ES2949962T3

ES2949962T3 - Método enzimático para la preparación de GDP-fucosa

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Publication number: ES2949962T3
Application number: ES20714232T
Authority: ES
Inventors: Reza Mahour; Thomas Rexer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2023-10-04
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: EP3784792C0; US20220177940A1; WO2020201315A1; EP3784792B9; CA3133590A1; EP3784792A1; EP3719135A1; CN113748212A; JP7299339B2; CA3133590C; CN113748212B; EP3784792B1; US11795486B2; JP2022528874A; US20240124911A1

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso catalizado por enzimas para producir GDP-fucosa a partir de sustratos de bajo costo guanosina y L-fucosa o guanosina y D-Manosa en una única mezcla de reacción. Dicho proceso puede operarse (semi)continuamente o en modo discontinuo. Además, dicho proceso puede adaptarse para producir moléculas y biomoléculas fucosiladas que incluyen glicanos, tales como oligosacáridos, proteínas, péptidos, glicoproteínas o glicopéptidos de la leche humana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método enzimático para la preparación de GDP-fucosa

Campo de la invención

[0001] La presente invención se relaciona con un proceso catalizado por enzimas para producir GDP-fucosa a partir de sustratos de bajo costo guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa en un solo mezcla de reacción. Dicho proceso se puede operar de forma semicontinua, incluso de forma continua o en modo alimentado por lotes. Además, dicho proceso puede adaptarse para producir moléculas y biomoléculas fucosiladas que incluyen glicanos, tales como oligosacáridos, proteínas, péptidos, glicoproteínas o glicopéptidos de la leche humana.

Antecedentes de la invención

[0002] La guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa (GDP-fucosa o GDP-Fuc) es un sustrato clave para un gran número de aplicaciones biotecnológicas y tecnología alimentaria. Es el sustrato para la fucosilación central de anticuerpos antiinflamatorios que se utilizan para tratar enfermedades autoinmunes. Además, la GDP-fucosa es necesaria para la producción de vacunas de carbohidratos y en el creciente campo de la medicina personalizada, es decir, la preparación de gliconanomateriales para la administración de fármacos. En los alimentos infantiles (leche humana), los oligosacáridos fucosilados comprenden la mayoría de los azúcares y, por lo tanto, existe una gran demanda de incluir azúcares fucosilados en los productos lácteos producidos sintéticamente para lactantes.

[0003] Sin embargo, a pesar de la alta demanda de GDP-fucosa (del orden de toneladas por año), la disponibilidad de GDPfucosa es muy limitada, incluso para los investigadores. Hasta el momento, el precio de la GDP-fucosa baja en endotoxinas está por encima de los 3.000 euros el gramo. Debido al alto precio del GDP-fucosa, no solo se obstaculizan las actividades de investigación básica y aplicada, sino también las aplicaciones industriales.

[0004] Las estrategias de ingeniería de bioprocesos para sintetizar GDP-fucosa se pueden clasificar en procesos in vivo e in vitro: los microorganismos se modifican metabólicamente para producir GDP-fucosa, intracelular o extracelularmente, como parte de su metabolismo. Sin embargo, los bajos rendimientos, los altos niveles de subproductos no deseados, el tiempo requerido para el diseño de la línea celular y el complicado escalado son inconvenientes. Teniendo en cuenta los aspectos regulatorios, específicamente para alimentos infantiles, la aplicación de organismos genéticamente modificados (OGM) puede retrasar severamente el proceso de aprobación.

[0005] La GDP-fucosa también se puede producir in vitro usando procesos biocatalíticos (enzimáticos) (ver APMIS 2006, 114, 539-548). Por ejemplo, la síntesis enzimática de GDP-fucosa a partir de L-fucosa y trifosfato de guanosina usando la enzima bifuncional L-fucosa pirofosforilasa (FKP) es informada por Zhao et al. (Protocolo Nacional 20105(4): 636-646). Witmann et al. (J. Org. Chem. 1997, 62, 2144-2147) describen la síntesis de GDP-fucosa a partir de fucosa-1-fosfato y 5'-monofosfo-morfolidato de guanosina usando química de fosfoamidita. Tonetti et al. (J. Biol. Chem. 1996, 271(44), 27274 27279) informan sobre la proteína de unión a NADP(H) homodimérica FX, que aparentemente cataliza una actividad combinada de epimerasa y reductasa dependiente de NADPH, convirtiendo así GDP-4-ceto-6-D-desoximanosa a GDP-L-fucosa. Sullivan et al. (J. Biol. Chem. 1998, 273(14), 8193-8202) describen la preparación in vitro de GDP-fucosa a partir de GDP-manosa utilizando GDP-manosa-4,6-deshidratasa humana recombinante y la proteína FX. Lau et al. informe sobre la biosíntesis de GDP-L-fucosa a partir de GDP-D-manosa e investigó la enzima GDP-fucosa sintasa que participa en la síntesis. La enzima convierte GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa en GDP-L-fucosa (J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 17593-17602). Rexer et al. informan la síntesis en un solo recipiente de GDP-manosa a partir de manosa mediante una cascada multienzimática de glucocinasa (Glk), fosfomanomutasa (ManB), manosa-1-fosfato-guanililtransferasa (ManC), pirofosfatasa inorgánica (PmPpA) y polifosfato de 1 dominio quinasa 2 (1D-Ppk2) expresada en E. coli. (Biotechnology and Bioengineering 2018, 115, 192-205). Li et a. (J. Biotechnol. 2017, 264, 1-7) describen la síntesis en un solo recipiente de GDPL-fucosa a partir de manosa-6-fosfato, extractos celulares que comprenden las 4 enzimas ManB, ManC, GDP-D-manosa-4,6-deshidratasa (Gmd) y GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (WcaG; también conocida como GDP-L-fucosa sintasa), así como GTP, NADPH y glucosa-1,6 -bisfosfato. Existe una necesidad sentida desde hace mucho tiempo de un método para producir GDP-fucosa de una manera rentable a partir de sustratos fácilmente disponibles y de bajo costo.

[0006] Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un método rentable y eficiente para la preparación de GDP-fucosa.

[0007] El objetivo de la presente invención se resuelve mediante las enseñanzas de las reivindicaciones independientes. Otras características, aspectos y detalles ventajosos de la invención son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes, la descripción, las figuras y los ejemplos de la presente solicitud.

Descripción de la invención

[0008] En bioquímica, los azúcares de nucleótidos son bien conocidos como formas activas de monosacáridos y en las reacciones de glicosilación, los azúcares de nucleótidos son conocidos por actuar como donantes de glucosilo. Las glicosiltransferasas (GTF) son enzimas que catalizan la transferencia de fracciones de sacárido desde azúcares de nucleótidos activados a moléculas aceptoras de glicosil nucleofílicas. Así, en bioquímica las reacciones de glicosilación son catalizadas por glicosiltransferasas.

[0009] Para actuar como donantes de glucosilo es esencial que los respectivos monosacáridos estén presentes en una forma altamente energética, como por ejemplo en forma de azúcares de nucleótidos, particularmente azúcares de nucleótidos difosfo derivados de uridina difosfato, guanosina difosfato o citosina difosfato y pronto. Ejemplos de azúcares de nucleótido bien conocidos son UDP-glucosa, UDP-galactosa, UDP-GlcNAc, UDP-GalNac, UDP-xilosa, ácido UDP-glucurónico, GDP-manosa y GDP-fucosa. Es bien sabido que la conversión de monosacáridos simples en azúcares de nucleótidos activados puede lograrse mediante la reacción catalizada por enzimas de un nucleósido trifosfato (NTP) y un glucosil monofosfato, en el que el glucosil monofosfato contiene un grupo fosfato en el carbono anomérico.

[0010] Para obtener un monosacárido de difosfato de nucleósido (NDP), el monosacárido usado necesita convertirse en un derivado de monofosfato de glicosilo. En general, dicha reacción se puede lograr aplicando enzimas específicas como fosfotransferasas y adicionalmente fosfomutasas, si se requiere, para obtener el monosacárido-1-fosfato deseado. Las fosfotransferasas son enzimas clasificadas con el número CE 2.7 que catalizan reacciones de fosforilación. Las fosfotransferasas se clasifican además según su molécula aceptora. Por ejemplo, las fosfotransferasas bajo CE 2.7.1 son fosfotransferasas con un grupo alcohol como aceptor. Las fosfomutasas son isomerasas, es decir, enzimas que pueden catalizar una transferencia interna de un grupo fosfato. Se requieren fosfomutasas en caso de que la fosforilación del sustrato a través de la fosfotransferasa dé como resultado un monosacárido-6-fosfato, como en el caso de D-manosa o D-glucosa, por ejemplo, manosa-6-fosfato o glucosa-6-fosfato, respectivamente. La fosfomutasa respectiva luego cataliza la transferencia interna del grupo fosfato que da como resultado la conversión de manosa-6-fosfato en manosa-1-fosfato o glucosa-6-fosfato en glucosa-1-fosfato, respectivamente.

[0011] Las quinasas son enzimas que forman parte de la familia de las fosfotransferasas. Las quinasas son enzimas que catalizan la transferencia de grupos fosfato de moléculas donadoras de fosfato de alta energía a sustratos específicos. Este proceso se conoce como fosforilación, donde el sustrato gana un grupo fosfato y la molécula de trifosfato de adenosina (ATP) de alta energía dona un grupo fosfato. Esta transesterificación produce un sustrato fosforilado y ADP. Por lo tanto, para obtener un monosacárido-1-fosfato, se pueden aplicar quinasas adecuadas como una fucoquinasa o N-acetilhexosamina-1-quinasa para obtener fucosa-1-fosfato a partir de L-fucosa o manosa-1-fosfato a partir de D-manosa. respectivamente.

[0012] Con el uso de nucleotidiltransferasas, un nucleósido trifosfato (NTP) y un monosacárido-1-fosfato pueden convertirse en el respectivo nucleósido difosfato (NDP)-monosacárido. Las nucleotidiltransferasas son enzimas transferasas de grupos que contienen fósforo y se clasifican con el número CE 2.7.7. Para los diferentes nucleótidos naturales, se conocen en la técnica nucleotidiltransferasas específicas de nucleótidos, por ejemplo, las uridiltransferasas transfieren grupos uridilo, las adeniltransferasas transfieren grupos adenililo, las guanililtransferasas transfieren grupos guanililo, las citidililtransferasas transfieren grupos citidililo y las timidiltransferasas transfieren grupos timidililo. Por lo tanto, las nucleotidiltransferasas son adecuadas para catalizar la reacción de monosacárido-1-fosfato con nucleósido trifosfato, por ejemplo, fucosa-1-fosfato con guanosina trifosfato (GTP) para obtener GDP-fucosa o manosa-1-fosfato con guanosina trifosfato (GTP) para obtener GDP-manosa. En el caso de GDP-fucosa y GDP-manosa, una guanililtransferasa es adecuada para catalizar la reacción con trifosfato de guanosina (GTP).

[0013] Los monosacáridos de difosfato de guanosina (GDP) que se relacionan con monosacáridos de GDP de origen natural son GDP-manosa y GDP-fucosa. El esquema de reacción general descrito anteriormente para obtener los monosacáridos de GDP se puede realizar con guanosina trifosfato y manosa-1-fosfato (Man-1-P) en el caso de GDP-manosa y fucosa-1-fosfato (Fuc-1-P) en el caso de GDP-fucosa con guanililtransferasas específicas que catalizan la reacción para obtener la GDP-manosa o GDP-fucosa deseada respectivamente.

[0014] Sin embargo, una desventaja del esquema de reacción catalizada por enzimas para obtener monosacáridos de difosfato de nucleósido (NDP) se basa en el hecho de que los materiales de partida, en particular los trifosfatos de nucleósido respectivos son muy costosos y, por lo tanto, la ruta de síntesis resulta en un costo. -síntesis intensiva de NDP-monosacáridos y en particular de GDP-fucosa o GDP-manosa. Como ya se describió anteriormente para GDP-fucosa, existe la necesidad en la técnica de proporcionar un método rentable y eficiente para la preparación de monosacáridos de difosfato de nucleósido, como GDP-fucosa o GDP-manosa, y en particular existe la necesidad de proporcionar un costo método efectivo y eficiente para la preparación de GDP-fucosa a partir de materiales de partida de bajo costo y fácilmente disponibles.

[0015] Con respecto a los GDP-monosacáridos, la GDP-fucosa y la GDP-manosa se relacionan con los GDP-azúcares activados de forma natural en los mamíferos. Por lo tanto, la guanosina se ha identificado como un nucleótido adecuado y la L-fucosa y la D-manosa se han identificado como monosacáridos adecuados para la preparación de GDP-fucosa. Debe quedar claro que, con respecto a una reacción catalizada por enzimas, deben proporcionarse al menos enzimas adecuadas. Por lo tanto, los inventores han identificado guanosina y monosacáridos fácilmente disponibles, como L-fucosa o D-manosa, como materiales de partida adecuados para la producción de GDP-fucosa en una reacción enzimática en cascada de un solo recipiente.

[0016] Hasta el momento no se ha establecido un proceso para la producción biocatalítica de GDP-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa.

[0017] Con el fin de proporcionar un método rentable y eficiente para la preparación de GDP-fucosa, se identificaron guanosina y L-fucosa como materiales de partida adecuados para la producción de GDP-fucosa en una reacción enzimática en cascada como se muestra en la Figura 1, que consiste en (a) formar de fucosa-1-fosfato (Fuc-1-P) a partir de L-fucosa y adenosina trifosfato (ATP; cantidad catalítica), (b) la formación de trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina y polifosfato, y (c) la reacción de fucosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina (GTP) a GDP-fucosa. Se imaginó que se puede producir GDP-fucosa a partir de L-fucosa y guanosina en presencia de una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa en un tampón adecuado (Figura 2).

