ES2957217T3 - Marcadores de vesículas extracelulares para angina estable y angina inestable - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a la determinación de marcadores proteicos asociados con vesículas extracelulares presentes en subfracciones de muestras de plasma tomadas de personas que experimentan dolor en el pecho y se sospecha que padecen una cardiopatía isquémica. La invención se refiere al uso de marcadores en la identificación de sujetos que padecen o corren el riesgo de padecer una cardiopatía isquémica, en particular angina estable y angina inestable. Los marcadores especialmente preferidos son SerpinC1, SerpinG1, CD14, Cistatina C y SerpinF2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Marcadores de vesículas extracelulares para angina estable y angina inestable
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la medicina. Más particularmente, se refiere a un método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable midiendo la concentración o un valor relacionado con la misma de uno o más marcadores de proteína en una o más fracciones de plasma sanguíneo. Los marcadores de proteína son especialmente adecuados para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, y equivalentes de los mismos.
Antecedentes de la técnica
La cardiopatía isquémica es una causa principal de morbimortalidad a nivel mundial. Aunque la terapia para la cardiopatía isquémica ha mejorado en gran medida y la mortalidad se ha reducido gradualmente en los países industrializados durante las últimas décadas, la mortalidad debida a cardiopatía isquémica todavía está aumentando en otras partes del mundo tales como África y partes de Asia (Mathers y Loncar. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS Med. 2006; 3: e442; WHO. World Health Statistics 2013. Ginebra, Suiza; Alwan A. WHO. Global status report on noncommunicable diseases 2010. Ginebra, Suiza). Los síndromes clínicos asociados con cardiopatía isquémica son angina estable, angina inestable e infarto de miocardio.
Angina estable
La arteriopatía coronaria estable es la causa subyacente del síndrome clínico denominado “angina estable”: episodios de dolor torácico inducido por estrés, ejercicio o emociones. La arteriopatía coronaria estable también puede provocar síntomas atípicos tales como disnea o tolerancia reducida al ejercicio. Estos síntomas no se denominan generalmente angina estable, pero pueden denominarse “equivalentes de angina estable” ya que están provocados por el mismo trastorno subyacente. La arteriopatía coronaria estable está generalmente caracterizada por episodios de discrepancia de demanda/suministro de miocardio reversible debido a estenosis significativa en las arterias coronarias. Dado que la aparición de dolor torácico o síntomas equivalentes son en cierto modo predecibles, la enfermedad se denomina angina estable. Con frecuencia se mezclan los términos “angina estable” y “arteriopatía coronaria estable” y con frecuencia se usan en la técnica para referirse a lo mismo. Por motivos de claridad, “angina estable” tal como se usa en el presente documento se refiere a todos los síntomas (episodios de dolor torácico inducido por estrés, ejercicio o emociones predecibles, y síntomas atípicos tales como disnea o tolerancia reducida al ejercicio) que están provocados por arteriopatía coronaria estable. La prevalencia de angina estable varía desde el 5-14% dependiendo del sexo y la edad. La incidencia anual de muerte es del 1,2-2,4% (frente al 0,6% en sujetos sin arteriopatía coronaria obstructiva), y la incidencia anual de infarto de miocardio es del 2,7%. Debido a la variedad de presentación clínica y a un amplio diagnóstico diferencial (tal como problemas musculoesqueléticos o psicológicos, embolia pulmonar, neumonía, neumotórax, pericarditis), el diagnóstico de angina estable es tristemente difícil. Puede remitirse a los pacientes para realizar ECG de esfuerzo u obtención de imágenes no invasiva tal como TAC cardíaco, IRM o gammagrafía. Tales pruebas de obtención de imágenes tienen una sensibilidad y especificidad de aproximadamente el 85% y requieren mucho tiempo y son caras. En muchos casos, se necesita un angiograma coronario invasivo para confirmar el diagnóstico y para determinar las opciones para la revascularización mediante intervención coronaria percutánea o injerto de derivación de arterias coronarias. El estudio diagnóstico es ineficiente y caro. Actualmente no existe ninguna prueba directa rápida para diagnosticar (o descartar) la angina estable.
Angina inestable
Cada año, millones de pacientes acuden a servicios de urgencias con dolor torácico u otros síntomas que sugieren síndrome coronario agudo (ACS). ACS es un estado potencialmente mortal provocado principalmente por formación de trombos intracoronarios que conducen a estrechamiento luminal agudo o incluso oclusión. Hay dos tipos de ACS: angina inestable e infarto de miocardio. El infarto de miocardio puede diagnosticarse rápidamente con ECG y/o elevación de troponina cardíaca en la sangre. La angina inestable es un síndrome coronario inestable, sin signos de lesión de miocardio (tales como un nivel elevado de troponina cardíaca). El término inestable se usa porque, en contraposición a la angina estable, el dolor torácico no es tan predecible y también puede producirse en reposo y generalmente aumenta de intensidad a lo largo del tiempo. El 5% de todas las personas que acuden a los servicios de urgencias con dolor torácico u otros síntomas que sugieren ACS, tienen angina inestable. Un diagnóstico rápido de angina inestable resulta esencial, ya que está asociado con un alto riesgo de acontecimientos cardíacos adversos; más que en el caso de angina estable. Aproximadamente el 35% de los pacientes con angina inestable se someten a revascularización durante la visita inicial. De manera importante, los pacientes con angina inestable no detectados que se envían a casa, con frecuencia vuelven para revascularización dentro del plazo de un año (~50%) o padecen infarto de miocardio (el 8% en 30 días; base de datos MINERVA Meander MC Amersfoort). Al igual que para la angina estable, el diagnóstico para angina inestable resulta similarmente difícil. La troponina es negativa por definición y el ECG sólo resulta diagnóstico en el 10-15% de los casos. Con frecuencia se requiere hospitalización para determinar niveles de troponina cardíaca en serie, pruebas no invasivas tales como ECG de esfuerzo u obtención de imágenes, o un angiograma coronario invasivo. No está disponible ningún marcador de diagnóstico fiable y rápidamente determinare que identifique de manera positiva al paciente con angina inestable o que, por otro lado, excluya la angina inestable.
Biomarcadores en sangre
Evidentemente, tal como se expuso anteriormente, el establecimiento de una identificación oportuna de un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable y angina inestable resulta importante para permitir un tratamiento adecuado. Un diagnóstico temprano preciso puede eliminar los síntomas y mejorar el pronóstico de los pacientes. Además, descartar ambas enfermedades evita derivaciones innecesarias e ingresos hospitalarios para pruebas de diagnóstico invasivas y no invasivas que requieren mucho tiempo, reduciendo por tanto significativamente la carga asistencial. Se desea altamente una prueba rápida y sencilla para todos los pacientes que presenten síntomas que sugieren angina estable e inestable. Se ha reconocido en la técnica que un análisis de sangre es lo más conveniente, ya que es una herramienta de diagnóstico de bajo riesgo y fácilmente accesible tanto en atención primaria como secundaria.
Se han investigado muchas proteínas en relación con angina estable e inestable. El concepto inflamatorio de aterosclerosis condujo a muchos investigadores a centrarse en mediadores inflamatorios tales como hsCRP, GDF-15, neopterina, IL-6, IL-10, IL-17, MPO, procalcitonina, fetuína A, Lp-PLA2 y MMP/TIMP. Aunque estos marcadores tienen cierto valor de pronóstico, ninguno de ellos parece tener un poder diagnóstico suficiente como para distinguir pacientes con angina estable e inestable (Tsakniset al.Clinical usefulness of novel serum and imaging biomarkers in risk stratification of patients with stable angina. Dis Markers 2014:831364).
También se han investigado marcadores distintos de proteína. En un pequeño estudio piloto que implicó a 53 pacientes, tres microARN (miARN) parecieron tener el potencial para distinguir pacientes con angina estable frente a controles. Los miARN son pequeños ARN no codificantes que regulan complejos procesos biológicos. Los miARN que se encontraron fueron miR-1, miR-126, miR-483-5p, que tienen un área bajo la curva (AUC) de 0,91, 0,92 y 0,85, respectivamente (D'Alessandraet al.Diagnostic potential of plasmatic MicroRNA signatures in stable and unstable angina. PLoS One. Noviembre de 2013, 15: 8). Sin embargo, hasta ahora no se han validado estos miARN. En el mismo estudio piloto, también se encontraron tres posibles biomarcadores para angina inestable: miR-1, miR-126 y miR-133a, con AUC de 0,92, 0,87, 0,91, respectivamente. Sin embargo, en contraposición, estos miARN no se identificaron como posibles biomarcadores para angina inestable en otros estudios. En aún otra investigación, un panel de miARN (que consistía en miR-132, miR-150 y miR-186) mostró el mayor poder discriminatorio con un AUC de 0,91 (Zelleret al.Assessment of microRNAs in patients with unstable angina pectoris. Eur Heart J. 14 de agosto de 2014; 35(31): 2106-14). Resulta evidente que posiblemente pueden usarse miARN como biomarcadores para angina estable e inestable, pero se requieren estudios adicionales para validar su potencial y para abordar la variabilidad entre los diferentes estudios. A continuación, la detección de miARN resulta técnicamente difícil requiriendo la síntesis de ADNc y qPCR, lo cual limita su aplicación en un entorno agudo (tal como con angina inestable) o en entornos de GP.
