ES2953232T3

ES2953232T3 - Partículas similares a norovirus con estabilidad mejorada

Info

Publication number: ES2953232T3
Application number: ES20708137T
Authority: ES
Inventors: Franziska Jarczowski; André Diessner; Frank Thieme
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2023-11-08
Anticipated expiration: 2040-03-11
Also published as: EP3938378C0; EP3938378A1; EP3938378B1; MX2021011059A; AU2020235344B2; JP2024009801A; JP2022522891A; CN113557240A; JP7672460B2; CA3133030A1; CN113557240B; IL285914B2; KR20220021451A; IL285914A; AU2020235344A1; IL285914B1; WO2020182860A1; JP7536031B2; US20220152186A1

Abstract

La invención proporciona una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de norovirus que tiene una secuencia de aminoácidos en la que la secuencia de aminoácidos que se extiende en el dominio P Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr está modificada a Ala-Ala-Leu-LeuNal-Arg. /Lys-Tyr. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Partículas similares a norovirus con estabilidad mejorada

Campo de la invención

La presente invención proporciona una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de norovirus (NoV), que es capaz de formar una VLP (partícula similar a un virus). La invención proporciona además una VLP que contiene dicha proteína de la cápside y una composición inmunogénica y una vacuna que contiene dicha proteína de la cápside o dicha VLP. La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside. La invención proporciona además una composición inmunogénica y una vacuna que contiene dicha proteína de la cápside o dicha VLP y una proteína de la cápside del genogrupo II o del genogrupo IV o VLP. La invención proporciona además la proteína de la cápside, la VLP o la vacuna, para su uso en la prevención o el tratamiento de la infección por norovirus en un sujeto, preferentemente un ser humano. También se proporciona un método para aumentar la estabilidad de las VLP del genogrupo I de norovirus.

Antecedentes de la invención

Los norovirus son la causa principal de los brotes de gastroenteritis en todo el mundo. Son responsables de 685 millones de casos al año, incluidos 200 millones de casos entre niños de 5 años o menos (www.cdc.gov/norovirus/worldwide.html). Hasta la fecha no hay vacuna contra el norovirus en el mercado. Además, no existen protocolos establecidos para el cultivo de norovirus, lo que ralentiza significativamente el progreso en el desarrollo de vacunas contra el norovirus. Además, la rápida tasa de cambios genéticos de los norovirus circulantes hace que surjan nuevas cepas de norovirus cada 2 a 4 años, causando brotes epidémicos y complicando el desarrollo de vacunas y de terapias que se requieren para contrarrestar estos desafíos (de Graaf, M, van Beek, J, & Koopmans, PG, 2016, Nature Rev Microbiol, 14: 421-433). Es evidente que las principales causas de la mayoría de los brotes en las últimas dos décadas han sido representantes de los genogrupos GI y GII (Matthews et al., 2012, Epidemiol. Infect, 140: 1161-1172) con predominio del genotipo 4 del genogrupo GII (GII.4). Por ejemplo, desde 2014, se ha descrito la aparición de nuevas cepas de GII.17 en el este asiático, así como el resurgimiento de antiguas cepas de GII.4 (Chan et al, 2015, Nat Commun, doi: 10.1038/ncomms10061; Choi et al, 2017, Food Environ Virol, doi: 10.1007/s12560-017-9278-4). Este panorama en constante cambio agrega complejidad a la definición de una composición de vacuna eficaz, ya que un enfoque generalmente preferido es el uso de una vacuna multivalente. El desarrollo actual de la vacuna contra el norovirus se basa principalmente en el uso de vacunas con partículas similares a virus (VLP) (para revisiones recientes, consulte: Tan, M. & Jiang, X., 2014, Hum. Vaccin Immunother, 10:1449-1456; Debbink, K., Lindesmith, L. & Baric, R.S., 2014, Clin Infect Dis, 58:1746-1752; Ramani, S., Estes, M.K. & Atmar, R.L., 2016, PLoS Pathog, 12:e1005334) predominantemente producidas en cultivo de células animales, específicamente en células de insecto, utilizando el sistema de expresión de baculovirus (Huhti, L., et al., 2013, Arch. Virol., 158: 933-942; Koho, T., et al., 2012, J. Virol. Methods, 181: 6-11).

Un problema importante para el desarrollo de vacunas polivalentes es que incluso los aislados de norovirus relativamente relacionados estrechamente desde el punto de vista genético presentan distintos perfiles de estabilidad de VLP (Pogan, R, et al., 2018, Curr Opin Virol, en prensa; Pogan, R, et al., 2018 J. Phys.: Condens. Matter, 30:064006). Por lo tanto, la preparación de vacunas multivalentes que consisten en una mezcla de diferentes VLP que requieren diferentes condiciones de tampón debido a sus diferentes perfiles de estabilidad es un serio desafío para la formulación. En algunos casos, este problema se resuelve añadiendo alumbre como estabilizador y adyuvante a la mezcla de VLP (Leroux-Roels, G., et al., 2018, The J. Infect. Diseases, 217:597-607). Sin embargo, a pesar de que las vacunas que contienen alumbre generalmente se toleran bien, el alumbre tiene una biopersistencia duradera en el cuerpo, la capacidad de migrar en los órganos linfoides y de acumularse en el cerebro, lo que plantea preocupaciones especialmente para las aplicaciones pediátricas (Petrovsky, N. & Aguilar, JC., 2004, Immunol. &Cell Biol., 82:488-496; Gherardi R.K., et al., 2014, Front. Neurol, 6:4; Gherardi R.K., et al., 2016, Morphologie, 100:85-94). Un enfoque alternativo es la sustitución de aminoácidos de restos críticos que conducen a VLP más homogéneas (Someya, Y., et al., 2011, Journal of General Virology, 92:2320-2323) y también podría mejorar la estabilidad de las VLP (Pogan, R., et al., 2018, J. Phys.: Condens. Matter, 30:064006) incluso en una formulación más compleja de una mezcla de VLP.

Partiendo del estado de la técnica, es un objeto de la presente invención proporcionar VLP de norovirus, en particular VLP del genogrupo I, de estabilidad mejorada y proteínas de la cápside para dichas VLP. Otro objeto es proporcionar vacunas y composiciones inmunogénicas bivalentes o multivalentes que aborden la cuestión de la compatibilidad y la estabilidad de las VLP de norovirus para permitir la formulación de composiciones de vacunas sin necesidad de estabilizadores como el alumbre. Por lo tanto, también es un objeto proporcionar composiciones que comprendan VLP de NoV de diferentes genogrupos que tengan una estabilidad comparable o similar. Otro objeto es proporcionar protocolos para la purificación, preparación y formulación de VLP, en particular de VLP de diferentes genogrupos tales como los genogrupos I y II.

Sumario de la invención

Estos objetos se resuelven mediante:

1. Una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de norovirus, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 un resto de Arg o Lys.

2. Una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de norovirus que tiene una secuencia de aminoácidos en donde el tramo de secuencia de aminoácidos Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr (SEQ ID NO: 57) está modificado a Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr (SEQ ID NO: 58), en donde Leu/Val significa Leu o Val, y Arg/lys significa Arg o Lys.

3. La proteína de la cápside de acuerdo con el punto 2, en donde el tramo de secuencia de aminoácidos Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr-Val/Leu/lle-Asp (SEQ ID NO: 59) se modifica a Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr-Val/Leu/lle-Asp (SEQ ID NO: 60), en donde Val/Leu/lle significa Val o Leu o Ile.

4. La proteína de la cápside de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde dicha proteína de la cápside pertenece a cualquiera de los siguientes genotipos del genogrupo I: GI.1, GI.2, GI.3, GI.4, GI.5, GI.6, GI.7, GI.8 o GI.9.

5. La proteína de la cápside de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en donde dicha proteína de la cápside tiene una secuencia de aminoácidos como se define en una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21, excepto porque el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 es Arg o Lys; o dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 5.

6. La proteína de la cápside de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde

(i) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 480, preferentemente al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21, excepto porque el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 es Arg o Lys; o

(ii) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 480, preferentemente al menos 500 restos de aminoácidos y tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia sobre esta longitud con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21; o

(iii) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con un segmento de secuencia de al menos 480, preferentemente al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21;

de modo que en los puntos (ii) o (iii), el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 es Arg o Lys.

7. La proteína de la cápside de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde

(i') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5; o

(ii') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5; o

(iii') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5;

de modo que en los apartados (ii') o (iii') el aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3, o en la posición correspondiente a His472 en la SEQ ID NO: 2, es Arg o Lys.

8. Molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 7.

9. Partícula similar a virus (VLP) que consiste en o comprende la proteína de la cápside de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 7.

10. Una composición inmunogénica que comprende la proteína de la cápside como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 7 o la VLP del punto 9 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición inmunogénica de acuerdo con el punto 10, que comprende además una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II de norovirus, o una VLP que consiste en o comprende una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II.

12. Una vacuna contra la infección por norovirus, que comprende la composición inmunogénica del punto 10 u 11.

13. Una vacuna contra la infección por norovirus, que comprende la proteína de la cápside tal como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 7 o la VLP del punto 9.

14. La vacuna de acuerdo con el punto 12 o 13, que comprende una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II de norovirus o una VLP que consiste en o comprende una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II.

15. La proteína de la cápside como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 7, o la VLP del punto 9, o la vacuna de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12 a 14 para su uso en la prevención o tratamiento de la infección por norovirus en un sujeto.

16. Un método para aumentar la estabilidad de las VLP del genogrupo I de norovirus, que comprende reemplazar el resto de His en el tramo de secuencia Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr (SEQ ID NO: 57) en el dominio P de una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I por Arg o Lys.

Los inventores han descubierto que las VLP de genogrupo I de norovirus (NoV) generalmente tienen una estabilidad más baja que las VLP de genogrupo II de NoV, lo cual es problemático para proporcionar composiciones de VLP estables y vacunas que contienen VLP del genogrupo I. Los inventores han descubierto además una forma de aumentar la estabilidad de las VLP del genogrupo I de NoV modificando la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside VP1 del genogrupo I. La proteína de la cápside VP1 modificada es la proteína de la cápside o el antígeno de la invención. Por tanto, las VLP formadas a partir de la proteína VP1 de la invención tienen una estabilidad mejorada. La estabilidad mejorada se demuestra en el Ejemplo 3 y por los resultados presentados en las Figs. 9 y 10. La Fig. 9 muestra la homogeneidad y la pureza mejoradas de las VLP de la invención mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La Fig. 10 muestra una tendencia de estabilidad mejorada y pureza de la proteína de la cápside de la invención (B) en comparación con la proteína de la cápside original (A).

Asimismo, si se preparan vacunas o composiciones inmunogénicas que contienen VLP tanto del genogrupo I como del genogrupo II o IV, la estabilidad de las VLP del genogrupo I y las VLP del genogrupo II o IV puede hacerse más similar, de modo que las composiciones que contienen ambos tipos de VLP también son más estables, lo que aumenta el tiempo de almacenamiento y permite el uso de condiciones de almacenamiento menos estrictas (por ejemplo, temperatura de refrigeración en lugar de temperatura de congelación) durante el almacenamiento y el suministro de la vacuna de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Alineamiento de la proteína VP1 de la cápside de norovirus de diferentes cepas de norovirus del genogrupo I. El motivo (S/A/T/V)TA(V/A/T/L)ATA y el resto de histidina conservado de las secuencias del genogrupo I se indican mediante un recuadro. La Fig. 1A muestra un alineamiento de norovirus GI de la parte N-terminal de proteínas VP1. La Fig. 1B muestra un alineamiento de norovirus GI de la parte C-terminal de proteínas VP1. Las secuencias que se muestran son secuencias parciales de secuencias completas de aminoácidos de VP1 proporcionadas más adelante en la sección "Secuencias de aminoácidos" y en la lista de secuencias electrónica.

