ES2946945T3 - Composición para aumentar la expresión de PGC-1 alfa - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición para prevenir o tratar enfermedades o síntomas asociados con una reducción en la expresión del coactivador del receptor activado por el proliferador de peroxisomas 1-alfa (PGC-1α), que contiene, como ingrediente activo, un compuesto representado por la siguiente fórmula general I, una de sus sales o uno de sus solvatos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para aumentar la expresión de PGC-1 alfa
Campo técnico
La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente coreana N.° 10-2016-0004383 presentada en la Oficina de Propiedad Intelectual de Corea el 13 de enero de 2016.
La presente invención se refiere a una composición para prevenir o tratar una enfermedad o síntoma asociados con una disminución en la expresión del coactivador 1 -alfa del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PGC-1a), en donde la composición es para su uso en la reducción del volumen del tejido adiposo o en la reducción del contenido de triglicéridos en el tejido adiposo.
Antecedentes de la técnica
El destino celular está regulado por el equilibrio y la combinación de factores para mantener la supervivencia celular y factores para inducir la muerte celular. La señalización de los factores estimulantes de la muerte celular inicia procesos de muerte celular a través de varias vías predeterminadas, y el proceso representativo de los mismos es la apoptosis. El proceso de muerte celular de la apoptosis, que se caracteriza por cambios distintivos en las formas de condensación de cromatina y división nuclear, se produce a través de la actividad de las enzimas caspasas debido a los factores estimulantes de la muerte celular en la membrana interna mitocondrial, y este proceso se produce con la transducción a través de la membrana externa mitocondrial (Galluzzi et al., 2007; Kroemer et al., 2009) [1] (Chipuk et al., 2010; Youle y Strasser, 2008) [2]. Dicha apoptosis a través de las mitocondrias comienza mediante varios estímulos, tales como programas de desarrollo, daño en el ADN, deficiencia de factores de crecimiento y nutrientes, infección viral y estrés oxidativo (Youle y Strasser, 2008) [3]. Sin embargo, la inducción anormal de la apoptosis es una causa obvia de enfermedades. La inducción anormal de la apoptosis causa, por ejemplo, neurodegeneración, lesión por isquemia reperfusión, enfermedades autoinmunitarias, y similares (Fadeel y Orrenius, 2005) [4]. Los resultados de investigaciones recientes confirmaron varias enfermedades que pueden estar causadas por las funciones de PGC-1a y la desregulación de PGC-1a en la muerte y supervivencia celular.
1. Enfermedades neurodegenerativas
Las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y esclerosis lateral amiotrófica (ELA), están causadas por disfunciones graduales y apoptosis de las células nerviosas (Jones et al., 2012) [5]. Los signos generales de estas enfermedades son el resultado de la pérdida de células nerviosas en partes específicas. Se puede ver que PGC-1a está directamente asociado con este tipo de enfermedades neurodegenerativas, a partir de la hiperactividad causada por la neurodegeneración y las lesiones evidentes en la región estriatal del cerebro a diferencia de lesiones menos abundantes en la corteza cerebral, que se puede observar en ratones con PGC-1a desactivado (Lin et al., 2004) [6]. Se puede observar, junto con estos hallazgos, que PGC-1a desempeña un papel importante en el mantenimiento de las funciones de las células nerviosas al confirmar las lesiones vacuolares que se muestran en el sistema nervioso central de ratones con PGC-1a desactivado (Leone et al., 2005) [7].
Los fenómenos fisiopatológicos de la EA, como la disfunción oxidativa mitocondrial, la degradación de la producción mitocondrial y disfunción cerebral en el cerebro de pacientes con EA, se deben a una disfunción mitocondrial (Chaturvedi & Flint, 2013)[8]. Especialmente, la expresión de PGC-1a disminuye en el cerebro de pacientes con Alzheimer, lo que da como resultado la apoptosis de las células nerviosas debido a la reducción de la producción y las funciones mitocondriales y al aumento del estrés oxidativo (Katsouri et al., 2011; Qin et al., 2009) [9, 10]. La disminución de la expresión de PGC-1a aumenta la expresión de BACE1, que rompe y escinde la proteína precursora de amiloide, causando EA, para producir p-amiloide, aumentando de este modo la cantidad de p-amiloide, causando disfunción mitocondrial y apoptosis (Wang et al., 2013)[11].