[0018] Además, la guanosina y la D-manosa se identificaron como materiales de partida adecuados para la producción de GDPfucosa en una reacción enzimática en cascada, como se muestra en la Figura 3, que consiste en (a) formar de manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina (ATP), (b) la formación de trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina y polifosfato, y (c) la reacción de manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina (GTP) a GDP-manosa y (d) la conversión de GDP-manosa a GDP-fucosa. Se imaginó que la GDP-fucosa se puede producir a partir de D-manosa y guanosina en presencia de una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa sintasa o una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa en un buffer.

[0019] Sin embargo, cualquier intento de producir GDP-fucosa a partir de L-fucosa y guanosina o D-manosa y guanosina en esta reacción enzimática en cascada no tuvo éxito y no se observó formación de GDP-fucosa (Ejemplo 3).

[0020] Sorprendentemente, los inventores han descubierto que, al solubilizar guanosina en un codisolvente, como dimetilsulfóxido, se logró una conversión casi completa de guanosina y L-fucosa en GDP-fucosa después de tres horas (Ejemplo 2). Además, el cosolvente no afectó la actividad de las enzimas utilizadas en la preparación de GDP-fucosa. El título está por encima de la solubilidad del sustrato, que se logra mediante el uso de un codisolvente. Además, los inventores han descubierto que, al solubilizar la guanosina en un codisolvente, como el sulfóxido de dimetilo, se logró una conversión casi completa de guanosina y D-manosa en GDP-fucosa. Además, el cosolvente no afectó la actividad de las enzimas utilizadas en la preparación de GDP-fucosa a partir de guanosina y D-manosa.

[0021] Por ejemplo, el método de la presente invención es beneficioso sobre los métodos descritos anteriormente conocidos en la técnica para la síntesis enzimática de GDP-fucosa a partir de L-fucosa y trifosfato de guanosina, ya que se puede evitar el caro material de partida trifosfato de guanosina y reemplazado con guanosina de nucleósido más simple, lo que da como resultado un método rentable y eficiente para la preparación de GDP-fucosa, como se describe en este documento.

[0022] La presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa representada por las siguientes fórmulas

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato, un codisolvente para solubilizar guanosina y en el caso de D-manosa NADPH; y

proporcionando un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucocinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucocinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente.

[0023] En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa representada por las siguientes fórmulas

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, un codisolvente para solubilizar guanosina y NADPH; y

proporcionando un conjunto de enzimas que comprende (a) una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH y el codisolvente.

[0024] En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa representada por las siguientes fórmulas

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente.

[0025] En una redacción alternativa, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

[0026] En una redacción alternativa, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar las siguientes enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia de las enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente.

[0027] También se describe aquí un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia de las enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente,

en donde la conversión de guanosina en guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa es al menos 78% después de 3 horas.

[0028] La etapa de producción B) de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa según la invención comprende

(a) formar fucosa-1-fosfato (Fuc-1-P) a partir de L-fucosa y trifosfato de adenosina catalizados por una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa,

(b) formar trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina, trifosfato de adenosina y polifosfato catalizados por una guanosina quinasa y una polifosfato quinasa; y

(c) hacer reaccionar fucosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-fucosa en presencia de una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa.

[0029] Aparentemente, los pasos (a) y (b) pueden realizarse simultánea o sucesivamente. Además, su orden puede revertirse a (b) ^ (a) ^ (c).

[0030] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa fucosa;

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente mediante

(a) formar fucosa-1-fosfato a partir de L-fucosa y trifosfato de adenosina siendo catalizado por una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa,

(b) formar trifosfato de guanosina a partir de guanosina, trifosfato de adenosina y polifosfato siendo catalizados por una guanosina quinasa y una polifosfato quinasa; y

[0031] Más específicamente, la etapa de producción B) de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa según la invención comprende

(a) formar fucosa-1-fosfato (Fuc-1-P) a partir de L-fucosa y trifosfato de adenosina siendo catalizada por una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa,

(b1) formar monofosfato de guanosina (GMP) a partir de guanosina y trifosfato de adenosina siendo catalizada por una guanosina quinasa;

(b2) formar trifosfato de guanosina (GTP) a partir de monofosfato y polifosfato de guanosina catalizados por una polifosfato quinasa; y

[0032] Aparentemente, el paso (a) puede llevarse a cabo antes, simultáneamente o después del paso (b1) o (b2). Por lo tanto, el orden de los pasos también puede revertirse a (b1) ^ (b2) ^ (a) ^ (c).

[0033] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente mediante

(a) formar fucosa-1-fosfato a partir de L-fucosa y adenosina trifosfato siendo catalizada por una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa,

(b1) formar guanosina monofosfato a partir de guanosina y adenosina trifosfato siendo catalizada por una guanosina quinasa;

(b2) formar trifosfato de guanosina a partir de monofosfato y polifosfato de guanosina catalizados por una polifosfato quinasa; y

[0034] Incluso más específicamente, la etapa de producción B) de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa según la invención comprende

(b2') formar guanosina difosfato (GDP) a partir de guanosina monofosfato y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa

(b2”) formar guanosina trifosfato (GTP) a partir de guanosina difosfato y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y

(c) hacer reaccionar fucosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-fucosa en presencia de una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa

[0035] Aparentemente, el paso (a) puede llevarse a cabo antes, simultáneamente o después de los pasos (b1), (b2') y (b2”). Por lo tanto, el orden de los pasos también puede revertirse a (b1) ^ (b2') ^ (b2”) ^ (a) ^ (c).

[0036] Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente

(a) formar fucosa-1-fosfato a partir de L-fucosa y trifosfato de adenosina siendo catalizada por una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa,

(b1) formar monofosfato de guanosina a partir de guanosina y trifosfato de adenosina catalizados por una guanosina quinasa;

(b2') formar difosfato de guanosina a partir de monofosfato y polifosfato de guanosina catalizados por una polifosfato quinasa

(b2”) formar trifosfato de guanosina a partir de difosfato de guanosina y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y

[0037] La etapa de producción B) de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa según la invención comprende

(a) formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizado por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formar manosa-6-fosfato (Man-6- P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por glucocinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato catalizados por fosfomanomutasa (b) formar trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina, adenosina el trifosfato y el polifosfato son catalizados por una guanosina quinasa y una polifosfato quinasa; y

(c) hacer reaccionar manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-manosa en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa

(d) formar GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de la GDP-manosa es catalizada por la GDP-manosa-4,6-deshidratasa; y

(e) formar GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por GDP-L-fucosa sintasa.

[0038] Aparentemente, los pasos (a) y (b) pueden realizarse simultánea o sucesivamente.

[0039] Además, su orden puede revertirse a (b) ^ (a) ^ (c).

[0040] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D- manosa;

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato, NADpH y el codisolvente mediante

(a) formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formando manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por glucoquinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato catalizada por fosfomanomutasa

(b) formar guanosina trifosfato (GTP) a partir de guanosina, adenosina trifosfato y polifosfato catalizada por una guanosina quinasa y una polifosfato quinasa; y

(e) formar GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por GDPL-fucosa sintasa.

[0041] Más específicamente, la etapa de producción B) de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa según la invención comprende

o

formando manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por glucoquinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) de manosa-6-fosfato catalizado por fosfomanomutasa (b1) formar guanosina monofosfato (GMP) a partir de guanosina y adenosina trifosfato catalizada por una guanosina quinasa;

[0042] Aparentemente, el paso (a) puede llevarse a cabo antes, simultáneamente o después del paso (b1) o (b2). Por lo tanto, el orden de los pasos también puede revertirse a (b1) ^ (b2) ^ (a) ^ (c).

[0043] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D- manosa;

o

formar manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por glucoquinasa y formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato que es catalizada por fosfomanomutasa

(b1) formar guanosina monofosfato (GMP) a partir de guanosina y adenosina trifosfato que es catalizada por una guanosina quinasa;

[0044] Incluso más específicamente, la etapa de producción B) de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa según la invención comprende

o

formar manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por glucoquinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato siendo catalizada por fosfomanomutasa (b1) formar guanosina monofosfato (GMP) a partir de guanosina y adenosina trifosfato siendo catalizada por una guanosina quinasa;

(b2') formar guanosina difosfato (GDP) a partir de guanosina monofosfato y polifosfato siendo catalizada por una polifosfato quinasa

(c) hacer reaccionar manosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-manosa en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa

(d) formar GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa, y

(e) formar GDP-fucosa a partir de GDP-4-deshidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH son catalizados por la GDP-L-fucosa sintasa

[0045] Aparentemente, el paso (a) puede llevarse a cabo antes, simultáneamente o después de los pasos (b1), (b2 ') y (b2”). Por lo tanto, el orden de los pasos también puede revertirse a (b1) ^ (b2') ^ (b2”) ^ (a) ^ (c).

[0046] Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

B) que produce guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente mediante

(a) formar de manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

(b1) formar monofosfato de guanosina (GMP) a partir de guanosina y trifosfato de adenosina catalizada por una guanosina quinasa;

(d) formar GDP-4-deshidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa y

[0047] El método inventivo para producir GDP-fucosa tiene las siguientes ventajas significativas sobre los métodos descritos en la técnica anterior:

• reducción significativa de costos con respecto a los materiales de partida, es decir, no se requiere GDP o GTP costosos,

• el método se puede realizar de manera continua, lo que potencialmente permite proporcionar GDP-fucosa en una escala de toneladas por año,

• proceso libre de células, evitando así los aspectos adversos de los OMG (regulación, etiquetado),

• uso directo de extractos libres de células, sin costes de purificación de biocatalizadores,

• las enzimas se pueden inmovilizar en soportes sólidos de bajo costo, comercialmente disponibles y listos para usar, • rendimiento casi cuantitativo con respecto a la guanosina,

• la alta escalabilidad hace que el método inventivo sea útil para aplicaciones industriales.

[0048] Debido a la adición de pequeñas cantidades de un codisolvente para solubilizar la guanosina, los inventores pudieron establecer una reacción en cascada multienzimática de guanosina a guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa con una alta tasa de conversión. Preferiblemente, el codisolvente es un disolvente orgánico seleccionado del grupo que comprende: metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol, terc-butanol, acetonitrilo, acetona y sulfóxido de dimetilo. Preferiblemente, el codisolvente es un disolvente polar aprótico, como dimetilsulfóxido o dimetilformamida. Preferiblemente, el codisolvente no inhibe la actividad enzimática. Más preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo.

[0049] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa fucosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente,

siendo el codisolvente para solubilizar la guanosina dimetilsulfóxido.

[0050] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH y el codisolvente

mediante el cual se obtiene el codisolvente para solubilizar la guanosina dimetilsulfóxido.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

[0051] Como se usa en este documento, el término “polifosfato” se refiere a cualquier sal que contenga varios enlaces POP generados compartiendo esquinas de seis o más tetraédricos de fosfato (PO⁴), lo que conduce a la formación de cadenas largas. El término “PoliPn” se usa como sinónimo, en el que n representa la longitud de cadena promedio del número de residuos de fosfato, p. ej. PoliP²⁵se refiere a un polifosfato que tiene aproximadamente 25 residuos de fosfato y PoliP-M se refiere a un polifosfato que tiene aproximadamente 14 residuos de fosfato.

[0052] Como se usa en este documento, el término “guanosina quinasa “ o “ inosina quinasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de guanosina quinasa, es decir, una guanosina quinasa cataliza la reacción de guanosina a guanosina 5'-monofosfato en presencia de adenosina trifosfato. La guanosina quinasa pertenece a la clase CE 2.7.1.73.

[0053] Como se usa en el presente documento, el término “polifosfato quinasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de polifosfato quinasa, es decir, una polifosfato quinasa cataliza las siguientes reacciones:

siendo N un nucleótido tal como guanosina, adenosina, uridina, etc. y NMP siendo nucleósido monofosfato, NDP siendo nucleósido difosfato y NTP siendo nucleósido trifosfato.

[0054] En el caso de la guanosina, la polifosfato quinasa cataliza las siguientes reacciones:

[0055] El polifosfato quinasa pertenece a la clase CE 2.7.4.I. Representantes de la enzima polifosfato quinasa utilizada en los métodos inventivos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, polifosfato quinasa 1 (PPK1), polifosfato quinasa 2 (PPK₂), polifosfato quinasa 2 de 2 dominios (2D-PPK₂) polifosfato quinasa 2 de 1 dominio (1DPPK₂), polifosfato quinasa 3 (PPK3) y guanilato quinasa (CE clase 2.7.4.8).

[0056] Como se usa en el presente documento, el término “L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa” se refiere a un polipéptido bifuncional que tiene actividad L-fucoquinasa y actividad L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa, es decir, un polipéptido que cataliza las siguientes reacciones:

[0057] La L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa pertenece a las clases CE 2.7.1.52 y 2.7.7.30.

[0058] Debería quedar claro que también pueden ser adecuados para el método de la presente invención dos polipéptidos funcionales separados, uno que tenga actividad de L-fucoquinasa y el otro que tenga actividad de L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa.

[0059] Como se usa en el presente documento, el término “pirofosfatasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de pirofosfatasa, es decir, un polipéptido que cataliza la siguiente reacción:

en la que PPi se refiere a pirofosfato y Pi a fosfato.

[0060] La pirofosfatasa pertenece a la clase CE 3.6.1.1.

[0061] Como se usa en el presente documento, el término “glucocinasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de quinasa, es decir. una quinasa que cataliza las siguientes reacciones:

[0062] La glucoquinasa pertenece a la clase CE 2.7.1.1.

[0063] Como se usa en este documento, el término “fosfomanomutasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de fosfomanomutasa, es decir, una fosfomanomutasa que cataliza las siguientes reacciones:

[0064] La fosfomanomutasa pertenece a la clase CE 5.4.28.

[0065] Como se usa en el presente documento, el término “N-acetilhexosamina-1-quinasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad quinasa, es decir, un polipéptido que cataliza las siguientes reacciones:

[0066] La N-acetilhexosamina-1-quinasa pertenece a la clase CE 2.7.1.162.