Se concluye que sigue existiendo una urgente necesidad de biomarcadores en circulación alternativos para identificar a sujetos que padecen, o que corren el riesgo de padecer, una cardiopatía isquémica y para distinguir entre acontecimientos potencialmente mortales tales como angina estable e inestable de pacientes con dolor torácico o síntomas equivalentes, por un lado, y acontecimientos más leves en personas que también experimentan síntomas similares pero no padecen una cardiopatía isquémica de este tipo, por otro lado.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, una cardiopatía isquémica tal como se expone en el juego adjunto de reivindicaciones, en el que la cardiopatía isquémica es angina estable. El método comprende las etapas de:
a) obtener una o más de las fracciones de plasma seleccionadas del grupo que consiste en la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL) y la fracción de lipoproteína de alta densidad (HDL) a partir de una muestra de plasma de dicho sujeto;
b) determinar uno o más valores, en el que cada uno del uno o más valores:
- es un valor derivado de una concentración de un marcador de proteína en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, en el que al menos uno del uno o más valores se deriva de una concentración de serpina C1, o
- es un valor que es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, o
- es un valor que es una combinación de un valor derivado de una concentración de un marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, y un valor que es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1,
c) y en el que el uno o más valores se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) difiere de la línea de referencia diagonal de 0,5 con un valor de p de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados, realizar una comparación del uno o más valores tal como se determinan en la etapa b) con uno o más valores de referencia correspondientes, que se han derivado de la misma manera de la concentración del mismo uno o más marcadores de proteína en fracciones de plasma correspondientes tal como se determina en un grupo de sujetos de referencia que no padecen cardiopatía isquémica, en el que una diferencia estadísticamente significativa entre el uno o más valores determinados en la etapa b) y el uno o más valores de referencia correspondientes es indicativa de que el sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable.
Mediante este método, por primera vez es posible identificar a sujetos que padecen angina estable, a partir de una muestra de sangre con un alto nivel de significación estadística.
En una realización preferida, al menos uno del uno o más valores en la etapa b) se selecciona del grupo que consiste en valores derivados de la concentración de:
- serpina C1 en la fracción de plasma de HDL, y
- CD14 en la fracción de plasma de HDL,
y/o en el que al menos uno del uno o más valores es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, seleccionadas del grupo que consiste en:
- la concentración de serpina C1 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de CD14 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de cistatina C en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de serpina F2 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL.
Esta realización de la invención proporciona por primera vez un método para identificar a sujetos que padecen, o que corren el riesgo de padecer, angina estable a partir de una muestra de sangre con un alto nivel de significación estadística.
En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención, un kit que comprende medios para realizar el método según la invención.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros aspectos de la invención resultan evidentes a partir de, y se esclarecerán con referencia a, las realizaciones descritas a continuación en el presente documento.
La figura 1 (no según la invención y sólo con fines de ilustración) es una tabla que muestra el nivel inicial de 30 casos de angina inestable y 30 controles coincidentes.
La figura 2 es una tabla que muestra la medida de niveles de CD14, serpina G1, serpina F2, cistatina C y serpina C1 en cada una de las diez fracciones de gradiente de densidad por subfracción de plasma.
La figura 3 (no según la invención y sólo con fines de ilustración) presenta el gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la identificación de angina inestable en una cohorte de servicio de urgencias de pacientes con dolor torácico de 30 casos de angina inestable definitiva y 30 controles coincidentes usando la combinación de marcadores que consiste en serpina C1-HDL CD14-TEX serpina C1-LDL.
La figura 4 muestra un gráfico de ROC de la identificación de angina estable (denominada en este caso arteriopatía coronaria estable (SCAD)) en una cohorte de arteriopatía coronaria sintomática sospechada de 30 casos definitivos con angina estable y 30 controles coincidentes usando la combinación de marcadores que consiste en serpina C1-HDL serpina G1-TEX serpina C1-REX.
La figura 5 muestra las combinaciones de mayor puntuación de tres pares de marcador/fracción y/o marcador/razón en la cohorte de miomarcador (dos columnas por página, mostrando cada columna la combinación de marcadores a la izquierda y su valor de AUC a la derecha). Abreviaturas: c1=serpina C1, g1=serpina G1, f2=serpina F2, cc=cistatina C, cd14=CD14, Idl=lipoproteína de baja densidad, hdl=lipoproteína de alta densidad, rex=fracción restante, tex=fracción total. Siempre que se menciona la abreviatura de dos fracciones de plasma en relación con un marcador de proteína, significa que se toma la razón entre la concentración (o un valor derivado de la misma) en estas dos fracciones de plasma. A modo de ejemplo, “c1ldlhdl” significa la razón de un valor derivado de la concentración de serpina C1 en la fracción de LDL con respecto a HDL. En total, la lista contenía 19.600 combinaciones, sólo se muestran las combinaciones con un AUC de 0,876 o superior.
La figura 6 (no según la invención y sólo con fines de ilustración) muestra las combinaciones de mayor puntuación de tres pares de marcador/fracción y/o marcador razón en la cohorte de Minerva (dos columnas por página, mostrando cada columna la combinación de marcadores a la izquierda y su valor de AUC a la derecha). Las abreviaturas son como en la figura 5 y también lo es la nomenclatura cuando se mencionan dos fracciones de plasma en relación con un marcador de proteína. En total, la lista contenía 19.600 combinaciones, sólo se muestran las combinaciones con un AUC de 0,9 o superior. La combinación con mejor puntuación de pares de marcador/fracción (es decir, que no comprende ningún par de marcador/razón) serpina C1-HDL CD14-TEX serpina C1-LDL (AUC de 0,933) representada en la figura 3 está subrayada.
Descripción detallada de realizaciones
La presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable a partir de una muestra de sangre basándose en la concentración (o un valor derivado de la concentración) de uno o más marcadores de proteína identificados en una o más fracciones de plasma sanguíneo o basándose en la razón de concentración (o valores derivados de la concentración) de un marcador de proteína dado en dos diferentes de dichas fracciones de plasma y comparándola con la concentración y/o razón correspondiente tal como se determina en un grupo de sujetos de referencia que no padecen cardiopatía isquémica, en el que una diferencia estadísticamente significativa entre la concentración y/o razón determinada para el sujeto en cuestión y la concentración y/o razón correspondiente del grupo de referencia es indicativa de que el sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable. En el contexto de la presente invención, “concentración” de un marcador de proteína dado en una subfracción de plasma dada también puede significar un “valor derivado de la concentración” del marcador de proteína en la subfracción de plasma en cuestión, en el que un valor derivado de la concentración es un valor que se correlaciona directamente con la concentración del marcador de proteína. En una realización, la presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) obtener una o más de las fracciones de plasma seleccionadas del grupo que consiste en la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL), la fracción de lipoproteína de alta densidad (HDL), la fracción restante (REX) y la fracción total (TEX) a partir de una muestra de plasma de dicho sujeto;
b) determinar uno o más valores, en el que cada uno del uno o más valores:
- se deriva de una concentración de un marcador de proteína en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, en el que al menos uno del uno o más valores se deriva de una concentración de serpina C1, o
- es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, o
- es un valor que es una combinación de un valor derivado de una concentración de un marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CDl4, serpina F2 y serpina G1, y una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1,
c) realizar una comparación del uno o más valores tal como se determinan en la etapa b) con uno o más valores de referencia correspondientes, que se han derivado de la misma manera de la concentración del mismo uno o más marcadores de proteína en fracciones de plasma correspondientes tal como se determina en un grupo de sujetos de referencia que no padecen angina estable, en el que una diferencia estadísticamente significativa entre el uno o más valores determinados en la etapa b) y el uno o más valores de referencia correspondientes es indicativa de que el sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable.
Mediante este método, por primera vez es posible identificar a sujetos que padecen angina estable, a partir de una muestra de sangre con una relevancia estadística, caracterizado porque el uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) difiere de la línea de referencia diagonal de 0,5 con un valor de p de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. Preferiblemente, la relevancia estadística del método según la invención está caracterizada porque el uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) es de 0,8 o más, tal como 0,85 o más, 0,9 o más o 0,95 o más y el valor de p es de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. Incluso más preferiblemente, la relevancia estadística del método según la invención está caracterizada por dar como resultado un valor pronóstico negativo y/o un valor pronóstico positivo que es de 0,8 o más, tal como 0,85 o más, 0,9 o más o 0,95 o más. En una realización, el marcador de proteína es serpina C1. El método según la presente invención es un métodoin vitro.
En el contexto de la presente invención, el sujeto puede ser cualquier mamífero, pero es preferiblemente un sujeto humano, e incluso más preferiblemente un paciente humano, tal como un paciente humano que tiene dolor torácico. En el contexto de la presente invención, el grupo de sujetos de referencia es del mismo origen que el propio sujeto y, por consiguiente, si el sujeto es un ser humano, el grupo de sujetos de referencia también son seres humanos. En una realización de la presente invención, el grupo de sujetos de referencia tienen los mismos síntomas y signos clínicos que el propio sujeto pero no padecen cardiopatía isquémica.
Las fracciones de plasma usadas en la presente invención pueden obtenerse de la siguiente manera:
usando sulfato de dextrano y Mn, se precipitan quilomicrones, lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y lipoproteína de baja densidad (LDL) en la primera etapa de fraccionamiento. A continuación en el presente documento, la fracción de plasma obtenida en esta primera etapa de fraccionamiento se denomina “LDL”. En la segunda etapa, se precipita lipoproteína de alta densidad (HDL). El subfraccionamiento de las fracciones de LDL y HDL a partir de plasma se conoce en la técnica. La subfracción restante se denomina (REX), está casi completamente agotada de partículas de lipoproteína. Los inventores de la presente invención han investigado el contenido en proteína de vesículas extracelulares de plasma presentes en tres subfracciones de plasma sanguíneo diferentes: LDL, HDL y la subfracción de plasma restante REX. Además de eso, los inventores han evaluado los patrones de proteína asociados con vesículas extracelulares en plasma no fraccionado (total) (denominado TEX). La fracción TEX puede obtenerse usando tampón de precipitación Exoquick comercializado por SBI o tampón Xtractt de Cavadis B.V. según las instrucciones de los fabricantes. En el contexto de la presente invención, el término “fracción de plasma” se refiere a las fracciones de plasma LDL, HDL, REX y TEX. Los términos “fracción de plasma” y “subfracción de plasma” se usan de manera intercambiable en el presente documento.
Las vesículas extracelulares de plasma son vesículas de membrana lipídica bicapa que incluyen exosomas, microvesículas y micropartículas (Colomboet al.Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Ann Rev Cell Dev Biol 2014:255-289). Los exosomas se sintetizan en el endosoma multivesicular, mientras que las microvesículas se forman mediante la membrana plasmática. Una vez secretadas en el plasma, estas vesículas extracelulares ya no pueden distinguirse unas de otras. Por eso los exosomas se denominan con frecuencia microvesículas y las microvesículas se denominan con frecuencia exosomes. Por motivos de claridad, las vesículas extracelulares tal como se usan en el presente documento se refieren a la totalidad de tales vesículas de membrana lipídica bicapa extracelulares presentes en las subfracciones del plasma, tal como se expone adicionalmente a continuación.
