ES2951691T3 - Variante de la proteína BPIFB4 - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una variante de la proteína BPIFB4 (familia de proteínas bactericidas/aumentantes de la permeabilidad B, miembro 4) y a su uso para el tratamiento de patologías que implican deterioro de la señalización del óxido nítrico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Variante de la proteína BPIFB4
Campo de la invención
La presente invención se refiere, entre otras cosas, a un polinucleótido que codifica una variante de la proteína BPIFB4 (familia B de proteínas bactericidas/que aumentan la permeabilidad, miembro 4) para su uso en el tratamiento de patologías asociadas con la disfunción endotelial debida a la alteración de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y vasodilatación mediada por óxido nítrico (NO).
Antecedentes de la invención
La BPIFB4 humana (también conocida como C20orf186; RY2G5; LPLUNC4) es un miembro de las proteínas secretadas de la familia de tipo BPI/LBP/PLUNC, que se ha implicado en los procesos de defensa del hospedante contra las bacterias. La proteína existe en dos isoformas diferentes de distinta longitud con secuencias de aminoácidos de 575 (Acc. P-59827-2) y 613 (Acc. EAW76337.1) aminoácidos (Bingle CD et al., Biochem Soc Trans. (2011) 39 (4): 977-83; Andrault J.-B et al., Genomics (2003) 82: 172-184; Bingle C.D. et al., Hum. Mol. Genet. (2002) 11: 937-943; Bingle C.D. et al., Protein Sci. (2004) 13: 422-430).
Se han descrito varios polimorfismos de un solo nucleótido para esta proteína en los siguientes sitios, indicados con referencia a la secuencia de 575 aminoácidos: rs2070325-Ile229Val, rs571391-Asn281Thr, rs7583529Phe488Leu y rs285097-Thr494Ile, lo que puede llevar a la generación de una serie de diferentes variantes de la proteína. Los autores de la presente invención han identificado y caracterizado una serie de variantes de BPIFB4. Después de un análisis minucioso de las fases de los haplotipos (es decir, la combinación de los alelos) de los cuatro polimorfismos descritos anteriormente, los autores de la presente invención han encontrado que el haplotipo más común (65% de los cromosomas analizados) es la combinación AACT que codifica los aminoácidos Ile229/Asn281/Leu488/Ile494 (INLI); el segundo haplotipo más frecuente es la combinación GCTC (30% de los cromosomas contienen este haplotipo) que codifica los aminoácidos Val229/Thr281/Phe488/Thr494 (VTFT) y, finalmente, la combinación de AATC está representada solo en el 2% de los cromosomas caucásicos humanos, que codifica Ile229/Asn281/Phe488/Thr494 (INFT).
El endotelio vascular está formado por una capa de células situadas entre la luz de los vasos y las células de músculo liso vascular. Estas células producen continuamente NO, un gas soluble que es sintetizado por la enzima eNOS. Esta sustancia tiene un papel crucial en la regulación de la homeostasis vascular y la función endotelial, lo que incluye la modulación del tono vascular, la regulación del crecimiento de células locales y la protección del vaso frente a las consecuencias perjudiciales de las plaquetas y las células que circulan en la sangre.
Una lista creciente de afecciones se ha asociado con una disminución en la liberación de óxido nítrico por la pared arterial debido a una síntesis deficiente por eNOS o a una degradación oxidativa excesiva (American Journal of Physiology, Endocrinology and metabolism 1 Mar. 2012; 302(5) y Current Vascular Pharmacology Ene. 2012; 10 (1): páginas 4-18). La mayoría de estas afecciones patológicas están asociadas con el envejecimiento. Por ejemplo, el deterioro de la señalización del óxido nítrico se ha descrito en la angina espástica coronaria (Miyamoto Y et al. Hum Mol Genet. 1 Nov. 2000; 9(18): páginas 2629-37), trombosis (Loscalzo J , Circulation Research., 2001; 88, páginas 756-762), hipertensión pulmonar (D'Uscio LD., Cardiovasc Res 2011, 92 (3), páginas 359-360), preeclampsia (The Lancet, volumen 361, 9368, páginas 1511-1517), vasculitis (Kanwar JR et al., Curr Med Chem. 2009; 16(19): 2373 2394), cáncer (Kanwar JR et al. Curr Med Chem. 2009; 16(19): páginas 2373-2394), trastornos inflamatorios (Kanwar JR et al., Curr Med Chem. 2009; 16(19): páginas 2373-2394), insuficiencia venosa (Forstermann U et al. Circulation.
2006; 113: páginas 1708-1714), en enfermedades genéticas con menor actividad de eNOS y producción de NO, por ejemplo como para las variaciones del gen MTHFR (Lemarie CA et al. al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011, vol.
300: H745-53), hipertensión arterial (Sparacino-Watkins CE et al., Circulation., 2012; vol 125(23), páginas 2824-6; Boger RH et al., Circulation. 2009, vol 119(12), páginas 1592-600), aterosclerosis, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal (Jiang B et al., Hum Gene Ther. 2012; 23(11), páginas 1166-75 Ponnuswamy Pet al. PLoS One.
2012; 7(1):e30193; Vita JA. et al., Circulation. 2011, Vol 124(25), páginas 906-12; Li ZL et al. , PLoS One. 2012, Vol 7(6):e38787), síndrome metabólico (Quyyumi AA et al., Circulation. 1995, Vol 92: páginas 320-326), accidente cerebrovascular (Madden JA. , Neurology. 2012 Sep 25;79(13 Suppl 1):S58-62), infarto de miocardio (Nakata S et al., Circulation. 29 Abr. 2008; Vol 117(17): páginas 2211-23), disfunción eréctil (Bianca Rd et., PLoS One. 2012, Vol 7(2): e31019), enfermedades neurodegenerativas y esclerosis múltiple (Faraci FM., Circulation Research. 2006, Volumen 99, páginas 1029-1030; Wu M, et al., Glia. 2009, Vol 57(11), páginas 1204-15), trastornos cognitivos (Rayatnia et al., Eur J Pharmacol. 2011, Vol 666(1-3), páginas 122-30; Paydar et al., Brain Res. 2011; Vol 1386, páginas 89-99), degeneración retiniana, uveoretinitis, retinopatía vascular, cataratas y glaucoma (Chiou g et al. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. Abril 2001, 17 (2): páginas 189-198, Li Q et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. Oct 2010, 51 (10): páginas 5240-6, Kwak HJ et al., Mol Cells. 31 Oct. 2001 ;12(2):páginas 178-84).
La publicación internacional WO2001/79269 (Grell) describe un polipéptido de 614 aminoácidos de longitud que se dice que es un nuevo polipéptido de la proteína 4 de unión a lípidos.
