidina

12 3,394 taurina

13 3,779 PAG

14 4,386 trigonelina (?)

15 5,223 a-glucosa

16 5,601 acetil-carnitina

17 7,335 PAG/acetato de fenilo

18 7,396 PAG/acetato de fenilo

19 7,551 hipurato

20 7,828 hipurato

Además, con ayuda de la matriz de correlación generada se determinó entre cuáles de las sustancias asignadas existen correlaciones significativas. Estas correlaciones se representan en la siguiente tabla 6.

Tabla 6: Correlaciones significativas entre las sustancias asignadas

Esta asignación también se representa en la figura 7 en forma de red metabólica. Mediante la asignación realizada y la determinación de correlaciones significativas de las sustancias asignadas entre sí es posible determinar cuáles de las sustancias interactúan entre sí dentro de las vías metabólicas. Este es un aspecto adicional interesante que se puede observar conjuntamente en el marco de la presente generación de distintivos.

Con el fin no solo de asignar un distintivo a cada una de las personas examinadas, sino de determinar también con ayuda del distintivo correspondiente si la persona debe ser asignada al grupo con rechazo renal o al grupo sin rechazo renal, se comparó el distintivo correspondiente con distintivos comparativos de los respectivos grupos. De esta manera, se puede determinar si la red de concentraciones relativas de sustancias, es decir, el distintivo, se parece más bien a la clase de los que tienen rechazo renal o más bien a la clase de los que no tienen rechazo renal.

Para determinar en este caso una similitud entre los respectivos distintivos, se comparó el distintivo de la muestra que se iba a evaluar en cada elemento de la matriz con el correspondiente elemento de la matriz del distintivo del grupo comparativo. Por consiguiente, se calcularon y ponderaron las diferencias correspondientes. La similitud de la muestra que se iba a evaluar con el respectivo grupo comparativo resulta finalmente de la suma de las desviaciones ponderadas de todos los elementos de la matriz.

Si este distintivo de RMN medido se compara ahora con un distintivo comparativo correspondiente al rechazo renal y un distintivo comparativo correspondiente al no rechazo renal, se obtiene una distancia entre el distintivo de RMN medido y el distintivo de los que tienen rechazo renal, así como el distintivo de los que no tienen rechazo renal, a partir del criterio de similitud aplicado (es decir, la suma ponderada de todas las desviaciones entre la medición que se ha de evaluar y el distintivo comparativo). Esto se representa esquemáticamente en la figura 8. En este caso, por un lado, se puede ver el distintivo de RMN medido 200 que se encuentra a una distancia A del distintivo 210 del grupo sin rechazo renal y a una distancia B del distintivo 220 del grupo con rechazo renal. En la actualidad, la distancia A es inferior a la distancia B. A partir de ambos valores, se puede calcular la puntuación mediante la ecuación:

puntuación = ((distancia A)/(distancia B))*ajuste ;;Si esta puntuación es inferior al valor de 1, el distintivo de RMN medido 200 debe asignarse más bien al distintivo 210 de los grupos sin rechazo renal. Si el valor de la puntuación es superior a 1, el distintivo de RMN medido 200 debe asignarse más bien al distintivo 220 de los grupos sin rechazo renal. ;;De esta manera, por supuesto, no solo se puede asignar un único distintivo de RMN medido 200 a un grupo comparativo correspondiente, sino también una pluralidad de distintivos de RMN medidos. Esto se representa a modo de ejemplo en la figura 9, en donde se asignó la misma referencia numérica 200 a todos los distintivos de RMN medidos. Los distintivos de RMN medidos representados en la figura 9 presentan, en cada caso, una distancia A que es inferior a la distancia B correspondiente. Esto significa que los distintivos de RMN medidos 200 representados en la figura 9 deben asignarse, en cada caso, al distintivo 210 de los que no tienen rechazo renal. ;;En la figura 10, se muestra una imagen comparable a la figura 9, en donde, en este caso, sin embargo, los distintivos de RMN medidos 200 se deben asignar en cada caso más bien al grupo con rechazo renal en lugar de al grupo sin rechazo renal. Por lo tanto, las figuras 9 y 10 solo explican de manera ilustrativa cómo debe entenderse la relación entre los distintivos de RMN medidos 200 y el distintivo 220 de los que tienen rechazo renal y el distintivo 210 de los que no tienen rechazo renal que ya están presentes como conjuntos de datos de referencia. ;;Con ayuda de la puntuación calculada para un distintivo de RMN medido 200, es posible determinar con qué probabilidad una persona sometida a un trasplante de riñón sufrirá el rechazo del riñón trasplantado. ;;En la figura 11, se representa una comparación con los hallazgos clínicos para validar el presente método de caracterización mediante un distintivo caracterizador. Por tanto, los hallazgos clínicos de diferentes pacientes después del trasplante de riñón se representan en la figura 11, en el recuadro superior indicado con I por las letras "A" y "N". Por consiguiente, "A" denota un rechazo renal después del trasplante de riñón y "N" que no hay rechazo renal después del trasplante. ;;En el recuadro indicado con II y representado en la parte inferior de la figura 11, se representan las puntuaciones del pronóstico de RMN basándose en el distintivo caracterizador. Como ya se ha explicado, una puntuación inferior a 1 indica rechazo renal y una puntuación superior a 1 indica que no hay rechazo renal después del trasplante. Por consiguiente, cuanto más alejada de 1 esté la puntuación, mayor será la probabilidad de que el comportamiento después del trasplante predicho por el pronóstico de RMN corresponda al comportamiento real del paciente correspondiente. Considerando únicamente las puntuaciones inferiores a 0,7 o superiores a 1,4 (marcadas con flechas en cada caso), el rechazo renal se puede predecir correctamente en un 95 % mediante el método de distintivos de RMN. Con estos requisitos previos, el no rechazo renal puede incluso predecirse correctamente en un 100 %. ;;Por tanto, el presente método para utilizar un distintivo caracterizador puede utilizarse de manera excelente para la predicción de los comportamientos de un paciente ante un trasplante de riñón. Sin embargo, como se ha explicado con anterioridad, el presente método no se limita a tales predicciones en el área de los trasplantes de riñón, sino que puede encontrar múltiples campos de aplicación. ;;Ahora, se explicarán las figuras 12 a 17 en relación con un ejemplo fuera del alcance de la invención. ;;Segundo ejemplo: Identificación del tipo de café ;;Se introdujo una cápsula de café "Nespresso" que contenía aprox. 5 g de café en polvo en una máquina de café "Nespresso". Se extrajo el café en polvo en aprox. 120 ml de agua caliente según el procedimiento de extracción convencional que realiza la cafetera. Se obtuvieron aprox. 118 ml de extracto líquido de café. Se añadieron 50 pl de tampón fosfato de sodio y 25 pl de patrón de RMN (que consistía en 2 mmol/I de propionato de trimetilsililo [TSP] en D<2>O) a 425 pl del extracto de café. A continuación, se transfirió esta mezcla a un tubo de muestra de RMN de 5 mm para la posterior medición de RMN. ;;Para la medición de RMN se utilizó un espectrómetro de RMN del tipo Advance II 600 con un cabezal de muestra TXI. La altura del tubo de muestra en el centrifugador fue de 20 mm y la temperatura real ajustada fue de 24,85 °C (298 K). El tiempo máximo de almacenamiento de la muestra a temperatura ambiente/de medición fue de cuatro horas. La medición se inició cuando estaba presente un equilibrio de temperatura suficiente; este fue el caso si la fluctuación de temperatura de la muestra estaba dentro de ± 0,2 °C (± 0,2 K) de la temperatura nominal. ;;Para la medición de RMN real, se utilizó un conjunto de parámetros que se muestra en la siguiente tabla 7. Mediante una medición de RMN con los parámetros correspondientes se obtuvo un espectro procesado automáticamente para cada muestra. Durante el tratamiento automático se efectuaron una corrección de fase, una corrección del valor basal y una referenciación. ;;Tabla 7: Descripción general de los parámetros utilizados durante la medición de RMN ;Adquisición (variable) Adquisición (variable) prOCabam^*0

p1 ~10 ps PI1: 0 dB SI: 64 k

pl9: 65 dB TD: 32 k WDW: EM

o1: 2852 Hz DS: 4 LB[Hz]: 0,3

____________________________ (continuación)____________________________

Adquisición (variable) Adquisición (variable) piOCabteT^^0

PHC1: 0

PH_mod: pk

Esta extracción de café y medición de RMN se repitió para diferentes clases o tipos de café, cada uno contenido en una cápsula "Nespresso". Estos tipos de café se diferenciaban en su contenido de cafeína, en su composición del café y en su grado de tueste.

En la figura 12 se representan espectros de RMN procesados ilustrativos de un café que contiene cafeína (línea continua) y un café descafeinado (línea discontinua). La intensidad en el eje y se representa en unidades arbitrarias con respecto al cambio químico en ppm en el eje x. Se suprimen las señales que se encuentran en el intervalo de resonancias del agua. Los picos que solo se pudieron observar en el espectro de RMN del café que contiene cafeína indican que los picos son causados por la cafeína. Estos picos están marcados con una flecha.

Seguidamente, se separaron las líneas de los espectros de RMN individuales, es decir, el espectro medido se transformó en un espectro sintético que consistía en una pluralidad de picos agudos que tienen un área definida. La figura 13 representa un espectro medido (línea continua) y un espectro sintético (línea discontinua). La intensidad en el eje y se representa en unidades arbitrarias con respecto al cambio químico en ppm en el eje x.

Integrando el área de los picos causados por la cafeína y estandarizándola conforme al área del pico causado por el patrón de RMN TSP, fue posible cuantificar la cafeína presente en las respectivas muestras. Por tanto, todas las muestras de café medidas se analizaron con respecto a su contenido de cafeína. El resultado se muestra en la figura 14. Los nombres representados en la figura 14 indican los distintos tipos de café disponibles para el sistema "Nespresso".

Obviamente, el contenido de cafeína de los tipos de café descafeinado era significativamente inferior al de los tipos de café no descafeinado. De los últimos, "Fortissimo Lungo" contenía la mayor cantidad de cafeína, mientras que "Cosi" era el café con la menor cantidad de cafeína de los cafés no descafeinados analizados.

Además del contenido de cafeína, la mejor forma de distinguir los distintos cafés es en función de los granos de café utilizados para su elaboración y del grado de tueste. El tueste del café tiene muchos efectos pequeños (pero no cuantitativamente significativos). A pesar de ello, la composición química general del café se ve afectada por el tueste, lo que da lugar a distinciones sensoriales de cafés tostados de forma diferente. Para clasificar un café como café muy tostado o café poco tostado, se generó un distintivo caracterizador de los extractos de café.