Los polimorfismos de un solo nucleótido del gen PGC-1a (PPARGC1A) se asocian significativamente con un mayor riesgo de EP y EH (Clark et al., 2011; Weydt et al., 2009)[12, 13]. La expresión del gen PGC-1a está disminuida en pacientes con EA, EP y EH, así como en modelos de EH en ratones (Cui et al., 2006; Qin et al., 2009; Ranganathan et al., 2009; Weydt et al., 2006; Xiang et al., 2011;Zheng et al., 2010) [14-19]. Por tanto, la expresión artificial de PGC-1a en un cultivo celular modelo de EH reduce significativamente la apoptosis de las células nerviosas (Chaturvedi et al., 2009) [20]. De manera adicional, la sobreexpresión de PGC-1a mejora el rendimiento motor a través de las neuronas motoras de ratones modelo de ELA (Zhao et al., 2011)[21 ]. Debido a tales funciones de PGC-1a estrechamente asociadas con enfermedades neurodegenerativas, los mecanismos de activación farmacológica de PGC-1a están surgiendo como nuevos métodos para curar diversas enfermedades neurodegenerativas.
2. Fenómeno de envejecimiento por especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés)
PGC-1a desempeña un papel clave en el inicio de los mecanismos de defensa en situaciones de estrés oxidativo por PGC1 (Chaturvedi & Flint, 2013) [22]. Esto se entrelaza con funciones en enfermedades neurodegenerativas, y las cantidades de complejos relacionados con la respiración mitocondrial y la proteína de desacoplamiento (UCP, por sus siglas en inglés) aumentan por la sobreexpresión de PGC1-a (St-Pierre et al., 2003) [23]. Estos aumentos se producen con los aumentos de expresión de grupos de proteínas que desintoxican las especies reactivas de oxígeno (ROS) en las mitocondrias y el citoplasma (Cowell et al., 2009) [24]. El primer estudio, que revela los papeles de PGC-1a en el metabolismo de ROS, indicó que la expresión ectópica de PGC-1a en células musculares aumenta la expresión de superóxido dismutasa 2 (SOD2), superóxido antioxidante y glutatión peroxidasa (GPX1), peróxido de hidrógeno antioxidante (St-Pierre et al., 2003) [23]. A través de la investigación avanzada desde entonces, se investigó que todos los tipos de enzimas detoxificadoras de ROX presentes en varios órganos intercelulares, tales como las mitocondrias, citoplasma y peroxisomas, están regulados por PGC-1a (St-Pierre et al., 2006; Valle et al., 2005) [25, 26]. Estos estudios también establecieron la importancia fisiológica en los programas metabólicos de ROS regulados por PGC-1a. Se puede observar que PGC-1a realiza funciones citoprotectoras en situaciones de estrés oxidativo ya que la supresión de la expresión de PGC-1a impide el aumento de los grupos proteicos detoxificadores de ROS (St-Pierre et al., 2006) [25].
De manera adicional, las enfermedades crónicas relacionadas con el envejecimiento, por ejemplo, enfermedades cerebrales degenerativas, enfermedades metabólicas y enfermedades cardiovasculares, preceden al envejecimiento celular o al envejecimiento del organismo. Estas enfermedades aumentan el estrés por especies reactivas de oxígeno, inflamación estéril, disfunción mitocondrial, daño en el ADN y disfunción y acortamiento de los telómeros. La comprensión de los mecanismos comunes de estos fenómenos ha sido incompleta hasta ahora, pero un artículo reciente informó que la eliminación de PGC-1a acorta los telómeros e induce daños en el ADN, causando envejecimiento vascular y aterosclerosis (Xiong, S 2015)[27]. Según el artículo, la eliminación de PGC-1a redujo la actividad y la expresión de la transcriptasa inversa de los telómeros (TERT, por sus siglas en inglés), que mantiene la longitud de los telómeros, y aumenta la actividad y expresión de p53. Este estudio muestra que PGC-1a desempeña un papel clave en el alivio del envejecimiento y las enfermedades crónicas que causan el envejecimiento.
3. En relación con enfermedades vasculares o miocárdicas
Las funciones antioxidantes de PGC-1a están asociadas con la protección de las células endoteliales vasculares. Al igual que en los modelos neuronales, el aumento de la expresión de PGC-1a en células endoteliales vasculares humanas produce mitocondrias y aumenta los grupos de enzimas detoxificadoras de ROS (Valle et al., 2005) [26]. La aplicación de ROS a las células endoteliales bovinas aumenta PGC-1a y las funciones antioxidantes intercelulares (Borniquel et al., 2006) [28]. La aplicación de estrés oxidativo artificial tras la sobreexpresión de PGC-1a en células endoteliales vasculares humanas reduce el aumento de ROS intercelulares y obstruye la actividad de la caspasa 3 (Valle et al., 2005) [26]. La principal causa de muerte es la insuficiencia cardíaca en los modelos de ratones con doble desactivación de PGC-1a y PGC-1p (Lai et al., 2008) [29], y la disminución de PGC-1a se asocia con insuficiencia cardíaca por estrés y muerte de células miocárdicas en modelos de ratones con insuficiencia cardíaca congestiva (Gamier et al., 2003) [30]. De esta manera, PGC-1a desempeña un papel importante en el metabolismo y crecimiento de las células miocárdicas.