Figura 2: Alineamiento de la parte N-terminal de la proteína VP1 de la cápside de norovirus de diferentes cepas del genogrupo I, II y IV. Las secuencias de los diferentes genogrupos están separadas por una línea horizontal. El motivo (S/A/T/V)TA(V/A/T/L)ATA del genogrupo I y la región correspondiente en las secuencias del genogrupo II y IV se indica mediante un recuadro. Las secuencias que se muestran son secuencias parciales de secuencias completas de aminoácidos de VP1 proporcionadas más adelante en la sección "Secuencias de aminoácidos" y en la lista de secuencias electrónica.

Figura 3: El panel A muestra un corte de la estructura de una partícula similar a norovirus GI (PDB: 1IHM; blanco: dominio que sobresale; gris: dominio de cubierta; negro: superficie interna). El panel B muestra solo la superficie interna de la VLP (PDB: 1IHM, restos de aminoácidos 29-45). El Panel C representa una sección del Panel B que ilustra la configuración de los dos restos de treonina conservados del motivo (S/A/T/V)TA(V/A/T/L)ATA del genogrupo I en la superficie interna de la VLP. La sustitución de los dos restos de treonina con restos de lisina y ácido aspártico en la superficie interna de la VLP puede conducir a la formación de interacciones iónicas estabilizadoras o puentes salinos.

Figura 4: Alineamiento de la parte C-terminal de la proteína VP1 de la cápside de norovirus de diferentes cepas del genogrupo I, II y IV. Las secuencias de los diferentes genogrupos están separadas por una línea horizontal. El resto de histidina conservado del genogrupo I y el resto de arginina conservado en las secuencias de los genogrupos II y IV se indican mediante un recuadro. Las secuencias que se muestran son secuencias parciales de secuencias completas de aminoácidos de VP1 proporcionadas más adelante en la sección "Secuencias de aminoácidos" y en la lista de secuencias electrónica.

Figura 5: Estructura de una sección del dominio que sobresale (parte superior) y de cubierta (parte inferior) de una VP1 de genogrupo I (PDB: 1IHM) y estructura teórica de la misma región de una VP1 de genogrupo II. El resto de histidina conservado en el genogrupo I y el resto de arginina conservado en el genogrupo II se indican mediante una flecha. El resto de arginina en la VP1 del genogrupo II puede participar en la interacción iónica o en la formación de puentes salinos entre el dominio que sobresale y el de la cubierta y, de este modo, puede ser responsable del mejor ensamblaje y estabilidad de las partículas similares a virus basadas en VP1 del genogrupo II.

Figura 6: Esquemas de clonación para VP1 de norovirus GI.4 Chiba de tipo silvestre, NC y NCHR (Fig. 6A) y NCHRKD y NCHRDK (Fig. 6B). Se clonan módulos de secuencia para VP1 de norovirus GI.4 Chiba en un vector de expresión binario viral basado en TMV utilizando la enzima Bsal de tipo IIS. Se indican los intervalos de secuencias de aminoácidos codificados por los módulos. Se muestran los salientes que flanquean los módulos después de la digestión de restricción con Bsal.

Figura 7: Expresión de versiones de tipo silvestre y mutantes de VP1 de GI.4 Chiba 407 en Nicotiana benthamiana utilizando magnICON®. Los extractos de proteínas totales de Laemmli se separaron en un gel de poliacrilamida al 12 % y después se tiñeron con Coomassie (M: marcador de tamaño; 0: tejido vegetal no infiltrado; 1: VP1 de GI.4 Chiba 407 de tipo silvestre; 2: VP1 de GI.4 Chiba 407 con un solo resto de metionina iniciador y eliminación de los dos restos de arginina C-terminales; 3: VP1 de GI.4 Chiba 407 con un solo resto de metionina iniciador, H472R y eliminación de los dos restos de arginina C-terminales; 4: VP1 de GI.4 Chiba 407 con un solo resto de metionina iniciador, T39K, T43D, H472R y eliminación de los dos restos de arginina C-terminales; 5: VP1 de GI.4 Chiba 407 con un solo resto de metionina iniciador, T39D, T43K, H472R y eliminación de los dos restos de arginina C-terminales). El asterisco indica la señal correspondiente a VP1 de GI.4 Chiba 407.

Figura 8: Micrografía electrónica de transmisión de dos lotes independientes de VLP, cada uno preparado con VP1 de GI.4 Chiba 407 de tipo silvestre, versión NC o versión NCHR. Microscopía electrónica de transmisión de muestras de VLP teñidas con UranyLess preparadas a partir de VP1 de GI.4 Chiba 407 A) de tipo silvestre, B) NC y C) versión NCHR. La barra en la parte inferior derecha de las imágenes representa 500 nm.

Figura 9: SE-HPLC de VLP derivada de VP1 de GI.4 Chiba 407 versión NC y versión NCHR. Cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alta resolución para analizar la formación de v Lp en muestras preparadas a partir de VP1 de GI.4 Chiba 407 A) NC y B) versión NCHR. La flecha negra indica la segunda especies de VLP más pequeña en la muestra de VP1 de GI.4 Chiba 407 NC.

Figura 10: Estabilidad de la versión NC y NCHR de GI.4 Chiba 407. Tendencia de estabilidad de GI.4 Chiba 407 A) versión NC y B) versión NCHR según lo indicado por el contenido de VLP en % (medido mediante SE-HPLC) y la pureza de VP1 en % (medida mediante electroforesis capilar en gel).

Figura 11: Comparación de inmunogenicidad de GI.4 Chiba 407 NC y versión NCHR. A) Titulación de IgG sérica específica de antígeno VP1 de norovirus homólogo. Se analizaron mediante un ELISA los niveles de anticuerpos en muestras de suero diluidas en serie, individuales, de ratones inmunizados, en la semana 5. Se muestran las curvas de titulación de punto final medio de anticuerpos inducidos contra GI.4 Chiba después de una dosis de VLP de 10 |jg de GI.4 Chiba NC o GI.4 Chiba NCHR. B) Se ensayó la actividad de bloqueo (neutralización) específico de genotipo frente a las VLP de variantes homólogos de GI.4 Chiba de muestras de suero agrupadas y tituladas dos veces utilizando un ensayo de bloqueo basado en mucina gástrica de cerdo. El índice de bloqueo (%) se calculó como 100 % -[(DO pocillos con VLP y suero / DO pocillos sin suero, "unión máxima") x 100 %].

Descripción detallada de la invención

Los norovirus son virus de ARN de sentido positivo monocatenario sin envoltura. Pertenecen a la familia Calciviridae. El genoma del norovirus consiste en tres marcos de lectura abiertos (ORF). ORF1 codifica las proteínas no estructurales que son esenciales para la replicación del virus, mientras que ORF2 y ORF3 codifican una proteína principal de la cápside VP1 y una proteína estructural menor VP2, respectivamente. VP1 se autoensambla en partículas similares a virus (VLP) que son morfológica y antigénicamente similares a los viriones nativos. Debido a que los NoV no se pueden cultivar en cultivo celular, gran parte de la comprensión de la biología de los NoV humanos procede de estudios que utilizan VLP.

Hay cinco genogrupos diferentes de norovirus (GI, GII, GIll, GIV y GV) que se pueden dividir en genotipos. Los genotipos se clasifican y denominan mediante números arábigos, a menudo después de la indicación del genogrupo en números romanos. Son ejemplos de norovirus el virus de Norwalk (GenBank: AF093797.1), GI.1 cepa Aichi/124-89/JP (GenBank: BAA834130), GI.2 cepa Funabashi258/96/JP (GenBank: BAC05516), virus de Maryland (MV, AY032605), GI.3 cepa Shimizu/KK₂866/JP (GenBank: AII73765), GI.4 cepa Chiba407/87/JP (GenBank: BAA82106), GI.7 cepa TCH-060/USA/2003 (GenBank: AEQ77282), GII.3 cepa Kashiwa336/00/JP (GenBank: AAZ66774), GII.4 cepa NL/2014/GII.4/Groningen01 (GeneBank: CRL46961), GII.4 cepa Sydney/NSW0514/2012 /All (GenBank: AFV08795), GII.4 cepa Aomori2/2006/JP (GenBank: BAG70446), GII.17 cepa JP/2002/Saitama/T87 (GenBank: AII73747), Virus Jena (JV, AJ01099), GII.17 cepa JP/2013//Saitama5203 (GenBank: BAR63715), Virus Seto (GenBank: AB031013), GII.17 cepa C142/1978/GUF (GenBank: AGI17592), GIV.1 cepa Ahrenshoop246/DEU/2012 (GenBank: AFN61315). Hay muchas otras cepas de norovirus cuyos genomas completos están anotados en bases de datos disponibles públicamente (www.viprbrc.org).

Un componente estructural clave de las partículas de norovirus es la proteína de la cápside VP1. Otra proteína de la cápside es VP2 que, sin embargo, no es necesaria para el ensamblaje de las partículas virales o VLP. El tamaño de la partícula de NoV varía entre 23 y 40 nm de diámetro. Dependiendo del tamaño, el número de moléculas de VP1 por partícula viral es generalmente de 60 o 180 moléculas (http://viralzone.expasy.org/194).

La proteína de la cápside VP1 puede ensamblarse, en ausencia del material genético del virus, en partículas similares a virus (VLP) que se asemejan a las partículas virales en tamaño y forma, pero no contienen el genoma de NoV. La VP1 sola (en ausencia de VP2) es suficiente para formar VLP. Por tanto, en el presente documento, las VLP comprenden moléculas de proteína VP1 y pueden comprender además moléculas de proteína VP2. En una realización preferida, las VLP de la invención comprenden moléculas de proteína de la cápside v P1 pero no moléculas de proteína VP2.

La proteína VP1 de la cápside de NoV tiene dos dominios, el dominio de cubierta (S) formado por, en el caso de la proteína de la cápside del virus Norwalk (SEQ ID NO: 10), los restos de aminoácidos 1-225, y el dominio que sobresale (P) formado por los restos 225-530 (Choi et al., PNAS 105 (2008) 9175-9180), véase también la Fig. 3. El dominio S está implicado en la formación de la cubierta icosaédrica de la cápside de NoV, mientras que el dominio P está implicado en los contactos diméricos de la proteína VP1. Los dímeros del dominio P se proyectan desde la capa icosaédrica. El dominio P se subdivide en los subdominios P1 y P2. Los restos de aminoácidos 225-278 y 406-519 de la proteína de la cápside VP1 del virus de Norwalk forman el subdominio P1, y los restos 279-405 forman el subdominio P2 distal (Choi et al., ibíd.). En el caso de la proteína de Chiba de SEQ ID NO: 3, los restos 1-224 constituyen el dominio S, los restos 224-540 constituyen el dominio P, los restos 224-277 y 414-531 constituyen el dominio P1 y los restos 278-413 constituyen el dominio P2. Los dominios S, P, P1 y P2 de otras proteínas VP1 del genogrupo I tales como las de SEQ ID NO: 6 a 21 pueden determinarse por alineamiento de secuencias para encontrar los segmentos de secuencia primaria correspondientes que forman los dominios mencionados.

Proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de norovirus de la invención

Los inventores han encontrado variantes de proteínas VP1 del genogrupo I de NoV que pueden ensamblarse formando VLP de estabilidad mejorada. Por tanto, la invención proporciona proteínas VP1 del genogrupo I de NoV. Estas proteínas VP1 pueden ensamblarse a, o ensamblarse en, VLP más estables. En una realización, la proteína VP1 del genogrupo I de la invención tiene un resto de Arg o Lys, preferentemente un resto de Arg, en la posición de un resto de histidina que está altamente conservado entre las proteínas VP1 del genogrupo I. Esta posición es la posición 474 en la SEQ ID NO: 1 o la posición 472 en la SEQ ID NO: 2 o 3. La posición correspondiente puede identificarse en otras proteínas VP1 del genogrupo I mediante el alineamiento de una secuencia de aminoácidos de al menos 500 aminoácidos con la SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, la invención proporciona una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de NoV, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene en la posición correspondiente a His472 de la SEQ ID NO: 2, o en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3, 4 o 5, un resto de Arg o Lys, preferentemente un resto de Arg. En el presente documento, la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 es la secuencia de referencia preferida para identificar la posición en la secuencia de VP1 en la que la proteína de la cápside de la invención tiene un resto de Arg o Lys.

