ES2957622T3

ES2957622T3 - Proteína de cápside de rAAV modificada para terapia génica

Info

Publication number: ES2957622T3
Application number: ES19701080T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Douglas Finn; Dirk Grimm; Kathleen Börner; Susanne Anna Snoek; Niels Broekstra; Der Sanden Sabine Maria Gertrude Van
Original assignee: Universitaet Heidelberg; MeiraGTx UK II Ltd
Current assignee: Universitaet Heidelberg; MeiraGTx UK II Ltd
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: WO2019141765A1; FI3740222T3; KR20200135768A; JP7389040B2; CA3087910A1; EA202091712A1; SI3740222T1; SG11202006056RA; HUE062774T2; NZ767106A; US20200354744A1; EP3740222A1; EP3740222B1; AU2019209595B2; HRP20231126T1; MX2020006764A; BR112020014625A2; IL275838B1; IL275838A; PL3740222T3

Abstract

La invención se refiere a viriones de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para terapia génica, en los que los viriones rAAV comprenden una nueva proteína de la cápside. En particular, la invención se refiere al uso de tales viriones en terapia génica para el tratamiento de una enfermedad artrítica, tal como por ejemplo artritis reumatoide, o síntomas de la misma, preferiblemente mediante administración intraarticular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína de cápside de rAAV modificada para terapia génica

Campo de la invención

[0001] La invención se define por las reivindicaciones y se refiere al campo de la terapia génica basada en virus adenoasociado recombinante (rAAV), en particular al uso de una cápside mutante de rAAV en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica.

Antecedentes de la invención

[0002] Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) han demostrado unos excelentes perfiles de seguridad y eficacia para la administración de genes en seres humanosin vivo.Por lo tanto, los vectores de rAAV se han utilizado ampliamente para terapia génicain vivoy han demostrado ser seguros y eficaces en modelos preclínicos, al igual que en pruebas clínicas. Los vectores rAAV han sido exitosos en varias pruebas clínicas de terapia génica para un abanico de enfermedades que incluye hemofilia B, hemofilia A, fibrosis quística, deficiencia de alfa-1 antitripsina, atrofia muscular espinal (SMA), enfermedad de Parkinson, distrofia muscular de Duchenne y amaurosis congénita de Leber (Selotet al.,Current Pharmaceutical Biotechnology, 2013, 14, 1072-1082). Se ha concedido autorización de comercialización en Europa a alipogén tiparvovec (Glybera®; uniQure) como terapia génica para el tratamiento de la deficiencia de lipoproteína-lipasa (LPLD). Posteriormente, se concedió aprobación de medicamento de terapia génica para talimogén laherparepvec a base de virus de herpes para el tratamiento de cáncer de piel (T-Vec, Imlygic®, Amgen) y para la terapia génica Strimvelis basada en retrovirales de células madreex vivopara el tratamiento de ADA-SCID (GSK).

La terapia génica basada en vector rAAV también se ha aplicado en artritis reumatoide (RA), que es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta al ~1 % de la población. La patología de RA se extiende en toda la articulación sinovial. La naturaleza localizada de la articulación hace que la terapia génicain vivoresulte muy atractiva. Se han aplicado terapias que proporcionan proteínas antiinflamatorias dirigidas a cambiar el equilibrio en RA hacia un estado antiinflamatorio.

[0003] Gran parte del trabajo se ha centrado en el desarrollo de proteínas de cápsides de AAV con propiedades deseadas. Tales propiedades pueden incluir mayor eficiencia de transducción, tropismo de tejido/órgano, no direccionamiento de tejidos/órganos no deseados, o evitación de anticuerpos de neutralización preexistentes.

[0004] No obstante, sigue existiendo la necesidad en la técnica de mejorar aún más vectores de terapia génica de rAAv. En particular, existe la necesidad de mejorar el uso de vectores de terapia génica de rAAV en la enfermedad artrítica y, más precisamente, para mejorar la eficiencia de administrar material genético al tejido dirigido, como la articulación sinovial o tipos de célula específicos en la articulación sinovial, preferiblemente a sinoviocitos de tipo fibroblasto (FLS).

Breve descripción de la invención

[0005] La invención se define mediante las reivindicaciones. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una proteína de cápside modificada para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas. La proteína de cápside modificada comprende, en la parte C-terminal de la proteína, una secuencia de aminoácidos Z, cuyos residuos están expuestos en la superficie de la proteína de cápside, y donde la secuencia de aminoácidos Z:

a. comprende o consiste en una secuencia de residuos de aminoácidos de la fórmula I:

y - G - Q - x - G -(x)3 - R -(x)3 - y - A - Q - A - A

donde x representa un único residuo de aminoácido y donde y representa 0, 1 o 2 residuos de aminoácido; y b. está presente en una ubicación que corresponde a una posición 100 - 200, preferiblemente 120 - 180, más preferiblemente 130 - 170, más preferiblemente 140 - l 6o residuos de aminoácido del C-terminal de una proteína de cápside AAV de tipo silvestre.

[0006] Preferiblemente, los residuos de aminoácidos de la fórmula I se exponen en la superficie de la proteína de cápside. En una forma de realización preferida, la secuencia Z está comprendida en la proteína de cápside modificada en una ubicación representada por la fórmula II:

EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z -(x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG donde Z, x e y son tal y como se define anteriormente; y donde n es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.

[0007] En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un virión rAAV que comprende una proteína de cápside modificada para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de síntomas asociados con una enfermedad artrítica, donde la proteína de cápside comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 1 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 1 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 11 ; ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID n .0: 2 y donde los aminoácidos en las posiciones 585 - 599 de SEQ ID N.º: 2 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID n .0: 10; iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID n .0: 3 y donde los aminoácidos en las posiciones 587 - 601 de SEQ ID N.º: 3 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 9; iv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 4 y donde los aminoácidos en las posiciones 586 - 600 de SEQ ID n .0: 4 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 8; v) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID n .0: 5 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID n .0: 5 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID n .0: 9; vi) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 6 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 6 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 8; y vii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 7 y donde los aminoácidos en las posiciones 587 - 601 de SEQ ID N.º: 7 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 12; donde la proteína de cápside modificada proporciona al menos un incremento de dos veces en la expresión en comparación con una proteína de cápside no modificada con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 13 - 19, cuando se evalúa en las mismas condiciones, donde preferiblemente la proteína de cápside no modificada presenta la secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 19 o tiene el mismo serotipo que la proteína de cápside modificada.

[0008] En una forma de realización preferida, la proteína de cápside modificada proporciona al menos un incremento de dos veces en la expresión en células FLS humanas en comparación con la proteína de cápside no modificada con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n .0: 13 - 19, cuando se evalúa en las mismas condiciones, donde preferiblemente la proteína de cápside no modificada presenta la secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 19<o>tiene el mismo serotipo que la proteína de cápside modificada.

[0009] Alternativamente,<o>en combinación con cualquiera de las formas de realización precedentes, en una forma de realización preferida de la presente invención, la proteína de cápside comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No : 1 - 7.

[0010] Alternativamente,<o>en combinación con cualquiera de las formas de realización precedentes, en una forma de realización preferida de la presente invención, el virión rAAV comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. Preferiblemente, el virión comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés. Aún más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés se localiza entre dos secuencias ITR de AAV.

[0011] En una forma de realización preferida, el producto génico de interés trata, evita<o>suprime síntomas asociados con una enfermedad artrítica, donde preferiblemente el producto génico de interés se selecciona del grupo que consiste en interleucinas, inmunomoduladores, anticuerpos, ARNhc, miARN, ARN guía, factores de crecimiento, proteasas, nucleotidasas/nucleosidasas, péptidos, inhibidores de proteasa, inhibidores, enzimas y combinaciones de los mismos, y donde, más preferiblemente, el producto génico de interés es al menos uno de CD39, CD73 e IFN-p.

[0012] Alternativamente, o en combinación con cualquiera de las formas de realización precedentes, en una forma de realización preferida de la presente invención, el virión rAAV comprende al menos uno de: (i) un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al menos un ARN guía; donde el o cada ARN guía es sustancialmente complementario a una(s) secuencia(s) de polinucleótido objetivo en un genoma; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una nucleasa; donde la nucleasa forma un complejo de ribonucleasa con el ARN guía, y donde el complejo de ribonucleasa hace roturas de doble cadena del ADN (DSDB) específicas del sitio en el genoma.

[0013] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición rAAV para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o inflamación de una o más articulaciones artríticas, y donde la composición rAAV comprende un virión rAAV según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, la composición rAAV comprende, además, una cápside vacía en una proporción entre cápside vacía y virión rAAV de al menos 1:1, al menos 5:1 o al menos 10:1.

[0014] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición rAAV y a un inmunosupresor para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o inflamación de una o más articulaciones artríticas, y donde la composición rAAV es una composición rAAV según la invención, y preferiblemente donde el tratamiento o prevención comprende la administración de la composición rAAV y la administración del inmunosupresor a un individuo.

[0015] Alternativamente, o en combinación con cualquiera de las formas de realización anteriores, en una forma de realización preferida de la presente invención, la enfermedad artrítica se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA), artritis reumatoide juvenil, osteoartritis (OA), gota, pseudogota, espondiloartritis (SpA), artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis séptica, artritis, artritis idiopática juvenil, reemplazo articular y enfermedad de Still.

[0016] Alternativamente, o en combinación con cualquiera de las formas de realización precedentes, en una forma de realización preferida de la presente invención, el virión rAAV o la composición rAAV se administra sistémicamente y/o localmente. En una forma de realización preferida, al menos uno de la composición rAAV y el inmunosupresor se administra localmente. Preferiblemente, la administración local es administración intraarticular.

Descripción detallada de la invención

[0017] Los inventores han descubierto que un virión de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una proteína de cápside modificada es sorprendentemente eficiente para transducir células, y en particular eficiente para transducir células de la articulación sinovial. Como los sinoviocitos de tipo fibroblasto (FLS) son típicamente la célula diana principal en la articulación en el tratamiento de enfermedades artríticas, tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, el objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas de cápside que sean mejoradas en una o más de las siguientes propiedades: i) mayores niveles de expresión en el tejido sinovial, en particular en FLS; ii) tropismo de tejido sinovial mejorado, en particular tropismo mejorado para fLS; y/o iii) no direccionamiento mejorado a tejidos/órganos no deseados tras la administración de rAAV en comparación con proteínas de cápside conocidas en la técnica. En particular, estas propiedades del virión rAAV que comprende una proteína de cápside modificada de la invención se mejoran en comparación con las proteínas de cápside no modificadas, preferiblemente la proteína de cápside de tipo silvestre del mismo serotipo que la proteína de cápside modificada y/o proteínas de cápside AAV5. Se ha establecido previamente que la cápside AAV5 da lugar a los mayores niveles de expresión de FLS en comparación con otros serotipos AAV (Adriaansenet al.(2005) Ann Rheum Dis 64:1677-1684; Apparaillyet al.(2005) Hum. Gene Ther. 16:426-434). Puesto que la cápside es la que confiere las propiedades de tropismo al tejido/célula, las cápsides modificadas descritas en esta invención tienen la propiedad de potencial de transducción de FLS mejorado, preferiblemente en comparación con AAV5 sin modificar. En particular, se prefiere que las proteínas de cápside de la presente invención proporcionen mayores niveles de expresión en el tejido sinovial, en particular en FlS, preferiblemente tras la administración intraarticular, en comparación con proteínas de cápside no modificadas (esto es, la misma proteína de cápside sin la modificación que se va a evaluar, preferiblemente del mismo serotipo que las proteínas de cápside modificadas), preferiblemente proteínas de cápside no modificadas de tipo silvestre (preferiblemente del mismo serotipo que las proteínas de cápside modificadas), más preferiblemente proteínas de cápside AAV5 o wtAAV5 no modificadas.

[0018] Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un virión rAAV que comprende una proteína de cápside modificada para su uso tal y como se define en las reivindicaciones. El virión rAAV tal y como se define en el presente documento es particularmente útil para su uso en terapia génica.

[0019] Según se utiliza en el presente documento, "terapia génica" es la inserción de secuencias de ácido nucleico (como, por ejemplo, un transgén (también denominada secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés) según se define a continuación) en las células y/o tejidos de un individuo para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno o para tratar o prevenir los síntomas de una enfermedad o trastorno.

[0020] AAV puede infectar tanto células en división como células quiescentes, y la infección ocurre por interacción de las proteínas de cápside con un receptor de membrana celular, seguida de endocitosis del virión AAV. AAV pertenece al géneroDependovirus,que a su vez pertenece a la subfamilia de losParvovirinae,también denominados parvovirus, que son capaces de infectar a vertebrados.Parvovirinaepertenece a una familia de pequeños virus animales de ADN, es decir, la familiaParvoviridae.Como se puede deducir a partir del nombre de su género, los miembros de losDependovirusson únicos en cuanto a que normalmente requieren la coinfección con un virus auxiliar, tal como un adenovirus o virus del herpes para la infección productiva en cultivo celular. El géneroDependovirusincluye a AAV, que infecta normalmente a seres humanos, y virus relacionados que infectan a otros animales de sangre caliente (por ejemplo, virus adenoasociados bovinos, caninos, equinos y ovinos). Se describe información adicional sobre parvovirus y otros miembros de losParvoviridaeen Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Capítulo 69 en Fields Virology (3.a Ed., 1996).

[0021] La organización genómica de todos los serotipos conocidos de AAV es muy similar. El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenario lineal que tiene menos de aproximadamente 5000 nucleótidos (nt) de longitud. Las repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias de nucleótidos de codificación únicas para las proteínas de replicación no estructurales (Rep) y las proteínas estructurales (VP). Las proteínas VP (VP1, VP2 y VP3) forman la cápside o recubrimiento de la proteína con la ayuda de la proteína activadora del ensamblaje (AAP) (para algunos serotipos), que se codifica en un marco de lectura abierto alternativo superpuesto con el de VP2/VP3. Los nucleótidos terminales son autocomplementarios y se organizan de modo que se pueda formar un dúplex intramolecular energéticamente estable formando una horquilla en forma de T. El tamaño de los nucleótidos terminales depende del serotipo. Por ejemplo, en el caso de Aa V2, del terminal 145 nt, 125 nt son autocomplementarios y los 20 nt restantes siguen siendo monocatenarios. Estas estructuras de horquilla funcionan como origen para la replicación de ADN viral, sirviendo como cebadores para el complejo de ADN polimerasa celular. Tras la infección con AAV de tipo silvestre (wtAAV) en células de mamíferos, se expresan las proteínas Rep (es decir, Rep78 y Rep52) a partir de ARNm transcritos por el promotor p5 y el promotor p19, respectivamente. Ambas proteínas Rep desempeñan una función en la replicación del genoma viral. Un evento de empalme en los resultados ORF de Rep en la expresión de realmente cuatro proteínas Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40). Sin embargo, se ha demostrado que las proteínas Rep78 y Rep52, codificadas por los ARNm sin empalme, en células de mamíferos son suficientes para la producción de vector AAV. Además, la producción de wtAAV o rAAV en células de mamíferos se basa en una combinación de uso alterno de dos sitios de aceptor de empalme y la utilización subóptima de un codón de iniciación ACG para VP2, que garantiza la expresión adecuada de las tres proteínas de cápside en una proporción aproximada de 1 :1 :1o (VP1:VP2:VP3).