4. Pérdida muscular y enfermedades relacionadas Las funciones antioxidantes de PGC-1a están asociadas con funciones de mantenimiento y fortalecimiento muscular. La masa muscular reducida y las funciones musculares degradadas (pérdida de músculo por envejecimiento, sarcopenia o disfunción muscular) tienen una amplia gama de efectos adversos, desde enfermedades relacionadas con las hormonas hasta el mantenimiento de la homeostasis intracelular. Varios estudios han revelado que el aumento de la expresión (expresión motora o génica) de PGC-1a en las células musculares puede resolver la disfunción mitocondrial, que provoca la pérdida de masa muscular, para mantener el músculo [31-38].
5. Eliminación de grasa y mantenimiento de la temperatura corporal En ratones con mutación anuladora de PGC-1a, la expresión de genes mitocondriales, que contienen varios genes que actúan como componentes del sistema de transferencia electrónica (ETC, por sus siglas en inglés), disminuyó a una respiración más baja (Lin et al., 2004; Leone et al., 2005) [6, 7]. Estas funciones mitocondriales reducidas dañaron los procesos fisiológicos que dependen de los procesos metabólicos mitocondriales. En realidad, los ratones deficientes en PGC-1a no pudieron aumentar la expresión de UCP1, cuya expresión aumenta por la exposición al frío, y mostraron sensibilidad al frío (Lin et al., 2004; Leone et al., 2005) [6, 7]. Estos ratones tenían una capacidad motora reducida en comparación con los ratones normales (Leone et al., 2005) [7]. La producción mitocondrial aumentó y la expresión génica mitocondrial aumentó en ratones transgénicos que sobreexpresan PGC-1a en el corazón y el músculo en comparación con los ratones que carecen de PGC-1a (Lehman et al., 2000; Lin et al., 2002b; Wende et al., 2007). Estos estudios muestran que la presencia o ausencia de PGC-1a in vivo tiene un efecto importante sobre la fisiología mitocondrial. El aumento de PGC-1a en preadipocitos beis o pardos inducibles induce la diferenciación de adipocitos beis o pardos inducibles en adipocitos pardos para oxidar ácidos grasos, aumentando la capacidad de irradiar calor del cuerpo en lugar de producir ATP. De manera adicional, PGC-1a también elimina grasa [39-42].
Como es bien sabido, la grasa subcutánea está compuesta por capas granulares rodeadas de celulitis. Esta grasa subcutánea no se descompone bien con el ejercicio. La razón es que las enzimas lipolíticas del cuerpo están bloqueadas por la celulitis. Convencionalmente, prevalece un procedimiento de succión física de adipocitos mediante la inserción de un catéter llamado aguja de acupuntura, y dicho procedimiento provoca dolor en un paciente que se somete al procedimiento y, por lo tanto, la anestesia general suele preceder al procedimiento. Sin embargo, no se puede excluir que la anestesia general pueda actuar como un factor de riesgo para un paciente que se somete al procedimiento, y la inserción del catéter provoca inevitablemente una hemorragia interna y aumenta el tiempo de recuperación del tejido resultante de la misma.
En la lipólisis mediante inyección (lipólisis por inyección), se inyecta directamente un fármaco capaz de realizar la lipólisis por vía subcutánea en un sitio de grasa para disolver y eliminar la grasa, y los productos representativos para ello incluyen Lipostabil®, Lipodissolve, Lipo-zap y Flab-Jab, que se conocen como inyección de PPC. Estas inyecciones de PPC están compuestas de fosfatidilcolina y ácido desoxicólico para mantener la fosfatidilcolina en estado líquido, y son medicamentos especiales que se aprobaron por primera vez como ayuda para el tratamiento del coma hepático en pacientes que caen en coma causado por cirrosis. Sin embargo, las inyecciones de PPC se utilizan indebidamente como eliminadores de grasa no autorizados, ya que se sabe que las inyecciones de PPC degradan los adipocitos para perder peso cuando se inyectan en el área grasa. Las fosfatidilcolinas son los materiales principales que constituyen las membranas celulares, y se ha pensado que las fosfatidilcolinas permiten que los componentes grasos se disuelvan bien en la sangre y disuelven los adipocitos de los tejidos grasos para descargar la grasa de los adipocitos fuera de los adipocitos. Teóricamente, las inyecciones de PPC se pueden usar para eliminar una pequeña cantidad de grasa subcutánea y celulitis que están limitadas por vía tópica, pero la inyección de PPC per se no elimina grasa. No se revelaron los mecanismos de acción de las inyecciones de PPC. La mayoría de los estudios sobre las inyecciones de PPC dependen de la evaluación subjetiva de los pacientes, y no hay resultados de estudios que muestren objetivamente los cambios en la masa grasa subcutánea. La FDA de Estados Unidos no aprueba el uso de fosfatidilcolinas para la reducción de grasa subcutánea debido a la falta de datos sobre la eficacia y seguridad de las inyecciones de PPC, y advierte contra el uso indiscriminado de las mismas. De manera adicional, hay bibliografía que indica efectos adversos sobre la esteatohepatitis, la piel y el aparato respiratorio.
