ES2954929T3

ES2954929T3 - Regulación de expresión génica mediante control mediado por aptámeros de ribozimas de autocorte

Info

Publication number: ES2954929T3
Application number: ES17748194T
Authority: ES
Inventors: Michael Volles; Olivier Danos; Alex Boyne; Veronique Zennou; Xuecui Guo
Original assignee: MeiraGTx UK II Ltd
Current assignee: MeiraGTx UK II Ltd
Priority date: 2016-02-02
Filing date: 2017-02-02
Publication date: 2023-11-27
Anticipated expiration: 2037-02-02
Also published as: SI3411506T1; SG11201806589UA; MX2018009369A; US20200032253A1; IL260842B2; WO2017136608A3; HRP20231119T1; CN109476697B; LT3411506T; EP3411506B1; HUE063465T2; US20230220382A1; BR112018015815A2; IL260842B1; WO2017136608A4; WO2017136608A2; US11512310B2; KR20180118650A; CN109476697A; RS64585B1

Abstract

La invención proporciona construcciones de polinucleótidos para la regulación de la expresión génica mediante modulación basada en aptámeros de ribozimas autoescindibles y métodos para usar las construcciones para regular la expresión génica en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se une al aptámero. La invención proporciona además métodos para fabricar y usar riboconmutadores que disminuyen la expresión del gen diana en respuesta a un ligando de aptámero, así como riboconmutadores que aumentan la expresión del gen diana en respuesta a un ligando de aptámero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Regulación de expresión génica mediante control mediado por aptámeros de ribozimas de autocorte Campo de la invención

La invención proporciona construcciones de polinucleótidos para regular la expresión génica mediante modulación a base de aptámeros de ribozimas de autocorte, así como métodos para usar las construcciones para regular la expresión génica en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se una al aptámero.

Antecedentes de la invención

Las ribozimas endonucleolíticas pequeñas comprenden motivos de ARN de aproximadamente 50-150 nucleótidos (“nt”) de longitud con actividad de corte de ARN intrínseca. Existen diversas clases de ribozimas endonucleolíticas pequeñas, incluidas las de cabeza de martillo y las horquilladas. Recientemente, se han identificado nuevas clases de ribozimas de autocorte, incluidas twister, twister sister, pistol y hatchet.

Felletti et al: (“Screening of Genetic Switches Based on the Twister Ribozyme Motif”, Nucleic Add Aptamers: Selection, Characterization, and Application, Methods in Molecular Biology, en: Methods Mol Biol. 2016; 1380:225-39) divulgan un método para desarrollar nuevos riborreguladores dependientes de ligando que comprenden un motivo twister, que emplean el motivo catalítico como plataforma de expresión en conjugación con dominios aptaméricos seleccionados de manera natural o in vitro.

En el documento U.S. 2015/0056174 se proporcionan ribosomas de cabeza de martillo modificados con actividad endonucleolítica aumentada (véanse, por ejemplo, las figs. 5A-F)

Berens et al. (“Riboswitch engineering - making the all-important second and third steps”, Curr. Opin. Biotechnol., febrero de 2015; 31:10-5) se refieren a ciertos detalles de selección e idoneidad de aptámeros. En la presente invención se usan ribozimas enlazadas a aptámeros para crear casetes de polinucleótidos para regular la expresión del gen objetivo en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se una al aptámero.

Compendio de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un casete de polinucleótidos para regular la expresión de un gen objetivo que comprende un riborregulador que comprende una ribozima twister enlazada mediante un tallo a un aptámero, en donde el tallo que enlaza la ribozima twister al aptámero se conecta a la ribozima en la ubicación del tallo P3 de la ribozima twister y en donde el gen objetivo se encuentra enlazado al tallo P1 de la ribozima twister, en donde el casete de polinucleótidos, cuando se incorpora a un gen objetivo, inhibe la expresión del gen objetivo en presencia de un ligando aptámero. En este contexto, el riborregulador es un “riborregulador de apagado”, dado que la unión de aptámero/ligando aumenta la función de la ribonucleasa de la ribozima twister que conduce al corte del ARN del gen objetivo que contiene el casete de polinucleótidos, lo cual reduce la expresión del gen objetivo. En una realización, el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

En una realización, la ribozima twister proviene de Nasonia vitripennis. En una realización, la ribozima twister comprende la SEQ ID NO:38. En una realización, la ribozima twister comprende la SEQ ID NO:39.

En una realización, el tallo P1 comprende una secuencia que alarga el tallo P1 de la ribozima twister en 1 a 3 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 3 a 9 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 4 a 7 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 6 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 7 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 8 pares de bases.

En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero comprende la secuencia del tallo de ribozima P3 y/o la secuencia del tallo de aptámero P1. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero no comprende la secuencia del tallo de ribozima P3 y/o no comprende la secuencia del tallo de aptámero P1. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 pares de bases. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de 3 a 7 pares de bases. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de 4 pares de bases. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de 3 pares de bases.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para modular la expresión de un gen objetivo que comprende:

(a) insertar un casete de polinucleótidos que comprende un riborregulador de apagado descrito en la presente en un gen objetivo,

(b) introducir el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos en una célula y

(c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de forma específica al aptámero en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen objetivo,

en donde dicho método no es un método para tratar el cuerpo de un ser humano o de un animal mediante terapia.

De manera similar, la presente invención también proporciona un casete de polinucleótidos que comprende un biorregulador de apagado descrito en la presente para uso en un método de terapia mediante la modulación de la expresión de un gen objetivo que comprende:

(a) insertar dicho casete de polinucleótidos en un gen objetivo,

(b) introducir el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos en una célula, y

(c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de manera específica al aptámero en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen objetivo.

En una realización, el casete de polinucleótidos se inserta en la región sin traducción 5' del gen objetivo, la región sin traducción 3' del gen objetivo y/o corriente abajo del codón de inicio de la traducción del gen objetivo.

En una realización, cuando el casete de polinucleótidos se inserta corriente abajo (es decir, 3') del codón de inicio de la traducción del gen objetivo, el riborregulador se encuentra adyacente al codón de inicio. En otras realizaciones, el riborregulador se encuentra a de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, a de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, o a de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 nucleótidos del codón de inicio del gen objetivo. En una realización, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de péptidos 2A entre el extremo 3' del riborregulador y la secuencia de codificación del gen objetivo. En una realización, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia enlazadora adyacente a la secuencia de péptidos 2A.

En una realización, dos o más de los casetes de polinucleótidos se insertan en el gen objetivo. En una realización, los dos o más casetes de polinucleótidos comprenden diferentes aptámeros que se unen de forma específica a diferentes ligandos de molécula pequeña. En una realización, los dos o más casetes de polinucleótidos comprenden el mismo aptámero.

En una realización, el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos se incorpora en un vector para expresión del gen objetivo. En una realización, el vector es un vector viral. En una realización, el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector de virus asociado con adeno y un vector lentiviral.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un casete de polinucleótidos para regular la expresión de un gen objetivo con un riborregulador que comprende una ribozima twister enlazada a un aptámero, en donde el tallo P1 de la ribozima twister y el tallo P1 del aptámero comprenden un brazo de tallo compartido alternativamente, en donde el aptámero se encuentra enlazado al extremo 3' o 5' del tallo P1 de la ribozima twister y en donde, cuando el aptámero se encuentra enlazado al extremo 3' del tallo P1 de la ribozima twister, una parte del brazo 3' del tallo P1 de la ribozima twister es, de forma alternativa, el brazo 5' del tallo P1 del aptámero, y en donde, cuando el aptámero se encuentra enlazado al extremo 5' del tallo P1 de la ribozima twister, una parte del brazo 5' del tallo P1 de la ribozima twister es, de forma alternativa, el brazo 3' del tallo P1 del aptámero (véanse, p. ej., las figuras 6a-6b), en donde el casete de polinucleótidos, cuando se incorpora a un gen objetivo, aumenta la expresión del gen objetivo en presencia de un ligando de aptámero. En este contexto, el riborregulador es un “riborregulador de encendido”, dado que la unión de aptámero/ligando inhibe la función de ribonucleasa de la ribozima twister, lo cual disminuye el corte del ARN del gen objetivo que contiene el casete de polinucleótidos y, de esa forma, aumenta la expresión del gen objetivo. En una realización, el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

En una realización, la parte del brazo del tallo P1 de la ribozima twister que es, de forma alternativa, un brazo del tallo P1 del aptámero tiene 4 a 8 nucleótidos, 5 a 7 nucleótidos, 6 nucleótidos o 7 nucleótidos. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 4 a 9 pares de bases, 5 a 8 pares de bases, 6 pares de bases o 7 pares de bases. En una realización, el tallo P1 del aptámero tiene 6 a 11 pares de bases, 7 a 10 pares de bases, 8 pares de bases o 9 pares de bases.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de modulación de la expresión de un gen objetivo que comprende:

a) insertar un casete de polinucleótidos que comprende un riborregulador de encendido descrito en la presente en un gen objetivo,

b) introducir el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos en una célula, y

c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de forma específica al aptámero en una cantidad eficaz para aumentar la expresión del gen objetivo,

De manera similar, la presente invención también proporciona un casete de polinucleótidos que comprende un riborregulador de encendido descrito en la presente para uso en un método de terapia mediante la modulación de la expresión de un gen objetivo que comprende:

a) insertar dicho casete de polinucleótidos en un gen objetivo,

c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de forma específica al aptámero en una cantidad eficaz para aumentar la expresión del gen objetivo.

En una realización, el casete de polinucleótidos se inserta en la región sin traducción 5' del gen objetivo, la región sin traducción 3' del gen objetivo y/o corriente abajo del codón de inicio de la traducción.

En una realización, cuando el casete de polinucleótidos se inserta corriente abajo (es decir, 3') del codón de inicio de la traducción del gen objetivo, el riborregulador de encendido se encuentra adyacente al codón de inicio. En otras realizaciones, el riborregulador se encuentra a de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, a de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, o a de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 nucleótidos del codón de inicio del gen objetivo. En una realización, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de péptidos 2A entre el extremo 3' del riborregulador y la secuencia de codificación del gen objetivo. En una realización, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia enlazadora adyacente a la secuencia de péptidos 2A.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende un gen objetivo que contiene un casete de polinucleótidos de la presente invención. En una realización, el vector es un vector viral. En una realización, el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector de virus asociado con adeno y un vector lentiviral.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1 a-1 b. Las ribozimas twister se autocortan y suprimen la expresión génica en células de mamífero. Figura 1a. La secuencia de ribozima twister de N. vitripennis (twister de avispa) o de una muestra ambiental (twister de muestra) se clonó en la región sin traducción (“UTR”, por su sigla en inglés) 3' en el vector pEGFP-C1. Las células HEK 293 se transfectaron con las construcciones idénticas y se midió la intensidad de fluorescencia de GFP. La twister de avispa provocó cerca de un 97% de reducción o reducción de 36 veces en la expresión de GFP, en comparación con el control de pEGFP-C1. Al clonarse en la UTR 3' de GFP, la twister de muestra redujo de forma considerable la expresión del gen objetivo en células HEK 293, pero no en la misma medida que la twister de avispa.

Figura 1b. Se generó una secuencia twister mutante mediante mutación de A6 en G, según indica la estructura secundaria de twister de avispa incorporada en el gráfico. Las células HEK 293 se transfectaron con las construcciones idénticas y se midió la intensidad de fluorescencia de GFP. La twister de avispa nuevamente redujo la expresión de GFP al clonarse en la UTR 3'. No obstante, el mutante de twister de avispa no provocó una reducción en la expresión de GFP.

Figuras 2a-2b. La modificación de la secuencia de tallo P1 mejora la actividad de corte de la ribozima twister. Figura 2a. Secuencia con extensión de 3 pares de bases (3HP) del tallo P1 de twister de avispa.