[0022] Un "virión rAAV" (también denominado en el presente documento "vector rAAV" o "transgén vector rAAV"), según se utiliza en el presente documento, se refiere a una cápside AAV que comprende una secuencia de ácidos nucleicos no nativa. Dicha secuencia en rAAV está generalmente flanqueada por secuencias ITR, preferiblemente de wtAAV, y codifica preferiblemente un producto génico de interés, tal como, por ejemplo, unos brazos de homología o transgén. Dicho de otro modo, un virión rAAV se refiere a un genoma rAAV, que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés y (ii) al menos una secuencia ITR de AAV, encapsidada por proteínas de cápside. Un genoma rAAV puede tener uno o preferiblemente todos los genes wtAAV delecionados, pero aun así puede comprender secuencias de ácido nucleico ITR funcionales. Preferiblemente, el virión rAAV no comprende ninguna secuencia de nucleótidos que codifique proteínas virales, como los genesrep(replicación) ocap(cápside) de AAV. Por lo tanto, un virión rAAv se distingue de un virión wtAAV, ya que todo o una parte del genoma viral se ha sustituido por una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés, que es un ácido nucleico no nativo con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos AAV según lo definido en el presente documento.

[0023] El virión rAAV que comprende una proteína de cápside modificada de la invención es para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado a una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas. El uso médico (por ejemplo, terapia génica para tratamiento o prevención de (síntomas asociados con) enfermedad artrítica) descrito en el presente documento se formula como un virión rAAV según la invención para su uso como un medicamento para la prevención o el tratamiento de la(s) enfermedad(es) y/o trastorno(s) definido(s) en el presente documento. La proteína de cápside modificada comprende en la parte C-terminal de la proteína una secuencia de aminoácidos Z tal y como se define en el presente documento, cuyos residuos están expuestos en la superficie de la proteína de cápside.

[0024] Según se utilizan en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" o "tratando" se refieren a la aplicación o administración de un virión rAAV para su uso según la invención a un sujeto que tiene una enfermedad artrítica, donde el objeto es curar, revertir parcial o completamente, aliviar, mejorar, inhibir, retrasar, suprimir, ralentizar o detener la progresión o gravedad de una enfermedad artrítica, o de los síntomas asociados a la enfermedad artrítica. El término "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de la enfermedad artrítica. El tratamiento es generalmente "eficaz" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Alternativamente, el tratamiento es "eficaz" si la progresión de la enfermedad artrítica se reduce o se detiene. Es decir, "tratamiento" no solo incluye la mejora de síntomas o marcadores, sino también un cese o al menos una ralentización del progreso o empeoramiento de los síntomas que se esperaría en ausencia de tratamiento. Entre los resultados clínicos beneficiosos o deseados se incluyen, aunque de forma no limitativa, el alivio de uno o más síntoma(s), la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, el retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, y la remisión (parcial o total), ya sea detectable o no detectable. El término "tratamiento" de una enfermedad artrítica incluye también proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad artrítica (incluyendo tratamiento paliativo). Según se utiliza en el presente documento, el término "prevenir", "prevención", o "preventivo/a(s)" (también denominado profiláctico) se refieren a la aplicación o administración de un virión rAAV para su uso según la invención a un sujeto que tiene una predisposición hacia una enfermedad artrítica, con el fin de retrasar o evitar su aparición, aliviar, mejorar, mitigar, inhibir la progresión, reducir la gravedad, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una futura enfermedad artrítica. Por lo tanto, un virión rAAV para su uso según la invención se puede administrar a un sujeto que no muestre señales de una enfermedad artrítica y/o a un sujeto que solo muestre señales tempranas de una enfermedad artrítica, preferiblemente con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada con la enfermedad artrítica.

[0025] El término "curar" o "curación", según se utiliza en el presente documento, se refiere a aliviar completamente uno o más, preferiblemente todos, los síntomas o características de una enfermedad artrítica. El término "retrasar" o "retraso", según se utiliza en el presente documento, se refiere a retrasar la aparición y/o inhibir la progresión y/o reducir la gravedad de uno o más de los síntomas o características de la enfermedad artrítica.

[0026] En una forma de realización preferida, la proteína de cápside modificada de la invención según lo definido por las reivindicaciones proporciona un incremento de al menos dos veces en la expresión en comparación con una proteína de cápside no modificada, cuando se evalúan en las mismas condiciones. Preferiblemente, la proteína de cápside no modificada es una proteína de cápside del mismo serotipo que la proteína de cápside modificada, pero sin la modificación que se va a evaluar. Más preferiblemente, la proteína de cápside no modificada es una proteína de cápside de tipo silvestre (wt) del mismo serotipo que la proteína de cápside modificada, donde la proteína de cápside wt tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 13 - 19. Alternativamente, se prefiere que la proteína de cápside no modificada tenga una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 13 - 19. Más preferiblemente, la proteína de cápside no modificada tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID N.º: 19. Las proteínas de cápside no modificadas preferidas pueden depender del tejido al que se va a dirigir el virión rAAV. Por ejemplo, un rAAV con proteínas de cápsides AAV5 parece ser un virión de elección para células FLS (Apparaillyet al.(2005) Human Gene Therapy 16(4):426-434; Adriaansenet al.(2005) Ann. Rheum. Dís. 64(12):1677-1684) y, por lo tanto, sin tener en cuenta el serotipo original de los viriones rAAV mutantes, el virión de control rAAV comprende preferiblemente proteínas de cápside AAV5, más preferiblemente proteínas de cápside AAV5 de tipo silvestre (wtAAV5), más preferiblemente la proteína de cápside AAV5 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID N.º:19, aún más preferiblemente el virión de control rAAV es un virión rAAV5. Un virión de control Raav es un virión rAAV que comprende proteínas de cápside no modificadas tal y como se define aquí en lugar de proteínas de cápside modificadas. En una forma de realización preferida, el virión rAAV (que comprende proteínas de cápside modificadas) proporciona una mayor expresión tras la transducciónin vitroen sinoviocitos de tipo fibroblasto de pacientes con artritis reumatoide (RA-FLS) y/o en células HEK 293, preferiblemente HEK293T, en comparación con el mismo virión rAAV con proteínas de cápside no modificadas según lo definido en el presente documento en lugar de proteínas de cápside modificadas, usando un método según se describe en los Ejemplos. Dicho de otro modo, además de las proteínas de cápside, el virión rAAV y el virión de control rAAV son preferiblemente idénticos. Preferiblemente, la eficiencia de transducción se detecta en un ensayo de transducciónin vitro:midiendo los niveles de expresión de un gen reportero codificado por el transgén, tal como GFP, YFP y/o luciferasa. En una forma de realización preferida, la prueba para determinar la expresión es un ensayo de transducciónin vitrocomo se descrito en el Ejemplo 2/3. En resumen, se colocan células RA-FLS (aisladas como se describe en van de Sande MGet al.,(2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427) en placas a 2500 células/pocillo o HEK293T (células de riñón embrionario humano) a 40.000 células/pocillo en una placa de 96 pocilios (DMEM-GlutaMAX-l (Gibco, ref. 31966-021), FBS al 10 % (suero bovino Gold con calor inactivado (Hl), Gibco ref. A15-151), 100 jg/ml de penicilina/100 jg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, ref. P0781, 37 °C / 5 % de CO2). Tras 24 horas, se elimina el sobrenadante y se sustituye por medio (DMEM-GlutaMAX-l (Gibco, ref. 31966-021), 0,001 % de F65 plurónico (Sigma, ref. P5559)) que contiene los viriones mutantes rAAV o los viriones de control rAAV, expresando todos la proteína fluorescente amarilla (yFP) y/o la luciferasa bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV), a una multiplicidad de infección (MOl) de 10.000, 2O.OOO y 100.000. Se pueden utilizar Ios lisados crudos (es decir, sobrenadantes no purificados de células transfectadas con todos Ios plásmidos necesarios para la producción de rAAV y que contienen viriones que expresan reporteros) o AAV purificado (preferiblemente a base de purificación de lodixanol o purificación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (CsCI). Cuatro horas después de la transducción, se añade el medio (DMEM-GlutaMAX-l, 1O % de FBS 1o0 U/ml de penicilina, loO jg/ml de estreptomicina) que contiene doxorrubicina (Sigma, ref. D1515; concentración final 0,4 j M), FBS (concentración final 1 %). Después de 48 horas (HEK293T) o 4-6 días (RA-FLS), se evalúan las células para determinar el porcentaje de células que expresan YFP o luciferasa por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Preferiblemente, el ensayo de transducciónin vitrose realiza múltiples veces con FLS aislado de distintos pacientes, por ejemplo, f Ls aislado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1O o más pacientes.

[0027] Un "serotipo" se define tradicionalmente basándose en una falta de reactividad cruzada entre anticuerpos a un virus en comparación con otro virus. Tales diferencias de reactividad cruzada se deben normalmente a diferencias en secuencias de proteína de cápside/determinantes antigénicos (por ejemplo, debido a diferencias de secuencia en VP1, VP2 y/o VP3 de serotipos AAV). Con la definición tradicional, un serotipo significa que el virus de interés se ha evaluado frente a suero específico para todos serotipos existentes y caracterizados para actividad neutralizante y no se ha encontrado ningún anticuerpo que neutralice el virus de interés. Conforme se descubren más aislados de virus de origen natural y se generan mutantes de cápside, puede haber o no diferencias serológicas con cualquiera de los serotipos existentes actualmente. Por lo tanto, en casos donde el AAV nuevo no tiene diferencia serológica, este AAV nuevo sería un subgrupo o variante del serotipo correspondiente. En muchos casos, las pruebas de serología para actividad neutralizante todavía deben realizarse en virus mutantes con modificaciones de secuencia de cápside para determinar si son de otro serotipo según la definición tradicional de serotipo. Por consiguiente, por conveniencia y para evitar repeticiones, el término "serotipo" se refiere en términos generales a ambos virus serológicamente diferentes (por ejemplo, AAV) así como a virus (por ejemplo, AAV) que no son serológicamente diferentes que pueda haber dentro de un subgrupo o una variante de un serotipo determinado.

[0028] "Transducción" se refiere a la transferencia de un transgén a una célula huésped receptora mediante un vector viral. La transducción de una célula diana mediante un virión rAAV para su uso según la invención conduce a transferir el transgén contenido en ese virión rAAV en la célula transducida. "Célula huésped" o "célula diana" se refiere a la célula en la que se produce la administración de ADN, como los sinoviocitos o células sinoviales de un individuo, o como células FlS aisladas de pacientes o HEK293T células en el caso del ensayo de transducciónin vitro.Los vectores AAV son capaces de transducir tanto células en división como células que no están en división. En una célula que comprende un producto génico de interés, como, por ejemplo, GFP, el producto génico de interés se ha introducido/transferido/transducido mediante "transducción" rAAv de la célula. Una célula en la que se ha introducido el transgén se denomina célula "transducida".

[0029] La célula huésped receptora donde se transduce el transgén es preferiblemente una célula que está afectada por la enfermedad que se va a tratar, como, por ejemplo, células sinoviales, más específicamente FLS, macrófagos, monocitos, neutrófilos, osteoblastos, osteoclastos, condrocitos, linfocitos T, células dendríticas, células plasmáticas, mastocitos, linfocitos B en caso de una enfermedad artrítica. Los términos "sinovia" o "tejido sinovial" o "células sinoviales", según se utilizan en el presente documento, se refieren al revestimiento celular que cubre las superficies no cartilaginosas de las articulaciones sinoviales, como se describe con más detalle en Tak (2000, Examination of the synovium and synovial fluid. En: Firestein GS, Panyani GS, Wollheim FA editores. Rheumatoid Arthritis. Nueva York: Oxford Univ. Press, Inc. 55-68). La sinovia consiste en la capa de revestimiento íntima (o capa de revestimiento sinovial) y el subrevestimiento sinovial (subsinovia), que se fusiona con la cápsula de articulación. La capa de revestimiento íntima comprende macrófagos íntimos (o sinoviocitos de tipo macrófago o sinoviocitos de tipo A) y FLS (o sinoviocitos de tipo B). Por lo tanto, "sinovia" se puede sustituir o es sinónimo de “tejido sinovial”. Una célula sinovial puede incluir cualquier célula presente en la sinovia incluyendo FLS y sinoviocitos de tipo tipo macrófago. Una célula de sinoviocito también pueden ser neutrófilos, células T, células B y/o células del tejido conectivo, que pueden estar todas presentes en la sinovia.

[0030] Los “sinoviocitos de tipo fibroblasto” (FLS) son células de origen mesenquimal que muestran muchas características en común con los fibroblastos, como la expresión de proteínas específicas, por ejemplo, varios tipos de colágenos. Sin embargo, los FLS segregan también proteínas que normalmente están ausentes en otros linajes de fibroblasto, como, por ejemplo, lubricina. Además, los FLS expresan moléculas que son importantes para la mediación de la adhesión celular, como cadherina-11, VCAM-1, varias integrinas y sus receptores. Específica de los FLS es la expresión de CD55 y, por lo tanto, esta proteína se usa típicamente para identificar FLS en la sinovia por inmunohistoquímica. Los FlS representan un tipo de célula especializada situada dentro de las articulaciones en la sinovia, cuyas células juegan un papel crucial en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas, tales como la artritis reumatoide (RA). El término "sinovia reumatoide o "células sinoviales reumatoides" o "tejido sinovial reumatoide" se refiere a la sinovia inflamada de las articulaciones de un individuo que padece RA. La sinovia reumatoide se caracteriza por hiperplasia del revestimiento íntimo y por acumulación de FLS, células T, células plasmáticas, macrófagos, células B, células asesinas naturales y células dendríticas en el subrevestimiento sinovial. Estas células acumuladas están comprendidas en la definición de células sinoviales reumatoides. Durante la progresión de RA, el tejido sinovial se vuelve una posición donde ocurren procesos inflamatorios constantes, lo que puede derivar finalmente en daño en el cartílago y destrucción y deformación de la articulación. Se ha observado que los FLS que están presentes en la sinovia durante rA muestran un fenotipo alterado en comparación con los FLS presentes en tejidos normales. Por ejemplo, los FLS en la sinovia reumatoide pierden la "inhibición de contacto", es decir, pierden la propiedad para detener su crecimiento cuando más células entran en contacto entre sí. Además, pierden la dependencia al crecimiento en superficies adhesivas. Como resultado, el número de FLS en la sinovia enferma aumenta. La inflamación se mejora además mediante la producción de varias moléculas de señalización proinflamatoria, particularmente interleucinas IL-6 e IL-8, prostanoides y metaloproteinasas de la matriz (MMP).

[0031] Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, un virión rAAV que comprende una proteína de cápside modificada para su uso según la invención proporciona un aumento de al menos dos veces en la expresión del transgén en FLS humano en comparación con un virión rAAV que comprende una proteína de cápside no modificada tal y como se define en el presente documento, preferiblemente a la proteína de cápside no modificada con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 13 - 19, cuando se evalúan en las mismas condiciones, donde preferiblemente la proteína de cápside no modificada tiene el mismo serotipo que la proteína de cápside modificada o tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID N.º: 19.

