ES2949180T3 - Construcción de espícula del virus de la rubéola - Google Patents

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Abstract

La construcción de pico del virus de la rubéola comprende al menos un componente E1 y un componente E2 que están interconectados. El componente E1 consiste en la proteína de la envoltura E1 cuya región transmembrana C terminal y dominio intravirión se han eliminado y cuyo extremo N comprende el ectodominio de la proteína de la envoltura E1. El componente E2 consiste en la proteína de la envoltura E2 cuyas regiones transmembrana y dominio intravirión se han eliminado y cuyo extremo C comprende el ectodominio de la proteína de la envoltura E2. El extremo C del componente E2 se une mediante fusión directa o mediante un conector de manera que se obtiene una proteína de fusión E1-E2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Construcción de espícula del virus de la rubéola
La invención se refiere a una construcción de espícula del virus de la rubéola adecuada y destinada a aplicaciones de diagnóstico y/o terapéuticas.
El virus de la rubéola (en alemán: Roteln-Virus) es el agente causal del sarampión alemán (rubéola, rubeola). La rubéola es una enfermedad infecciosa aerogénica (es decir, que se propaga por el aire) altamente contagiosa que confiere inmunidad de por vida. Los síntomas típicos de la rubéola en los niños son manchas rojas en la piel (exantema), fiebre y posiblemente inflamación de los ganglios linfáticos. Las complicaciones suelen ser raras. Sin embargo, la infección por rubéola durante el embarazo puede provocar complicaciones graves con malformaciones pronunciadas en el niño y abortos espontáneos. Si una mujer embarazada se infecta con el virus de la rubéola (RUBV) durante el primer trimestre del embarazo, existe un riesgo del 20 % de que el feto desarrolle el síndrome de rubéola congénita (SRC). El RUBV es endémico en todo el mundo y la infección puede prevenirse mediante la vacunación (Hobman et al., 2007).
El virus de la rubéola es el único miembro del género Rubivirus y pertenece a la familia de Togaviridae, cuyo genoma está constituido normalmente por ARN monocatenario con polaridad positiva. El genoma de ARN está rodeado por una cápside icosaédrica (simetría T=4) y tiene una longitud de aproximadamente 10 kb (10.000 nucleótidos). Codifica tres proteínas estructurales, a saber, la proteína de la cápside (31 kDa) y las dos proteínas de la envoltura E1 (58 kDa) y E2 (42-47 kDa), y dos proteínas no estructurales (p150 y p90) (Hobman et al., 2007). La cápside está rodeada por una membrana lipídica (envoltura viral) derivada de la membrana de la célula hospedadora. Las dos proteínas de la envoltura E1 y E2 están incrustadas en esta membrana lipídica en forma de heterodímeros. Ambas proteínas de la envoltura (E1 y E2) son glicoproteínas y están ancladas a la membrana viral mediante dominios transmembrana C-terminales (DuBois et al., 2012).
Los viriones de rubéola (sinónimo de: partículas del virus de la rubéola fuera de una célula hospedadora) tienen un tamaño de diámetro de 50 a 70 nm. Los viriones adoptan una variedad de formas, que van desde estructuras casi esféricas hasta estructuras tubulares alargadas (Battisti et al., 2012). Según el estado actual del conocimiento, la forma de la estructura superficial es la misma en todos los viriones de rubéola y, por lo tanto, existe solo un serotipo.
La proteína de la envoltura E1 es responsable del reconocimiento y la unión de los viriones de rubéola a los receptores celulares (de las células hospedadoras) y participa en la fusión de membranas (DuBois et al., 2012). La proteína de la envoltura E2 es necesaria para el plegamiento y el transporte eficientes de E1 a través de los compartimentos relevantes de la célula hospedadora. De las dos proteínas de la envoltura, solo se conoce la estructura del ectodominio E1 en su conformación trimérica posfusional (Prasad et al., 2017).
Ambas proteínas de la envoltura E1 y E2 son glicoproteínas transmembrana de tipo I. Están ubicadas en la superficie del virión (virión = partícula de virus fuera de la célula hospedadora) como un complejo heterodimérico de glicoproteína E1 y E2 del virus de la rubéola en forma de las denominadas espículas (sinónimos: espículas de rubéola; complejo de proteína E1-E2; heterodímero E1-E2). Durante la biogénesis del virus de la rubéola en la célula hospedadora, primero se sintetiza una poliproteína estructural en el curso de la traducción, que se escinde mediante peptidasas señalizadoras en la proteína de la cápside y las dos proteínas de la envoltura E1 y E2. La dimerización de E1 y E2 tiene lugar en el retículo endoplásmico. A este respecto, E2 promueve como chaperona el plegamiento y con ello la integridad estructural de E1. A diferencia de los otros Togavidirae E1 y E2 del virus de la rubéola no pasan por una etapa de maduración proteolítica. Las partículas del virus de la rubéola se forman en el aparato de Golgi, pasan por la vía secretora habitual y finalmente se liberan al medio extracelular. (Dube et al. 2014.)
Las funciones principales de estas espículas (sinónimo: espículas de rubéola) son la unión a/con los receptores de la célula hospedadora y mediación de la fusión con las membranas de la célula (hospedadora) (Katow et al., 1988).
El estado de la técnica ha sostenido durante mucho tiempo que la proteína de la envoltura E1 es el determinante antigénico más importante contra el que se dirigen los anticuerpos neutralizantes del organismo hospedador (Waxham et al., 1985). Sin embargo, la proteína de la envoltura E2 y la proteína de la cápside C también pertenecen a las dianas de la respuesta inmunitaria humoral a una infección por rubéola. Los anticuerpos contra E1 y e2 abundan regularmente en los sueros de individuos (pacientes) infectados con rubéola.
Una comparación (por Nedelkovic et al. 1999) del potencial diagnóstico de proteínas de rubéola C, E1 y E2 producidas de forma recombinante (en células de insecto Sf9 con el sistema de baculovirus) en el ensayo de inmunotransferencia e inmunoensayo enzimático (EIA) mostró que las proteínas recombinantes E1 y C desencadenaron predominantemente la respuesta inmunitaria, tanto en infecciones posnatales y vacunales por el virus de la rubéola. La respuesta inmunitaria contra la proteína E2 recombinante fue mucho más débil, pero significativamente más fuerte en el caso de una infección congénita.
Se conocen varios enfoques en el estado de la técnica para producir la proteína de la envoltura E1 de rubéola con fines de diagnóstico. Se ha dirigido mucho esfuerzo hacia la producción de fragmentos estables y solubles de E1 con alta antigenicidad y en grandes cantidades. Un método para esto fue la producción de líneas celulares infectadas/transfectadas de forma estable que expresaban E1 y/o E2 de forma recombinante. Por ejemplo, Seppanen et al. (1991) ya describieron la expresión de glicoproteínas E l y E2 de rubéola en células de insecto Spodoptera frugiperda Sf9 usando el sistema de expresión de baculovirus.
En el documento EP1780282A1 se ha descrito la expresión recombinante y la producción de una proteína de la envoltura E1 de rubéola, a la que le faltan al menos la región transmembrana C-terminal, el segmento de anclaje y los aminoácidos 143 a 164 en la parte media de la molécula de proteína. Esta proteína de la envoltura E1 modificada contiene al menos aquella región de la secuencia de aminoácidos de E1 de rubéola que abarca los puentes disulfuro Cys 349 - Cys 352 y Cys 368 - Cys 401 y comprende al menos los aminoácidos 315-412 y está fusionada con una chaperona FKΒP. De acuerdo con las enseñanzas del documento EP1782082A1, es esencial que ambos puentes disulfuro en la parte C-terminal estén intactos, es decir estén cerrados, para obtener una variante de E1 de rubéola que sea suficientemente antigénica y adecuada para la detección de anticuerpos.