Figura 2b. La eliminación del punto SacII de la construcción inicial GFP_twister-avispa y la adición de un tallo de 3 pb al tallo P1 de twister mejoró el corte por parte de la ribozima twister, lo cual condujo a una reducción adicional de la expresión de GFP.

Figura 2c. Se muestra el resultado del ensayo de luciferasa. Se transfectaron células HEK 293 con las construcciones indicadas que contenían el gen de luciferasa de luciérnaga y twister con o sin 3HP en la UTR 3'.

Figuras 3a-3e. Generación de ribozima twister con respuesta a guanina.

Figura 3a. Esquema del enlace de la secuencia de aptámero a la ribozima twister y explicación de la respuesta de la ribozima twister al ligando de aptámero. La secuencia de aptámero se ilustra con una línea más gruesa. En ausencia del ligando de aptámero, el aptámero libre de ligando altera el corte de ribozima twister, lo cual conduce a un ARNm intacto y posterior expresión génica. En presencia del ligando de aptámero, el ligando enlazado al aptámero facilita la formación del tallo P3 y, por lo tanto, restablece la actividad de corte de la ribozima twister, lo cual conduce a inhibición de la expresión génica.

Figura 3b. Resultados del ensayo de luciferasa de luciérnaga. Se realizaron veinte construcciones enlazando el tallo P1 del aptámero de guanina al tallo P3 de la ribozima twister, como se muestra en el panel inferior de la figura 3a. El 3HP adicional se contó como porción del tallo P1 de twister. El tallo que conecta el bucle 2 y el aptámero se truncó en forma de secuencia, lo cual generó tallos de diferentes longitudes, según se indica entre paréntesis. Las células HEK 293 se transfectaron con construcciones idénticas y se trataron con o sin guanina. La cantidad múltiplo de reducción de la construcción Luci-Gua16avispa se indica en la gráfica. Figura 3c. Validación de construcciones de luciferasa que contienen Gua16avispa o una Gua16avispa mutante. La Gua16avispa de tipo natural redujo la actividad de luciferasa tras el tratamiento con guanina 500 |jM, mientras que este no fue el caso de Gua16avispa mutante.

Figura 3d. Se muestran los resultados del ensayo de luciferasa. Las células HEK 293 se transfectaron con construcciones idénticas y se trataron con o sin guanina 500 jM o guanosina 1 mM.

Figura 3e. Las células HEK 293 se transfectaron con construcciones idénticas y se trataron con guanosina 500 jM. Se usó DMSO como control de disolvente. El sobrenadante se recogió 18 horas tras el tratamiento con guanosina y se midió Epo usando el equipo de ELISA. Los resultados se expresaron como media ± DE (n = 2). Se muestra una representación de dos experimentos independientes.

Figuras 4a-4b. Generación de riborreguladores twister con respuesta a teofilina.

Figura 4a. Esquema del enlace del aptámero de teofilina a la secuencia de bucle 2 en la ribozima twister. Se muestran las secuencias y la longitud del tallo que conecta el aptámero de teofilina y el bucle 2 de twister. El aptámero y el ligando se indican como

Figura 4b. Se muestran los resultados del ensayo de luciferasa. Las células HEK 293 se transfectaron con las construcciones indicadas y se trataron con y sin teofilina 2 mM 4 horas después de la transfección.

Figuras 5a-5b. Transferibilidad del riborregulador twister en células de mamífero.

Figura 5a. Esquema de las construcciones con riborregulador twisterGua16 y un enlazador y la secuencia peptídica 2A (enlazador 2A) insertada corriente abajo de ATG y corriente arriba de la secuencia de codificación de luciferasa restante (panel superior), o twisterGua16 y la secuencia de enlazador 2A insertada corriente abajo de la secuencia de codificación para los primeros 10 aminoácidos de GFP (panel inferior).

Figura 5b. Se muestra el resultado de un ensayo de luciferasa. Se transfectaron células HEK293 con las construcciones indicadas. Las células transfectadas se trataron con o sin guanina 4 horas después de la transfección. Los resultados se expresan como media ± DE (n = 3).

Figuras 6a-6b. Generación de riborregulador twister DE ENCENDIDO con respuesta al ligando del aptámero.

Figura 6a. Se muestra un esquema del riborregulador de guanina twister DE ENCENDIDO (en el que el aptámero se encuentra enlazado al extremo 3' del P1 de twister). La configuración de twister de avispa y la secuencia de aptámero se muestran a modo de ejemplo, con el extremo 3' del tallo P1 (incluido el tallo de 3 pb) enlazado a la secuencia de aptámero. En esta configuración, la secuencia de tallo se comparte entre el tallo P1 de twister y el tallo P1 del aptámero. La secuencia de tallo compartida se indica con una línea más gruesa. Se supone que, ante la ausencia del ligando de aptámero (panel superior), la secuencia de aptámero enlazada al tallo P1 de twister no altera la estructura de twister y su actividad de corte de ribozima, lo cual produce corte del ARNm y posterior inhibición de la expresión génica. En presencia del ligando de aptámero (panel inferior), el aptámero forma el tallo P1 y no permite el acceso de la formación de tallo P1 de twister a la secuencia de tallo compartida (línea más gruesa), lo cual altera la estructura de twister y su actividad de ribozima y, por lo tanto, produce un ARNm intacto y posterior expresión génica.

Figura 6b. Se transfectaron células HEK293 con las construcciones de luciferasa indicadas. Las células transfectadas se trataron con o sin guanosina 500 μM. Se usó DMSO como control de disolvente. Los resultados se expresan como media ± DE (n = 3). En la gráfica se indica la cantidad de inducción de cada construcción.

Figuras 7a-7b. Secuencia (7a) de ribozima de cabeza de martillo y secuencia (7b) de ribozima de tipo horquilla colocadas corriente abajo del codón de inicio de la traducción. El panel superior muestra la secuencia de nucleótidos y el panel inferior muestra las secuencias peptídicas traducidas usando diferentes marcos de lectura. La línea superior en cada caso es la ribozima original, sin traducción. Los puntos en la secuencia de nucleótidos se usan para indicar “igual a la línea superior”. La secuencia peptídica 2A de virus Thoseaasigna (T2A) se indica como 2A. Se realizaron mutaciones para eliminar los posibles codones de detención en las secuencias de ribozima.

Figura 7c. Resultados de la actividad de beta-galactosidasa generados a partir de células HEK 293 transfectadas con las construcciones indicadas. La mitad izquierda de la gráfica muestra los resultados de construcciones con la secuencia de ribozima de cabeza de martillo y la mitad derecha indica los resultados de construcciones con la secuencia de ribozima de tipo horquilla. La reducción múltiplo de la actividad de LacZ se expresa como la relación del valor generado a partir de la construcción mutante inactiva de ribozima al valor generado de la construcción activa de ribozima. El múltiplo mayor se indica mediante una flecha para cada ribozima.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona construcciones de polinucleótidos para regular la expresión génica mediante modulación a base de aptámeros de ribozimas endonucleolíticas pequeñas, así como métodos para usar las construcciones para regular la expresión génica en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se une al aptámero. La construcción de polinucleótidos contiene al menos un riborregulador que contiene una ribozima y un aptámero. La forma en que la se conecta la ribozima al aptámero proporciona riborreguladores que activan el autocorte de ribozimas en presencia del ligando del aptámero (riborreguladores “de apagado”) o riborreguladores que inhiben el autocorte de ribozimas en presencia del aptámero (riborreguladores “de encendido”).

El casete de polinucleótidos de regulación génica se refiere a una construcción de ADN recombinante que, cuando se incorpora al ADN de un gen objetivo, proporciona la capacidad de regular la expresión del gen objetivo por regulación mediada por aptámero/ligando de autocorte de ribosomas. Como se usa en la presente, un casete de polinucleótidos o construcción de polinucleótidos es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende elementos derivados de diferentes fuentes (por ejemplo, diferentes organismos, diferentes genes del mismo organismo, y similares). El casete de polinucleótidos comprende un riborregulador. El riborregulador en el contexto de la presente invención contiene una región de sensor (por ejemplo, un aptámero) y una ribozima que en conjunto realizan la detección de la presencia de un ligando que une la región de sensor y de alterar la conformación del punto de unión de la ribozima. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister y el tallo P1 del aptámero comprenden un brazo de tallo compartido de forma alternativa, se aumenta la expresión del gen objetivo cuando está presente el ligando de aptámero y disminuye cuando está ausente el ligando. En otra realización, la expresión del gen objetivo disminuye cuando está presente el ligando de aptámero y aumenta cuando está ausente el ligando.

Ribozimas

La ribozima de uso en la presente invención, cualquier ribozima endonucleolítica pequeña que experimente autocorte en el tipo celular objetivo, es decir, una ribozima twister. Véase, p. ej., a Roth et al., Nat Chem Biol.

10(1): 56-60; y Weinberg et al., Nat Chem Biol. agosto de 2015; 11(8): 606-10. En el documento U.S.

2015/0056174 se proporcionan ribozimas de cabeza de martillo modificadas con mejor actividad endonucleolítica (véanse, p. ej., las figuras 5A-F). En una realización, la ribozima es la ribozima twister de Nasonia vitripenni comprende la SEQ. ID NO.:39 que corresponde a una (SEQ. ID NO.:38). En una realización, la ribozima, ribozima twister identificada a partir de una muestra ambiental.

Riborregulador

El término “riborregulador”, tal como se usa en la presente, se refiere a un segmento regulador de un polinucleótido de ARN. Un riborregulador en el contexto de la presente invención contiene una región de sensor (p. ej., un aptámero) y una ribonucleasa de autocorte que en conjunto realizan la detección de la presencia de un ligando (p. ej., una molécula pequeña) y la modulación de la conformación de una ribonucleasa de autocorte y, por lo tanto, su actividad. En una realización, el riborregulador es recombinante y utiliza polinucleótidos de dos o más fuentes. El término “sintético”, según su uso en la presente en el contexto de un riborregulador, hace referencia a un riborregulador que no es de origen natural. El sensor (p. ej., aptámero) y las regiones de ribonucleasa se juntan mediante un enlazador polinucleótido. El enlazador polinucleótido forma un tallo de ARN (es decir, una región del polinucleótido de a Rn de cadena doble). Riborreguladores de apagado

En un aspecto, la presente invención proporciona un casete de polinucleótidos para la regulación de la expresión de un gen objetivo que comprende un riborregulador que comprende una ribozima twister enlazada por un tallo a un aptámero, en donde el tallo que enlaza la ribozima twister al aptámero se conecta a la ribozima en la ubicación del tallo P3 de la ribozima twister, y en donde el gen objetivo está enlazado al tallo P1 de la ribozima twister (véase, por ejemplo, la figura 3a), en donde el casete de polinucleótidos, cuando se incorpora en un gen objetivo, inhibe la expresión del gen objetivo en presencia de un ligando de aptámero. En este contexto, el riborregulador es un “riborregulador de apagado” dado que la unión aptámero/ligando aumenta la función de la ribonucleasa de la ribozima twister que conduce al corte del ARN del gen objetivo que contiene el casete de polinucleótidos, por lo que se reduce la expresión del gen objetivo.