[0067] Como se usa en el presente documento, el término “guanililtransferasa de manosa-1-fosfato” se refiere a un polipéptido que tiene una actividad de guanililtransferasa de D-manosa-1-fosfato, es decir, un polipéptido que cataliza las siguientes reacciones:

[0068] La guanililtransferasa de manosa-1-fosfato pertenece a la clase CE 2.7.7.13.

[0069] Como se usa en el presente documento, el término “GDP-manosa 4,6-deshidratasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de GDP-manosa 4,6-deshidratasa, es decir, un polipéptido que cataliza las siguientes reacciones:

[0070] La 4,6-deshidratasa pertenece a la clase CE 4.2.1.47.

[0071] Como se usa en el presente documento, el término “GDP-L-fucosa sintasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de GDP-L-fucosa sintasa, es decir, un polipéptido que cataliza las siguientes reacciones:

[0072] La GDP-L-fucosa sintasa pertenece a la clase CE 1.1.1.271 y tiene los siguientes sinónimos y abreviaturas GDP-4-ceto-6-deoximanosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (WCAG), GDP-4-ceto-6-deoxi-D-manosa epimerasa-reductasa, GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa epimerasa/reductasa, GDPFuc sintasa, GER, GFS, GMER, guanosina difosfoucosa sintetasa.

[0073] Como se usa en este documento, el término “cosolvente” se refiere a un compuesto orgánico o una mezcla de compuestos orgánicos, particularmente un solvente orgánico o una mezcla de diferentes solventes, que aumenta o mejora la solubilidad de la guanosina en agua. El experto en la materia puede imaginar fácilmente que un codisolvente adecuado es un disolvente en el que la guanosina tiene una alta solubilidad, incluidos metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol, terc-butanol, acetonitrilo, acetona o dimetilsulfóxido. Preferiblemente, el codisolvente es un disolvente polar aprótico, como dimetilsulfóxido o dimetilformamida. El codisolvente particularmente preferido es dimetilsulfóxido.

[0074] Como se usa en el presente documento, “sacárido” se refiere, entre otros, a monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, pentasacárido, hexasacárido, heptasacárido, octasacárido..., oligosacárido, glicano y polisacárido. El sacárido comprende preferiblemente unidades de monosacárido seleccionadas de: D-arabinosa, D-lixosa, D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, L-lixosa, L-ribosa, L-xilosa, D-ribulosa, D-xiulosa, L-ribulosa, L-xiulosa, D-desoxirribosa, L-desoxirribosa, D-eritrosa, D-treosa, L-glicero-D-mano-heptosa, D-glicero-D-mano-heptosa, D-alosa, D-altrosa, D-Glucosa, D-manosa, D-gulosa, D-idosa, D-galactosa, D-talosa, D-psicosa, D-fructosa, D-sorbosa, D-tagatosa, 6-desoxi-L-altrosa, 6-desoxi-D-talosa, D-Fucosa, L-Fucosa, D-Ramnosa, L-Ramnosa, D-Quinovosa, Olivosa, Tivelosa, Ascarilosa, Abecuosa, Paratosa, Digitoxose, Colitosa, D-Glucosamina, D-Galactosamina, D-Mannosamina, D-allosamina, I-altrosamina, D-gulosamina, L-idosamina, D-talosamina, N-acetil-d-glucosamina, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-manosamina, N-acetil-D-allosamina, N-acetil-L-altrosamina, N-acetil-D-gulosamina, N-acetil-L-idosamina, N-acetil-D-talosamina, N-acetil-D-fucosamina, N-acetil-L-fucosamina, N-Acetil-L-ramnosamina, N-Acetil-D-quinovosamina, ácido D-Glucurónico, ácido D Galacturónico, ácido D-Manurónico, ácido D-Alurónico, ácido L-Altrurónico, ácido D-Gulurónico, ácido L-Gulurónico, ácido L-idurónico, ácido D-talurónico, ácido neuramínico, ácido N-acetilneuramínico, ácido N-glicolilneuramínico, apiosa, bacillosamina, tevetosa, acofriosa, cimarosa, ácido murámico, ácido N-acetilmurámico, ácido N-glicolilmurámico, ácido 3-desoxi-licoheptulosárico, ácido cetodesoxioctónico y ácido cetodesoxinonónico. Preferiblemente, las unidades de monosacáridos pertenecen al siguiente grupo de a-y p-D/L-carbohidratos que comprenden o consisten en:

a-D-ribopiranosa, a-D-arabinopiranosa, a-D-xilopiranosa, a-D-lixopiranosa, a-D-alopiranosa, a-D-altropiranosa, a-D-glucopiranosa, a-D-manpiranosa, a-D-glucopiranosa, a-D-idopiranosa, a-D-galactopiranosa, a-D-talopiranosa, a-D-psicopiranosa, a-D-fructopiranosa, a-D-sorbopiranosa, a-D-tagatopiranosa, a-D-ribofuranosa, a-D-arabinofuranosa, a-D-xilofuranosa, a-D-lixofuranosa, a-D-alofuranosa, a-D-Altrofuranosa, a-D-Glucofuranosa, a-D-Mannofuranosa, a-D-gulofuranosa, a-D-idofuranosa, a-D-galactofuranosa, a-D-talofuranosa, a-D-psicofuranosa, a-D-fructofuranosa, a-D-sorbofuranosa, a-D-tagatofuranosa, a-D-xilulofuranosa, a-D-ribulofuranosa, a-D-treofuranosa, a-D-ramnopiranosa, a-D-eritrofuranosa, a-D-glucosamina, ácido a-D-glucopiranurónico, p-D-ribopiranosa, p-D-arabinopiranosa, p-D-xilopiranosa, p-D-lixopiranosa, p-D-alopiranosa, p-D-altropiranosa, p-D-glucopiranosa, p-Dmanpiranosa, p-D-glucopiranosa, p-D-idopiranosa, p-D-galactopiranosa, p-D-talopiranosa, p-D-psicopiranosa, p-D-fructopiranosa, p-D-sorbopiranosa, p-D-tagatopiranosa, p-D-ribofuranosa, p-D-arabinofuranosa, p-D-xilofuranosa, p-D-lixofuranosa, p-D-ramnopiranosa, p-D-allofuranosa, p-D-altrofuranosa, p-D-glucofuranosa, p-D-manofuranosa, p-D-gulofuranosa, p-D-idofuranosa, p-D-galactofuranosa, p-D-talofuranosa, p-D-psicofuranosa, p-D-fructofuranosa, p-D-sorbofuranosa, p-D-tagatofuranosa, p-D-xilulofuranosa, p-D-ribuiofuranosa, p-D-treofuranosa, p-D-eritrofuranosa, p-D-glucosamina, ácido p-D-glucopiranurónico, a-L-ribopiranosa, a-L-arabinopiranosa, a-L-xilopiranosa, a-L-lixopiranosa, a-L-alopiranosa, a-L-altropiranosa, a-L-glucopiranosa, a-L-manpiranosa, a-L-glucopiranosa, a-Lidopiranosa, a-L-galactopiranosa, a-L-talopiranosa, a-L-psicopiranosa, a-L-fructopiranosa, a-L-sorbopiranosa, a-L-tagatopiranosa, a-L-ramnopiranosa, a-L-ribofuranosa, a-L-arabinofuranosa, a-L-xilofuranosa, a-L-lixofuranosa, a-L-Alofuranosa, a-L-Altrofuranosa, a-L-Glucofuranosa, a-L-Mannofuranosa, a-L-gulofuranosa, a-L-idofuranosa, a-L-galactofuranosa, a-L-talofuranosa, a-L-psicofuranosa, a-L-fructofuranosa, a-L-sorbofuranosa, a-L-tagatofuranosa, a-L-xilulofuranosa, a-L-ribulofuranosa, a-L-treofuranosa, a-L-eritrofuranosa, a-L-glucosamina, ácido a-L-glucopiranurónico, p-L-ribopiranosa, p-L-arabinopiranosa, p-L-xilopiranosa, p-L-lixopiranosa, p-L-alopiranosa, p-L-altropiranosa, p-L-glucopiranosa, p-L-manpiranosa, p-L-glucopiranosa, p-L-idopiranosa, p-L-galactopiranosa, p-L-talopiranosa, p-L-psicopiranosa, p-L-fructopiranosa, p-L-sorbopiranosa, p-L-tagatopiranosa, p-L-ribofuranosa, p-L-arabinofuranosa, p-L-xilofuranosa, p-L-lixofuranosa, p-L-allofuranosa, p-L-altrofuranosa, p-L-glucofuranosa, p-L-manofuranosa, p-L-guiofuranosa, p-L-idofuranosa, p-L-galactofuranosa, p-L-taiofuranosa, p-L-psicofuranosa, p-L-fructofuranosa, p-L-sorbofuranosa, p-L-tagatofuranosa, p-L-xiiofuranosa, p-L-ribuiofuranosa, p-L-treofuranosa, p-L-eritrofuranosa, p-L-glucosamina, ácido p-L-glucopiranurónico y p-L-ramnopiranosa.

[0075] Los sacáridos se modifican adicionalmente opcionalmente para llevar amida, carbonato, carbamato, carbonilo, tiocarbonilo, carboxi, tiocarboxi, éster, tioéster, éter, epoxi, hidroxialquilo, alquilenilo, fenileno, alquenilo, imino, imida, isourea, tiocarbamato, tiourea y/o fracciones de urea.

[0076] Como se usa en el presente documento, el término “glucopéptido” se refiere a un péptido que contiene restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el péptido. Los restos de carbohidrato forman cadenas laterales y son O-glucosídicos conectados al grupo hidroxi de un residuo de serina o treonina o N-glucosídicos conectados al nitrógeno amido de un residuo de asparagina.

[0077] Como se usa en el presente documento, el término “glucoproteína” se refiere a un polipéptido que contiene restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el polipéptido. Los restos de carbohidrato forman cadenas laterales y son O-glucosídicos conectados al grupo hidroxi de un residuo de serina o treonina o N-glucosídicos conectados al nitrógeno amido de un residuo de asparagina. Tal como se usa en este documento, el término “proteína” se refiere a un polipéptido que contiene o carece de restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el polipéptido que incluye proteínas aglicosiladas y proteínas glicosiladas.

[0078] Como se usa en el presente documento, el término “péptido” se refiere a un péptido que contiene o carece de restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el péptido, incluidos los péptidos aglicosilados y los péptidos glicosilados.

Regeneración del cofactor

[0079] La GDP-L-fucosa sintasa consume el cofactor NADPH en la formación de GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro-6-desoxi-a-D-manosa. Por lo tanto, en los métodos inventivos descritos en el presente documento, aunque no se indique explícitamente, la GDP-fucosa se produce a partir de guanosina y D-manosa en presencia del cofactor NADPH.

[0080] Dado que los cofactores NADPH y NADP+ son muy caros, es ventajoso que se regeneren en el sistema para mantenerlos en una cantidad catalítica y desarrollar un proceso rentable.

[0081] Las enzimas que se pueden utilizar para la regeneración de NADPH son:

Fosfito deshidrogenasa CE número 1.20.1.1:

Glucosa deshidrogenasa CE número 1.1.1.47 o 1.1.1.118:

Glicerol deshidrogenasa CE número 1.1.1.72:

G

Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH) CE número 1.1.1.49:

Glutamato deshidrogenasa (GLDH) CE número 1.4.1.4:

[0082] Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el conjunto de enzimas incluye además una de las enzimas enumeradas anteriormente que pueden utilizarse para la regeneración de NADPH, es decir, una fosfito deshidrogenasa, una glicerol deshidrogenasa, una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o una glutamato deshidrogenasa. Más preferiblemente, el conjunto de enzimas incluye además una enzima seleccionada de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y una glutamato deshidrogenasa.

[0083] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato un codisolvente para solubilizar guanosina y en el caso de D-manosa NAPDH; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; y cualquiera de una fosfito deshidrogenasa, una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NAPDH y el codisolvente.

[0084] En una forma de realización preferida, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa -sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; y una enzima seleccionada de una fosfito deshidrogenasa, una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa;

[0085] En una forma de realización particularmente preferida, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH, L-glutamato y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una glutamato deshidrogenasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH, L-glutamato y el codisolvente.

[0086] En una forma de realización particularmente preferida, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH, D-glucosa y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH, D-glucosa y el codisolvente.

[0087] El término “soporte sólido”, como se usa en el presente documento, se refiere a un material insoluble, funcionalizado, al que se pueden unir o inmovilizar enzimas u otros reactivos, directamente o a través de un enlazador que lleva un grupo de anclaje, lo que permite que las enzimas se separen fácilmente (mediante lavado, filtración, centrifugación, etc.) del exceso de reactivos, productos de reacción solubles, subproductos o disolventes. Un soporte sólido puede estar compuesto por polímeros orgánicos tales como poliestireno, polietileno, polipropileno, polifluoroetileno, polietilenoxi y poliacrilamida, así como copolímeros e injertos de los mismos. Un soporte sólido también puede ser inorgánico, como vidrio, sílice, vidrio de poro controlado (CPG), sílice de fase inversa o metal, como oro o platino. Un soporte sólido también puede consistir en partículas magnéticas. Para obtener una descripción general de los materiales de soporte adecuados para la inmovilización de enzimas, consulte Zdarta et al. Catalysts 20l8, 8, 92, y Datta et al. Biotech 2013 3:1-9.

[0088] La configuración de un soporte sólido puede ser en forma de perlas, monolitos, esferas, partículas, un lecho de partículas, una estera de fibra, gránulos, un gel, una membrana, una membrana de fibra hueca, una membrana de matriz mixta o una superficie. Las superficies pueden ser planas, sustancialmente planas o no planas. Los soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos y pueden tener características de hinchamiento o no hinchamiento. Un soporte sólido se puede configurar en forma de pozo, depresión u otro contenedor, recipiente, característica o ubicación.