El aminoácido His correspondiente a la posición 474 en la SEQ ID NO: 1 o a la posición 472 en la SEQ ID NO: 2, en las proteínas VP1 del genogrupo I de NoV, forma parte del tramo de secuencia Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-(SEQ ID NO: 61), preferentemente Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr (SEQ ID NO: 57). Este tramo de secuencia está presente en el dominio P de la proteína VP1, preferentemente el subdominio P1 de la proteína VP1. Por tanto, la proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de NoV de la invención puede definirse como se indica a continuación. Tiene una secuencia de aminoácidos en donde el tramo de la secuencia de aminoácidos en el dominio P, preferentemente el dominio P1, Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr (SEQ ID NO: 57) se modifica a Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr (SEQ ID NO: 58), en donde Leu/Val significa Leu o Val, y Arg-/Lys significa Arg o Lys. Preferentemente, el tramo de la secuencia de aminoácidos en el dominio P de Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr-Val/Leu/lle-Asp (SEQ ID NO: 59) se modifica a Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr-Val/Leu/lle-Asp (SEQ ID NO: 60), en donde Val/Leu/Ile significa Val o Leu o Ile. La secuencia de aminoácidos de dicha proteína comprende preferentemente al menos 510, preferentemente al menos 520, más preferentemente al menos 530 restos de aminoácidos.

La proteína de la cápside VP1 de la invención es una proteína del genogrupo I de NoV. La clasificación de los norovirus se basa en la proteína VP1 (Hansman et al., Journal of General Virology (2006), 87, 909-919). Por tanto, se puede utilizar la clasificación establecida de NoV para determinar si una proteína de la cápside VP1 de NoV dada es una proteína de la cápside del genogrupo I.

Las realizaciones de la proteína de la cápside VP1 de la invención son las siguientes:

(i) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21, excepto porque el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 es Arg o Lys; o

(ii) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 500 restos de aminoácidos y tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % e incluso más preferentemente al menos un 95 % de identidad de secuencia sobre esta longitud con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21; o

(iii) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, aún más preferentemente de 1 a 30 e incluso más preferentemente de 1 a 20 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21;

de modo que en los puntos (ii) o (iii), el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 (o el resto 469 de la SEQ ID NO: 6) es Arg o Lys, preferentemente Arg. En estas realizaciones, el número mínimo de restos de aminoácidos contiguos es preferentemente 510, más preferentemente 520, incluso más preferentemente 530 y aún más preferentemente 540 restos de aminoácidos.

Otras realizaciones de la proteína de la cápside VP1 de la invención son las siguientes:

(ii') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y, aún más preferentemente, al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5; o

(iii') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, aún más preferentemente de 1 a 30 e incluso más preferentemente de 1 a 20 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5;

de modo que en los puntos (ii') o (iii'), el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3, 4 o 5, respectivamente, es Arg o Lys, preferentemente Arg.

Son realizaciones más preferidas de la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside VP1, las siguientes:

(i'') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5;

(ii'') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y, aún más preferentemente, al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5;

(iii'') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, aún más preferentemente de 1 a 30 e incluso más preferentemente de 1 a 20 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5;

de modo que en los puntos (ii'') o (iii''), el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3, 4 o 5, respectivamente, es Arg o Lys, preferentemente Arg.

En otras realizaciones, la proteína de la cápside se define por

(i''') que comprende una molécula polipeptídica de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5; o

(ii''') que comprende una molécula polipeptídica de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y, aún más preferentemente, al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5; o

(iii''') que comprende una molécula polipeptídica de una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, aún más preferentemente de 1 a 30 e incluso más preferentemente de 1 a 20 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos desde el resto 43 hasta el resto 540 de la SEQ ID NO: 3, 4 o 5;

de modo que en los puntos (ii''') o (iii'''), el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3, 4 o 5, respectivamente, es Arg o Lys, preferentemente Arg.

Una proteína VP1 del genogrupo I de acuerdo con la invención, tal como las definidas anteriormente, puede ser de uno o más de los siguientes genotipos: I.1, I.2, I.3, I.4, I.5, I.6, I.7, I.8 o I.9. Se prefieren los genotipos I.1 y I.4.

Las SEQ ID NO: 1 a 21 también se denominan en el presente documento "secuencias de referencia". Un "segmento" o "porción" de una secuencia de aminoácidos es una secuencia parcial (o fragmento) de restos de aminoácidos contiguos de cualquier número dado de restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos a la que hace referencia. La longitud de una secuencia de aminoácidos se mide por el número de restos de aminoácidos en los que consiste, incluidos los restos terminales. Las identidades de las secuencias de aminoácidos pueden determinarse mediante programas de alineamiento y búsqueda de secuencias de proteínas a los que se puede acceder libremente desde Internet, por ejemplo PROTEIN BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) y ExPASy (http://web.expasy.org/sim/). Se puede encontrar una lista completa de herramientas de alineamiento de secuencias en http://molbiol-tools.ca/Alignments.htm.

La proteína VP1 de NoV de la invención puede ser una proteína VP1 de cualquier genotipo I del genogrupo I de NoV, un fragmento de tal proteína, un derivado de la proteína o del fragmento, o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína o derivado de VP1 del genogrupo I de NoV, como se ha definido anteriormente.

La proteína VP1 puede tener eliminaciones de aminoácidos, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con las secuencias de referencia indicadas anteriormente. Entre estas, se prefieren las eliminaciones, sustituciones y adiciones. Los números de dichas alteraciones indicados anteriormente se refieren a la suma de todas las supresiones, sustituciones, adiciones e inserciones. El término "inserción" se refiere a las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de referencia, es decir, excluyendo las adiciones en el extremo C o el extremo N. El término "adiciones" significa adiciones en el extremo C y/o en el extremo N de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de referencia. Una deleción puede ser una deleción de un resto de aminoácido terminal o interno de una secuencia de referencia.

La proteína VP1 de la invención puede tener la longitud de las proteínas VP1 del genogrupo I natural o puede ser un fragmento de las mismas o un derivado de las mismas. Sin embargo, la proteína VP1 de la invención debe ser capaz de ensamblarse para formar VLP. En el presente documento, una proteína VP1 de la invención tiene, como se ha indicado anteriormente, preferentemente una longitud mínima de 500 restos de aminoácidos y una identidad o similitud mínima con las proteínas VP1 del genogrupo I natural, como también se ha indicado anteriormente. La formación de VLP se puede determinar mediante métodos establecidos tales como la microscopía electrónica (Laue M & Bannert N., 2010, J Applied Microbiol., 109:1159-1168; Harris JR, 1999, Methods Mol Biol., 117:13-30; Pogan R et al., 2018, J Phys.: Condens. Matter, 30: 064006) o mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Effio CL et al., 2016, Vaccine, 34:1259-1267).

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside de la invención. La molécula de ácido nucleico puede ser un vector utilizado para expresar la proteína de la invención en células hospedadoras o en un organismo hospedador. La molécula de ácido nucleico puede contener una construcción de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la invención; la molécula de ácido nucleico puede contener además elementos genéticos para expresar la secuencia de nucleótidos. A continuación se proporciona más información sobre la molécula de ácido nucleico y la construcción, en la sección sobre la producción de la proteína de la invención.

Partículas similares a virus (VLP) de la invención

La invención también proporciona una VLP que consiste en o comprende una proteína de la cápside VP1 de la invención. Una VLP es una partícula que consiste en una o más proteínas estructurales de virus, pero no contiene ácido nucleico viral. Preferentemente, una VLP es una partícula que consiste en una o más proteínas estructurales de virus, pero no contiene ácido nucleico noroviral que codifique la VP1 o la VP1 y la VP2 de dicha VLP. En el caso de los norovirus, una VLP consiste en una o más proteínas estructurales VP1 o en proteínas VP1 y VP2 (o cualquier fragmento o derivado como se describe en el presente documento). La VLP de la invención comprende o consiste en la proteína de la cápside VP1 de la invención, tal como las definidas en uno cualquiera de los puntos (i) a (iii), puntos (i') a (iii'), puntos (i'') a (iii"), o de los puntos (i''') a (iii'") anteriores. Estas proteínas son preferentemente capaces de formar VLP.

La VLP de la invención preferentemente comprende al menos 60, preferentemente al menos 90, más preferentemente aproximadamente 180 moléculas de proteína VP1. No es necesario que todas las moléculas de proteína VP1 de la VLP de la invención sean moléculas de proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de acuerdo con la invención. Es posible que la VLP también contenga otras moléculas de proteína VP1, preferentemente del genogrupo I. Sin embargo, con el fin de proporcionar un alto efecto estabilizador de la proteína VP1 de la invención sobre la VLP, al menos un 50 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 90 % del número de moléculas de proteína VP1 de una VLP deben ser moléculas de proteína de la cápside VP1 de acuerdo con la invención. En una realización preferida, todas las moléculas de proteína VP1 de una ^vL^pson moléculas de proteína de la cápside VP1 de acuerdo con la invención. Por tanto, en una realización, la VLP de la invención comprende al menos 60, preferentemente al menos 90, más preferentemente aproximadamente 180 moléculas de proteína de la cápside VP1 de acuerdo con la invención. La VLP puede comprender además una o más moléculas de proteína VP2, preferentemente moléculas de proteína VP2 del genogrupo I.

La proteína de la cápside VP1 de la invención puede ensamblarse espontáneamente en la VLP de la invención. La expresión y producción de la proteína VP1 de la invención y la producción de la VLP se explican con más detalle más adelante.

La invención también proporciona un método para aumentar la estabilidad de VLP del genogrupo I de NoV, que comprende reemplazar el resto de His en el tramo de secuencia Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr (SEQ ID NO: 57) en el dominio P de una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I por Arg o Lys. El reemplazo generalmente se realiza mediante cambios apropiados en un ácido nucleico que codifica una proteína VP1 del genogrupo I, y expresando el ácido nucleico que codifica VP1 modificado en un hospedador de expresión adecuado (que se describe con más detalle más adelante). La proteína VP1 expresada preferentemente se ensambla, en presencia o ausencia de otra proteína VP1 del genogrupo I del mismo o diferente genotipo del genogrupo I, a la VLP de la invención.

Composición inmunogénica de la invención

La invención proporciona además una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos de NoV, en donde al menos un antígeno de NoV es la proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de la invención. Por tanto, la proteína de la cápside VP1 de la invención también se denomina en el presente documento "antígeno de la invención". La composición inmunogénica es capaz de generar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra los uno o más antígenos de NoV presentes en la composición. La composición inmunogénica comprende como antígeno de NoV, la proteína de la cápside VP1 de la invención o, preferentemente, la VLP de la invención. La composición inmunogénica puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante de vacuna.