La menor producción de NO y el consiguiente desequilibrio en la función endotelial se han identificado como uno de
los factores clave responsables de los estados patológicos anteriores. Por lo tanto, se han realizado esfuerzos en la técnica para identificar posibles terapias candidatas para revertir la disfunción endotelial potenciando la liberación de óxido nítrico desde el endotelio.
Además, se ha demostrado que un aumento en la actividad de la eNOS/producción de NO es beneficioso en la fatiga posterior al ejercicio en pacientes con distrofia muscular (Nature. 27 Nov. 2008; 456, páginas 511-515) y en la implantación de endoprótesis para oclusiones vasculares (Sharif F, et al. Mol Ther. Oct.2008; 16 (10): páginas 1674-80.).
Los autores de la presente invención han identificado ahora sorprendentemente que una variante específica de la proteína BPIFB4 está asociada con una longevidad excepcional. Los autores de la invención han encontrado además que la variante identificada sorprendentemente es capaz de aumentar la activación de eNOS y la producción de NO en células endoteliales. Estas propiedades biológicas dependen de la presencia en la proteína de cuatro aminoácidos específicos en las posiciones 229, 281, 488 y 494, ya que la sustitución de cualquiera de estas posiciones con diferentes aminoácidos conduce a la pérdida de actividad de la proteína.
Sumario de la Invención
En consecuencia, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica
(i) una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1;
(ii) una variante de proteína BPIFB4 de la proteína BPIFB4 de (i) que tiene al menos 95% de homología con la de la SEQ ID NO: 1; o
(iii) un fragmento de la proteína de (i) o la variante de (ii),
en donde dicha variante o fragmento de la proteína BPIFB4 comprende una valina en la posición correspondiente a la posición 229 de la SEQ ID NO: 1, una treonina en la posición correspondiente a la posición 281 de la SEQ ID NO: 1, una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 488 de la SEQ ID NO: 1 y una treonina en la posición correspondiente a la posición 494 de la SEQ ID NO: 1 y dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 tiene actividad en el aumento de actividad de la eNOS y/o la producción de NO para uso en terapia.
Dicha homología en la secuencia de aminoácidos es preferiblemente de al menos 99%.
Según una realización particularmente preferida, la proteína codificada por dicho polinucleótido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 1.
Según una realización preferida alternativa, la proteína codificada por dicho polinucleótido tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de SEQ ID NO 1, en donde uno o más aminoácidos en posiciones diferentes de las posiciones 229, 281,488 y 494 de la SEQ ID NO 1 se han sustituido por un aminoácido conservado. Por "aminoácido conservado" se entiende un aminoácido con propiedades funcionales y fisicoquímicas equivalentes a las del aminoácido original.
La invención proporciona además un polinucleótido para usar en terapia en donde el polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína anterior y un vector para usar en terapia que contiene dicho polinucleótido unido operativamente a secuencias de control de la expresión. Según una realización preferida, dicho polinucleótido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.
La descripción también proporciona una célula hospedante que se ha transformada con el vector anterior y es capaz de expresar la proteína codificada por dicho polinucleótido.
En particular, un objeto de la invención es el polinucleótido o vector para uso en la prevención, reducción del riesgo, mejora y/o tratamiento de disfunciones endoteliales debidas a una disminución en la actividad de eNOS y/o en la producción de NO, o de patologías o afecciones donde es beneficioso aumentar la actividad de eNOS y/o la producción de NO. Según una realización preferida, la proteína, polinucleótido o vector anterior es para uso en la prevención, reducción del riesgo, mejora o tratamiento de una patología o afección seleccionada de hipertensión arterial, aterosclerosis, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal, síndrome metabólico, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, disfunción eréctil, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, trastornos cognitivos, degeneración retiniana, uveoretinitis, retinopatía vascular, cataratas, glaucoma, angina espástica coronaria, trombosis, hipertensión pulmonar, preeclampsia, vasculitis, cáncer, trastornos inflamatorios, insuficiencia venosa, enfermedades genéticas con actividad de eNOS y producción de NO reducidas, por ejemplo, variaciones del gen MTHFR, fatiga posterior al ejercicio en pacientes con distrofia muscular. Según una realización preferida adicional, el polinucleótido o vector anterior se usa como coadyuvante en la implantación de una o más endoprótesis, preferiblemente medicadas, para oclusiones vasculares.
Finalmente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de la descripción en combinación con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las
reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia del vector pRK5 que codifica INFT hBPIFB4 (SEQ ID NO: 3) o VTFT hBPIFB4 (SEQ ID NO: 1) usado en el Ejemplo 3, con la secuencia de la proteína BPIFB4 subrayada y la de EGFP en cursiva.
La Figura 2 muestra la detección de la proteína fluorescente verde en vasos mesentéricos perfundidos ex vivo con un plásmido que codifica INFT BPIFB4 (panel izquierdo) o un plásmido pRK5 vacío de control (panel derecho) en el Ejemplo 3.
La Figura 3 representa la expresión de la proteína BPIFB4 y la activación de la eNOS en vasos mesentéricos perfundidos con un vector vacío (EV), un plásmido que codifica INFT hBPIFB4 o VTFT hBPIFB4. El panel a muestra una transferencia Western de siete experimentos combinados y la detección de BPIFB4 (arriba) y P-eNOS S1177 (centro). El panel b muestra la cuantificación de la expresión de BPIFB4 y el panel c muestra la cuantificación de la fosforilación en la serina 1177 de eNOS.
Figuras 4, 5 y 6: los paneles 4a, 5a y 6a representan la vasoconstricción inducida por KCI observada en el ejemplo 3 en vasos mesentéricos perfundidos ex vivo con un plásmido vacío plásmido pRK5 (EV/Fig. 4a), un plásmido pRK5 que codifica INFT hBPIFB4 (INFT/Fig. 5a) o un plásmido pRK5 que codifica VTFT hBPIFB4 (VTFT/Fig. 6a). Los paneles 4b, 5b y 6b representan la vasoconstricción inducida por fenilefrina observada en el ejemplo 3 en vasos mesentéricos perfundidos ex vivo con un plásmido vacío plásmido pRK5 (EV/Fig. 4b), un plásmido pRK5 que codifica INFT hBPIFB4 (INFT/Fig. 5b) o un plásmido pRK5 que codifica VTFT hBPIFB4 (VTFT/Fig. 6b). Los paneles 4c, 5c y 6c representan la vasodilatación inducida por acetilcolina observada en el ejemplo 3 en vasos mesentéricos perfundidos ex vivo con un plásmido vacío plásmido pRK5 (EV/Fig. 4c), un plásmido pRK5 que codifica INFT hBPIFB4 (INFT/Fig. 5c) o un plásmido pRK5 que codifica VTFT BPIFB4 (VTFT hBPIFB4/Fig. 6c). Los resultados observados con el plásmido que codifica VNFT hBPIFB4 (SEQ ID NO: 4), ITFT hBPIFB4 (SEQ ID NO: 5), VTLI hBPIFB4 (SEQ ID NO: 6) e INLI hBPIFB4 (SEQ ID NO: 7), observados en la vasoconstricción inducida por KCI, vasoconstricción inducida por fenilefrina o vasodilatación inducida por acetilcolina en vasos mesentéricos perfundidos son superponibles a los obtenidos con el vector vacío. (Datos no mostrados).