Al hacerlo, en primer lugar, se construyeron dos grupos a partir de la información proporcionada por el fabricante de café sobre el grado de tueste. Los tipos de café "Ristretto", "Arpeggio", "Fortissio Lungo" y "Descafeinado intenso" formaban parte del grupo de cafés "muy tostados". Los tipos de café "Finezzo Lungo", "Volluto", "Descafeinado", "Cosi", "Cappricio" y "Roma" constituían el grupo de cafés "poco tostados".

Ahora, Se produjo una simplificación inteligente de la información. Al hacerlo, se seleccionaron las líneas mejor separadas para reducir la información del espectro sintético a un pequeño grupo de líneas muy bien separadas. Por consiguiente, también se tuvieron en cuenta los picos muy pequeños siempre que pudieran estar bien separados de sus picos vecinos. La figura 15 representa esquemáticamente la simplificación de la información. En la parte superior de la figura 15, se representa un espectro sintético. En la parte inferior, se muestra un espectro simplificado que solo consiste en las mejores líneas separables de este espectro sintético. Dicho de otro modo, las líneas resultantes son aquellas líneas de todo el espectro que son lo más selectivas posible.

Basándose en el espectro simplificado y el resto de líneas selectivas, los grupos "muy tostados" y "poco tostados" se pueden separar bien entre sí. Esto se muestra en la figura 16. El uso de solo las líneas mejor separadas de todo el espectro evita un ajuste insuficiente o excesivo de la separación. Por tanto, la elección de los picos más adecuados da como resultado una regla de separación "aprendida", a partir de la cual se puede distinguir muy bien entre los grupos de cafés muy tostados y poco tostados.

Es posible no utilizar todas las líneas que están presentes en el espectro simplificado, sino solo un subconjunto de las mismas. Esto se puede hacer manualmente seleccionando los picos significativos de espectros promedio a simple vista. Sin embargo, también se puede hacer automáticamente almacenando todos los picos que exceden un valor umbral y difieren de los picos observados en el otro grupo respectivo. Instantáneamente, se hizo tal elección automática. Esta elección se redujo aún más al mantener solo un pico fuera de un grupo de picos que pertenecían al mismo grupo. Adicionalmente, se eliminaron los picos no predictivos. Finalmente, el subconjunto de picos resultante formó la base para la regla de separación y para generar un distintivo caracterizador. Dado que el trabajo preparatorio tenía como objetivo seleccionar solo los picos más selectivos, a partir de estos picos se podría obtener un distintivo caracterizador selectivo del café.

La siguiente tabla 7 muestra un conjunto de 6 picos selectivos utilizados para generar un distintivo de café.

Tabla 7: Picos selectivos utilizados para generar un distintivo de café.

Pico n.° Posición de la señal Posición del pico muy correlacionado

[PPm] [PPm]

1 1,281 1,303

2 2,482 4,176; 2,409

3 3,554 4,154; 1,983; 1,901

4 3,955 ninguno identificado 5 5,245 ninguno identificado

6 9,127 8,838; 4,44

Por interés científico, se asignaron las sustancias causantes a los picos selectivos seleccionados. Esta asignación se indica en la siguiente tabla 8.

Tabla 8: Asignación de sustancias causantes a los picos selectivos que se muestran en la tabla 7.

Pico n.° Posición de la señal Asignación (sustancia)

[PPm]

1 1,281 triglicéridos

2 2,482 ?

3 3,554 ácido quínico

4 3,955 ácido glicólico

5 5,245 ?

6 9,127 trigonelina

El símbolo "?" de la tabla 8 indica que no se pudo identificar ninguna sustancia causante, por lo que aún no era posible realizar ninguna asignación.

Como control, se estudió si las sustancias identificadas tendrían sentido como base para el distintivo del café.

La trigonelina (1-metilpuridinio-3-carboxilato) está presente en el café en una cantidad de aprox. el 0,6 %. El 50 % de la trigonelina se descompone al tostar el café. La descomposición conduce a la formación de N-metilpiridina. la figura 17 muestra un espectro de diferencia entre el espectro promedio de cafés muy tostados y el espectro promedio de cafés poco tostados. Las sustancias que están presentes en el grupo de cafés poco tostados pero no (o en menor medida) en el grupo de cafés muy tostados aparecen como picos de diferencia negativos. Las sustancias que están presentes en el grupo de cafés muy tostados pero no (o en menor medida) en el grupo de cafés poco tostados aparecen como picos de diferencia positivos.

En la figura 17 se puede ver claramente que la trigonelina está presente en el café poco tostado en una cantidad significativamente mayor que en el café muy tostado, mientras que la N-metilpiridina (el producto de descomposición de la trigonelina) está presente en el café muy tostado en cantidades significativamente mayores que en el café poco tostado.

Por tanto, la elección del pico en 9,127 ppm, al que se le asignó trigonelina como sustancia causante, para el uso de generación de un distintivo de café parece ser muy sensato.