[0089] Sorprendentemente, los inventores han descubierto que, al solubilizar guanosina en un codisolvente, como dimetilsulfóxido, se logró una conversión casi completa de guanosina en GDP-fucosa después de tres horas (Ejemplo 2).

Además, el cosolvente no afectó la actividad de las enzimas utilizadas en la preparación de GDP-fucosa. Como codisolvente es adecuado cualquier compuesto que aumente o mejore la solubilidad de la guanosina en agua o tampón.

[0090] Preferiblemente, el codisolvente es un disolvente orgánico seleccionado del grupo que comprende: metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol, terc-butanol, acetonitrilo, acetona y dimetilsulfóxido. Preferiblemente, el codisolvente es un disolvente aprótico polar tal como sulfóxido de dimetilo o dimetilformamida. Más preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina y, en el caso de D-manosa, NADPH; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente,

donde el codisolvente para solubilizar guanosina se selecciona del grupo que comprende metanol, etanol, isopropanol, npropanol, isobutanol, n-butanol, terc-butanol, acetonitrilo, acetona y dimetilsulfóxido.

[0091] Preferiblemente, el codisolvente es un disolvente orgánico seleccionado del grupo que comprende: metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol, terc-butanol, acetonitrilo, acetona y dimetilsulfóxido. Más preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente,

donde el codisolvente para solubilizar la guanosina se selecciona del grupo que comprende: metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol, terc-butanol, acetonitrilo, acetona y dimetilsulfóxido.

[0092] Preferiblemente, la cantidad de codisolvente para solubilizar la guanosina se mantiene lo más baja posible para permitir la solubilización de la guanosina. Por lo tanto, preferiblemente la cantidad de codisolvente es suficiente para solubilizar completamente la guanosina en la solución proporcionada en el paso A) de los métodos inventivos descritos en este documento. Alternativamente, la cantidad de codisolvente es suficiente para solubilizar al menos la mitad de la cantidad de guanosina en la solución proporcionada en el paso A) de los métodos inventivos descritos en este documento.

[0093] Además, la cantidad de codisolvente está entre el 0,01 % en volumen y el 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Más preferiblemente, la cantidad de codisolvente está entre el 0,05 % en volumen y el 25 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Aún más preferiblemente, la cantidad de codisolvente está entre el 0,1 % en volumen y el 15 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Más preferiblemente, la cantidad de codisolvente está entre 0,1 % en volumen y 10 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Lo más preferiblemente, la cantidad de codisolvente está entre 1 % en volumen y 5 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0094] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente, en el que la cantidad de codisolvente para solubilizar la guanosina está entre el 1 % en volumen y el 5 % en volumen con respecto al volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0095] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionando una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

donde la cantidad de codisolvente para solubilizar la guanosina está entre 1 vol% a 5 vol% basado en el volumen total de la solución provista en el paso A).

[0096] En una forma de realización, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

donde la cantidad el codisolvente es sulfóxido de dimetilo y la cantidad de codisolvente está entre el 1 % en volumen y el 5 % en volumen en función del volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0097] En una forma de realización, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente,

donde la cantidad el codisolvente es dimetilsulfóxido y la cantidad de codisolvente está entre

1% en volumen y 5% en volumen basado en el volumen total de la solución provista en el paso A).

[0098] Con la solubilidad aumentada, se pueden realizar mezclas de reacción más concentradas, reduciendo así los costes del proceso. Así, la concentración de guanosina y L-fucosa en la solución proporcionada en el paso A) está preferentemente en el rango de 0,01 mM a 100.000 mM. Más preferentemente, la concentración de guanosina y L-fucosa está preferentemente en el intervalo de 0,05 mM a 50.000 mM. Más preferentemente, la concentración de guanosina y L-fucosa está preferentemente en el intervalo de 0,1 mM a 10.000 mM. Más preferiblemente, la concentración de guanosina y L-fucosa está preferiblemente en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0099] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

donde la concentración de guanosina y L-fucosa en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0100] Con la mayor solubilidad, se pueden realizar mezclas de reacción más concentradas, reduciendo así los costes del proceso. Así, la concentración de guanosina y D-manosa en la solución proporcionada en el paso A) está preferiblemente en el rango de 0,01 mM a 100.000 mM. Más preferentemente, la concentración de guanosina y D-manosa está preferentemente en el intervalo de 0,05 mM a 50.000 mM. Más preferentemente, la concentración de guanosina y D-manosa está preferentemente en el intervalo de 0,1 mM a 10.000 mM. Más preferiblemente, la concentración de guanosina y D-manosa está preferiblemente en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0101] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente,

en donde la concentración de guanosina y D-manosa en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0102] Preferiblemente, la concentración de las enzimas en el conjunto de enzimas está entre 0,0001 mg/mL y 100 mg/mL en base al volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0103] Como producto secundario en la reacción de fucosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-fucosa, así como en la reacción de 1-fosfato de manosa con trifosfato de guanosina a GDP-manosa, el pirofosfato (PPi) es formado. Aunque el pirofosfato es inestable en solución acuosa, solo se hidroliza lentamente en fosfato inorgánico (Pi). Una alta concentración de pirofosfato también puede disminuir la actividad de la enzima L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y manosa-1-fosfato guanililtransferasa involucrada en la formación de GDP-fucosa. La enzima pirofosfatasa es capaz de catalizar la hidrólisis de pirofosfato a fosfato, lo que hace que la formación de GDP-fucosa/GDP-manosa sea irreversible. Así, en una forma de realización preferida de la presente invención, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa.

[0104] El método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una pirofosfatasa, y en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucocinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-dehidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

[0105] La presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y una pirofosfatasa;

[0106] Reformulado, el método inventivo para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

(b1) formar monofosfato de guanosina a partir de guanosina y trifosfato de adenosina siendo catalizado por una guanosina quinasa;

(b2') formar guanosina difosfato a partir de guanosina monofosfato y polifosfato catalizada por una polifosfato quinasa

(b2”) formar guanosina trifosfato a partir de guanosina difosfato y polifosfato catalizada por una polifosfato quinasa,

(c') hacer reaccionar fucosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-fucosa y pirofosfato en presencia de una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y

(c”) convertir pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa.

[0107] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa y una pirofosfatasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa y una pirofosfatasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato, NADpH y el codisolvente por

(a) formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizada por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formar manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizados por glucocinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato catalizados por fosfomanomutasa

(b1) formar monofosfato de guanosina (GMP) a partir de guanosina y trifosfato de adenosina catalizados por una guanosina quinasa;

(c') hacer reaccionar la manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-manosa y pirofosfato en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa

(c”) que convierte el pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa.

(d) formar GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa; y

[0108] Preferiblemente, el método inventivo para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una pirofosfatasa, y en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde la cantidad el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0109] Preferiblemente, el método inventivo para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

donde la cantidad el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0110] Preferiblemente, la pirofosfatasa utilizada en los métodos inventivos descritos en el presente documento es una pirofosfatasa inorgánica. Preferiblemente, la pirofosfatasa es una pirofosfatasa inorgánica de Pasteurella multocida (PmPpA).

[0111] El polifosfato es capaz de formar complejos solubles en agua estables con iones metálicos (p. ej., Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+) que se disolvieron inicialmente en medios acuosos. Este efecto se denomina secuestro y evita que los iones metálicos unidos participen en las reacciones, particularmente en las reacciones enzimáticas. Por lo tanto, los iones metálicos secuestrados, particularmente Mg2+ y Mn2+, no puede actuar como cofactor para las enzimas involucradas en los métodos inventivos descritos en este documento. Como la capacidad de un polifosfato particular para secuestrar un ion metálico particular disminuye al aumentar la longitud de la cadena del polifosfato, en la presente invención se prefieren los polifosfatos de cadena larga. Más preferidos son los polifosfatos que tienen al menos 14 residuos de fosfato. Los más preferidos son los polifosfatos que tienen al menos 25 residuos de fosfato.

[0112] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

donde la cantidad el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato.

[0113] Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa fucosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente;

donde el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato

[0114] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende lo siguiente etapas:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

donde la cantidad el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato y el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0115] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y, opcionalmente, una pirofosfatasa;

donde el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato y el codisolvente es sulfóxido de dimetilo.

[0116] Preferiblemente, las enzimas están presentes en una sola mezcla de reacción con los otros sustratos. La mezcla puede ser homogénea (solución) o heterogénea. Las enzimas pueden estar inmovilizadas sobre un soporte sólido o no. Así, la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa se produce en una única mezcla de reacción según otro aspecto del método inventivo.

[0117] Así, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una mezcla que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(iii) un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

[0118] Así, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una mezcla que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, un codisolvente para solubilizar guanosina y, en el caso de D-manosa, NADPH; y (iii) un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

[0119] Por lo tanto, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una mezcla que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y (iii) un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

[0120] Además, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

[0121] Reformulado, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una mezcla que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

(iii) al menos tres enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia de al menos tres enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente.

[0122] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(iii) un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, opcionalmente una pirofosfatasa y (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDPmanosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato, NADpH y el codisolvente,

donde la cantidad el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0123] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa;

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y (iii) un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y, opcionalmente, una pirofosfatasa;

donde el codisolvente es sulfóxido de dimetilo.

[0124] La síntesis de GDP-fucosa a partir de guanosina y D-manosa requiere NADPH. La cascada es particularmente económica si se recicla NADPH costoso en la cascada. Además, el equilibrio de la reacción puede conducirse hacia GDP-fucosa mediante el reciclaje continuo de NADPH desde NADP+.

[0125] Se puede aplicar cualquiera de las siguientes enzimas para reciclar NADPH de NADP+: una fosfito deshidrogenasa, una glicerol deshidrogenasa, una glucosa deshidrogenasa (GlcDH), una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y una glutamato deshidrogenasa (GLDH).

[0126] Por tanto, en una forma de realización preferida, el conjunto de enzimas incluye además cualquiera de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y una glutamato deshidrogenasa.

[0127] La presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa y una enzima seleccionada de glucosa deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa; o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6 deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, y una enzima seleccionada de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH y el codisolvente, preferiblemente el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0128] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa y cualquiera de glucosa deshidrogenasa, glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa; o

(b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, y cualquiera de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente, preferiblemente sulfóxido de dimetilo mediante

(a) formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizado por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formando manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizada por glucocinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato catalizada por fosfomanomutasa;

(b1) formar guanosina monofosfato (GMP) a partir de guanosina y adenosina trifosfato siendo catalizada por una guanosina quinasa;

(b2') formar guanosina difosfato (GDP) a partir de guanosina monofosfato y polifosfato catalizada por una polifosfato quinasa;

(b2”) formar trifosfato de guanosina (GTP) a partir de difosfato de guanosina y polifosfato catalizados por una quinasa de polifosfato; (c') haciendo reaccionar manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-manosa y pirofosfato en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa (d) formar GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa,

(e) formar GDP-fucosa a partir de GDP-4-deshidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por la GDPL-fucosa sintasa; y

(f) regeneración de NADPH a partir de NADP+ catalizada por cualquiera de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa.

[0129] Preferiblemente, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, una pirofosfatasa y cualquiera de glucosa deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa; o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, una pirofosfatasa y cualquiera de las glucosas deshidrogenasas, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa;

[0130] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

(a) formar de manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizada por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formar manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizada por glucoquinasa y formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato catalizada por fosfomanomutasa;

(b2') formar guanosina difosfato (GDP) a partir de guanosina monofosfato y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa,

(c') hacer reaccionar manosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-manosa y pirofosfato en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa

(e) formar GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por GDPL-fucosa sintasa; y

(f) regenerar NADPH a partir de NADP+ catalizado por cualquiera de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa.

[0131] En la síntesis de GDP-fucosa a partir de guanosina y D-manosa, se puede producir in situ GDP a partir de GMP mediante una guanilato quinasa (GMK).

[0132] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una guanilato quinasa (GMK) y

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; o

(b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

[0133] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; o

(b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, una pirofosfatasa;

(a) formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina siendo catalizado por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formando manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina siendo catalizada por glucoquinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato siendo catalizada por fosfomanomutasa;

(b2') formar guanosina difosfato (GDP) a partir de guanosina monofosfato y polifosfato catalizados por una guanilato quinasa (GMK),

(c') hacer reaccionar manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-manosa y pirofosfato en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa

(e) formación de GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por GDPL-fucosa sintasa.

[0134] Preferiblemente, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar la guanosina; y

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una guanililtransferasa de manosa-1-fosfato, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa- sintasa, una pirofosfatasa; o

[0135] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, una pirofosfatasa; o

o

formar manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina siendo catalizada por glucoquinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato siendo catalizada por fosfomanomutasa;

(c”) convirtiendo pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa.

[0136] Preferiblemente, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, y cualquiera de glucosa deshidrogenasa, glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa; o

[0137] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una guanilato quinasa (GMK) y ya sea

(a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, y cualquiera de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6 -fosfato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa; o

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente, preferiblemente sulfóxido de dimetilo, mediante

(a) formar manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina siendo catalizada por una N-acetilhexosamina-1-quinasa

o

formando manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y adenosina el trifosfato es catalizado por glucoquinasa y forma manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato que es catalizado por fosfomanomutasa;

(c') hacer reaccionar manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina para dar GDP-manosa y pirofosfato en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa;

(d) formar GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa,

[0138] También preferido, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D -manosa

[0139] Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionando una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

o

(c') hacer reaccionar manosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-manosa y pirofosfato en presencia de una D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa (c”) convirtiendo pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa.

[0140] Debido al reciclaje del subproducto NADP+ en los métodos inventivos para producir GDP-fucosa a partir de guanosina y D-manosa descritos en este documento, se requieren menores cantidades de NADPH en la solución proporcionada en el paso A). Así, en una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa está entre 0,01 y 0,5, más preferiblemente entre 0,02 y 0,5, más preferiblemente entre 0,03 y 0,4, más preferiblemente entre 0,03 y 0,3 y lo más preferiblemente entre 0,05 y 0,2. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,5.