Figuras 7 y 8: los paneles 7a y 8a representan el efecto del inhibidor de eNOS L-NAME sobre la relajación inducida por acetilcolina de los vasos perfundidos ex vivo o con un plásmido pRK5 vacío (EV/Fig. 7a) o un plásmido pRK5 que codifica VTFT hBPIFB4 mutado (VTFT/Fig. 8a). El panel 8b representa la recuperación de la vasorrelajación de vasos de ratones con inactivación de la metilentetrahidrofolato reductasa (Mthfr+/-), de control (Mthfr+/+) y ratones con inactivación tratados con plásmido pRK5 vacío ((Mthfr /- EV) (Fig. 7b) o un plásmido pRK5 que codifica VTFT hBPIFB4 ((Mthfr+/- - M) (Fig. 8b).
Figura 9: el panel a) muestra una RT-PCR que demuestra la inducción de la expresión de BPIFB4 por H2O2 en células HEK293T. El panel b) muestra una transferencia Western de la fosforilación en eNOS en la Ser1177 en células HEK293T que expresan VTFT hBPIFB4 (VTFT) y en células que sobreexpresan INFT hBPIFB4 (INFT) o en las expuestas a un vector vacío (EV). El panel c), parte superior, muestra las OD normalizadas respecto a actina p.
Descripción detallada de la invención
Un primer objeto de la presente invención es un polinucleótido que codifica
(i) una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1;
(ii) una variante de proteína BPIFB4 de la proteína BPIFB4 de (i) que tiene al menos 95% de homología con la de la SEQ ID NO: 1; o
(iii) un fragmento de la proteína de (i) o la variante de (ii),
en donde dicha variante o fragmento de proteína BPIFB4 comprende una valina en la posición correspondiente a la posición 229 de la SEQ ID NO: 1 (en lo sucesivo denominada valina 229), una treonina en la posición correspondiente a la posición 281 de la SEQ ID NO: 1 (en lo sucesivo denominada treonina 281), una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 488 de la SEQ ID NO: 1 (en lo sucesivo denominada fenilalanina 488) y una treonina en la posición correspondiente a la posición 494 de la SEQ ID NO: 1 (en lo sucesivo denominada treonina 494) y dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 tiene actividad en el aumento de actividad de eNOS y/o la producción de NO para su uso en terapia..
Preferiblemente, dicha homología es de al menos 99%.
La secuencia de aminoácidos de la variante de proteína BPIFB4 puede diferir de la de SEQ ID NO: 1 debido a la presencia de adiciones, deleciones o sustituciones adicionales de aminoácidos.
Sin embargo, una característica esencial de la variante es que contiene los cuatro aminoácidos mencionados anteriormente. En el caso de homólogos que difieren de la SEQ ID NO: 1 debido a deleciones o adiciones de
aminoácidos, los cuatro aminoácidos anteriores están presentes en la posición que corresponde a su posición original en la SEQ ID NO: 1. En el caso de homólogos que difieren de la SEQ ID NO: 1 debido a la sustitución de aminoácidos, los cuatro aminoácidos anteriores están presentes en la misma posición que en la SEQ ID NO: 1. Según una realización preferida, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO 1, en donde uno o más aminoácidos en posiciones diferentes de las posiciones 229, 281, 488 y 494 de la SEQ ID NO 1 se han sustituido por un aminoácido conservado. Por "aminoácido conservado" se entiende un aminoácido con propiedades funcionales y fisicoquímicas equivalentes a las del aminoácido original.
Las proteínas particularmente preferidas tienen la secuencia de aminoácidos de proteínas BPIFB4 conocidas identificadas en Homo Sapiens (SEQ ID NO: 1) y Pan Troglodytes (Acc N XP525303) que se ha modificado para que comprenda una valina en la posición correspondiente a la posición 229 de la SEQ ID NO: 1, una treonina en la posición correspondiente a la posición 281 de la SEQ ID NO: 1, una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 488 de la SEQ ID NO: 1 y una treonina en la posición correspondiente a la posición 494 de la SEQ ID NO: 1.
Según una realización particularmente preferida, la proteína BPIFB4 codificada por el polinucleótido para usar en la terapia de la invención tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1. Una proteína que tenga tal secuencia se denominará en lo sucesivo VTFT hBPIFB4.
Un segundo objeto de la presente invención es un polinucleótido para uso en la terapia de la invención que codifica una proteína que tiene una secuencia que consiste en la secuencia de aminoácidos de una proteína, variante o fragmento de BPIFB4 de la descripción unida a una secuencia de aminoácidos adicional capaz impartir a la proteína propiedades particularmente ventajosas. Preferiblemente, dicha secuencia de aminoácidos adicional es útil para identificar dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 o para dirigir dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 a un órgano o tejido específico. Preferiblemente dicha proteína es una proteína quimérica.
Tal como se describirá en detalle en la sección experimental, los autores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que la VTFT hBPIFB4 anterior está asociada con una longevidad excepcional en tres poblaciones independientes. Los autores de la presente invención han demostrado además que el efecto beneficioso de la proteína mutante sobre la esperanza de vida es una consecuencia de su capacidad para modular las disfunciones vasculares asociadas con el envejecimiento. Tal como se demuestra en la sección experimental, esta modulación depende de la presencia de los cuatro aminoácidos específicos en las posiciones correspondientes a las posiciones 229, 281,488 y 494 de la SEQ ID NO: 1 en la VTFT hBPIFB4 de la descripción.