El documento EP 2222694A1 divulga la producción de otros antígenos de la envoltura E1 de rubéola solubles expresados de manera recombinante que, en comparación con la proteína de la envoltura E1 nativa, carecen de la región transmembrana y del segmento de anclaje C-terminal, así como del segmento con los aminoácidos 143 a 164 en la parte media de la molécula y que contienen al menos dos enlaces disulfuro, de los que uno está formado entre Cys 225 y Cys 235 (C13-C14) y el otro entre Cys 349 y Cys 352 (C17-C18).
Orellana et al. 1999 describen la generación de los denominados "proteoliposomas que imitan al virus de la rubéola", concretamente liposomas que llevan expuestas las proteínas de la envoltura E1 y E2 del virus de la rubéola producidas de manera recombinante (en células de insecto Sf9 con el sistema de baculovirus). Estos proteoliposomas que imitan al virus de la rubéola fueron reconocidos por anticuerpos específicos para las proteínas E1 y E2 del virus de la rubéola.
Los antígenos de rubéola generados de forma recombinante conocidos y no ensamblados adicionalmente, a saber, la glicoproteína E1, la glicoproteína E2 y la proteína de la cápside, tienen la desventaja de que su reactividad en inmunoensayos y/o su producción es limitada. En la fase aguda de una infección por el virus de la rubéola, el organismo del paciente produce principalmente anticuerpos IgM contra las glicoproteínas E1 y E2, que se presentan al sistema inmunitario en forma de heterodímeros o espículas. Si en cada caso se producen glicoproteínas E1 o E2 por separado con ayuda de sistemas de expresión de proteínas recombinantes de acuerdo con el estado de la técnica, sin embargo no se forman heterodímeros. La unión posterior de las glicoproteínas E1 y E2 purificadas tampoco conduce a un ensamblaje real de espículas heterodiméricas.
Las denominadas "partículas similares a virus" (VLP), también del virus de la rubéola (RLP, partículas similares a la rubéola), también se conocen desde hace mucho tiempo en el estado de la técnica. En diversos estudios se ha demostrado que la expresión de las tres proteínas estructurales de rubéola C, E1 y E2 en líneas celulares CHO o BHK transfectadas de manera estable conduce a la producción de VLP de rubéola, cuyo tamaño, morfología y densidad corresponden en cada caso a los del virus de la rubéola nativo, pero no eran infecciosas. Se detectaron anticuerpos humanos anti-virus de la rubéola con estas VLP de rubéola en inmunoensayos de diagnóstico. Además, la inmunización pudo conseguirse con estas VLP de rubéola en ratones, a saber, la formación de anticuerpos específicos contra proteínas estructurales del virus de la rubéola y de anticuerpos neutralizantes de virus e inhibidores de la hemaglutinación (véase la revisión de Petrova et al. 2016).
Para la producción recombinante de VLP de rubéola, generalmente se expresan todas las proteínas estructurales, la glicoproteína E1, la glicoproteína E2 y la proteína de la cápside. Las VLP, que se forman en este caso, están constituidas por la cápside que está rodeada por una bicapa lipídica en la que están incrustadas las glicoproteínas virales E1 y E2. Por lo tanto, las VLP son estructuralmente muy similares a los virus nativos de la rubéola. Una desventaja de la aplicación de VLP de rubéola en inmunoensayos es la presencia de la proteína de la cápside, que se sospecha que causa reacciones cruzadas (véase el documento US6670117B2). Especialmente los inmunoensayos de IgM son muy susceptibles a la reactividad cruzada. Además, la producción de VLP de rubéola está unida a varias desventajas: La tasa de expresión en los sistemas de expresión eucarióticos requeridos es por regla general muy baja. Las VLP deben purificarse laboriosamente a partir de lisados celulares o de sobrenadantes de cultivos celulares, lo que a menudo se asocia con pérdidas de rendimiento significativas. Las preparaciones de VLP contienen más impurezas que los antígenos recombinantes (que se han purificado con ayuda de una etiqueta de afinidad), de manera que se eleva el riesgo de reacciones inespecíficas.
En el estado de la técnica, las vacunas contra el virus de la rubéola se basan predominantemente en cepas atenuadas del virus de la rubéola. Sin embargo, estas tienen serias desventajas: No se pueden utilizar en mujeres embarazadas ni en personas con inmunodeficiencia. Los efectos secundarios como artritis, diabetes, daño al sistema nervioso central y reacciones alérgicas y anafilácticas son comunes. La producción, el transporte y el almacenamiento son caros. (Hobman et al 1994, Qiu et al. 1994 - revisión de Petrova et al. 2016).
Actualmente se observa un sustituto prometedor para la vacuna viva en una proteína de la envoltura E1 de rubéola recombinante. (Perrenoud G. et al. 2004 - revisión de Petrova et al. 2016).
Todavía existe la necesidad de preparaciones de antígenos de rubéola que presenten tantos epítopos diferentes como sea posible del virus nativo de la rubéola infecciosa y, por lo tanto, sean adecuados para su uso en sistemas de diagnóstico, por ejemplo sistemas ELISA o CLIA para unirse a una amplia variedad de anticuerpos anti-rubéola de muestras de pacientes humanos y con ello detectar y/o desencadenar la formación de anticuerpos en el organismo del paciente como principio activo de la vacuna.
La presente invención se basa en el objetivo de proporcionar nuevos antígenos de rubéola que sean altamente solubles e altamente reactivos desde el punto de vista inmunológico (es decir, altamente antigénicos) y que sean muy adecuados para la detección eficaz de una infección por rubéola, concretamente de una infección con el agente causal rubéola, y/o como principio activo de vacuna.
Una solución de este objetivo consiste en la indicación de una construcción del complejo de proteína de la envoltura E1-E2 del virus de la rubéola, de manera abreviada "construcción de espícula de rubéola", que está caracterizada por
- que comprende al menos un componente E1 y un componente E2 que están unidos (o bien acoplados) entre sí (ya sea directa o indirectamente),
- que el componente E1 está constituido por la proteína de la envoltura E1 cuya región transmembrana C-terminal y dominio intravirional están eliminados y cuyo extremo N-terminal comprende el ectodominio de la proteína de la envoltura E1,
- que el componente E2 está constituido por la proteína de la envoltura E2, cuyas regiones transmembrana y dominio intravirional está eliminados y cuyo extremo N-terminal comprende el ectodominio de la proteína de la envoltura E2,
- y por que el extremo C-terminal del componente E2 (es decir, el extremo C-terminal del ectodominio de la proteína de la envoltura E2) está unido (acoplado) con el extremo N-terminal del componente E1 (es decir, el extremo N-terminal del ectodominio de la proteína de la envoltura E1) directamente (en fusión directa) o indirectamente, concretamente por medio de o a través de un conector, de modo que esté presente una proteína de fusión E1-E2.
Sorprendentemente, se encontró que dichas construcciones de espícula de rubéola de acuerdo con la invención, es decir proteínas de fusión E1-E2 después de la expresión en la célula hospedadora, se procesan con éxito en el RE (retículo endoplásmico) y el aparato de Golgi y se secretan (segregan, separan) en forma soluble, y que obviamente son inmunológicamente tan similares a un heterodímero nativo que se reconocen y se unen como éste por anticuerpos humanos anti-virus de la rubéola (por ejemplo, de sueros de pacientes) en sistemas de pruebas de diagnóstico conocidos.
Preferentemente, la proteína de fusión E1-E2 de la construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la invención está fusionada (acoplada) aún con una secuencia señalizadora (sinónimos: péptidos señalizadores, péptidos de tránsito).
Las secuencias señalalizadoras son secuencias de aminoácidos relativamente cortas (que comprenden aproximadamente 20-30 aminoácidos) que están localizadas en el extremo N-terminal de proteínas y contienen información para la secreción de esta proteína, en particular para su ruta de transporte y posiblemente también su plegamiento. Son omnipresentes en procariotas y eucariotas y están constituidas básicamente por tres secciones: una sección amino-terminal cargada positivamente (región N), una sección hidrófoba media (región H) y una sección carboxilo ligeramente polar (región C). Se sabe a partir de numerosos estudios diferentes sobre la producción de proteínas recombinantes en líneas celulares que la eficiencia de secreción y, por lo tanto, la tasa de producción de la proteína recombinante puede aumentar significativamente mediante el uso de secuencias señalizadoras.