En esta configuración, en la que ambos brazos de un tallo del aptámero se encuentran enlazados a ambos brazos del tallo P3 de la ribozima, este tallo puede contener una secuencia adicional con capacidad de formar un tallo cuando el aptámero se une a su ligando. Esta secuencia de tallo adicional puede incluir una secuencia del tallo P1 del aptámero y/o una secuencia adicional añadida para facilitar la formación de tallos cuando el aptámero se une a su ligando. El tallo P3 puede comprender uno, dos, tres o más cambios con respecto a la secuencia P3 de tipo natural de la ribozima. En algunas realizaciones, el tallo que enlaza el aptámero a la ribozima no contiene una secuencia del tallo P3 de twister ni del tallo del aptámero. Asimismo, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero (incluido el tallo P3) puede comprender uno o más errores de emparejamiento en los que un nucleótido no es complementario de su contraparte en el otro brazo del tallo. El tallo que enlaza el aptámero a la ribozima debería tener una longitud (y contenido de GC) suficientes para formar un tallo tras la unión del ligando al aptámero y, de esa forma, promover la actividad de endonucleasa de ribozimas y, cuando el ligando no se encuentra presente en cantidades suficientes, adoptar una conformación que inhiba la actividad de endonucleasa de la ribozima. La longitud y la secuencia del tallo pueden modificarse usando técnicas conocidas para identificar tallos que permitan una expresión de referencia aceptable del gen objetivo cuando el ligando se encuentra presente, así como grados de expresión aceptables del gen objetivo cuando el ligando no se encuentra presente. Por ejemplo, si el tallo es demasiado largo, puede proporcionar una conformación de ribozima activa en presencia o ausencia del ligando. Si el tallo es demasiado corto, puede no proporcionar una ribozima activa incluso en presencia del ligando. En determinadas realizaciones, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene aproximadamente 3 a aproximadamente 7 pares de bases. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene 3 a 7 pares de bases. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de 4 pares de bases. En una realización, el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de 3 pares de bases.

Se debe comprender que el tallo que enlaza el aptámero y la ribozima no siempre se encuentra en una configuración de tallo de cadena doble. Tal como se muestra en la figura 3a, cuando el aptámero no se encuentra enlazado al ligando, la estructura del tallo se ve alterada e inhibe la actividad endonucleolítica de ribozima. Cuando el aptámero se une a su ligando, el tallo se estabiliza y promueve la actividad endonucleolítica de ribozima.

En esta configuración de riborregulador de apagado, el tallo P1 de la ribozima se enlaza a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo (véase, p. ej., la figura 3a). Este tallo P1 de la ribozima puede comprender todas o algunas de las secuencias P1 de la ribozima de origen natural. Este tallo P1 puede contener una secuencia de tallo adicional de otra fuente. El tallo P1 puede comprender uno, dos, tres o más cambios con respecto a la secuencia P1 de tipo natural de la ribozima. En algunas realizaciones, el tallo P1 de la ribozima no contiene ninguna secuencia de la secuencia P1 de tipo natural de la ribozima. El tallo se sigue indicando como tallo P1 de la ribozima debido a su ubicación. La longitud y la secuencia del tallo P1 pueden modificarse usando técnicas conocidas para identificar tallos que permitan, p. ej., una expresión de referencia aceptable del gen objetivo. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 3 a 9 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 4 a 7 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 7 pares de bases. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 8 pares de bases.

El casete de polinucleótidos que comprende el riborregulador de apagado puede colocarse en una o más ubicaciónes en el gen objetivo que incluyen, de modo no taxativo, las UTR 5' y 3' y corriente abajo del codón de inicio.

Riborreguladores de encendido

En otro aspecto, la presente invención proporciona un casete de polinucleótidos para la regulación de la expresión de un gen objetivo que comprende un riborregulador que comprende una ribozima twister enlazada a un aptámero, en donde el tallo P1 de la ribozima twister y el tallo P1 del aptámero comprenden un brazo de tallo compartido de forma alternativa, en donde el aptámero está enlazado al extremo 3' o 5' del tallo P1 de la ribozima twister, en donde cuando el aptámero se enlaza al extremo 3' del tallo P1 de la ribozima twister una parte del brazo 3' del tallo P1 de la ribozima twister es alternativamente la porción del brazo 5' del tallo P1 del aptámero, y en donde cuando el aptámero se enlaza al extremo 5' del tallo P1 de la ribozima twister, una parte del brazo 5' del tallo P1 de la ribozima twister es alternativamente porción del brazo 3' del tallo P1 del aptámero (véanse, por ejemplo, las figuras 6a-6b), en donde el casete de polinucleótidos, cuando se incorpora a un gen objetivo, aumenta la expresión del gen objetivo en presencia de un ligando de aptámero. En este contexto, el riborregulador es un “riborregulador de encendido” dado que la unión de aptámero/ligando inhibe la función ribonucleasa de la ribosoma twister que disminuye el corte del ARN del gen objetivo que contiene el casete de polinucleótidos, por lo que aumenta la expresión del gen objetivo en presencia del ligando.

Tal como sucede con los tallos de aptámero y ribozima mencionados con relación al riborregulador de apagado, el tallo P1 de la ribozima y el tallo P1 del aptámero pueden comprender o no una secuencia de tallo de tipo natural. De esta forma, los nombres del tallo se basan en su ubicación en la ribozima o el aptámero y no implican que los tallos comprendan ninguna secuencia particular. Cada uno del tallo P1 de la ribozima y el tallo P1 del aptámero puede comprender de forma independiente una secuencia de tallo además de la secuencia de tallo compartida. Esta secuencia de tallo adicional puede incluir una secuencia del tallo P1 del aptámero o P1 de la ribozima respectiva y/o una secuencia adicional añadida para facilitar la formación de tallos. Asimismo, el tallo P1 de la ribozima y/o P1 de aptámero puede comprender uno o más errores de emparejamiento en los que un nucleótido no es complementario de su contraparte en el otro brazo del tallo.

El tallo P1 del aptámero y P1 de la ribozima deberían tener una longitud (y contenido de GC) suficientes para que el aptámero forme el tallo P1 en presencia del ligando de aptámero y la ribozima forme el tallo P1 cuando no se encuentre presente el ligando. La longitud y la secuencia de los tallos pueden modificarse usando técnicas conocidas para identificar tallos que permitan una expresión de referencia aceptable del gen objetivo cuando el ligando no se encuentra presente, así como grados de expresión aceptables del gen objetivo cuando se encuentra presente el ligando. En una realización, el tallo P1 de la ribozima twister tiene 4 a 9 pares de bases, 5 a 8 pares de bases, 6 pares de bases o 7 pares de bases. En una realización, el tallo P1 del aptámero tiene 6 a 11 pares de bases, 7 a 10 pares de bases, 8 pares de bases o 9 pares de bases.

En esta configuración de riborregulador de encendido, el aptámero se encuentra adyacente a la ribozima (ya sea en 5' o 3') y tanto el aptámero como la ribozima comprenden un brazo de tallo compartido de forma alternativa. Cuando el aptámero se encuentra unido a su ligando, este estabiliza el tallo P1 del aptámero, lo cual evita su uso como porción de la estructura de ribozima e inhibe la actividad de endonucleasa de ribozima. Cuando el ligando no está presente, el tallo compartido se encuentra libre para formar una porción del tallo P1 de la ribozima, lo cual permite la actividad de endonucleasa de ribozima y el corte del ARN objetivo que conduce a menor expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, la parte compartida de forma alternativa de los tallos de la ribozima y el aptámero es de 4 a 8 nucleótidos, 5 a 7 nucleótidos, 6 nucleótidos o 7 nucleótidos.

El casete de polinucleótidos que comprende el riborregulador de encendido puede colocarse en una o más ubicaciones en el gen objetivo que incluyen, de modo no taxativo, las UTR 5' y 3' y corriente abajo del codón de inicio.

Aptámero/ligando

Según la invención, la región de sensor comprende un aptámero. El término “aptámero”, como se usa en la presente, hace referencia a un polinucleótido de ARN que se une de forma específica a un ligando. El término “ligando” hace referencia a una molécula unida de forma específica mediante un aptámero. En una realización, el ligando es una molécula de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 1000 dalton), por ejemplo, lípidos, monosacáridos, segundos mensajeros, factores conjuntos, iones metálicos, otros productos naturales y metabolitos, ácidos nucleicos, así como la mayoría de los fármacos terapéuticos. En una realización, el ligando es un polinucleótido con dos o más bases de nucleótidos.

En una realización, el ligando se selecciona del grupo que consiste en 8-azaguanina, monohidrato de adenosina 5'-monofosfato, anfotericina B, avermectina B1, azatioprina, acetato de clormadinona, mercaptopurina, clorhidrato de moricizina, N6-metiladenosina, nadida, progesterona, clorhidrato de promazina, pamoato de pirvinio, sulfaguanidina, propionato de testosterona, tioguanosina, tiloxapol y vorinostat.

Los ligandos de aptámeros también pueden ser componentes endógenos celulares que aumentan considerablemente en condiciones patológicas/fisiológicas específicas, como la transformación oncogénica. Estos pueden incluir moléculas mensajeras secundarias, como GTP o GDP, calcio; ácidos grasos o ácidos grasos metabolizados de forma incorrecta como 13-HODE en el cáncer de mama (Flaherty, JT et al., Plos One, tomo 8, e63076, 2013); aminoácidos o metabolitos de aminoácidos; metabolitos en la vía de glicólisis que suelen tener concentraciones superiores en células cancerosas o en células normales en enfermedades metabólicas; y moléculas asociadas con cáncer como Ras o la proteína Ras mutante, EGFR mutante en el cáncer de pulmón, indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO) en muchos tipos de cáncer. Los ligandos endógenos incluyen metabolitos de progesterona en el cáncer de mama, como divulga Wiebe (Endocrine-Related Cancer (2006) 13:717-738). Los ligandos endógenos también incluyen metabolitos con mayores concentraciones que resultan de mutaciones en enzimas metabólicas clave en el cáncer de riñón como lactato, glutationa, quinurenina, como desvelan Minton, D. R. y Nanus, D. M. (Nature Reviews, Urology, tomo 12, 2005).

Los aptámeros tienen regiones de unión con capacidad de formar complejos con una molécula objetivo deseada (es decir, el ligando). La especificidad de la unión puede definirse según las constantes de disociación (Kd) comparativas del aptámero con respecto a su ligando, en comparación con la constante de disociación del aptámero con respecto a moléculas no relacionadas. Por lo tanto, el ligando es una molécula que se une al aptámero con mayor afinidad que a un material no relacionado. Generalmente, la Kd del aptámero con respecto a su ligando es de al menos aproximadamente 10 veces menos que la Kd del aptámero con moléculas no relacionadas. En otras realizaciones, la Kd es de al menos aproximadamente 20 veces menos, al menos aproximadamente 50 veces menos, al menos aproximadamente 100 veces menos y al menos aproximadamente 200 veces menos. Un aptámero generalmente tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Más comúnmente, un aptámero tiene entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud.

Los aptámeros que pueden incorporarse como parte del riborregulador pueden ser un aptámero de origen natural o modificaciones de este, o aptámeros diseñados de novo y/o analizados mediante evolución sistémica de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX, por su sigla en inglés) u otros métodos de análisis. Los ejemplos de aptámeros que se unen a ligandos de molécula pequeña incluyen, de modo no taxativo, teofilina, dopamina, sulforhodamina B, celobiosa, kanamicina A, lividomicina, tobramicina, neomicina B, viomicina, cloranfenicol, estreptomicina, citocinas, moléculas de superficie celular y metabolitos. Se puede encontrar una revisión de aptámeros que reconocen moléculas pequeñas, p. ej., en Famulok, Science 9:324-9 (1999) y McKeague, M. & DeRosa, M. C. J. Nuc. Aci. 2012. En otra realización, el aptámero es un polinucleótido complementario.

Métodos para identificar aptámeros/ligandos

En una realización, el aptámero se encuentra diseñado para unirse a un ligando de molécula pequeña particular. Se divulgan métodos para diseñar y seleccionar aptámeros que se unen a ligandos particulares en 62/370,599. Otros métodos para analizar aptámeros incluyen, por ejemplo, SELEX. Se desvelan métodos para diseñar aptámeros que se unan de forma selectiva a moléculas pequeñas usando SELEX, p. ej., en las Patentes Estadounidenses n.° 5,475,096, 5,270,163, y Abdullah Ozer, et al. Nuc. Aci. 2014. Las modificaciones de los procesos de SELEX se describen en las Patentes Estadounidenses n.° 5,580,737 y 5,567,588.