[0032] Más preferiblemente, el virión rAAV para su uso según la invención da como resultado niveles de expresión aumentados del transgén tras la transducciónin vitrosegún lo descrito anteriormente en aumentos de niveles de expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 veces en células FLS humanas en comparación con un virión de control rAAV.

[0033] También se prefiere, o además de lo anterior, que el virión rAAV proporcione una expresión aumentada del transgén tras la administraciónin vivoal modelo de ratón de sinovia de bolsa de aire (ApS) (adaptado de Edwardset al(1981) J Pathol 134: 147-156, como se describe en el Ejemplo 4) en comparación con un virión de control rAAV, preferiblemente en comparación con un virión rAAV que comprende proteínas de cápside wtAAV5, siempre que el rAAV sea idéntico de otro modo (aparte de su(s) proteína(s) de cápside). Preferiblemente, la expresión del transgén aumenta en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 veces usando un rAAV que comprende las proteínas de cápside mutantes de la invención según se define en las reivindicaciones. En los Ejemplos se proporciona un ejemplo de método.

[0034] También se prefiere, o además de lo anterior, que el virión rAAV que comprende una proteína de cápside modificada proporcione títulos de anticuerpo de neutralización (nAb) similares o inferiores en comparación con el mismo virión rAAV que comprende una proteína de cápside AAV no modificada, preferiblemente de tipo silvestre, del mismo serotipo. Se sabe que las cápsides WtAAV5 presentan un perfil nAb atrayente, y, por lo tanto, se prefieren títulos nAb similares o inferiores a rAAV que comprende una proteína de cápside modificada según la presente invención en comparación con wtAAV5.

[0035] Alternativamente, el ensayo de transducciónin vitropodría realizarse de forma similar a como se ha descrito anteriormente, pero en un tipo celular/línea celular diferente de FLS, dependiendo del tipo celular al que se vaya a dirigir, como, por ejemplo, en células seleccionadas del grupo que consiste en hepatocitos primarios, líneas celulares hepáticas, por ejemplo, HuH, HepG2, HepA1-6, células cardíacas, células de músculo esquelético, células de pulmón, como la línea celular A549, células CNS, células oculares, células del tracto gastrointestinal, células de médula ósea y células sanguíneas, como la línea celular THP-1. Esto también puede requerir un serotipo AAV diferente como control preferido, dependiendo del tropismo de las proteínas de cápside de tipo silvestre. En general, un vector de control comprende preferiblemente proteínas de cápside de tipo silvestre que naturalmente se dirigen al tejido de elección. Como apreciará el experto en la materia, también puede depender del modo de administración: local o sistémicamente. Por ejemplo, AAV2, que ha sido el AAV más extensamente examinado, presenta tropismo hacia células de músculo esquelético, neuronas, células de músculo liso vasculares y hepatocitos; AAV6 presenta tropismo hacia células epiteliales de las vías respiratorias; AAV7 presenta tropismo hacia células de músculo esquelético; AAV8 presenta tropismo hacia hepatocitos; AAV1 y AAV5 presentan tropismo hacia células endoteliales vasculares. Tras la administración sistémica, AAV 1-3 y 5 9 tienen tropismo hacia el hígado, con altos niveles de proteína observados con AAV9, 8, 7, 6, 1 y en menor medida 5 y 2; el corazón se transduce mediante AAV4, 6, 7, 8 y 9; se observa expresión torácica para AAV4 y 6 (Zincarelliet al(2008) Molecular Therapy 16(6): 1073-1080).

[0036] Sin querer limitarse a ninguna teoría, creemos que la expresión aumentada conseguida mediante los viriones rAAV que comprenden una proteína de cápside modificada para su uso según la invención en comparación con viriones de control rAAv es provocada por una transducción mejorada del rAAV en la célula, posiblemente por tropismo alterado, dando como resultado (i) un número aumentado de células en la población celular que se transduce, y/o (ii) un nivel aumentado de expresión por célula, por ejemplo, debido a una mejor absorción del virión y/o procesamiento intracelular.

[0037] Otra ventaja del virión rAAV con una proteína de cápside modificada para su uso según la invención podría ser preferiblemente otras mejoras tales como la posible evitación de anticuerpos neutralizantes preexistentes.

[0038] La proteína de cápside modificada comprende una secuencia de aminoácidos Z. La secuencia de aminoácidos Z está comprendida en la parte C-terminal de la proteína. Preferiblemente, la secuencia Z tiene 12 -18 residuos de aminoácido de longitud (también denominada aquí "región bucle" e "inserto"). La secuencia Z se sitúa en la parte C-terminal de la proteína de cápside, en una ubicación que corresponde a una posición a 100 -200, preferiblemente 120 -180, más preferiblemente 130 - 170, más preferiblemente 140 - 160, más preferiblemente alrededor de 150 aminoácidos desde el extremo C-terminal de la proteína de cápside de tipo silvestre, tal como se muestra, por ejemplo, en SEQ ID N.º: 13 - 19. Los residuos de secuencia de aminoácidos Z están expuestos en la superficie de la proteína de cápside, tal como, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 residuos expuestos en la superficie de la proteína de cápside (un denominado "bucle"). En una forma de realización preferida, la secuencia Z tiene 14 - 18 residuos de aminoácidos de longitud, más preferiblemente, 15, 16, 17 o 18 residuos de longitud, más preferiblemente, 15, 17 o 18 residuos de aminoácidos de longitud. La secuencia Z puede sustituir algunos residuos de aminoácidos en comparación con la no modificada, tal como la secuencia de proteína de cápside de tipo silvestre. Preferiblemente, el inserto reemplaza 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente 6 o 7 residuos de aminoácidos de la misma secuencia, pero sin el inserto, preferiblemente de la no modificada, más preferiblemente de la secuencia de tipo silvestre. Además de la secuencia Z/inserto, por lo tanto, en la estructura, la proteína de cápside puede comprender modificaciones adicionales, como sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadoras) o la proteína de cápside de la estructura puede ser como la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. La estructura AAV donde está comprendido el inserto puede ser de cualquier serotipo, como, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrhlo o AAVDj . Preferiblemente, la estructura AAV donde está comprendida la secuencia Z se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV7, AAV9, AAVrhIO, AAVDJ, más preferiblemente de las proteínas de cápside no modificadas que tienen una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID N.º: 13 -19. El inserto tal y como se define en las reivindicaciones está comprendido en la parte C-terminal de la proteína de cápside, en una ubicación correspondiente a 100 - 200, preferiblemente 120 - 180, más preferiblemente 130 - 170, más preferiblemente 140 - 160, más preferiblemente aproximadamente 150 residuos de aminoácidos desde el C-terminal de la proteína de cápside de tipo silvestre, como se muestra, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 13 - 19, donde la ubicación del inserto se representa mediante la fórmula II:

EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z -(x)oLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG

donde x representa un único residuo de aminoácido, donde y representa 0, 1 o 2 residuo(s) de aminoácido (que, por lo tanto, puede estar ausente), y donde n es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, preferiblemente 8, 9 o 10 o donde la ubicación del inserto se representa mediante una secuencia con al menos 90, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con fórmula II. Preferiblemente, Ios últimos tres residuos de aminoácidos anteriores al extremo N-terminal de la secuencia Z de la invención son NLQ, NHQ o NFQ. Preferiblemente, y representa 0 o 2 residuos de aminoácidos. En algunos casos, y representa 2 residuos de aminoácidos, por lo tanto, dos residuos de aminoácidos adicionales, preferiblemente dos residuos de serina, puede estar presente entre el motivo NxQ y el inserto de la invención según lo definido por las reivindicaciones. Este es preferiblemente el caso donde el motivo NxQ es NFQ, por ejemplo, si la cápside AAV es una secuencia de cápside AAV1 como se representa en SEQ ID N.o:1. El experto en la materia será capaz de determinar estos motivos y esta región donde se ubica el inserto, también si alberga algunas variaciones, tal como sustituciones o deleciones de aminoácidos.

[0039] En una forma de realización preferida, basada en los alineamientos mostrados en las figuras 4 y 5, el inserto (secuencia Z) comprende o consiste en una secuencia de la fórmula: X1-G-Q-X2-G-X3-X4-X5-R-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15, donde xi es Q o nada, X2 es S o R, X3 es N o C, X4 es D, Y o E, X5 es C, V, S o A, X6 es G, S o V, X7 no es nada, A, V o R, X8 es D, N o E, X9 es C o A, xio es F o Q, xii no es nada, C o A, X12 no es nada o A, X13 no es nada o Q, X14 no es nada o A y X15 no es nada o A. Alternativamente, el inserto (secuencia Z) comprende o consiste en una secuencia de la fórmula: yi-G-Q-y2-G-y3-y4-y5-R-y6-y7-y8-y9-yio-A-yii-yi2-yi3, donde yi es Q o nada, y2 es S o R, y3 es N o C, y4 es D, Y o E, y5 es C, V, S o A, y6 es G, S o V, y7 no es nada o D, y8 no es nada o C, y9 es A, V, R o F, yio es N, D, E o C, yii no es nada o Q, y i2 no es nada o A, yi3 no es nada o A. En otra alternativa más, en la forma de realización más preferida, basada en Ios alineamientos mostrados en las figuras 6 y 7, el inserto (secuencia Z) comprende o consiste en una secuencia de la fórmula general I:

y - G - Q - x - G -(x)3 - R -(x)3 - y - A - Q - A - A

donde x representa un único residuo de aminoácido y donde y representa 0, 1 o 2 residuos de aminoácido (que, por lo tanto, puede estar ausente). Preferiblemente, (i) si en el N-terminal y representa 0 aminoácidos, entonces la otra y dentro de fórmula I representa 0 residuos de aminoácidos o (ii) si en el N-terminal y representa 1 residuo de aminoácido, entonces la otra y dentro de fórmula I representa 2 residuos de aminoácidos. Más preferiblemente, el inserto (secuencia Z) comprende o consiste en una secuencia de la fórmula más específica:

Zo - G - Q - zi - G - Z2 - Z3 - Z4 - R - Z5 - Z6 - Z7 - Z8 - Z9 - A - Q - A - A

donde zo no es nada o Q, zi es R o S, Z2 es C o N, Z3 es D, E o y , Z4 es C, A, S o V, Z5 es G, V o S, Z6 es d o nada, Z7 es C o nada, Z8 es F, R, V o A, Z9 es C, D, N o E. Más preferiblemente, si zo no es nada, entonces Z6 y Z7 tampoco representan nada.

[0040] Más preferiblemente, la secuencia Z/inserto comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 o 99 %, más preferiblemente 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID N.o: 8 -12. Se prefiere que la secuencia Z/inserto comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las fórmulas anteriormente expuestas y que tiene al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, más preferiblemente 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID N.o: 8 - 12.

[0041] En células de mamíferos, la expresión de las tres proteínas de cápside AAV (VP1, VP2 y VP3) en la estequiometría correcta se basa en una combinación de uso alterno de dos sitios de aceptor de empalme y la utilización subóptima de un codón de iniciación ACG para VP2 que no sea reproducido con precisión por células de insecto. La estequiometría correcta es importante para la infectividad de las partículas AAV. Para la producción de las tres proteínas de cápside AAV en células de insecto en la estequiometría correcta, es común en la técnica usar un constructo que se transcriba en un único mensajero policistrónico que sea capaz de expresar las tres proteínas VP sin necesidad de empalme. Para conseguirlo, la proteína VP1 podría estar bajo el control de un codón de iniciación de la traducción subóptimo en lugar de ATG. Ejemplos de dicho codón de iniciación de la traducción subóptimo son ACG, TTG, CTG y GTG (Urabeet al.(2002) Human Gene Therapy 13: 1935-1943; US 20030148506; US 20040197895; WO 2007/046703). Alternativamente, en la producción de rAAV en células de insecto, se puede utilizar un casete de ácido nucleico para expresar las proteínas VP1, VP2 y VP3, donde estas proteínas se codifican mediante una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la superposición de marcos de lectura abierta (ORF) como se describe en la patente europea n.02,061,891 B1, donde se da a conocer un casete de expresión VP que comprende un intrón que comprende un promotor antes del codón de iniciación ACG de VP2. La proteína de cápside modificada de la invención tal y como se define en las reivindicaciones se define con respecto a la secuencia de proteína de la proteína de cápside VP1. Sin embargo, puesto que la secuencia Z/inserto se localiza en la parte C-terminal de la proteína VP1, también se incluye en la invención que las proteínas VP2 y VP3 alberguen la secuencia Z/inserto y, por lo tanto, estén modificadas (sin tener en cuenta el método de producción de rAAV, por ejemplo, en células de insecto o en células de mamíferos).

[0042] Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, la proteína de cápside modificada según la invención tal y como se define por las reivindicaciones comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 1 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 1 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 11, ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 2 y donde los aminoácidos en las posiciones 585 - 599 de SEQ ID n .0: 2 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tienen un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID n .0: 10, iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un loo % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID n .0: 3 y donde los aminoácidos en las posiciones 587 - 601 de SEQ ID n .0: 3 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 9, iv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un loo % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 4 y donde los aminoácidos en las posiciones 586 - 600 de SEQ ID N.º: 4 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tienen un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 8, v) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID n .0: 5 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID n .0: 5 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tienen un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID n .0: 9, vi) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 6 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 6 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tienen un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 8, y vii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tiene un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 7 y donde los aminoácidos en las posiciones 587 - 601 de SEQ ID N.º: 7 tienen al menos 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %, más preferiblemente que tienen un 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 12. Preferiblemente, la proteína de cápside AAV de marco donde está comprendido el inserto tiene la secuencia de aminoácidos de una cápside AAV de tipo silvestre, tal como, por ejemplo, de AAV5, AAV1, AAV2, AAV7, AAV9, AAVrhIO o AAVDJ o una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos conservadoras. Más preferiblemente, la proteína de cápside AAV de marco donde está comprendido el inserto tiene la secuencia de aminoácidos de una cápside wtAAV5 o una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos conservadoras.

[0043] La "identidad de secuencia" se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácido nucleico (polinucleótido), como se determina comparando las secuencias. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se calcula basándose en la longitud total de dos SEQ ID N.º determinadas o en parte de estas. Parte de estas significa preferiblemente al menos 1O, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % o 1OO % de ambas SEQ ID n .0. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico, según el caso, determinada por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, la identidad o similitud con una SEQ ID N.º determinada significa identidad o similitud basada en la longitud total de dicha secuencia (es decir, en su longitud total o en conjunto).

[0044] La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos conservados de aminoácido de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, aunque sin carácter limitativo, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)).

[0045] Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para obtener la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informáticos públicamente disponibles. Los métodos de programa informático preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, el paquete de programa GCG (Devereux, J.,et al.,Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. F.et al.,J. MoI. BIoI. 215:403-410 (1990)). El programa BLAST X está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (Manual BLAST, Altschul, S.et al.,NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.et al.,J. MoI. BíoI.215:403-410 (1990)). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

[0046] Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptido incluyen el siguiente algoritmo: Needleman y Wunsch, J. MoI. BíoI. 48:443-453 (1970); matriz de comparación: BlOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Scí. USA. 89:10915-10919 (1992); penalización de espacio: 12; y penalización de longitud de espacio: 4. Dicho programa está disponible públicamente como programa "Ogap" de Genetics Computer Group, situado en Madison, Wisconsin. Los parámetros anteriormente mencionados son Ios parámetros por defecto para comparaciones de aminoácidos (junto con ninguna penalización por espacios finales).