Por consiguiente, los presentes inventores se esforzaron por crear materiales capaces de degradar de forma segura las grasas corporales para superar los efectos secundarios de los medicamentos y los problemas de las enfermedades crónicas.
6. En relación con el envejecimiento
El envejecimiento es un estado complejo y heterogéneo que implica varios cambios que se producen a lo largo del tiempo. En realidad, en los casos de incumplimiento de las demandas energéticas, la disfunción en algunos procesos fisiológicos y el aumento del estrés contribuyen a un estado de envejecimiento. Las mitocondrias han estado en el centro del envejecimiento durante un largo período de tiempo ya que las funciones mitocondriales generalmente se reducen con el envejecimiento (Quinlan et al., 2011) [43]. Por ejemplo, las funciones mitocondriales, junto con PGC-1a y PGC1b, se reducen durante la disfunción de los telómeros, y esta situación se asocia con el envejecimiento (Sahin et al., 2011) [44].
En los estudios de envejecimiento, la hipótesis más destacada es la "teoría de los radicales libres del envejecimiento", en la que el aumento de la producción de ROS por parte de las mitocondrias y el daño oxidativo resultante son factores determinantes del envejecimiento (Quinlan et al., 2011) [43]. Específicamente, se cree que las mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) desempeñan un papel central en el mal funcionamiento mitocondrial asociado con el envejecimiento. Modelos de ratón con polimerasa c mitocondrial (POLG, por sus siglas en inglés) (Kujoth et al., 2005; Trifunovic et al., 2004) [45, 46] han ayudado a resaltar la importancia de las mitocondrias en el envejecimiento. POLG es la ADN polimerasa ubicada en las mitocondrias e involucrada en la replicación y reparación del ADN mitocondrial. Los ratones con mutaciones en POLG tienen un aumento de mutaciones en el ADN mitocondrial, muestran alopecia (pérdida de cabello), y tienen osteoporosis y miocardiopatía, y estos síntomas están asociados con el envejecimiento (Kujoth et al., 2005; Trifunovic et al., 2004) [45, 46]. Con el fin de probar si el aumento mitocondrial a través de la expresión de PGC-1a podría mejorar los fenotipos externos de los ratones con POLG, estos ratones se cruzaron con ratones MCK-PGC-1a Tg (Lin et al., 2002b) [47]. Los ratones que expresan POLG y PGC-1a mutantes aumentaron la actividad mitocondrial en el corazón y el músculo esquelético, lo que dio como resultado mejoras en estas funciones tisulares en comparación con ratones que expresan solo GOLG mutante (Dillon et al., 2012) [48]. Estos datos destacaron que las funciones mitocondriales elevadas tienen efectos beneficiosos independientemente de las mutaciones del ADN mitocondrial. Es importante destacar que, la expresión elevada de PGC-1a durante la vida retrasa la aparición de los síntomas asociados con el envejecimiento, tales como la pérdida de masa muscular (sarcopenia) (Wenz et al., 2009) [49]. Estas funciones mejoradas se atribuyen a la disminución de la acumulación de daño oxidativo por la edad y las disfunciones mitocondriales (Wenz et al., 2009) [49]. De manera colectiva, estos estudios muestran que PGC-1a retrasa la aparición de los síntomas relacionados con el envejecimiento y mitiga los efectos del daño oxidativo que se ha producido.
El documento WO 2014/100126 A1 se refiere a oligosacáridos de leche humana para mejorar los síntomas de estrés. Yonekawa et al. (Brain 137.10 (2014): 2670-2679) se refiere a fenotipos miopáticos que mejoran la sialilactosa en ratones modelo de miopatía GNE sintomática. Tarr et al. (Brain, behavior, and immunity 50 (2015): 166-177) se refiere a los prebióticos 3' sialilactosa y 6' sialilactosa que disminuyen el comportamiento similar a la ansiedad inducido por estrés y las alteraciones de la microbiota colónica e incluye evidencia de los efectos sobre el eje intestino-cerebro. El documento US 2012/122814 Al se refiere a una composición para la prevención o el tratamiento de cicatrices hipertróficas o queloides. El documento WO 2014/100191 Al se refiere a composiciones nutricionales que comprenden oligonucleótidos dietéticos neuroprotectores. Sakai et al. (Journal of Applied Glycoscience 53.4 (2006): 249-254) se refiere a los efectos de la alimentación con sialilactosa y ácido N-acetilneuramínico galactosilado sobre la capacidad de aprender a nadar y la composición de lípidos cerebrales en ratas adultas. El documento WO 2016/146789 A1 se refiere a una composición que comprende sialilactosa para su uso en la potenciación de las habilidades de aprendizaje y la función de la memoria. El documento WO 92/11017 A2 se refiere al uso de sialilactosa para el tratamiento de artritis.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición para prevenir o tratar una enfermedad o síntoma asociados con una disminución en la expresión del coactivador 1 -alfa del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PGC-1a), comprendiendo la composición, como principio activo, un compuesto representado por la fórmula general I o una sal, hidrato o solvato del mismo: Fórmula general I: S-(MS)p-(MS)q, en donde S es ácido siálico; y (MS)p y (MS)q son cada uno independientemente un resto de monosacárido, en donde la composición es para su uso en la reducción del volumen del tejido adiposo o en la reducción del contenido de triglicéridos en el tejido adiposo.