Las técnicas de selección para identificar aptámeros suelen implicar la preparación de un gran conjunto de moléculas de ADN o ARN de la longitud deseada que contienen una región sometida a aleatorización o mutagénesis. Por ejemplo, un conjunto de oligonucleótidos para selección de aptámeros podría contener una región de 20-100 nucleótidos sometidos a aleatorización y flanqueadas por regiones de secuencia definida con una longitud de aproximadamente 15-25 nucleótidos y útiles para la unión de cebadores de PCR. El conjunto de oligonucleótidos se amplifica usando técnicas de PCR estándar u otros medios que permiten la amplificación de secuencias de ácido nucleico seleccionadas. El conjunto de ADN puede transcribirse in vitro para producir un conjunto de transcripciones de ARN cuando se desee un aptámero de ARN. El conjunto de oligonucleótidos de ADN o ARN luego se somete a una selección según su capacidad de unirse de forma específica al ligando deseado. Las técnicas de selección incluyen, por ejemplo, cromatografía por afinidad, si bien se puede usar cualquier protocolo que permita la selección de ácidos nucleicos en función de su capacidad de unirse específicamente a otra molécula. Las técnicas de selección para identificar aptámeros que se unen a moléculas pequeñas y funcionan dentro de una célula pueden implicar métodos de análisis a base de células. En el caso de la cromatografía por afinidad, los oligonucleótidos se ponen en contacto con el ligando objetivo inmovilizado en un sustrato en una columna o en microesferas magnéticas. El oligonucleótido se selecciona preferiblemente para unión de ligandos en presencia de concentraciones de sal, temperaturas y otras condiciones que imiten las condiciones fisiológicas normales. Los oligonucleótidos en el conjunto que se unen al ligando quedan retenidos en la columna o microesfera y se produce desprendimiento de las secuencias que no se unen. Los oligonucleótidos que se unen al ligando luego se amplifican (tras la transcripción inversa en caso de utilizar transcripciones de ARN) mediante PCR (normalmente tras la elución). El proceso de selección se repite en las secuencias seleccionadas durante un total de aproximadamente tres a diez rondas iterativas del procedimiento de selección. Los oligonucleótidos resultantes luego se amplifican, se clonan y se secuencian usando procedimientos estándar para identificar las secuencias de los oligonucleótidos con capacidad de unirse al ligando objetivo. Luego de identificar la secuencia de aptámeros, el aptámero puede optimizarse adicionalmente realizando rondas adicionales de selección a partir de un conjunto de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de aptámeros sometidos a mutagénesis.

El análisis de aptámeros in vivo puede usarse siguiendo una o más rondas de selección in vitro (p. ej., SELEX). Por ejemplo, Konig, J. et al. (RNA. 2007, 13(4): 614-622) describen la combinación de SEL^eX y un sistema híbrido de tres levaduras para selección in vivo de aptámeros.

Genes objetivo

El casete de regulación génica de la presente invención es una plataforma que puede usarse para regular la expresión de cualquier gen objetivo que pueda expresarse en una célula, un tejido o un organismo objetivo. El término “gen objetivo” hace referencia a un polinucleótido que se introduce en una célula y tiene la capacidad de transcribirse en ARN y traducirse y/o expresarse en condiciones adecuadas. De forma alternativa, el gen objetivo es endógeno con respecto a la célula objetivo y el casete de regulación génica de la presente invención se coloca en el gen objetivo (por ejemplo, en la UTR 5' o 3' de un gen objetivo endógeno). Un ejemplo de un gen objetivo es un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico. En otra realización, el gen objetivo codifica un ARN, como miARN, ARNr, ARN no codificantes pequeños o largos, ARN horquillado corto (ARNhc) y cualquier otro ARN regulador. En una realización, el gen objetivo es exógeno con respecto a la célula en la que se desea transcribir la construcción de ADN recombinante. En otra realización, el gen objetivo es endógeno con respecto a la célula en la que se desea transcribir la construcción de ADN recombinante.

El gen objetivo según la presente invención puede ser un gen que codifique una proteína o una secuencia que codifique un ARN no codificante de proteína. El gen objetivo puede ser, por ejemplo, un gen que codifique una proteína estructural, una enzima, una proteína de señalización celular, una proteína de mitocondria, una proteína de dedos de cinc, una hormona, una proteína de transporte, un factor de crecimiento, una citocina, una proteína intracelular, una proteína extracelular, una proteína transmembrana, una proteína citoplásmica, una proteína nuclear, una molécula receptora, una proteína de unión a ARN, una proteína de unión a ADN, un factor de transcripción, maquinaria de traducción, una proteína de canal, una proteína motora, una molécula de adhesión celular, una proteína de mitocondria, una enzima metabólica, una cinasa, una fosfatasa, factores de intercambio, una proteína chaperona y moduladores de cualquiera de estas. En algunas realizaciones, el gen objetivo codifica eritropoyetina (Epo), hormona de crecimiento humana (hGH), nucleasas efectoras tipo factor de transcripción (TALEN), insulina humana, proteína 9 asociada a CRISPR (cas9) o una inmunoglobulina (o parte de esta), incluido, p. ej., un anticuerpo terapéutico.

Construcciones de expresión

La presente invención contempla el uso de un vector recombinante para la introducción en células objetivo de un polinucleótido que codifique un gen objetivo y que contenga el casete de regulación génica descrito en la presente. En muchas realizaciones, la construcción de ADN recombinante de la presente invención incluye elementos de ADN adicionales que incluyen segmentos de ADN que proporcionan la replicación del ADN en una célula hospedadora y la expresión del gen objetivo en dicha célula a concentraciones adecuadas. El experto en la técnica observará que las secuencias de control de expresión (promotores, potenciadores y similares) se seleccionan según su capacidad de promover la expresión del gen objetivo en la célula objetivo.

“Vector” significa un plásmido recombinante, cromosoma artificial de levadura (YAC), minicromosoma, virus o minicírculo de ADN (incluidas secuencias derivadas de virus) que comprenden un polinucleótido que se lleva a una célula hospedadora in vitro o in vivo. En una realización, el vector recombinante es un vector viral o una combinación de múltiples vectores virales.

En la técnica se conocen los vectores virales para expresión mediada por aptámero de un gen objetivo en una célula, un tejido o un organismo conocidos, e incluyen vectores adenovirales (AV), vectores de virus asociados con adeno (AAV), vectores lentivirales y retrovirales y vectores de herpes simple de tipo 1 (HSV1).

Los vectores adenovirales incluyen, por ejemplo, los que se basan en adenovirus humano de tipo 2 y adenovirus humano de tipo 5 en los que se ha provocado un defecto de replicación mediante eliminaciones en las regiones E1 y E3. El casete de transcripción puede insertarse en la región E1, lo cual produce un vector de AV recombinante con eliminación de E1/E3. Los vectores adenovirales también incluyen vectores adenovirales de gran capacidad y dependientes de auxiliares (también conocidos como vectores “gutless" o “gutted" de gran capacidad) que no contienen secuencias de codificación viral. Estos vectores contienen los elementos de actuación cis necesarios para la replicación de ADN viral y envoltura de ADN, principalmente las secuencias de repetición terminal (ITR, por su sigla en inglés) y la señal de envoltura (^). Estos genomas de vector AV dependiente de auxiliares tienen el potencial de trasladar desde unos pocos cientos de pares de bases hasta cerca de 36 kb de ADN foráneo.

Los vectores de virus asociados con adeno recombinantes “rAAV” incluyen cualquier vector derivado de cualquier serotipo de virus asociado con adeno, incluidos, de modo no taxativo, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 y AAV-8, AAV-9, AAV-10 y similares. Uno o más de los genes de tipo natural de AAV en los vectores de rAAV pueden eliminarse de forma parcial o total, preferiblemente los genes Rep y/o Cap, pero se conservan las secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias de ITR funcionales se conservan para rescate, replicación, envoltura y posible integración cromosómica del genoma de AAV. No es necesario que las ITR sean secuencias de nucleótidos de tipo natural y pueden estar alteradas (p. ej., mediante inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos), siempre que las secuencias proporcionen rescate funcional, replicación y envoltura.

De forma alternativa, en realizaciones de la invención pueden usarse otros sistemas como vectores lentivirales. Los sistemas de base lentiviral pueden transducir células con o sin división, lo cual los hace útiles para aplicaciones dirigidas, por ejemplo, a células del SNC sin división. Los vectores lentivirales se derivan del virus de inmunodeficiencia humana y, al igual que dicho virus, se integran en el genoma hospedador y proporcionan el potencial de expresión génica a largo plazo.

También se pueden introducir en una célula u organismo polinucleótidos, incluidos plásmidos, YAC, minicromosomas y minicírculos, con el gen objetivo que contenga el casete de regulación génica, mediante sistemas de vectores no virales, usando, por ejemplo, lípidos catiónicos, polímeros o ambos como portadores. También pueden usarse sistemas poliméricos de polietilenimina (PEI) y polímero de poli-L-lisina (PLL) conjugados para suministrar el vector a las células. Otros métodos para suministrar el vector a las células incluyen inyección hidrodinámica y electroporación con uso de ultrasonido, tanto para cultivos celulares como para organismos. Se puede encontrar una revisión de sistemas de suministro virales y no virales para suministro génico en Nayerossadat, N. et al. (Adv Biomed Res. 2012; 1:27).

Métodos para modular la expresión de un gen objetivo

En un aspecto, esta invención proporciona un método para modular la expresión de un gen objetivo (por ejemplo, un gen terapéutico) mediante a) inserción del casete de polinucleótidos de regulación génica de la presente invención en un gen objetivo; b) introduciendo el gen objetivo que comprende el casete de regulación génica en una célula; y c) exponiendo la célula a un ligando que une el aptámero en una cantidad eficaz para modular la expresión del gen objetivo, en donde dicho método no es un método para tratamiento del cuerpo de un ser humano o de un animal mediante terapia. En un aspecto relacionado, esta invención proporciona un casete de polinucleótidos de regulación génica de la presente invención para uso en un método de terapia mediante la modulación de la expresión de un gen objetivo (por ejemplo, un gen terapéutico) mediante a) la inserción de dicho casete de polinucleótidos de regulación génica en un gen objetivo; b) la introducción del gen objetivo que comprende el casete de regulación génica en una célula; y c) exponiendo la célula a un ligando que une el aptámero en una cantidad eficaz para modular la expresión del gen objetivo.

En una realización, se insertan uno o más casetes de regulación génica en la UTR 3' y/o UTR 5' del gen objetivo. En una realización, se inserta un único casete de regulación génica en la UTR 3' de un gen objetivo. En otras realizaciones, se insertan 2, 3, 4 o más casetes de regulación génica en el gen objetivo. En una realización, se insertan dos casetes de regulación génica en el gen objetivo. Al insertar múltiples casetes de regulación génica en un gen objetivo, cada uno de ellos puede contener el mismo aptámero, de modo tal de poder usar un único ligando para modular el corte de ribonucleasa de los múltiples casetes y así modular la expresión del gen objetivo. En otras realizaciones, se insertan múltiples casetes de regulación génica en un gen objetivo, cada uno de los cuales contiene un aptámero diferente, para que la exposición a múltiples ligandos de molécula pequeña diferentes module la expresión del gen objetivo. En otras realizaciones, se insertan múltiples casetes de regulación génica en un gen objetivo, conteniendo cada uno diferentes secuencias de sustrato de ribonucleasa. Esto puede ser útil para reducir la recombinación y mejorar la facilidad de incorporación en vectores virales.