Las vesículas extracelulares desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular y contienen o están asociadas con proteínas, miARN y mARN de la célula de origen, reflejando su estado fisiológico o patológico. Se sabe que distintas vesículas de plasma extracelulares de membrana bicapa se fraccionan conjuntamente con LDL monocapa. Otras vesículas extracelulares de membrana bicapa (con un contenido diferente) se fraccionan conjuntamente con HDL (Zhanget al.Circulating TNFR1 exosome-like vesicles partition withthe LDL fraction of human plasma. Biochem Biophys Res Comm 2008:579-584). Esto permite la separación de distintas subfracciones de vesículas extracelulares de plasma mediante aislamiento secuencial de LDL y HDL. De este modo, los inventores pudieron identificar subpoblaciones de vesículas extracelulares, cada una con su propio contenido en proteínas particulares y rutas potencialmente (pato)fisiológicas asociadas con las mismas. En la técnica se ha reconocido que las vesículas extracelulares de plasma tienen un posible valor con respecto a la enfermedad cardiovascular (Wanget al.Plasma extracellular vesicle protein content for diagnosis and prognosis of global cardiovascular disease. Net Heart J 2013:467-471).
En el contexto de la presente invención, el marcador de proteína serpina C1 se identifica comoUniProtKB - P01008(ANT3_HUMAN),el marcador de proteína cistatina C se identifica comoUniProtKB - P01034(CYTC_HUMAN),el marcador de proteína CD14 se identifica comoUniProtKB - P08571(CD14_HUMAN),el marcador de proteína serpina F2 se identifica comoUniProtKB - P08697(A2AP_HUMAN)y el marcador de proteína serpina G1 se identifica comoUniProtKB - P05155(IC1_HUMAN),cuando el sujeto es un ser humano, tal como un paciente humano. El experto entenderá que, si el sujeto es otro mamífero distinto de un ser humano, los marcadores de proteína que van a usarse según la invención serán las proteínas correspondientes en el mamífero en cuestión.
En el contexto de la presente invención, un valor derivado de la concentración de un marcador de proteína dado en una fracción de plasma dada también se denomina valor de “par de marcador/fracción”. Por conveniencia, un par de marcador/fracción se abrevia algunas veces en el presente documento mediante [nombre del marcador]-[nombre de la fracción de plasma]. Por ejemplo, el marcador de proteína serpina C1 determinado en la fracción de plasma LDL también se denomina de manera intercambiable “serpina C1 en LDL”, “serpina C1-LDL” o “C1-LDL”. Asimismo, un valor que es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un marcador de proteína dado en dos fracciones de plasma diferentes se denomina valor de un “par de marcador/razón”. Por conveniencia, un par de marcador/razón se abrevia algunas veces en el presente documento mediante [nombre del marcador]-[nombre de fracción de plasma 1]/[nombre de fracción de plasma 2]. Por ejemplo, el marcador de proteína serpina C1 determinado en la fracción de plasma LDL y HDL y para el que se usa la razón de los valores derivados de las concentraciones en LDL con respecto a HDL, también se denomina “razón de serpina C1 en LDL con respecto a HDL”, “serpina C1-LDL/HDL” o “C1-LDL/HDL”. El valor derivado de la concentración de un marcador de proteína dado en una fracción de plasma dada puede determinarse de cualquier manera conocida por un experto en la técnica. En una realización de la presente invención, la determinación del uno o más valores en la etapa b) se realiza mediante un inmunoensayo usando anticuerpos específicos para el uno o más marcadores de proteína en cuestión. El inmunoensayo puede ser de manera adecuada un inmunoensayo basado en perlas, en el que las perlas se conjugan con los anticuerpos seleccionados para sintetizar el complejo de perla-anticuerpo de captura. Después se incuba el complejo de perlaanticuerpo de captura con las muestras y posteriormente con anticuerpos biotinilados para detectar la proteína capturada mediante reacción con estreptavidina y posterior cuantificación.
El uno o más valores de marcador/fracción y/o pares de marcador/razón seleccionados en la etapa b), se seleccionan basándose en su relevancia estadística individual o combinada para la identificación de un sujeto que padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable. La relevancia estadística puede determinarse de cualquier manera conocida por el experto en la técnica. Con frecuencia se usa análisis de regresión logística para predecir un desenlace binario (sí o no). En la investigación médica, con frecuencia se usa para predecir si un paciente tiene una determinada enfermedad, por ejemplo diabetes (sí o no) modelizando características observadas de los pacientes, por ejemplo, sexo, edad, peso y tensión arterial sistólica. En el ejemplo de la diabetes, un resultado de la regresión logística puede ser que un aumento de 10 años de la edad da una probabilidad un 20% superior de tener diabetes. Combinando más probabilidades, basándose en más de una característica de paciente en un modelo de predicción, puede predecirse incluso con mayor precisión si un paciente tiene diabetes o no. Además de usar características de paciente tales como sexo y edad, también puede realizarse regresión logística con niveles de biomarcadores asociados con vesículas extracelulares como posibles factores de predicción. Puede combinarse un conjunto de biomarcadores en un modelo y usarse para estimar la probabilidad de una enfermedad. El rendimiento de un modelo de regresión logística puede visualizarse en un gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC). Cuanto mayor es el área bajo la curva (AUC), mejor es el rendimiento del modelo. Un AUC de 0,5 corresponde a una probabilidad del 50% de la enfermedad en cuestión (lanzar una moneda al aire). En este caso, los inventores usaron regresión logística y análisis de gráfico de ROC con el fin de evaluar si el diagnóstico de arteriopatía coronaria estable podía mejorarse basándose en las cinco proteínas de vesícula extracelular en 4 subfracciones de plasma diferentes y si esto era mejor que mediante probabilidad aleatoria. Los presentes inventores determinaron la relevancia estadística de los diferentes pares de marcador/fracción y pares de marcador/razón individuales (tablas 1 y 3) y de combinaciones de los mismos (tablas 2 y 4 y figuras 5 y 6) mediante análisis de gráfico de ROC. El análisis de gráfico de ROC implica:
- analizar diferencias en las características de nivel inicial usando la prueba de la Chi cuadrado para variables categóricas
- realizar pruebas de la T para variables continuas con distribución normalmente y pruebas de la U de Mann-Whitney para variables continuas que no tenían distribución normal
- convertir el uno o más valores derivados de la concentración en una fracción de plasma dada o razón de concentraciones en dos fracciones de plasma diferentes en unidades de desviación estándar, o puntuación z, usando el valor observado menos el valor medio, dividido entre la desviación estándar, y
- realizar análisis de rendimiento diagnóstico (ROC) (gráfico de ROC) para determinar el área bajo la curva (AUC) y el punto de corte calculado óptimo para el valor pronóstico negativo (NPV) y/o el valor pronóstico positivo (PPV).
Este análisis estadístico puede realizarse mediante cualquier software adecuado, por ejemplo mediante SPSS® (IBM®, versión 22) y Rstudio usando software R para cálculos estadísticos, versión 3.1.2. El experto entenderá que, cuando se usan más de un valor de marcador/fracción y/o pares de marcador/razón, el AUC y el valor de corte calculado obtenidos a partir del análisis de gráfico de ROC se refieren a la combinación de dichos valores.
El uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) difiere de la línea de referencia diagonal de 0,5 con un valor de p de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. En una realización adicional, el uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) es de 0,8 o más, tal como 0,85 o más, 0,9 o más o 0,95 o más, y el valor de p es de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. En aún una realización adicional, el valor pronóstico negativo y/o el valor pronóstico positivo es de 0,8 o más, tal como 0,85 o más, 0,9 o más o 0,95 o más, para el uno o más valores seleccionados en la etapa b), cuando se usa el valor de corte óptimo tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. En el contexto de la presente invención, el término “grupo de sujetos definitivos” significa un grupo de sujetos que se ha verificado que padecen angina estable mediante otros medios distintos del método de la presente invención. Este grupo también puede denominarse grupo de control positivo. El término “grupo de sujetos de referencia” tal como se usa en el presente documento, es un grupo de sujetos que se ha verificado que no padecen angina estable mediante otros medios distintos del método de la presente invención. Este grupo también puede denominarse grupo de control negativo. En una realización de la presente invención, el grupo de sujetos de referencia tienen los mismos síntomas y signos clínicos que el grupo de casos definitivos, pero no padecen angina estable. En una realización adicional, el grupo de sujetos definitivos y el grupo de sujetos de referencia adecuados son una cohorte adecuada, tal como la cohorte de miomarcador. En el contexto de la presente invención, la cohorte de miomarcador comprende un grupo de sujetos definitivos, que se ha diagnosticado que padecen angina estable y un grupo de sujetos de referencia, que tienen los mismos síntomas y signos clínicos que el grupo de casos definitivos, pero que no padecen angina estable, en el que la evaluación de si un sujeto se encuentra o no en el grupo de casos definitivos o en el grupo de sujetos de referencia se realiza mediante otros medios distintos del método de la presente invención. Por tanto, la comparación realizada en la etapa c) del método según la presente invención puede implementarse alternativamente mediante la realización de una comparación usando un modelo y un valor de corte tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados, en el que el desenlace de dicho modelo es indicativo de que el sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar uno o más valores derivados de una concentración de un marcador de proteína en una fracción de plasma o de una razón de concentraciones de un único marcador de proteína en dos fracciones de plasma diferentes, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) obtener una o más de las fracciones de plasma seleccionadas del grupo que consiste en la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL) y la fracción de lipoproteína de alta densidad (HDL) a partir de una muestra de plasma de dicho sujeto;
b) determinar uno o más valores, en el que cada uno del uno o más valores:
- se deriva de una concentración de un marcador de proteína en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, y/o
- es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1.