La proteína de fusión E1-E2 de acuerdo con la invención preferentemente está dotada de (acoplada con) una etiqueta de afinidad para permitir una purificación eficaz, en particular en el caso de la producción recombinante. Una etiqueta de afinidad de estreptavidina (Strep-Tag, Twin-Strep-Tag) o una etiqueta de polihistidina (etiqueta de His) se tiene en consideración en particular como etiqueta de afinidad. De acuerdo con la invención, la etiqueta de afinidad está preferentemente acoplada al extremo C-terminal, igualmente se tiene en consideración una disposición (posicionamiento) en el extremo N-terminal o en el conector.
Preferentemente, el ectodominio de la proteína de la envoltura E1 comprende los aminoácidos (de las posiciones) 1­ 446 de acuerdo con SEQ ID NO:6 o (en consecuencia) los aminoácidos AA583-1028 en la secuencia de referencia UniProt-KΒ/SwissProt - P08563 (POLS_RUBVM), actualización de secuencia el 30 de mayo de 2006 (versión 2 de la secuencia).
Preferentemente, el ectodominio de la proteína de la envoltura E2 comprende los aminoácidos (de las posiciones) 1­ 234 de acuerdo con SEQ ID NO:8 o (en consecuencia) los aminoácidos AA301-534 en la secuencia de referencia UniProt-KΒ/SwissProt - P08563 (POlS_RUBVM), actualización de secuencia el 30 de mayo de 2006 (versión 2 de la secuencia).
Si se utiliza un conector, este es preferentemente un conector flexible, que más preferentemente está constituido total o predominantemente por glicina y serina, y que puede estar configurado en particular como conector corto o conector largo.
El tamaño o la longitud del conector pueden tener una influencia sobre las propiedades antigénicas de las espículas de rubéola. En la práctica, se ha observado que - dependiendo de la plataforma de diagnóstico utilizada y, en particular, cuando se utilizan conectores de glicina-serina - las construcciones de espícula con un conector de 24 aa suelen mostrar mejores propiedades antigénicas que las construcciones de espícula con un conector de 8 aa.
Modificando el conector, en particular eligiendo su tamaño o longitud y/o composición de aminoácidos, el antígeno de rubéola se puede optimizar y adaptar ("tailor-made-antigens") para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas específicas.
La generación (preparación/producción) de la construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la invención se realiza preferentemente en cultivos de células eucariotas con la ayuda de vectores de expresión. Para ello, con aquellas secuencias de ARN que codifican los componentes de proteína de la envoltura E1 y E2 en la construcción de espícula, y dado el caso con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de conector seleccionada, se crea una secuencia de nucleótidos recombinante que codifica la proteína de fusión E1-E2 de rubéola de acuerdo con la invención y ésta se inserta en un vector de expresión enlazada operativamente. Por lo tanto, la invención también se refiere a tales secuencias de nucleótidos recombinantes (sinónimo: moléculas de ADN recombinante) y preferentemente a aquellas que comprenden las secuencias de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:7.
Las secuencias de nucleótidos recombinantes o moléculas de ADN especialmente preferidas, que ya han demostrado su eficacia en la práctica, están caracterizadas por que comprenden la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y/o la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia señalizadora en el extremo N-terminal está presente opcionalmente, es decir, puede faltar o reemplazarse por una que funcione y actúe de manera similar.
Las proteínas de fusión E1-E2 preferidas o las construcciones de espícula de rubéola están caracterizadas por que comprenden la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o de acuerdo con SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia señalizadora en el extremo N-terminal y/o la secuencia de conector en la región media de estas secuencias de aminoácidos está presente opcionalmente, es decir, puede faltar o reemplazarse por una que funcione y actúe de manera similar.
Por lo tanto, la invención se refiere además a un vector de expresión que, en un enlace operativo, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los componentes de proteína de la envoltura E1 y E2 de rubéola en la construcción de espícula - de manera simplificada: codifica la proteína de fusión E1-E2 de rubéola.
El vector de expresión es preferentemente un vector de transferencia de acuerdo con el documento EP2307543B1; por ejemplo, el vector de transferencia "pExpres2.1", comercialmente disponible de Expres2ion Biotechnologies, Horsholm, Dinamarca.
La invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos enlazada operativamente que codifica los componentes de proteína de la envoltura E1 y E2 de rubéola en la construcción de espícula - de manera simplificada: codifica la proteína de fusión E1-E2 de rubéola.
Como célula hospedadora se utiliza preferentemente una célula de Drosophila Schneider 2 (S2) (véase Schneider 1972).
La línea celular de Drosophila S2 está disponible comercialmente, depositada en DSMZ (Braunschweig, Alemania) con el número de depósito DSMZ ACC 130 y en ATCC (American Type Culture Collection, apartado de correos 1549, Manassas, Virginia, EE. UU.) con el número de depósito CRL-1963 y de libre acceso al público.
Se ha encontrado que las construcciones de espícula de rubéola de acuerdo con la invención se expresan y secretan en células de Drosophila S2 de tal manera que imitan perfectamente las propiedades antigénicas de las espículas de E2/E1 de rubéola heterodiméricas nativas, es decir se reproducen de manera casi idéntica o en todo caso de la manera que lo hace el virus nativo en las pruebas de diagnóstico para la detección de anticuerpos IgM e IgG.
En principio, la producción de construcciones de espícula de rubéola por medio de técnicas de recombinación no se limita al sistema de expresión de células de Drosophila S2 transfectadas de forma estable (permanente) o transitoria (temporalmente), sino que también puede realizarse por medio de otros sistemas de expresión eucarióticos, tal como por ejemplo el sistema de expresión de baculovirus.
Cuando se utilizan células de Drosophila S2 transfectadas de forma estable (permanente) o transitoria (temporalmente) como sistema de expresión, la secuencia señalizadora que se proporciona preferentemente en la construcción de espícula de rubéola es preferentemente la secuencia señalizadora BiP de Drosophila. Esto ha demostrado ser particularmente adecuado en la práctica. También son posibles otras secuencias señalizadoras de Drosophila funcionalmente análogas.
Cuando se usan otros sistemas de expresión, pueden ser necesarias y/o más ventajosas otras secuencias señalizadoras, por ejemplo, la secuencia señalizadora gp64 o HMS en el caso del sistema de expresión de baculovirus.
La invención también se refiere a un procedimiento para producir una construcción de espícula de rubéola soluble e inmunorreactiva, en donde el procedimiento comprende las siguientes etapas:
(a) cultivar células hospedadoras, preferentemente células de Drosophila Schneider 2 (S2);
(b) transformar las células hospedadoras con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión E1-E2 de rubéola enlazada operativamente;
(c) cultivar las células hospedadoras transfectadas, en donde éstas expresan la proteína de fusión E1-E2 de rubéola (preferentemente de forma continua) y secretan/segregan la construcción de espícula de rubéola de la célula hospedadora;
(d) purificar la proteína de fusión.
La invención se refiere además a un procedimiento para detectar y/o determinar y/o cuantificar anticuerpos anti-rubéola (en particular de las subclases IgG o IgM o ambas) en una muestra humana, en donde la construcción de espícula de rubéola como reactivo de captura o asociado de unión o ambos se utilizan para los anticuerpos anti-rubéola.
En principio, todos los líquidos biológicos conocidos por el experto en la materia son adecuados como muestras.
La invención comprende además un kit de reactivos (kit de prueba) para realizar este procedimiento para detectar anticuerpos anti-rubéola, en donde este kit contiene al menos una construcción de espícula de rubéola como antígeno.
La construcción de espícula de rubéola como antígeno se puede usar como un conjugado específico para la detección selectiva de anticuerpos IgM anti-rubéola unidos, en particular cuando se usa en el denominado "ELISA de captura |j". Para ello, la construcción de espícula de rubéola puede dotarse de varias etiquetas (por ejemplo, etiqueta His6, (Twin)-Strep-Tag u otras etiquetas) y debido a ello el antígeno puede diseñarse óptimamente de manera dirigida para la producción de conjugados (etiqueta enzimática, fluoróforos, etc.). Esto mejora decisivamente la rentabilidad de la producción de conjugados. Los procedimientos de conjugación química no selectivos de uso frecuente, tal como por ejemplo la reticulación de proteínas con glutaraldehído pueden sustituirse por un acoplamiento dirigido intrínseco de este tipo con alta eficiencia y reproducibilidad.
La construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la invención es altamente soluble y altamente reactiva desde el punto de vista inmunológico (sinónimo: altamente antigénico), es decir, es muy capaz de unirse a anticuerpos específicos de rubéola o ser reconocido por éstos y unirse a éstos (por ejemplo, en el caso de anticuerpos anti-E1 de rubéola en una muestra). Por lo tanto, es muy adecuado como antígeno para aplicaciones de diagnóstico. Ofrece una sustitución completa de los antígenos de virus completo, que se utilizan según el estado de la técnica en diferentes plataformas de diagnóstico (ELISA, partículas, etc.).
Sobre todo, tiene las ventajas de que no hay riesgo de sustancias biológicas durante la producción debido a material potencialmente infeccioso, que la producción se realiza en condiciones S1 de acuerdo con GenTG y que la monoclonalización de las células de Drosophila S2 como sistema de expresión da como resultado un mayor rendimiento y mejora de la estandarización de la producción en comparación con el estado de la técnica. Otras ventajas importantes son la producción rentable mediante el uso de procesos biotecnológicos modernos, tal como por ejemplo biorreactores (por lotes o perfusión) y la producción en medios libres de suero, es decir, con eliminación de proteínas potencialmente infecciosas (por ejemplo, priones patológicamente modificados como en el caso de la EEB) o proteínas inmunogénicas de componentes animales utilizados, como en particular FCS o BSA. Ambas ventajas ofrecen seguridad futura en la producción y uso del antígeno, tanto desde el punto de vista ético como regulatorio.
Debido al hecho de que los componentes de la construcción de espícula de rubéola se pueden manipular en principio sin restricciones, los ajustes a los nuevos requisitos tecnológicos se pueden realizar con relativa facilidad. Por ejemplo, las etiquetas de todo tipo para el acoplamiento dirigido se pueden introducir en una amplia variedad de superficies, y la producción de conjugados para pruebas de captura j en diferentes plataformas (ELISA, CLIA, conjugados marcados con fluorescencia) también se puede realizar sin mayores dificultades técnicas.
Dado que la construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la invención reproduce las espículas de E2/E1 de rubéola heterodiméricas nativas prácticamente de la misma manera que el virus nativo en las pruebas de diagnóstico, es básicamente adecuada para la detección de cualquier tipo de anticuerpos anti-rubéola (en particular IgM, IgG e IgA) en pruebas diagnósticas (especialmente serológicas).
Las investigaciones por medio de pruebas de inmunodiagnóstico para determinar la reactividad inmunológica de las construcciones de espícula de rubéola como antígenos en comparación con los antígenos de rubéola del estado de la técnica muestran que los antígenos de la construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la invención son muy adecuados para el uso multiplataforma en sistemas de pruebas de diagnóstico para la serología de IgG e IgM de rubéola. Con respecto al antígeno estándar utilizado actualmente en el estado de la técnica, a saber, el virus completo de la rubéola aislado, esto significa una mejora significativa porque las construcciones de espícula de rubéola de acuerdo con la invención pueden modificarse casi a voluntad ("tailor-made-antigens") y pueden adaptarse a los requerimientos y procedimientos de diagnóstico existentes y futuros en la serología de rubéola. Además, los antígenos de construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la invención permiten una producción más rentable y una constancia de producto y calidad significativamente mejorada en comparación con el virus completo de antígeno estándar anterior a través de la producción biotecnológica como proteínas recombinantes. Además, se puede suponer que la manipulación en principio casi ilimitada de la proteína de la construcción de espícula de rubéola (por ejemplo, tamaño de los epítopos, composición de los epítopos, etc.) permite una eliminación específica de las influencias disruptivas, como la reactividad cruzada o las reacciones no específicas y eso a través de plataformas, individualmente para cada aplicación serológica en la serología de rubéola.
Debido a la calidad y cantidad mejoradas de epítopos conformacionales similares a los nativos accesibles, la construcción de espícula de rubéola también es un candidato prometedor para un principio activo de vacuna ampliamente aplicable contra las infecciones por rubéola.
La invención también se refiere al uso de la construcción de espícula de rubéola como vacuna. Por lo tanto, el objeto de la invención es también una preparación de vacuna que comprende la construcción de espícula de rubéola como principio activo antigénico.
La preparación de vacunas que contienen un polipéptido inmunogénico como principio activo es conocida por los expertos en la técnica. Dichas vacunas habitualmente se suministran como preparaciones inyectables (soluciones o suspensiones líquidas). El principio activo, en este caso la construcción de espícula de rubéola, se mezcla con coadyuvantes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo (por ejemplo, agua, tampones fisiológicos acuosos, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol).
La invención se explica con más detalle a continuación por medio de ejemplos de realización y figuras.
Breve descripción de las figuras:
Fig. 1: Modelos de configuración de espícula de glicoproteína E2/E1.
(A) Configuración de glicoproteínas E2 y E1 en la superficie de un virus de la rubéola nativo.
(B) Configuración de las construcciones de espícula de rubéola solubles. En estas construcciones, las regiones transmembrana y los dominios intravirionales (líneas grises claras) se eliminan y los ectodominios de E1 y E2 (líneas negras) se unen mediante un conector flexible de glicina-serina.
Fig. 2: Secuencia de aminoácidos de la construcción de espícula de rubéola;
(A) construcción de espícula de rubéola "larga" (es decir, con conector largo)
(B) construcción de espícula de rubéola "corta" (es decir, con conector corto)
Subrayado liso: secuencia señalizadora BiP
Fondo gris claro: Secuencia de aminoácidos del fragmento E2
Subrayado punteado: conector de glicina-serina corto (8 aminoácidos)
Fondo blanco: Secuencia de aminoácidos del fragmento E1
Fig. 3: Caracterización de las construcciones de espícula de rubéola en SDS-PAGE:
Alícuotas de las construcciones ("corta" y "larga") de espícula de rubéola purificadas después de la separación mediante SDS-PAGE (geles de tris-glicina al 4-20 %, número de artículo TG 42010, Anamed Elektrophorese GmbH) en condiciones reductoras y posterior tinción con azul brillante de Coomassie.
Carril 1: marcador de tamaño molecular (kDa),
Carril 2: construcción de espícula de rubéola "larga",
Carril 3: construcción de espícula de rubéola "corta".
Fig. 4: Caracterización de las construcciones de espícula de rubéola en la inmunotransferencia tipo Western:
Reacción de las construcciones de proteína de espícula de rubéola purificadas por medio de SDS-PAGE y luego transferidas a una membrana de PVDF con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la glicoproteína E1 de rubéola (A) o contra la glicoproteína E2 de rubéola (B).
(A): Anticuerpo = anti-glicoproteína estructural del virus de la rubéola, monoclonal, de ratón (MABR23-Ru6, ibt - immunological and biochemical testsystems GmbH).
Carril 1: marcador de tamaño molecular (kDa),
Carril 2: construcción de espícula de rubéola "larga",
Carril 3: construcción de espícula de rubéola "corta".
(B): Anticuerpo = anticuerpo monoclonal anti-E2 del virus de la rubéola (D92G) (MA5-18255, Thermo Fisher Scientific).
Carril 1: marcador de tamaño molecular (kDa),
Carril 2: construcción de espícula de rubéola "larga",
Carril 3: construcción de espícula de rubéola "corta".
Fig. 5: Reactividad inmunológica de distintas construcciones de espícula de rubéola (como antígenos) en comparación con el virus completo - en la prueba de partículas con diferentes sueros humanos positivos/negativos para IgM de rubéola.
eje x: sueros humanos
eje y: IFM = Mean Fluorescene Intensity = intensidad de fluorescencia media
Fig. 6: Reactividad inmunológica de distintas construcciones de espícula de rubéola (como antígenos) en comparación con el virus completo - comportamiento de titulación en la prueba de partículas con un suero humano seleccionado, positivo para IgM de rubéola, de alto título.