Como se muestra en el Ejemplo 3, los vasos mesentéricos de ratón se perfundieron ex vivo con un plásmido vacío o plásmidos que codifican VTFT hBPIFB4 o proteínas que difieren de VTFT hBPIFB4 en que muestran varias sustituciones en los 4 aminoácidos relevantes: INFT hBPFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene isoleucina y una asparagina en las posiciones 229 y 281, respectivamente, VNFT hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene una asparagina en la posición 281, ITFT hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O: 5, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene isoleucina en la posición 229, VTLI hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene una leucina en la posición 488 y una isoleucina en la posición 494, INLI hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, que se difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene isoleucina en la posición 229, asparagina en la posición 281, leucina en la posición 488 y una isoleucina en la posición 494. Mientras que VNFT hBPIFB4, ITFT hBPFB4, VTLI hBPIFB4 e INLI hBPIFB4 no mostraron ningún efecto sobre la función vascular e INFT hBPIFB4 inhibió fuertemente cualquier función vascular, bloqueando tanto la vasoconstricción como la vasodilatación, la proteína VTFT BPIFB4 mostró un efecto débil de inhibición de la vasoconstricción y una mejora importante de la vasodilatación. Se ha demostrado que este efecto es mediado por la activación de eNOS a través de la fosforilación en la serina 1177 y, por lo tanto, se asocia con un aumento en la liberación de NO por las células endoteliales. La capacidad de VTFT hBPIFB4 para inducir la activación de eNOS se ha corroborado en la línea celular HEK293T (Ejemplo 5).
Los datos anteriores también se han confirmado adicionalmente en un modelo animal de enfermedad vascular asociada con una producción deficiente de NO, los ratones con inactivación de Mthfr heterocigóticos, en donde se ha demostrado que la transfección de la proteína VTFT hBPIFB4 restablece la liberación de NO y la respuesta de vasodilatación dependiente del endotelio (Ejemplo 4).
Otro objeto de la presente descripción es un fragmento de la proteína BPIFB4 o variante de la descripción que tiene una secuencia que comprende las mencionadas antes valina 229, treonina 281, fenilalanina 488 y treonina 494.
Gracias a su actividad biológica, la mencionada antes variante de proteína, proteína o fragmento de BPIFB4 de la descripción puede usarse ventajosamente en la prevención, reducción del riesgo, mejora y/o tratamiento de afecciones patológicas del endotelio debidas a la disminución de la producción de NO o actividad de eNOS o de patologías o afecciones donde es beneficioso incrementar la actividad de eNOS y/o la producción de NO.
Por lo tanto, un objeto adicional de la descripción es la mencionada antes variante de proteína, proteína o fragmento de BPIFB4 para uso en terapia.
Preferiblemente, la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento descrito en el presente documento son para usar en la prevención, reducción del riesgo, mejora y/o tratamiento de una disfunción endotelial debida a la liberación de NO de las células endoteliales por debajo de los niveles fisiológicos o una disminución de la actividad de eNOS o en situaciones clínicas en donde es beneficioso obtener un aumento en la activación de eNOS y/o en la producción de NO. Según una realización preferida de la descripción, dicha variante de proteína BPIFB4, dicha proteína o dicho fragmento de la descripción son para usar en la prevención, reducción del riesgo, mejora o tratamiento de una patología seleccionada de hipertensión arterial, aterosclerosis, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal, síndrome metabólico, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, disfunción eréctil, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, trastornos cognitivos, degeneración retiniana, uveoretinitis, retinopatía vascular, cataratas, glaucoma, angina espástica coronaria, trombosis, hipertensión pulmonar, preeclampsia, vasculitis, cáncer, trastornos inflamatorios, insuficiencia venosa, enfermedades genéticas con actividad de eNOS reducida y producción de NO, por ejemplo, variaciones del gen MTHFR.
Según una realización alternativa preferida de la descripción, dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 es para usar en la mejora de la fatiga posterior al ejercicio en pacientes con distrofia muscular y como coadyuvante en la implantación de una o más endoprótesis, preferiblemente medicadas, para oclusiones vasculares.
La variante de la proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento según la descripción se puede administrar a un sujeto que lo necesite, afectado por una de las patologías anteriores o en las afecciones clínicas anteriores, por administración oral, nasal, endovenosa, tópica, intraocular o retroocular.
Por consiguiente, otro objeto de la descripción es una composición farmacéutica, preferiblemente adecuada para la administración oral, nasal, endovenosa, tópica, intraocular o retroocular, que comprende la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento de la descripción en mezcla con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones adecuadas para la composición farmacéutica de la descripción son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, por último de Babizhayev MA. Drug Testing and Analysis, Volumen 4, Número 6, páginas 468-485, junio de 2012).
Una formulación farmacéutica particularmente adecuada para la administración de la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento según la descripción se basa en copolímeros sintéticos, que usan estructuras poliaminoacídicas y polisacáridas, capaces de formar complejos físicos reversibles con la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento de la misma por interacciones electrostáticas, hidrófobas u otras interacciones físicas, y generar nanoagregados a partir de los cuales se libera la proteína o el fragmento en forma intacta después de la administración. (Díaz-Fernández YA et al., Biosens Bioelectron. 15 sep. 2010; 26 (1): 29-35).
Otro objeto de la presente descripción es un polinucleótido, preferiblemente un polinucleótido de ADN, que codifica la secuencia de aminoácidos de la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el polipéptido según la presente descripción. Según una realización preferida, dicho polinucleótido tiene una secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de un fragmento de la misma que comprende los nucleótidos que codifican dicha valina 229, treonina 281, fenilalanina 488 y treonina 494.
El polinucleótido anterior se puede usar con el fin de obtener la expresión de la proteína o polipéptido mutado en células hospedantes in vitro, ex vivo o in vivo por medio de un vector de expresión adecuado que lo comprende.
Por lo tanto, otro objeto de la descripción es un vector que contiene dicho polinucleótido de la descripción unido operativamente a secuencias de control de la expresión.
Según una realización preferida, la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento de la descripción se produce de forma recombinante en células hospedantes transfectadas con dicho vector anterior. Según esta realización, el vector de la descripción es preferiblemente uno que es adecuado para la producción de alto rendimiento de la proteína o polinucleótido. Por ejemplo, el vector pcDNA™ 3.3-TOPO® se puede usar para la expresión de alto nivel de la proteína de la descripción en células adherentes de cultivo de tejidos de mamíferos después de la transfección transitoria o la expresión de alto nivel de proteína secretada usando los sistemas FreeStyle™ MAX CHO y FreeStyle™ MAX 293 (Invitrogen INC.).
Por lo tanto, otro objeto de la presente descripción son células hospedantes transfectadas con el vector de la descripción mencionado antes.
Otro objeto de la descripción es un método para producir de forma recombinante la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento según la descripción que comprende el cultivo de dichas células hospedantes anteriores en condiciones que permiten la expresión de la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento y la recuperación de dicha variante de proteína BPIFB4, proteína o fragmento.