El método puede comprender además realizar una comparación del uno o más valores tal como se determinan en la etapa b) con uno o más valores de referencia correspondientes, que se han derivado de la misma manera de la concentración del mismo uno o más marcadores de proteína en fracciones de plasma correspondientes tal como se determina en un grupo de sujetos de referencia que no padecen angina estable. Cuando hay una diferencia estadísticamente significativa entre el uno o más valores determinados en la etapa b) y el uno o más valores de referencia correspondientes, es indicativa de que el sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable.
Los inventores de la presente invención mostraron anteriormente que el contenido en proteína de todas las vesículas extracelulares de plasma a las 6 horas tras el inicio de los síntomas pareció estar asociado con el diagnóstico de infarto de miocardio sin elevación de ST (De Hooget al.Serum extracellular vesicle protein levels are associated with acute coronary syndrome. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care 2013. 2(1):53-60), estableciendo que el contenido de vesículas extracelulares de plasma sin fraccionar (total) cambia rápidamente tras la cardiopatía isquémica. En la presente invención, se usó una muestra diferente de subfracciones de plasma, en la que los inventores evaluaron el contenido en proteínas de vesículas extracelulares. Se derivaron muestras de plasma a partir de pacientes con dolor torácico en el servicio de urgencias a los que finalmente se les diagnosticó que padecían angina inestable y a partir de individuos que también acudieron al servicio de urgencias con dolor torácico pero que no tenían cardiopatía isquémica (que sirven como controles). Los inventores realizaron proteómica con las subfracciones de vesícula extracelular de ambos grupos. Se caracterizaron las proteínas en las vesículas extracelulares presentes en las subfracciones de plasma extracelulares de LDL, HDL, REX y TEX de un total de 30 pacientes con dolor torácico con angina inestable establecida y de un total de 30 de pacientes del servicio de urgencias con dolor torácico de control coincidentes en cuanto a edad, sexo, riesgo, historia y medicación (sin angina inestable).
Aunque se piensa que la angina inestable es un acontecimiento trombótico, a diferencia de la angina estable, hay un solapamiento mecanístico entre los dos síndromes clínicos: hay arteriopatía coronaria e isquemia de miocardio (reducción del flujo sanguíneo) en ambos trastornos. Para ello, los inventores realizaron experimentos de ensayo de inmuno-perlas similares con muestras de sangre (plasma) de 30 pacientes con dolor torácico con arteriopatía coronaria estable establecida frente a 30 pacientes con dolor torácico de control coincidentes en cuanto a edad, sexo, riesgo, historia y medicación en las subfracciones de plasma extracelulares de LDL, HDL, REX y TEX.
En una realización, la presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) obtener una o más de las fracciones de plasma seleccionadas del grupo que consiste en la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL) y la fracción de lipoproteína de alta densidad (HDL) a partir de una muestra de plasma de dicho sujeto;
b) determinar al menos uno del uno o más valores se selecciona del grupo que consiste en valores derivados de la concentración de:
- serpina C1 en la fracción de plasma de HDL, y
- CD14 en la fracción de plasma de HDL,
y/o en el que al menos uno del uno o más valores es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, seleccionadas del grupo que consiste en:
- la concentración de serpina C1 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de CD14 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de cistatina C en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de serpina F2 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL, y
c) realizar una comparación del uno o más valores tal como se determinan en la etapa b) con uno o más valores de referencia correspondientes, que se han derivado de la misma manera de la concentración del mismo uno o más marcadores de proteína en fracciones de plasma correspondientes tal como se determina en un grupo de sujetos de referencia que no padecen angina estable, en el que una diferencia estadísticamente significativa entre el uno o más valores determinados en la etapa b) y el uno o más valores de referencia correspondientes es indicativa de que el sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, angina estable.
Los presentes inventores han encontrado que estos valores de pares de marcador/fracción y pares de marcador/razón proporcionan una identificación estadísticamente relevante de sujetos que padecen angina estable por sí solos (véase la tabla 3). Por consiguiente, no se requiere la combinación con valores de marcador/fracción y/o marcador/razón adicionales, pero en muchos casos mejorará la certeza con la que se identifica correctamente que un sujeto padece angina estable. Por consiguiente, el método según esta realización de la invención proporciona por primera vez un método para identificar a sujetos que padecen angina estable a partir de una muestra de sangre con una relevancia estadística caracterizada porque el uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) difiere de la línea de referencia diagonal de 0,5 con un valor de p de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. Preferiblemente, la relevancia estadística del método proporcionada en esta realización de la invención está caracterizada porque el uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) es de 0,8 o más, tal como 0,85 o más, 0,9 o más o 0,95 o más y el valor de p es de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados. Incluso más preferiblemente, la relevancia estadística de esta realización de la invención está caracterizada por dar como resultado un valor pronóstico negativo y/o un valor pronóstico positivo que es de 0,8 o más, tal como 0,85 o más, 0,9 o más o 0,95 o más.
Los presentes inventores han encontrado que el valor de marcador/fracción de serpina C1 en HDL y los valores de marcador/razón de serpina C1 en HDL/R<e>X, serpina C1 en HDL/TEX, CD14 en HDL/TEX y serpina F2 en LDL/HDL proporcionan todos ellos de manera individual un valor de AUC de 0,8 o más y un valor de p de 0,05 o menos en un gráfico de ROC realizado tal como se describió anteriormente. Por consiguiente, no se requiere la combinación con valores de marcador/fracción y/o marcador/razón adicionales, pero en muchos casos mejorará la certeza con la que se identifica correctamente que un sujeto padece angina estable. Por tato, una realización preferida de la presente invención es un método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, al menos uno del uno o más valores se deriva de la concentración de serpina C1 en la fracción de plasma de HDL y/o al menos uno del uno o más valores es una razón de la concentración de serpina F2 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL.
La tabla 1 en el ejemplo 4 muestra los pares de marcador/fracción y de marcador/razón que proporcionan la identificación estadísticamente más relevante de angina estable. El par de marcador/razón de F2-LDL/HDL tiene un valor de AUC de más de 0,8 para la identificación de angina estable por sí solo (sin combinación con un valor de marcador/fracción o marcador/razón adicional). En la tabla 1 se muestra que los pares de marcador/razón C1-REX/TEX, F2-LDL/REX, F2-HDL/TEX y G1-REX/TEX y el par de marcador/fracción C1-TEX están entre los pares de marcador/fracción y de marcador/razón individuales más significativos para la identificación de angina estable. Por consiguiente, en una realización preferida del método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, en el que al menos uno del uno o más valores es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, seleccionadas del grupo que consiste en: la concentración de serpina F2 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL.
Combinación de pares de marcador/fracción y/o de marcador/razón.
La tabla 2 en el ejemplo 4 muestra las combinaciones estadísticamente más relevantes de dos pares de marcador/fracción y/o de marcador/razón para la identificación de angina estable en la cohorte de miomarcador. A partir de la tabla 4, se desprende que la combinación estadísticamente más significativa de dos pares de marcador/fracciones y/o de marcador/razón para la identificación de angina estable tal como se determina en el presente documento es la combinación de serpina C1-HDL y serpina F2-LDL/HDL con un AUC de 0,881 tal como se determina mediante análisis de gráfico de ROC tal como se describió anteriormente. Con un valor de corte óptimo basado en el AUC, esta combinación de serpina C1-HDL y serpina F2-LDL/HDL tiene una sensibilidad de 0,786 (IC del 95% de 0,590-0,917), una especificidad de 0,852 (IC del 95% de 0,633-0,958), un valor pronóstico negativo (NPV) de 0,793 (IC del 95% de 0,601-0,938) y un valor pronóstico positivo de 0,846 (IC del 95% de 0,652-0,943). La tabla en la figura 5 muestra las combinaciones estadísticamente más relevantes de tres pares de marcador/fracción y/o de marcador/razón en la cohorte de miomarcador. A partir de la tabla en la figura 5, se desprende que la combinación estadísticamente más significativa de tres pares de marcador/fracciones y/o de marcador/razón para la identificación de angina estable tal como se determina en el presente documento es la combinación de serpina C1-HDL serpina F2-LDL/HDL serpina G1-HDL con un AUC de 0,922 tal como se determina mediante análisis de gráfico de ROC tal como se describió anteriormente. Con un valor de corte óptimo basándose en el AUC, la sensibilidad de estos tres marcadores era de 0,857 (IC del 95% de 0,673-0,960) y la especificidad de 0,852 (IC del 95% de 0,663-0,958). El valor pronóstico negativo (NPV) era de 0,852 (IC del 95% de 0,664-0,958) y el valor pronóstico positivo era de 0,857 (IC del 95% de 0,672-0,960). Los presentes inventores encontraron que serpina C1 es uno de los mejores marcadores de proteína cuando se usa sólo un par de marcador/fracción o de marcador/razón. A partir de la tabla 1, se desprende que los 3 mejores pares de marcador/fracción o de marcador/razón individuales son serpina C1 con la razón<h>D<l>/TEX y un AUC de 0,842 (IC del 95% de 0,741-0,944); serpina C1 con la razón HDL/REX y un AUC de 0,828 (IC del 95% de 0,718-0,938)) y serpina C1 en la fracción de Hd L con un AUC de 0,812 (IC del 95% de 0,700-0,924) para distinguir entre angina estable y controles coincidentes. La selección de la mejor combinación de marcadores y subfracciones sin las razones de marcadores entre las subfracciones mostró un AUC de 0,861, cuando no se tiene en cuenta ningún par de marcador/razón. Se concluyó que una de las combinaciones (paneles) más óptimas para diagnosticar angina estable parecía consistir en serpina C1-HDL serpina G1-TEX serpina C1-REX. Con un valor de corte óptimo basado en el AUC, la sensibilidad de estos 3 marcadores era del 93,3% y la especificidad del 76,7%. El NPV es del 92% y el valor pronóstico positivo es del 80%. Por tanto, los inventores de la presente invención también han encontrado ahora un método y medios para distinguir entre pacientes que experimentan angina estable y a los que debe tratarse adicionalmente, de pacientes que también tienen dolor torácico, pero que no padecen angina estable, aplicando preferiblemente una determinación de concentración de proteína de serpina C1 en HDL, y comparando las concentraciones con las encontradas en una muestra de control. En este caso, también se concluye que un ensayo basado en sangre tal como se expuso anteriormente ahora puede determinar si los pacientes padecen angina estable o no.