Entre otros ácidos, el ácido quínico representa una de las sustancias más destacadas en el contenido total de ácido del café verde. Durante el tostado, el ácido quínico aumenta progresivamente a medida que disminuye el nivel de ácido clorogénico. Se supone que la formación de ácido quínico durante el tueste se debe a la escisión del ácido clorogénico. Dicho de otro modo, el contenido de ácido quínico en el café está muy relacionado con el grado de tostado. Por tanto, además, el pico de 3,554 ppm causado por el ácido quínico parece ser una opción sensata para generar un distintivo caracterizador para el café.

Sin entrar en detalles, también se podría establecer con base científica que los triglicéridos y el ácido glicólico se ven afectados por el proceso de tueste. Por tanto, también tiene sentido la elección de los picos de 1,281 ppm y 3,955 ppm para generar un distintivo.

Para generar el distintivo, se elaboró una matriz de correlación de 6x6 como se describe anteriormente para cada espectro medido. Esta matriz se llenó con los valores de los cocientes entre dos valores (es decir, áreas de pico) del espectro analizado en cada caso. Seguidamente, se seleccionaron elementos de la matriz significativos (véase la tabla 4 y la descripción correspondiente para el método general). Estos elementos de la matriz significativos constituyeron el distintivo caracterizador.

Basándose en una primera matriz sumatoria para todos los cafés previamente agrupados en el grupo de cafés muy tostados y en una segunda matriz sumatoria para todos los cafés agrupados en el grupo de cafés poco tostados, se generó un distintivo para el café muy tostado y un distintivo para el café poco tostado.

Seguidamente, se extrajeron más cafés, se midieron y se analizaron de forma análoga. Basándose en los distintivos generados de esos otros cafés y en los distintivos ya existentes para el café poco tostado y para el café muy tostado, estos cafés se agruparon en el grupo de cafés muy tostados y poco tostados, respectivamente. Por consiguiente, todos los cafés medidos a ciegas podrían agruparse en el grupo correcto. Esto se demostró comparando la indicación del grado de tueste basada en el distintivo con el grado de tueste indicado por el fabricante del café.

Ahora, se explicarán las figuras 18 y 19 en relación con un ejemplo adicional fuera del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones.

Tercer ejemplo: Identificación de variedades de mostaza. Las semillas de mostaza contienen cientos de compuestos. La proporción de estos compuestos está determinada por las condiciones de crecimiento (influencia ambiental) y la pertenencia a una determinada variedad (influencia genética). Una pequeña parte de una red metabólica muy compleja es adecuada para determinar la pertenencia de una semilla de mostaza a una determinada variedad.

Los inventores pudieron demostrar que 50 rasgos de la compleja red metabólica son adecuados para una clasificación correspondiente (es decir, una clarificación de la variedad respectiva).

Se seleccionaron manualmente las semillas de mostaza que se iban a analizar para excluir la posibilidad de contaminación del material de muestra con piedras pequeñas, estipes, granos de semillas extrañas o semillas de coloración atípica, rotas, germinadas o sucias.

Las semillas seleccionadas (aprox. 2 g) se molieron en un molino mezclador durante 5 minutos a 30 Hz. El material molido se transfirió después de la molienda a un recipiente de polipropileno sellable y, si no se usó inmediatamente para la medición, se almacenó a 4 °C durante no más de 96 horas.

Se mezclaron 150 mg de material molido con 1,5 ml de agua y se mezclaron en el molino mezclador durante 3 minutos a 30 Hz para obtener un extracto acuoso. Se añadieron 50 pl de tampón fosfato de sodio y 25 pl de patrón de RMN (que consistía en 2 mmol/I de propionato de trimetilsililo [TSP] en D<2>O) a 425 pl de este extracto acuoso. A continuación, se transfirió esta mezcla a un tubo de muestra de<r>M<n>de 5 mm para la posterior medición de RMN. La medición se realizó en las mismas condiciones que la medición del extracto de café de acuerdo con el segundo ejemplo.

Esta extracción de mostaza y medición de RMN se repitieron para diferentes clases o tipos de semillas de mostaza. La figura 18 muestra un espectro de RMN del extracto de semilla de mostaza medido de esta manera. El espectro consiste en aprox. 300 picos relevantes. La intensidad en el eje y se representa en unidades arbitrarias con respecto al cambio químico en ppm en el eje x. Se suprimen las señales que se encuentran en el intervalo de resonancias del agua.

El espectro de RMN medido se convirtió en un espectro sintético mediante separación de líneas (para más información, véanse las explicaciones correspondientes con respecto al segundo ejemplo de realización).

La figura 19 muestra un extracto del espectro original (línea continua) junto con su espectro sintético (línea discontinua con espacios amplios) y las integrales correspondientes de los picos observados (línea discontinua con espacios estrechos).

Se seleccionaron 180 picos del espectro sintético y se utilizaron los valores de las áreas de los picos correspondientes para generar una matriz de correlación de 180x180. Los 32400 valores de esta matriz son los valores de los cocientes entre dos valores únicos de las áreas en cada caso. Esta matriz de correlación también puede denominarse matriz de histoidentificadores.

Diferentes mediciones de RMN posteriores de diferentes muestras de mostaza de la misma variedad de mostaza dieron como resultado una pluralidad de matrices de histoidentificadores. Todas estas matrices se sumaron en una matriz de correlación promedio para la respectiva variedad de mostaza. Esto mejora la fiabilidad de los datos obtenidos.