La composición inmunogénica puede comprender dos o más antígenos de NoV diferentes, tales como dos o más proteínas VP1, para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto frente a múltiples antígenos de NoV al mismo tiempo, tales como dos, tres o cuatro antígenos de NoV diferentes. El o los antígenos de NoV utilizados en la composición inmunogénica de la invención dependen del NoV o de los NoV contra los cuales se debe conseguir la inmunización en un sujeto utilizando la vacuna de la invención. A medida que evolucionan los norovirus (NoV) que causan infecciones en los mamíferos, el o los antígenos utilizados en la composición inmunogénica se puede cambiar o adaptar para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra los NoV considerados un riesgo para la salud en un momento dado o en una estación dada. La composición inmunogénica de la invención contiene al menos la cápside VP1 o la VLP de la invención. Por tanto, contiene al menos un antígeno del genogrupo I de NoV. La composición inmunogénica puede contener un segundo o más antígenos del genogrupo de NoV que puede ser o no un antígeno VP1 del genogrupo I de la invención; preferentemente, otro antígeno del genogrupo I de NoV es también un antígeno VP1 del genogrupo I de la invención. Por tanto, en una realización, la composición inmunogénica comprende dos o más antígenos VP1 del genogrupo I, preferentemente de diferentes genotipos, en donde los dos o más antígenos de VP1 del genogrupo I son antígenos de VP1 del genogrupo I de la invención.

La composición inmunogénica puede contener además un antígeno de NoV del genogrupo GIl y/o GIV de NoV. Preferentemente, la composición inmunogénica contiene además un antígeno de NoV del genogrupo II (GII) de NoV. Los antígenos de NoV del genogrupo GII y/o GIV son preferentemente proteínas de la cápside VP1.

La proteína de la cápside VP1 del genogrupo GII y/o GIV que puede estar contenida en la composición inmunogénica puede ser como se indica a continuación:

(a) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 53; o

(b) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 500 restos de aminoácidos y tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia sobre esta longitud con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 53; o

(c) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 53.

Otras realizaciones de la proteína de la cápside VP1 del antígeno del genogrupo II o IV son las siguientes:

(a') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 53; o

(b') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y, aún más preferentemente, al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 53; o

(c') la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, aún más preferentemente de 1 a 30 e incluso más preferentemente de 1 a 20 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 53.

Los genotipos de estos GII o proteínas de la cápside de GII se indican en la sección sobre las secuencias de aminoácidos.

En cuanto a los genotipos de los antígenos de NoV a utilizar en la composición inmunogénica de la invención, no hay limitaciones particulares. Los genotipos preferidos del genogrupo I son cualquiera de los genotipos del genogrupo I indicados anteriormente, preferentemente los genotipos 1.1 y I.4 y, aún más preferentemente, el genotipo I.4. Un antígeno del genogrupo II puede ser un antígeno de uno o más de los siguientes genotipos: II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8, II.12, II.13, II.14, II.17, II.21, II.22, II.24 o II.25, preferentemente II.4 y II.17, más preferentemente II.4. Un antígeno del genogrupo IV puede ser un antígeno de uno o más de los siguientes genotipos: IV.1 o IV.3. De forma similar a los antígenos del genogrupo I, los antígenos de otros genogrupos son preferentemente proteínas VP1.

Con respecto a las realizaciones en donde un antígeno del genogrupo I de NoV se combina con un antígeno del genogrupo II de NoV, se pueden mencionar los siguientes ejemplos de composiciones inmunogénicas:

una que comprende un antígeno de genotipo I.1 y un antígeno de genotipo II.1;

una que comprende un antígeno de genotipo I.1 y un antígeno de genotipo II.4;

una que comprende un antígeno de genotipo I.1 y un antígeno de genotipo II.6;

una que comprende un antígeno de genotipo I.4 y un antígeno de genotipo II.1;

una que comprende un antígeno de genotipo I.4 y un antígeno de genotipo II.4;

una que comprende un antígeno de genotipo I.4 y un antígeno de genotipo II.17;

una que comprende un antígeno de genotipo I.4 y un antígeno de genotipo II.2;

una que comprende un antígeno de genotipo I.1 y un antígeno de genotipo II.17;

una que comprende un antígeno de genotipo I.1 y un antígeno de genotipo II.2; y

una que comprende un antígeno de genotipo I.4 y un antígeno de genotipo II.6;

en todas estas realizaciones de la composición inmunogénica, la composición contiene al menos la proteína de la cápside VP1 de la invención como antígeno del genogrupo I, preferentemente los antígenos del genogrupo I son las proteínas de la cápside VP1 de la invención. Los antígenos de los genogrupos I y II pueden ser los definidos anteriormente con referencia a las SEQ ID NO. Se prefiere una realización en donde la composición inmunogénica contiene un antígeno de genotipo I.1 o I.4 (GI.4) y un antígeno de genotipo II.4 (GII.4) o GII.17 (GII.17). Es más preferida una realización en donde la composición inmunogénica contiene un antígeno de genotipo I.1 o I.4 y un antígeno de genotipo II.4. En todas estas realizaciones, las composiciones inmunogénicas pueden contener además un vehículo farmacéuticamente aceptable o un adyuvante de vacuna como se explica más adelante con más detalle.

La composición inmunogénica puede, en una realización adicional, comprender dos o más antígenos de un genogrupo de NoV, preferentemente del genogrupo II. La composición inmunogénica puede comprender, además de una proteína de la cápside VP1 de genotipo I de la invención, dos antígenos diferentes de norovirus del genogrupo II, tales como un antígeno de un primer genotipo de un norovirus del genogrupo II y un antígeno de un segundo genotipo de un norovirus del genogrupo II. Por ejemplo, la composición puede comprender un antígeno (p. ej., proteína VP1) de un NoV de genotipo II.1 y un antígeno (p. ej., proteína VP1) de un NoV de genotipo II.4. Como alternativa, la composición puede comprender un antígeno (p. ej., proteína VP1) de un NoV de genotipo II.1 y un antígeno (p. ej., proteína VP1) de un NoV de genotipo II.17. Como alternativa, la composición puede comprender un antígeno (p. ej., proteína VP1) de un NoV de genotipo II.4 y un antígeno (p. ej., proteína VP1) de un NoV de genotipo II.17. Estos antígenos del genogrupo II pueden ser los definidos anteriormente con referencia a las SEQ ID NO.

Los derivados de un antígeno como se ha definido anteriormente se consideran antígenos del genogrupo y/o genotipo al que pertenece el antígeno nativo. Si un antígeno, tal como una proteína VP1 puede, usando esta regla, pertenecer a dos genogrupos o genotipos diferentes, el antígeno o derivado pertenece al genogrupo o genotipo al que es más similar el antígeno o derivado en términos de identidad de secuencia de aminoácidos en toda la longitud de una secuencia de aminoácidos de una proteína VP1 nativa tal como una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 56.

La composición inmunogénica de la invención contiene preferentemente los antígenos en forma de VLP de NoV. Por tanto, la composición inmunogénica de esta realización puede contener la VLP de la invención definida anteriormente. La composición inmunogénica contiene preferentemente la VLP de la invención y una VLP de NoV de antígenos del genogrupo II y/o del genogrupo IV, preferentemente VLP de NoV de antígenos del genogrupo II. Las VLP de antígeno del genogrupo II y/o del genogrupo IV son preferentemente proteínas VP1 como las mencionadas anteriormente y de los genotipos mencionados anteriormente.

La composición inmunogénica de la invención puede contener una VLP que comprende o consiste en un antígeno de NoV de genogrupo I (que contiene la proteína de la cápside VP1 de la invención) y una VLP que comprende o consiste en un antígeno de NoV de un segundo genogrupo (p. ej., genogrupo II). Pueden mencionarse como ejemplos las siguientes composiciones inmunogénicas:

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.1 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.1;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.1 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.4;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.1 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.6;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.1 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.2;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.1 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.17;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.4 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.1;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.4 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.4; y

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo 1.4 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.6.

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo I.4 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.2;

una composición que comprende una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo I.4 y una VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo II.17;

en todas estas realizaciones, la VLP que consiste en o comprende un antígeno de genotipo I es la VLP de la invención, en donde el 100 % de las moléculas de proteína VP1 de dicha VLP pueden ser la proteína de la cápside VP1 de la invención.

La composición inmunogénica de la invención puede comprender el antígeno noroviral del genogrupo I (preferentemente proteína VP1) y el antígeno noroviral del genogrupo II (también preferentemente proteína VP1) en un intervalo de relación de masas de 1:1 a 1:6, preferentemente de 1:1,5 a 1:5, más preferentemente de 1:2 a 1:4. En otras realizaciones, la composición inmunogénica de la invención comprende el antígeno noroviral del genogrupo I y el antígeno noroviral del genogrupo II en un intervalo de relación de masas de 5:1 a 1:5, preferentemente de 3:1 a 1:3 y, más preferentemente, de 2:1 a 1:2, e incluso más preferentemente de 1,5:1 a 1:1,5.

En realizaciones preferidas, la composición inmunogénica de la invención comprende la proteína de la cápside VP1 del genogrupo I de la invención y un antígeno noroviral del genogrupo II (preferentemente proteína VP1) en un intervalo de relación de masas de 5:1 a 1:5, preferentemente de 3:1 a 1:3 y, más preferentemente, de 2:1 a 1:2, e incluso más preferentemente de 1,5:1 a 1:1,5.

En una realización preferida adicional, la composición inmunogénica de la invención comprende la VLP de la invención y una VLP del genogrupo II de NoV en un intervalo de relación de masas de 5:1 a 1:5, preferentemente de 3:1 a 1:3 y, más preferentemente, de 2:1 a 1:2, e incluso más preferentemente de 1,5:1 a 1:1,5. La VLP de la invención es como se ha definido anteriormente. La relación de masas puede medirse, p. ej., sometiendo las VLP a SDS-PAGE, tiñendo y leyendo las intensidades teñidas mediante un lector comercial. La medición se puede realizar antes de mezclar las VLP y, posteriormente, mezclando las VLP deseadas en la relación deseada. Como alternativa, las VLP se pueden cuantificar mediante espectroscopia de masas tal como MALDI-TOF.

La composición inmunogénica puede contener además un vehículo adecuado, en las cantidades y relaciones de mezcla deseadas. En caso de composiciones líquidas acuosas, un vehículo adecuado puede ser agua o una solución acuosa que debe estar a un pH apropiado, tal como de 6 a 8, preferentemente de 6,7 a 7,5. La solución acuosa puede contener, aparte del agua, un tampón, un agente de tonicidad y/o un conservante según se requiera. En caso de composiciones sólidas, una composición líquida puede secarse o liofilizarse.

Son ejemplos de tampones el tampón fosfato, tampón Tris, tampón acetato y tampón citrato. Son ejemplos de posibles agentes de tonicidad el cloruro de sodio, sacarosa, glicerol y trehalosa. Un ejemplo de un posible conservante es el timerosal. Sin embargo, la composición inmunogénica se puede proporcionar estéril sin la adición de un conservante.

La composición puede ser líquida o sólida. Si es líquida, puede ser una solución en agua o un tampón acuoso. Si es sólida, puede ser una mezcla que contenga la proteína de la cápside del genogrupo I de NoV, preferentemente que contiene las VLP de NoV de la invención. Una forma sólida preferida es una forma liofilizada.

La composición inmunogénica es inmunogénica porque genera una respuesta inmunitaria contra el o los antígenos que contiene si la composición se administra a un sujeto, tal como un ser humano. Para apoyar la respuesta inmune en un sujeto, la composición puede contener un adyuvante de vacuna. Un ejemplo de adyuvante es el hidróxido de aluminio (alumbre), que es un adyuvante generalmente conocido para vacunas u otras sales de aluminio. En una realización, sin embargo, la composición inmunogénica (y la vacuna) no contiene adyuvante. En una realización preferida, la composición (y la vacuna) no contiene alumbre ni otra sal de aluminio como adyuvante.

Para preparar la composición inmunogénica de la invención, el uno o más antígenos, preferentemente en forma de VLP, se puede mezclar preferentemente en o con un vehículo o medio adecuado. El vehículo o medio puede ser agua o un medio acuoso tal como una solución. El medio acuoso puede contener un tampón para controlar el pH y puede contener solución salina fisiológica y/u otros aditivos. Los posibles aditivos pueden ser, pero sin limitación, sacarosa, glicerol, trehalosa. Los antígenos de NoV pueden almacenarse en un medio acuoso hasta que se produzca la composición inmunogénica o la vacuna de la invención. Para tiempos de almacenamiento más prolongados, puede estar congelado o liofilizado. Después de la producción de la composición inmunogénica, se puede esterilizar, p. ej. por filtración estéril y almacenar. El almacenamiento puede ser en forma líquida o congelada. También se puede almacenar después de la liofilización como polvo seco.