[0047] Los parámetros preferidos para la comparación de ácido nucleico incluyen el siguiente algoritmo: Needleman y Wunsch, J. MoI. BíoI. 48:443-453 (1970); matriz de comparación: coincidencias=+10; no coincidencias=0; penalización de espacio: 50; penalización de longitud de espacio: 3. Disponible como el programa Gap en Genetics Computer Group, situado en Madison, Wisconsin, EE. UU. (www.biology.wustl.edu/gcg/gap). Anteriormente se han proporcionado Ios parámetros por defecto para comparaciones de ácido nucleico.

[0048] Opcionalmente, a la hora de determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede tener en cuenta sustituciones de aminoácidos denominadas "conservadoras", como quedará claro para el experto en la materia. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas alifáticas laterales es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucína; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales hidroxilo-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas aromáticas laterales es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisterna y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valinaleucína-isoleucína, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descritas en el presente documento son aquellas en las que al menos un residuo en las secuencias descritas se ha eliminado y un residuo diferente se ha insertado en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de Ios aminoácidos de origen natural son las siguientes: Ala a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln o Hís; Asp a GIu; Cys a Ser o Ala; Gln a Asn; GIu a Asp; Gly a Pro; Hís a Asn o Gln; lie a Leu o Val; Leu a lie o Val; Lys a Arg; Gln o GIu; Met a Leu o lie; Phe a Met, Leu o Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp o Phe; y Val a lie o Leu.

[0049] Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, la proteína de cápside comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 1 - 7, más preferiblemente del grupo consistente en SEQ ID N.º: 1, 2, 3, 4, 6 y 7, aún más preferiblemente del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 3, 4 y 6, aún más preferiblemente del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 4 y 6, más preferiblemente SEC ID N.º: 4.

[0050] Las secuencias ITR funcionales son necesarias para la replícación, rescate y empaquetamiento de viriones rAAV. Las secuencias ITR pueden ser secuencias de tipo silvestre o pueden tener al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con secuencias de tipo silvestre o se pueden alterar, por ejemplo, por inserción, mutación, deleción o sustitución de nucleótidos, siempre que sigan siendo funcionales. En este contexto, la funcionalidad se refiere a la capacidad para empaquetar directamente el genoma en el recubrimiento de cápside y después permitir la expresión en la célula huésped que se va a transducir o célula diana. Típicamente, las ITR del genoma AAV de tipo silvestre se retienen en el vector rAAV. Las ITR se pueden clonar a partir del genoma viral AAV o escindirse de un vector que comprende las ITR de AAV. Las secuencias de nucleótidos ITR pueden estar ligadas en cualquier extremo a un transgén tal y como se define en el presente documento usando técnicas convencionales de biología molecular, o la secuencia AAV de tipo silvestre entre las ITR se puede sustituir por la secuencia de nucleótidos deseada. El vector rAAV comprende preferiblemente al menos las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR de uno de los serotipos AAV, o secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a estas, y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína terapéutica (bajo el control de un elemento regulador adecuado) insertada entre las dos ITR. La mayoría de los vectores rAAV usados actualmente emplean las secuencias ITR de serotipo 2 de AAV. Las ITR más preferidas presentes en un vector rAAV son del serotipo AAV2. Otras ITR preferidas son del serotipo AAV1, AAV3, Aa V5 o AAV6 (Grimmet al.(2006) J Virol 80(1):426-439). Un genoma rAAV puede comprender ADN monocatenario o bicatenario (autocomplementario). La molécula de ácido nucleico monocatenario es una hebra de sentido o antisentido, ya que ambas polaridades son igualmente capaces de empaquetar en cápsides AAV. Los vectores rAAV monocatenarios pueden utilizar las secuencias ITR del serotipo 2 de AAV de tipo silvestre (AAV2), y los vectores rAAV bicatenarios (autocomplementarios) pueden utilizar una versión modificada de las ITR. Alternativamente, en una forma de realización, un vector bicatenario comprende una ITR, ITR que es de AAV4. El vector rAAV puede comprender, además, un marcador o gen reportero, tal como un gen, por ejemplo, que codifica un gen de resistencia antibiótica, una proteína fluorescente (por ejemplo,gfp)o un gen que codifica un producto detectable y/o seleccionable químicamente, enzimáticamente o de otro modo (por ejemplo,lacZ,fosfatasa alcalina (AP), SEAP, Luc, Neo, Bla, etc.) conocido en la técnica.

[0051] El vector rAAV, que incluye cualquier posible combinación de ITR de cápside de serotipo AAV y genoma AAV, se produce usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando un sistema de producción rAAV de mamíferos o un sistema de producción rAAV de célula de insecto. Se describen métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, en Panet al.(J. of Virology (1999) 73: 3410-3417), Clarket al.(Human Gene Therapy (1999) 10: 1031-1039), Wanget al.(Methods Mol. Biol. (2011) 807: 361-404), Grimm (Methods (2002) 28(2): 146-157), y el sistema de célula de insecto basado en Urabeet al(Human Gene Therapy (2002) 13:1935-1943), Kohlbrenneret al(Molecular Therapy (2005) 12(6):1217-1225), la publicación de patente internacional w O 2007/046703, la publicación de patente internacional WO 2007/148971 , la publicación de patente internacional WO 2009/014445, la publicación de patente internacional WO 2009/104964, la publicación de patente internacional WO 2009/154452, la publicación de patente internacional WO 2011/1i 2089, la publicación de patente internacional WO 2013/036118, la patente estadounidense n.06,723,551 B. En resumen, los métodos generalmente pueden implicar (a) la introducción del constructo de genoma rAAV en una célula huésped, (b) la introducción de un constructo auxiliar AAV en la célula huésped, donde el constructo auxiliar comprende las funciones virales que faltan del genoma rAAV de tipo silvestre y (c) la introducción de un constructo de virus auxiliar en la célula huésped. Todas las funciones para la replicación y empaquetamiento del vector rAAV han de estar presentes para conseguir la replicación y el empaquetamiento del genoma rAAV en vectores rAAV. La introducción en la célula huésped se puede llevar a cabo usando técnicas de biología molecular estándar y pueden ser simultánea o consecutivamente. Finalmente, las células huésped se cultivan para producir vectores rAAV, que se purifican a continuación usando técnicas estándar como gradientes CsCI (Xiaoet al.1996, J. Virol.

70: 8098-8108) o purificación con lodixanol. A continuación, el vector rAAV purificado está normalmente lisito para usar en los métodos. Se pueden conseguir títulos elevados de más de 1012 partículas por ml y pureza elevada (sin virus de tipo silvestre y auxiliares detectables) (ver, por ejemplo, Clarket al. supray Flotteet al.

1995, Gene Ther. 2: 29-37). El tamaño total del transgén insertado en el vector rAAV entre las regiones ITR es generalmente menor de 5 kilobases (kb) de tamaño.

[0052] En el contexto de la presente invención, un recubrimiento de proteína de cápside puede ser de un serotipo diferente al del genoma rAAV, que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés y (ii) al menos una secuencia ITR de AAV. Un genoma rAAV de la invención tal y como se define por las reivindicaciones pueden así estar encapsidado, por lo tanto, por un recubrimiento de proteína de cápside de la presente invención tal y como se define por las reivindicaciones, es decir, la cápside icosaédrica, que comprende proteínas de cápside (VP1, VP2, y/o VP3) según la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, mutantes de proteínas de cápside AAV según la invención tal y como se define en las reivindicaciones, mientras que las secuencias ITR contenidas en ese vector rAAV pueden ser cualquiera de los serotipos AAV anteriormente descritos, incluyendo, por ejemplo AAV2 o AAV5. En una forma de realización, el genoma rAAV o las ITR presentes en el virión rAAV se derivan del serotipo 2 de AAV o del serotipo 5 de AAV o del serotipo 8 de AAV. El genoma completo de AAV5 y otros serotipos a Av se ha secuenciado (Chioriniet al.

1999, J. of Virology VoI. 73, N.o 2, p. 1309-1319) y la secuencia de nucleótidos de AAV5 está disponible en GenBank (n.o de acceso AF085716). Las secuencias de nucleótidos ITR de AAV2 y AAV5 están disponibles fácilmente, por lo tanto, para un experto. El genoma completo de AAV2 está disponible en NCBI (secuencia de referencia NCBI NC_001401.2). Se pueden clonar o realizar mediante síntesis química según se conoce en la técnica, usando, por ejemplo, un sintetizador oligonucleótido como el suministrado, por ejemplo, por Applied Biosystems Inc. (Fosters, California, EE. UU.) o mediante técnicas de biología molecular estándar.

[0053] Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, el vector rAAV comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés.

[0054] Los términos "transgén" o "producto génico de interés" se usan de forma intercambiable aquí y se refieren a un ácido nucleico no nativo con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos AAV. Estos se usan para referirse a un polinucleótido que se puede introducir en una célula u organismo. Los productos génicos de interés incluyen cualquier polinucleótido, tal como un gen que codifica un polipéptido o proteína, un polinucleótido que se transcribe en un polinucleótido inhibitorio, o un polinucleótido que no está transcrito (por ejemplo, carece de un elemento de control de expresión, tal como un promotor que activa la transcripción). Un producto génico de interés de la invención puede comprender al menos dos secuencias de nucleótidos, siendo cada una diferente o que codifica moléculas terapéuticas diferentes. Las al menos dos secuencias de nucleótidos diferentes se pueden enlazar mediante un elemento IRES (sitio de entrada de ribosoma interno), proporcionando una transcripción bicistrónica bajo el control de un único promotor. Los elementos IRES adecuados se describen, por ejemplo, en Hsiehet al.(1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 214:910-917). Además, las al menos dos secuencias de nucleótidos diferentes que codifican diferentes proteínas o polipéptidos (terapéuticos) se pueden enlazar mediante una secuencia viral 2A para permitir la expresión eficiente de ambos transgenes a partir de un único promotor. Los ejemplos de secuencias 2A incluyen aquellas de virus de enfermedad podal y bucal, virus de la rinitis A equina, virus asigna Thosea y teschovirus-1 porcino (Kimet al.,PLoS One (2011) 6(4): e18556). Un producto génico de interés se inserta preferiblemente en el genoma rAAV o entre secuencias ITR. Un producto génico de interés también puede ser un constructo de expresión que comprende un elemento regulador de expresión, tal como una secuencia reguladora de promotor o transcripción operativamente enlazada a una secuencia codificante y a una secuencia de terminación 3'. El producto génico de interés puede ser un alelo de mutante funcional que reemplaza o complementa a uno defectuoso. La terapia génica incluye también la inserción de transgenes que son inhibitorios en la naturaleza, es decir, que inhiben, disminuyen o reducen la expresión, actividad o función de una proteína o gen endógeno o exógeno, tal como un gen o proteína indeseable o aberrante (por ejemplo, patógeno). Tales transgenes pueden ser exógenos. Se entiende por molécula o secuencia exógena una molécula o secuencia que no se produce normalmente en la célula, tejido y/o individuo que se va a tratar. Ambas enfermedades adquiridas y congénitas son susceptibles a la terapia génica.

[0055] "Gen" o "secuencia codificante" se refiere a una región de ADN o ARN que "codifica" una proteína particular. Una secuencia codificante se transcribe (ADN) y se traduce (ARN) en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de una región reguladora apropiada, tal como un promotor. Un gen puede comprender varios fragmentos operativamente enlazados, tal como un promotor, una secuencia 5' líder, un intrón, una secuencia codificante y una secuencia 3' no traducida, que comprende un sitio de poliadenilación o una secuencia señal. Un gen quimérico o recombinante es un gen que no se encuentra normalmente en la naturaleza, tal como un gen en el que, por ejemplo, el promotor no se asocia en la naturaleza con parte o la totalidad de la región de ADN transcrito. La "expresión de un gen" se refiere al proceso donde un gen se transcribe en un ARN y/o se traduce en una proteína activa.

[0056] Según se utiliza en el presente documento, el término "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificantes, y se localiza aguas arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia codificante, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente del ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, aunque sin carácter limitativo, sitios de unión de factor de transcripción, sitios de unión a proteína represora y activadora, y cualquier otra secuencia de nucleótidos que un experto en la materia sepa que actúa directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de tejidos en la mayoría de condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o en el desarrollo, por ejemplo, por la aplicación de un inductor químico. Un promotor inducible preferido es un promotor sensible a NfkB que es inducible tras la inflamación. Un promotor "específico del tejido" es preferentemente activo en tipos específicos de tejidos o células. La selección de una secuencia de promotor apropiada depende generalmente de la célula huésped seleccionada para la expresión de un segmento de a Dn . Las secuencias promotoras preferidas en el rAAV y/o transgén de la invención son promotores que confieren expresión en células de la sinovia reumatoide, tales como en macrófagos íntimos y/o en FLS y/u otras células sinoviales tales como, por ejemplo, células T. Los promotores preferidos son, por ejemplo, los promotores de genes conocidos por ser expresados en células sinoviales, como el promotor CMV, el promotor del gen IL-6 o el promotor SV40, o un promotor inducible por NF-kB según se ha identificado anteriormente en el presente documento, y otros, como ha determinado fácilmente un experto en la materia. Alternativamente, un transgén está operativamente enlazado a un promotor que permite una expresión sistémica eficiente. Las secuencias de promotor adecuadas son promotor CMV, CBA (beta-actina de pollo), o promotores específicos de hígado, como anti-tripsina alfa-1 de humano (hAAT) o TBG (globulina de unión a tiroxina). Preferiblemente, el promotor en el rAAV y/o transgén no es un promotor inducible de esteroide. Más preferiblemente, el promotor en el rAAV y/o transgén no es un promotor inducible de dexametasona.

[0057] Según se utiliza en el presente documento, el término "enlazado/a(s) operativamente" se refiere a un enlace de elementos de polinucleótido (o polipéptido) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está operativamente enlazada a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. El término "enlazado/a(s) operativamente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son normalmente contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en marco de lectura.

[0058] Un "producto génico de interés" puede ser un "polipéptido terapéutico" o "proteína terapéutica", que deben entenderse en el presente documento como un polipéptido o proteína que puede tener un efecto beneficioso en un individuo, preferiblemente dicho individuo es un humano, más preferiblemente dicho humano padece una enfermedad. Dicho polipéptido terapéutico puede seleccionarse, aunque sin carácter limitativo, del grupo que consiste en una enzima, un cofactor, una citocina, un anticuerpo, un factor de crecimiento, una hormona y una proteína antiinflamatoria.

[0059] Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está situada entre dos secuencias ITR de AAV. Dicho alternativamente, la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico de interés está flanqueada por dos secuencias ITR de AAV, es decir, una ITR en cualquier extremo de la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico de interés.

Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, el producto génico de interés trata, previene o suprime síntomas asociados a una enfermedad artrítica, donde preferiblemente el producto génico de interés se selecciona del grupo que consiste en interleucinas, moduladores inmunes, anticuerpos, ARNhc, miARN, factores de crecimiento, proteasas, nucleotidasas/nucleosidasas, péptidos, inhibidores de proteasa, inhibidores, enzimas y combinaciones de los mismos, y donde más preferiblemente el producto génico de interés es al menos uno de CD39, CD73 e lFN-p. Ejemplos de estos son: inhibidor de la interleucina 1 (IL-1) (por ejemplo, anakinra, canakinumab, rilonacept), inhibidor del factor alfa de necrosis tumoral (TNFo) (por ejemplo, etanercept, infliximab, adalimumab, certilizumab pegol, golimumab), antagonista del receptor de IL-1, receptor de IL-1 soluble, inhibidor de IL-17 (por ejemplo, secukinumab, brodalumab, ixekizumab, inhibidor de IL-12/IL-23 (ustekinumab, risankizumab, guselkumab, tildrakizumab), inhibidor de la coestimulación de células T (p. ej., abatacept), agentes de inhibición y agotamiento de 6 células (p. ej., rituximab, belimumab, ianalumab, tabalumab), inhibidor de IL-15 (por ejemplo, AMG-714), inhibidor de IL-22 (por ejemplo, Fezakunimab), inhibidor de GM-CSF (lenzilumab, namilumab), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-1), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) (por ejemplo, rhFGF-18/esprifermina), inhibidor del activador del receptor de factor nuclear del ligando kappa-B (RAn Kl) (por ejemplo, denosumab), inhibidor del complemento 5a (por ejemplo, C5aR-151), miembro de la familia de proteínas morfogenéticas de hueso (BMP), factor beta de crecimiento transformante (TGF-P), familia del factor de diferenciación de crecimiento (GDF), inhibidor de interleucina-18 (por ejemplo, Tadekinig alfa/proteína de unión IL-18), inhibidores IL-2 (por ejemplo, basiliximab, daclizumab), receptor p55 de TNFα soluble (sTNFα) o receptor p75 de sTNFα, receptores de sTNFα fusionados con una IgG, inhibidores del receptor p55 de TNFci, inhibidores del receptor p75 de sTNFα, kB-quinasa negativa dominante (dn-IKK-P), interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (lL-10) (F8IL10/Dekavil), interleucina-13 (IL-13), interferón beta (IFN-P), inhibidor de tejido de la familia de MMP (TIMP), inhibidor del activador de plasminógeno (PAI), inhibidores de serina proteasa (serpinas), moléculas de señalización/factores de transcripción (por ejemplo, SMAD, Sox9, IkB), componentes de matriz extracelular (por ejemplo, colágeno, proteína de matriz oligomérica de cartílago (COMP), proteoglicanos, elastina), péptido intestinal vasoactivo (VIP), cúmulo de diferenciación 39 (CD39) y cúmulo de diferenciación 73 (CD73), superóxido dismutasa (SOD), y combinaciones de los mismos.

[0060] Para los expertos en la materia resultan conocidos los sistemas de edición de genoma funcional para su uso en todas las formas de realización de la invención, e incluyen: nucleasas de actividad similar a activador de transcripción (TALEN, Gajet al.(2013) Trends Biotechnol. 31(7):397-405), nucleasas de dedo de zinc (ZFN, Gajet al.(2013)supra),meganucleasas como l-Scel (Arnouldet al.(2007) J Mol Biol 371(1):49-65; Takeuchiet al.(2011) PNAS EE. UU . 108(32):13077-13082), sistemas de endonucleasa guiados por ARn , como CRISPR/Cas (Maliet al.(2013) Nat methods 10(10):957-963; Maliet al.(2013) Nat Biotechnol 31(9):833-838; Conget al.(2013) Science 339(6121):819-823) y CRISPR/Cpfl (Zetscheet al.(2015) Cell 163(3):759-771), moléculas de formación triple, poliamidas sintéticas y proteínas diseñadoras de dedo de zinc (Uilet al.(2003) Nucleic Acids Res 31(21):6064-6078). Los sistemas de edición de genoma funcional emplean nucleasas que crean roturas bicatenarias específicas de sitio en ubicaciones deseadas en el genoma. Las roturas de cadena doble inducidas se reparan a través de unión de extremo no homóloga o recombinación homóloga. Como resultado, se obtienen mutaciones dirigidas. Resulta ventajoso reemplazar un gen defectuoso (que provoca una enfermedad o trastorno) con un alelo normal en su ubicación natural mediante cualquiera de estos métodos, porque no requiere que las secuencias codificantes completas y secuencias reguladoras se incluyan en el virión rAAV cuando solo una pequeña porción del gen necesita ser alterada. También se cree que la expresión del gen parcialmente sustituido es más coherente con la biología celular normal que los genes completos que llevan los viriones. El sistema de edición de gen preferido es CRISPR (que comprende CRISPR/Cpfl y CRISPR-Cas), porque es más rápido y menos costoso que otros métodos. Una gran ventaja es también que CRISPR puede se puede reutilizar fácilmente para dirigirse a distintas secuencias de ADN que usan ARN guía individuales de CRISPR. Por lo tanto, alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, el genoma rAAV comprende al menos uno de: (i) un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al menos un ARN guía (ARNg); donde el ARN guía es sustancialmente complementario, preferiblemente complementario, a una(s) secuencia(s) de polinucleótido objetivo en un genoma; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una nucleasa; donde la nucleasa forma un complejo de ribonucleasa con el ARN guía, y donde el complejo de ribonucleasa provoca roturas de ADN bicatenario específicas del sitio en el genoma.

[0061] En un segundo aspecto, la presente invención, según se define en las reivindicaciones, se refiere a una composición rAAV para su uso en el tratamiento, prevención o supresión de un síntoma asociado a una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas, y donde la composición rAAV comprende un virión rAAV de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo farmacéuticamente aceptable puede encontrarse, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a Edición. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Se puede utilizar cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en las presentes composiciones (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, Abril 1997). Las formas farmacéuticas preferidas estarían en combinación con solución salina estéril, solución de dextrosa, o solución tamponada, u otros fluidos estériles farmacéuticamente aceptables. Alternativamente, se puede usar un vehículo sólido, tal como, por ejemplo, perlas microportadoras.

[0062] Las composiciones farmacéuticas son normalmente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alojar una elevada concentración de fármaco. El vehículo puede ser un medio de dispersión o disolvente que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, de sales de monoestearato y gelatina. El virión parvoviral se puede administrar como un bolo o en una formulación de liberación controlada, por ejemplo, en una composición que incluya un polímero de liberación lenta u otros vehículos, que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar, por ejemplo, polímeros biodegradables y biocompatibles, como etilvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG). Según se utiliza en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye preferiblemente cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso isotónico y de absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas resulta conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquiera de los medios convencionales o agente es incompatible con el compuesto activo, su uso se contempla en las composiciones farmacéuticas de la invención.

[0063] Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. "Forma de dosificación unitaria", según se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos que se van a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se puede dictar por las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a conseguir, y por las limitaciones inherentes en la técnica de combinación de un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de una afección en individuos.

[0064] Se pueden incorporar también compuestos activos complementarios en las composiciones farmacéuticas de la invención. Se pueden encontrar directrices sobre la coadministración de sustancias terapéuticas adicionales, por ejemplo, en el Compendio de productos farmacéuticos y especialidades (CPS) de la Asociación de Farmacéuticos de Canadá.

[0065] En una forma de realización, la composición rAAV comprende, además, partículas vacías (es decir, partículas solo con cápside, no comprendiendo, por lo tanto, un genoma rAAV). Por consiguiente, alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización de la presente invención, la composición rAAV de la invención comprende, además, una cápside vacía en una proporción entre cápside vacía y virión rAAV de al menos 1:1, más preferiblemente de al menos 5:1, aún más preferiblemente de al menos 10:1. La composición rAAV puede comprender el virión rAAV, tal como se ha definido anteriormente, y una cápside vacía, como se define, por ejemplo, en el documento WO 2016/055437, y como se describe en Aalberset al.(2017) Hum. Gene Ther. 28(2):168-178. La cápside vacía puede ser del mismo serotipo o de un serotipo diferente en comparación con el vector de transgén rAAV de la composición de la invención. Preferiblemente, la cápside vacía es del mismo serotipo que el virión rAAV. Dentro de dicha composición rAAV, la cápside vacía y la cápside del virión rAAV pueden comprender una proteína de cápside modificada de la invención, preferiblemente el mismo tipo de proteínas de cápside modificadas. Sin embargo, también se abarca una composición rAAV donde las cápsides vacías tienen un serotipo diferente o son proteínas de cápside modificadas de forma distinta en comparación con las proteínas de cápside modificadas del virión rAAV. Además, se abarca una composición rAAV donde las cápsides vacías tienen una mezcla de serotipos, como, aunque sin carácter limitativo, una mezcla de cápsides AAV2 y AAV5. Los inventores observan un efecto creciente de expresión del transgén en las articulaciones después de la administración intraarticular de viriones rAAV mezclados con una cantidad significativa de cápsides vacías. Preferiblemente, en el virión rAAV y la cápside vacía, están presentes en la composición en una proporción entre cápside vacía y virión rAAV de al menos 1:1, 2:1, 3:1,4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 50:1, 100:1, o 1000:1, preferiblemente al menos 5:1 (es decir, una cantidad de cápsides vacías que sea al menos 5 veces la cantidad de vectores de transgén rAAV). Preferiblemente, dicha composición comprende el virión rAAV y la cápside vacía en una proporción entre cápside vacía y vector de transgén rAAV de como máximo 10000:1, 5000:1, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 15:1, 10:1 o 5:1, preferiblemente como máximo 1000:1. Preferiblemente, dicha composición comprende el virión rAAV y cápsides vacías en una proporción entre cápside vacía y virión rAAV de entre 1:1 y 100:1,2:1 y 100:1, 5:1 y 100:1, 1:1 y 20:1,2:1 y 20:1, o preferiblemente entre 5:1 y 20:1.

[0066] Anteriormente en el presente documento, se proporciona una forma de realización en la que el virión rAAV y las cápsides vacías están presentes en una única composición. También se abarca en la presente invención una forma de realización alternativa donde el virión rAAV y las cápsides vacías están presentes en (al menos dos o más) composiciones separadas y diferentes. En esta forma de realización alternativa, el virión rAAV y las cápsides vacías se pueden administrar por separado en el tiempo (por ejemplo, secuencialmente) y/o localización, donde se debe entender la localización como el sitio de administración. Además, el virión rAAV y las cápsides vacías se pueden administrar simultáneamente, por ejemplo, en sustancialmente el mismo momento, opcionalmente en una ubicación separada.

[0067] En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición rAAV y un inmunosupresor para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas, donde la composición rAAV es como se ha definido anteriormente y donde el tratamiento o prevención comprende la administración de la composición rAAV y la administración del inmunosupresor a un individuo. En el documento WO 2016/055437 se da a conocer un efecto creciente de un inmunosupresor en la expresión de transgén de AAV cuando se tratan sujetos con ambos inmunosupresores y viriones rAAV. Además, en el documento WO 2016/055437 se da a conocer un efecto sinérgico sorprendente del inmunosupresor junto con vectores vacíos en la expresión del transgén rAAV. En una forma de realización, el inmunosupresor se aplica por separado de la composición rAAV, significando separado que está separado en ubicación y/o momento. En dicha forma de realización, el inmunosupresor y la composición rAAV puede estar presente en composiciones separadas y distintas. El inmunosupresor, el virión rAAV y, opcionalmente, cada uno de los vectores vacíos puede estar presente incluso en una composición separada y distinta. En otra forma de realización, el virión rAAV y el inmunosupresor y la composición rAAV puede estar presente en una única composición. En otra forma de realización, el virión rAAV y el inmunosupresor están presentes en una única composición, y preferiblemente esta composición se usa en el tratamiento junto con una composición separada que comprende la cápside vacía. En otra forma de realización adicional, el inmunosupresor y la cápside vacía están presentes en una única composición, y preferiblemente esta composición se usa en el tratamiento junto con una composición separada que comprende el virión rAAV. Por lo tanto, la invención también contempla una composición que comprende un virión rAAV y un inmunosupresor según lo definido en el presente documento, y para una composición que comprende una composición rAAV y un inmunosupresor según lo definido en el presente documento para su uso según lo definido por las reivindicaciones.

[0068] Preferiblemente, un inmunosupresor para su uso en la presente invención es un inhibidor celular inmune innato, preferiblemente un inhibidor macrófago. Una célula inmune innata se define en el presente documento como un neutrófilo, macrófago, monocito, eosinófilo, basófilo o célula dendrítica que tiene el potencial para participar en la respuesta inflamatoria a una sustancia extraña. Un inhibidor celular inmune innato se define en el presente documento como un agente que da como resultado una reducción de la actividad de célula inmune innata y/o del número de células inmunes innatas. Un inhibidor macrófago se define en el presente documento como un agente que da como resultado una reducción en la actividad macrófaga y/o en el número macrófagos. En el presente documento, se entiende por “macrófago” a una célula inmune innata que envuelve y digiere desechos celulares, sustancias extrañas, microbios y células cancerosas en un proceso denominado fagocitosis. Preferiblemente, el inhibidor de célula inmune innata o macrófago de la invención da como resultado una reducción de al menos un 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95 % o preferiblemente de un 100 % en el número o actividad de células inmunes innatas o macrófagos en comparación con la actividad o el número inicial de células inmunes innatas o macrófagos antes del tratamiento. La actividad y/o el número de células inmunes innatas o macrófagos se puede detectar mediante cualquier ensayo adecuado conocido por el experto en la materia, tal como, aunque sin carácter limitativo, ensayo colorimétrico MTT (bromuro de tetrazolio de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenilo) para evaluar la actividad citotóxica del macrófagoin vitrocomo se describe en Ferrariet al.(Journal of Immunological Methods, 131 (1990) 165-172), por medición de niveles de citocina (por ejemplo, CCL2, TNF), por métodos de detección histológicos e histoquímicos, por ejemplo, por marcado CD68 o por detección de imágenes por resonancia magnéticain vivo(Mr I) de la absorción de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) por macrófagos, preferiblemente después de la administración intravenosa de SPIO según lo revisado por Yi-Xiang J. Wang (Quant. Imaging Med Surg (2011)1:35-40). La detección puede serin vitroo bienin vivo.Preferiblemente, la detecciónin vivose da en un modelo animal, preferiblemente un modelo murino o de rata.