Posteriormente, se repitió todo el procedimiento para otra variedad de mostaza de modo que resultaron dos matrices de correlación promedio, una para cada variedad o grupo.

Seguidamente, se compararon todas las matrices de correlación individuales con ambas matrices de correlación promedio utilizando una matriz delta (matriz de ponderación) que sirve como matriz de multiplicación. Luego, se optimizó la matriz delta de tal manera que la mayoría de las matrices de correlación individuales mostraron una pequeña desviación de la matriz de correlación promedio del mismo grupo pero una desviación alta de la matriz de correlación promedio del otro grupo.

La correspondiente optimización de la matriz delta se explicará ahora con más detalle. Esta optimización es un proceso iterativo. Inicialmente (primera iteración), la matriz delta se llenó con el valor de 1,0 en todos los campos de la matriz. Seguidamente, se incrementó un único valor de 1,0 en un 10 % hasta el valor de 1,1. Si se mejoró la separación entre ambos grupos (es decir, la desviación de la matriz de correlación considerada con respecto a la matriz de correlación promedio del mismo grupo se hizo más pequeña y/o la desviación de la matriz de correlación considerada con respecto a la matriz de correlación promedio del otro grupo se hizo mayor), se utilizó el valor de 1,1 como punto de partida para la segunda iteración. Si la separación entre ambos grupos empeoraba, el valor de 1,0 se reducía en un 10 % hasta 0,9. Si la separación mejoraba, se utilizaba 0,9 como punto de partida para la segunda iteración. En la segunda iteración, el punto de partida respectivo se volvió a subir y/o bajar en un 10 % para lograr una mejor separación de los grupos. También se pueden utilizar factores distintos del 10 %, en donde el factor no necesita ser constante durante la optimización.

Después de una pluralidad de iteraciones, el valor optimizado alcanzó asintóticamente el mejor valor para la separación o asintóticamente cero. Cuando era inferior a un valor umbral predeterminado, se ponía a cero.

A continuación, se repetía este procedimiento para todos los demás valores de la matriz delta. Como resultado, la matriz delta contenía muchos campos que tenían el valor de 0,0 (correlaciones no significativas) y algunos campos que tenían valores más altos (correlaciones significativas). Dicho de otro modo, la matriz delta se simplificó a correlaciones relevantes o significativas. Esta matriz delta ponderada representa el distintivo caracterizador del sistema examinado, es decir, de las variedades de mostaza. Por tanto, el método de generación de un distintivo proporciona una simplificación de numerosas relaciones entre señales individuales a relaciones únicamente significativas. Dicho de otro modo, todos los valores que están presentes en el distintivo se ponderan con respecto a su importancia. La matriz delta así simplificada se multiplicó luego por la matriz de correlación probada. Se produjo una matriz de correlación ponderada que contenía muchos campos que tenían el valor de 0,0 (correlaciones no significativas) y algunos campos que tenían valores altos (correlaciones significativas).

Seguidamente, según las explicaciones anteriores, se generó un distintivo caracterizador específico de la variedad para todas las variedades de mostaza que había que examinar. Posteriormente, de forma análoga, se analizó una muestra de una variedad de mostaza no divulgada (muestra para análisis a ciegas). A continuación, se calcularon valores de calificación que eran indicativos de la desviación del distintivo de la muestra para análisis a ciegas de cada uno de los distintivos de las variedades de mostaza ya examinadas. Para concretar más, se comparó una matriz de correlación ponderada de la muestra que había que probar con matrices de correlación promedio de variedades de mostaza ya analizadas. La ponderación se realizó utilizando la matriz delta optimizada correspondiente (es decir, el distintivo). Los valores de calificación individuales se calcularon de manera análoga al valor de puntuación explicado anteriormente, es decir, según la fórmula:

valor de calificación = (distancia Ai)/(distancia (A sin Ai))

En este caso "Ai" denota una primera matriz de correlación promedio de una única variedad de mostaza (i = 1 a n) y "A" es la suma de las n matrices de correlación promedio de todas las n variedades de mostaza que ya se están analizando. "A sin Ai" por lo tanto denota la suma de las (n-1) matrices de correlación promedio de todas las (n-1) variedades de mostaza que ya se están analizando a excepción de la variedad de mostaza Ai. Por tanto, se calcularon varios valores de calificación (es decir, n valores de calificación), uno por cada distintivo ya existente o variedad de mostaza ya analizada, respectivamente.

Específicamente, el distintivo de la muestra para análisis a ciegas mostró las desviaciones (expresadas como valor de calificación) indicadas en la siguiente tabla 9.

Tabla 9: Valor de calificación del distintivo de la muestra para análisis a ciegas en comparación con los distintivos de _____________________ cuatro variedades de mostaza._____________________

Variedad de mostaza Valor de calificación

Sinus 0,01

Tango 6,78

Seco 5,32

Ascot 13,69

Cuanto menor sea el valor de calificación, menor es la desviación de los distintivos considerados. Por tanto, la muestra para análisis a ciegas podría caracterizarse como una muestra de la variedad de mostaza "Sinus".

Las siguientes tablas 10 y 11 representan datos experimentales adicionales que muestran la identificación inequívoca de la variedad de mostaza de otras muestras para análisis a ciegas.

Tabla 10: Valor de calificación del distintivo de la primera muestra para análisis a ciegas adicional en comparación con los distintivos de once variedades de mostaza.