Descripción detallada de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
En una composición descrita en el presente documento, el principio activo es un compuesto de fórmula general I, o una sal, hidrato o solvato del mismo. En la fórmula general I, S representa ácido siálico.
El ácido siálico se puede unir con (MS)p de diversas maneras, pero está unido a un compuesto monosacárido (MS)p a través de un enlace a2,3 o un enlace a2,6. El ácido siálico modificado, en lugar de ácido siálico, puede ubicarse en S. Por ejemplo, una modificación en la que H del grupo -OH en el carbono n.° 4 del ácido siálico se sustituye con otro sustituyente o el OH del mismo se sustituye con otro sustituyente puede estar ubicado en S. La sustitución puede ser una sustitución con (p. ej., H es un grupo alquilo C1-C4). El grupo alquilo C1-C4 puede ser metilo, etilo, propilo o butilo. Lo más preferentemente, el ácido siálico sin modificar está ubicado en S.
Los compuestos monosacáridos correspondientes a (MS)p y (MS)q también pueden corresponder a cualquier compuesto monosacárido, y ejemplos de los mismos comprenden tetrosas (p. ej., eritrosa y treosa), pentosas (por ejemplo, ribosa, arabinosa, xilosa y lixosa) y hexosas (alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa y talosa). Los compuestos monosacáridos ubicados en (MS)p y (MS)q son preferentemente pentosas o hexosas, más preferentemente hexosas, aún más preferentemente glucosa, manosa o galactosa, y lo más preferentemente glucosa o galactosa. El compuesto monosacárido correspondiente a (MS)p y (MS)q pueden ser estereoisómeros D o L, y más preferentemente estereoisómeros D. Los compuestos monosacáridos iguales o diferentes, preferentemente compuestos monosacáridos diferentes, se pueden ubicar en (MS)p y (MS)q.
Según un aspecto descrito en el presente documento, (MS)p es galactosa o glucosa y (MS)q es glucosa o galactosa, y lo más preferentemente, (MS)p es galactosa y (MS)q es glucosa. Cuando (MS)p es galactosa y (MS)q es glucosa, se obtiene el compuesto disacárido lactosa.
Los compuestos monosacáridos correspondientes a (MS)p y (MS)q pueden estar modificados o sin modificar. Por ejemplo, un compuesto monosacárido modificado puede ser uno en el que el H del grupo -OH puede estar sustituido con un grupo acetilo y el OH del mismo puede estar sustituido con un grupo N-acetilo. Preferentemente, los compuestos monosacáridos correspondientes a (MS)p y (MS)q pueden ser compuestos monosacáridos sin modificar.
Según un aspecto descrito en el presente documento, el compuesto de fórmula general I utilizado como principio activo es sialilactosa. La sialilactosa, que se usa como principio s activo, es un compuesto formado por la unión secuencial de galactosa y glucosa al ácido siálico.
El ácido siálico se puede unir a la galactosa de diversas maneras, por ejemplo, a través de enlace a-2,3 o a-2,6. El ácido siálico se puede modificar y, por ejemplo, una modificación en la que H del grupo -OH en el carbono n.° 4 del ácido siálico se sustituye con otro sustituyente o el OH del mismo se sustituye con otro sustituyente puede estar ubicado en S. La sustitución puede ser una sustitución con (p. ej., H es un grupo alquilo C1-C4). El grupo alquilo C1-C4 puede ser metilo, etilo, propilo o butilo.
La galactosa y la glucosa de la sialilactosa pueden tener estereoisómeros D o L, y más preferentemente estereoisómeros D. La galactosa y la glucosa de la sialilactosa están modificadas o sin modificar. Por ejemplo, un compuesto monosacárido modificado puede ser uno en el que el H del grupo -OH puede estar sustituido con un grupo acetilo y el OH del mismo puede estar sustituido con un grupo N-acetilo. Preferentemente, la galactosa y la glucosa de la sialilactosa son compuestos monosacáridos sin modificar.