Fig. 7: Reactividad inmunológica de distintas construcciones de espícula de rubéola (como antígenos) en comparación con el virus completo - relación p/n (positivo/negativo) en la detección basada en partículas de anticuerpos IgM de rubéola en distintos sueros humanos.
Fig. 8: Reactividad inmunológica de distintas construcciones de espícula de rubéola como antígenos en la prueba de inmunodiagnóstico - detección de anticuerpos IgM anti-rubéola en sueros humanos de IgM anti-rubéola precaracterizados, seleccionados en comparación con una prueba de referencia basada en virus completo (ELISA).
(A) (Parte 1 y Parte 2): Tabla de valores
ID: Identificación de muestra
DO: Densidad óptica a 405 nm
IFM: Intensidad de fluorescencia media
pos: valoración positiva para anticuerpos IgM anti-rubéola
neg: valoración negativa para anticuerpos IgM anti-rubéola Fig. 8 (A) - parte 2 es la continuación de la tabla Fig. 8 (A) - parte 1 en dirección vertical.
(B) : Rendimiento de diagnóstico - curva ROC (receiver operating characteristic)
Fig. 9: Reactividad inmunológica de distintas construcciones de espícula de rubéola como antígenos en la prueba de inmunodiagnóstico - detección de anticuerpos IgG anti-rubéola en sueros humanos de IgG anti-rubéola precaracterizados, seleccionados, en comparación con una prueba de referencia basada en virus completo (ELISA).
(A) (Parte 1 y Parte 2): Tabla de valores
ID: Identificación de muestra
DO: Densidad óptica a 405 nm
IFM: Intensidad de fluorescencia media
pos: valoración positiva para anticuerpos IgG anti-rubéola
neg: valoración negativa para anticuerpos IgG anti-rubéola Fig. 9 (A) - parte 2 es la continuación de la tabla Fig. 9 (A) - parte 1 en dirección vertical.
(B) : Rendimiento de diagnóstico - curva ROC (receiver operating characteristic)
Ejemplo 1: Generación de las construcciones de espícula de rubéola recombinantes solubles de acuerdo con la invención
La preparación de las construcciones de espícula de rubéola de acuerdo con la invención se realiza en principio de tal manera que, de acuerdo con la representación esquemática en la Fig. 1, la región transmembrana y el dominio intravirional de la glicoproteína E2 y la región transmembrana C-terminal de la glicoproteína E1 se eliminan en cada caso y los ectodominios de E1 y E2 se unen (acoplan) entre sí mediante un conector flexible de glicina-serina.
En una forma de realización a modo de ejemplo concreta, en la que las construcciones de espícula de rubéola de acuerdo con la invención se derivan de las glicoproteínas E1 y E2 de la cepa de rubéola M33, el extremo C-terminal del ectodominio de E2 (aminoácidos 1-234 de e2 de acuerdo con SEQ ID NO:8) está unido con el extremo N-terminal del ectodominio de E1 (aminoácidos 1-446 de E1 de acuerdo SEQ ID NO:6) a través de un conector corto (espícula de rubéola "corta") o un conector largo (espícula de rubéola "larga"). (Véase secuencia de referencia: UniProtKΒ/SwissProt - P08563 (POLS_RUBVM), versión 2 de la secuencia, actualización de secuencia el 30 de mayo de 2006). La secuencia de aminoácidos de estas construcciones de espícula de rubéola se muestra en la Fig. 2A y la SEQ ID NO:2 (construcción de espícula de rubéola "larga", es decir, con conector largo) y en la Fig. 2B y SEQ ID NO:4 (construcción de espícula de rubéola "corta "es decir, con un conector corto).
Al derivar las construcciones de espícula de rubéola de acuerdo con la invención de las glicoproteínas E1 y E2 de la cepa de rubéola Rubella TO-336 (Ru BV) UniProtKΒ/SwissProt - P08564 (POLS_RUBVV) versión 3 de la secuencia, actualización de secuencia el 30 de mayo de 2006, que presenta una homología de secuencia de aminoácidos del 99 % con la cepa M33, la construcción está estructurada en principio de la misma manera.
Para una expresión de la construcción de espícula de rubéola en células de Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), la construcción de proteína debía estar dotada en el extremo N-terminal preferentemente de una secuencia señalizadora de Drosophila BiP o una secuencia señalizadora funcionalmente análoga. La secuencia señalizadora de Drosophila BiP promueve especialmente bien la secreción de las espículas de rubéola expresadas de las células de Drosophila S2.
La producción de las espículas de rubéola no se limita a células de Drosophila S2 transfectadas de forma estable o transitoria. También se contemplan otros sistemas de expresión eucarióticos tal como por ejemplo el sistema de expresión de baculovirus. Si se utilizan otros sistemas de expresión, pueden ser necesarias otras secuencias señalizadoras, por ejemplo, la secuencia señalizadora gp64 o HMS para el sistema de expresión de baculovirus.
Con el fin de permitir una purificación eficaz de las construcciones de espícula de rubéola expresadas, la proteína de fusión E1-E2 de acuerdo con la invención se dota de (se acopla con) una etiqueta de afinidad de estreptavidina en el extremo C-terminal en el presente ejemplo de realización. También se contemplan otras etiquetas de afinidad, por ejemplo una etiqueta de His. Además, la posición de la etiqueta de afinidad no se limita al extremo C-terminal de la proteína de fusión E1-E2, sino que también puede ubicarse en el extremo N-terminal o en el conector.
(A) Preparación de la secuencia de nucleótidos que codifica las construcciones de espícula de rubéola
La preparación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión E1-E2 de acuerdo con la invención de la construcción de espícula de rubéola de acuerdo con la Fig. 1 (B) se realiza preferentemente por medio de secuencias de ARN del virus de la rubéola conocidas y depositadas en los bancos de datos de secuencias para las proteínas de la envoltura E1 y E2.
Por ejemplo, para la construcción de espícula de rubéola mencionada anteriormente, derivada de la cepa M33 de la rubéola se utiliza una secuencia de nucleótidos construida a partir del ARNm del virus de la rubéola 24S de acuerdo con GenBank, Acceso X05259, Versión X05259.1.
En detalle, se procede para ello tal como sigue: La preparación de las construcciones de espícula de rubéola "cortas" (con conector corto) y construcciones "largas" (con conector largo) se realiza en principio de la misma manera. Por lo tanto, en la siguiente descripción del procedimiento de preparación solo se menciona la construcción de espícula de rubéola.
La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción de espícula de rubéola (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3) se prepara de manera sintética, preferentemente complementada aún con una secuencia de etiqueta de afinidad, y se clona en un vector de clonación μMX estándar (Invitrogen/Geneart, Regensburg). Ésta está optimizada por codones para la expresión en Drosophila melanogaster y contiene una secuencia Kozak (gccaccATG) para garantizar un inicio eficiente de la traducción en el contexto de la biosíntesis de proteínas en células de Drosophila S2. Adicionalmente, la construcción de ADN contiene un sitio de corte de restricción EcoRI y NotI con el fin de clonar la construcción de ADN de espícula de rubéola en el vector de expresión pExpres2.1 (véase el documento EP2307543B1; comercialmente disponible de Expres2ion Biotechnologies, Horsholm, Dinamarca).
(B) Preparación del vector de transfección para la producción de proteínas recombinantes
De acuerdo con (A), las secuencias de nucleótidos preparadas que codifican las construcciones de espícula de rubéola, - en este caso por ejemplo las construcciones de espícula de rubéola derivadas de la cepa M33 de rubéola (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o s Eq ID NO:3) -, se clonan en un vector de transfección, que son adecuados para las células del sistema de cultivo celular previsto.