Variedad de mostaza Valor de calificación

Tango 0,06

Sirtaki 2,18

Albatros 3,47

Seco 3,61

Litember 4,36

Radena 4,48

Semper 7,14

Bardena 7,31

Sinus 9,96

Accent 10,17

Ascot 24,66

Por tanto, la primera muestra para análisis a ciegas adicional se pudo asignar sin ambigüedades a la variedad de mostaza "Tango".

Tabla 11: Valor de calificación del distintivo de la segunda muestra para análisis a ciegas adicional en comparación ____________con los distintivos de once variedades de mostaza.____________

Variedad de mostaza Valor de calificación

Sinus 0,16

Ascot 2,17

Bardena 3,58

Seco 3,60

Semper 4,54

Albatros 6,74

Radena 6,92

Litember 7,61

Accent 10,28

Sirtaki 11,86

Tango 19,60

Por tanto, la segunda muestra para análisis a ciegas adicional se pudo asignar sin ambigüedades a la variedad de mostaza "Sinus".

Al repetir el procedimiento explicado para las muestras para análisis a ciegas adicionales, la mayoría de esas muestras pudieron asignarse correctamente a las respectivas variedades de mostaza. La sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) estuvo en el intervalo del 91 al 100 % para las muestras para análisis a ciegas pertenecientes a una de las once variedades de mostaza indicadas anteriormente. Las muestras que no pudieron ser asignadas correctamente a "su" variedad de mostaza mostraron, sin embargo, un valor de calificación muy bajo para la variedad correcta, pero un valor de calificación incluso ligeramente inferior para una variedad de mostaza falsa.

Dentro de todo el análisis, se examinaron diferentes lotes de variedades individuales de mostaza a fin de evaluar si se debe considerar que las diferencias específicas de los lotes, como la ubicación del cultivo o el clima de cultivo, tienen una influencia significativa en el distintivo caracterizador. Resultó que los distintivos caracterizadores son básicamente independientes de criterios específicos del lote, de modo que es posible una identificación independiente del lote de diferentes variedades de mostaza.

Dado que el distintivo de cada muestra que hay que clasificar o identificar debe compararse con todos los distintivos existentes, la exactitud del método aumenta con un número cada vez mayor de distintivos almacenados.

Ahora, se explicará la figura 20 en relación con otro ejemplo (cuarto ejemplo) fuera del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones.

Cuarto ejemplo:

Seguimiento del desarrollo terapéutico en el tratamiento del carcinoma de próstata

En el tratamiento del carcinoma de próstata, generalmente se utilizan superagonistas de la hormona liberadora de gonadotropina como la leuprorelina, goserelina o buserelina para la inhibición de los andrógenos. Estos superagonistas se aplican en forma de un implante destinado a inhibir el crecimiento tumoral dependiente de testosterona durante un período de tiempo más prolongado. Los implantes suelen estar diseñados para liberar el fármaco durante 1 mes.

En esta realización ilustrativa, se examinó si el tratamiento de inhibición de andrógenos conduce a un cambio significativo en el metabolismo del tumor que puede observarse examinando muestras de orina de pacientes y analizándolas mediante técnicas de RMN a través de distintivos caracterizadores.

En el presente estudio se incluyeron 28 pacientes que padecían carcinoma de próstata y estaban sometidos a un tratamiento con leuprorelina o goserelina. Se extrajo la orina de estos pacientes y se analizó mediante espectroscopia de RMN. La preparación de la muestra y la medición de RMN se realizaron de manera análoga al segundo ejemplo (usando 425 pl de orina en lugar de extracto de café).

Como primer grupo, se analizaron los espectros de RMN de la orina obtenidos el día 0 (antes de implantar un implante de leuprorelina o goserelina). Estos espectros de RMN representaban el metabolismo tumoral sin inhibición de andrógenos.

Los espectros de RMN de orina obtenidos el día 28 (en este día, el primer implante fue reemplazado por un segundo implante nuevo) se analizaron como segundo grupo. Estos espectros de RMN representaban el metabolismo tumoral con inhibición de andrógenos.

Esas líneas de los espectros de RMN de ambos grupos, gracias a las cuales fue posible una distinción estadísticamente significativa entre ambos grupos, se separaron. Al hacerlo, se obtuvo una matriz de correlación ponderada (matriz delta) que indica correlaciones significativas entre líneas o picos significativos (para ver el principio general, véanse los ejemplos de realización anteriores). Instantáneamente, se elaboró una matriz de correlación de 61x61.

Para la validación, se analizó de forma análoga la orina de hombres que no tenían carcinoma de próstata. Los espectros de RMN de este tercer grupo podrían diferenciarse inequívocamente de los espectros de RMN del primer y segundo grupo. Por tanto, los distintivos caracterizadores (representados por la respectiva matriz delta) creados para los pacientes con carcinoma de próstata (tanto para el grupo 1 como para el grupo 2) eran muy adecuados para diferenciar a las personas sanas de las enfermas y, por lo tanto, se basaban obviamente en señales específicas del tumor.

Posteriormente, las sustancias causantes se asignaron a los picos que se identificaron como significativos. Esta asignación se realizó mediante la aplicación de tres grupos de significancia (asignación asegurada; asignación probable; asignación posible). El resultado de la asignación se muestra en la siguiente tabla 12.