[0141] El método inventivo para producir GDP-fucosa también se puede llevar a cabo con un conjunto de enzimas inmovilizadas. A continuación, las enzimas se inmovilizan sobre un soporte sólido de modo que conserven su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades. Los soportes sólidos adecuados son, por ejemplo, perlas, monolitos, esferas, partículas, un lecho de partículas, una estera de fibra, gránulos, un gel, una membrana, una membrana de fibra hueca, una membrana de matriz mixta, una superficie u otro material en fase sólida. En una forma de realización, cada enzima, es decir, la guanosina quinasa, la polifosfato quinasa, la L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y opcionalmente la pirofosfatasa, se inmoviliza sobre un soporte sólido. En una forma de realización adicional, cada enzima, es decir, la guanosina quinasa, la polifosfato quinasa, la glucoquinasa, la fosfomanomutasa, la manosa-1-fosfato guanililtransferasa, la GDP-manosa-4,6-deshidratasa, la GDP-L-fucosa-sintasa, opcionalmente la pirofosfatasa, opcionalmente la guanilato quinasa y opcionalmente una enzima seleccionada de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y una glutamato deshidrogenasa, se inmoviliza sobre un soporte sólido. En una forma de realización adicional, cada enzima, es decir, la guanosina quinasa, el polifosfato quinasa, la N-acetilhexosamina-1-quinasa, la manosa-1-fosfato guanililtransferasa, la GDP-manosa 4,6-deshidratasa, la GDP-L-fucosasintasa, opcionalmente la pirofosfatasa, opcionalmente la guanilato quinasa y una enzima seleccionada de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y una glutamato deshidrogenasa, se inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0142] En una forma de realización, solo algunas de las enzimas del conjunto de enzimas están inmovilizadas sobre un soporte sólido. En una forma de realización adicional, solo una enzima seleccionada del conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa o una combinación de polifosfato quinasas, por ejemplo, la combinación 1D y 2D-ppk2 y ppk3, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y opcionalmente se inmoviliza una pirofosfatasa sobre un soporte sólido. En otra forma de realización más, al menos una enzima seleccionada del conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1fosfato guanililtransferasa y opcionalmente una pirofosfatasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferiblemente, la polifosfato quinasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferiblemente, la guanosina quinasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferentemente, la L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferentemente, la pirofosfatasa se inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0143] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina y, en el caso de dmanosa, NADPH; y

donde el conjunto de enzimas se une o inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0144] Por lo tanto, la presente invención también se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa-fucosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente, donde el conjunto de enzimas se une o inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0145] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde el conjunto de enzimas se une o inmovilizado sobre un soporte sólido.

[0146] Además, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una pirofosfatasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde el conjunto de enzimas se une o inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0147] Además, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa fucosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa y una pirofosfatasa;

donde el conjunto de enzimas se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido.

[0148] Además, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una pirofosfatasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde el conjunto de enzimas se inmoviliza en un soporte sólido.

[0149] La presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

donde al menos una enzima del conjunto de enzimas se encuentra inmovilizada sobre un soporte sólido.

[0150] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa-fucosa,

donde al menos una enzima del conjunto de enzimas se inmoviliza en un apoyo sólido.

[0151] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde la cantidad al menos una enzima del conjunto de enzimas se inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0152] Preferiblemente, las enzimas utilizadas en los métodos de la invención descritos en el presente documento se coinmovilizan sobre un soporte sólido. La inmovilización de enzimas que actúan secuencialmente dentro de un espacio confinado aumenta la eficiencia catalítica de conversión debido a la reducción drástica del tiempo de difusión del sustrato. Además, la formación in situ de sustratos genera altas concentraciones locales que conducen a mejoras cinéticas y pueden equivaler a ahorros sustanciales de costos. La co-inmovilización generalmente se logra mezclando las enzimas antes de la inmovilización en un soporte sólido.

[0153] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde el conjunto de enzimas se encuentra coinmovilizado sobre un soporte sólido.

[0154] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa-fucosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente,

donde el conjunto de enzimas se coinmoviliza sobre un soporte sólido.

[0155] Por lo tanto, la presente invención también se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

donde la cantidad el conjunto de enzimas está coinmovilizado sobre un soporte sólido.

[0156] La presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

[0157] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

[0158] Por lo tanto, la presente invención también se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosasintasa;

[0159] La presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente, donde la cantidad el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0160] Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa-fucosa,

donde la cantidad el codisolvente es sulfóxido de dimetilo.

[0161] Por lo tanto, la presente invención también se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D- manosa,

donde la cantidad el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0162] La presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

donde la cantidad el soporte sólido tiene forma de perlas, monolitos, esferas, partículas, lecho de partículas, estera de fibra, gránulos, gel, membrana, membrana de fibra hueca, una membrana de matriz mixta o una superficie.

[0163] En tales formas de realización, las enzimas inmovilizadas pueden facilitar la producción de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa, y una vez que se completa la reacción, las enzimas inmovilizadas se retienen fácilmente (p. ej., reteniendo perlas en en el que las enzimas se inmovilizan) y luego se reutilizan o reciclan en procesos posteriores. Dichos procesos biocatalíticos inmovilizados permiten una mayor eficiencia y reducción de costos. Además, el método de la invención se puede realizar de manera continua pasando la solución de alimentación del paso A) a través de un reactor que contiene el conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido.

[0164] Así, en una forma de realización, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución de alimentación que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, y en el caso de L-fucosa una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o en el caso de D-manosa (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, donde el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas se encuentra en un reactor químico,

B) producir guanosina 5'-difosfo- p- L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH y el co -disolvente haciendo pasar en continuo la solución de alimentación del paso A) por el reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas.

[0165] También el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución de alimentación que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, donde el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas co-inmovilizadas se encuentra en un reactor químico,

B) productor de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente haciendo pasar en continuo la solución de alimentación del paso A) por el reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas coinmovilizadas,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0166] Por lo tanto, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución de alimentación que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa, donde el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas coinmovilizadas es ubicado en un reactor químico,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente pasando continuamente la solución de alimentación del paso A) a través del reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas co inmovilizadas,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0167] Por lo tanto, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución de alimentación que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDPmanosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa, en donde el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas co-inmovilizadas se ubica en un reactor químico,

B) produciendo guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente haciendo pasar en continuo la solución de alimentación del paso A) por el reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas co-inmovilizadas,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0168] Los métodos de inmovilización de enzimas son bien conocidos en la técnica. Las enzimas se pueden unir de forma no covalente o covalente, como adsorción, unión covalente, unión iónica, unión de metales, reticulación o cristalización. Varios métodos para la conjugación e inmovilización de enzimas en soportes sólidos (p. ej., resinas, membranas, perlas, vidrio, etc.) son bien conocidos en la técnica y se describen en, p. ej. ej., Yi et al., Process Biochemistry 2007, 42, 895; Martin et al., Applied Microbiology and Biotechnology 2007, 76, 843; Koszelewski et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2010, 63, 39; Truppo y col., Org. Process Res. Dev., 2011, 15, 1033; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, segunda edición, Academic Press (2008); Mateo et al., Biotechnology Progress, 2002, 18, 629; y Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, C.M. Niemeyer ed., Humana Press (2004).

[0169] Las enzimas utilizadas en los métodos inventivos descritos en el presente documento se pueden preparar mediante métodos recombinantes a partir de bacterias, como E. coli. Las soluciones que contienen enzimas obtenidas de la lisis celular, que normalmente se centrifugan y filtran para eliminar los restos celulares, se pueden utilizar directamente para inmovilizar las enzimas sobre un soporte sólido. Por lo tanto, no se requiere ningún paso de purificación o aislamiento adicional y el lisado celular crudo se puede usar para inmovilizar las enzimas en un soporte sólido de modo que conserven su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades.

[0170] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato y en el caso de d-manosa NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, y en el caso de L-fucosa una L-fucoquinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o en el caso de D-manosa (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente,

donde el conjunto de enzimas se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido a partir de lisado celular.

[0171] Además, la presente invención se dirige a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

donde el conjunto de enzimas se inmoviliza sobre un soporte sólido a partir de lisado celular crudo.

[0172] Además, la presente invención está dirigida a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, opcionalmente una pirofosfatasa, y en el caso de L-fucosa una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o en el caso de D-manosa (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

donde el conjunto de enzimas se coinmoviliza sobre un soporte sólido a partir de lisado celular.

[0173] Además, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, opcionalmente una pirofosfatasa y en el caso de L-fucosa una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o en el caso de D-manosa ya sea (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente, donde el conjunto de enzimas está coinmovilizado sobre un soporte sólido a partir de lisado celular, y el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0174] Además, la presente invención se refiere a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, opcionalmente una pirofosfatasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

en el que al menos una enzima del conjunto de enzimas se coinmoviliza sobre un soporte sólido a partir de un lisado celular.

[0175] Los soportes sólidos útiles para inmovilizar las enzimas utilizadas en el método de la presente invención incluyen, entre otros, perlas o resinas que comprenden polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones amino epóxido, polimetacrilato con etilendiamina. grupos funcionales, ácido poliacrílico con funciones epoxi, ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amino C6 espaciador, ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amina terciaria, poliestireno con funciones aniónicas/amina cuaternaria, poliestireno con funciones catiónicas/sulfónicas, ácido poliacrílico con funciones éster carboxílico, poliestireno con funciones fenilo, polimetacrilato con funciones octadecilo, poliestireno con funciones estireno/metilo, partículas magnéticas de sílice con función Ni-NTA, o nanopartículas magnéticas con núcleo de magnetita y cubierta de dextrano con grupo funcional Ni-NTA. Los ejemplos de soportes sólidos útiles para inmovilizar las enzimas usadas en el método de la invención incluyen, entre otros, perlas separadas (Resindion): CE-EP, EP403/M, CE-HFA, CE-ENM y CE-HA; immobeads (ChiralVision) IB-COV1, IB-COV2, IB-COV3, IB-ANI1, IB-ANI2, IB-ANI3, IB-ANI4, IB-CAT1, IB-ADS1, IB-ADS2, IB-ADS3 e IB-ADS4; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG) y partículas magnéticas (micromod GmbH): Nano-mag, Sicastar-6 y Sicastar-1.5. Preferentemente, el soporte sólido está compuesto por una resina o perlas seleccionadas entre: perlas separadas (Resindion): CE-EP, EP403/M, CE-ENM y CE-HA; immobeads (ChiralVision) IB-COV1, IB-COV2, IB-COV3, IB-ANI1, IB-CAT1, IB-ADS1, IB-ADS2, IB-ADS3 e IB-ADS4; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG) y partículas magnéticas (micromod GmbH): Nano-mag, Sicastar-6 y Sicastar-1.5.

[0176] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

donde la cantidad el soporte sólido está compuesto por una resina o perlas seleccionadas entre: perlas separadas: CE-EP, EP403/M, CE-ENM y CE-HA; immobeads: IB-COV1, IB-COV2, IB-COV3, IB-ANI1, IB-CAT1, IB-ADS1, IB-ADS2, IBADS3 y IB-ADS4; Eupergit y partículas magnéticas: Nano-mag, Sicastar-6 y Sicastar-1.5.

[0177] Además, la presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

donde la cantidad el soporte sólido está compuesto por una resina o perlas seleccionadas entre: perlas separadas: CE-EP, EP403/M, CE-ENM y CE-HA; immobeads: IB-COV1, IB-COV2, IB-COV3, IB-ANI1, IB-CAT1, IB-ADS1, IB-ADS2, IB-ADS3 y IB-ADS4; Eupergit y partículas magnéticas: Nano-mag, Sicastar-6 y Sicastar-1.5; y en el que el codisolvente es sulfóxido de dimetilo.

[0178] Además, la presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

donde el soporte sólido está compuesto por perlas o resinas que comprenden polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones amino epóxido, polimetacrilato con funciones etilendiamina, ácido poliacrílico con funciones epoxi, ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amino C6 espaciador, ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amina terciaria, poliestireno con funciones aniónicas/amina cuaternaria, poliestireno con funciones catiónicas/sulfónicas, ácido poliacrílico con éster carboxílico grupos funcionales, poliestireno con funciones fenilo, polimetacrilato con funciones octadecilo, poliestireno con funciones estireno/metilo, partículas magnéticas de sílice con función Ni-NTA, o nanopartículas magnéticas con núcleo de magnetita y cubierta de dextrano con grupo funcional Ni-NTA.

[0179] En otra forma de realización de la presente invención, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa comprende el paso adicional C):

C) aislar la guanosina 5'-difosfo- p- L-fucosa.

[0180] En una forma de realización adicional de la presente invención, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa comprende el paso adicional C):

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa por cromatografía de intercambio de iones.

[0181] Por lo tanto, la presente invención se refiere además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

[0182] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa-fucosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente; y

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

[0183] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; y una pirofosfatasa;

C) aislando la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

[0184] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa; y una pirofosfatasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

[0185] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, opcionalmente una pirofosfatasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, ya sea (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente; y

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa,

[0186] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; y opcionalmente una pirofosfatasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

[0187] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa; y opcionalmente una pirofosfatasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

[0188] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o de guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, opcionalmente una pirofosfatasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDPmanosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa,

donde el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre un soporte sólido a partir de lisado celular.

[0189] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0190] Preferiblemente, la cantidad de codisolvente es del 0,01 % en volumen al 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo y la cantidad de sulfóxido de dimetilo es de 0,01 % en volumen a 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0191] Preferiblemente, el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato.

[0192] Preferiblemente, la concentración de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0193] Preferiblemente, el método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa; y opcionalmente una pirofosfatasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0194] Preferiblemente, la cantidad de codisolvente es del 0,01 % en volumen al 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo y la cantidad de sulfóxido de dimetilo es de 0,01 % en volumen a 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0195] Preferiblemente, el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato.

[0196] Preferiblemente, la concentración de guanosina y L-fucosa en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

Sacáridos fucosilados, glicopéptidos fucosilados, glicoproteínas fucosiladas, proteínas fucosiladas, péptidos fucosilados y moléculas pequeñas fucosiladas, como la stevia.