[0069] Preferiblemente, el inmunosupresor es un glucocorticoide y/o un bisfosfonato, preferiblemente un bisfosfonato liposómico. Ejemplos no limitativos particulares de glucocortocoides son cortisol, cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona y aldosterona. Preferiblemente, el inmunosupresor es triamcinolona. Ejemplos no limitativos particulares de bisfosfonatos son etidronato, clodronato, tiludronato, pamidronato, neridronato, olpadronato, alendronato, ibandronato, risedronate y zoledronate. Preferiblemente, el bisfosfonato es un bisfosfonato encapsulado en liposoma o bisfosfonato liposómico, preferiblemente clodronato liposómico. Preferiblemente, el glucocorticoide no es dexametasona. Debe entenderse que el inhibidor inflamatorio o macrófago de la invención no se limita a unos glucocorticoides y/o un bisfosfonato. Por ejemplo, el inhibidor inflamatorio o macrófago de la invención también puede ser un anticuerpo inflamatorio o de reducción de macrófago, tal como un anticuerpo anti-F4/80. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado. Otros inmunosupresores relevantes que se utilizan en la presente invención son fármacos citostáticos (por ejemplo, agentes alquilantes y/o antimetabolitos, como metotrexato), fármacos que modifican el ruta de señalización purinérgica (por ejemplo, metotrexato, análogos de adenosina, antagonistas o agonistas de receptores de adenosina), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE, por ejemplo, ibuprofeno, diclofenaco, meloxicam, naproxeno, ácido acetiisalicílico), sustancias biológicas, como bloqueadores de TNF (por ejemplo, infliximab, etanercept, adalimumab, certolizumab, golimumab), bloqueadores de IL-6 (por ejemplo, tocilizumab), bloqueadores de iL-2 (por ejemplo, basiliximab, daclizumab), bloqueadores de IL-1|3 (por ejemplo, anakinra, rilonacept, canakinumab), IL-17 (secukinumab, brodalumab, ixekinumab), anti-IL-12/IL-23 (ustekinumab), un inhibidor de PDE4 (apremilast), muromonab, abatacept y/o rituximab, y/u otros compuestos, como hidroxicloroquina, cloroquina, leflunomida, sulfasalazina, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, sal de oro, inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina/sirólimus, everólimus) y penicilamina.

[0070] Preferiblemente, la composición rAAV y/o la composición que comprende cápsides vacías y/o la composición que comprende el inmunosupresor comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable, diluyentes, solubilizador, carga, conservante y/o excipiente según lo definido en otra sección del presente documento.

[0071] Preferiblemente, la terapia génica según la presente invención comprende, además, la administración de un inmunosupresor según lo definido en el presente documento, ya sea presente en la composición rAAV, o comprendido dentro de una composición separada y diferente, es decir, separada y diferente de la composición rAAV. En la administración, la composición rAAV y/o cápsides vacías y/o inmunosupresor de la invención se administra a un individuo, una célula, tejido u órgano de dicho individuo, preferiblemente un individuo que padece una afección o enfermedad tal y como se define en el presente documento. Preferiblemente, la composición rAAV y el inmunosupresor se administran simultáneamente. La administración simultánea debe entenderse en el presente documento como la administración en más o menos el mismo momento, preferiblemente no separada más de 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 12 horas o 24 horas en el tiempo, preferiblemente no separada más de 15 min en el tiempo. En otra forma de realización, la composición rAAv y el inmunosupresor se administran secuencialmente, donde preferiblemente el inmunosupresor se administra antes de la composición rAAV. Preferiblemente, el inmunosupresor se administra al menos 1 hora, 3 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 4 días o 1 semana antes de la administración de la composición rAAV. En caso de que los viriones rAAV y las cápsides vacías estén presentes en composiciones separadas, el inmunosupresor se puede administrar simultáneamente o dentro de al menos 15 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 1 día, 2 días o 1 semana antes de las cápsides vacías, y las cápsides vacías se administran a su vez simultáneamente o dentro de al menos 15 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 1 día, 2 días o 3 días antes del virión rAAV.

[0072] En las formas de realización definidas en el presente documento, el inmunosupresor se puede administrar repetidamente, es decir, antes y/o simultáneamente con la composición rAAV. Como se ha indicado anteriormente en el presente documento, preferiblemente la composición rAAV comprende una cantidad significativa de cápsides vacías. Además, la invención abarca la administración tanto de vectores de transgén rAAV como de cápsides vacías en composiciones separadas y diferentes, que se puede administrar simultánea o secuencialmente en un método o uso de la invención. Si están comprendidos en composiciones separadas, los vectores de transgén rAAV y las cápsides vacías se administran preferiblemente simultáneamente. En otra forma de realización, las cápsides vacías se administran como máximo 3 días, 2 días, 1 día, 24 horas, 12 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 min, 15 min o 5 min, preferiblemente como máximo 24 horas, antes de la administración del vector de transgén rAAV. Además, si están comprendidos en composiciones separadas, los vectores de transgén rAAV y las cápsides vacías se administran preferiblemente en el mismo sitio.

[0073] La dosis de inmunosupresor depende del tipo de inmunosupresor. Las dosis efectivas son conocidas por el experto en la materia. Una dosis terapéutica efectiva preferida de triamcinolona se indica arriba. Una dosis terapéutica efectiva preferida de clodronato liposómico es preferiblemente una dosis efectiva terapéutica conocida por el experto en la materia, por ejemplo, preferiblemente 80-320 mg/dosis intraarticular, más preferiblemente 160 mg/dosis intraarticular (Barreraet al.2000, Arthritis & Rheumatism Vol 43(9), p1951-1959).

[0074] Generalmente, un trastorno de articulación se denomina artropatía, y cuando implica inflamación de una o más articulaciones, el trastorno se denomina artritis. La mayoría de trastornos de articulación implican artritis; sin embargo, el daño articular provocado por un traumatismo físico externo no se denomina normalmente artritis. El término "enfermedad artrítica”, según se utiliza en el presente documento, que también se denomina "artritis", se define aquí como una forma de trastorno articular que implica inflamación de una o más articulaciones. Actualmente, se calcula que existen más de un centenar de formas distintas de artritis. Se entiende que la enfermedad artrítica hace referencia en el presente documento a "dolor articular" o "enfermedad articular". En una forma de realización preferida, la enfermedad artrítica se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Still con aparición adulta, espondilitis anquilosante, artritis, dolor de espalda, enfermedad de Behqet, bursitis, enfermedad por depósito de pirofosfato de calcio (CPPD), síndrome del túnel carpiano, condromalacia rotuliana, síndrome de fatiga crónica, síndrome de dolor regional complejo, síndromes periódicos asociados a criopirina (CAPS), enfermedad de disco degenerativo, displasia del desarrollo de la cadera, Ehlers-Danlos, fiebre mediterránea familiar, fibromialgia, quinta enfermedad, arteritis de células gigantes, gota, hemocromatosis, artritis infecciosa, artritis inflamatoria, enfermedad inflamatoria intestinal, reemplazo articular, artritis juvenil, dermatomiositis juvenil (JD), artritis idiopática juvenil (JIA), artritis reumatoide juvenil, esclerodermia juvenil, enfermedad de Kawasaki, lupus, lupus en niños y adolescentes, enfermedad de Lyme, enfermedad mixta del tejido conectivo, miositis (incluyendo polimiositis, dermatomiositis), osteoartritis (OA), osteoporosis, paget, reumatismo palindrómico, síndrome de dolor rotulofemoral, enfermedades reumáticas pediátricas, SLE pediátrico, polimialgia reumática, pseudogota, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, artritis reactiva, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, fiebre reumática, reumatismo, artritis reumatoide, esclerodermia, artritis séptica, enfermedad de Sjogren, estenosis espinal, espondiloartritis, enfermedad de Still, artritis idiopática juvenil sistémica, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso sistémico en niños y adolescentes, esclerosis sistémica, arteritis temporal, tendinitis, vasculitis y granulomatosis de Wegener. En otra forma de realización preferida, la enfermedad artrítica se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA), artritis reumatoide juvenil, osteoartritis (OA), gota, pseudogota, espondiloartritis (SpA), artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis séptica, artritis, artritis idiopática juvenil, reemplazo articular y enfermedad de Still. En una forma de realización más preferida, la enfermedad artrítica es un trastorno articular que implica la inflamación de una o más articulaciones. Preferiblemente, la enfermedad artrítica se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA), artritis reumatoide juvenil, osteoartritis (OA), gota, pseudogota, espondiloartritis (SpA), artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis séptica, artritis, artritis idiopática juvenil y enfermedad de Still.

[0075] Alternativamente, o en combinación con otra forma de realización, en otra forma de realización preferida de la presente invención, el virión rAAV o la composición rAAV se administra sistémicamente y/o localmente. Una composición rAAV y/o cápsides vacías y/o un inmunosupresor de la invención se puede administrar directa o indirectamente usando medios adecuados conocidos en la técnica. Los métodos y usos de la invención incluyen la administración y suministro de la composición rAAV y/o vector vacío y/o inmunosupresor sistémicamente, regional o localmente, o por cualquiera vía, por ejemplo, por inyección, infusión, oralmente (por ejemplo, ingesta o inhalación), o tópicamente (por ejemplo, por vía transdérmica). Entre los ejemplos de vías de suministro y administración se incluye la vía intravenoso (í.v.), intraarticular, intraperitoneal (i.p.), intraarterial, intramuscular, parenteral, subcutánea, intrapleural, tópica, dérmica, intradérmica, transdérmica, parenteral, por ejemplo, transmucosa, intracraneal, intraespinal, oral (alimentaria), por mucosa, por respiración, intranasal, por intubación, intrapulmonar, instilación intrapulmonar, bucal, sublingual, intravascular, intratecal, intracavidad, iontoforética, intraocular, oftálmica, óptica, intraglandular, intraórgano, intralinfática. Se anticipan mejoras en medios para proporcionar a un individuo o una célula, tejido, órgano de dicho individuo una composición rAAV y/o cápsides vacías y/o un inmunosupresor de la invención, teniendo en cuenta el progreso que ya se ha conseguido hasta ahora. Evidentemente, dichas mejoras futuras pueden incorporarse para conseguir el efecto mencionado de la invención. Cuando se administra una composición rAAV y/o cápsides vacías y/o un inmunosupresor de la invención, se prefiere que dicha combinación y/o composición se disuelva en una solución que sea compatible con el método de suministro. Para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal, intraarticular y/o intraventricular, se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. En el caso de que haya presente un inmunosupresor en la composición rAAV de la invención, el inmunosupresor se administra en el mismo sitio que la composición rAAV, es decir, preferiblemente localmente, como se ha indicado arriba. En la forma de realización en la que el inmunosupresor está comprendido en una composición separada diferente de la composición rAAV, el inmunosupresor se puede administrar sistémicamente, preferiblemente intramuscularmente o por vía intravenosa. La composición rAAV también se puede administrar localmente, preferiblemente en un sitio del cuerpo que comprenda cantidades sustanciales de macrófagos según lo definido en el presente documento, y el inmunosupresor es administrado sistémicamente, preferiblemente intramuscularmente o por vía intravenosa. En la invención también se abarca una forma de realización en la que el inmunosupresor y la composición rAAV, aunque estén presentes en composiciones diferentes, se administran en el mismo sitio, preferiblemente localmente, más preferiblemente por vía intraarticular. Como se indica también en el presente documento, la administración de tales composiciones diferentes puede ser simultánea o bien secuencial. En una forma de realización preferida de la presente invención, al menos uno de la composición rAAV y el inmunosupresor se administra localmente. Más preferiblemente, la administración local es administración intraarticular. En el presente documento, "inyección intraarticular" (también conocida como "inyección articular” o "inyección intraarticular") se define como inyección o infusión en la articulación. La inyección intraarticular se suele utilizar para la administración de un agente antiinflamatorio en una articulación afectada por inflamación.

[0076] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición rAAV que comprende un virión rAAV de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable según lo definido en el presente documento. En una forma de realización preferida, la composición comprende, además, cápsides vacías según lo definido en el presente documento y/o un inmunosupresor según lo definido en el presente documento.

[0077] Las referencias a los métodos de tratamiento, prevención o síntomas de supresión asociados a una enfermedad artrítica se deben interpretar como referencias a un virión rAAV o una composición rAAV para su uso en esos métodos. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para el tratamiento, prevención, o supresión de síntomas asociados a una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas, y donde el método comprende la etapa de administración intraarticular de un medicamento que comprende una cantidad efectiva de un virión rAAV según lo definido en el presente documento o de una composición rAAV según se ha definido anteriormente.

[0078] Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, virión rAAV o composición farmacéutica puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del sujeto que se va a tratar, y la capacidad del ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, virión rAAV o composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el sujeto. Las pautas de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente efectiva también suele ser una en la que cualquier efecto nocivo o tóxico del ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, virión rAAV o composición farmacéutica es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado, tal como la prevención o inhibición de varias afecciones. Una dosis profiláctica se puede usar en sujetos antes o en una fase temprana de la enfermedad, y una cantidad profilácticamente efectiva puede ser mayor o menor que una cantidad terapéuticamente efectiva en algunos casos. La dosificación que se va a administrar puede depender en gran parte de la condición y el tamaño del sujeto que se va a tratar, así como de la formulación terapéutica, frecuencia de tratamiento y la vía de administración. Los regímenes para continuar la terapia, incluyendo dosis, formulación y frecuencia, se pueden guiar por la respuesta inicial y el criterio clínico.

[0079] El término "sujeto" o "paciente" se usa indistintamente en el presente documento, y se refiere a un animal, incluyendo al ser humano, que pueda ser tratado con las composiciones y/o rAAV de la presente invención. Por consiguiente, el término "sujeto" o "paciente" incluye, aunque sin carácter limitativo, un humano, un primate no humano, como chimpancés, y otras especies de simios y monos, o cualquier mamífero, tal como perro, gato, caballo, oveja, cerdo, vaca, etc. En una forma de realización preferida de la presente invención, el sujeto tratado con un rAAV según la presente invención es un mamífero, más preferiblemente un humano, perro, gato o caballo, más preferiblemente un humano.

[0080] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para referirse a que se incluyen los artículos que siguen a la palabra, pero que los artículos no mencionados específicamente no están excluidos. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un/a(s)" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que solo haya uno de los elementos. Por lo tanto, el artículo indefinido "un/a(s)" suele significar "al menos uno/a".

[0081] La palabra "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10, alrededor de 10), significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos el 10 % del valor.

[0082] Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente para fines ilustrativos, y no se pretende que limiten de ningún modo el alcance de la presente invención. La invención se define mediante las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

[0083] La presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, se describirá con más detalle a continuación, en referencia a los dibujos unidos:

Figura 1: cribado de serotipos de cápside en células HEK293T y FLS. Se utilizó lisado crudo que contiene 7 serotipos de cápside mutante (más AAV5) que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) para transducir células HEK293T o 3 líneas celulares FLS diferentes (cada una a partir de un paciente distinto con RA). Tras 72 horas (HEK293T) o 6 días (FLS), en las células se analizó el porcentaje de células que expresaban YFP por citometría de flujo. El panel A muestra el % de células HEK 293T que expresan YFP; el panel B muestra el % de células que expresan YFP en 3 líneas celulares FLS diferentes; el panel C muestra la intensidad fluorescente media (MFI) en células HEK293T; el panel D muestra la MFI en 3 líneas celulares FLS diferentes (todas las células); el panel E muestra la MFI en 3 líneas celulares FLS diferentes (solo población positiva). La leyenda de la muestra se representa en la Tabla 2.

