CN104558144B - 鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用，所述鼠Bpifb5的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:11所示。制备得到的Bpifb5突变体蛋白能够有效杀灭大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌，具有一定的灭菌能力。

Description

鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及一种鼠Bpifb5突变体及蛋白。
背景技术
Bpifb5蛋白能够特异性杀灭革兰氏阴性病菌及消除内毒素，是极具临床应用价值的抗菌肽，因此，有必要对其进行更进一步的研究。
发明内容
本发明提供一种新的鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用。
本发明提供一种用于构建鼠Bpifb5突变体的引物，所述鼠Bpifb5的序列如SEQ IDNO:1所示，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:11所示。
一种鼠Bpifb5突变体，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
一种鼠Bpifb5突变体蛋白，其序列如SEQ ID NO:8所示。
一种所述的蛋白在特异性杀灭革兰氏阴性病菌上的应用。所述病菌包括大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌。
本发明的有益效果是：制备得到的Bpifb5突变体蛋白能够有效杀灭大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌，具有一定的灭菌能力。
附图说明
图1是Bpifb5测序突变位点结果；
图2是Bpifb5克隆鉴定结果图，其中，1～3为Bpifb5cDNA片段，大小为1473kb；
图3是pET32a-Bpifb5及其突变体重组质粒电泳检测结果图，其中，M：DL10000marker，1：pET32a-Bpifb5，2：pET32a-Bpifb5突变体；
图4是SDS-PAGE表达分析图，其中，M：marker，1：pET32a-Bpifb5，2：pET32a-Bpifb5突变体，目的条带大小为53kd；
图5是杀菌实验结果图，其中，1～2排为Bpifb5对照，3～4排为Bpifb5突变体干扰组，a～d分别为菌液浓度10-1，10-2，10-3，10-4，结果显示Bpifb5突变体蛋白具有一定程度的灭菌能力。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
一种鼠Bpifb5突变体，突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，突变体蛋白的序列如SEQ ID NO:8所示。鼠Bpifb5基因序列是现有序列，其登录信息是：NM_144890，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示；其蛋白序列如SEQ ID NO:9所示，其登录号是：NP_659139；基因序列的从起始密码子ATG开始的第569位点由A突变为C。
如图1至图5所示，在一种实施方式中，鼠Bpifb5突变体的制备方法包括如下步骤：
1、通过不依赖连接酶的克隆方法(LIC)重组质粒
a)设计质粒pET32a(DNA序列如SEQ ID NO:2所示)以及基因Bpifb5mRNA的引物，引物如表1所示：
表1质粒pET32a和基因Bpifb5的合成引物
b)通过PCR的方法扩增目的片段Bpifb5和表达质粒pET32a(采用TAKARA公司的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，GXL高保真PCR反应体系如表2所示：
表2：PCR反应体系
试剂 使用量
5×PrimeSTAR GXL Buffer(缓冲液) 10μl
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μl
Primer F(Bpifb5和pET32a的上游引物) 10～5pmol
Primer R(Bpifb5和pET32a的下游引物) 10～15pmol
Template(模板DNA) 100ng
PrimeSTAR GXL DNA Polymera 2μl
灭菌蒸馏水 Up to 50μl
PCR反应条件是：1.98℃5min；2、98℃10sec；3、60℃15sec；4、68℃17min；5、2～4循环30次；6、60℃10min；7、12℃O/N(overnight，过夜)。
PCR反应体系中，dNTP Mixture为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM。
c)通过胶纯化试剂盒纯化所得Bpifb5片段和pET32a表达载体。
d)T4DNA连接酶处理pET32a表达载体和Bpifb5片段。
d1)每20ul反应液加入0.037pmol的pET32a表达载体；
d2)每20ul反应液加入0.12-0.48pmol的胶回收纯化产物；
d3)用T4连接酶处理pET32a表达载体与Bpifb5片段，其反应体系如表3所示；
表3T4连接酶处理时的反应体系
a:Vector Mix 1X
T4 Buffer(缓冲液) 2μl
DTT(100mM) 1μl
T4 Polymerase(T4连接酶) 0.4μl
dGTP 2μl
ddH2O fill to make 20ul
b:Insert Mix 1X
T4 Buffer 2μl
DTT(100mM) 1μl
T4 Polymerase 0.4μl
dCTP 2μl
ddH2O fill to make 20μl
d4)在22℃条件下孵育30min；
d5)75℃孵育20min以灭活T4连接酶。
e)表达载体与目的片段链接
e1)将样品(表达载体和目的片段的混合液)离心处理；
e2)根据表达载体与目的片段的所得的浓度将两者以1:1的拷贝数混合于一管；
e3)22℃孵育5min；
e4)加2.5μl EDTA(25mM)并混匀；
e5)22℃孵育5min；
e6)将所构建的重组质粒转入BL21感受态细菌。
f)构建突变体质粒
f1)设计点突变引物：
f2)GXL高保真PCR反应：
试剂 使用量
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μl
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μl
上游引物 10～5pmol
下游引物 10～15pmol
Template 100ng
PrimeSTAR GXL DNA Polymera 2μl
灭菌蒸馏水 Up to 50μl
PCR反应条件是：1.98℃5min；2、98℃10sec；3、60℃15sec；4、68℃8min；5、2～4循环25次；6、68℃12min；7、12℃O/N(overnight，过夜)。
f3)酶切反应：
反应条件：37℃孵育2～3小时。
f4)取10ul酶切产物转化，挑克隆测序。
f5)将所构建的Bpifb5突变体重组质粒转入BL21感受态细菌。
2、表达融合蛋白pET32a-Bpifb5突变体
1)挑选转化后的单克隆于5ML LB培养基中，37℃，280rpm培养箱摇菌16h。
2)用500ML锥形瓶装入100ml的无抗生素LB培养基，高压灭菌。
3)将含有重组质粒的1ml菌液加入到高压灭菌的无抗生素LB培养基中，加入100ul浓度100ug/ml的氨苄抗生素。
4)37℃，280rpm摇菌两小时45分钟后，检测其OD595≈0.6。
5)冰上冷却15分钟。
6)加入IPTG(原浓度24mg/ml，终浓度1/100)。
7)37℃，280rpm摇菌三小时。
8)12000rpm，4℃，离心30min。收集沉菌，称净重。
9)每1g加入2～5ml buffer W(100Mm Tris HCl ph8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)，吹打混匀，于功率17％～20％超声破碎，至悬液澄清为宜。
10)12000rpm，4℃，离心10min。收集上清液以及沉淀。
3、包涵体蛋白处理：
1)配置8M的尿素(融于1XPBS)冰上预冷。
2)将超声破碎后的沉菌融于8M尿素中，吹打混匀，4℃垂直旋转8h～O/N。
3)4℃，12000rcf离心15min，收集上清，上清即为可溶蛋白。
4)用两倍体积的8M尿素加10mM咪唑溶解可溶蛋白，加入预先准备的带特定标签的beadz。
5)4℃摇晃1～2h。
6)10000rcf离心10min。
7)用预装柱收集beadz。
8)用8M尿素配制300mM咪唑，将吸附在beadz的目的蛋白洗脱下来。
4、梯度透析：
1)用1X PBS分别配制7M、6M、5M、4M、2M、0M尿素，预冷。
2)组装半透膜透析袋，将目的蛋白密封在透析袋中，分别从高浓度的尿素到底浓度的尿素进行透析，每一个浓度透析4～6h。
3)回收蛋白溶液，用超滤管进行超滤浓缩。
4)最后将浓缩蛋白-80℃保持，以备后续实验使用。
上述梯度透析和包涵体蛋白处理都用于纯化蛋白。
5、BCA蛋白浓度检测
1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液，充分混匀。
2)完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml。用PBS稀释。
3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20l加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20ul。
4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20ul。
5)各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30分钟。
6)测定A562，540～595mm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
6、杀菌实验
1)将不做任何处理的革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌液摇菌扩增至OD＝0.6。
2)提前制备Bpifb5蛋白与Bpifb5突变体蛋白并稀释成终浓度1ug/ul。
3)将300ug Bpifb5突变体蛋白(Bpifb5蛋白作为对照组)加入1ml菌液，37℃孵育30分钟。
4)离心4000rcf，3分钟。
5)去上清，加入1ml PBS吹打均匀。4000rcf，离心3分钟。
6)重复步骤5一次。去上清，加入0.5ml PBS吹打均匀。
7)按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，倍数稀释。稀释过程中每孔吹打40次。
8)每管吸取10ul菌液滴加到预先标记的培养板上，待液滴干后倒置培养12小时。
9)分析结果。
BPI蛋白能特异性杀灭革兰氏阴性病菌及清除内毒素，是极具临床应用价值的抗菌肽。申请人发现了一个鼠源Bpifb5突变体(D190A)其杀灭大肠杆菌(Escherichia coli)和克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)显著高于野生型，该发现也为其他BPI蛋白的分子设计、改造和利用提供了参考和借鉴。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (5)