De forma alternativa a la administración directa como tal, la variante de proteína BPIFB4, la proteína o el fragmento de la descripción pueden expresarse en el tejido diana después de la administración, preferiblemente por vía endovenosa, subcutánea, intraocular o retroocular, en un sujeto que lo necesite de un vector según la presente descripción, que es adecuado para inducir la expresión en dicho tejido diana de la proteína o polipéptido mutado. El
tejido diana puede diferir dependiendo de la patología que se va a tratar y puede ser, por ejemplo, el tejido endotelial, el tejido del hígado, corazón, riñón, ojo o músculo.
Según esta realización, el vector de la descripción es uno que preferiblemente es adecuado para la transfección de las células del tejido diana de interés después de la administración endovenosa.
Según una realización particularmente preferida, dicho vector es un vector viral, preferiblemente un vector de adenovirus, más preferiblemente un vector seleccionado de vectores de los serotipos 1-9 de AAV, basado en la especificidad por el tejido diana de interés (Varadi K, et al., Gene Ther. (2012); 19 (8):800-9; Zincarelli C et al., Mol Ther. (2008), 16(6): 1073-80, Diaz-Fernandez YA et al., Oligonucleotides. 2010; 20(4): 191-8.).
Por lo tanto, un tercer objeto de la invención es el polinucleótido o vector de la descripción mencionado antes para usar en terapia. Preferiblemente, dicho polinucleótido o vector es para uso en la prevención, reducción del riesgo, mejora o tratamiento de una disfunción endotelial debida a la liberación de NO de las células endoteliales por debajo de los niveles fisiológicos o una disminución en la actividad de eNOS o en afecciones en donde es beneficioso para obtener un aumento en la activación de eNOS y/o en la producción de NO. Según una realización preferida de la invención, dicho polinucleótido o vector es para uso en la prevención, reducción del riesgo, mejora o tratamiento de una patología o afección seleccionada de hipertensión arterial, aterosclerosis, hipertensión, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal, síndrome metabólico, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, disfunción eréctil, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, trastornos cognitivos, degeneración retiniana, uveoretinitis, retinopatía vascular, cataratas, glaucoma, angina espástica coronaria, trombosis, hipertensión pulmonar, preeclampsia, vasculitis, cáncer, trastornos inflamatorios, insuficiencia venosa, enfermedades genéticas con actividad de eNOS reducida y producción de NO, por ejemplo, variaciones del gen MTHFR.
Según una realización alternativa preferida de la invención, dicho polinucleótido o vector es para uso en la mejora de la fatiga posterior al ejercicio en pacientes con distrofia muscular y como coadyuvante en la implantación de una o más endoprótesis, preferiblemente medicadas, para oclusiones vasculares. Un cuarto objeto de la invención es una composición farmacéutica, preferiblemente adecuada para administración endovenosa, subcutánea, intraocular o retroocular, que comprende un vector según la invención mezclado con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones adecuadas para la composición farmacéutica de la invención son bien conocidas en la técnica. Como un ejemplo, se pueden usar nanosistemas basados en polímeros o nanosistemas de policomplejos para administrar el vector de la descripción (Murano E et al., Nat Prod Commun. (2011), 6(4): 555-72, Moustafine RI et al., Int J Pharm. 2012 Oct 3)..
La dosis media diaria de la variante de proteína BPIFB4 o el fragmento o vector de la descripción dependerá de diversos factores, tales como la gravedad de la enfermedad y las condiciones del paciente (edad, sexo y peso). El experto en la técnica puede usar medios técnicos bien conocidos en la técnica para encontrar la cantidad de la dosis y la pauta correctas con el fin de asegurar el tratamiento óptimo en cada afección patológica particular.
La presente invención se ilustrará mejor mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de la proteína VTFT hBPIFB4 en tres poblaciones independientes
Un estudio de asociación del genoma completo (GWAS, por sus siglas en inglés Genome Wide Association Study) publicado recientemente sobre una población de centenarios del Sur de Italia (SIC) ha identificado una serie de variantes genéticas asociadas con individuos longevos (Malovini y al., Rejuvenation Research 2011; vol. 14 (3), páginas 283-291).
Con el fin de validar las cuatro variaciones principales descritas en ese estudio (p≤1x10-4), se llevó a cabo un intento de replicación en una primera cohorte de replicación reclutada para el Estudio de Centenarios Alemanes (Keidorp et al.; Aging Cell2011; vol. 10, páginas 622-8), que comprende 1.447 individuos longevos (LLI) (intervalo de edad de 95 110 años, media de edad 98,8 años) y 1.029 controles más jóvenes (intervalo de edad 60-75 años y media de edad 66,8 años). Por lo tanto, mediante el análisis de Taqman se ensayaron dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) no sinónimos, rs2070325 y rs571391, y dos marcadores intrónicos, rs7583529 y rs285097, que marcan las variantes funcionales rs7917 y rs1695501.
En detalle, se extrajo ADN de sangre periférica (kit QIAamp DNA midi blood, Qiagen) de los individuos y se genotipificó con sonda TaqMan en PCR en tiempo real en ABI 7900HT (Applied Biosystems). Para el cribado, se usaron las siguientes sondas:
hCV25757827 para rs2070325;
hCV958887 para rs571391;
hCV28993331 para rs7583529; y
hCV3073023 para rs285097.
El análisis de los datos se realizó con Sequence Detection Systems (Applied Biosystems).
Los métodos y procedimientos estadísticos aplicados al análisis de datos que se derivan de la exploración completa del genoma se describen en Malovini A et al., Rejuvenation Res 2011, vol. 14, páginas 283-91.
De las cuatro variantes ensayadas, solo rs2070325, que produce el cambio de aminoácido Ile229Val en BPIFB4, replicó la asociación observada en la cohorte de SIC bajo el modelo genético recesivo (OR=2,42, IC al 95% =1,56-3,77, p=5,98 x 10-5) en este conjunto de LLI (OR=1,42, lC al 95% =1,12-1,80, p=5,3 x 10-3, ajuste de Bonferroni p=0,021).
Después en esta variante se ensayó por análisis de Taqman, tal como se describió anteriormente, la asociación en un segundo conjunto, representado por una colección basada en EE. UU. de 1.461 LLI (intervalo de edad de 91-119 años, media de edad 100,8) y 526 controles (intervalo de edad de 0-35 años, media de edad 28,2). La regresión logística confirmó la asociación del SNP anterior también en este segundo conjunto de replicación (OR: 1,62, IC al 95%=1,15-2,27, p=3,7 x 10-3).
El metaanálisis de los resultados de la asociación se realizó mediante el paquete "meta" implementado en R (http://cran.r-project.org/web/packages/meta/index.html). La anotación posicional y funcional de los SNP identificados se realizó mediante el recurso en línea SNPNexus.