La liofilización de la composición inmunogénica y vacunas es bien conocida en la técnica. Normalmente, la composición se liofiliza en presencia de agentes para proteger el antígeno y/o el adyuvante de la invención durante el proceso de liofilización y para producir polvos con características deseables. Normalmente, para la crioprotección y lioprotección de antígenos proteicos y para producir tortas o polvos liofilizados con características deseables se utilizan azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o lactosa (presente en una concentración inicial de 10-200 mg/ml). Las composiciones liofilizadas pueden ser más estables. También pueden utilizarse otras tecnologías de secado, tales como secado por aspersión o liofilización por aspersión.

Vacuna de la invención

La vacuna de la invención comprende la composición inmunogénica de la invención en una forma adecuada para la administración a un sujeto o en una forma que puede, antes de la administración, llevarse a una forma adecuada para la administración a un sujeto. Preferentemente, la vacuna contiene la composición inmunogénica en una forma farmacéutica adecuada, preferentemente como una forma farmacéutica de dosis única o unitaria que contiene la cantidad de antígeno a administrar a un sujeto en una sola administración.

La forma adecuada para la administración está relacionada con el modo de administración. Por ejemplo, la vacuna puede ser una formulación sólida que puede reconstituirse antes de la administración mediante la adición de una cantidad predeterminada de agua o solución acuosa, suspensión o emulsión. De este modo, pueden prepararse soluciones para la administración, p. ej. por inyección poco antes de la administración. Como alternativa, la vacuna puede ser una formulación sólida para administración intranasal a un sujeto. La vacuna también puede ser una preparación líquida, preferentemente una formulación líquida acuosa, para administración por inyección. En el último caso, la vacuna puede ser una solución acuosa como forma farmacéutica unitaria.

La vacuna puede comprender, además de la composición inmunogénica, uno o más excipientes o vehículos farmacéuticos. Los excipientes pueden ser líquidos o sólidos. Los excipientes líquidos incluyen, sin limitación, agua, alcohol, solución salina y soluciones tamponadas. Otros posibles excipientes incluyen, sin limitación, conservantes y otros aditivos tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y sustancias tamponadoras. La composición inmunogénica de la invención puede ser en sí misma una vacuna en el sentido de la invención.

La vacuna es una vacuna anti-NoV. Al mismo tiempo, es una composición farmacéutica. La vacuna se usa generalmente para prevenir o tratar la infección por NoV en un sujeto, o para reducir la gravedad de una infección por NoV. Para prevenir o tratar la infección por norovirus, o para reducir la gravedad de una infección por NoV, la composición inmunogénica o vacuna de la invención se puede administrar a un sujeto. Los sujetos en los que se puede prevenir o tratar el NoV o en los que se puede reducir la gravedad de una infección por NoV son mamíferos, preferentemente seres humanos. Dentro de los seres humanos, tanto los niños como los adultos pueden ser sujetos para prevenir o tratar la infección por NoV. Dentro de los seres humanos, se prefieren los niños para conseguir la una inmunización temprana en la vida. Los sujetos humanos se consideran niños hasta la edad de 16 años. Preferentemente, la vacuna de NoV se utiliza en niños de 1 a 16 años, preferentemente de 2 a 14 y, más preferentemente, de 3 a 12 años de edad.

En cuanto a la vía de administración de la vacuna, la invención no está limitada. La vacuna de la invención se administra preferentemente a un sujeto por vía parenteral, p. ej. por inyección. Para la administración por inyección, la vacuna se puede formular como un líquido o como un sólido que se reconstituirá para formar un líquido. La administración parenteral por inyección puede ser la administración intravenosa, intradérmica, intramuscular o subcutánea. Se prefiere la administración intradérmica, intramuscular o subcutánea, más preferentemente la administración intradérmica e intramuscular. En una realización, la vacuna se administra por vía intradérmica. En otra realización, la vacuna se administra por vía intramuscular. La vacuna también se puede administrar por vía intranasal. En este caso, la composición o vacuna puede ser líquida, preferentemente una solución acuosa. Como alternativa, la composición o vacuna para administración intranasal puede estar en forma sólida, tal como en una forma liofilizada.

Cuando la vacuna se administra a un sujeto humano, el o los antígenos de NoV se pueden administrar en una cantidad de 10 a 1000 |jg, preferentemente de 30 a 300 |jg, más preferentemente de 55 a 150 |jg de antígeno de NoV. Si la vacuna contiene más de un antígeno de NoV, estas cantidades se refieren a la suma de las cantidades de los antígenos de NoV individuales. Si la vacuna contiene antígenos del genogrupo I y antígenos del genogrupo II, la cantidad del antígeno o antígenos del genogrupo II puede ser igual o mayor que la del antígeno o antígenos del genogrupo I. La cantidad del antígeno o antígenos del genogrupo II puede ser de 1,5 a 6 veces, preferentemente de 2,0 a 5 veces, más preferentemente de 2,5 a 4,5 veces, e incluso más preferentemente de 3,0 a 4,0 veces la cantidad del antígeno o antígenos del genogrupo I en términos de masa.

La vacuna se puede envasar en una forma de dosis única o de dosis múltiple en un recipiente que contiene la cantidad deseada de la vacuna adecuada para la administración. Se prefieren las formas de dosis única, donde la dosis única contiene la cantidad de administración de antígeno de NoV como se ha indicado anteriormente. La forma de dosis única puede comprender de 10 a 1000 jg , preferentemente de 30 a 300 jg , más preferentemente de 55 a 150 jg de uno o más antígenos de NoV. Si la vacuna contiene antígenos del genogrupo I y antígenos del genogrupo II, las relaciones de estos antígenos pueden ser las definidas en el párrafo anterior.

La vacuna se puede administrar una o dos veces a un sujeto para mejorar la inmunidad frente a la infección por NoV. Si la vacuna se administra dos veces, la segunda administración puede hacerse dentro de las 2 a 8 semanas, preferentemente dentro de las 3 a 5 semanas posteriores a la primera administración de la vacuna.

La vacuna de la invención también puede contener antígenos contra otras enfermedades infecciosas para generar protección inmunológica no solo contra el NoV, sino también contra otros virus. La vacuna puede comprender, por ejemplo, antígenos de rotavirus para generar protección contra NoV y rotavirus.

Un método para producir una composición inmunogénica o vacuna contra la infección por NoV puede comprender expresar la proteína de la cápside VP1 de la invención en un hospedador de expresión, ensamblar la proteína de la cápside VP1 expresada para formar VLP y formular las VLP para su administración a un sujeto.

Producción de antígenos de NoV

Los antígenos de NoV, como se ha descrito anteriormente, se pueden expresar y purificar a partir de diferentes hospedadores de producción, incluidas células de mamíferos, células de insectos y plantas o células vegetales (para revisión: Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S. & Chen, Q. 2010, Exp. Rev. Vaccines, 9:299-307). Se han descrito protocolos fiables de purificación de antígeno de NoV y de VLP de NoV y modificaciones de los mismos para células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus (Jiang, X. et al., 1992, J.Virol., 66:6527-6532; Prasad BVV, Hardy D, Estes M. 2000, J. Infect. Dis., 181:S317-S321; Huhti, L., et al., 2010, Arch. Virol., 155:1855-1858; Koho, T., et al., 2012, J. Virol. Methods, 181:6-11; Huhti, L., et al., 2013, Arch. Virol., 158:933-942; documento WO2013192604) y para plantas (Santi L. et al., 2008, Vaccine, 26:1846-1854; Lai, H. & Chen, Q. 2012, Plant Cell Rep., 31:573-584). También se puede considerar el documento EP2601970 con respecto a la producción de VLP de NoV.

Aunque no se observa ninguna diferencia en la estructura y las propiedades inmunogénicas de las VLP aisladas de células de insectos y vegetales, un sistema preferido para la producción de VLP está basado en plantas, ya que esto permite evitar impurezas de baculovirus en el antígeno o las VLP aisladas de tejidos vegetales. Además, los sistemas de expresión transitoria basados en plantas, a diferencia del sistema basado en baculovirus, son fácilmente redimensionables. Los genes del antígeno de NoV se pueden expresar con éxito en plantas utilizando un sistema de expresión basado en virus vegetales denominado magnICON® (Gleba et al., 2005, Vaccine, 23:17-18; Marillonnet et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723; Gleba et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18:134-141; Klimyuk, V., et al., 2014, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 375:127-154) que permite expresar fácilmente VLP de virus en plantas Nicotiana benthamiana (Zahin, M. et al., 2016, PLoS One, 11(8):e0160995).

En más detalle, la proteína de la cápside de la invención y otros antígenos que se van a incluir en la vacuna o composición inmunogénica se pueden producir mediante métodos de expresión de proteínas conocidos en un sistema de expresión estándar. Para producir la proteína de la cápside o el antígeno, una secuencia de nucleótidos que la codifica puede expresarse en un organismo hospedador adecuado. En la técnica anterior se han descrito métodos que se pueden usar para producir y purificar una proteína de interés y se puede usar cualquiera de tales métodos. Si se utiliza un sistema de expresión eucariótico, se pueden insertar uno o más intrones en la secuencia codificante del antígeno.

Son métodos de expresión particularmente eficaces los sistemas de expresión de plantas que también se conocen en la técnica anterior. Una forma posible para conseguir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés que codifica un antígeno de acuerdo con la invención en plantas es el uso de replicones autorreplicantes (de virus) que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno. Se han descrito sistemas de expresión de virus vegetales en muchas publicaciones, tales como WO2012019660, WO2008028661, WO2006003018, WO2005071090, WO2005049839, WO2006012906, WO02101006, WO2007137788 o WO02068664, y en estos documentos se citan muchas más publicaciones. Se conocen diversos métodos para introducir una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ADN, en una planta o parte de una planta para su expresión transitoria. Se pueden usar agrobacterias para transfectar plantas con la molécula de ácido nucleico (vector) o la construcción de ácido nucleico, p. ej., por agroinfiltración o aspersión con suspensiones agrobacterianas. Como referencias, véanse los documentos W o 2012019660, WO 2014187571 o WO 2013149726.

En realizaciones en donde se desea una fuerte expresión del antígeno, una construcción de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápside puede codificar un vector de virus que puede replicarse en células vegetales para formar replicones del vector de virus. Para poder replicarse, el vector de virus y los replicones pueden contener un origen de replicación que puede ser reconocido por una polimerasa de ácido nucleico presente en las células vegetales, tal como por la polimerasa viral expresada a partir del replicón. En el caso de vectores de virus de ARN (denominados "replicones de ARN"), los replicones pueden formarse por transcripción bajo el control de un promotor activo en células vegetales, a partir de la construcción de ADN después de que este último se haya introducido en núcleos de células vegetales. En el caso de los replicones de ADN, los replicones pueden formarse por recombinación entre dos sitios de recombinación que flanquean la secuencia que codifica el replicón del virus en la construcción de ADN, p. ej., como se describe en los documentos WO00/17365 y WO 99/22003. Si el replicón está codificado por la construcción de ADN, se prefieren replicones de ARN. El uso de vectores de virus de a Dn y ARN (replicones de ADN o ARN) se ha descrito ampliamente en la bibliografía a lo largo de los años. Algunos ejemplos son las siguientes publicaciones de patentes: WO2008028661, WO2007137788, WO 2006003018, W02005071090, WO2005049839, WO02097080, WO02088369 y WO02068664. Son ejemplos de vectores de virus de ADN los basados en geminivirus. Para la presente invención, preferentemente pueden utilizarse vectores de virus o replicones basados en virus de ARN de plantas, en particular, los basados en virus de ARN monocatenario de sentido positivo. Por consiguiente, el replicón viral puede ser un replicón de ARN monocatenario de sentido positivo. Son ejemplos de estos vectores de virus los basados en el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el potexvirus X (PVX). "Basado en" significa que el vector de virus utiliza el sistema de replicación, tal como la replicasa y/u otras proteínas implicadas en la replicación de estos virus. Se describen sistemas de expresión y vectores de virus basados en potexvirus en los documentos EP2061890 o WO2008/028661.

