CN104558144B

CN104558144B - 鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用

Info

Publication number: CN104558144B
Application number: CN201410841057.4A
Authority: CN
Inventors: 黄卫人; 吴汉伟; 牟丽莎; 林穆奇; 刘宇辰; 刘璐; 桂耀庭; 蔡志明
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104558144A

Abstract

本发明公开了一种鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用，所述鼠Bpifb5的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:11所示。制备得到的Bpifb5突变体蛋白能够有效杀灭大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌，具有一定的灭菌能力。

Description

鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用

技术领域

本申请涉及一种鼠Bpifb5突变体及蛋白。

背景技术

Bpifb5蛋白能够特异性杀灭革兰氏阴性病菌及消除内毒素，是极具临床应用价值的抗菌肽，因此，有必要对其进行更进一步的研究。

发明内容

本发明提供一种新的鼠Bpifb5突变体、蛋白及其应用。

本发明提供一种用于构建鼠Bpifb5突变体的引物，所述鼠Bpifb5的序列如SEQ IDNO:1所示，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:11所示。

一种鼠Bpifb5突变体，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。

一种鼠Bpifb5突变体蛋白，其序列如SEQ ID NO:8所示。

一种所述的蛋白在特异性杀灭革兰氏阴性病菌上的应用。所述病菌包括大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌。

本发明的有益效果是：制备得到的Bpifb5突变体蛋白能够有效杀灭大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌，具有一定的灭菌能力。

附图说明

图1是Bpifb5测序突变位点结果；

图2是Bpifb5克隆鉴定结果图，其中，1～3为Bpifb5cDNA片段，大小为1473kb；

图3是pET32a-Bpifb5及其突变体重组质粒电泳检测结果图，其中，M：DL10000marker，1：pET32a-Bpifb5，2：pET32a-Bpifb5突变体；

图4是SDS-PAGE表达分析图，其中，M：marker，1：pET32a-Bpifb5，2：pET32a-Bpifb5突变体，目的条带大小为53kd；

图5是杀菌实验结果图，其中，1～2排为Bpifb5对照，3～4排为Bpifb5突变体干扰组，a～d分别为菌液浓度10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，结果显示Bpifb5突变体蛋白具有一定程度的灭菌能力。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

一种鼠Bpifb5突变体，突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，突变体蛋白的序列如SEQ ID NO:8所示。鼠Bpifb5基因序列是现有序列，其登录信息是：NM_144890，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示；其蛋白序列如SEQ ID NO:9所示，其登录号是：NP_659139；基因序列的从起始密码子ATG开始的第569位点由A突变为C。

如图1至图5所示，在一种实施方式中，鼠Bpifb5突变体的制备方法包括如下步骤：

1、通过不依赖连接酶的克隆方法(LIC)重组质粒

a)设计质粒pET32a(DNA序列如SEQ ID NO:2所示)以及基因Bpifb5mRNA的引物，引物如表1所示：

表1质粒pET32a和基因Bpifb5的合成引物

b)通过PCR的方法扩增目的片段Bpifb5和表达质粒pET32a(采用TAKARA公司的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，GXL高保真PCR反应体系如表2所示：

表2：PCR反应体系

试剂	使用量
		5×PrimeSTAR GXL Buffer(缓冲液)	10μl
dNTP Mixture(2.5mM each)	4μl
		Primer F(Bpifb5和pET32a的上游引物)	10～5pmol

Primer R(Bpifb5和pET32a的下游引物)	10～15pmol
		Template(模板DNA)	100ng
PrimeSTAR GXL DNA Polymera	2μl
		灭菌蒸馏水	Up to 50μl

PCR反应条件是：1.98℃5min；2、98℃10sec；3、60℃15sec；4、68℃17min；5、2～4循环30次；6、60℃10min；7、12℃O/N(overnight，过夜)。

PCR反应体系中，dNTP Mixture为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM。

c)通过胶纯化试剂盒纯化所得Bpifb5片段和pET32a表达载体。

d)T4DNA连接酶处理pET32a表达载体和Bpifb5片段。

d1)每20ul反应液加入0.037pmol的pET32a表达载体；

d2)每20ul反应液加入0.12-0.48pmol的胶回收纯化产物；

d3)用T4连接酶处理pET32a表达载体与Bpifb5片段，其反应体系如表3所示；

表3T4连接酶处理时的反应体系

a:Vector Mix	1X
		T4 Buffer(缓冲液)	2μl
DTT(100mM)	1μl
		T4 Polymerase(T4连接酶)	0.4μl
dGTP	2μl
		ddH2O	fill to make 20ul
b:Insert Mix	1X
		T4 Buffer	2μl
DTT(100mM)	1μl
		T4 Polymerase	0.4μl
dCTP	2μl
		ddH2O	fill to make 20μl

d4)在22℃条件下孵育30min；

d5)75℃孵育20min以灭活T4连接酶。

e)表达载体与目的片段链接

e1)将样品(表达载体和目的片段的混合液)离心处理；

e2)根据表达载体与目的片段的所得的浓度将两者以1:1的拷贝数混合于一管；

e3)22℃孵育5min；

e4)加2.5μl EDTA(25mM)并混匀；

e5)22℃孵育5min；

e6)将所构建的重组质粒转入BL21感受态细菌。

f)构建突变体质粒

f1)设计点突变引物：

f2)GXL高保真PCR反应：

试剂	使用量
		5×PrimeSTAR GXL Buffer	10μl
dNTP Mixture(2.5mM each)	4μl
		上游引物	10～5pmol
下游引物	10～15pmol
		Template	100ng
PrimeSTAR GXL DNA Polymera	2μl
		灭菌蒸馏水	Up to 50μl