Figura 2: mutantes de cápside muestran un aumento de la expresión de luciferasa frente a wt-AAV5 en células FLS. Se utilizó AAV purificado (4 serotipos mutantes o AAV5) que expresa la proteína de fusión YFP-Luc para transducir tres líneas celulares FLS diferentes de distintos pacientes con RA: BB5498 (FLS 1), BB5540 (FLS 2) y BB7144 (FLS 3) usando dos MOI (20000 o 100000 partículas de rAAV por célula). Tras 4 días, las células se lisaron y se midió la expresión de luciferasa. Los datos se presentan como niveles de expresión absolutos de luciferasa (RLU; barras blancas) o aumento en veces sobre AAV5 (barras negras). El panel A muestra FLS 1 a MOI 2oK; el panel B muestra FLS 1 a MOI 100K; el panel C muestra FLS 2 a Mo I 20K; el panel D muestra FLS 2 a MOI 100K; el panel E muestra FLS 3 a MOI 20k ; y el panel F muestra FLS 3 a MOI 1o0K. Las barras abiertas muestran luciferasa (RLU) y las barras rellenas muestran el "aumento en veces" sobre AAV5. En un experimento diferente, tres líneas celulares FLS adicionales de pacientes con RA se transdujeron con AAV (7 serotipos mutantes o AAV5) que expresan luciferasa: BB4308 (FLS 4), BX 1592 (FLS 5), BB4426 (FLS 6) usando 2 MOI (10K o 100K partículas de rAAV por célula). El panel G muestra FLS 4 a MOI 10K; el panel H muestra FLS 4 a MOI 100K; el panel I muestra FLS 5 a m Oi 10K; el panel J muestra FLS 5 a MOI 1o0k ; el panel K muestra FLS 6 a MOI 10K; y el panel L muestra FLS 3 a MOI i 0oK.

También se evaluó la eficacia de transducción de los 7 serotipos mutantes o AAV5 (MOi 100K) en células HEK293T (panel M). Las barras abiertas muestran expresión de luciferasa (RLU) y las barras rellenas muestran el "incremento en veces” sobre AAV5.

Figura 3A: Ios mutantes de cápside muestran un aumento de la expresión génicain vivo.Dos mutantes de cápside (AAV9-A2 y AAV7-A6) se compararon con wtAAV5 usando el modelo sinovial de bolsa de aire. El vector que expresa luciferasa se administró en el día 0 tras la formación de la bolsa de aire y la expresión de luciferasa se midió mediante la toma de imágenes de animales vivos (IVIS) en el día 3 después de la transducción. Los datos representados son la luminiscencia (fotón/segundo/ centímetro cuadrado m2/ estereorradián) en la bolsa de aire en media+SEM.

Figura 3B: en un segundo experimento, se inyectaron 5 mutantes de cápside seleccionadas (AAV1-P4, AAV7-A6, AAV9-A2, AAVrh10-A2; AAVrh10-A6) y wtAAV5 en las articulaciones de rodilla de ratones. Se inyectó un vector que expresa luciferasa en el día 0 y se midió la expresión mediante la toma de imágenes en vivo (IVIS) en momentos indicados tras la administración. Los datos mostrados son la luminiscencia (fotón/segundo/centímetro cuadrado m2/estereorradián)(panel izquierdo) en media+SEM. **P<0,05, ***P<0,01, ****P<0,00001 frente a wtAAV5 en el día 14. Figura 3C: incremento en veces frente a wtAAV5. Figura 4: alineamiento de formato CLUSTAL mediante MAFFT FFT-NS-I (v7.215). Por debajo del alineamiento hay una clave que indica un residuo conservado (*); y una mutación no conservadora ().

Figura 5: alineamiento de secuencia múltiple CLUSTAL mediante MUSCLE (3.8). Por debajo del alineamiento hay una clave que indica un residuo conservado (*); una mutación conservadora (:); una mutación semiconservadora (.); y una mutación no conservadora ().

Figura 6: alineamiento de formato CLUSTAL de insertos P4, A2, A6, P2 y QR-P2 (SEQ ID N.º: 8 - 12) mediante MAFFT FFT-NS-I (v7.215). Por debajo del alineamiento hay una clave que indica un residuo conservado (*); y una mutación no conservadora ().

Figura 7: alineamiento de secuencia múltiple ClUsTAL de insertos P4, A2, A6, P2 y QR-P2 (SEQ ID N.º: 8 12) mediante MUSCLE (3.8). Por debajo del alineamiento hay una clave que indica un residuo conservado (*); y una mutación no conservadora ().

Listado de secuencias

[0084] La Tabla 1 proporciona una explicación de las referencias de secuencia en correlación con la SEQ ID N.o.

T l 1: Ex li i n r f r n i n i

Ejemplos

Ejemplo 1

Cribado inicial de biblioteca de cápside

1.1. Materiales y métodos

[0085] Se obtuvieron placas de 96 pocilios manchadas (y posteriormente secadas) con lisado crudo que contiene AAV de 91 serotipos diferentes de cápside AAV de Dirk Grimm y Kathleen Borner de la Universidad de Heidelberg. Cada vector codificó un transgén YFP impulsado por un promotor CMV. Como FLS son las células diana principales en la articulación, se cribó una biblioteca de mutantes de cápside AAV para determinar los serotipos que muestran un aumento de la expresión en FLS humanos aislados de articulaciones de pacientes con artritis reumatoide (RA-FLS) (como se describe en van de Sande MGet al.,(2011) Ann Rheum Dis 70: 423 427). Las RA-FLS se colocaron en placas (2500/pocillo, 370C / 5 % de CO2) directamente sobre las placas manchadas (DMEM-GlutaMAX-l (Gibco, ref. 31966-021), 10 % de FBS (calor inactivado (Hl) suero bovino Gold, Gibco, ref A15-151), 10 mM de HEPES (Gibco, ref. 15630-056), 50 gg/ml de gentamicina (Gibco, ref. 15710 049), 100U/ml de penicilina/ 100gg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, ref. P0781) y todos los pocilios se visualizaron para determinar la expresión de YFP mediante microscopía de fluorescencia después 6 días.

1.2. Resultados

[0086] Eficacia de transducción de mutantes de cápside frente a WT-AAV5 en FLS de pacientes con RA.

[0087] En el cribado de las 91 mutantes de cápside, mientras los niveles de expresión generales fueron bajos, los presentes inventores identificaron 7 serotipos diferentes que mostraron una maYor expresión que wtAAV5: AAV9-A2, AAV7-A6, AAV1-P4, AAVDJ-QR-P2, AAVrh10-A6, AAVrh10-A2 y AAV2-P2 (secuencias de aminoácidos SEQ ID N.º: 1 - 7; wtAAV5 SEQ ID N.º: 19).

[0088] Se usaron lisados crudos de los 7 vectores en un ensaYo de transducciónin vitroen 3 líneas celulares FLS de distintos pacientes y en células HEK293T (ejemplo 2).

T l 2: L n m r r l fi r 1

Ejemplo 2

Expresión de lisados crudos de 7 mutantes seleccionados

2.1. Materiales y métodos

Producción de AAV

[0089] Se pueden encontrar detalles sobre la producción de los lisados de AAV crudos en Grosseet al.(J. Virol, 2017, doi: 10.1128/JVI.01198-17).

[0090] Se utilizaron alícuotas de lisado crudo para cada una de las 7 mutantes de cápside seleccionadas (más wtAAV5 como control) para transducir células (HEK293T o 3 líneas celulares FLS diferentes aisladas de pacientes con RA) y se midió la expresión de YFP por citometría de flujo 3 días (HEK293T) y 5 días (FLS) después de la transducción. De forma detallada, se sembraron HEK293T en una placa de 96 pocilios (Greiner Bio-One, ref. 655180) a 45 000 células por pocilio. Se sembraron RA-FLS en una placa de 96 pocilios a 2500 células por pocilio. Después de la incubación durante toda la noche, los sobrenadantes celulares se sustituYeron por 40 |_il de DMEM-glutaMAX-l (Gibco 31966-021) que contenía 0,001 % de solución de F68 plurónico (Sigma P5556). Los lisados de virus se añadieron por duplicado, 10 gl por pocilio. Tras 4 horas, se añadió doxorrubicina (concentración final 0,4 gM) (Sigma D1515) en DMEM-glutaMAX-l que contenía FBS (calor inactivado (Hl), suero bovino Gold, Gibco, ref A15-151), concentración final 1 %) a los pocilios (50 gl por pocilio). El día después, el medio de FLS se eliminó y se añadió DMEM-glutaMAX-1 (10 % de FBS (calor inactivado (Hl), suero bovino Gold, Gibco, ref A15-151), 10 mM de HEPES (Gibco, ref. 15630), 50 gg/ml de gentamicina (Gibco ref. 15710-049), 100 U/ml de penicilina/100 gg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, ref. P0781)) (200 gl por pocilio). El medio de células HEK293T no se modificó. Tres días (células HEK293T) o 6 días (FLS) después de la transducción, las células se tripsinizaron usando 0,5 % de tripsina/EDTA (Gibco ref. 15400-054) en PbS (Gibco, ref. 10010) y se analizaron para determinar la expresión de YFP por citometría de flujo (FACSCanto ll, BD Biosciences). Se determinó tanto el porcentaje de células que expresan como la media intensidad de fluorescencia (MFl) para todas las células.

2.2. Resultados

[0091] Se utilizaron lisados crudos de los 7 vectores en un ensaYo de transducciónin vitroen 3 líneas celulares FLS de pacientes distintos y en células HEK293T. En las células se evaluó el porcentaje de células que expresan YFP por microscopía de fluorescencia (datos no representados) o citometría de flujo (paneles A - E de la figura 1). A pesar de que hubo algo de variabilidad entre tipos celulares, todas las cápsides mutantes proporcionaron una maYor expresión tanto en células FLS como HEK293T que en AAV5-WT (Figura 1). La Tabla 2 proporciona la leYenda de la muestra para la Figura 1. Basándose en estos resultados, se seleccionaron cuatro mutantes de cápside para investigación adicional (véase el ejemplo 3).

Ejemplo 3

Ensayo in vitro de variantes de cápside en HEK293Ty FLS

3.1 Materiales y métodos

[0092] 3.1.1 Cuatro de las proteínas de cápside mutantes, AAV9-A2, AAV7-A6, AAV1-P4 y AAVDJ-QR-P2, se investigaron más. Se generó un vector purificado (gradiente de lodixanol) que expresaba una proteína de fusión YFP-Luciferasa (para permitir la visualización (YFP), así como la cuantificación por ensaYo de luciferasa). Tres líneas FLS primarias diferentes aisladas de pacientes con artritis reumatoide (según se describe en van de Sande MGet al.,(2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427) se transdujeron con cada serotipo con 2 dosis de vector (MOl 20 000 o 100 000) y después de 4 días, las células se recolectaron y se cuantificó la expresión génica mediante ensaYo de luciferasa (kit de ensaYo de luciferasa Promega).

[0093] De forma detallada, las RA-FLS se colocaron en placas a 2500 células/pocillo en una placa de 96 pocilios (Greiner Bio-One, ref. 655207) en medio (DMEM-GlutaMAX (Gibco ref. 31966-021), 10 % de FBS (calor inactivado (Hl), suero bovino Gold, ref. A15-151), 10 mM de HEPES (Gibco ref. 15630-056), 50 gg/ml de gentamicina (Gibco, ref 15710-049), 100 u/ml de penicilina/100 gg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich Merck ref. P0781). Tras 48 h, el medio se retiró y se añadió el virus (en DMEM-Glutamax que contenía un 0,001 % de 68 Plurónico (Sigma, ref. P5556)) a una Mol de 20 000 o 1o0000. Tras 4 h, se añadió el medio que contenía doxorrubicina (Sigma, ref. D1515, concentración final 0,4 gM) y FBS (concentración final 1 %).

[0094] 24 horas después, el medio se sustituYÓ por DMEM-GlutaMAX, (10 % de FBS, 10 mM de HEPES, 50 gg/ml de gentamicina, 100 u/ml de penicilina, 100 gg/ml de estreptomicina). Cuatro días después de la transducción, las células se lavaron 1x con 100 gl de PBS (Gibco, ref. 10010) y se determinó la actividad de luciferasa usando el sistema de ensaYo de luciferasa ONE Glo™ (Promega, ref. E6110): se añadieron 100 gl de tampón de lisis y las células se colocaron en un agitador durante 10', 900 rpm a temperatura ambiente. Posteriormente, se transfirieron 20 gl de lisado a una placa blanca de 96 pocilios, 80 gl sustrato (se añadieron durante 3' (oscuridad) y se determinó la actividad de luciferasa en un luminómetro (1 s/pocillo, sinergia HT, Biotek).

[0095] 3.1.2. En un experimento similar, se transdujeron tres líneas celulares FLS adicionales aisladas de pacientes con artritis reumatoide con AAV5 y 7 mutantes de cápside a partir de una preparación AAV diferente de la descrita en 3.1.1 (AAV9-A2, AAV1-P4, AAV7-A6, AAVDJ-QR-P2, AAVrh10-A6, AAVrh10-A2, AAV2-P2) que contenía un gen de luciferasa (MOI 10 000 y 100 000). El número de partículas vacías difirió entre las preparaciones AAV. Para excluir un posible efecto en la eficacia de transducción, se realizó una corrección de cápside vacía mediante la adición de partículas vacías de AAV5 para igualar el porcentaje de partículas vacías por preparación.

[0096] 3.1.3. Las 7 mutantes de cápside de la misma preparación que se describe en 3.1.2 se analizaron también en células HEK293T. De forma detallada, se sembraron HEK293T en una placa de 96 pocilios (Greiner Bio-One, ref. 655180) a 50 000 células por pocilio. Después de la incubación durante toda la noche, los sobrenadantes celulares se sustituyeron por DMEM-glutaMAX-l (Gibco 31966-021) que contenía un 0,001 % de solución de F68 plurónico (Sigma P5556). Los vectores diferentes se añadieron por duplicado, en una MOI de 100000. En este protocolo, la corrección de cápside vacía se realizó como se describe para 3.1.2. Tras 4 horas, se añadió en los pocilios doxorrubicina (concentración final de 0,4 μM) (Sigma D1515) en FBS que contenía DMEM-glutaMAX-l (calor inactivado (Hl), suero bovino Gold, Gibco, ref A15-151), concentración final 1 %. Tres días después de la transducción, las células se recolectaron y se cuantificó la expresión génica mediante el ensayo de luciferasa (kit de ensayo de luciferasa Promega) en un luminómetro (BMG Labtech Fluostar Omega).

3.2. Resultados

[0097] 3.2.1 Se realizaron transduccionesin vitrode tres líneas celulares FLS diferentes usando AAV recombinante que comprendía una de las 4 cápsides mutantes (así como AAV5 como control, realizada del mismo modo) siguiendo el protocolo descrito en 3.1.1. Los 4 serotipos mostraron niveles de expresión aumentados en comparación con AAV5, oscilando entre incrementos de 2 veces e incrementos de 35 veces, en función del serotipo y línea celular usados (Figura 2A-F).

[0098] 3.2.2 En otra serie de experimentos, se evaluó la eficacia de transducciónin vitrode 7 cápsides mutantes (así como control AAV5, realizado de la misma manera) en 3 líneas celulares FLS. Los 7 serotipos mostraron niveles de expresión de luciferasa aumentados en comparación con AAV5, oscilando entre incrementos de 6 veces e incrementos de 55 veces en función del serotipo y la línea celular utilizados (Figura 2G-L).

[0099] 3.2.3 Se realizó experimento similar en células HEK293T. La transducción con los 7 serotipos dio como resultado una mejor expresión de luciferasa en comparación con wtAAV5, oscilando entre incrementos de 2 veces e incrementos de 12 veces (Figura 2M).