La proteína de la cápside puede expresarse en una planta multicelular o en una parte de la misma, en particular, en una planta superior o partes de la misma. Se pueden utilizar plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas (cultivos). Las plantas comunes que se pueden usar para expresar proteínas incluyen Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana. Sin embargo, también pueden emplearse muchas otras.

Generalmente, la proteína de la cápside puede expresarse en el citosol de las células de las plantas o partes de plantas. En este caso, no se añade a la enzima ningún péptido señal que dirija la proteína de interés a un compartimento particular. Como alternativa, la proteína de la cápside o el antígeno pueden expresarse en o dirigirse a los cloroplastos de las plantas o secretarse en el espacio extracelular; en estos casos, se añade una presecuencia N-terminal, tal como un péptido de tránsito de plástido o una secuencia señal para el direccionamiento al espacio extracelular, en el extremo N o el extremo C, preferentemente en el extremo C, de la proteína de la cápside como proteína de interés.

En la siguiente etapa, se cosecha material vegetal que contiene proteína de la cápside expresada procedente de una planta que ha expresado el antígeno. El material vegetal puede ser, p. ej., hojas, raíces, tubérculos o semillas, o un producto triturado, molido o machacado de hojas, raíces, tubérculos o semillas. A continuación, la proteína de la cápside se puede extraer del material vegetal utilizando un tampón acuoso. Esto puede incluir que el material vegetal se homogeneice y que el material insoluble se elimine por centrifugación o filtración. Los componentes solubles, incluida la proteína de la cápside, se extraerán en el tampón acuoso para producir una solución de proteína de la cápside en el tampón acuoso. El tampón acuoso puede contener un ácido inorgánico u orgánico o sus sales y puede tener un pH como se define a continuación para la solución acuosa como composición de la invención. Además, el tampón acuoso puede contener sal y/o un compuesto de sulfhidrilo. A continuación, la proteína de la cápside en la preparación de antígeno obtenida se puede purificar aún más utilizando métodos estándar de purificación de proteínas, tales como métodos cromatográficos.

La proteína de la cápside, al ser una proteína VP1 o derivado de NoV, puede formar VLP. Estas VLP generalmente se forman espontáneamente en el tampón acuoso utilizado en la extracción y purificación. La formación de VLP se puede verificar, p. ej., utilizando microscopía electrónica.

Si la composición inmunogénica o vacuna de la invención contiene dos o más antígenos de NoV, los dos o más antígenos se pueden expresar y purificar por separado y después mezclarse en las relaciones deseadas cuando se prepare la composición o la vacuna. También es posible coexpresar dos o más proteínas de la cápside o antígenos en las mismas plantas o células vegetales y purificarlos juntos como una mezcla.

En los Ejemplos 1 y 2 se describe la obtención mediante ingeniería genética de construcciones para la expresión de antígenos, incluidos los antígenos VP1, la expresión de antígenos y la purificación. La figura 6 muestra la generación del vector de expresión que contiene la secuencia codificante del antígeno GI.4. Se puede utilizar un enfoque similar utilizando enzimas de restricción de tipo IIS para clonar cualquier secuencia de interés en el vector de expresión. La figura 7 muestra la expresión de la proteína VP1 de GI.4 de tipo silvestre y mutante en gel teñido con Coomassie.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Construcción y ensayo funcional de vectores de expresión para versiones mutantes y de tipo silvestre de VP1 de norovirus

La secuencia correspondiente a la proteína de la cápside VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 (Japón, 1987) (n.° de acceso de GenBank: BAB18267, 544 restos de aminoácidos, SEQ ID NO: 1, Fig. 1) se generó utilizando síntesis de genes y se añadieron sitios Bsal de la enzima de restricción de Tipo IIS flanqueantes para la clonación. Los módulos de Norovirus GI.4 Chiba 407 se clonaron en vectores de expresión de virus basados en TMV (sistema magnICON®, véase más adelante) utilizando la enzima de restricción Bsal de tipo IIS que genera salientes diferentes adaptados para cada módulo y que, de este modo, permiten el ensamblaje de la construcción final mediante la eliminación de estos sitios de restricción (Engler, C., Kandzia, R. & Marillonnet, S. 2008, PLoS One, 3:e3647).

El análisis de la proteína VP1 de GI.4 Chiba 407 reveló que a la secuencia de la proteína de tipo silvestre le faltaban dos restos de metionina N-terminales y los dos restos de arginina C-terminales, lo que daba como resultado una diferencia de la masa de proteína teórica y determinada. Por lo tanto, se generó una variante NC truncada en los extremos N y C (SEQ ID NO: 2) sin dos restos de metionina N-terminales y dos restos de arginina C-terminales de VP1 de GI.4 Chiba 407 para proporcionar una variante coincidente para la masa teórica y determinada. Los módulos respectivos de VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 se generaron mediante PCR con sitios Bsal de enzima de restricción de tipo IIS flanqueantes y se clonaron en vectores de expresión de virus magnICON® basados en TMV que usan estos sitios Bsal. Como base para la introducción de mutaciones adicionales se utilizó la versión NC de SEQ ID NO: 2 (en comparación con la secuencia de tipo silvestre: AMM N-terminal, ARR C-terminal).

Las VLP de GI.4, en comparación con las VLP de GII.4, mostraron menor homogeneidad y también menor estabilidad. Adicionalmente, para la VP1 de GI.4 Chiba 407 de tipo silvestre y la versión NC, se copurificó y se coformuló un producto de alto peso molecular relacionado con el antígeno con las VLP de manera reproducible. Dado que este comportamiento no se observó para las cepas de GII.4, se realizó un análisis comparativo de secuencia y estructura. Se identificó un solo resto del aminoácido arginina dentro de una región conservada pero estructuralmente flexible del dominio P1 de las cepas de los genogrupos II y IV, que puede conducir a la formación de puentes salinos entre la cubierta y el dominio que sobresale, mejorando de este modo la conformación, multimerización y ensamblaje de VP1 y la estabilización de las VLP resultantes. En las cepas del genogrupo I, el resto de aminoácido en esta posición es histidina. Por lo tanto, este resto de histidina en la secuencia de VP1 de GI.4 Chiba 407 se reemplazó con arginina (H474R en el tipo silvestre y H472R para la variante NC). Los módulos respectivos de la versión NC de VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 se generaron mediante PCR con sitios Bsal de enzima de restricción de tipo IIS flanqueantes y se clonaron en vectores de expresión de virus magnICON® basados en TMV que usan estos sitios Bsal dando como resultado la versión NCHR (SEQ ID NO: 3) de VP1 de GI.4 Chiba 407 (en comparación con la secuencia de tipo silvestre: AMM N-terminal, H474R, ARR C-terminal).

Para mejorar aún más la estabilidad e integridad de VLP de GI.4 Chiba 407, el dominio de la cubierta interna se modificó mediante la sustitución de restos para permitir la formación adicional de puentes salinos que estabilizan la cubierta en la superficie interna de las VLP, es decir, el motivo STALATA N-terminal se modificó a SKALADA o SDALAKA. Los módulos respectivos de la versión NCHR de VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 se generaron mediante PCR con sitios Bsal de enzima de restricción de tipo IIS flanqueantes y se clonaron en vectores de expresión de virus magnICON® basados en TMV que usan estos sitios Bsal dando como resultado la versión NCHRKD (SEQ ID NO: 4) y la versión NCHRDK (SEQ ID NO: 5) de VP1 de GI.4 Chiba 407 (en comparación con la secuencia de tipo silvestre: AMM N-terminal, T41K/D, T45D/K, H474R, ARR C-terminal).

Se desarrollaron vectores de expresión binarios virales basándose en la tecnología magnICON® (Gleba, Y., Klimyuk, V. & Marillonnet, S., 2005, Vaccine, 2005, 23:2042-2048; Gleba, Y., Klimyuk, V. & Marillonnet, S. 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:134-141) utilizando elementos de tobamovirus (virus del mosaico del tabaco, TMV), es decir, de los ADNc de dos virus vegetales estrechamente relacionados, TVCV (virus del aclaramiento de las venas del nabo; Lartey, R.T., Lane, L.C. & Melcher, U. 1994, Arch. Virol., 138:287-298; Lartey, R.T., Voss, T.C. & Melcher, U. 1995, Gene, 166:331-332) y crTMV (tobamovirus que infecta a las cruciferas; Dorokhov, Y.L., Ivanov, P.A., Novikov, V.K., et al., 1994, FEBS Lett., 350:5-8). Los vectores resultantes se denominan "basados en TMV", ya que los dos virus parentales son tobamovirus y están relacionados con el conocido virus del mosaico del tabaco (TMV). Los tres virus (TVCV, crTMV y TMV) son virus de ARN de cadena positiva y tienen la misma estructura general y modo de replicación. Básicamente, los virus codifican una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), la proteína de movimiento (MP) y la proteína de recubrimiento (CP). El RdRP replica el transcrito de ARN viral completo (ARN genómico), así como los dos ARN subgenómicos (ARNsg) que se requieren para la expresión de las otras dos proteínas virales, MP y CP. La MP es necesaria para el movimiento de célula a célula de corta distancia del ARN genómico viral dentro de la hoja infiltrada. La CP es necesaria para la formación de partículas virales y para el movimiento sistémico de larga distancia de hoja a hoja a través del sistema vascular. No se requiere la formación de partículas virales para el movimiento de célula a célula. Por lo tanto, la CP se eliminó de los vectores virales y se reemplazó con el gen de interés. Por tanto, el vector viral no puede producir partículas virales y el gen de interés se expresa en niveles más altos. Además de los genes de proteínas virales y el gen de interés, el vector viral también contiene las secuencias virales 5' y 3' no traducidas (5' ntr y 3' ntr) que son esenciales para la replicación (Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M. et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 101:6852-7).

Para la expresión eficiente del vector viral basado en TMV en células vegetales, el ADNc del vector viral se clonó entre un promotor vegetal y un terminador vegetal (Act2 y nos) (Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M. et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 101:6852-6857) y se añadieron intrones de plantas dentro de las secuencias de RdRP y MP (Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R. et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723). Para el suministro eficaz de vectores virales basados en TMV a células vegetales, los presentes inventores utilizaron Agrobacterium tumefaciens. Por lo tanto, el vector viral completo (promotor de planta, secuencias de vector viral basado en TMV con gen de interés, terminador de planta) se clonó entre los bordes izquierdo y derecho del T-DNA de un vector binario. Los elementos del vector binario son un origen de pVS1 (Hajdukiewicz, P., Svab, Z. & Maliga, P., 1994, Plant Mol Biol., 25:989-994) para la replicación de plásmidos en Agrobacterium, un origen de co/E1 para la replicación de plásmidos en E. coli, un gen de resistencia al antibiótico kanamicina nptIII (Frisch, D.A., Harris-Haller, L.W., Yokubaitis, N.T. et al., 1995, Plant Mol. Biol., 27:405-409) y los bordes izquierdo y derecho de T-DNA (Frisch, D.A., Harris-Haller, L.W., Yokubaitis, N.T. et al., 1995, Plant Mol. Biol., 27:405-409) para delimitar los extremos del ADN transferido a las células vegetales. Para facilitar la selección azul/blanco, se insertó un casete lacZa amplificado a partir de pUC19 entre dos sitios de restricción Bsal que permiten la clonación sin fisuras en el marco del gen de interés. Por lo tanto, durante la construcción inicial de los vectores de virus, se eliminaron todos los sitios de reconocimiento de Bsal de origen natural para permitir una clonación fácil y robusta del gen de interés.