Los resultados del metaanálisis, combinando los estadísticos de asociación que derivan de la evaluación de este marcador en los conjuntos de replicación de Alemania y EE. UU., no pusieron de manifiesto heterogeneidad estadísticamente significativa entre los OR estimados en las dos poblaciones (estadístico Q, p>0,05; índice de heterogeneidad, I2=0%). De acuerdo con estas observaciones, los estadísticos de asociación se combinaron asumiendo un modelo de efectos fijos (OR = 1,49; IC al 95 % = 1,22-1,81; p ≤ 1 x 10-4).
Ejemplo 2: Análisis de haplotipos del locus de BPIFB4
Los análisis de haplotipos pusieron de manifiesto patrones de fuerte desequilibrio de unión (LD) dentro del locus genómico de BPIFB4, delimitando una región que está altamente enriquecida en SNP no sinónimos (Fig. S1 en el Apéndice Suplementario). La variación rs2070325 (Ile229Val) de los marcadores de BPIFB4 rs2889732 (Asn288Thr), rs11699009 (Leu488Phe) y rs11696307 (Ile494Thr).
La estructura tridimensional de BPIFB4 humana se predijo por modelización de homología con el programa I-TASSER (REF: Ambrish Roy, Alper Kucukural, Yang Zhang. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nature Protocols, vol 5, 725-738 (2010).) utilizando como molde la proteína BPI de PDB (código 1EWF). Se consideraron todos los modelos en el análisis estructural visual, realizado con el programa PyMOL Versión 1.2r3pre, Schrodinger, LLC (Molecular Graphics System). El análisis anterior puso de manifiesto que tanto Ile268Val como Asn320Thr están ubicados en un sitio de posible interacción proteína-proteína. Para evaluar los efectos de las variaciones, los autores de la invención predijeron la estructura de las proteínas BPIFB4 de tipo natural (WT) y mutadas (Ile229Val, Asn281Thr, Leu488Phe, Ile494Thr) mediante modelización de homología. BPIFB4 es estructuralmente muy similar a BPI y CETP, para las cuales están disponibles las estructuras experimentales y, debido a sus similitudes estructurales, los autores de la invención pensaron que era razonable esperar que BPIFB4 se una a lipopolisacáridos en regiones que son similares a las de las otras dos proteínas. El análisis estructural de los autores de la invención puso de manifiesto que Leu488Phe está ubicada en un bolsillo de unión a lípidos cuyo tamaño se predice que disminuirá como consecuencia de la mutación. La mutación Ile494Thr se sitúa en un segundo bolsillo de unión a lípidos, cuya hidrofobicidad disminuye por la sustitución. En los dos casos, la mutación puede producir una disminución de la capacidad para unir lípidos.
En contraste, Ile229Val y Asn281Thr están situadas lejos de los sitios de unión de lípidos de las proteínas estructuralmente homólogas, por lo que probablemente afectan a funciones tales como la interacción con otras proteínas, en lugar de la unión de lípidos.
Ejemplo 3: Reactividad de los vasos ex vivo frente a INFT hBPIFB4 y VTFT hBPIFB4
Para determinar el papel de la variante de BPIFB4 específica identificada en la función de los vasos, los autores de la invención estudiaron los efectos de la transfección ex vivo de vasos mesentéricos de ratón con un vector pRK5 que codifica VTFT hBPIFB4 o proteínas que difieren de VTFT hBPIFB4 en que muestran varias sustituciones en los 4 aminoácidos relevantes: INFT hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene isoleucina y una asparagina en las posiciones 229 y 281, respectivamente, VNFT hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene una asparagina en la posición 281, ITFT hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene isoleucina en la posición 229, VTLI hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene una leucina en la posición 488 y una isoleucina en la posición 494 e INLI hBPIFB4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, que difiere de la de VTFT hBPIFB4 en que contiene Isoleucina en la posición 229, Asparagina en la posición 281, Leucina
en la posición 488 y una Isoleucina en la posición 494. La secuencia de los vectores pRK5 utilizados se da en la Figura 1 (a, secuencia del vector que codifica wtBPIFB4 y GFP y b, secuencia del vector que codifica VTFT hBPIFB4 y GFP) Se transfectaron ramas de segundo orden del árbol arterial mesentérico de ratones C57BL6 como se describió anteriormente (Vecchione C et al., J Exp M ed2005; Vol. 201, páginas 1217-28).
En resumen, los vasos (n = 7) se pusieron en un sistema de presión Mulvany lleno de solución de Krebs a la que se añadieron 20 gg de un vector pRK5 que codifica INFT o VTFT hBPIFB4. Se usó un plásmido vacío como control negativo. Los vasos se perfundieron a 100 mmHg durante 1 hora y a continuación a 60 mmHg durante 5 horas.
La eficacia de la transfección se evaluó por la presencia de la coexpresión de la proteína fluorescente verde (GFP) (Fig. 2) y por transferencia Western.
En detalle, el análisis de transferencia Western se realizó en extractos de proteínas de vasos perfundidos transfectados (n = 7 para cada vector). Los extractos de proteínas se separaron en SDS-PAGE al 10% a 100 V durante 1 h o en SDS-PAGE al 4-12% a 100 V durante 2 h y a continuación se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Las membranas se incubaron durante toda la noche con los siguientes anticuerpos primarios: anti-fosfo-Ser1177 eNOS (Cell Signaling, mAb de conejo, 1:1.000), anti-BPIFB4 (Abcam, Ab policlonal de conejo, 1:200) y anti-p-actina (Cell Signaling, mAb de ratón, 1:3.000). Las membranas se lavaron tres veces y a continuación se incubaron durante 1 o 2 h con el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo unido a peroxidasa de rábano picante o anti-IgG de ratón, Amersham Life Science) a una dilución de 1:3.000. A continuación, se lavó la membrana cuatro veces y se detectaron bandas de proteínas específicas con agentes quimioluminiscentes ECL Prime (Amersham Life Science). Los datos de la transferencia Western se analizaron usando el software Imaged (desarrollado por Wayne Rasband, National Institutes of Health, EE. UU.) para determinar la densidad óptica (OD) de las bandas. La lectura de la OD se normalizó respecto a p-actina para tener en cuenta las variaciones en la carga.
Tal como se muestra en la Figura 3, la proteína BPIFB4 se detectó abundantemente en los vasos después de la perfusión con plásmidos que codifican INFt hBPIFB4 o VTFT hBPIFB4 tanto de tipo natural como de VTFT hBPIFB4 que se expresa en cantidades comparables. Por el contrario, los vasos expuestos a plásmidos vacíos expresaron un nivel bajo de proteína BPIFB4 natural.