Tabla 12: Asignación de sustancias a picos significativos.

Significación Metabolito Señal/ppm

segura -<Citrato 2,669/2,673/2,695/2,699>

Creatinina 4,048

Malonato 3,111

metilmalonato 1,205

Metilguanidina 2,829

altamente Succinato de dimetilo<1,213>

<probable>Hidroxi-isovalerato 1,232

Tartrato 4,347

Salicilato 7,019/7,025/7,489

Hipoxantina 8,194

posible hidroxibutirato 1,205

Alotreonina 1,205

1-Metil-urato 3,259

N-óxido de trimetilamina 3,259

Glicolato 3,914

5-Hidroxi-metiluracilo____________ 4,347

Ácido 3-hexeno-diona___________ 5,698

______ Xantina__________________7,935 _____Formiato_________________ 8,371

Ácido graso (derivado) 2,167

(continuación)

Significación Metabolito Señal/ppm

Histamina 7,984/7,990/8,000

Dimetil-aminopurina 7,984/7,990/8,000

Benzoato 7,885

Se sabe por la técnica anterior que la biosíntesis de ácidos grasos y fosfolípidos, la biosíntesis de proteínas y aminoácidos y la biosíntesis de nucleótidos se activa en las células tumorales. Además, en las células tumorales puede observarse un aumento de las especies reactivas del oxígeno, una mayor aparición de metabolitos tóxicos (como nucleótidos no canónicos) y la activación de fuentes de energía inusuales y múltiples.

A diferencia de otros tejidos, el epitelio prostático muestra una acumulación de citrato debido a una limitación en la generación de isocitrato. Las células malignas del carcinoma de próstata pierden esta capacidad de acumulación de citrato. Mientras que la concentración de citrato en el tejido prostático sano es de aprox. 20.000 nmol/g, tan solo es de 500 nmol/g (es decir, inferior al 2,5 %) en el tejido maligno.

Dado que el citrato es una molécula primordial para la regulación general del metabolismo, se espera que un cambio tan drástico en la concentración de citrato influya en la biosíntesis de aminoácidos, proteínas y nucleótidos. La concentración de citrato y de productos intermedios del ciclo del ácido cítrico tiene una influencia directa sobre la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los lípidos. Por tanto, parece muy sensato comprobar que las señales provocadas por el citrato desempeñan un papel importante en el distintivo que caracteriza el metabolismo tumoral.

La creatinina también es un producto metabólico característico que podría identificarse sin ambigüedades por desempeñar un papel importante en el distintivo específico del metabolismo tumoral. La creatinina es el producto final del metabolismo energético muscular y se excreta como producto de desecho en la orina. Otras sustancias identificadas están estrechamente relacionadas con los productos intermedios del ciclo del ácido cítrico. Sin entrar en detalles, los inventores pudieron asignar un papel metabólico relevante a casi cada una de las sustancias enumeradas en la tabla 12. Por tanto, la composición del distintivo caracterizador no es arbitraria, sino que de hecho refleja el metabolismo del tumor.

La figura 20 representa una red de sustancias interrelacionadas, cuyas señales de RMN se tuvieron en cuenta al generar el distintivo caracterizador. "U1", "U2" y "U3" designan tres sustancias aún no identificadas. Algunas sustancias exógenas como el salicilato y el tartrato probablemente pueden atribuirse a medicamentos. Aunque no están directamente relacionadas con el metabolismo tumoral, podrían reflejar efectos secundarios debido a la energía metabólica disponible para procesos metabólicos "normales".

Seguidamente, se analizaron los espectros de RMN de la orina obtenidos el día 85 (se administró un tercer implante el día 58) como cuarto grupo. Estos espectros de RMN también representaban el metabolismo tumoral con la inhibición de los andrógenos.

Se generó un nuevo distintivo tumoral caracterizador utilizando los espectros de RMN del primer grupo (día 0) y del cuarto grupo (día 85). Al hacerlo, esas líneas de los espectros de r Mn de ambos grupos, gracias a las cuales fue posible una distinción estadísticamente significativa entre ambos grupos, se separaron. A continuación, se obtuvo una matriz de correlación ponderada (matriz delta) que indica correlaciones significativas entre líneas o picos significativos (para ver el principio general, véanse los ejemplos anteriores). Instantáneamente, se elaboró una matriz de correlación de 61x61.

Este segundo distintivo tumoral mostró un alto solapamiento con el primer distintivo tumoral (construido en función de los espectros de RMN del primer y segundo grupo). Por ejemplo, se pudieron identificar el citrato, la creatinina, el metilmalonato, elp-hidroxi-isovalerato, la xantina y la hipoxantina como sustancias causantes de las líneas consideradas en este nuevo distintivo. Esto subraya la importancia de estas sustancias para controlar los cambios en el metabolismo tumoral.

El segundo distintivo tumoral fue validado como el primer distintivo tumoral, es decir, comparándolo con el distintivo de hombres que no tienen carcinoma de próstata. La evolución observada de los valores de calificación puede utilizarse como indicación de la progresión del tratamiento antitumoral: Cuanto menor sea la desviación entre el distintivo de un paciente con tumor sometido a tratamiento y el distintivo de una persona que no padece tumor, mejor funciona el tratamiento. Al controlar el desarrollo de los valores de calificación a lo largo del tiempo, se puede realizar el control y la evaluación del tratamiento.