En conclusión, el experto entenderá que, mientras que se identifica que los pares de marcador/fracción y de marcador/razón tienen un valor pronóstico estadísticamente significativo para la identificación de sujetos que padecen, o corren el riesgo de padecer, angina estable, el valor pronóstico aumentará si se incluyen más de uno, tal como al menos dos o al menos tres de los pares de marcador/fracción o de marcador/razón identificados, en los métodos según la presente invención. En una realización de la presente invención, el método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, comprende que se determinan al menos dos valores, tal como al menos tres valores, en la etapa b). En otra realización de la presente invención, el método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, angina estable, comprende que al menos uno del uno o más valores determinados en la etapa b) es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1. En otra realización se determinan al menos dos, tal como al menos tres, valores en la etapa b) y al menos uno de estos valores es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma. En otra realización de la presente invención, se determinan al menos dos valores que implican al menos dos marcadores de proteína diferentes en la etapa b), valores que pueden seleccionarse, cada uno, de un valor de un par de marcador/fracción o un par de marcador/razón. En aún una realización adicional de la presente invención, al menos uno de dichos marcadores de proteína es serpina C1, lo que significa que se usa o bien un par de marcador/fracción o bien un par de marcador/razón que implica serpina C1 en el método para identificar a un sujeto que padece, o que corre el riesgo de padecer, una cardiopatía isquémica, tal como angina estable o inestable. Cuando uno de los marcadores de proteína usados en el método según la presente invención es serpina C1, y se usa al menos un marcador de proteína adicional en combinación con el mismo, dicho al menos un marcador de proteína adicional se selecciona de manera adecuada del grupo que consiste en cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1. De manera adecuada, todos los marcadores de proteína seleccionados son diferentes.
Kit
En el presente documento se da a conocer, pero no forma parte de la invención, un kit que comprende medios para realizar el método según la invención. En una realización, el kit comprende medios para determinar la concentración de dichos marcadores de proteína en dichas fracciones. Dichos medios pueden comprender cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como un procedimiento basado en inmuno-perlas tal como se expone en el presente documento. Además, el kit puede comprender instrucciones y medios para el fraccionamiento de una muestra de plasma para permitir el fraccionamiento rápido y la posterior determinación de concentración de proteína tal como se expone en el presente documento. El kit también puede comprender medios para realizar la comparación de la etapa c) en forma de un algoritmo con un valor de corte adecuado. Preferiblemente, el valor de corte se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados.
Los pacientes con cardiopatía isquémica sospechada constituyen una enorme carga asistencial. Actualmente no se dispone de herramientas de diagnóstico rápidas y directas para angina estable. La tecnología usada en esta invención para caracterizar el contenido en proteína de las vesículas extracelulares de las diferentes subfracciones de plasma y la posterior detección inmunitaria de las proteínas indicadas en tales fracciones es adecuada para entornos automatizados y resulta ideal para aplicaciones en el lugar de asistencia y tiene implicaciones principales para la eficiencia del procedimiento de diagnóstico y la gestión clínica. El diagnóstico de angina estable con la prueba tal como se indica en el presente documento permite ahora un tratamiento posterior oportuno y adecuado. Tendrá un impacto significativo sobre el pronóstico del paciente. Por otro lado, descartar ambas enfermedades previene derivaciones/ingresos hospitalarios innecesarios que resultan caros, requieren mucho tiempo y algunas veces contienen pruebas adicionales peligrosas.
Realizaciones adicionales
La presente invención se refiere a un método para diagnosticar que un paciente humano padece angina estable, comprendiendo dicho método: obtener una lipoproteína de baja densidad (LDL) y un lipoproteína de alta densidad (HDL) de una muestra de plasma a partir de dicho paciente; determinar la concentración de un marcador de proteína en dichas fracciones de LDL y HDL; determinar la concentración de dicho marcador de proteína en fracciones de referencia de un sujeto humano que no padece angina estable; y determinar si dicho paciente padece angina estable basándose en la diferencia en las concentraciones determinadas en las fracciones de dicho paciente y dicho sujeto que no padece angina estable, en el que dicho marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en: serpina C1, serpina G1, CD14 y serpina F2 humanas, mediante lo cual se determina la concentración de serpina C1. En otro aspecto de la invención, se miden la concentración de serpina C1 y serpina G1 se combinan para determinar si un paciente padece angina estable.
Los inventores de la presente invención han encontrado que proteínas particulares se expresan de manera diferencial entre subfracciones de muestras de plasma de pacientes humanos con cardiopatía isquémica y subfracciones de referencia de muestras de plasma de sujetos humanos que no padecen cardiopatía isquémica. Las muestras de referencia significa que las muestras de plasma se tratan de la misma manera y se comparan subfracciones de LDL y HDL. Preferiblemente, para tener una comparación apropiada entre paciente y sujeto distinto de paciente (que sí/no padecen angina estable) tanto dicho paciente humano como dicho sujeto humano que no padece angina estable experimentan dolor torácico, indicativo de angina estable. Sin embargo, el sujeto humano que no padece cardiopatía isquémica puede haber acudido al servicio de urgencias con dolor torácico que parecía indicativo de angina estable. Evidentemente, el experto entenderá que también pueden usarse otras muestras de referencia en la comparación, por ejemplo las que se obtienen de sujetos humanos que están sanos y que no experimentaron dolor torácico u otros síntomas que están relacionados con, o que son indicativos de, angina estable. Tal como se expuso anteriormente, no se dispone de ningún marcador basado en proteína rápido y fiable en la técnica que permita que un médico o GP determine rápidamente si un paciente humano que padece síntomas que son indicativos de angina estable, padece realmente angina estable. Los mismos se presentan ahora en el presente documento: se fracciona una muestra de plasma a partir de un paciente con cardiopatía isquémica sospechada para dar subfracciones y se determina la concentración de una única o de un conjunto de proteínas en dichas fracciones. Se sabe que las proteínas en dichas fracciones están asociadas con las vesículas extracelulares dentro de dichas fracciones. Posteriormente, se comparan las concentraciones con concentraciones determinadas en muestras de referencia a partir de un sujeto humano de control y, cuando se comparan, la concentración determinada en dichas fracciones puede ahora indicar al médico o GP si un paciente con sospecha padece realmente angina estable.
En un aspecto particularmente preferido de la invención, dicha cardiopatía isquémica es angina estable, y para ello se determinan las concentraciones de serpina C1 y serpina G1. Más preferiblemente, en el caso de angina estable, se determina la concentración de serpina C1 en la fracción de HDL. En otro aspecto preferido, serpina C1 en HDL por sí sola pareció ser indicativa.
En el presente documento también se describe un kit para realizar el método según la invención, comprendiendo dicho kit los medios para determinar la concentración de dichos marcadores de proteína en dichas fracciones. Dichos medios pueden comprender cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como un procedimiento basado en inmunoperlas tal como se expone en el presente documento. Además, el kit puede comprender instrucciones y medios para el fraccionamiento de una muestra de plasma para permitir el fraccionamiento rápido y la posterior determinación de concentración de proteína tal como se expone en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un marcador de proteína para el diagnóstico de angina estable en un paciente humano, en el que dicho marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en: serpina C1, serpina G1, CD14 y serpina F2 humanas; o en el que dicho marcador de proteína es una combinación de serpina C1, serpina G1, CD14 y serpina F2. El marcador de proteína con mejor rendimiento del que disponen los inventores pareció ser serpina C1 que pareció ser indicativa de angina estable en determinadas subfracciones de plasma (tal como se expone en detalle en el presente documento). El valor de AUC aumentó cuando se combinaron combinaciones de concentraciones de marcador de proteína y determinadas subfracciones. Para angina estable, pareció que la mejor puntuación se obtuvo cuando se determinó serpina C1 en HDL y REX en combinación con la concentración de serpina G1 en TEX (evidentemente, en comparación con sus valores respectivos en muestras/fracciones de control de referencia). Por tanto, el biomarcador más preferido para su uso en la mayoría, si no en todos, de los métodos de la presente invención es serpina C1 humana, cuando se determina su concentración en las fracciones de LDL y HDL de una muestra de plasma a partir de un paciente humano que se sospecha que padece angina estable o inestable.
En aún otra realización, la presente invención se refiere a un método para determinar el nivel de serpina C1, serpina G1, CD14 y/o serpina F2 humanas en una muestra de plasma a partir de un paciente humano que experimenta dolor torácico, comprendiendo dicho método: obtener una muestra de plasma a partir de dicho paciente; fraccionar fracciones de LDL y HDL a partir de dicha muestra de plasma; y determinar el nivel de serpina<c>1, serpina G1, CD14 y/o serpina F2 humanas en las vesículas extracelulares presentes en dichas fracciones. Los marcadores de proteína preferidos son serpina C1, CD14 y serpina G1. Se prefiere altamente una combinación de serpina C1 y serpina G1, y más preferiblemente la concentración se determina en HDL.
Debe observarse que las realizaciones anteriormente mencionadas ilustran, en vez de limitar, la invención, y que los expertos en la técnica podrán diseñar muchas realizaciones alternativas.
En las reivindicaciones, ningún signo de referencia colocado entre paréntesis deberá interpretarse como que limita la reivindicación. El uso del verbo “comprender” y sus conjugaciones no excluye la presencia de elementos o etapas distintos de los mencionados en una reivindicación. El artículo “un” o “una” que precede a un elemento no excluye la presencia de una pluralidad de tales elementos. El simple hecho de que determinadas medidas se mencionen en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que no pueda usarse de manera ventajosa una combinación de estas medidas.