Además, los vasos que expresan VTFT hBPIFB4 pero no INFT hBPIFB4 mostraron una inducción fuerte de la fosforilación de eNOS en la serina 1177, un sitio de activación de la enzima.
La vasoconstricción se evaluó con KCl (80 mM) y dosis crecientes de fenilefrina (de 10-9 M a 10-6 M), como el porcentaje de cambio en el diámetro de la luz después de la administración del fármaco. Las respuestas vasculares se ensayaron antes y después de la transfección. Las relajaciones independientes y dependientes del endotelio se evaluaron midiendo las respuestas dilatadoras de las arterias mesentéricas a las concentraciones acumuladas de acetilcolina (de 10-9 M a 10-5 M) y nitroglicerina (de 10-9 M a 10-5 M), respectivamente, en vasos precontraídos con fenilefrina en una dosis necesaria para obtener un nivel similar de precontracción en cada anillo (80% de la contracción inicial inducida por KCl). La contracción máxima provocada por la fenilefrina se consideró el valor base para las vasorrelajaciones provocadas posteriores. Se tomaron precauciones para no dañar el endotelio: la integridad funcional se reflejó en la respuesta a la acetilcolina (10-6 M).
La sobreexpresión de INFT hBPIFB4 casi suprimió las vasoconstricciones inducidas por KCl y fenilefrina que podían ser provocadas antes de la exposición a los plásmidos (fig. 5a). La ausencia de vasoconstricción significativa impidió la evaluación posterior de la vasorrelajación. En contraste, la expresión de VTFT hBPIFB4 rescató parcialmente los efectos inhibitorios ejercidos por INFT hBPIFB4 sobre las vasoconstricciones inducidas por KCI y fenilefrina: de hecho, las respuestas vasculares provocadas por los agonistas se redujeron cuando se compararon con las observadas antes de la perfusión, pero no se eliminaron (fig. 6a-6b). Además, tras la expresión de VTFT hBPIFB4 se produjo una mejora significativa en la vasodilatación de los vasos inducida por acetilcolina en comparación con la observada antes de la transfección (fig. 6c), pero no hubo diferencias en la relajación del músculo liso provocada por nitroglicerina (datos no mostrados), lo que indica que este efecto se debe a una mejora en la función endotelial. No se observó ningún efecto sobre la función vascular con VNFT hBPIFB4, ITFT hBPIFB4, VTLI hBPIFB4 e INLI hBPIFB4.
Los autores de la invención examinaron el efecto de L-NAME, un inhibidor de la eNOS, en los vasos transfectados con un vector vacío (Fig. 7, panel a, EV) o plásmidos que codifican VTFT hBPIFB4 (Fig. 8, panel a, VTFT). Como se esperaba, L-NAME mitigó el efecto vasodilatador de la acetilcolina en los vasos perfundidos con plásmidos vacíos, y este efecto fue más pronunciado en los vasos que expresaban VTFT hBPIFB4, lo que indica la presencia de más NO en esta última condición.
Ejemplo 4: Efecto de VTFT hBPIFB4 en el modelo in vivo de enfermedad vascular debido a la deficiencia de la liberación de NO
Los experimentos descritos anteriormente también se realizaron en vasos mesentéricos de ratones Mtfr heterocigóticos y su control, tal como se describe en Lemarie CA et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol2011; Vol 300: H745-53. Los ratones Mthfr /- muestran disfunción de la eNOS que está asociada con la regulación por disminución del factor de longevidad surtuina 1. Por lo tanto, se exploró el efecto de VTFT hBPIFB4 en los vasos mesentéricos de
estos ratones. Tal como se esperaba, la vasorrelajación inducida por acetilcolina se redujo significativamente en ratones Mthfr+/- en comparación con crías de la misma camada Mthfr+/+ después de la exposición a EV (Fig. 7, panel b), pero no se observaron diferencias en las respuestas vasculares provocadas por nitroglicerina (datos no mostrados). Después de la exposición a los plásmidos que codifican VTFT hBPIFB4 Mthfr+/- - VTFT, la relajación endotelial de los vasos Mthfr+/- mejoró significativamente, haciéndose comparable a la observada en los vasos Mthfr++ (fig. 8b). Esto indica que VTFT hBPIFB4 puede tener fuertes efectos terapéuticos en la lucha contra la disfunción vascular (Fig. 8, panel b).
Ejemplo 5: Evaluación de la modulación de la eNOS por BPIFB4 en células Hek293T
Células renales embrionarias humanas (HEK293T) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) y aminoácidos no esenciales al 1% al 37% en una atmósfera de CO2 al 5%. Las células se sembraron en placas a razón de 0,25 x 106 por pocillo en placas de seis pocillos, y 24 horas después de la siembra en placas se transfectaron usando 10 gl de Lipofectamina 2000 (LifeTechnologies) y 4 gg de plásmidos. Después de 24 h, las células se mantuvieron privadas de suero durante 24 h. Durante la privación de suero, las células transfectadas se trataron con H2O2400 gM durante 24 h. La transcripción de BPIFB4 se detectó por extracción de las células del ARN total con TRIzol (Ambion), retrotranscripción (iScript BioRad). El ADNc se amplificó con cebadores específicos para BPIFB4 (Directo: CTCTCCCCAAAATCCTCAACA, Inverso: AGCCTCTCTGGGACTGGTTC) y GAPDH (Directo: GTGAAGGTCGGAGTCAACG, Inverso: GGTGGAATCATATTGGAACATG).
La transcripción de BPIFB4 podía ser inducida en células HEK293T tras la exposición a H2O2 : esto demuestra un papel de BPIFB4 en la respuesta al estrés (Fig. 9, panel a). Por lo tanto, los autores de la invención exploraron el modo en que BPIFB4 afectaba a la fosforilación mediada por el estrés de eNOS en la serina 1177.
Los extractos de proteínas se separaron en SDS-PAGE al 10% a 100 V durante 1 h o en SDS-PAGE al 4-12% a 100 V durante 2 h y a continuación se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Las membranas se incubaron durante toda la noche con los siguientes anticuerpos primarios: anti-fosfo-Ser1177 eNOS (Cell Signaling, mAb de conejo, 1:1.000) y anti-p-actina (Cell Signaling, mAb de ratón, 1:3.000). Las membranas se lavaron tres veces y a continuación se incubaron durante 1 o 2 h con el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo unido a peroxidasa de rábano picante o anti-IgG de ratón, Amersham Life Science, 1:3.000). A continuación las membranas se lavaron cuatro veces y se detectaron bandas de proteínas específicas con agentes quimioluminiscentes ECL Prime (Amersham Life Science). Los datos de la transferencia Western se analizaron usando el software Imaged (desarrollado por Wayne Rasband, National Institutes of Health, EE. UU.) para determinar la densidad óptica (OD) de las bandas. La lectura de la OD se normalizó respecto a p-actina para tener en cuenta las variaciones en la carga.