Las células de Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2) en particular entran en consideración como un sistema de cultivo celular. Un vector de transfección adecuado para estas células es el vector de expresión pExpres2.1 de Drosophila S2 (disponible comercialmente de Expres2ion Biotechnologies, Horsholm, Dinamarca; véase también el documento EP2307543B1). El vector de expresión pExpres2.1 contiene el gen de resistencia a la zeocina como marcador de selección.
Para la expresión en las células de Drosophila (S2) de acuerdo con el presente ejemplo de realización, se insertó la secuencia de nucleótidos preparada de acuerdo con el ejemplo (A) (que codifica las construcciones de espícula de rubéola) en el vector de expresión pExpres2.1.
Las etapas de clonación necesarias para ello se realizaron de acuerdo con las indicaciones del fabricante de pExpres2.1 y son conocidas y familiares en principio para el experto en la materia.
Se transfectaron células de Drosophila S2 con el vector de transfección generado de esta forma.
(C) Expresión de las construcciones de espícula de rubéola en cultivos celulares de Drosophila S2
Las células de Drosophila S2 son células de la línea celular embrionaria Schneider 2 Drosophila melanogaster, que está disponible entre otros en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania con el número de depósito DSMZ ACC 130, y en American Type Culture Collection (ATCC), apartado de correos 1549, Manassas, VA 20108, EE. UU., con el número de depósito CRL-1963, y puede obtenerse allí.
Las células de Drosophila S2 utilizadas en el ejemplo de realización descrito en este caso proceden de cultivos celulares de la empresa Expres2ion Biotechnologies, Horsholm, Dinamarca, están disponibles comercialmente como las denominadas "ExpreS2 cells", y se denominan a continuación de manera abreviada "células S2".
Materiales usados:
- Suero bobino fetal "FKS"
- Medio libre de suero para células de insecto, por ejemplo, EXCELL® 420 (número de artículo 14420, Sigma) - Zeocina (número de artículo R25001, Thermo Fisher Scientific)
- Penicilina-estreptomicina, 10.000 u/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina (número de artículo P06-07050, PAN Biotech)
- Células S2 (Drosophila melanogaster) (ExpreS2 cells, Expres2ion Biotechnologies)
- Reactivo de transfección ExpreS2 Insect-TRx5 (número de artículo S2-55A-001, Expres2ion Biotechnologies) - Tampón W: Tris/HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM
- Tampón E: Tris/HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 2,5 mM
- Solución de bloqueo de biotina BioLock (número de artículo 2-0205-050, IBA Lifesciences)
- Frasco de cultivo celular con tapa de filtro, 25 cm2 (T-25) (número de artículo 156367, Thermo Fisher Scientific) - Frasco de cultivo celular con tapa de filtro, 80 cm2 (T-80) (número de artículo 178905, Thermo Fisher Scientific) - Frasco de agitación con tapa de filtro, 250 ml (número de artículo 431144, Corning) (volumen de trabajo: 20-60 ml) - Frascos rodantes, PET 850 cm2 (número de artículo 680180, Greiner bio-one GmbH) con cubierta de ventilación (número de artículo 383382, Greiner bio-one GmbH) (volumen de trabajo: 200-400 ml)
- Tubos criogénicos con rosca interna (número de artículo 114841, Brand GmbH)
- Cámara de recuento de células, Neubauer Improved (Brand GmbH)
- Incubadora con agitación (CERTOMAT BS-1, Sartorius Stedim Biotech)
- Membrana TFF, Vivaflow 200, membrana Hydrosart de 10.000 MWCO (número de artículo VF20H0, Sartorius Stedim Biotech)
- Filtro (0,45 |jm), Minisart (número de artículo 16555-K, Sartorius Stedim Biotech)
- Sistema de cromatografía Ákta-pure (GE Healthcare)
- Cartucho de alta capacidad Strep-Tactin® Superflow®, 5 ml (número de artículo 2-1238-001, IBA Lifesciences)
(i) Transfección y preparación de una línea celular de Drosophila S2 transformada de forma estable
Para preparar la línea celular S2 transformada de forma estable, los vectores de expresión pExpres2-1 preparados de acuerdo con (B) con los insertos que codifican las construcciones de espícula de rubéola ("corta" o "larga") se transfieren a las células S2. Para ello, se cuentan las células S2 del frasco de agitación y se dividen en 2 x 106 células/ml en medio EX-CELL420. Para cada transfección, se transfieren 5 ml de esta suspensión celular a un frasco de cultivo de células T-25. A continuación se agregan 50 j l de reactivo de transfección y el reactivo de transfección se distribuye uniformemente en el medio inclinando el frasco. Luego se agrega el ADN del plásmido (preferentemente de 5-15 jg ) y se distribuye uniformemente inclinando el frasco. Los frascos T-25 se incuban a 23-27 °C. Después de aproximadamente 3-4 horas, se agrega 1 ml de FKS.
Después de 2 días, se inicia la fase de selección añadiendo zeocina hasta una concentración final de aproximadamente 1500-2000 jg/ml. Las células se cuentan cada 3-4 días. Una vez que su concentración es superior a 1 x 106 células/ml, las células se reducen en medio de selección fresco (EX-CELL420 10 % de FCS y zeocina (concentración final de aproximadamente 1500-2000 jg/ml)) hasta 1 x 106 células/ml en un volumen final de 6 ml. Este proceso se repite varias veces a intervalos de varios días.
Después de 2-4 semanas de selección en medio que contiene zeocina, la línea celular puede considerarse estable. Después de la fase de selección y tan pronto como las células alcanzan una concentración de >6 x 106 células/ml, se transfieren 6 ml de esta suspensión celular del T-25 a un frasco T75 con 4 ml de medio fresco (EX-CELL420 10 % de FCS). Tan pronto como estas células se hayan recuperado, se añaden otros 5 ml de medio fresco (EX-CELL420 10 % de FCS). Después de 3-4 días se cuentan las células. Una vez que las células han alcanzado una concentración de >6 x 106 células/ml, se transfieren 15 ml de estas células a un frasco de agitación de 250 ml y se añaden 15 ml de medio (EX-CELL420). La expansión de las células se realiza tal como se ha descrito anteriormente en (ii).
(ii) Expansión de las células de Drosophila S2 en frascos de agitación
El cultivo de células S2 preparado de acuerdo con (i) se conserva y controla en el proceso de expansión. Una vez que la viabilidad de las células asciende a >90 % y la concentración celular asciende a >8 x 106 células/ml, las células se reducen en medio EX-CELL420 hasta 8x106 células/ml. Siempre que a este respecto el volumen total del cultivo no exceda el volumen de trabajo permisible del frasco de agitación, simplemente se agrega el medio fresco al frasco original para este fin. Si el volumen total excede el volumen de trabajo permitido del frasco original, las células se reducen hasta 8 x 106 células/ml y se distribuyen en varios matraces de agitación. Por lo general, las células se reducen cada 3-4 días. Después de 3-4 días, normalmente se ha alcanzado una concentración de células de 25-50 x 106 células/ml.
(iii) Producción de las construcciones de espícula de rubéola
Para la producción y obtención de las construcciones de espícula de rubéola, las líneas celulares policlonales obtenidas de acuerdo con (i) o (ii) se cultivan en medio libre de suero. Después de aproximadamente cuatro días de cultivo, las células se separan por centrifugación y se recoge el sobrenadante. Las construcciones de espícula de rubéola se aíslan del sobrenadante por medio de cromatografía de afinidad sobre columnas de Strep-Tactin usando su etiqueta de afinidad de estreptavidina C-terminal.