1.一种用于构建鼠Bpifb5突变体的引物，所述鼠Bpifb5的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:11所示。
2.一种鼠Bpifb5突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
3.一种鼠Bpifb5突变体蛋白，其特征在于，所述蛋白的序列如SEQ ID NO:8所示。
4.一种权利要求3所述的蛋白在制备特异性杀灭革兰氏阴性病菌的药物上的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)和克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella Pneumoniae)。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876650A (zh) * 2012-07-23 2013-01-16 江南大学 一种普鲁兰酶突变体及其制备方法
WO2014102343A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Annibale Alessandro Puca Variant of bpifb4 protein

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876650A (zh) * 2012-07-23 2013-01-16 江南大学 一种普鲁兰酶突变体及其制备方法
WO2014102343A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Annibale Alessandro Puca Variant of bpifb4 protein

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Comparative analysis of the PLUNC (palate, lung and nasal epithelium clone) protein families;C.D. Bingle 等;《Biochemical Society Transactions》;20030801;第31卷(第4期);全文 *
Systematic nomenclature for the PLUNC/PSP/BSP30/SMGB proteins as a subfamily of the BPI fold-containing superfamily;C.D. Bingle 等;《Biochem Soc Trans》;20120801;第39卷(第4期);全文 *
定点突变对BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白表达和复性率的影响;安云庆 等;《首都医科大学学报》;20020930;第23卷(第3期);全文 *
杀菌/通透性增加蛋白研究进展;肖晶 等;《中国畜牧兽医》;20091130;第36卷(第11期);全文 *

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