En una realización, un casete de polinucleótidos de la presente invención es eficaz en la modulación de la expresión del gen objetivo al colocarse corriente abajo (es decir, 3') del codón de inicio del gen objetivo. En una realización, cuando el casete de polinucleótidos se inserta corriente abajo del codón de inicio de la traducción del gen objetivo, el riborregulador de encendido se encuentra adyacente al codón de inicio. En otras realizaciones, el riborregulador se encuentra a ade proximadamente 1 a aproximadamente 100, a de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, o de a aproximadamente 1 a aproximadamente 20 nucleótidos del codón de inicio del gen objetivo. En una realización, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de péptidos 2A entre el extremo 3' del riborregulador y la secuencia de codificación del gen objetivo. En una realización, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de péptidos 2A y un enlazador (“enlazador 2A”) entre el extremo 3' del riborregulador y la secuencia de codificación del gen objetivo. La secuencia 2A que se usa en los ejemplos se identificó a partir del virus Thoseaasigna y, por tanto, se suele denominar “T2A”. En lugar de T2A, se pueden usar otras secuencias que separan los polipéptidos líder del resto del producto génico. Otros péptidos 2A incluyen los identificados en Picornavirus: virus de la enfermedad de fiebre aftosa (F2A, el primero descubierto), virus de rinitis equina A (E2A) y tescovirus porcino (P2A). Otros péptidos 2A incluyen el péptido 2A de rotavirus tipo C.

El casete de polinucleótidos de la presente invención puede usarse en combinación con otros mecanismos para regular la expresión del gen objetivo. En una realización, se usa un casete de polinucleótidos de la presente invención en combinación con un casete de regulación génica que modula la expresión de genes objetivo mediante regulación mediada por aptámeros del proceso de corte y empalme alternativo, según se describe en el documento WO 2016/126747.

Usos médicos y composiciones farmacéuticas

Como se describió en detalle anteriormente, un aspecto de la invención proporciona un casete de polinucleótidos de la presente invención para uso en un método de terapia por regulación de la concentración de una proteína terapéutica que proporciona la terapia génica. En esta realización, el “gen objetivo” puede codificar la proteína terapéutica. El “gen objetivo” puede codificar una proteína endógena o exógena con respecto a la célula.

La secuencia del gen terapéutico que contiene el casete de regulación con riborregulador impulsado por aptámeros se suministra a las células objetivo in vitro o ex vivo, p. ej., mediante un vector. La especificidad celular del “gen objetivo” puede controlarse mediante el promotor u otros elementos en el vector. La primera etapa en la producción de la proteína terapéutica es el suministro de la construcción de vector que contiene el gen objetivo y el casete de polinucleótidos y la transfección de los tejidos objetivo que produce transfección estable del gen objetivo regulado.

No obstante, debido a la presencia del casete de regulación en la secuencia génica objetivo, el gen objetivo no se expresa en niveles significativos. En algunas realizaciones, el gen objetivo se encuentra en el “estado apagado” en ausencia del ligando específico que se une al aptámero contenido en el riborregulador del casete de regulación. La expresión del gen objetivo solamente se activa cuando se administra el ligando específico del aptámero (o cuando este se encuentra presente de otra forma en cantidades suficientes). En otras realizaciones, el gen objetivo se encuentra en el “estado apagado” en presencia del ligando específico que se une al aptámero contenido en el riborregulador del casete de regulación. Cuando la administración se detiene (o el ligando se encuentra presente de otra forma en concnetraciones suficientemente bajas), tiene lugar la expresión del gen objetivo.

El suministro de la construcción de vector que contiene el gen objetivo, así como el suministro del ligando de activación usualmente se encuentran separados en el tiempo. El suministro del ligando de activación controla cuándo se expresa el gen objetivo, así como el grado de expresión de proteína. El ligando puede suministrarse mediante distintas vías que incluyen, de modo no taxativo, oral, intramuscular (IM), intravenosa (IV), intraocular o tópica.

El momento de suministro del ligando dependerá del requisito de activación del gen objetivo. Por ejemplo, si la proteína terapéutica codificada por el gen objetivo se requiere de manera constante, en el caso de los riborreguladores “de encendido”, se puede suministrar un ligando de molécula pequeña oral de forma diaria o múltiples veces al día, para asegurar una activación continua del gen objetivo y, por lo tanto, la expresión continua de la proteína terapéutica. Si el gen objetivo tiene un efecto de larga duración, el ligando inductor puede dosificarse con menor frecuencia.

La presente invención permite controlar de manera temporal la expresión del transgén terapéutico, de una forma determinada por la dosificación temporal del ligando específico del aptámero en el riborregulador del casete de polinucleótidos de regulación. La mayor expresión del transgén terapéutico solamente en la administración del ligando (en el caso de los riborreguladores “de encendido”) aumenta la seguridad de un tratamiento de terapia génica al permitir que el gen objetivo se encuentre apagado en ausencia del ligando.

Se pueden usar distintos aptámeros para permitir la activación de ligandos diferentes o la represión de genes objetivos. En determinadas realizaciones de la invención, cada gen terapéutico que contiene un casete de regulación tendrá un aptámero específico en dicho casete que se activará mediante una molécula pequeña específica. Esto significa que cada gen terapéutico puede activarse solamente mediante el ligando específico del aptámero que contiene. En estas realizaciones, cada ligando solamente activa un gen terapéutico. Esto permite la posibilidad de suministrar varios “genes objetivo” diferentes a un individuo, cada uno de los cuales se activa al suministrar el ligando específico para el aptámero contenido en el casete de regulación incluido en cada uno de los genes objetivo.

La presente invención permite que el organismo produzca cualquier proteína terapéutica cuyo gen pueda suministrarse al organismo (como eritropoyetina (EPO) o un anticuerpo terapéutico), al suministrar el ligando de activación. Este método de suministro proteína terapéutica puede remplazar la fabricación de dichas proteínas terapéuticas fuera del organismo para su posterior inyección o perfusión, p. ej., se pueden usar anticuerpos en cáncer o para bloquear una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria. El organismo que contiene el gen objetivo regulado se convierte en una fábrica para producción de elementos biológicos que se pone en marcha al administrar el ligando específico del gen.

Los niveles de dosificación y el momento de la dosificación de una proteína terapéutica pueden ser importantes para el efecto terapéutico. Por ejemplo, en el suministro de AVASTIN (anticuerpo anti-VEGF) contra el cáncer. La presente invención aumenta la facilidad de dosificación en respuesta a la supervisión de los efectos y las concentraciones de la proteína terapéutica.

En una realización, el gen objetivo puede codificar una nucleasa que pueda dirigirse a una secuencia de ADN particular y editarla. Dichas nucleasas incluyen Cas9, nucleasas con dedos de cinc o TALEN. En el caso de estas nucleasas, la proteína de nucleasa puede ser necesaria solamente durante un período de tiempo suficiente para editar los genes endógenos objetivo. No obstante, si se suministra al organismo un gen de nucleasa no regulado, esta proteína puede estar presente durante el resto de la vida de la célula. En el caso de las nucleasas, cuanto más tiempo se encuentre presente una nucleasa mayor riesgo existirá de edición no específica. La regulación de la expresión de dichas proteínas tiene una ventaja de seguridad considerable. En este caso, el vector que contiene el gen objetivo de nucleasa que contiene un casete de regulación podría suministrarse a las células adecuadas del organismo. El gen objetivo se encuentra en el estado “apagado” en ausencia del ligando específico del casete, por lo que no se produce nucleasa. La nucleasa solamente se produce al administrar el ligando de activación. Una vez que transcurre suficiente tiempo para permitir una edición suficiente, se retira el ligando y no se vuelve a administrar. Por lo tanto, el gen de nucleasa luego se encuentra en el estado “apagado”, ya no se produce nucleasa y se detiene la edición. Este enfoque puede usarse para corregir trastornos genéticos, incluidas diversas retinopatías hereditarias, como LCA10, provocada por mutaciones en CEP290, y enfermedad de Stagardt, provocada por mutaciones en ABCA4.

La administración de un gen objetivo regulado que codifique una proteína terapéutica activada solamente tras la administración del ligando específico podría usarse para regular los genes terapéuticos para el tratamiento de muchos tipos de enfermedades diversas, p. ej., cáncer con anticuerpos terapéuticos, trastornos inmunológicos con anticuerpos o proteínas inmunomoduladoras, enfermedades metabólicas, enfermedades poco frecuentes como PNH con anticuerpos anti-C5 o fragmentos de anticuerpo como gen regulado o angiogénesis ocular con anticuerpos terapéuticos y DMAE seca con proteínas inmunomoduladoras.

Diversos genes objetivo específicos que permiten el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones específicas son adecuados para uso en la presente invención. Por ejemplo, se puede usar insulina o un análogo de insulina (preferiblemente insulina humana o un análogo de insulina humana) como gen objetivo para tratar la diabetes tipo I, diabetes tipo II o el síndrome metabólico, la hormona de crecimiento humana puede usarse como gen objetivo para tratar a niños con trastornos de crecimiento o adultos con deficiencia de hormona de crecimiento, se puede usar eritropoyetina (preferiblemente eritropoyetina humana) como gen objetivo para tratar la anemia debida a enfermedad renal crónica, anemia debida a mielodisplasia o anemia debida a quimioterapia contra el cáncer.

La presente invención puede ser especialmente adecuada para el tratamiento de enfermedades provocadas por defectos génicos únicos, como la fibrosis cística, hemofilia, distrofia muscular, talasemia o anemia de células falsiformes. Por lo tanto, se puede usar p-, y-, 6- o Z-globina humana como gen objetivo para tratar la p-talasemia o anemia de células falsiformes y se puede usar el factor VIII o factor IX humano como gen objetivo para tratar la hemofilia A o la hemofilia B.

Los ligandos que se usan en la presente invención suelen combinarse con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables para formar composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un paciente. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, aglutinantes, diluyentes, disgregrantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que suelen usarse en la técnica farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en forma de comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y similares y se formulan para asegurar compatibilidad con la vía de administración deseada. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, p. ej., intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutánea, oral, por inhalación, transdérmica (tópica), transmucosal y rectal.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los ligandos se administran a un paciente en un cronograma de dosificación adecuado para el suministro al paciente de una cantidad de ligando suficiente para regular de manera deseada el gen objetivo. Cuando el ligando es una molécula pequeña y la forma farmacéutica es un comprimido, una cápsula o similar, la composición farmacéutica comprende preferiblemente de 0.1 mg a 10 g de ligando, de 0.5 mg a 5 g de ligando, de 1 mg a 1 g de ligando, de 2 mg a 750 mg de ligando, de 5 mg a 500 mg de ligando o de 10 mg a 250 mg de ligando.

Las composiciones farmacéuticas pueden dosificarse una vez al día o múltiples veces al día (p. ej., 2, 3, 4, 5 o más veces al día). De forma alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden dosificarse con una frecuencia inferior a una vez al día, p. ej., una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, una vez al mes o una vez cada ciertos meses. En algunas realizaciones de la invención, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un paciente solamente una pequeña cantidad de veces, p. ej., una vez, dos veces, tres veces, etc.

También se describe, pero no está cubierto por la materia de las reivindicaciones, un método para tratar a un paciente que necesite una mayor expresión de una proteína terapéutica codificada por un gen objetivo, comprendiendo el método administrarle al paciente una composición farmacéutica que comprende un ligando para un aptámero, en el que el paciente ya recibió previamente un ADN recombinante que comprende el gen objetivo y donde el gen objetivo contiene un casete de regulación génica de la presente invención que proporciona la capacidad de regular la expresión del gen objetivo mediante el ligando del aptámero a través de proceso de corte y empalme alternativo del pre-ARNm del gen objetivo, con lo cual se aumenta la expresión de la proteína terapéutica.