Para las pruebas funcionales de expresión de las proteínas recombinantes, la cepa de Agrobacterium seleccionada que albergaba el vector de expresión basado en t Mv se cultivó en medio LBS líquido con peptona de soja (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos) en sustitución de la triptona y complementado con 50 mg/ml de rifampicina y 50 mg/ml de kanamicina. Los cultivos de agrobacterias se dejaron crecer a 28 °C hasta que la DO600 alcanzó un valor de 2 a 4. La solución de infiltración se prepara diluyendo el cultivo de agrobacterias en tampón de infiltración (MES 10 mM, pH 5,5, MgSO₄10 mM) a una concentración celular definida (equivalente a una dilución de 1000 veces de un cultivo con un valor de DO600 de 2,0).

Se infiltraron hojas de plantas Nicotiana benthamiana cultivadas en condiciones controladas y estandarizadas durante 6-8 semanas con la solución de infiltración agrobacteriana utilizando una jeringa sin aguja y después se mantuvieron en el invernadero durante aproximadamente 7 días para la expresión y acumulación de la proteína recombinante. Posteriormente se recolectó el material foliar de la planta, se trituró en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y se extrajeron las proteínas con tampón Laemmli. Los extractos de proteínas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y las proteínas se visualizaron mediante tinción con Coomassie.

Ejemplo 2

Purificación de VLP de norovirus a partir de material vegetal

Se purificaron VLP de VP1 de norovirus como se describe a continuación. Se infiltraron al vacío (80-100 mbar durante 3-4 minutos) plantas Nicotiana benthamiana de cinco semanas con cultivos de Agrobacterium tumefaciens diluidos que llevaban vectores magnICON® ensamblados basados en TMV (Gleba et al., 2005, Vaccine, 23:17-18; Marillonnet et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723; Gleba et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18:134-141; Klimyuk, V., et al., 2014, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 375:127-154) que permite expresar fácilmente VLP de virus en plantas Nicotiana benthamiana (Zahin, M. et al., 2016, PLoS One, 11(8):e0160995). El material vegetal se recolectó 6-14 días después de la infiltración. El punto de tiempo de recolección de 7-8 días después de la infiltración da como resultado el nivel de expresión más alto.

La biomasa verde se homogeneizó en presencia de dos volúmenes de tampón neutro (es decir, 15 g de biomasa y 30 ml de Tris 100 mM, Na₂S2O55 mM, pH 7,5). Para la clarificación, el homogeneizado de plantas se centrifugó 20 min a 15.000 x g. El extracto resultante se clarificó adicionalmente por filtración usando un filtro de fibra de vidrio Millipore® (AP25).

Los componentes de alto peso molecular se sedimentaron por ultracentrifugación (150.000 x g durante 90 min). El sedimento se suspendió en 1 ml de histidina 20 mM, NaCl 137 mM pH 6,0 y se clarificó por centrifugación a 15.000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante que contenía VLP se puso en la parte superior de un colchón de sacarosa al 30 % (en histidina 20 mM, NaCl 137 mM, pH 6,5). La ultracentrifugación se realizó durante 90 min a 150.000 x g. El sedimento resultante se resuspendió en histidina 20 mM, NaCl 137 mM, pH 6,5.

EJEMPLO 3

Caracterización de VLP de VP1 purificadas

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

La presencia de VLP ensambladas se supervisó mediante microscopía electrónica de transmisión. Se tomaron micrografías TEM para visualizar el tamaño, dispersidad y morfología icosaédrica de VLP purificadas.

Las muestras se prepararon utilizando la técnica de tinción negativa de una sola gota (J. Robbin Harris, Methods in Molecular Biology 117: Electron Microscopy Methods and Protocols capítulo S. 13 - 30). Se utilizaron rejillas prerecubiertas (Formvar-Carbon, malla Cu 200, FCF200-Cu-25, Science Services GmbH, Munich, Alemania) como películas de apoyo y UranyLess (E22409, Science Services GmbH, Munich, Alemania) como solución de contraste. Se aplicaron 10 μl de cada muestra a una rejilla y se incubaron durante 10 min. La superficie de la rejilla se lavó tocando el lado recubierto con una gota de agua ultrapura durante 5 segundos. El exceso de agua se eliminó con papel de filtro. Las VLP se tiñeron dos veces con UranyLess listo para usar durante 1 minuto cada vez. Después de secar durante la noche, las rejillas se observaron con un microscopio electrónico de transmisión EM 900 (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Alemania) que funcionaba a 80 kV. Las micrografías se tomaron con una cámara Variospeed SSCCD SM-1k-120 (Trondle, Moorenweis, Alemania) utilizando el software de imágenes iTEM (EMSIS GmbH, Münster, Alemania).[Ref.] J. Robbin Harris: Negative staining of thinly spread biological particulates, Methods in Molecular Biology 117: Electron Microscopy Methods and Protocols capítulo S. 13 - 30

Cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alta resolución (SE-HPLC)

La formación, el contenido relativo y el tamaño (masa molar y radio) de las VLP se confirmaron mediante cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alta resolución (SE-HPLC) con detección por ultravioleta (UV), dispersión de luz (LS) e índice de refracción (RI).

El análisis de SE-HPLC se realizó en un sistema de HPLC Agilent serie 1200 (Agilent Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn, Alemania). La HPLC consistía en una bomba binaria G1312A, desgasificador de vacío micro G1379B, muestreador automático de líquidos G1329A, termostato automático para toma de muestras de líquidos G1330B, compartimento de columna termostatizado G1316A y detector de longitud de onda variable G1314C. El fotómetro láser miniDAWN TREOS de los instrumentos de Wyatt Technology Europe GmbH con un módulo de dispersión de luz dinámica de dispersión de luz cuasi-elástica (detector QELS-DLS) y el refractómetro Optilab rEX se acoplaron en línea con el sistema de SE-HPLC.

El volumen máximo de inyección de muestra fue de 100 μl y las muestras se termostatizaron en el muestreador automático a 23 °C antes de la inyección. Las carreras se realizaron a 25 °C y se realizaron por triplicado. Las VLP se separaron utilizando una precolumna TSKgel PWxl (40 x 6 mm, tamaño de partícula de 12 μm, tamaño de poro mixto, Tosoh) junto con una columna analítica TSKGel G6000 PWxI (300 x 7,8 mm, tamaño de partícula de 13 μm, diámetro de poro >1000 A, Tosoh Bioscience, Stuttgart, Alemania) como fase estacionaria y fosfato de hidrógeno disódico 25 mM/cloruro de sodio 125 mM/cloruro de sodio 1 mM (pH 7,4) como eluyente de SE-HPLC (fase móvil) a un caudal de 0,8 ml/min.

El control del sistema de SE-HPLC y la integración de picos de la señal UV para la determinación del contenido de VLP se realizaron con el software ChemStation (versión B.04.03, Agilent). Los detectores Wyatt conectados aguas abajo fueron controlados por el programa ASTRA (versión 5, Wyatt) y se utilizaron para la caracterización de VLP mediante la medición del tamaño a través de la dispersión de luz multiángulo (MALS), dispersión de luz dinámica (DLS) y detección del índice de refracción (RI). El análisis de los datos y el cálculo de la masa molar y el radio de las VLP se realizó con herramientas de programa y también con modelos de ASTRA.

Electroforesis en gel capilar (CGE)

Para el ensayo de la pureza de VP1, se realizó un análisis CGE-on-a-chip en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Deutschland GmbH; Waldbronn, Alemania) en combinación con un kit Agilent Protein 230 (intervalo de tamaño: 14-230 kDa) y 2100 Expert Software (Kuschel, M., et al. 2002, J Biomol Tech 13(3): 172-178). Todos los reactivos y chips se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de gel y tinte para la separación de proteínas se pipeteó en los depósitos designados en un chip y se introdujo en los canales de microfluidos usando una estación de cebado de chip.

Se mezclaron 4 μl de cada muestra de VLP y 2 μl de tampón de muestra y se calentaron a 95 °C durante 5 min. El tampón de muestra para condiciones reductoras contenía dodecilsulfato de litio, dos patrones internos y un 3,5 % (v/v) de DTT 1 M como agente reductor. Después de añadir 84 μl de agua a cada mezcla de muestra y tampón, se cargaron 6 μl de cada muestra en un chip junto con un marcador de peso molecular (Ladder) de proteínas. Los resultados del ensayo del chip se presentaron como una imagen similar a un gel, como electroferogramas y en forma de tabla. El ajuste del punto de referencia de los picos y la integración de los picos de los electroferogramas se realizaron automáticamente y, cuando fue necesario, el ajuste manual de los puntos de referencia de los picos se realizó caso por caso. Pudieron identificarse picos de proteína para el producto deseado (proteína de cubierta VP1 completa) y para una sustancia relacionada con el producto (VP1 truncada en el extremo N) y se distinguieron claramente de las impurezas relacionadas con el producto o el proceso al comparar el tiempo de migración en segundos o el tamaño de la proteína en kDa, respectivamente.[Ref.] Kuschel, M., T. Neumann, et al. (2002). "Use of lab-on-a-chip technology for protein sizing and quantitation". J Biomol Tech 13(3): 172-178.

Resultados

La sustitución de aminoácidos H472R altera significativamente el ensamblaje de las VLP y mejora la homogeneidad de las VLP. Se detectó un solo producto de VLP altamente homogéneo en un lote de ensayo producido a escala piloto.

SE-HPLC: Chi_NCHR mostró un contenido y una pureza de VLP mucho más altos (95,0 %) en comparación con las preparaciones anteriores de Chi y Chi_NC (75-85 %)

CGE, reducción: la degradación de VP1 de Chi_NCHR permaneció en el mismo nivel (80-85 %), sin mejora en comparación con las preparaciones de Chi_NC

TEM: sin cambios significativos, es posible que los dominios que sobresalen de Chi_NCHR sean más pronunciados en las Chi_NC-VLP o las Chi-VLP

EJEMPLO 4

Inmunogenicidad comparativa de VLP de VP1 de GI.4 Chiba NC purificada (tipo silvestre) y la versión mutante GI.4 Chiba NCHR en ratones usando la vía de suministro intramuscular (IM).

Se administraron VLP de norovirus recombinantes dos veces a ratones BALB/c en las semanas 0 y 3 en PBS (pH 7,3) IM. Los grupos se inmunizaron con una dosis de 10 μg de VLP de las VLP de GI.4 Chiba, ya sea GI.4 Chiba NC (Grupo I) o GI.4 Chiba NCHR (Grupo II). Todos los ratones fueron sacrificados en la semana 5 del estudio. Las respuestas inmunitarias humorales (anticuerpos) se analizaron mediante ensayos basados en ELISA.

Animales de estudio

Se enviaron ratones hembra BALB/c Ola/Hsd (Envigo, Países Bajos) a temperatura ambiente a una instalación para animales. Los animales se aclimataron una semana antes de las inmunizaciones y se inmunizaron a las 7 semanas de edad. Con el envío de los ratones se proporcionó un formulario de resumen de datos de supervisión de la salud. Se supervisaron diariamente la salud animal (signos clínicos de enfermedad) y el bienestar por el personal de la instalación de animales. Todos los procedimientos fueron autorizados y realizados de acuerdo con las directrices de la Junta Nacional de Experimentación Animal de Finlandia.

Procedimientos de inmunización

Los ratones fueron anestesiados con inhalación de isoflurano durante el tiempo de la inmunización y los procedimientos relacionados. Los animales se pesaron al inicio del estudio y se marcaron con un tatuaje grupal e individualmente con una perforación en la oreja. El artículo de ensayo se administró IM en el músculo tenso caudal (50 μl de volumen) con una jeringa de insulina de 0,5 ml (29G x 1/2"- 0,33 x 12 mm).