Ejemplo 4

Estudio in vivo en el modelo sinovial de bolsa de aire

4.1. Materiales y métodos

Animales

[0100] Los ratones Balb/C hembra (8-10 semanas de edad y peso de 20-25 g; (Harían, Boxmeer, Países Bajos)) se alojaron en jaulas ventiladas individuales en la instalación animal del Centro Médico Académico, Ámsterdam. El alimento y el agua estaban disponiblesad libitum.Todos los experimentos animales se realizaron según las directrices del Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad de Ámsterdam.

Modelo sinovial de bolsa de aire(APS)

[0101] Dos serotipos, AAV9-A2 y AAV7-A6, se compararon frente a wtAAV5. El modelo sinovial de bolsa de aire se adaptó de Edwardset al(1981; J Pathol 134: 147-156). En el día 0, se inyectaron 3 ml de aire subcutáneamente en la piel dorsal de ratones Balb/cOlaHsd hembra de 7-9 semanas de edad (Harían) (día 0). Inmediatamente después de la formación de la bolsa de aire, se extrajo 1 ml de aire y se añadió 1 ml de AAV (vector 2e10 genomas/ratón en PBS (Gibco, ref. 10010 que contenía 0,001 % de F68 plurónico (Sigma; ref. p5556) directamente en la bolsa de aire. Tres días después de la transducción, se midió la expresión génica mediante la toma de imágenes animalesin vivo.

Toma de imágenes de expresión de luciferasa

[0102] La expresión de luciferasa se midió en el día 3. Al principio, se planeó continuar monitorizando la expresión hasta 3 meses después de la administración del vector; sin embargo, una infección de parvovirus de la instalación animal dio como resultado la finalización prematura de todos los experimentos en curso. Se inyectó intraperitonealmente sustrato de sal de potasio de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, Massachusetts, EE. UU.) (150 mg/kg de peso corporal, en un volumen de aproximadamente 200 μl). Los recuentos de fotón se adquirieron 10 min después de la administración de sustrato durante 5 min usando un sistema de cámara con dispositivo acoplado a la carga enfriado (CCD) (Photon Imager, Biospace Lab, París, Francia) y el procesamiento de imágenes y la cuantificación y análisis de la intensidad de señal se realizaron utilizando M3 Vision (Biospace Lab). El número de fotones emitidos por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián se calculó como una medida de actividad de luciferasa.

Condiciones generales del animal y declaración ética

[0103] La formación de la bolsa de aire, la administración del vector y la captación de imágenesin vivose realizaron con anestesia de isoflurano (3 % de isoflurano y oxígeno). Al final de los experimentos, los animales fueron sacrificados por punción cardíaca con anestesia de isoflurano, seguida de dislocación cervical. Los estudios fueron revisados y aprobados por el comité de cuidado y uso animal de la Universidad de Ámsterdam y se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con las recomendaciones de la ley neerlandesa sobre bienestar animal (en neerlandés: "Wet op Dierproeven"). Los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógeno en la instalación animal de la Universidad de Ámsterdam.

4.2. Resultados

[0104] En función de estos resultados prometedores, se realizó un estudio preliminarin vivousando el modelo sinovial de bolsa de aire (APS), donde dos serotipos, AAV9-A2 y AAV7-a 6, se compararon frente a wtAAV5. Debido a una infección desafortunada en la instalación animal que requirió la finalización prematura de este estudio, solo se pudieron obtener datos de un único momento, el día 3 después de la administración del vector. En ese momento, estaba claro que las mutantes de cápside estaban dando lugar a un aumento de la expresión génica en comparación con AAV5, con AAV7-A6 mostrando incrementos de 6 veces en la expresión y<a>AV9-A2 de 22 veces (Figura 3A).

Ejemplo 5:

Estudio in vivo: inyecciones intraarticulares en animales sanos

5.1. Material y métodos

Animales

[0105] Los ratones DBA1/J macho (12 semanas de edad, Envigo) se alojaron en jaulas ventiladas individuales en la instalación animal del Centro Médico Académico, Ámsterdam. El alimento y el agua estaban disponiblesad libitum.Los experimentos animales fueron realizados después de la aprobación de la Comisión Central de Experimentos Animales (CCD) y el Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad de Ámsterdam, Países Bajos.

Estudio de expresión

[0106] Cinco rAAV que comprendían mutantes de cápside, es decir, AAV9-A2, AAV1-P4, AAV7-A6, AAVrh10-A6 y AAVrh10-A2 se compararon frente a wtAAV5. Puesto que la carga de cápside puede afectar a la expresión (Aalbers CJet al.,Hum Gene Ther 2017;28 (2):168-178), las preparaciones rAAV fueron corregidas para la carga de cápside añadiendo partículas vacías den wtAAV5. Los ratones sanos (n=9 por grupo) recibieron inyecciones intraarticulares de vector AAV que llevaba el gen de luciferasa en ambas rodillas (7,5<x>109 genomas virales por rodilla). La expresión génica se determinó mediante la captación de imágenesin vivoen varios momentos después de la administración del vector.

Toma de imágenes de expresión de luciferasa

[0107] La expresión de luciferasa se determinó en momentos indicados (Fig 3B). En cada momento, se inyectó intraperitonealmente sustrato de sal de potasio de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, Massachusetts, EE. UU.) (150 mg/kg de peso corporal, en un volumen de aproximadamente 200 |_il). Los recuentos de fotón se adquirieron 15 min después de la administración de sustrato durante 5 min usando un sistema de cámara con dispositivo acoplado de carga enfriado (CCD) (Photon Imager, Biospace Lab, París, Francia). El procesamiento de imágenes y la cuantificación y el análisis de la intensidad de señal se realizaron usando M3 Vision (Biospace Lab). El número de fotones emitidos por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián se calculó como medida de la actividad de luciferasa.

Condiciones generales del animal y declaración ética

[0108] La administración del vector y la toma de imágenesin vivose realizaron con anestesia de isoflurano (4 % de isoflurano y oxígeno). Los estudios se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con las recomendaciones de la ley neerlandesa sobre bienestar animal (en neerlandés: "Wet op Dierproeven"). Los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógeno en la instalación animal de la Universidad de Ámsterdam.

5.2. Resultados

[0109] En el primer momento, el día 3, se detecta expresión mediada por AAV en la rodilla en todos los grupos y aumenta con el tiempo (Figura 3B). Todos los mutantes de cápside excepto AAV1-P4 muestran expresión aumentada frente a wtAAV5 con AAV9-A2 mostrando la máxima expresión (incrementos de 5 veces frente a wtAAV5 en el día 14) (Figura 3C). Niveles de expresión en el día 14 de mayor a menor: AAV9-A2 > AAVrh10-A2 > AAVrh10-A6 > AAV7-A6 > wtAAV5 > AAV1-P4. En el día 7, AAVrh10-A2, AAV9-A2 y AAVrh10-A6 muestran un aumento significativo de la expresión frente a wtAAV5 (**P<0,05, ***P<0,01, ****P<0,00001 frente a wtAAV5 en el día 14 (Figura 3B).

Ejemplo 6:

Determinación de títulos de anticuerpo de neutralización contra mutantes de cápside en sueros humanos6.1 Material y métodos

[0110] Las células HEK293T se colocaron en placas en DMEM que contenía 9 % de FBS, 0,9 % de penicilina/estreptomicina en placas de fondo claro de 96 pocilios. Las células se dejaron reposar durante 24 horas (a 370C, 5 % de CO2) antes de la transducción. Las muestras de suero humano (obtenidas del instituto de sangre francés) se diluyeron de la siguiente manera: suero no diluido nítido - 1:4 -1:16 - 1:64 - 1:256 - 1:1024 (suero nítido significa 1 volumen de virus por 1 volumen de suero). Una muestra de plasma de ratón agrupado (de 10 DBA/1 ratones, tomada 42 días después de la inyección intraarticular de un vector AAV5) se diluyó en serie en FBS de la siguiente manera: 1:10 - 1:50 - 1:250 - 1:6250 - 1:31.25o. Una solución de inmunoglobulina intravenosa humana (IVig, Sanquin, lote 15D30H4560A) se diluyó en serie semilogarítmica de 1:10 hasta 1:10.00o. Las muestras y controles se incubaron junto con el mutante de cápside apropiado o el vector wtAAV5 durante 30' ± 5 min a 35-38 °C a una MOI de 2500 (según lo determinado anteriormente). Tras 48 ± 2 horas, se añadió el reactivo de luciferasa y se midió la emisión de luminiscencia con el lector de microplacas VictorX. Los títulos de inhibición de transducción se determinaron como la mayor dilución de suero asociada todavía a una actividad neutralizante detectable, es decir, una actividad neutralizante >50 %.

6.2 Resultados

[0111] Como se presenta en la Tabla 3, el 70 %-85 % de las muestras no contenían anticuerpos de neutralización contra wtAAV5 o las 7 mutantes de cápside. La mayoría de las muestras compartían reactividad contra las siete mutantes de cápside, por lo que una muestra de suero que tiene reactividad contra la cápside AAV5 de tipo silvestre también reaccionó contra otras cápsides. En cuanto al nivel de respuesta, estos también fueron comparables entre mutantes de cápside. Para cada mutante de cápside, se indica el número de muestras que no reaccionaron (ND = no detectado). Estos datos solo se proporcionan como información, ya que es muy difícil comparar títulos con vectores diferentes. Con respecto a la muestra de suero de ratón agrupado de articulaciones con inyección intraarticular, solo reaccionó contra la cápside AAV5 WT que se usó para inmunizar a los animales, mientras que no se observó ninguna respuesta contra las cápsides mutantes (Tabla 3). Las mutantes de cápside y AAV5 WT se neutralizaron mediante IVig (títulos >100) (datos no representados).

Tabla 3: Para cada muestra de suero, así como el plasma de ratón agrupado, se indica el título inhibidor y corresponde a la mayor dilución asociada todavía a una actividad neutralizante detectable. Títulos > 8 se consideran seropositivos.

Las señales positivas se destacan en negrita/cursiva. ND = no detectable

Claims

REIVINDICACIONES

1. Virión de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una proteína de cápside modificada para su uso en el tratamiento prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica,

donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas,

donde la proteína de cápside modificada comprende en la parte C-terminal de la proteína una secuencia de aminoácidos Z, cuyos residuos están expuestos en la superficie de la proteína de cápside, y

donde la secuencia de aminoácidos Z:

y - G - Q - x - G -(x)3- R -(x)3 - y - A - Q - A - A

donde x representa un único residuo de aminoácido y donde y representa 0, 1 o 2 residuos de aminoácido; y

b. está presente en una ubicación que corresponde con una posición 100 - 200, preferiblemente 120 -180, más preferiblemente 130 - 170, más preferiblemente l4o - 160 residuos de aminoácidos del C terminal de una proteína de cápside de AAV de tipo silvestre.

2. Virión rAAV para su uso según la reivindicación 1, donde la secuencia Z está comprendida en la proteína de cápside modificada en una ubicación representada por la fórmula II:

EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG

c. donde Z, x e y son como se define en la reivindicación 1; y

d. donde n es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.

3. Virión rAAV para su uso según la reivindicación 1, donde la proteína de cápside comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 1 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 1 tienen al menos un 80 % identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 11,

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 2 y donde los aminoácidos en las posiciones 585 - 599 de SEQ ID n .0: 2 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 10,

iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 3 y donde los aminoácidos en las posiciones 587 - 601 de SEQ ID n .0: 3 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID n .0: 9,

iv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 4 y donde los aminoácidos en las posiciones 586 - 600 de SEQ ID N.º: 4 tienen al menos un 80 % identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 8,

v) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 5 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 5 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID n .0: 9,

vi) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID N.º: 6 y donde los aminoácidos en las posiciones 588 - 602 de SEQ ID N.º: 6 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 8, y

vii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID n .0: 7 y donde los aminoácidos en las posiciones 587 - 601 de SEQ ID n .0: 7 tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 12,

donde la proteína de cápside modificada contempla al menos un incremento de dos veces en la expresión, preferiblemente en células FLS humanas, en comparación con una proteína de cápside no modificada con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.º: 13 - 19, cuando se evalúa en las mismas condiciones, donde preferiblemente la proteína de cápside no modificada tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID N.º: 19 o tiene el mismo serotipo que la proteína de cápside modificada.

4. Virión rAAV para su uso según la reivindicación 1 o 3, donde la proteína de cápside comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n .0: 1 - 7.

5. Virión rAAV para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el virión rAAV comprende: i) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV y

ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés, donde preferiblemente la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está localizada entre dos secuencias ITR de AAV.

6. Virión rAAV para su uso según la reivindicación 5, donde el producto génico de interés trata, evita o suprime síntomas asociados con una enfermedad artrítica, donde preferiblemente el producto génico de interés se selecciona del grupo que consiste en interleucinas, inmunomoduladores, anticuerpos, ARNhc, miARN, ARN guía, factores de crecimiento, proteasas, nucleotidasas/nucleosidasas, péptidos, inhibidores de proteasa, inhibidores, enzimas y combinaciones de los mismos, y donde más preferiblemente el producto génico de interés es al menos uno de CD39, CD73 e IFN-0.

7. Virión rAAV para su uso según la reivindicación 5, donde el producto génico de interés es un inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en etanercept, infliximab, adalimumab, certilizumab pegol y golimumab, y donde más preferiblemente el producto génico de interés es etanercept.

8. Virión rAAV para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el virión rAAV comprende al menos uno de:

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al menos un ARN guía; donde el o cada ARN guía es sustancialmente complementario a una(s) secuencia(s) de polinucleótido objetivo en un genoma; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una nucleasa; donde la nucleasa forma un complejo de ribonucleasa con el ARN guía, y donde el complejo de ribonucleasa hace roturas de doble cadena del ADN (DSDB) específicas del sitio en el genoma.

9. Composición rAAV para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas, y donde la composición rAAV comprende un virión rAAV como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Composición rAAV para su uso según la reivindicación 9, donde la composición rAAV comprende, además, una cápside vacía en una proporción entre cápside vacía y virión rAAV de al menos 1:1.

11. Composición rAAV y un inmunosupresor para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad artrítica o para su uso en el tratamiento o prevención de un síntoma asociado con una enfermedad artrítica, donde el síntoma es dolor articular o la inflamación de una o más articulaciones artríticas, y donde la composición rAAV es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 y donde el tratamiento o prevención comprende la administración de la composición rAAV y la administración del inmunosupresor a un individuo.

12. Virión rAAV para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, una composición rAAV para su uso según la reivindicación 9 o 10, o una composición rAAV y un inmunosupresor para su uso según la reivindicación 11, donde la enfermedad artrítica se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA), artritis reumatoide juvenil, osteoartritis (OA), gota, pseudogota, espondiloartritis (SpA), artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis séptica, artritis, artritis idiopática juvenil, reemplazo articular y enfermedad de Still.

13. Virión rAAV para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 y 12 o composición rAAV para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 y 12, donde el virión rAAV o la composición rAAV se administra sistémicamente y/o localmente.

14. Composición rAAV y un inmunosupresor para su uso según la reivindicación 11, donde al menos uno de la composición rAAV y el inmunosupresor se administra localmente.

15. Virión rAAV o composición rAAV para su uso según la reivindicación 13 o composición rAAV y un inmunosupresor para su uso según la reivindicación 14, donde la administración local es administración intraarticular.