Artículos de fabricación y equipos

También se describen, pero no están cubiertos por la materia de las reivindicaciones, equipos o artículos de fabricación para uso en los métodos descritos en la presente. En algunos aspectos, los equipos comprenden las composiciones descritas en la presente (p. ej., para composiciones para suministro de un vector que comprende el gen objetivo que contiene el casete de regulación génica) en un envase adecuado. En la técnica se conoce el envasado adecuado para las composiciones descritas en la presente (como composiciones oculares para inyección) e incluyen, por ejemplo, viales (como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (p. ej., bolsas plásticas o película Mylar sellada) y similares. Estos artículos de fabricación pueden esterilizarse y/o sellarse adicionalmente.

También se describen, pero no están cubiertos por la materia de las reivindicaciones, equipos que comprenden composiciones descritas en la presente y que pueden comprender adicionalmente instrucciones sobre los métodos de uso de la composición, como los usos descritos en la presente. Los equipos descritos en la presente pueden incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para llevar a cabo la administración, incluido, p. ej., cualquier método descrito en la presente. Por ejemplo, el equipo puede comprender rAAV para expresión del gen objetivo que comprende el casete de regulación génica de la presente invención, un portador farmacéuticamente aceptable para inyección y uno o más de los siguientes: un amortiguador, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa y un prospecto con instrucciones para realizar las inyecciones. El equipo puede ser adecuado para inyección intraocular, inyección intramuscular, inyección intravenosa y similares.

“Homología” y “homólogo/a”, según su uso en la presente hacen referencia al porcentaje de identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia y otra puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante comparación directa de dos moléculas de polipéptido alineando la información de secuencia y usando programas informáticos fácilmente disponibles. Dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos son “sustancialmente homólogas” entre sí cuando, tras una alineación óptima con inserciones o eliminaciones adecuadas, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90% y al menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, son correspondientes en una longitud definida de las moléculas, según se determina usando los métodos anteriores.

“Porcentaje de identidad de secuencia” con respecto a una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos de referencia, luego de alinear las secuencias e introducir separaciones, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos puede lograrse de diversas formas conocidas para el experto en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles al público, como el software B^lA^sT, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNA^sT^aR).

Los términos “polinucleótido” o “ácido nucleico”, según su uso en la presente, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, estos términos incluyen, de modo no taxativo, ADN o ARN de cadena simple, doble o múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas químicamente o bioquímicamente, no naturales o derivadas. “Heterólogo/a” o “exógeno/a” significan derivado/a de una entidad genotípicamente distinta a la del resto de la entidad con la que se compara o en la que se introduce o se incorpora. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de modificación genética en un tipo celular diferente es un polinucleótido heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). De forma similar, una secuencia celular (p. ej., un gen o una parte de este) que se incorpora en un vector viral es una secuencia de nucleótidos heteróloga con respecto al vector.

La tabla a continuación incluye un listado de las secuencias de ADN de construcciones descritas en la presente, así como otras secuencias descritas. La secuencia de ribozimas se encuentra subrayada y en letras minúsculas cursivas, el tallo de 3 pares de bases (3HP) adicionales se encuentra en letras minúsculas con subrayado doble, las secuencias de aptámeros se encuentran en letra minúscula con subrayado ondulado, las secuencias de tallo compartidas entre el tallo de twister y el tallo de aptámero se encuentran en letras minúsculas con sombreado de color gris, la secuencia de enlazador 2A se encuentra en letras minúsculas con subrayado grueso y las secuencias de codificación se encuentran en letras mayúsculas.

Se debe comprender y prever que la invención desvelada en la presente puede experimentar variaciones en sus principios según realice el experto en la técnica. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1

Las ribozimas twister se autocortan y suprimen la expresión génica en células de mamífero Procedimientos experimentales

Construcciones de plásmido: Se sintetizaron (IDT) oligonucleótidos con secuencias de ribozima twister mutantes o de tipo natural de Nasonia Vitripennis (avispa) o de muestras ambientales, flanqueados por los puntos BsrGI y MfeI. Los oligonucleótidos (“oligos”) sintetizados se digirieron con BsrGI y MfeI y se clonaron en pEGFP-C1 (Clontech) digerido con las enzimas de restricción compatibles. Las secuencias de los vectores construidos se verificaron mediante secuenciación de ADN (Genewiz).

Transfección y medición de fluorescencia de GFP: El día antes de la transfección, se colocaron 3.5 x104 células HEK 293 en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se añadió ADN plásmido (500 ng) a un tubo o una placa de fondo en U de 96 pocillos. Por separado, se añadió reactivo TransIT-293 (Mirus; 1.4 μl) a 50 μl de medio Opti-mem I (Life Technologies) y se dejó reposar 5 minutos a temperatura ambiente (“TA”). Luego se añadieron 50 μl de este reactivo de transfección diluido al ADN, se mezclaron e incubaron a TA durante 20 min. Por último, se añadieron 7 μl de esta disolución a un pocillo de células en una placa de 96 pocillos. Se usó una construcción LacZ sin expresión de GFP como control negativo de referencia. Se midió la intensidad de fluorescencia de GFP mediante el lector de placas Tecan usando una longitud de onda de excitación a 484 nm, una longitud de onda de emisión a 510 nm y un ancho de banda de excitación a 5 nm. La intensidad de fluorescencia de GFP se expresó como el valor generado por las construcciones de GFP menos el valor generado por la construcción LacZ.

Resultados

Las ribozimas twister existen en muchas especies de bacterias y eucaria. No obstante, no se ha determinado su actividad de autocorte en células de mamífero. Para investigar si es posible que la ribozima twister corte el ARNm y suprima la expresión génica en células de mamífero, se insertaron una secuencia de ribozima twister de N. Vitripennis (avispa) y una secuencia de ribozima twister de muestras ambientales en las UTR 3' del gen EGFP en el vector pEGFP-C1. Tal como se muestra en la figura 1a, la inserción de la ribozima twister de avispa en la UTR 3' produjo un 97% de inhibición e inhibición de 36 veces de la expresión de GFP en comparación con la construcción de control pEGFP-C1. La secuencia twister de la muestra ambiental (twister de muestra) no produjo una supresión tan marcada de la expresión de GFP como la twister de avispa y generó aproximadamente el 50% de supresión de la expresión de GFP en comparación con el vector de GFP de control. Para determinar adicionalmente que la supresión de la expresión de GFP se debía al corte de la ribozima twister, se generó una construcción mutante en la que se remplazó A6 con G, lo que imposibilitó el corte de la ribozima twister. Esta mutación A6G abolió por completo la supresión de la expresión de GFP, mientras que la ribozima twister de tipo natural provocó una reducción de 44 veces, como se muestra en la figura 1b. Estos resultados indican que, en células de mamífero, las ribozimas twister de autocortan al encontrarse presentes en el ARN del gen objetivo y, de esa forma, suprimen la expresión del gen objetivo.

Ejemplo 2

La modificación de la secuencia de tallo P1 de la ribozima twister mejora la actividad de corte de la ribozima twister

Procedimientos experimentales

Construcciones de plásmido: Se usaron los siguientes cebadores para generar las construcciones GFP_avispa_No Sac 0HP o GFP_avispa_No Sac 3HP: cebadores directos NoSac_Dir (5' GCTGTACAAGTAAACTTGTAATGCGGCCGTGTAAATAATTTAC) y NoSac3HP_Dir (5' AGCTGTACAAGTAAACGCCTTGTAATGCGGCCGTGTAAATAATTTAC) y cebador inverso MfeI Inv (5' ACAACAACAATTGCATTCATTTTATG). Se usó el vector GFP_twister-avispa como plantilla y los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR se digirieron con BsrGI y MfeI y se clonaron en pEGFP-C1 digerido con enzimas BsrGI y MfeI. El gen EGFP en pEGFP-C1 se remplazó con el gen de luciferasa de luciérnaga para generar el vector pFLuc, usando la estrategia de clonación Gibson y un equipo de clonación (NEB). Se usó la misma estrategia para generar las construcciones Luc_avispa_No Sac 0HP y Luc_avispa_No Sac 3 HP remplazando el gen EGFP en las construcciones GFP_avispa_no Sac 0HP y GFP_avispa_no Sac 3HP con el gen de luciferasa de luciérnaga.

Se realizó una medición de la intensidad de fluorescencia de GFP como se describió en el ejemplo 1.

Ensayo de luciferasa de luciérnaga de células cultivadas: 24 horas después del cambio de medio, se retiraron las placas de la incubadora, se equilibraron hasta TA durante varios minutos en una mesa de laboratorio y luego se aspiraron. Se añadió amortiguador Glo-lisis (Promega, 100 μL, TA) y se permitió que las placas permanecieran a TA durante al menos 5 minutos. Se mezcló el contenido de los pocillos mediante trituración con 50 μL y se mezclaron 20 μL de cada muestra con 20 μL de reactivo bright-glo (Promega) diluido hasta el 10% en amortiguador de glo-lisis. Se separaron 96 pocillos en una placa de 384 pocillos blanca opaca. Tras una incubación de 5 minutos a TA, se midió la luminiscencia usando una máquina Tecan con un tiempo de lectura de 500 ms. La actividad de luciferasa se expresó como unidad lumínica relativa media (RLU) ± DE.

Resultados

Para potenciar adicionalmente la actividad de corte de la ribozima twister en células de mamífero y, de esa forma, aumentar el intervalo dinámico de supresión de la expresión del gen objetivo mediante la ribozima, se modificaron las secuencias adyacentes al tallo P1 de twister en la construcción GFP-twister. Primero, se eliminó la secuencia SacII ubicada en el extremo 5' de la secuencia twister, lo cual generó GFP_avispa_no Sac 0HP. Para determinar si un tallo P1 más largo podría estabilizar la ribozima twister y, por lo tanto, aumentar su actividad de corte, la secuencia del punto SacII se remplazó con CGC para crear un tallo de 3 pares de bases (3HP) en la base del tallo P1 de la ribozima twister (figura 2a), lo cual generó la construcción GFP_avispa_no Sac 3HP. Curiosamente, como se muestra en la figura 2b, la eliminación de la secuencia SacII aumentó la supresión de GFP, de 37 veces con la construcción con la secuencia SacII a 68 veces con la construcción GFP_avispa_no Sac 0HP sin el punto SacII, lo que sugiere que la secuencia adyacente al 5' de la secuencia P1 impidió la actividad de ribozima. La adición de un tallo de 3 pb a la base del tallo P1 aumentó adicionalmente la actividad de ribozima y generó una supresión de 104 veces en la expresión de GFP. La actividad de esta construcción twister modificada también se probó usando un gen de luciferasa de luciérnaga como informante. Tal como se muestra en la figura 2c, la eliminación de la secuencia SacII produjo una reducción de 101 veces en la actividad de luciferasa en comparación con la construcción de control pFLuc. La adición de un tallo de 3 pb en el tallo P1 aumentó adicionalmente la reducción de la actividad de luciferasa hasta 254 veces en comparación con la construcción de control.

Ejemplo 3

Uso del aptámero de xpt-guanina para regular la expresión del gen objetivo mediante modulación de la ribozima twister

Procedimientos experimentales

Se sintetizaron (IDT) oligos que contenían la secuencia de ribozima twister enlazados con un aptámero de xpt-guanina y se clonaron en el vector μLuc usando la estrategia de clonación Gibson y el equipo (NEB). Las secuencias de las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN (Genewiz).

Transfección y tratamiento del ligando del aptámero: Se transfectaron células HEK 293 como se describió en el ejemplo 1. Cuatro horas tras la transfección, se aspiró el medio y se añadió nuevo medio con o sin guanina 500 |jM o guanosina 1 mM (Sigma). Se realizó un ensayo de luciferasa 20 a 24 horas tras el tratamiento con guanina o guanosina, como se describió en el ejemplo 2. La reducción múltiplo se expresó como el cociente de actividad de luciferasa objetivo sin el ligando del aptámero, dividido entre el valor obtenido en presencia del ligando del aptámero.