Tal como se muestra en la Figura 9, panel b y c, eNOS se activó más tras la exposición a H2O2 en células HEK293T que expresaban VTFT hBPIFB4 en comparación con células que sobreexpresaban INFT hBPIFB4. Este resultado corroboraba el obtenido sobre la activación de eNOS con la perfusión de vasos ex vivo.
Claims (14)
1. Un polinucleótido que codifica
(i) una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1;
(ii) una variante de proteína BPIFB4 de la proteína BPIFB4 de (i) que tiene al menos 95% de homología con la de la SEQ ID NO: 1; o
(iii) un fragmento de la proteína de (i) o la variante de (ii),
en donde dicha variante o fragmento de proteína BPIFB4 comprende una valina en la posición correspondiente a la posición 229 de la SEQ ID NO: 1, una treonina en la posición correspondiente a la posición 281 de la SEQ ID NO: 1, una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 488 de la SEQ ID NO: 1 y una treonina en la posición correspondiente a la posición 494 de la SEQ ID NO: 1 y dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 tiene actividad en el aumento de actividad de la eNOS y/o la producción de NO para uso en terapia.
2. Un polinucleótido según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido es para usar en (i) la prevención, reducción del riesgo, mejoría o tratamiento de una patología seleccionada de hipertensión arterial, aterosclerosis, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal, síndrome metabólico, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, disfunción eréctil, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, trastornos cognitivos, degeneración de la retina, uveorretinitis, retinopatía vascular, cataratas, glaucoma, angina espástica coronaria, trombosis, hipertensión pulmonar, preeclampsia, vasculitis, cáncer, trastornos inflamatorios, insuficiencia venosa; o (ii) para la mejoría de la fatiga posterior al ejercicio en la distrofia muscular o como coadyuvante en la implantación de una o más endoprótesis para oclusiones vasculares.
3. Un polinucleótido para usar según la reivindicación 2, en donde el polinucleótido es para usar en (i) la prevención, reducción del riesgo, mejoría o tratamiento de una patología seleccionada de hipertensión arterial, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal, síndrome metabólico, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, disfunción eréctil, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, trastornos cognitivos, degeneración de la retina, uveorretinitis, retinopatía vascular, glaucoma, angina espástica coronaria, trombosis, hipertensión pulmonar, preeclampsia, vasculitis, trastornos inflamatorios e insuficiencia venosa; o (ii) para la mejoría de la fatiga posterior al ejercicio en la distrofia muscular o como coadyuvante en la implantación de una o más endoprótesis para oclusiones vasculares.
4. Un polinucleótido para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína BPIFB4, variante o fragmento de la misma está unida a una secuencia de aminoácidos adicional para dirigir la proteína BPIFB4, variante o fragmento de la misma a un órgano o tejido específico.
5. Un polinucleótido para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde el polinucleótido codifica una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1.
6. Un polinucleótido para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma que comprende los nucleótidos que codifican la valina 229, treonina 281, fenilalanina 488 y treonina 494 de la SEQ ID NO: 1.
7. Un polinucleótido para usar según la reivindicación 6, en donde la secuencia de polinucleótidos consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
8. Un vector que contiene un polinucleótido que codifica
(i) una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1;
(ii) una variante de proteína BPIFB4 de la proteína BPIFB4 de (i) que tiene al menos 95% de homología con la de la SEQ ID NO: 1; o
(iii) un fragmento de la proteína BPIFB4 de (i) o la variante de (ii),
en donde dicha variante o fragmento de la proteína BPIFB4 está operativamente unida a secuencias de control de la expresión, en donde dicha variante o fragmento de la proteína BPIFB4 comprende una valina en la posición correspondiente a la posición 229 de la SEQ ID NO: 1, una treonina en la posición correspondiente a la posición 281 de la SEQ ID NO: 1, una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 488 de la SEQ ID NO: 1 y una treonina en la posición correspondiente a la posición 494 de la SEQ ID NO: 1 y dicha proteína BPIFB4, variante o fragmento tiene actividad en el aumento de actividad de la eNOS y/o la producción de NO para uso en terapia.
9. Un vector según la reivindicación 8, en donde el vector es para usar (i) en la prevención, reducción del riesgo, mejora o tratamiento de una patología seleccionada de hipertensión arterial, aterosclerosis, diabetes mellitus, dislipidemia, insuficiencia renal, síndrome metabólico, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, disfunción eréctil, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, trastornos cognitivos, degeneración retiniana,
uveoretinitis, retinopatía vascular, cataratas, glaucoma, angina espástica coronaria, trombosis, hipertensión pulmonar, preeclampsia, vasculitis, cáncer, trastornos inflamatorios, insuficiencia venosa; o (ii) para la mejora de la fatiga posterior al ejercicio en distrofia muscular o como coadyuvante en la implantación de una o más endoprótesis para oclusiones vasculares.
10. Un vector para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en donde la proteína BPIFB4, variante o fragmento de la misma está unida a una secuencia de aminoácidos adicional para dirigir la variante de la proteína BPIFB4 o fragmento de la misma a un órgano o tejido específico.
11. Un vector para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el polinucleótido codifica una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1.
12. Un vector para su usar según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma que comprende los nucleótidos que codifican la valina 229, treonina 281, fenilalanina 488 y treonina 494 de la SEQ ID NO: 1, en donde opcionalmente la secuencia de polinucleótidos consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
13. Un vector para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde el vector es un vector vírico, por ejemplo, el vector es un vector de adenovirus o se selecciona de los vectores de los serotipos 1 -9 de AAV.
14. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido que codifica
(i) una proteína BPIFB4 que consiste en la SEQ ID NO: 1;
(ii) una variante de proteína BPIFB4 de la proteína BPIFB4 de (i) que tiene al menos 95% de homología con la de la SEQ ID NO: 1; o
(iii) un fragmento de la proteína de (i) o la variante de (ii),
en donde dicha variante o fragmento de la proteína BPIFB4 comprende una valina en la posición correspondiente a la posición 229 de la SEQ ID NO: 1, una treonina en la posición correspondiente a la posición 281 de la SEQ ID NO: 1, una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 488 de la SEQ ID NO: 1 y una treonina en la posición correspondiente a la posición 494 de la SEQ ID NO: 1 y dicha proteína, variante o fragmento de BPIFB4 tiene actividad en el aumento de actividad de la eNOS y/o la producción de NO o un vector que comprende dicho polinucleótido, mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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