Ejemplos
Ejemplo 1. Estudio proteómico en la cohorte de angina inestable de Minerva
El estudio MINERVA (abreviatura de determinación del contenido en microvesículas en el servicio de urgencias: valor de diagnóstico para síndromes coronarios agudos (Microvesicle content IN the Emergency Room: diagnostic Value for Acute coronary syndromes))es un estudio de un único centro, de cohorte prospectiva, de pacientes que acuden al servicio de urgencias dentro del plazo de 24 horas desde la aparición de dolor torácico que sugiere síndrome coronario agudo (ACS). Entre enero de 2012 yjunio de 2014, se incluyeron más de 2000 pacientes consecutivos en el Meander Medical Center Amersfoort, Países Bajos, que es un gran hospital universitario regional que proporciona asistencia sanitaria para una población de ~300.000 pacientes. Los pacientes de menos de 18 años de edad, pacientes que no podían o no estaban dispuestos a dar su consentimiento informado y pacientes con un MI con elevación del segmento ST bien definida (STEMI) no se incluyeron en este estudio. Se evaluó a todos los pacientes y se trataron según las directrices internacionales. Junto con las mediciones de laboratorio clínico rutinarias directamente tras la presentación, se extrajeron 3x tubos de 10 cc adicionales de sangre venosa. Se congeló el componente de plasma y se almacenó a -80°C dentro del plazo de una hora tras la recogida de muestra.
Adquisición de datos
Se recopiló información de paciente detallada y se documentó en un cuaderno de recogida de datos digital: presentación clínica, historia clínica, factores de riesgo cardiovascular, uso de medicamentos actuales, hallazgos en la exploración física, evaluación de ECG, parámetros de bioquímica en sangre y resultados de investigaciones adicionales.
Validación de diagnóstico
El desenlace primario es ACS (es decir angina inestable, infarto de miocardio sin elevación del segmento ST (NSTEMI) e infarto de miocardio con elevación del segmento ST (STEMI)), validado según la definición universal de infarto de miocardio y las directrices de ESC más recientes (Hammet al.ESC Committee for Practice Guidelines. ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute coronary syndromes (ACS) in patients presenting without persistent ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J, diciembre de 2011; 32(23): 2999-3054). El diagnóstico de NSTEMI se realizó cuando se observó un aumento y/o disminución de la troponina cardíaca con al menos un valor por encima del percentil 99 en un entorno clínico compatible con isquemia de miocardio. Se diagnosticó angina inestable basándose en signos y síntomas compatibles con isquemia de miocardio, acompañada por cambios de ECG dinámicos, evidencia de isquemia con pruebas funcionales o nuevos cambios angiográficos coronarios. Un panel de desenlaces que consistía en dos cardiólogos validó el diagnóstico final. En caso de incertidumbre, un tercer cardiólogo tomó la decisión.
Seguimiento
Se realizó un seguimiento de los pacientes durante al menos 1 año tras la inclusión. Se comprobaron los registros del hospital local para determinar la hospitalización (insuficiencia cardíaca o angina inestable), infarto de miocardio, revascularización coronaria y muerte. Se contactó con los pacientes por carta y/o por teléfono y se les preguntó si se les había ingresado en un hospital desde su inclusión. Cuando era así, se comprobaron los registros del hospital para la verificación de acontecimientos, también cuando se ingresó a los pacientes en un centro distinto del centro de inclusión. Se puntuaron los acontecimientos cardiovascular adversos principales, definidos como MI no mortal (STEMI/NSTEMi de tipo 1), revascularización coronaria (PCI o CABG), ingreso en hospital por insuficiencia cardíaca o angina inestable y/o muerte por cualquier causa durante 1 año de seguimiento. La verificación del descubrimiento de espectrometría de masas se realizó en 27 casos de UA definitiva y 31 controles (véase la figura 1).
Preparación de fracciones de plasma
El aislamiento de subfracciones de plasma de vesículas extracelulares usando precipitación secuencial se realizó generalmente de la siguiente manera. Tal como se describió anteriormente (Burnsteinet al.Rapid method for the isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J Lipid Res 1970; 11: 583-595), se usó una disolución de sulfato de dextrano (DS) y cloruro de manganeso (II) (MnCh) para precipitar las fracciones de plasma de LDL y HDL. En resumen, se preparó una disolución madre de DS y MnCh como disoluciones al 6,5% y 2 M, respectivamente. Para la fracción total de vesículas extracelulares (TEX), se añadió tampón Xtractt (Cavadis B.V.; 1:4) 125 |il de plasma y se mezcló. Se incubó la mezcla a 4°C durante 30 min y posteriormente se centrifugó a 4.800g a 4°C durante 10 min. Se disolvió este sedimento en 125 |il de tampón de lisis de Roche (Roche n.° 04719956001) y se usó en los ensayos de perlas magnéticas cuantitativos como fracción TEX. Para la precipitación de la fracción de LDL, se añadieron disolución madre de DS (1:125) y disolución madre de MnCh (1:40) en otros 125 |il de plasma y se mezcló. Se centrifugó la muestra mezclada durante 10 min a 4.800g a 4°C precipitando el sedimento de fracción de LDL. Se disolvió este sedimento en 125 |il de tampón de lisis y se usó en los ensayos de perlas magnéticas cuantitativos como la fracción de LDL. Para la fracción de HDL, se transfirieron 60 |il de sobrenadante por encima del sedimento de LDL a un nuevo tubo sobre el que se añadieron 65 |il de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se mezcló. A continuación, se añadieron disolución madre de DS (1:10) y disolución madre de MnCh (1:10) en los 125 |il de sobrenadante diluido y se mezcló. Posteriormente, se incubó la muestra durante 2 h a 4°C y se centrifugó la muestra durante 10 min a 4.800g a 4°C para recoger el sedimento de fracción de HDL. Se disolvió este sedimento en 125 |il de tampón de lisis de Roche y se usó e los ensayos de perlas magnéticas cuantitativos como la fracción de HDL. Para la fracción restante de vesículas extracelulares (REX), se añadieron 32 |il de tampón Xtractt al sobrenadante restante después de HDL para precipitar las vesículas extracelulares restantes. Después de 30 min a 4°C seguido por centrifugación a 4000 g durante 30 min, se disolvió el sedimento en 125 |il de tampón de lisis de Roche con las vesículas de REX sometidas a lisis en esta fracción.
Proteómica
Con el fin de determinar el contenido en proteína de las subfracciones de vesículas, se realizó un análisis proteómico basado en espectrometría de masas realizado con la fracción de plasma de LDL recogida a partir de pacientes de MINERVA. Se usó cromatografía de líquidos con espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM) para el análisis proteómico tal como se describe (Sok Hwee Cheowet al.Simultaneous Enrichment of Plasma Soluble and Extracellular Vesicular Glycoproteins Using Prolonged Ultracentrifugation-Electrostatic Repulsion-hydrophilic Interaction Chromatography (p Uc -ERLIC) Approach. MCP 2015 14(6):1657-1671). En resumen, se usó CL-e M/EM para analizar proteínas purificadas a partir de las fracciones de VLDL-EV. Tras aislar la fracción de VLDL-EV a partir del plasma, se resolvió la fracción en un carril de un gel del 10% de SDS-PAGE respectivamente y posteriormente se tiñó con azul de Coomassie. Se escindió el carril y se dividió en 6 fragmentos iguales para la digestión con tripsina en gel; tras la reducción y alquilación, se digirió cada fragmento con tripsina durante la noche. Se extrajeron los péptidos digeridos a partir del gel, se secaron y después se desalaron. Se analizaron los péptidos con un dispositivo de CL-EM/EM Q-Exactive (Thermo Scientific, San Jose, EE.UU.). Se convirtieron los datos sin procesar en archivos Mascot generic (mgf) usando Proteome Discoverer ver. 1.4 (Thermo Scientific, San Jose, EE.UU.) y después se realizó una búsqueda de los archivos mgf frente a la base de datos de proteoma humano de Uniprot usando un Mascot Server ver. 2.4.1 interno (Matrix Science, Londres, R.U.). Se usó Ingenuity Pathway Analysis (IPA®, QIAGEN Redwood City, versión de construcción 321501M, versión de contenido 17199142) para determinar rutas canónicas estadísticamente sobrerrepresentadas en las proteínas en comparación con la base de datos de Ingenuity. La proteómica identificó 815 proteínas individuales de las cuales 572 pudieron mapearse a la base de datos de Ingenuity.
Las 5 rutas canónicas principales identificadas fueron:
- activación de LXR/RXR: p= 8,15*10'56
- señalización de respuesta de fase aguda: p= 4,35*10'45
- activación de FXR/RXR: p= 1,58*10-42
- sistema de coagulación: p= 1,23*10-31
- sistema de complemento: p= 5,12*10-27
La selección de proteínas para la verificación se realizó con los siguientes criterios de selección: (1) proteínas descritas como proteína de vesícula extracelular en la base de datos de Exocarta (http://exocarta.org/) o identificadas como proteínas de vesícula extracelular en estudios anteriores realizados por los inventores; (2) proteínas asociadas con enfermedad aterosclerótica como causa subyacente de arteriopatía coronaria estable y angina inestable; y (3) disponibilidad de dos anticuerpo compatibles y proteína recombinante que puede usarse en ensayo de inmuno-perlas.
Como resultado, los inventores encontraron que las cuatro proteínas siguientes eran de particular relevancia:
CD14 (ruta de activación de LXR/RXR), UniProtKB - P08571(CD14_HUMAN)
Serpina G1 (ruta de respuesta de fase aguda), UniProtKB - P05155(IC1_HUMAN)
Serpina F2 (ruta de respuesta de fase aguda/sistema de coagulación), UniProtKB - P08697(A2AP_HUMAN)
Serpina C1 (sistema de coagulación), UniProtKB - P01008(ANT3_HUMAN)
Además de estas cuatro, los inventores seleccionaron cistatina C,UniProtKB - P01034(CYTC_HUMAN),porque esta proteína no se añade a ninguna ruta canónica pero es una proteína de vesícula y está asociada con futuros acontecimientos cardiovasculares. Además, hay un ensayo de inmuno-perlas disponible que es compatible con la multiplexación para serpina G1, CD14 y serpina F2.