Según un aspecto descrito en el presente documento, la sialilactosa utilizada como principio activo es a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc o a-NeuNAc-(2^-6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc [NeuNAc: N-acetilneuraminilo, Gal: galactosa, Glc: Glucosa]. a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc es una sustancia que se encuentra en el gangliósido GM3, y a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc es un isómero de la sustancia.
Más preferentemente, la sialilactosa utilizada como principio activo es a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4 )-D-Glc. Como se valida en los ejemplos a continuación, a-NeuNAc-(2^-6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc tiene una eficacia superior a a-NeuNAc-(2^3)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc.
Uno que se utiliza como principio activo en la composición descrita en el presente documento puede ser el compuesto per se, así como una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal del compuesto que produce los efectos farmacológicos deseados, es decir, aumentar la expresión de PGC-1a y las funciones mitocondriales. Ejemplos de esta sal se forman usando ácidos inorgánicos, tales como clorhidrato, bromhidrato, y yodhidrato y ácidos orgánicos, tales como acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, bisulfato, sulfamato, sulfato, naftilato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, propionato de ciclopentano, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, 2-hidroxietano sulfato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftaleno sulfonato, nicotinato, oxalato, tosilato y undecanoato.
La expresión "hidrato farmacéuticamente aceptable" se refiere a un hidrato del compuesto que tiene los efectos farmacológicos deseados. La expresión "solvato farmacéuticamente aceptable" se refiere a un solvato del compuesto que tiene los efectos farmacológicos deseados. El hidrato y el solvato también se pueden preparar usando los ácidos.
La composición descrita en el presente documento comprende, como principio activo, el compuesto anterior de fórmula general 1, o una sal (por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable), hidrato o solvato del mismo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad neurodegenerativa" se refiere a un término genérico de enfermedades en las que ciertos grupos de células cerebrales del cerebro y la médula espinal pierden gradualmente sus funciones y el número de células cerebrales disminuye. Las células nerviosas del cerebro y la médula espinal tienen una amplia variedad de funciones dependiendo de su ubicación y, por lo tanto, muestran una gran variedad de aspectos clínicos según la ubicación en la que las células nerviosas se dañan primero y pierden su funcionamiento y en función de la forma en que progresa dicha disfunción.
Las enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad de Alzheimer (EA), esclerosis lateral amiotrófica (ELA, enfermedad de Lou-Gehrig), distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), enfermedad de Pick, enfermedad de Kuf, síndrome de Mohr-Tranebjerg, enfermedad de Wilson, enfermedad de Alzheimer esporádica, esclerosis lateral amiotrófica esporádica, enfermedad de Parkinson esporádica, cambio en la función autónoma, trastorno del sueño, trastorno neuropsiquiátrico, depresión, esquizofrenia, trastorno esquizoafectivo, psicosis de Korsakov, manía, trastorno de ansiedad, trastorno fóbico, deterioro del aprendizaje o de la memoria, amnesia o pérdida de memoria relacionada con la edad, trastorno por déficit de atención, trastorno depresivo del estado de ánimo, trastorno depresivo mayor, trastorno anancástico de la personalidad, trastorno por uso de sustancias psicoactivas, trastorno de pánico, desorden afectivo bipolar, migraña, trastorno de hiperactividad y discinesia.
Más específicamente, las enfermedades neurodegenerativas pueden comprender enfermedades neurodegenerativas agudas, subagudas o crónicas. Las enfermedades neurodegenerativas agudas pueden comprender accidentes cerebrovasculares, infarto cerebral, hemorragia cerebral, lesión cerebral o lesión de la médula espinal, y las enfermedades neurodegenerativas subagudas comprenden enfermedades desmielinizantes, síndrome paraneoplásico neurológico, degeneración combinada subaguda, encefalitis necrotizante subaguda o encefalitis esclerosante subaguda. Las enfermedades neurodegenerativas crónicas pueden comprender pérdida de memoria (incluyendo demencia senil, demencia vascular, enfermedad difusa de la sustancia blanca (enfermedad de Binswanger), demencia de origen endocrino o metabólico, demencia por traumatismo craneoencefálico y daño cerebral difuso, demencia pugilística y demencia del lóbulo frontal), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad por cuerpos de Lewy difusos, parálisis supranuclear progresiva (síndrome de Steel-Richardson), atrofia multisistémica, afecciones epilépticas crónicas asociadas con neurodegeneración, enfermedades de las motoneuronas (incluyendo esclerosis lateral amiotrófica, ataxias degenerativas, degeneración basal cortical, complejo ELA-Parkinson-Demencia de Guam, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, sinucleinopatías, afasia primaria progresiva, degeneración estriatonigral, enfermedad de Machado-Joseph/ataxia espinocerebelosa y degeneraciones olivopontocerebelosas), enfermedad de Gilles de la Tourette, parálisis bulbar y pseudobulbar, atrofia muscular espinal y espinobulbar (enfermedad de Kennedy), esclerosis múltiple, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffman, enfermedad de Kugelberg-Welander, enfermedad de Tay-Sach, enfermedad de Sandhoff, enfermedad espástica familiar, enfermedad de Wohlfart-Kugelberg-Welander, paraparesia espástica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, disautonomía familiar (síndrome de Riley-Day) y enfermedades priónicas (incluyendo la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y Gerstmann Straussler-Scheinker, Kuru e insomnio familiar fatal).