[0197] En otro aspecto de la presente invención, los métodos inventivos descritos en el presente documento son útiles para producir sacáridos fucosilados, glicopéptidos fucosilados, glicoproteínas fucosiladas, proteínas fucosiladas, péptidos fucosilados o moléculas pequeñas fucosiladas, por ejemplo, stevia.

[0198] Así, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente, y

D) produciendo un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una pequeña molécula fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa.

[0199] Así, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una fucosiltransferasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

D) producir un sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña por formar un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa.

[0200] Así, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH y el codisolvente; y

[0201] En una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una pequeña molécula fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa; y

[0202] En una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa; y

[0203] En una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa; y

[0204] La fucosiltransferasa cataliza la reacción de GDP-fucosa con un grupo hidroxilo disponible de un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña, formando así un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido o una molécula pequeña fucosilada y difosfato de guanosina (GDP) como producto secundario. Al ser el GDP un producto intermedio formado en el paso B), concretamente en el paso (b2'), puede ser reutilizado o reciclado.

[0205] Así, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

(b2') formar guanosina difosfato a partir de guanosina monofosfato y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa

(b2”) formar guanosina trifosfato a partir de guanosina difosfato y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y

(c) hacer reaccionar fucosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-fucosa en presencia de una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa;

D) producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa y E) reciclar el difosfato de guanosina formado in situ para formar trifosfato de guanosina.

[0206] Así, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa;

proporcionar un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa y una pirofosfatasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa,

o

formando manosa-6-fosfato (Man-6-P) a partir de D-manosa y trifosfato de adenosina catalizada por glucoquinasa y formando manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de manosa-6-fosfato siendo catalizada por fosfomanomutasa

D) producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa; y

E) reciclar el difosfato de guanosina formado in situ para formar trifosfato de guanosina.

[0207] Debido al reciclado del subproducto guanosina difosfato en los métodos de fucosilación inventivos descritos en el presente documento, se requieren menores cantidades de guanosina en la solución proporcionada en el paso A). Así, en una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa está entre 0,01 y 0,5, más preferiblemente entre 0,02 y 0,5, más preferiblemente entre 0,03 y 0,4, más preferiblemente entre 0,03 y 0,3 y lo más preferiblemente, entre 0,05 y 0,2. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,5.

[0208] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

D) que produce un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una pequeña molécula fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo- p-I-fucosa y un sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa,

F) aislar el sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada.

[0209] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

D) producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación un enlace O-glucosídico entre guanosina 5-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa; y

F) aislar el sacárido fucosilado, el glicopéptido fucosilado, la glicoproteína fucosilada, la proteína fucosilada, el péptido fucosilado o la molécula pequeña fucosilada.

[0210] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, (a) una glucoquinasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetil-hexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa; y

D) producir un sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña por formando un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0211] Preferiblemente, la cantidad de codisolvente es del 0,01 % en volumen al 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo y la cantidad de sulfóxido de dimetilo es de 0,01 % en volumen a 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0212] Preferiblemente, el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato.

[0213] Preferiblemente, la concentración de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0214] Preferiblemente, la concentración de las enzimas en el conjunto de enzimas está entre 0,0001 mg/mL y 100 mg/mL en base al volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0215] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

D) producir un sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña por formando un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0216] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

D) producir un sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña por formando un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa,

donde el codisolvente es dimetilsulfóxido.

[0217] Preferiblemente, la cantidad de codisolvente es del 0,01 % en volumen al 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A). Preferiblemente, el codisolvente es sulfóxido de dimetilo y la cantidad de sulfóxido de dimetilo es de 0,01 % en volumen a 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0218] Preferiblemente, el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato.

[0219] Preferiblemente, la concentración de guanosina y L-fucosa en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.

[0220] Preferiblemente, la concentración de las enzimas en el conjunto de enzimas está entre 0,0001 mg/mL y 100 mg/mL en base al volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

[0221] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucocinasa / L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucocinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa; y una pirofosfatasa;

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa; y

D) producir un sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña por formar un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa.

[0222] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa, una fucosiltransferasa y una pirofosfatasa;

[0223] Preferiblemente, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa,

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente; y

D) producir un sacárido fucosilado, glicopéptido fucosilado, glicoproteína fucosilada, proteína fucosilada, péptido fucosilado o molécula pequeña fucosilada a partir de guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña por formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-I-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de una fucosiltransferasa,

donde al menos una enzima de el conjunto de enzimas se inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0224] En una forma de realización, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

en donde al menos una enzima de el conjunto de enzimas se inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0225] En una forma de realización, el método para producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña fucosilada comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa,

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y fucosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH y el codisolvente; y

en donde al menos una enzima del conjunto de enzimas se inmoviliza sobre un soporte sólido.

[0226] En una forma de realización, los sacáridos de leche fucosilados se producen mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento. Así, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa,

D) producir un sacárido de leche fucosilado a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un sacárido de leche mediante la formación de un enlace O-glicosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido de la leche, en presencia de una fucosiltransferasa.

[0227] En una forma de realización, los sacáridos de leche fucosilados se producen mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento. Así, en una forma de realización el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionando una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

D) producir un sacárido de leche fucosilado a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un sacárido de leche formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido de la leche, en presencia de una fucosiltransferasa.

[0228] Preferiblemente, los sacáridos de leche fucosilados se seleccionan del grupo que comprende 2'-fucosilactosa, 3-fucosilactosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa III, lacto-N-difucohexaosa I y lacto-N-difucohexaosa II (ver Figura 6).

[0229] En una forma de realización preferida, la 2'-fucosilactosa se produce mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento (Figura l0 ). Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina y en caso de dmanosa NADPH; y

D) producir 2'-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo- p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de una fucosiltransferasa.

[0230] En una forma de realización preferida, la 2'-fucosilactosa se produce mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

D) producir 2'-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de galactósido-alfa-(1,2)-fucosiltransferasa de tipo 1.

[0231] En una forma de realización preferida, el método para producir 2'-fucosilactosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato y un co -disolvente para solubilizar guanosina y en el caso de dmanosa NADPH; y

D) producir 2'-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo- p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de galactósido-alfa-(1,2)-fucosiltransferasa tipo 1; y

[0232] En una forma de realización preferida, la 3-fucosilactosa se produce mediante los métodos inventivos descritos en este documento (Figuras 18 y 19). Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

D) producir 3-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de una fucosiltransferasa.

[0233] En una forma de realización preferida, la 3-fucosilactosa se produce mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, ya sea (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

D) producir 3-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de 3/4-fucosiltransferasa.

[0234] En una forma de realización preferida, la 3-fucosilactosa se produce mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento. Así, en una forma de realización el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas polifosfato, adenosina trifosfato y el codisolvente o a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente,

[0235] En una forma de realización preferida, el método para producir 3-fucosilactosa comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato y una codisolvente para solubilizar guanosina y en el caso de dmañosa NADPH; y

D) producir 3-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de 3/4-fucosiltransferasa; y

[0236] Debido al reciclado del subproducto guanosina difosfato en los métodos de fucosilación inventivos descritos en el presente documento, se requieren menores cantidades de guanosina en la solución proporcionada en el paso A). Así, en una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa está entre 0,01 y 0,5, más preferiblemente entre 0,02 y 0,5, más preferiblemente entre 0,03 y 0,4, más preferiblemente entre 0,03 y 0,3 y lo más preferiblemente, entre 0,05 y 0,2. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,5.

[0237] En una forma de realización preferida, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH, L-glutamato y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprenden una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa, una glutamato deshidrogenasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

D) producir 3-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de 3/4- fucosiltransferasa,

E) reciclar el difosfato de guanosina formado in situ para formar trifosfato de guanosina,

F) regenerar NADPH a partir de NADP+ formado in situ siendo catalizada por una glutamato deshidrogenasa.

[0238] En una forma de realización preferida, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, adenosina trifosfato, NADPH, D-glucosa y un codisolvente para solubilizar guanosina; y

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH, D-glucosa y el codisolvente,

D) producir 3-fucosilactosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y lactosa formando un enlace O-glucosídico entre guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible de la lactosa, en presencia de 3/4-fucosiltransferasa,

[0239] Debido al reciclaje del subproducto NADP+ en los métodos inventivos para producir GDP-fucosa a partir de guanosina y D-manosa descritos en el presente documento, se requieren menores cantidades de NADPH en la solución proporcionada en el paso A). Así, en una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa está entre 0,01 y 0,5, más preferiblemente entre 0,02 y 0,5, más preferiblemente entre 0,03 y 0,4, más preferiblemente entre 0,03 y 0,3 y lo más preferiblemente entre 0,05 y 0,2. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de NADPH a D-manosa es 0,5.

Producción de L-fucosa

[0240] Dado que la L-fucosa se puede considerar como un azúcar caro (a escalas muy grandes), la síntesis de L-fucosa a partir de D-manosa se proporciona además con el método de la presente invención. Primero se produce GDP-fucosa a partir de D-manosa y guanosina como se describe en este documento. Posteriormente, mediante la adición de una fucosiltransferasa (CE 2.4.1.344 o CE 2.4.1.69) o una fucosidasa (CE 3.2.1.51) sin adición de ningún aceptor, la GDP-fucosa se hidrolizará a fucosa, ya que la transferasa puede funcionar de manera reversible. El esquema de reacción se muestra en la Figura 9. Por lo tanto, la L-fucosa se puede producir a partir de sustratos de bajo costo como la D-manosa y la guanosina.

[0241] Alternativamente, la L-fucosa se produce simplemente calentando la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a una temperatura en un rango de 80 a 100 °C como se describe en el Ejemplo 10. Preferiblemente, la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa se calienta a esta temperatura durante 0,5 a 3 horas, preferiblemente 0,5 a 2 horas, más preferiblemente 0,5 a 1,5 horas, lo más preferiblemente durante 1 hora.

[0242] Por lo tanto, en una forma de realización, la L-fucosa se produce mediante el método inventivo como se describe en el presente documento a partir de guanosina y D-manosa. Así, en una forma de realización el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa; y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

D) producir L-fucosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa en presencia de una fucosiltransferasa y en ausencia de un aceptor; o producir L-fucosa calentando guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a una temperatura en un rango de 80 a 100°C.

[0243] Por lo tanto, en una forma de realización, la L-fucosa se produce mediante el método inventivo como se describe en el presente documento a partir de guanosina y D-manosa. Así, en una forma de realización el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

D) producir L-fucosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa en presencia de galactósido-alfa-(1,2)-fucosiltransferasa de tipo 1 y en ausencia de un aceptor,

o producir L-fucosa calentando guanosina 5'-difosfo- p- L -fucosa a una temperatura en un rango de 80 a 100°C.

[0244] Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(i) guanosina y D-manosa

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y un codisolvente para solubilizar guanosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa; y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, ⁿA ^dPH y el codisolvente,

D) producir L-fucosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa en presencia de galactósido-alfa-(1,2)-fucosiltransferasa de tipo 1 y en ausencia de un aceptor, o produciendo L-fucosa calentando guanosina 5'-difosfop- L -fucosa a una temperatura en un intervalo de 80 a 100°C, y

[0245] Debido al reciclado del subproducto guanosina difosfato en los métodos de fucosilación inventivos descritos en el presente documento, se requieren menores cantidades de guanosina en la solución proporcionada en el paso A). Así, en una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa está entre 0,01 y 0,5, más preferiblemente entre 0,02 y 0,5, más preferiblemente entre 0,03 y 0,4, más preferiblemente entre 0,03 y 0,3 y lo más preferiblemente, entre 0,05 y 0,2. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de guanosina a L-fucosa o guanosina a D-manosa es 0,5.

[0246] Como se usa en el presente documento, el término “aceptor” se refiere a cualquier molécula o macromolécula, incluido un sacárido, péptido o proteína que es capaz de ser fucosilado por una fucosiltransferasa, es decir, actuar como sustrato en la reacción catalizada por una fucosiltransferasa como se describe en este documento. Así, el aceptor evita la hidrólisis de GDP-fucosa por fucosiltransferasa en medios acuosos. Particularmente, el aceptor es un aceptor de glicosilo que es nucleófilo. Preferiblemente, el aceptor de glicosilo tiene un grupo nucleofílico basado en oxígeno-carbono, nitrógeno o azufre que puede formar un enlace glicosídico covalente con el resto fucosil de GDP-fucosa.

[0247] En cualquiera de los métodos inventivos descritos anteriormente, preferiblemente la glucoquinasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; la fosfomanomutasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; la N-acetilhexosamina-1-quinasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; la manosa-1-fosfato guaniltransferasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; la GDP-manosa-4,6-deshidratasa comprende al menos el 85 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5; la GDP-L-fucosa-sintasa comprende al menos el 85 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6; la L-fucoquinasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; la guanosina quinasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; la polifosfato quinasa comprende cualquiera de al menos el 85% de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 9 (2D-PPK₂) y SEQ ID NO: 14 (PPK3); la pirofosfatasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; la guanilato quinasa (GMK) comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11; la glutamato deshidrogenasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13; la glucosa deshidrogenasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15; la fucosiltransferasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 (3/4FT).

[0248] También preferiblemente, en cualquiera de los métodos inventivos descritos anteriormente, la glucoquinasa comprende al menos el 90% de una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; la fosfomanomutasa comprende al menos el 90% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; la N-acetilhexosamina-1-quinasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; la manosa-1-fosfato guaniltransferasa comprende al menos el 90% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; la GDP-manosa-4,6-deshidratasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5; la GDP-L-fucosa-sintasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6; la L-fucoquinasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; la guanosina quinasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; la polifosfato quinasa comprende cualquiera de al menos el 90 % de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 9 (2D-PPK₂) y SEQ ID NO: 14 (PPK3); la pirofosfatasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; la guanilato quinasa (GMK) comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11; la glutamato deshidrogenasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13; la glucosa deshidrogenasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15; la fucosiltransferasa comprende al menos el 90 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 (3/4FT).