Ejemplo 2. Cohorte de angina estable de miomarcador
La cohorte de arteriopatía coronaria estable de miomarcador (abreviatura de detección de isquemia de miocardio mediante biomarcadores circulantes (MYOcardial ischemia detection by circulating bioMARKERs))es un estudio de un único centro, de cohorte prospectiva, de pacientes que se evalúan en la clínica ambulatoria de Meander Medical Center Cardiology por arteriopatía coronaria sintomática sospechada (aparición reciente), que se someten a obtención de imágenes por perfusión en miocardio de radionúclido (rMPI) tal como se indica por su propio cardiólogo. Antes de rMPI, se obtiene sangre venosa (6x10 cc) a partir de la cánula intravenosa periférica, que se inserta como parte de la preparación convencional para rMPI. Se congela el componente de plasma y se almacena a -80°C dentro del plazo de 1 hora tras la recogida de muestra. Se evalúa a todos los pacientes y se tratan según las directrices internacionales, por su propio cardiólogo. La inclusión de pacientes comenzó en agosto de 2014 y continúa hasta que al menos 1250 pacientes estén participando en el estudio. En la presentación de la presente solicitud (noviembre de 2015), se ha incluido más de 800 pacientes. Los pacientes de menos de 18 años de edad y los pacientes que no pueden o no están dispuestos a dar su consentimiento informado no se incluyen en este estudio.
Adquisición de datos
Se recopila información de paciente y se documenta en un cuaderno de recogida de datos digital: presentación clínica, historia clínica, factores de riesgo cardiovascular, uso de medicamentos actuales, evaluación de ECG, parámetros de bioquímica en sangre y resultados de investigaciones adicionales.
Validación de criterio de valoración
Arteriopatía coronaria isquémica concretada, tal como se determina mediante obtención de imágenes por perfusión en miocardio de radionúclido (rubidio 82) y validado por un panel de al menos dos médicos de medicina nuclear.
Seguimiento
Se realiza un seguimiento de los pacientes durante al menos 1 año tras la inclusión. Se comprobaron los registros del hospital local para determinar la hospitalización (insuficiencia cardíaca o angina inestable), obtención de imágenes cardíacas y/o coronarias adicionales, revascularización coronaria, infarto de miocardio y muerte. Se contactó con los pacientes por carta y/o por teléfono y se les preguntó si se les había ingresado en un hospital desde su inclusión. Cuando era así, se comprobaron los registros del hospital para la verificación de acontecimientos, también cuando se ingresó a los pacientes en un centro distinto del centro de inclusión. Se puntuaron los acontecimientos cardiovascular adversos principales (MACE), definidos como MI no mortal (STEMI/NSTEMI de tipo 1), revascularización coronaria (PCI o CABG), ingreso en hospital por insuficiencia cardíaca o angina inestable y/o muerte por cualquier causa durante 1 año de seguimiento.
Preparación de fracciones de plasma y proteómica
Se realizó la preparación de fracciones de plasma y la proteómica de la misma manera que en el ejemplo 1.
Ejemplo 3. Localización de proteínas asociadas con vesículas extracelulares
Con el fin de determinar si las cinco proteínas seleccionadas estaban presentes en o sobre vesículas extracelulares (EV), se realizó una ultracentrifugación por gradiente de densidad. Se aislaron fracciones de VLDL-EV, HDL-EV, REX-EV y TEX-EV a partir de 8 ml de plasma tal como se mencionó en el ejemplo 1. Se resuspendió cada uno de los precipitados (LDL, HDL, REX, TEX) en 500 |il de PBS y se usó para la centrifugación por gradiente de densidad. Con el fin de preparar el tampón de gradiente de densidad, se prepararon 5 disoluciones que contenían diferentes concentraciones de medio OptiPrep™ (OptiPrep, Axis-shiled n.° 1114542) con 10x PBS pH 7,4 (Ambion®, Life Technologies n.° AM9265) y ddH<2>O. Las disoluciones de trabajo comprendían el 5%, el 10%, el 20%, el 30% y el 40% de OptiPrep y 1xPBS respectivamente. Se añadieron las disoluciones y se superpusieron en los tubos de ultracentrífuga (Beckman Coulter n.° 344059) secuencialmente desde la de densidad más alta (con la concentración más alta de OptiPrep) hasta la de densidad más baja (con la concentración más baja de OptiPrep). Posteriormente, se añadieron cuidadosamente los sedimentos aislados de cada fracción en los tubos de ultracentrífuga encima de los tampones de gradiente de densidad. Después se centrifugaron a 200.000g durante 18 h a 4°C con baja aceleración y bajo freno (Beckman Coulter #Optima XL-90 Ultracentrifuge #SW 41 Ti Rotor). Después de eso, se recogieron 10 subfracciones de gradiente diferente (1 ml por cada subfracción) secuencialmente (desde arriba hacia abajo) en cada tubo de ultracentrífuga y se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml. Tras una agitación con vórtex exhaustiva de las subfracciones, se transfirieron 900 |il de cada subfracción a un nuevo tubo de ultracentrífuga junto con 7 ml de tampón de BSA al 0,1% (Sigma Aldrich n.° 05470, en 1x PBS, m/v) y después se centrifugaron a 200.000g durante 1 h a 4°C. Se resuspendieron los sedimentos en 200 |il de tampón de lisis de Roche para la medición del nivel de proteína.
Se realizó una medición cuantitativa usando un inmunoensayo basado en perlas tal como se describió en otra parte (Kanhaiet al.Microvesicle protein levels are associated with increased risk for future vascular events and mortality in patients with clinically manifest vascular disease. Int J Cardiol 2013 168:2358-2363). En resumen, se conjugaron las perlas (Luminex #MagPlex-C Microspheres, MC100) con los anticuerpos seleccionados para sintetizar el complejo de perla-anticuerpo de captura. Se incubaron las muestras con el complejo de perla-anticuerpo de captura y posteriormente con los anticuerpos biotinilados para detectar la proteína capturada. Se añadió estreptavidinaficoeritrina (SA-PE, BD bioscience n.° 554061) para cuantificar la concentración de proteína capturada. Se correlacionaron curvas estándar con la señal de SA-PE y la dilución de proteínas recombinantes homólogas. Se usaron los sistemas Bio-Plex® 200 (Bio-Rad n.° 171-000201) para la medición y el procesamiento de datos. Los anticuerpos y las proteínas recombinantes usados en la detección se indican a continuación. Para serpina C1: anticuerpo antitrombina III (NOVUS n.° NBP1-05149), PAb purificado por afinidad biotinilado para serpina C1 humana (R&D n.° BAF1267), serpina C1 humana recombinante (R&D Systems n.° 1267-PI-010); para serpina F2: anticuerpo anti-serpina F2 humana (R&D Systems n.° MAB1470), anticuerpo anti-serpina F2 humana biotinilado (R&D Systems n.° BAF1470), serpina F2 humana recombinante (R&D Systems n.° 1470-PI-010). Para cistatina C: anticuerpo anti-cistatina C humana (R&D Systems n.° MAB11962), anticuerpo anti-cistatina C humana biotinilado (R&D Systems n.° BAM11961) y cistatina C humana recombinante (R&D Systems n.° 1196-PI). Para CD14, se usaron anticuerpo anti-CD14 humano (R&D Systems n.° MAB3832), anti-CD14 humano biotinilado (R&D Systems n.° BAF383) y CD14 humano recombinante (R&D Systems n.° 383-CD) y para serpina G1, se usaron anticuerpo anti-serpina G1 humana (R&D Systems n.° MAB2488), anti-serpina G1 humana biotinilado (R&D Systems n.° BAF2488) y serpina G1 humana recombinante (R&D Systems n.° 2488-PI). La medición cuantitativa de los niveles de proteína también se denomina ensayo de Bioplex.
Tras la ultracentrifugación por gradiente de densidad, se usó cada fracción en el ensayo de Bioplex para medir la concentración de proteína en cada fracción así como la densidad en cada una de las fracciones. Para cada una de las 4 subfracciones de plasma y las mediciones de CD14, serpina G1, serpina F2, cistatina C, serpina C1 en cada una de las 10 fracciones de gradiente de densidad se muestra en la figura 2. Esta tabla muestra que las proteínas están realmente asociadas con vesículas extracelulares ya que sólo las vesículas pueden flotar en tales gradientes de densidad. Las partículas de LDL también flotan, pero debido al alto contenido en lípidos su densidad es inferior a 1. HDL tienen una densidad de 1-1,2. La fracción REX y TEX no contienen lipopartículas. En la tabla de la figura 2 se muestra que las partículas de LDL no contienen las proteínas de EV ya que las partículas de LDL flotan todas por debajo de una densidad < 1. Para HDL, esto queda menos claro ya que la densidad de EV coincide parcialmente con HDL, aunque las proteínas de EV también están presentes en la región de densidad superior en la que no está presente ninguna partícula de HDL. Para la fracción REX y TEX, todas las proteínas flotan con vesículas extracelulares con una densidad de entre 1 -1,2 (TEX) y entre 1 -1,8.
Ejemplo 4. Validación de proteínas de vesícula extracelular para el diagnóstico de arteriopatía coronaria estable
Análisis estadísticos para angina estable(cohorte de miomarcador)
Se analizaron diferencias en características de nivel inicial usando la prueba de la Chi cuadrado para variables categóricas, pruebas de la T para variables continuas con distribución normal y pruebas de la U de Mann-Whitney para variables continuas que no tenían distribución normal. Para calcular la razón de probabilidades y permitir la comparación directa entre diferentes proteínas y fracciones, se convirtieron los niveles de proteínas de EV en unidades de desviación estándar, o puntuación z, usando el valor observado menos el valor medio, dividido entre la desviación estándar. La selección de la mejor combinación de marcadores y subfracciones se realizó usando análisis de regresión logística con selección directa basándose en la prueba de la Chi cuadrado y basándose en el criterio de información de Akaike (AIC). Se realizó un análisis de rendimiento diagnóstico (ROC) para el AUC y el punto de corte calculado óptimo para NPV y PPV. Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante SPSS® (IBM®, versión 22) y Rstudio usando software R para cálculos estadísticos, versión 3.1.2.
Diagnóstico de angina estable
Aunque se piensa que la angina inestable está mucho más asociada con la coagulación que la angina estable, el proceso patológico subyacente es el mismo: aterosclerosis.