Las enfermedades metabólicas, enfermedades relacionadas con el metabolismo de los lípidos, el envejecimiento y las enfermedades causadas por el envejecimiento, y la pérdida de masa muscular (sarcopenia, caquexia) y las enfermedades causadas por la pérdida de masa muscular incluyen gluconeogénesis, celulitis, ginecomastia, pseudoginecomastia, lipodistrofia, envejecimiento, fotoenvejecimiento, traumatismos cutáneos, reepitelización de lesiones, deshidratación de la piel, xerosis, trastornos de la queratinización, callosidades, piel endurecida, liquen plano, lesiones cutáneas asociadas con lupus, dermatitis seborreica, dermatitis senil, caspa, costra láctea, seborrea, hiperseborrea del acné, dermatitis solar, queratosis seborreica, queratosis senil, queratosis actínica, queratosis fotoinducida, queratosis folicular, acné, nevo, cambio en la función de los fibroblastos, fascitis nodular, esclerodermia, contractura de Dupuytren, trastorno de las glándulas sebáceas, acné rosácea, acné polimórfico, comedones, polimorfa, rosácea, acné noduloquístico, acné conglobado, acné senil, ictiosis, enfermedad de Darier, queratodermia palmoplantar, leucoplasia, liquen mucoso, liquen cutáneo, eccema, verrugas comunes, verrugas planas, epidermodisplasia verruciforme, papilomatosis oral, lupus eritematoso, enfermedades ampollosas, penfigoide ampolloso, esclerodermia, trastornos de la pigmentación, vitíligo, alopecia areata, enfermedad de cuerpos de Lewy, ovillos neurofibrilares, fibras de Rosenthal, hialina de Mallory, miastenia grave, síndrome de Gilles de la Tourette, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, epilepsia, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de sordera-distonía, enfermedad de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distonía, enfermedad de la motoneurona, síndrome de neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa, enfermedad de Leigh de herencia materna, ataxia de Friedreich y paraplejía espástica hereditaria.
La composición descrita en el presente documento se puede seleccionar del grupo que consiste en suspensiones, jarabes, emulsiones, liposomas, extractos, polvos, gránulos, comprimidos, preparaciones de liberación sostenida y cápsulas.
La composición descrita en el presente documento puede ser una composición para administración oral y está en una forma farmacéutica de un sistema de suministro de fármacos que comprende liposomas o una preparación de liberación sostenida.
Cuando la composición descrita en el presente documento es una composición para administración parenteral, la composición puede estar en una forma farmacéutica de un sistema de suministro de fármacos que comprende liposomas y un agente de contraste de ultrasonidos o una preparación de liberación sostenida.
La composición descrita en el presente documento puede prepararse como una composición farmacéutica, una composición cosmética, una composición nutracéutica, o una composición alimenticia.
La composición descrita en el presente documento comprende: (a) una cantidad farmacéuticamente eficaz del compuesto anterior de fórmula general I; y (b) un transportador farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para lograr la eficacia o actividad del compuesto de fórmula general I anterior.
La composición descrita en el presente documento se puede preparar en una composición farmacéutica, en donde la composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende un transportador farmacéuticamente aceptable. El transportador farmacéuticamente aceptable que se encuentra en la composición farmacéutica descrita en el presente documento se usa habitualmente en el momento de la formulación, y los ejemplos del mismo pueden comprender, pero sin limitación, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender además un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente saborizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares, además de los ingredientes anteriores. Se describen en detalle transportadores y agentes farmacéuticamente aceptables adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
La composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por vía oral o parenteral. Los ejemplos de administración parenteral pueden comprender inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección transdérmica, administración mucosa, administración en colirio y similares.