Ensayo ELISA para medir la Epo de ratón en el medio de cultivo: Se recogió el sobrenadante 18 horas tras el tratamiento con fármaco y se realizó un ELISA con un equipo de ELISA (R&D), según las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron usando un ajuste de curva de 4 parámetros.

Resultados

Para regular la actividad de corte de la ribozima twister y, de esa forma, regular la expresión del gen objetivo, se enlazó la secuencia de aptámero al tallo P3 de la ribozima twister. Cuando el ligando del aptámero no se encuentra presente, se altera la estructura de la ribozima, lo cual evita el corte y permite la expresión del gen objetivo (figura 3a, panel superior). La adición del ligando del aptámero conduce a un cambio conformacional que permite el corte de la ribozima twister y la reducción de la expresión de gen objetivo (figura 3a, panel inferior). El tallo P1 del aptámero de xpt-guanina se injertó en el tallo P3 de la ribozima twister para generar la ribozima twister con respuesta a guanina. En esta configuración (figura 3a), en ausencia del ligando del aptámero, la inserción de la secuencia de aptámero entre los dos brazos del tallo P3 de twister altera el tallo P3 y la estructura de la ribozima twister, lo cual altera la actividad de corte y permite la expresión del gen objetivo. En presencia del ligando del aptámero, la unión de aptámero/ligando une los brazos del tallo, lo cual facilita la formación del tallo P3 y la actividad de corte de twister y suprime la expresión del gen objetivo. Asimismo, se analizó la hipótesis de que si el tallo que conecta el aptámero y twister es demasiado largo la formación del tallo podría ser independiente de la existencia de una secuencia de aptámero y producirse en ausencia del ligando del aptámero. No obstante, si el tallo es demasiado corto puede no alcanzarse una estructura de tallo estable, incluso en presencia del ligando del aptámero. Por tanto, para determinar una longitud óptima del tallo (para lograr una capacidad de respuesta óptima al ligando del aptámero), se optimizó la logitud del tallo que conecta el aptámero y la ribozima. Se realizaron truncamientos en serie del tallo, lo cual generó un total de 20 construcciones con la longitud del tallo de entre 17 y 1 pb. Tal como se muestra en la figura 3b, de las 20 construcciones construidas, Luci-Gua16avispa con 3 pb de tallo que conecta el aptámero de guanina directamente con el bucle 2 de twister mostró la reducción más profunda en la expresión del gen de luciferasa (15 veces). Las construcciones con una longitud de tallo inferior a 3 pb o superior a 7 pb no mostraron reducción considerable tras el tratamiento con guanina.

La construcción Luci-Gua16avispa luego se validó en un experimento separado, en el que se incluyó una construcción de control con el mutante sin capacidad de corte. Tal como se muestra en la figura 3c, tras el tratamiento con guanina, Luci-Gua16avispa generó el 92% (12 veces) de reducción en la actividad de luciferasa en comparación con la actividad de luciferasa sin adición de guanina. Por el contrario, ni la construcción μLuc ni Luci-Gua16avispamut mostraron reducción en la actividad de luciferasa tras el tratamiento con guanina. Estos resultados indican que, tras el tratamiento con ligando de aptámero, se restableció la actividad de ribozima twister, lo cual condujo a la menor producción de la expresión del gen objetivo. Al usar guanosina a 1 mM como ligando del aptámero, la construcción Luci-G16avispa produjo una reducción de 25 veces en la expresión de luciferasa (figura 3d).

Al insertar Gua16avispa en la UTR 3' de un gen de eritropoyetina (Epo) de ratón, tras el tratamiento con guanina, la producción de Epo se redujo aproximadamente un 30% en comparación con la Epo producida a partir de las células de control tratadas con disolvente. Nuestros resultados demuestran la generación de una ribozima twister con respuesta a guanina/guanosina, un riborregulador twister sintético que suprime la expresión del gen objetivo en respuesta al tratamiento con ligando del aptámero.

Ejemplo 4

Uso del aptámero de teofilina para regular la expresión del gen objetivo mediante modulación de la ribozima twister

Procedimiento experimental

Se sintetizaron (IDT) oligos que contenían la secuencia de ribozima twister enlazados con un aptámero de teofilina y se clonaron en el vector pLuc usando la estrategia de clonación Gibson y el equipo (NEB). Las secuencias de las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN (Genewiz).

Transfección y ensayo de luciferasa de luciérnaga: Se transfectaron células HEK 293 como se describió en el ejemplo 1. Cuatro horas tras la transfección, se aspiró el medio y se añadió nuevo medio con o sin teofilina 2 mM (Sigma). Se realizó un ensayo de luciferasa 20 a 24 horas tras el tratamiento con teofilina, como se describió en el ejemplo 2. La reducción múltiplo se expresó como el cociente de actividad de luciferasa objetivo sin el ligando del aptámero, dividido entre el valor obtenido en presencia del ligando del aptámero. Resultados

Se probó el uso de un aptámero adicional en la modulación del corte por parte de la ribozima twister, lo cual regula la expresión del gen objetivo. En función de las 20 construcciones Luci-Guaavispa (1-20) descritas en el ejemplo 3, se usó una secuencia de tallo con 3 o 4 pb adicionales para conectar el aptámero de teofilina al bucle 2 de la ribozima twister. Asimismo, la secuencia de los tallos fue variable, como se ilustra en la figura 4a. Tal como se muestra en la figura 4b, el tratamiento con teofilina produjo una reducción en la actividad de luciferasa en todas las construcciones, en comparación con las muestras sin tratamiento con teofilina. La construcción twister_teo_3 experimentó una reducción del 62% en la expresión génica tras el tratamiento con teofilina. Estos datos demuestran la generación de una ribozima twister con respuesta a teofilina, un riborregulador twister sintético.

El injerto de secuencias de tallo y aptámero de teofilina a la secuencia de bucle 2 en twister provocó un efecto diferente en la alteración de la actividad de la ribozima twister, como se demuestra en la figura 4b, en ausencia de tratamiento con teofilina. La construcción twister_teo_3 mostró la alteración más profunda de la actividad de ribozima y, por tanto, la actividad de luciferasa más marcada, en ausencia del ligando del aptámero. La diferencia entre twister_teo_2 y twister_teo_3 es la longitud del tallo que conecta el aptámero y twister, lo cual condujo a una diferencia en la alteración de la actividad de ribozima. Al comparar la construcción twister_teo_1, 3 y 4, todas con la misma longitud de tallo (3 pb), la diferencia se encuentra en la composición del tallo. Estos resultados indican que la composición de la secuencia del tallo también afecta la actividad de la ribozima. Por ende, se puede lograr una ribozima con respuesta al ligando del aptámero optimizando la longitud y la composición de la secuencia de la región del tallo efector que conecta el aptámero y la ribozima twister.

Ejemplo 5

Las ribozimas de autocorte suprimen la expresión del gen objetivo al colocarse corriente abajo del codón de inicio de la traducción

Procedimientos experimentales

Construcciones de plásmido: Se usaron ADNcd sintético (IDT) y técnicas de clonación por restricción estándar para introducir las secuencias de prueba en el vector pHDM.2b-LacZ previamente creado (disposición: promotor de CMV - intrón - LacZ - poliA). Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Transfección: El día antes de la transfección, se colocaron células HEK293 (ATCC CRL-1573; cultivadas en DMEM, FBS al 10%, 37 °C, CO²al 10%) en placas de fondo plano de 96 pocillos (100 j L), de modo tal de lograr una confluencia de aproximadamente el 70% al momento de la transfección. Se añadió ADN plásmido (500 ng) a un tubo o una placa de fondo en U de 96 pocillos. Por separado, se añadió reactivo TransIT-293 (Mirus; 1.4 μl) a 50 μL de medio Optimem I (Life Technologies) y se dejó reposar 5 minutos a TA. Luego, se añadieron 50 μL de este reactivo de transfección diluido al ADN, se mezclaron e incubaron a TA durante 20 min. Por último, se añadieron 7 μL de esta disolución a un pocillo de células en una placa de 96 pocillos. Ensayo de beta-galactosidasa (LacZ): 24 horas después de la transfección, se retiraron las placas de la incubadora, se equilibraron hasta TA durante varios minutos en una mesa de laboratorio y luego se aspiraron. Se añadió amortiguador Glo-lisis (Promega, 100 j L, TA) y se permitió que las placas permanecieran a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos. Luego, se mezcló el contenido de los pocillos mediante 50 ^jL de trituración. Se tomó una muestra de 2 ^jL de cada pocillo y se diluyó en 200 ^jL de amortiguador de glo-lisis (dilución de 101 veces). Las diluciones se mezclaron mediante trituración y luego se mezclaron 20 μL de cada dilución con 20 μL de reactivo beta-glo (Promega) en una placa de 384 pocillos completamente blanca. Treinta minutos más tarde, se midió la luminiscencia para determinar las unidades de luz relativa (RLU, por su sigla en inglés). Como máximo, se usaron 96 de los 384 pocillos, en un patrón que permitiera que cada pocillo analizado estuviera rodeado por pocillos vacíos o por el borde de la placa, para reducir la interferencia. Todas las mediciones se encuentran dentro del intervalo lineal del ensayo (determinado mediante comparación de diversas muestras diluidas y sin diluir, no se ilustran los datos). Resultados: se realizaron construcciones en las que solamente el ATG en marco que se podía usar para el informante LacZ se encontraba corriente arriba de una ribozima de cabeza de martillo o de tipo horquilla (descrita en el documento U.S. 2015/0056174, véase, p. ej., la figura 1E), y para cada una se realizaron tres variantes poniendo la secuencia de ribozima en cada marco posible. En todas las construcciones, la ribozima estuvo seguida por enlazador-2A-péptido-LacZ. También se realizaron versiones con ribozimas mutantes (inactivas) como control. Se introdujeron mutaciones en cada ribozima para eliminar los posibles codones de detención. Las secuencias de proteína y nucleótidos se proporcionan en las figuras 7a y 7b. (La línea superior en cada caso es la ribozima original, sin traducción. Los puntos en la secuencia de nucleótidos se usan para indicar “igual a la línea superior”).

Estas construcciones y sus versiones con ribozima inactivada se transfectaron a células HEK293 y, tras 24 horas, se midió la expresión de LacZ, como se muestra en la figura 7c. Los resultados de las ribozimas de cabeza de martillo (HH, por su sigla en inglés) se muestran a la izquierda en la figura 7c. La colocación de la ribozima HH en la UTR 5' dio una reducción de 162 veces en la expresión, en comparación con la ribozima mutante inactiva. No obstante, la traducción (marco 2, flecha) dio una reducción mucho mejor de 513 veces en la expresión. El marco 1 no funciona, lo cual era previsible debido a los codones de detención dentro del marco en la secuencia de ribozima que no podían eliminarse. Las ribozimas de tipo horquilla (HP, por su sigla en inglés) se muestran a la derecha en la figura 7c. La colocación de la ribozima HP en la UTR 5' dio 133 veces, pero la traducción en el marco 1 produjo una reducción de 502 veces (flecha) en la expresión. Otros marcos también funcionaron. Se realizaron construcciones de ribozimas novedosas que mostraron una mayor capacidad de control génico en comparación con los trabajos publicados. Las construcciones de expresión génica se describen en la presente con la ribozima no ubicada en la UTR, sino tras el codón de inicio. El control de la expresión del gen objetivo puede potenciarse de manera considerable al colocar la ribozima 3' del inicio de la traducción, en comparación con la colocación de la ribozima en la UTR 5'. Cuando la ribozima se coloca corriente abajo del inicio de la traducción, el autocorte elimina el codón de inicio del resto del ARNm del gen objetivo, lo cual produce una menor expresión de referencia residual.