En particular se procede para ello por ejemplo como sigue:
La densidad celular de la suspensión celular obtenida en (i) o (ii) se ajusta a 8 x 106 células/ml y se transfieren las células a un frasco rodante (con tapa de ventilación) con la adición de penicilina-estreptomicina (1:000). Los frascos rodantes se incuban verticalmente en una incubadora con agitación a 27 °C y 120 rpm durante 4 días. Posteriormente, las células se separan y eliminan por centrifugación (4400 x g, 20 min). El sobrenadante celular se concentra primero a 1/10 del volumen inicial mediante filtración de flujo tangencial (Vivaflow 200, membrana Hydrosart de 10.000 MWCO) y luego se diafiltra continuamente con la misma membrana contra diez veces el volumen de tampón W. Se añade PMSF (concentración final 1 mM) para inhibir las proteasas en el sobrenadante celular concentrado. Para eliminar la biotina del sobrenadante celular concentrado, se agrega una solución de bloqueo de biotina BioLock (3 ml/l), se incuba durante 15 min a temperatura ambiente con agitación y luego se centrifuga (10.000 xg, 30 min, 4 °C). El sobrenadante se filtra con un filtro de 0,45 μm. Para purificar las construcciones de espícula de rubéola con etiqueta de estreptomicina, el sobrenadante se aplica a una columna Strep-Tactin Superflow de un sistema de cromatografía Áktapure. Después de la aplicación, se lava con 4 volúmenes de columna de tampón W y a continuación con 5 volúmenes de columna de tampón E. El eluato obtenido se recoge en varias fracciones separadas. Las fracciones que contienen la construcción de espícula de rubéola se combinan y se lleva a cabo una determinación de la concentración de proteínas (por ejemplo, según Bradford).
Ejemplo 2: Caracterización de las propiedades antigénicas de las construcciones de espícula de rubéola por medio de SDS-PAGE e inmunotransferencia tipo Western.
Se aplican alícuotas de las construcciones de espícula de rubéola "corta" y "larga" purificadas de acuerdo con el ejemplo 1 a SDS-PAGE (geles de Tris-glicina al 4-20 %, número de artículo TG 42010, Anamed Elektrophorese GmbH), se separan en condiciones reductoras y a continuación se tiñen con azul brillante de Coomassie. Los resultados están representados en la Fig. 3. A partir de la comparación con las bandas del marcador de tamaño molecular (kDa) en el carril 1, se puede ver que la construcción de espícula de rubéola "larga" (carril 2) y la construcción de espícula de rubéola "corta" (carril 3) presentan tamaños moleculares de aproximadamente 80 kDa. Estos valores concuerdan con los tamaños moleculares que se esperan mediante el cálculo basándose en su secuencia de aminoácidos, concretamente 77 kDa para la construcción de espícula de rubéola "larga" y 76 kDa para la construcción de espícula de rubéola "corta".
Para la inmunotransferencia tipo Western, las proteínas de SDS-PAGE se transfieren a una membrana de PVDF. Después de bloquear los sitios de unión a proteínas libres, las proteínas de la membrana se incuban con un anticuerpo monoclonal para la glicoproteína E1 de rubéola y un anticuerpo monoclonal para la glicoproteína E2 de rubéola. En el caso de los anticuerpos utilizados se trata, por ejemplo, de (a) anti-glicoproteína estructural del virus de la rubéola, monoclonal, de ratón (MABR23-Ru6, ibt - immunological and biochemical testsystems GmbH), que reacciona con la glicoproteína E1, y (b) anticuerpo monoclonal contra E2 del virus de la rubéola (D92G) (MA5-18255, Thermo Fisher Scientific), que reacciona con la glicoproteína E2. Para la visualización, se incuba a continuación con un anticuerpo IgG de cabra anti-ratón (conjugado de fosfatasa alcalina). Los resultados de las inmunotransferencias tipo Western se muestran en la Fig. 4 (A) y (B). A partir de la comparación con las bandas del marcador de tamaño molecular (kDa) en el carril 1, se puede ver que tanto la construcción de espícula de rubéola "larga" (carril 2) como la construcción de espícula de rubéola "corta" (carril 3) se reconocen por los anticuerpos anti- E1 de rubéola y anti-E2 de rubéola. Estos resultados muestran claramente que los epítopos de la glicoproteína E1 de rubéola y la glicoproteína E2 de rubéola están presentes tanto en la construcción "larga" como en la construcción "corta".
Ejemplo 3 : Estudio de la reactividad inmunológica de las construcciones de espícula de rubéola en la prueba de inmunodiagnóstico: Detección de anticuerpos IgM anti-rubéola en sueros humanos
Para ello se utilizaron dos sistemas de prueba diferentes - un sistema ELISA convencional y un sistema basado en partículas basado en citometría de flujo y una lectura de fluorescencia de la señal del conjugado. Ambos sistemas (ELISA y basado en partículas) son sistemas representativos (portador de antígeno - partícula o placa) para los procedimientos de detección comunes actualmente en la serología de IgM e IgG de rubéola.
Para el estudio de la reactividad inmunológica de las construcciones de espícula de rubéola con respecto a los anticuerpos IgM del paciente, se realizaron distintos desarrollos de prueba en cada caso en comparación con el virus completo (como el antígeno comúnmente utilizado en el estado de la técnica):
(a) Una prueba de partículas con cuatro sueros humanos distintos (es decir, sueros de cuatro pacientes distintos) dio los resultados que se muestran gráficamente en la Fig. 5. La "intensidad de fluorescencia media (IFM)" en el eje y es una medida de la cantidad de anticuerpos IgM del paciente detectados en la muestra respectiva. Los resultados demuestran que las construcciones de espícula de rubéola "corta" y "larga" de acuerdo con la invención alcanzan al menos el rendimiento de detección de virus completo y en la mayoría de los casos incluso lo superan.
(b) Una prueba de partículas con distintas diluciones de un suero humano positivo para IgM de rubéola y de alto título, seleccionado dio los resultados que se muestran gráficamente en la Fig. 6. La intensidad de fluorescencia media (IFM) en el eje y es una medida de la cantidad de anticuerpos IgM del paciente detectados en la dilución respectiva de la muestra (eje x). Los resultados demuestran que las construcciones de espícula de rubéola "corta" y "larga" de acuerdo con la invención muestran un "comportamiento de titulación" muy similar, incluso mejorado en cuando a la forma con un suero humano en comparación con el virus completo. Esta es una propiedad esencial de un antígeno para una prueba serológica.
(c) La relación de positivos con respecto a negativos (P/N) se determinó con ayuda de los métodos conocidos por el experto en la técnica usando un procedimiento interno basado en partículas y usando distintos sueros humanos positivos y negativos para IgM de rubéola para los antígenos de construcción de espícula de rubéola "larga" y "corta" en cada caso en comparación con el virus completo. Se determinó la correspondiente relación de positivos con respecto a negativos (P/N) para cada antígeno o configuración de prueba. Los resultados están representados gráficamente en la Fig. 7. Éstos demuestran que las construcciones de espícula de rubéola "corta" y "larga" de acuerdo con la invención presentan una relación de positivos con respecto a negativos (P/N) muy similar, parcialmente superior al virus completo en una prueba serológica para la detección de anticuerpos IgM contra la rubéola. La relación de positivos con respecto a negativos (P/N) de una prueba de diagnóstico, al igual que el comportamiento de titulación, es un parámetro esencial de este procedimiento de prueba y una medida del llamado rendimiento de diagnóstico: Cuanto mayor sea el cociente P/N, mayor o mejor será el rendimiento diagnóstico.
(d) En una prueba comparativa adicional, se usaron los dos sistemas de prueba distintos ELISA y el sistema basado en partículas para el estudio de la reactividad inmunológica de las construcciones de espícula de rubéola "corta" y "larga" con respecto a los anticuerpos IgM anti-rubéola en 36 muestras de suero humano precaracterizadas (es decir, analizadas previamente con respecto a los anticuerpos IgM anti-rubéola), 17 positivas y 19 negativas. Un ELISA recubierto con virus completo sirvió como referencia.
Para la comparación y determinación de los valores de corte para las configuraciones experimentales se realizó un análisis de ROC en Microsoft Excel utilizando el software "Analyse-it" (Analyse-it Software, Ltd., R.U.).
Los resultados de la prueba están tabulados y representados gráficamente en la Fig. 8A y Fig. 8B.