Procedimientos de terminación y toma de muestras

Los pesos de los animales se registraron en el momento del sacrificio. Los ratones se sacrificaron anestesiándolos con 1 mg/kg de medetomidina (Dorbene® 1 mg/ml, Laboratorios Syva) y 75 mg/kg de ketamina (Ketalar® 50 mg/ml, Pfizer) y recogiendo la sangre entera terminal del área axilar (axila). Se separó el suero de las muestras de sangre entera recogidas individualmente y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Ensayos de respuesta inmune humoral

Los títulos de IgG específica de antígeno en suero se analizaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) como se ha descrito anteriormente (Blazevic et al., 2011, Vaccine, 29:81268133; Tamminen et al., 2012, Immunology, 135:89-99). Se utilizó el ensayo de bloqueo homólogo basado en mucina gástrica de cerdo (PGM) (Lindesmith et al., 2012, J. Virol., 86:873-883) para determinar la capacidad de los sueros inmunológicos para bloquear la unión de las VLP de NoV a los supuestos receptores de NoV, antígenos del grupo histo-sanguíneo humano (HBGA) como se ha descrito anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2014, Microbes Infect., 16:472-480).

Ambas VLP de GI.4 Chiba indujeron una respuesta considerable de IgG sérica específica de genotipo en ratones BALB/c cuando se administraron por vía parenteral por vía IM con una dosis de 10 ^g (figura 11). No se observaron diferencias significativas entre los ratones individuales ni entre los dos grupos experimentales (figura 11). Adicionalmente, los sueros agrupados de ambos grupos inmunizados dos veces con 10 ^g de VLP de GI.4 Chiba tenían una actividad de bloqueo igualmente alta de la unión de VLP de GI.4 Chiba homóloga a los receptores de HBGA PGM (figura 11). En conclusión, no se observaron diferencias en la inmunogenicidad de las VLP de GI.4 Chiba NC (Grupo I) o GI.4 Chiba NCHR (Grupo II) al comparar las respuestas inmunitarias inducidas.

SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS SEQ ID NO: 1: secuencia de tipo silvestre de proteína de la cápside VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 (Japón, 1987) (acc. GenBank: BAB18267)

SEQ ID NO: 2: secuencia de la proteína de la cápside VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 (Japón, 1987) con un solo codón iniciador y eliminación de los dos restos de arginina C-terminales

SEQ ID NO: 3: secuencia de la proteína de la cápside VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 (Japón, 1987) con un solo codón iniciador, eliminación de los dos restos de arginina C-terminales y mutación H472R

SEQ ID NO: 4: secuencia de la proteína de la cápside VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 (Japón, 1987) con un solo codón iniciador, eliminación de los dos restos de arginina C-terminales y mutaciones T39^k, T43D, H472R

SEQ ID NO: 5: secuencia de la proteína de la cápside VP1 de norovirus GI.4 Chiba 407 (Japón, 1987) con un solo codón iniciador, eliminación de los dos restos de arginina C-terminales y mutaciones T39^d, T43K, H472R

SEQ ID NO: 6:gb:AGJ52175|GI Hu/GI/HuzhouNll/2008/CHN

SEQ ID NO: 7:gb:AFNO6736|GI Hu/GI/E8/UG/1976

SEQ ID NO: 8:gb:AUF81820|GI Hu/ETH/2016/P15

SEQ ID NO: 9:gb:BAV21674|GI Hu/GI/46-2/Tokio/1977/JPN

SEQ ID NO: 10:gb:NP_056821GI.1 GI/Humano/Estados Unidos/Norwalk/1968

SEQ ID NO: 11:gb:ARC53064|GI.2 Hu/GI.2/Kaohsiung/16-AF-2/2016/TW

SEQ ID NO: 12:gb:AFN06739|GI.3 Hu/GI.3/B8/CH1977

SEQ ID NO: 13:gb:AOO95034|GI.3 15-EN-3/2015

SEQ ID NO: 14:qb:AEY77031IGI.4 Hu/GI.4/S14/2008/LiNaEdet/Suecia

SEQ ID NO: 15:gb:BAA82106|GI.4 Hu/Chiba407/87/JP

SEQ ID NO: 16:gb:A0095019|GI.5 15-EN-8/2015/GI.5

SEQ ID NO: 17:gb:BAU16307|GI.5 Hu/Jp/2002/GI.5/OC020180

SEQ ID NO: 18:gb:BAU16303|GI.6 Hu/Jp/2013/GI.6/s130147

SEQ ID NO: 19:gb:APA31976|GI.7 Hu/USA/2011/GI.P7_GI.7/CS5567

SEQ ID NO: 20:gb:AKM20815|GI.8 Hu/CHN/2008/GI.P8 GI.8/Huzhou/N10

SEQ ID NO: 21:qb:APA31982IGI.9 Hu/USA/2016/GI.P9 GI.9/SC6350

SEQ ID NO: 22:gb:AGL98416|GII Hu/GII/T091/TN/1976

SEQ ID NO: 23:gb:AUD54969|GII Hu/PE/2012/GM.PNA1-GM.NA1/Loreto1041

SEQ ID NO: 24:gb:AU028670|GII 768/2002/TUN

SEQ ID NO: 25:gb:BAJ25074|GII Hu/OC07118/2007/JP

SEQ ID NO: 26:gb:AN73762|GN Hu/JP/2011/GN/Yuzawa/Gira2HS

SEQ ID NO: 27:gb:ASW22508|GII.1 Hu/IDN/ITD11-3/2015/GNPg/GIU

SEQ ID NO: 28:gb:BBB86933|GII.2 Hu/GN/JP/2004/GN.P2_GN.2/Tochigi-86

SEQ ID NO: 29:gb:AUD54972|GII Hu/PE/2013/GN.PNA2-GN.NA2/Loreto1257

SEQ ID NO: 30:gb:BAK43275|GII.3 Hu/Tokio/10-1105/2010/JPN

SEQ ID NO: 31:gb:BAG70446|GII.4 Aomori2/2006/JP

SEQ ID NO: 32:gb:AND99841|GII.4 32-15

SEQ ID NO: 33:ab:AEG79288IGII.4 Hu/GII.4/Hong Kong/CUB001/2010/CHN

SEQ ID NO: 34:gb:AQU14484|GII.4 3.10

SEQ ID NO: 35:gb:AQU14462|GII.42.8b

SEQ ID NO: 36:gb:AHH44895|GII.4 Hu/GII.4/paciente_C/2010/USA

SEQ ID NO: 37:gb:AGX85889|GII.4 Hu/GII.4/NIHIC1.8/2012/USA

SEQ ID NO: 38:gb:AHH44878|GII.4 Hu/GII.4/paciente A/2010/USA

SEQ ID NO: 39:gb:BAW33648|GII.4 Hu/GII/3-157/Tokio/1994/JPN

SEQ ID NO: 40:gb:ABD77588|GII.4 Hu/Beijing/CR2905/2004/CHN

SEQ ID NO: 41:gb:AGE99612|GII.4 Hu/GII.4/KL45/1978/MYS

SEQ ID NO: 42:gb:AN73753|GN.5 Hu/JP/2002/GII.P5 GII.5/Saitama/T52

SEQ ID NO: 43:gb:BAN16287|GII.6 Hu/GII.6/Ehime090549/2009/JP

SEQ ID NO: 44:gb:AN73774GN.7 Hu/JP/2010/GN.P7_GN.7/Musashimurayama

SEQ ID NO: 45:qb:ATM5126|GN.8 Hu/JC231/ZS/GD/CHN/2016

SEQ ID NO: 46:gb:AGT39194|GII.12 Hu/GII.12/CGMH39/2010/TW

SEQ ID NO: 47:gb:BAQ94581|GII.13 Hu/GII.13/10N4555/2010/NP

SEQ ID NO: 48:gb:AAN05735|GII.14 Hu/NLV/MH1999/US

SEQ ID NO: 49:gb:AOQ30449|GII.17 E11161

SEQ ID NO: 50:gb:AN73747|GN.17 Hu/JP/2002/GII.P16 GII.17/Saitama/T87

SEQ ID NO: 51:gb:ALP48670|GII.21 Hu/GII.21/CUHK-NS-290/HKG/2014

SEQ ID NO: 52:gb:AUD54981|GII.22 Hu/BD/2012/GN.P22-GN.22/Dhakal940

SEQ ID NO: 53:gb:AUD54978|GII.24 Hu/PE/2014/GNP24-GN.24/Loreto6424

SEQ ID NO: 54:gb:AUD54984|GII.25 Hu/BD/2012/GN.P22-GN.25/Dhaka1928

SEQ ID NO: 55:gb:YP_009237904|GIV.1 Hu/GIV.1/Lake Macquarie/NSW2680/2010/AU

SEQ ID NO: 56:gb:APA31973|GIV.3 Hu/USA/2016/GIV.3/WI7002

SEQ ID NO: 57: Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr

SEQ ID NO: 58: Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr

SEQ ID NO: 59: Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr-Val/Leu/Ile-Asp

SEQ ID NO: 60: Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys- Tyr-Val/Leu/lle-Asp

SEQ ID NO: 61: Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His

Claims

REIVINDICACIONES

2. Una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I del norovirus que tiene una secuencia de aminoácidos en donde el tramo de secuencia de aminoácidos Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr en el dominio P se modifica a Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr, en donde Leu/Val significa Leu o Val, y Arg/lys significa Arg o Lys.

3. La proteína de la cápside de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tramo de secuencia de aminoácidos Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr-Val/Leu/lle-Asp en el dominio P se modifica a Ala-Ala-Leu-Leu/Val-Arg/lys-Tyr-Val/Leu/lle-Asp, en donde Val/Leu/Ile significa Val o Leu o Ile.

4. La proteína de la cápside de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína de la cápside pertenece a cualquiera de los siguientes genotipos del genogrupo I de norovirus: GI.1, GI.2, GI.3, GI.4, GI.5, GI.6, GI.7, GI.8 o GI.9.

5. La proteína de la cápside de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21, excepto porque el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 es Arg o Lys; o dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 5.

6. La proteína de la cápside de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

(ii) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína consiste en o comprende al menos 500 restos de aminoácidos y tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia sobre esta longitud con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21; o

(iii) la secuencia de aminoácidos de dicha proteína tiene de 1 a 50, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30 eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones en comparación con un segmento de secuencia de al menos 500 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 21;

7. La proteína de la cápside de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde

de modo que en los puntos (ii') o (iii'), el resto de aminoácido en la posición correspondiente a Arg472 en la SEQ ID NO: 3 es Arg o Lys.

8. Molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Partícula similar a virus (VLP) que consiste en o comprende la proteína de la cápside de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una composición inmunogénica que comprende la proteína de la cápside como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la VLP de la reivindicación 9 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II de norovirus, o que comprende además una VLP que consiste en o comprende una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II.

12. Una vacuna contra la infección por norovirus, que comprende la composición inmunogénica de la reivindicación 10 u 11, o que comprende la proteína de la cápside como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o que comprende la VLP de la reivindicación 9.

13. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II de norovirus o una VLP que consiste en o comprende una proteína de la cápside VP1 del genogrupo II.

14. La proteína de la cápside como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la VLP de la reivindicación 9, o la vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 para su uso en la prevención o tratamiento de la infección por norovirus en un sujeto, preferentemente un sujeto humano.

15. Un método para aumentar la estabilidad de las VLP del genogrupo I de norovirus, que comprende reemplazar el resto de His en el tramo de secuencia Ala-Ala-Leu-Leu/Val-His-Tyr en el dominio P de una proteína de la cápside VP1 del genogrupo I por Arg o Lys, preferentemente Arg.