[0249] Más preferiblemente, en cualquiera de los métodos inventivos descritos anteriormente, la glucoquinasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; la fosfomanomutasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; la N-acetilhexosamina-1-quinasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; la manosa-1-fosfato guaniltransferasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; la GDP-manosa-4,6-deshidratasa comprende al menos el 95 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5; la GDP-L-fucosa-sintasa comprende al menos el 95 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6; la L-fucoquinasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; la guanosina quinasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; la polifosfato quinasa comprende cualquiera de al menos el 95% de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 9 (2D-PPK₂) y SEQ ID NO: 14 (PPK3); la pirofosfatasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; la guanilato quinasa (GMK) comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11; la glutamato deshidrogenasa comprende al menos el 95% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa comprende al menos el 95 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13; la glucosa deshidrogenasa comprende al menos el 95 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15; la fucosiltransferasa comprende al menos el 95 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 (3/4FT).

[0250] Aún más preferiblemente, en cualquiera de los métodos inventivos descritos anteriormente, la glucoquinasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; la fosfomanomutasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; la N-acetilhexosamina-1-quinasa comprende al menos el 98% de un aminoácido la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3; la manosa-1-fosfato guaniltransferasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; la GDP-manosa-4,6-deshidratasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5; la GDP-L-fucosa-sintasa comprende al menos el 98 % de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6; la L-fucoquinasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; la guanosina quinasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; la polifosfato quinasa comprende cualquiera de al menos el 98% de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 9 (2D-PPK₂) y SEQ ID NO: 14 (PPK3); la pirofosfatasa comprende al menos el 85% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; la guanilato quinasa (GMK) comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11; la glutamato deshidrogenasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13; la glucosa deshidrogenasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15; la fucosiltransferasa comprende al menos el 98% de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 (3/4FT).

[0251] Más preferiblemente, en cualquiera de los métodos inventivos descritos anteriormente, la glucoquinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; la fosfomanomutasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2; la N-acetilhexosamina-1-quinasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; la manosa-1-fosfato guaniltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; la GDP-manosa-4,6-deshidratasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ Id NO: 5; la GDP-L-fucosa-sintasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6; la L-fucoquinasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; la guanosina quinasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; la polifosfato quinasa comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 9 (2D-PPK₂) y SEQ ID NO: 14 (PPK3); la pirofosfatasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; la guanilato quinasa (GMK) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11; la glutamato deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13; la glucosa deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15; la fucosiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 (3/4FT).

Descripción de las figuras

[0252]

Figura 1: muestra la ruta de reacción del método inventivo para producir GDP-fucosa, que consiste en (a) formar de fucosa-1-fosfato (Fuc-1-P) a partir de L-fucosa y ATP, (b) la formación de guanosina trifosfato (GTP) a partir de guanosina y polifosfato, y (c) la reacción de fucosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-fucosa.

Figura 2: muestra un esquema de reacción ejemplar del método inventivo para producir GDP-fucosa, que consiste en (a) formar de fucosa-1-fosfato (Fuc-1-P) a partir de L-fucosa y ATP catalizada por fucoquinasa (9), (b) la formación de guanosina trifosfato (GTP) a partir de guanosina y polifosfato catalizada por guanosina quinasa/inosina quinasa (7) y polifosfato quinasa (8), y (c) la reacción de fucosa-1-fosfato con guanosina trifosfato para GDP-fucosa catalizada por fucosa-1-fosfato guanililtransferasa (9)

Figura 3: muestra un esquema de reacción ejemplar del método inventivo para producir GDP-fucosa, que consiste en (a) formar de manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y ATP catalizada por glucocinasa (1) y fosfomanomutasa (2) o N-acetilhexosamina-1-quinasa (3), (b) la formación de trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina y polifosfato catalizada por guanosina quinasa/inosina quinasa (7) y polifosfato quinasa (8), y (c) la reacción de manosa-1-fosfato con guanosina trifosfato a GDP-manosa catalizada por manosa-1-fosfato guanililtransferasa (4) y (d) formación de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa (5) y (e) formación de GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro- 6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizados por GDP-L-fucosa sintasa (6).

Figura 4A: muestra la concentración de GDP-fucosa preparada por el método inventivo en diferentes puntos de tiempo (ver Ejemplo 3).

Figura 4B: muestra la concentración de GDP-fucosa preparada por el método inventivo usando enzimas inmovilizadas en diferentes momentos (ver Ejemplo 5).

Figura 5A: muestra un cromatograma del material de partida en t=0.

Figura 5B: muestra un cromatograma de la mezcla de reacción después de 48 horas.

Figura 6: muestra ejemplos de sacáridos de leche fucosilados.

Figura 7: muestra la cantidad de enzimas unidas en un soporte sólido después de la incubación a 4 °C durante 24 horas (ver Ejemplo 4).

Figura 8: muestra la cantidad de GDP-fucosa formada después de la reacción con las enzimas inmovilizadas durante 24 horas a 30 °C (ver Ejemplo 4).

Figura 9: muestra el esquema de reacción ejemplar del método inventivo para producir L-fucosa a partir de guanosina y D-manosa, que consiste en (a) formar de manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y ATP catalizado por glucoquinasa (1) y fosfomanomutasa (2) o N-acetilhexosamina-1-quinasa (3), (b) la formación de trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina y polifosfato catalizada por guanosina quinasa/inosina quinasa (7) y polifosfato quinasa (8), y (c) la reacción de manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-manosa catalizada por manosa-1-fosfato guanililtransferasa y (d) formación de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa y (e) formación de GDP-fucosa a partir de GDP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por GDP-L-fucosa sintasa y formación de L-fucosa a partir de GDP-L-fucosa catalizada por galactósido alfa-(1,2)-fucosiltransferasa tipo 1 en ausencia de una molécula aceptora.

Figura 10: muestra un esquema de reacción ejemplar del método inventivo para producir 2'-fucosilactosa a partir de guanosina y D-manosa, que consiste en (a) formar de manosa-1-fosfato (Man-1-P) a partir de D-manosa y ATP catalizada por glucoquinasa (1) y fosfomanomutasa (2) o N-acetilhexosamina-1-quinasa (3), (b) la formación de trifosfato de guanosina (GTP) a partir de guanosina y polifosfato catalizada por guanosina quinasa/inosina quinasa (7) y polifosfato quinasa (8), y (c) la reacción de manosa-1-fosfato con trifosfato de guanosina a GDP-manosa catalizada por manosa-1-fosfato guanililtransferasa y (d) formación de GDP-4-dehidro-6-desoxi -alfa-D-manosa a partir de GDP-manosa catalizada por GDP-manosa-4,6-deshidratasa y (e) formación de GDP-fucosa a partir de GOP-4-dehidro-6-desoxi-alfa-D-manosa y NADPH catalizada por GDPL-fucosa sintasa y formación de 2'-fucosilactosa a partir de GDP-L-fucosa y lactosa catalizada por galactósido alfa-(1,2)-fucosiltransferasa tipo 1.

Figura 11: muestra la cascada de reacción de (A1) GDP-manosa a GDP-fucosa realizada en el Ejemplo 6-A1;

(A2) GDP-manosa a GDP-fucosa en presencia de glucosa y G6PDH como se realizó en el Ejemplo 6-A2; y (A3) manosa y GTP a GDP-fucosa en presencia de glutamato y GLDH como se realizó en el Ejemplo 6-A3. Se llevaron a cabo reacciones para demostrar que el reciclaje de NADPH puede conducir el equilibrio de la reacción multienzimática hacia el lado de la GDP-fucosa.

Figura 12: muestra el cromatograma de alícuotas de reacción de las reacciones A1, A2 y A3 después de la incubación durante la noche). El cromatograma (A1) muestra que el equilibrio de la reacción está del lado de la GDP-manosa. Cuando se implementa el reciclaje de NADPH, el equilibrio de la reacción puede conducirse hacia GDP-fucosa (ver A2 y A3).

Figura 13: muestra la cascada de reacción de la cascada de reacción de manosa y guanosina a GDP-fucosa como se realizó en el Ejemplo 7.

Figura 14: muestra el transcurso del tiempo de reacción en el ejemplo 7 medido por cromatografía iónica.

Figura 15: muestra la cascada de reacción de manosa y guanosina a GDP-fucosa como se realizó en el Ejemplo 8.

Figura 16: muestra el transcurso del tiempo de reacción de la reacción en el ejemplo 8 medido por cromatografía iónica.

Figura 17: muestra la cascada de reacción de mañosa y guanosina a 3-fucosilactosa como se realizó en el Ejemplo 9.

Figura 18: muestra la síntesis de 3-fucosilactosa a partir de manosa y guanosina. Cromatograma de reacción de una alícuota de reacción tomada después de un tiempo de reacción de 48 horas (negro) y de muestras estándar de 3-fucosilactosa. Los picos se detectaron mediante detección amperométrica.

Figura 19: muestra la síntesis de 3-fucosilactosa a partir de guanosina y fucosa (reacción D2 del ejemplo 9). Cromatograma de una alícuota de reacción tomada después de un tiempo de reacción de 48 horas. Los picos se detectaron por detección de amperometría.

Figura 20: muestra la producción de L-fucosa a partir de D-manosa. La reacción de la muestra del ejemplo 8 se calentó durante 1 hora a 95°C (véase el ejemplo 10). Se tomó una alícuota de la muestra calentada y se midió por cromatografía iónica con detección amperométrica (negro) y se comparó con un estándar de fucosa (Fuc).

Ejemplos

Abreviaturas y Acrónimos

[0253]

ADP adenosina 5'-difosfato

ATP adenosina 5'-trifosfato

Fuc L-fucosa

GSK guanosina quinasa

GDP guanosina 5'-difosfato

GDH glucosa deshidrogenasa; glucosa-1-deshidrogenasa

GLDH glutamato deshidrogenasa

G6PDH glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa

GMD GDP-D-manosa-4,6-deshidratasa

GMK guanilato quinasa

GMP guanosina 5'-monofosfato

GLK glucoquinasa

GTP guanosina 5'-trifosfato

GUO guanosina

Lac D-lactosa

Man D-manosa

ManB fosfomanomutasa

ManC manosa-1-fosfato guaniltransferasa

NADP nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

NADPH nicotinamida reducida adenina dinucleótido fosfato

NAHK N-acetilhexosamina-1-quinasa

PoliP polifosfato

PPi pirofosfato

Pi fosfato

PPK₂polifosfato quinasa 2

PPK3 polifosfato quinasa 3

2D-PPK₂polifosfato quinasa 2 de 2 dominios

FKP L-fucoquinasa/ L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa

PmPpA Pasteurella multocida pirofosfatasa inorgánica (PPA)

WCAG GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa-4-reductasa

3/4FT a-1 -3/4-fucosiltransferasa

Productos químicos y reactivos

[0254] A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich y eran de la mayor pureza disponible. Los soportes sólidos se obtuvieron de Resindion, ChiralVision, Rohm GmbH & Co. KG y micromod GmbH.

Ejemplo 1: Preparación de enzimas

[0255] Los genes que codifican las enzimas GSK, PPK₂, FKP y PmPpA se clonaron en vectores de expresión estándar como se indica en la Tabla 1. Los vectores de expresión se transformaron en E. coli BL21 Oro (DE3).

Tabla 1

[0256] Los transformantes se cultivaron en matraces de agitación de 1 L con deflectores en un volumen de 500 ml de medio LB (caldo de lisogenia) suplementado con 50 mg /ml de kanamicina. Los cultivos se hicieron crecer a 37 °C hasta una DO⁶⁰⁰= 0,8. La expresión se indujo mediante la adición de IPTG con una concentración final de 0,5 mM al cultivo. El tiempo de expresión terminó después de 12-18 horas a 20 °C. La biomasa se separó del medio por centrifugación a 6.000 x g durante 10 min. La expresión satisfactoria de la enzima respectiva se analizó mediante SDS-PAGE siguiendo procedimientos operativos estándar (Laemmli, Nature 1970, 227, 680-685). La biomasa húmeda se almacenó a -20°C.

[0257] Para la purificación, normalmente se añadieron 30 ml de tampón de equilibrio a 3 g de biomasa congelada. El tampón de equilibrio contiene un cóctel inhibidor de proteasas cOmplete™ a pH 7,5: HEPES 100 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), MgCh 10 mM, MnSO⁴5 mM, NaCl 300 mM y glicerol al 5% en volumen. Después de descongelar a 4 °C con agitación, las células se rompieron mediante cuatro pases a través de un homogeneizador de alta presión (Emulsiflex C5, Avestin Inc., Ottawa, Canadá) a 1000 bar con enfriamiento intermedio en hielo. Después de la centrifugación (45 min, 20.000 x g), el sobrenadante se aplicó a una columna de cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC) equilibrada (10 ml de CV) que contenía material de cromatografía de alto rendimiento Ni2+ Sepharose™ de Amersham Biosciences (Uppsala, Suecia). Las proteínas no unidas se lavaron usando tampón de equilibrio. La proteína inmovilizada se eluyó en fracciones de 1 ml utilizando tampón de elución. Finalmente, las soluciones enzimáticas se concentraron mediante Centrifugal Filter Units Amicon® Ultra-15 con un corte de 50 kDa de Merck Millipore (Darmstadt, Alemania). No se observó pérdida de enzima durante la ultrafiltración. Las enzimas se almacenaron en glicerol al 50% a -20°C. La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford usando BSA como patrón (Bradford, Analytical Biochemistry 1976, 72(1), 248-254).

Ejemplo 2: Preparación homogénea de GDP-fucosa

[0258] Las enzimas purificadas (Tabla 1) se mezclan junto con guanosina, L-fucosa, ATP, polifosfato y tampón HEPES a las concentraciones que se indican en la Tabla 2. Experimentos realizados en baja unión viales de proteínas. La guanosina se solubilizó en sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 6% en volumen antes de la adición a la mezcla. La reacción se llevó a cabo a 30°C en un termomezclador.