Por eso, se midieron las 5 proteínas de vesícula extracelular serpina F2, serpina G1, serpina C1, CD14 y cistatina C en las fracciones de plasma LDL, HDL, REX y TEX en una cohorte de 30 pacientes con arteriopatía coronaria estable de la cohorte de miomarcador y 30 controles coincidentes en cuanto a sexo, edad, historia y medicación de la misma cohorte usando precipitación secuencial tal como se describió anteriormente en el ejemplo 1 y se realizó un ensayo de inmuno-perlas tal como se describió anteriormente en el ejemplo 3. En la tabla 1 se indican los pares de marcador/fracción y pares de marcador/razón individuales con mejor rendimiento para la identificación de angina estable. La tabla 1 indica los pares de marcador/fracción y pares de marcador/razón más significativos y con mejor rendimiento que, por sí solos, y sin necesidad de combinación con pares de marcador/fracción o pares de marcador/razón adicionales, proporcionan una identificación estadísticamente relevante de sujetos que padecen angina estable. La tabla 1 muestra los valores de AUC, valores superiores e inferiores obtenidos en los gráficos de ROC de estos pares de marcador/fracción o pares de marcador/razón individual más significativos y con mejor rendimiento. Los gráficos de ROC se realizan con los datos procedentes de los grupos de pacientes y de control anteriormente mencionados de la cohorte de miomarcador. Todas las combinaciones indicadas tienen un valor de p de 0,05 o menos. Las abreviaturas y la nomenclatura de tabla 1 son: c1=serpina C1, g1=serpina G1, f2=serpina F2, cc=cistatina C, cd14=CD14, Idl=lipoproteína de baja densidad, hdl=lipoproteína de alta densidad, rex=fracción restante, tex=fracción total. A modo de ejemplo “c1 hdl/rex” significa que el gráfico de ROC se basa en la razón de un valor derivado de la concentración de serpina C1 en la fracción de plasma de HDL con respecto a la fracción de plasma REX, en el que el gráfico de ROC se realiza con los datos procedentes de los grupos de pacientes y de control anteriormente mencionados de la cohorte de miomarcador. Todas las combinaciones indicadas tienen un valor de p de 0,05 o menos.
Tabla 1:
Las combinaciones con mejor rendimiento de dos pares de marcador/fracción y pares de marcador/razón para la identificación de angina estable se indican en la tabla 2. La combinación de dos marcadores/fracciones y/o marcadores/razones significa que se determinan dos valores diferentes derivados de la concentración de al menos un marcador de proteína. Los dos valores diferentes pueden ser, por ejemplo, valores derivados de la concentración del mismo marcador pero en diferentes fracciones y/o razones o pueden ser de diferentes marcadores en fracciones y/o razones iguales o diferentes. La tabla 2 indica las combinaciones más significativas y con mejor rendimiento de dos pares de marcador/fracción y pares de marcador/razón y muestra los valores de AUC tal como se obtienen en los gráficos de ROC de estas combinaciones más significativas y con mejor rendimiento de pares de marcador/fracción y/o pares de marcador/razón. Los gráficos de ROC se realizaron con los datos de los grupos de pacientes y de control anteriormente mencionados de la cohorte de miomarcador. Todas las combinaciones indicadas tienen un valor de p de 0,05 o menos. Las abreviaturas y la nomenclatura de la tabla 2 son las mismas que en la tabla 1. Sin embargo, en la tabla 2 falta el signo “/” entre las fracciones de las que se toma una razón. A modo de ejemplo, “c1ldlhdl” significa la razón de un valor derivado de la concentración de serpina C1 en la fracción de LDL con respecto a HDL.
Tabla 2:
Los tres mejores marcadores individuales parecieron ser serpina C1 con la razón HDL/TEX y un AUC de 0,842 (IC del 95% de 0,741-0,944); serpina C1 con la razón HDL/REX y un AUC de 0,828 (IC del 95% de 0,718-0,938) y serpina C1 en la fracción de HDL con un AUC de 0,812 (IC del 95% de 0,700-0,924) para distinguir entre arteriopatía coronaria estable y controles coincidentes. La selección de la mejor combinación de marcadores y subfracciones (sin las razones de marcadores entre las subfracciones) usando análisis de regresión logística con selección directa basándose en el criterio de información de Akaike (AIC) mostró un AUC de 0,861 (IC del 95% de 0,86 - 1). La combinación de marcadores consistía en serpina C1-HDL serpina G1-TEX serpina C1-REX (véase la figura 4) sin usar las razones entre las subfracciones, porque con 30 frente a 30 pacientes no se dispone de poder suficiente para usar todos los biomarcadores en todas las combinaciones. Esto es una elección conservadora que evita el sobreajuste del modelo de regresión y por ello proporciona un cálculo más realista. Estos resultados muestran que el uso del mismo conjunto de niveles de proteínas extracelulares en cuatro fracciones puede usarse en una cohorte diferente de un síndrome cardiovascular diferente: angina estable, que tiene el mismo proceso patológico subyacente: aterosclerosis. Usando la combinación seleccionada con un valor de corte óptimo basándose en el AUC, se mostró que la sensibilidad de estos tres marcadores era del 93,3% y la especificidad del 76,7%. El NPV es del 92% y el valor pronóstico positivo es del 80%. La figura 5 muestra las combinaciones de mayor puntuación de marcador/subfracción para la cohorte de miomarcador pero ahora (como para angina inestable) incluyendo las razones del biomarcador entre las subfracciones de plasma. Esta combinación/razones entre fracciones se usa en el cálculo de la mejor combinación de marcadores de vesículas extracelulares tras la validación de los marcadores de vesículas extracelulares en las cohortes grandes (ejemplo 5) que proporcionarán suficiente poder ya que los números de pacientes son mucho mayores.
Ejemplo 5. Validación de proteínas de vesícula extracelular para el diagnóstico de angina estable en cohortes grandes
Se lleva a cabo un estudio de seguimiento para la validación de las proteínas de vesícula extracelular para el diagnóstico de angina estable. Para ello, se usa la cohorte de miomarcador, descrita anteriormente. Esta cohorte contiene aproximadamente 1250 pacientes con isquemia de miocardio sospechada que provoca angina estable. Se prevé que aproximadamente 250 pacientes tienen isquemia de miocardio significativa en la obtención de imágenes por perfusión en miocardio de radionúclido. En todos los pacientes, se miden las 5 proteínas de vesícula extracelular serpina F2, serpina G1, serpina C1, CD14 y cistatina C en las fracciones de plasma LDL, HDL, REX y TEX usando precipitación secuencial y un ensayo de inmuno-perlas. Usando selección inversa y directa, se determinan el AUC, NPV, PPV, sensibilidad y especificidad con el fin de identificar los marcadores (incluyendo las razones del biomarcador entre las subfracciones de plasma) y la combinación de marcadores con el mejor rendimiento diagnóstico.
Claims (8)
1. Método para identificar a un sujeto que padece una cardiopatía isquémica, que es angina estable, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) obtener una o más de las fracciones de plasma seleccionadas del grupo que consiste en la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL) y la fracción de lipoproteína de alta densidad (HDL) a partir de una muestra de plasma de dicho sujeto;
b) determinar uno o más valores, en el que cada uno del uno o más valores:
- es un valor derivado de una concentración de un marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, en el que al menos uno del uno o más valores se deriva de una concentración de serpina C1, o
- es un valor que es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, o
- es un valor que es una combinación de un valor derivado de una concentración de un marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en una de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1, y un valor que es una razón de dos valores derivados de las concentraciones de un único marcador de proteína asociado con las vesículas extracelulares en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, en el que el marcador de proteína se selecciona del grupo que consiste en serpina C1, cistatina C, CD14, serpina F2 y serpina G1,
y en el que el uno o más valores se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) difiere de la línea de referencia diagonal de 0,5 con un valor de p de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados,
c) realizar una comparación del uno o más valores tal como se determinan en la etapa b) con uno o más valores de referencia correspondientes, que se han derivado de la misma manera de la concentración del mismo uno o más marcadores de proteína en fracciones de plasma correspondientes tal como se determina en el grupo de sujetos de referencia que no padecen dicha cardiopatía isquémica, en el que una diferencia estadísticamente significativa entre el uno o más valores determinados en la etapa b) y el uno o más valores de referencia correspondientes es indicativa de que el sujeto padece dicha cardiopatía isquémica.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más valores en la etapa b) se seleccionan de tal manera que el área bajo la curva (AUC) es de 0,8 o más y el valor de p es de 0,05 o menos, tal como se determina mediante análisis de gráfico de rendimiento diagnóstico (ROC) de la combinación de dicho uno o más valores basándose en un grupo de sujetos definitivos y grupo de sujetos de referencia adecuados.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el valor pronóstico negativo y/o el valor pronóstico positivo es de 0,8 o más.
4. Método según la reivindicación 1o 2, en el que al menos uno del uno o más valores se selecciona del grupo que consiste en valores derivados de la concentración de:
- serpina C1 en la fracción de plasma de HDL,
y
- CD14 en la fracción de plasma de HDL,
y/o en el que al menos uno del uno o más valores es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma, seleccionadas del grupo que consiste en:
- la concentración de serpina C1 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de CD14 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de cistatina C en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL,
- la concentración de serpina F2 en la fracción de plasma de LDL con respecto a la concentración en la fracción de plasma de HDL.
5. Método según la reivindicación 4, en el que al menos uno del uno o más valores se selecciona del grupo que consiste en un valor derivado de la concentración de:
- serpina C1 en la fracción de plasma de HDL,
y/o un valor que es una razón de
- un valor derivado de la concentración de serpina F2 en la fracción de plasma de LDL con respecto a un valor derivado de la concentración en la fracción de plasma de HDL.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno del uno o más valores es una razón de dos valores derivados de concentraciones de un único marcador de proteína en dos diferentes de dichas fracciones de plasma.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa b) comprende determinar al menos dos valores que implican al menos dos marcadores de proteína diferentes.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un marcador de proteína es serpina C1.
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