Resumiendo, se pudo demostrar que el tratamiento de inhibición de andrógenos conduce a un cambio significativo en el metabolismo del tumor que puede observarse examinando muestras de orina de pacientes y analizándolas mediante técnicas de RMN por medio de distintivos caracterizadores. Además, podría establecerse que es posible controlar la progresión del tratamiento eficazmente mediante el uso de distintivos caracterizadores.

Pasando ahora a la figura 21, se ilustra una representación esquemática de un sistema informático, en el que se puede ejecutar unsoftware300 ilustrativo que es adecuado para llevar a cabo un método como se ha explicado anteriormente. Estesoftware300 se carga en la memoria 310 de un ordenador 320. A continuación, el procesador 330 ejecuta elsoftware.Seguidamente, los datos experimentales 340 en forma de un resultado de análisis numérico de una muestra se introducen en la memoria 310 del ordenador. Entonces, elsoftware300 selecciona (ya sea automáticamente o mediante una entrada del usuario) un subconjunto de valores numéricos de los datos experimentales 340. El procesador 330 calcula entonces cocientes como relaciones matemáticas entre todos los valores seleccionados, en donde se calcula un cociente entre dos valores a la vez. Se produce una matriz de n2 valores, en donde n denota el número de valores seleccionados.

Posteriormente, el procesador 340 determina la significación de los cocientes simples, mientras se sigue ejecutando elsoftware300. Ya se han explicado anteriormente diferentes métodos para este fin. Esta etapa produce una matriz que consiste en muchos ceros y algunos valores diferentes de cero. Esta matriz es el distintivo caracterizador que se va a generar y que luego se almacena en la memoria 310. Es posible comparar este distintivo con otros distintivos almacenados para calcular la distancia entre los distintivos. El resultado de esta comparación se puede visualizar en un sistema de representación 350 del ordenador 320. Este resultado puede, por ejemplo, ser información acerca de:

a) la probabilidad de que una persona sufra el rechazo de un riñón trasplantado,

b) la pertenencia de la muestra a una determinada variedad de café,

c) la pertenencia de la muestra a una determinada variedad de mostaza,

d) el efecto de un tratamiento contra un tumor.

La figura 22 representa esquemáticamente un diagrama de flujo de un método para caracterizar una muestra explicado anteriormente. Se proporcionan datos de RMN 400 como resultado del análisis de una muestra. En la etapa 410, se calcula un valor de una relación matemática (por ejemplo, un cociente) entre al menos dos valores de los datos de RMN 400. Preferentemente, se calculan muchos valores de la relación matemática para pares individuales de dos valores de los datos de RMN 400 de manera que se obtiene una matriz de correlación en la etapa 410. Seguidamente, en la etapa 420, se genera un distintivo caracterizador basándose en la matriz obtenida en la etapa 410. Este distintivo puede, por ejemplo, ilustrarse en forma de una matriz delta. Los datos 400 y las etapas de procesamiento 410 y 420 se pueden resumir como el método 430.

La figura 23 representa esquemáticamente un diagrama de flujo de un método para caracterizar un sistema explicado anteriormente. En primer lugar, en la etapa 500, se toma una muestra procedente de un sistema que se ha de caracterizar. A continuación, esta muestra se analiza en la etapa 510 mediante un método de análisis como la espectroscopia de RMN. Se obtiene un resultado del análisis. Este resultado del análisis se utiliza para llevar a cabo dicho método 430 para caracterizar una muestra (véase la figura 22 para más detalles). Por este método, se obtiene un distintivo caracterizador. En la etapa 520, el distintivo obtenido se compara con un distintivo comparativo. En la etapa 530, se determina una desviación entre el distintivo generado en la etapa 430 y el distintivo comparativo. Esta desviación puede, por ejemplo, ser una puntuación o un valor de calificación. En la etapa 540, se asigna la desviación al sistema.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una sustancia que se selecciona del grupo que consiste en metilmalonato, lactato, succinato de metilo, pcresol, 3-hidroxi-isovalerato, citrato, metilguanidina, malonato, taurina, fenilacetilglicina, trigonelina, a-glucosa, acetilcarnitina, acetato de fenilo e hipurato como marcador en un método para determinar el riesgo de rechazo renal en un individuo a quien se le ha realizado un trasplante de riñón, en donde el método requiere analizar una muestra de orina del individuo con espectroscopia de RMN para obtener una señal correspondiente a una concentración de la sustancia que se va a utilizar como marcador.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,caracterizado por quese utilizan al menos dos sustancias como marcador.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,caracterizado por quese utiliza al menos uno de los siguientes pares de sustancias como marcador: lactato y taurina; lactato y acetato de fenilo; lactato y fenilacetilglicina; succinato de metilo y acetato de fenilo; succinato de metilo y fenilacetilglicina; 3-hidroxi-isovalerato y acetato de fenilo; 3-hidroxiisovalerato y fenilacetilglicina; trigonelina y malonato; taurina y malonato; taurina y citrato; acetato de fenilo y malonato; fenilacetilglicina y malonato; acetato de fenilo y p-cresol; fenilacetilglicina y p-cresol; malonato y p-cresol; malonato y metilmalonato; citrato y metilguanidina; p-cresol y metilmalonato; metilmalonato y metilguanidina.