Tabla 2

[0259] Después de casi tres horas, se obtuvo una conversión del 90 % del sustrato (guanosina) en GDP-fucosa (véase la Figura 4A). No se detectaron otros productos finales (véase la Figura 5B que muestra un cromatograma de la mezcla de reacción después de 48 horas).

Ejemplo 3: Síntesis fallida de GDP-fucosa

[0260] La síntesis de GDP-fucosa se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2, pero sin agregar DMSO. La reacción se llevó a cabo a 30°C en un termomezclador y la mezcla de reacción obtenida permaneció turbia. Después de tres horas no se observó conversión de sustrato (guanosina) en GDP-fucosa.

[0261] Este ejemplo demuestra que la mera combinación de las dos rutas enzimáticas no proporciona GDP-fucosa. Ejemplo 4: Inmovilización de enzimas sobre soporte sólido

[0262] Las enzimas se inmovilizaron sobre soportes sólidos para permitir el uso múltiple de las enzimas.

[0263] Los lisados celulares obtenidos en el Ejemplo 1 mediante homogeneización a alta presión se centrifugaron y filtraron para eliminar los residuos celulares. Las resinas: perlas separadas (Resindion): CE-EP, EP403/M, CE-HFA, CE-ENM y CE-HA; immobeads (ChiralVision) IB-COV1, IB-COV2, IB-COV3, IB-ANI1, IB-ANI2, IB-ANI3, IB-ANI4, IB-CAT1, IB-ADSl, IB-ADS2, IB-ADS3 e IB- ADS4; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG) y partículas magnéticas (micromod GmbH): Nano-mag, Sicastar-6 y Sicastar-1.5 se incubaron junto con las enzimas durante 24 horas a 4°C.

[0264] El ensayo de proteínas se realizó mediante ensayo BCA. Los resultados de proteína unida total se muestran en la Figura 7.

[0265] Después de la inmovilización, las resinas cargadas con enzima se lavaron con tampón como se describe en el Ejemplo 1. Las resinas se incubaron con una solución de reactivos como se muestra en la Tabla 3 a 30 °C durante 24 horas.

Tabla 3

[0266] Se observó la formación de GDP-fucosa para todas las resinas cargadas, como se muestra en la Figura 8. Ejemplo 5: Preparación heterogénea de GDP-fucosa sobre partículas magnéticas

[0267] Hasta este punto, se combinaron los caldos de fermentación (ver Ejemplo 1) de 135 ml de FKP, 45 ml de PmPpA, 90 ml de GSK y 90 ml de 2D-PPK₂y se lisaron en 25 ml de tampón (como se describe en el Ejemplo 1) que contenía mM de imidazol, para obtener 0,5 ml de una mezcla de enzimas, que se incubado con 12,5 mg de resinas magnéticas Sicastar-6. Después de 1 hora de incubación a 10°C, las resinas se lavaron con tampón y se combinaron en un vial con 0,25 mL de una solución de reactivos (ver Tabla 4). La mezcla se incubó a 30°C durante 48 horas.

Tabla 4

[0268] Después de 48 horas, se obtuvo una conversión casi cuantitativa (98%) del sustrato (guanosina) en GDP-fucosa (véase la Figura 4B).

Ejemplo 6: Reciclado de NADPH

[0269] Se llevó a cabo una reacción en un solo recipiente (véanse las condiciones de reacción de la reacción A1 en la Tabla 5) para mostrar que el equilibrio de la GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD, CE 4.2.1.47) y las reacciones catalizadas por GDP-L-fucosa sintasa (wcaG, CE 1.1.1.271) de GDP-manosa a GDP-fucosa están del lado de GDP-manosa (véanse las figuras 11-A1 y 12-A1). En este experimento, primero se dosificaron las enzimas en un vial hasta las cantidades mencionadas en la tabla 5. Se agregaron tampón, cofactor, GDP-Man, NADPH en este orden, hasta la concentración mencionada en la tabla 5. La reacción fue realizada en viales Eppendorf de 1,5 mL, a 37 °C y 550 rpm en el Eppendorf thermomixer comfort. Se tomaron alícuotas en diferentes momentos y se extinguieron calentando a 90 °C durante 3 minutos y se midieron mediante cromatografía de intercambio iónico. Se puede ver que el equilibrio está del lado del PIB-Hombre (ver Fig. 12-A1).

[0270] Para empujar el equilibrio de la reacción hacia GDP-Fuc, es necesario diseñar el acoplamiento a otra reacción (de manera que NADP+ se elimine constantemente). En la reacción A2, se usaron las enzimas Glk, PPK3 y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (adquirida de Merck - 10165875001) (G6PDH, CE: 1.1.1.49) para reciclar NAp Dh y aumentar el rendimiento de GDP-fucosa. En este experimento, primero se dosificaron las enzimas en un vial hasta las cantidades mencionadas en la tabla 6. Después de agregar las enzimas, se agregaron tampón, cofactor, GDP-Man, NADPH, glucosa, ATP y polifosfato en este orden, hasta las concentraciones mencionadas en la tabla 6. La reacción se realizó en un vial Eppendorf de 1,5 mL, a 37 °C y 550 rpm en el Eppendorf thermomixer Comfort. Se tomaron alícuotas en diferentes momentos y se extinguieron calentando a 90 °C durante 3 minutos y luego se midieron mediante cromatografía de intercambio iónico. Para el reciclado se utilizan como sustratos los sustratos económicos glucosa y polifosfato (véanse las Figuras 11-A2 y 12-A2).

[0271] Se realizó otro experimento para la producción de GDP-Fuc a partir de Man, ATP, GTP y polifosfato, y L-glutamato para la regeneración de NADPH y cambiando el equilibrio hacia GDP-Fuc. En este experimento, primero se dispensaron enzimas en un vial hasta las cantidades mencionadas en la tabla 7. Después de agregar las enzimas, se agregaron tampón, cofactor, Man, GTP, ATP y L-glutamato, y polifosfato en este orden, hasta las concentraciones mencionadas en la tabla 7. La reacción se realizó en un vial Eppendorf de 1.5 mL, a 37°C y 550 rpm en el Eppendorf thermomixer Comfort. Se tomaron alícuotas en diferentes momentos y se extinguieron calentando a 90 °C durante 3 minutos y luego se midieron mediante cromatografía de intercambio iónico. En la reacción A3 (véanse las condiciones de reacción de la reacción A3 en la Tabla 7) se usó glutamato deshidrogenasa (comprada a Merck - 10197734001) (GLDH, CE 1.4.1.4) para reciclar NADPH a partir de L-glutamato y agua. (ver Figura 11-A3 y 12-A3).

Tabla 5: Condiciones de reacción de los ejemplos A1.

Tabla 6: Condiciones de reacción para la reacción A2.

Tabla 7: Condiciones de reacción de la reacción A3.

Ejemplo 7: Síntesis de GDP-fucosa a partir de D-manosa usando Glk

[0272] Se llevó a cabo una reacción enzimática en un solo recipiente para validar la síntesis de GDP-fucosa a partir de mañosa a través de la cascada que se muestra en la Figura 13. En este experimento, las primeras enzimas se dispensaron en un vial hasta las cantidades mencionadas en la tabla 8. Después de agregar las enzimas, se agregaron tampón, cofactor, manosa, ATP, L-glutamato, NADPH, guanosina (de un stock que contenía DMSO) y polifosfato en este orden, hasta a las concentraciones mencionadas en la tabla 8. La reacción se realizó en un vial Eppendorf de 1,5 mL, a 37 °C y 550 rpm en un termomezclador Eppendorf Comfort. Se tomaron alícuotas en diferentes momentos y se extinguieron calentando a 90 °C durante 3 minutos y luego se midieron mediante cromatografía de intercambio iónico. El curso del tiempo de reacción de la reacción en el ejemplo 7 se mide por cromatografía iónica como se muestra en la Figura 14.

Tabla 8 - Condiciones de reacción utilizadas en el ejemplo 7.

(Continuación)

Ejemplo 8: Síntesis de GDP-fucosa a partir de D-manosa usando NahK

[0273] Se llevó a cabo una reacción enzimática de un solo recipiente para validar la síntesis de GDP-fucosa a partir de mañosa a través de la cascada que se muestra en la Figura 15. En este experimento, las primeras enzimas se dispensaron en un vial hasta las cantidades mencionadas en la tabla 9. Después de la adición de enzimas, tampón, cofactor, manosa, ATP, L-glutamato, NADPH, guanosina (la reserva se preparó en DMSO) y polifosfato se añadieron en el orden, hasta a las concentraciones mencionadas en la tabla 9. La reacción se realizó en viales Eppendorf de 1,5 mL, a 37°C y 550 rpm en un termomezclador Eppendorf comfort. Se tomaron alícuotas en diferentes momentos y se extinguieron calentando a 90 °C durante 3 minutos y luego se midieron mediante cromatografía de intercambio iónico. El curso del tiempo de reacción de la reacción en el ejemplo 8 se mide mediante cromatografía iónica como se muestra en la Figura 16.

Tabla 9 - Condiciones de reacción para el ejemplo 8.

Ejemplo 9: Síntesis de 3-fucosilactosa

[0274] Las cascadas para la producción de GDP-fucosa se pueden acoplar a fucosiltransferasas para moléculas de fucosilato o biomoléculas, p. ej. oligosacáridos de leche humana y proteínas terapéuticas. El acoplamiento se realiza en reacciones de un solo recipiente (ver Figura 17). Se realizaron reacciones en las que la cascada de GDP-fucosa se acopló a 3/4-fucosiltransferasa para producir 3-fucosilactosa a partir de D-manosa (reacción D1; véase la Figura 18). En este experimento, las primeras enzimas se dispensaron en un vial hasta las cantidades mencionadas en la tabla 10. Después de la adición de enzimas, tampón, cofactor, manosa, ATP, L-glutamato, NADPH, lactosa, guanosina (la solución madre se preparó en DMSO) y polifosfato se agregaron en este orden, hasta las concentraciones mencionadas en la tabla 10. La reacción se realizó en viales Eppendorf de 1,5 mL, a 37 °C y 550 rpm en un termomezclador Eppendorf comfort. Se tomó una alícuota y se inactivó calentando a 90 °C durante 3 minutos y luego se midió mediante cromatografía de intercambio iónico. Se realizó otro experimento para producir 3-fucosilactoseína en la que se produjo GDP-Fuc a partir de guanosina, L-fucosa (reacción D2; véase la Figura 19). En este experimento, las primeras enzimas se sumaron a las cantidades mencionadas en la tabla 11. Después de la adición de enzimas, tampón, cofactor, L-fucosa, ATP, lactosa, guanosina (la solución madre se preparó en DMSO) y polifosfato se agregaron en el orden, hasta la concentración mencionada en la tabla 11. La reacción se realizó en viales Eppendorf de 1,5 mL, a 37°C y 550 rpm en un termomezclador Eppendorf comfort. Se tomó una alícuota y se inactivó calentando a 90 °C durante 3 minutos y luego se midió mediante cromatografía de intercambio iónico.

3-fucosilactosa (3-FL; Galp4/Fuca3)Glc)

Tabla 10 - Condiciones de reacción para la reacción D1.

Tabla 11 - Condiciones de reacción para la reacción D2.

Ejemplo 10: Producción de L-fucosa a partir de D-manosa

[0275] La cascada descrita en los ejemplos 7 y 8 se puede utilizar para producir L-fucosa a partir de D-manosa y guanosina. La reacción del ejemplo 8 se calentó a 95°C durante 1 hora. Se midió una alícuota tomada después del calentamiento mediante cromatografía iónica (ver Figura 20).

[0276] Se adjunta a esta solicitud un listado de secuencias que comprende las secuencias de la siguiente tabla:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa o D-manosa que comprende los siguientes pasos:

A) proporcionar una solución que comprende

(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina y un codisolvente para solubilizar guanosina y en el caso de D-manosa NADPH; y

proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y, en el caso de L-fucosa, una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa o, en el caso de D-manosa, bien (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa;

B) producir guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a partir de guanosina y L-fucosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina y el codisolvente o de guanosina y D-manosa en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato, trifosfato de adenosina, NADPH y el codisolvente.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la solución comprende guanosina y L-fucosa; y el conjunto de enzimas comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y una L-fucoquinasa/L-fucosa-1-fosfato guanililtransferasa.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la solución comprende guanosina y D-manosa; y el conjunto de enzimas comprende una guanosina quinasa, una polifosfato quinasa y (a) una glucoquinasa, fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa o (b) una N-acetilhexosamina-1-quinasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa y una GDP-L-fucosa-sintasa.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre un soporte sólido.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre un soporte sólido a partir de lisado celular.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, donde la concentración de guanosina y L-fucosa o guanosina y D-manosa en la solución provista en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5,000 mM.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en el que la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa se produce en una sola mezcla de reacción.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que la cantidad de codisolvente es de 0,01 % en volumen a 30 % en volumen basado en el volumen total de la solución proporcionada en el paso A).

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que el codisolvente es dimetilsulfóxido.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 - 10, en el que el método comprende además el paso de

producir L-fucosa a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa en presencia de una fucosiltransferasa y en ausencia de un aceptador; o

producir L-fucosa calentando la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa a la temperatura en un rango de 80 a 100°C.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11, que comprende además el paso de

C) aislar la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende además el paso de D) producir un sacárido fucosilado, un glicopéptido fucosilado, una glicoproteína fucosilada, una proteína fucosilada, un péptido fucosilado o una molécula pequeña a partir de guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la guanosina 5'-difosfo-p-L-fucosa y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido glicoproteína, proteína, péptido o pequeña molécula en presencia de una fucosiltransferasa.

14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 - 13, en el que el conjunto de enzimas comprende además cualquiera de una glucosa deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y una glutamato deshidrogenasa.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, donde el conjunto de enzimas comprende además una guanilato quinasa.