PCR反应条件是：1.98℃5min；2、98℃10sec；3、60℃15sec；4、68℃8min；5、2～4循环25次；6、68℃12min；7、12℃O/N(overnight，过夜)。

f3)酶切反应：

反应条件：37℃孵育2～3小时。

f4)取10ul酶切产物转化，挑克隆测序。

f5)将所构建的Bpifb5突变体重组质粒转入BL21感受态细菌。

2、表达融合蛋白pET32a-Bpifb5突变体

1)挑选转化后的单克隆于5ML LB培养基中，37℃，280rpm培养箱摇菌16h。

2)用500ML锥形瓶装入100ml的无抗生素LB培养基，高压灭菌。

3)将含有重组质粒的1ml菌液加入到高压灭菌的无抗生素LB培养基中，加入100ul浓度100ug/ml的氨苄抗生素。

4)37℃，280rpm摇菌两小时45分钟后，检测其OD₅₉₅≈0.6。

5)冰上冷却15分钟。

6)加入IPTG(原浓度24mg/ml，终浓度1/100)。

7)37℃，280rpm摇菌三小时。

8)12000rpm，4℃，离心30min。收集沉菌，称净重。

9)每1g加入2～5ml buffer W(100Mm Tris HCl ph8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)，吹打混匀，于功率17％～20％超声破碎，至悬液澄清为宜。

10)12000rpm，4℃，离心10min。收集上清液以及沉淀。

3、包涵体蛋白处理：

1)配置8M的尿素(融于1XPBS)冰上预冷。

2)将超声破碎后的沉菌融于8M尿素中，吹打混匀，4℃垂直旋转8h～O/N。

3)4℃，12000rcf离心15min，收集上清，上清即为可溶蛋白。

4)用两倍体积的8M尿素加10mM咪唑溶解可溶蛋白，加入预先准备的带特定标签的beadz。

5)4℃摇晃1～2h。

6)10000rcf离心10min。

7)用预装柱收集beadz。

8)用8M尿素配制300mM咪唑，将吸附在beadz的目的蛋白洗脱下来。

4、梯度透析：

1)用1X PBS分别配制7M、6M、5M、4M、2M、0M尿素，预冷。

2)组装半透膜透析袋，将目的蛋白密封在透析袋中，分别从高浓度的尿素到底浓度的尿素进行透析，每一个浓度透析4～6h。

3)回收蛋白溶液，用超滤管进行超滤浓缩。

4)最后将浓缩蛋白-80℃保持，以备后续实验使用。

上述梯度透析和包涵体蛋白处理都用于纯化蛋白。

5、BCA蛋白浓度检测

1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液，充分混匀。

2)完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml。用PBS稀释。

3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20l加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20ul。

4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20ul。

5)各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30分钟。

6)测定A562，540～595mm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

6、杀菌实验

1)将不做任何处理的革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌液摇菌扩增至OD＝0.6。

2)提前制备Bpifb5蛋白与Bpifb5突变体蛋白并稀释成终浓度1ug/ul。

3)将300ug Bpifb5突变体蛋白(Bpifb5蛋白作为对照组)加入1ml菌液，37℃孵育30分钟。

4)离心4000rcf，3分钟。

5)去上清，加入1ml PBS吹打均匀。4000rcf，离心3分钟。

6)重复步骤5一次。去上清，加入0.5ml PBS吹打均匀。

7)按照10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，倍数稀释。稀释过程中每孔吹打40次。

8)每管吸取10ul菌液滴加到预先标记的培养板上，待液滴干后倒置培养12小时。

9)分析结果。

BPI蛋白能特异性杀灭革兰氏阴性病菌及清除内毒素，是极具临床应用价值的抗菌肽。申请人发现了一个鼠源Bpifb5突变体(D190A)其杀灭大肠杆菌(Escherichia coli)和克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)显著高于野生型，该发现也为其他BPI蛋白的分子设计、改造和利用提供了参考和借鉴。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims

1.一种用于构建鼠Bpifb5突变体的引物，所述鼠Bpifb5的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:11所示。

2.一种鼠Bpifb5突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。

3.一种鼠Bpifb5突变体蛋白，其特征在于，所述蛋白的序列如SEQ ID NO:8所示。

4.一种权利要求3所述的蛋白在制备特异性杀灭革兰氏阴性病菌的药物上的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)和克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella Pneumoniae)。