Ejemplo 6

El riborregulador twister con respuesta a guanina funciona corriente abajo del codón de inicio de la traducción Procedimientos experimentales

Se sintetizaron (IDT) oligos con un codón de inicio o una secuencia de codificación de los 10 primeros aminoácidos de GFP y Gua16avispa, seguido por una secuencia de enlazador 2A y se clonaron en el vector μLuc usando la estrategia de clonación Gibson y un equipo de clonación (NEB). La transfección y el ensayo de luciferasa de las células cultivadas se realizaron como se describió en el ejemplo 3.

Resultados

Para analizar la transferibilidad de la ribozima twister con respuesta al ligando del aptámero, se colocó la secuencia Gua16avispa corriente abajo de (i) el codón de inicio de la traducción del gen de luciferasa o (ii) la secuencia de codificación de los 10 primeros aa de GFP, según se ilustra en la figura 5a. La fusión de la secuencia de riborregulador twister con un gen objetivo corriente abajo crearía una etiqueta de extremo N al expresar el producto del gen objetivo, lo cual podría afectar la función proteica. Para eliminar esta etiqueta de extremo N, se insertó una secuencia de enlazador 2A entre el riborregulador twister y la secuencia del gen objetivo corriente abajo. Tal como se muestra en la figura 5b, la inserción del casete de polinucleótidos del riborregulador twister no alteró la expresión del gen de luciferasa en ausencia del ligando del aptámero, guanina, lo cual indica la alteración de la actividad de ribozima. No obstante, en presencia de guanina, la expresión del gen de luciferasa se redujo en un 68% en el control sin tratamiento tanto para la construcción ATG_Gua16avispa como para 10aa_Gua16avispa, mientras que las construcciones de control que contienen la secuencia twister mutante no mostraron reducción en la expresión de luciferasa en respuesta al tratamiento con guanina. Este resultado demuestra que la reducción en la expresión del gen objetivo con el casete de polinucleótidos que contiene los riborreguladores twister funcionales se debió al restablecimiento de la actividad de la ribozima twister debido a la unión de aptámero/ligando. Los resultados indican que el riborregulador twister funciona corriente abajo del codón de inicio en la secuencia de codificación, lo cual demuestra la transferibilidad del casete de polinucleótidos con el riborregulador twister sintético.

Ejemplo 7

Uso de un aptámero de guanina para generar un riborregulador twister DE ENCENDIDO con respuesta a guanina

Procedimientos experimentales

Construcciones de plásmido: Se sintetizaron (IDT) oligos con el enlazador de secuencia de aptámero al tallo P1 de la ribozima twister y se clonaron en el vector μLuc usando la estrategia de clonación Gibson y el equipo de clonación (NEB).

La transfección se realizó como se describió en el ejemplo 1 y se realizó un ensayo de luciferasa de luciérnaga como se describió en el ejemplo 3.

Resultados

Los riborreguladores twister descritos en los ejemplos 3 y 4 suprimen la expresión del gen objetivo en respuesta al tratamiento con ligando del aptámero y, por lo tanto, son riborreguladores twister DE APAGADO. En este caso, se empleó una estrategia diferente para enlazar la secuencia de aptámero a la ribozima twister y generar riborreguladores twister DE ENCENDIDO que indujeran la expresión del gen objetivo tras el tratamiento con ligando del aptámero. Tal como se muestra en la figura 6a, el extremo 3' del tallo P1 de twister (incluido el tallo con 3 pb adicionales) es adyacente a la secuencia del aptámero. En esta configuración, la secuencia de tallo es compartida entre el tallo P1 de twister y el tallo P1 del aptámero, de modo tal que la secuencia compartida pueda formar el tallo P1 de twister o el tallo P1 del aptámero. Ante la ausencia del ligando de aptámero (panel superior), la secuencia de aptámero adyacente al tallo P1 de twister no altera la estructura de twister y su actividad de corte de ribozima permanece intacta, lo cual conduce a corte del ARNm e inhibición de la expresión del gen objetivo. En presencia del ligando del aptámero (panel inferior), el aptámero enlazado al ligando forma el tallo P1 del aptámero con la secuencia compartida del tallo P1 de twister, lo cual altera la formación del tallo P1 de twister, altera su actividad de ribozima y aumenta la expresión del gen objetivo. Tal como se describió en los ejemplos 3 y 4, la longitud del tallo P1 del aptámero es importante en su función de regulación en el contexto de un riborregulador. Si el tallo tiene una longitud demasiado larga, la formación del P1 del aptámero se vuelve independiente del ligando del aptámero, lo cual conduce a una expresión desregulada del gen objetivo. Asimismo, se especuló que la longitud de la secuencia compartida también sería importante. Si la longitud de la secuencia de tallo compartida es demasiado corta, la ribozima twister puede no verse afectada por la formación del tallo P1 del aptámero. Se crearon riborreguladores twister DE ENCENDIDO con 6 o 7 nt de la secuencia de tallo P1 twister compartidos con el tallo P1 del aptámero. Con las secuencias de tallo de 6 o 7 nt compartidos, el aptámero forma un tallo P1 de 8 o 9 pb. Se enlazó un aptámero de xpt-guanina al brazo 5' o 3' de la secuencia de tallo P1 twister, lo cual generó construcciones GT8 o TG8 y t G9. El enlace del aptámero de guanina al brazo 5' del tallo P1 de twister (construcción GT8) proporcionó una inducción de 1.4 veces de la actividad de luciferasa tras el tratamiento con guanosina, como se muestra en el panel izquierdo de la figura 6b. No obstante, cuando el aptámero se enlazó al extremo 3' del tallo P1 de twister, como se ilustra en la figura 6a, el nivel inicial de actividad de luciferasa se redujo al 0.7% del vector de control sin las secuencias de twister/aptámero en la UTR 3'. Tras el tratamiento con guanosina, se indujo actividad de luciferasa que generó 8.6 veces y 9.2 veces de inducción de la construcción TG8 y TG9, respectivamente, como se muestra en la figura 6b (paneles medio y derecho). El nivel bajo de expresión inicial de luciferasa de las construcciones TG8 y TG9 indica que el enlace del aptámero con el extremo 3' del tallo P1 no alteró la actividad de ribozima y que dicha actividad de ribozima twister se vio alterada tras la unión de aptámero/ligando, lo cual condujo a una mayor expresión del gen objetivo. Estos resultados demuestran la generación de riborreguladores twister DE ENCENDIDO que inducen la expresión del gen objetivo en respuesta al tratamiento con ligando del aptámero.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un casete de polinucleótidos para regular la expresión de un gen objetivo que comprende un riborregulador que comprende una ribozima twister enlazada mediante un tallo a un aptámero, en donde el tallo que enlaza la ribozima twister al aptámero se conecta a la ribozima en la ubicación del tallo P3 de la ribozima twister y en donde el gen objetivo se encuentra enlazado al tallo P1 de la ribozima twister, en donde el casete de polinucleótidos, cuando se incorpora a un gen objetivo, inhibe la expresión del gen objetivo en presencia de un ligando de aptámero.

2. El casete de polinucleótidos de la reivindicación 1, en donde el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

3. El casete de polinucleótidos de la reivindicación 1, en donde la ribozima twister

a) proviene de Nasonia vitripennis;

b) comprende la SEQ ID NO.: 38 o

c) comprende la SEQ ID NO.: 39.

4. El casete de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la secuencia que alarga el tallo P1 de la ribozima twister mediante 1 a 3 pares de bases.

5. El casete de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde:

a) el tallo P1 de las ribozima twister es de 4 a 7 pares de bases;

b) el tallo que enlaza la ribozima al aptámero comprende la secuencia del tallo P3 de la ribozima y/o la secuencia del tallo P1 del aptámero; y/o

c) el tallo que enlaza la ribozima al aptámero tiene una longitud de 3 a 7 pares de bases.

6. Un casete de polinucleótidos para la regulación de la expresión de un gen objetivo que comprende un riborregulador que comprende una ribozima twister enlazada a un aptámero, en donde el tallo P1 de la ribozima twister y el tallo P1 del aptámero comprenden un brazo de tallo compartido de forma alternativa, en donde el aptámero está enlazado al extremo 3' o 5' del tallo P1 de la ribozima twister, en donde cuando el aptámero se enlaza al extremo 3' del tallo P1 de la ribozima twister, una parte del brazo 3' del tallo P1 de la ribozima twister es una porción alternativamente del brazo 5' del tallo P1 del aptámero y en donde cuando el aptámero se enlaza al extremo 5' del tallo P1 de la ribozima twister, una parte del brazo 5' del tallo P1 de la ribozima twister es una porción alternativamente del brazo 3' del tallo P1 del aptámero, en donde el casete de polinucleótidos, cuando se incorpora a un gen objetivo, aumenta la expresión del gen objetivo en presencia de un ligando de aptámero.

7. El casete de polinucleótidos de la reivindicación 6, en donde el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

8. El casete de polinucleótidos de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde la ribozima twister a) proviene de Nasonia vitripennis;

b) comprende la SEQ ID NO.: 38 o

c) comprende la SEQ ID NO.: 39.

9. El casete de polinucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la parte del brazo del tallo P1 de la ribozima twister que es alternativamente un brazo del tallo P1 del aptámero es de 5 a 8 nucleótidos.

10. El casete de polinucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde

a) el tallo P1 de la ribozima twister es de 4 a 9 pares de bases; o

b) el tallo P1 del aptámero es de 5 a 8 pares de bases.

11. Un método de modulación de la expresión dio un gen objetivo que comprende:

a) insertar el casete de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el gen objetivo; b) introducir el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos en una célula; y

c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de manera específica al aptámero en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen objetivo; o

a') insertar el casete de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en un gen objetivo; b') introducir el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos en una célula; y

c') exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de manera específica al aptámero en una cantidad eficaz para aumentar la expresión del gen objetivo;

en donde dicho método no es un método para el tratamiento del cuerpo de un ser humano o de un animal mediante terapia.

12. Un polinucleótido para uso en un método de terapia mediante la modulación de la expresión de un gen objetivo que comprende:

a) insertar el casete de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un gen objetivo; b) introducir el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos en una célula; y

c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de manera específica al aptámero en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen objetivo;

c') exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une de manera específica al aptámero en una cantidad eficaz para aumentar la expresión del gen objetivo.

13. El método de la reivindicación 11 o el casete de polinucleótidos para uso de la reivindicación 12, en donde el casete de polinucleótidos:

a) se inserta en la región 5' sin traducción del gen objetivo;

b) se inserta en la región 3' sin traducción del gen objetivo; o

c) se inserta corriente abajo del codón de inicio de traducción, en donde opcionalmente el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de péptidos 2A entre el extremo 3' del riborregulador y la secuencia de codificación del gen objetivo.

14. El método de la reivindicación 11 o 13 o el casete de polinucleótidos para uso de la reivindicación 12 o 13, en donde dos o más de los cassettes de polinucleótidos se insertan en el gen objetivo, en donde opcionalmente los dos o más casetes de polinucleótidos comprenden a) diferentes aptámeros que se unen de manera específica a diferentes ligandos de molécula pequeña; o b) el mismo aptámero.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 o 14 o el casete de polinucleótidos para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el gen objetivo que comprende el casete de polinucleótidos se incorpora en un vector para la expresión del gen objetivo.

16. Un vector que comprende un gen objetivo que contiene un casete de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. El método o el casete de polinucleótidos para el uso de la reivindicación 15, o el vector de la reivindicación 16, en donde el vector es un vector viral, en donde opcionalmente el vector viral se selecciona del grupo que consiste en vector adenoviral, vector de virus asociado con adeno y vector lentiviral.