A partir de las Fig. 8A y Fig. 8B puede distinguirse que los nuevos antígenos de construcción de espícula de rubéola "corto" y "largo" tienen éxito tanto en la configuración de ELISA como en la prueba basada en partículas para la diferenciación serológica de muestras de pacientes positivos para IgM anti-rubéola y negativos para IgM anti-rubéola. Con ambos antígenos de construcción de espícula de rubéola ("corto" y/o "largo") es posible una clara distinción entre muestras positivas y negativas de/en diferentes colectivos de donantes (panel). En comparación con la prueba de referencia (ELISA), se lograron sensibilidades y especificidades del 100 % con la construcción de espícula de rubéola "larga" en ambas plataformas de prueba. Con la construcción de espícula de rubéola "corta" igualmente se lograron sensibilidades y especificidades del 100 % en el ELISA, en la prueba basada en partículas la sensibilidad fue del 94,1 % y las especificidades fueron nuevamente del 100 %.
Ejemplo 4: Estudio de la reactividad inmunológica de las construcciones de espícula de rubéola en la prueba de inmunodiagnóstico: Detección de anticuerpos IgG anti-rubéola en sueros humanos
Para ello se utilizaron como en el ejemplo 3 dos sistemas de prueba diferentes - un sistema ELISA convencional y un sistema basado en partículas basado en citometría de flujo y una lectura de fluorescencia de la señal del conjugado.
Para el estudio de la reactividad inmunológica de las construcciones de espícula de rubéola "corta" y "larga" con respecto a los anticuerpos IgG anti-rubéola, se sometieron a prueba 44 muestras de suero humano precaracterizadas (es decir, analizadas previamente con respecto a anticuerpos IgG anti-rubéola), 21 positivas y 23 negativas, en las dos plataformas mencionadas frente a un ELISA de referencia comercial. El ELISA de referencia estaba recubierto con virus completo.
Para la comparación y determinación de los valores de corte para las configuraciones experimentales se realizó un análisis de ROC en Microsoft Excel utilizando el software "Analyse-it" (Analyse-it Software, Ltd., R.U.).
Los resultados de la prueba están tabulados y representados gráficamente en la Fig. 9A y Fig. 9B.
A partir de las Fig. 9A y Fig. 9B puede distinguirse que los nuevos antígenos de construcción de espícula de rubéola "corto" y "largo" tienen éxito tanto en la configuración de ELISA como en la prueba basada en partículas para la diferenciación serológica de muestras de pacientes positivos para IgG anti-rubéola y negativos para IgG anti-rubéola. Con ambos antígenos de construcción de espícula de rubéola ("corto" y/o "largo") es posible una clara distinción entre muestras positivas y negativas de/en diferentes colectivos de donantes (panel). En comparación con la prueba de referencia (ELISA), se lograron especificidades del 100 % con las dos construcciones de espícula de rubéola "larga" y "corta" en ambas plataformas de prueba. Las sensibilidades en ambas construcciones en ELISA ascendieron igualmente en cada caso al 100 %, en la prueba basada en partículas la sensibilidad en ambas construcciones se encontraba igualmente en cada caso en el 95,2 %.
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Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Antígeno del virus de la rubéola, caracterizado por que éste es una construcción del complejo de proteína de la envoltura E1-E2 del virus de la rubéola (sinónimo: construcción de espícula de rubéola), que comprende
- al menos un componente E1 y un componente E2 que están unidos,
- en donde el componente E1 está constituido por la proteína de la envoltura E1 cuya región transmembrana C-terminal y dominio intravirional están eliminados y cuyo extremo N-terminal comprende el ectodominio de la proteína de la envoltura E1,
- y en donde el componente E2 está constituido por la proteína de la envoltura E2, cuyas regiones transmembrana y dominio intravirional están eliminados y cuyo extremo N-terminal comprende el ectodominio de la proteína de la envoltura E2,
- y en donde el extremo C-terminal del componente E2 está unido al extremo N-terminal del componente E1 directamente o por medio de conectores.
2. Antígeno del virus de la rubéola según la reivindicación 1, caracterizado por que el antígeno se prepara como proteína de fusión E1-E2 recombinante.
3. Antígeno del virus de la rubéola según la reivindicación 2, caracterizado por que la proteína de fusión E1-E2 está acoplada con una secuencia señalizadora.
4. Antígeno del virus de la rubéola según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la proteína de fusión E1-E2 está acoplada con una etiqueta de afinidad, preferentemente una etiqueta de afinidad de estreptavidina, que preferentemente está dispuesta el extremo C-terminal.
5. Antígeno del virus de la rubéola según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el ectodominio de la proteína de la envoltura E1 presenta los aminoácidos (de las posiciones) 1-446 de acuerdo con SEQ ID NO:6 o los aminoácidos AA583-1028 de la secuencia de referencia Uni-ProtKΒ/SwissProt - P08563 (POLS_RUBVM), secuencia actualizada el 30 de mayo de 2006 (versión 2 de la secuencia).
6. Antígeno del virus de la rubéola según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el ectodominio de la proteína de la envoltura E2 presenta los aminoácidos (de las posiciones) 1-234 de acuerdo con SEQ ID NO:8 o los aminoácidos AA301-534 de la secuencia de referencia Uni-ProtKΒ/SwissProt - P08563 (POLS_RUBVM), secuencia actualizada el 30 de mayo de 2006 (versión 2 de la secuencia).
7. Antígeno del virus de la rubéola según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el conector es un conector flexible que presenta glicina y/o serina.
8. Antígeno del virus de la rubéola según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por que la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia señalizadora en el extremo N-terminal y/o la secuencia de conector están presentes opcionalmente en la región media de esta secuencia de aminoácidos.
9. Antígeno del virus de la rubéola según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por que la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia señalizadora en el extremo N-terminal y/o la secuencia de conector están presentes opcionalmente en la región media de esta secuencia de aminoácidos.
10. Molécula de ADN recombinante que codifica un antígeno del virus de la rubéola y comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión E1-E2 de rubéola según la reivindicación 2.
11. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 10, caracterizada por que comprende las secuencias de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO. 7.
12. Molécula de ADN recombinante según las reivindicaciones 10 u 11, caracterizada por que ésta comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia señalizadora en el extremo N-terminal y/o la secuencia de conector están presentes opcionalmente en la región media de esta secuencia de nucleótidos.
13. Molécula de ADN recombinante según las reivindicaciones 10 u 11, caracterizada por que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia señalizadora en el extremo N-terminal y/o la secuencia de conector están presentes opcionalmente en la región media de esta secuencia de nucleótidos.
14. Vector de expresión que comprende una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 10 a 13 enlazada operativamente.
15. Célula hóspedadora, transformada con un vector de expresión según la reivindicación 14.
16. Célula hospedadora según la reivindicación 15, caracterizada por que es una célula de insecto, preferentemente una célula de Drosophila Schneider 2 (S2).
17. Procedimiento para la preparación de una construcción del complejo de proteína de la envoltura E1-E2 del virus de la rubéola (sinónimo: construcción de espícula de rubéola) de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas:
(a) cultivar células hospedadoras, preferentemente células de Drosophila Schneider 2 (S2);
(b) transformar las células hospedadoras con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión E1-E2 de rubéola enlazada operativamente;
(c) cultivar las células hospedadoras transfectadas, en donde éstas expresan la proteína de fusión E1-E2 de rubéola y secretan/segregan la construcción de espícula de rubéola de la célula hospedadora;
(d) purificar la proteína de fusión.
18. Uso de una construcción del complejo de proteína de la envoltura E1-E2 del virus de la rubéola (sinónimo: construcción de espícula de rubéola) de acuerdo con la reivindicación 1 en un procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de anticuerpos anti-rubéola en una muestra de líquido como reactivo captador y/o asociado de unión para los anticuerpos anti-rubéola.
19. Kit de reactivos (kit de prueba) para realizar un procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de anticuerpos anti-rubéola en una muestra de líquido, en donde este kit contiene al menos una construcción del complejo de proteína de la envoltura E1-E2 del virus de la rubéola (sinónimo: construcción de espícula de rubéola) de acuerdo con la reivindicación 1 como antígeno.
20. Preparación de vacuna que comprende una construcción del complejo de proteína de la envoltura E1-E2 del virus de la rubéola (sinónimo: construcción de espícula de rubéola) según la reivindicación 1 como principio activo antigénico.
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