Una dosis adecuada de la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede variar dependiendo de diversos factores, tales como el método de formulación, la forma de administración, la edad del paciente, el peso corporal, el sexo, la morbilidad y la dieta, el momento de la administración, la tasa de excreción y la sensibilidad de respuesta. Preferentemente, la dosis de la composición farmacéutica descrita en el presente documento es de 0,0001­ 1000 mg/kg (peso corporal), por ejemplo, de 0,001-800 mg/kg (peso corporal), o de 0,001-600 mg/kg (peso corporal) por día en adultos. De manera adicional, la composición farmacéutica puede administrarse una o varias veces al día en un intervalo de tiempo predeterminado según el criterio de un médico o farmacéutico.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede formularse en una forma farmacéutica unitaria o puede prepararse en un recipiente multidosis usando un transportador y/o un excipiente farmacéuticamente aceptables según un método que puede realizarse fácilmente por una persona experta en la materia a la que pertenece la presente invención.
La forma farmacéutica de la composición descrita en el presente documento puede ser soluciones, suspensiones, jarabes, emulsiones, liposomas, extractos, polvos, gránulos, comprimidos, preparaciones de liberación sostenida y cápsulas y la composición descrita en el presente documento pueden comprender además un dispersante o un estabilizante.
Específicamente, según la vía de administración, la forma farmacéutica sólida para administración oral comprende cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En estas formas farmacéuticas sólidas, los compuestos activos pueden mezclarse con al menos un excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable inerte (p. ej., citrato de sodio o fosfato dicálcico) y/o a) rellenos o diluyentes (p. ej., almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), b) aglutinantes (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato, gelatina, polvinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, c) agentes hidratantes (p. ej., glicerol), d) agentes desintegrantes (p. ej., agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, silicato predeterminado y carbonato de sodio), e) retardadores de la solución (p. ej., parafina), f) aceleradores de la absorción (p. ej., compuestos de amonio cuaternario), g) agentes humectantes (p. ej., alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), h) absorbentes (p. ej., caolín y arcilla de bentonita), e i) lubricantes (p. ej., talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos). En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma farmacéutica de los mismos también puede comprender agentes tamponantes.
De manera adicional, los compuestos activos pueden usarse como excipientes, tales como lactosa o azúcar de la leche, así como rellenos en cápsulas de gelatina blandas y duras utilizando polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas de administración sólidas de comprimidos, comprimidos recubiertos con azúcar, cápsulas, píldoras y granulados, pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica del campo farmacéutico. Estos pueden comprender opcionalmente un opacificante, y pueden formularse de tal manera que solo el principio activo se libere en un lugar en particular en el tracto gastrointestinal de manera sostenida o preferencial. También, si es necesario, los compuestos activos pueden prepararse en microcápsulas junto con al menos uno de los excipientes.
Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral incluyen emulsiones, disolventes, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de la adición a los compuestos activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden comprender diluyentes inertes utilizados habitualmente en la técnica, tales como, agua u otros disolventes, solubilizantes y emulsionantes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida), aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, aceite de maíz, aceite de germen, aceite de oliva, aceite de ricino o aceite de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicol y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, la composición oral también puede comprender adyuvantes, tales como un agente humectante, un emulsionante, un agente de suspensión, un agente edulcorante, un agente saborizante y un aroma.
Una forma farmacéutica para la administración rectal o vaginal es preferentemente un supositorio que se puede preparar mezclando el compuesto descrito en el presente documento con un adyuvante o transportador no irritante adecuado (por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol o cera de supositorio), que es un sólido a temperatura ambiente pero un líquido a temperatura corporal y por lo tanto se derrite en el recto o en la cavidad vaginal para liberar el compuesto activo.
Una forma farmacéutica adecuada para inyección parenteral puede comprender una solución acuosa o no acuosa estéril, una dispersión, una suspensión, o una emulsión, y un polvo estéril fisiológicamente aceptables que pueden reconfigurarse en una solución o dispersión inyectable estéril. Ejemplos adecuados del transportador, diluyente, disolvente o vehículo acuosos o no acuosos comprenden agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etc.), aceites vegetales (aceite de oliva), ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y mezclas adecuadas de los mismos.
De manera adicional, la composición descrita en el presente documento puede comprender un adyuvante, tal como un conservante, un agente humectante, un emulsionante y un dispersante. Las acciones de los microorganismos pueden suprimirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos (p. ej., parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, etc.). De manera adicional, la composición descrita en el presente documento puede comprender preferentemente osmorreguladores, tales como azúcar y cloruro de sodio. La absorción prolongada de la formulación inyectable se puede lograr mediante el uso de agentes retardantes de la absorción (p. ej., monoestearato de aluminio y gelatina).
Una suspensión, además de los compuestos activos, puede comprender un agente de suspensión (por ejemplo, alcohol isoestearílico etoxilado, polioxietilensorbitol y éster de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto o mezclas de los mismos).
En algunos casos, para prolongar los efectos de los fármacos, es deseable ralentizar la absorción de los fármacos mediante inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse utilizando una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. En este caso, la velocidad de absorción del fármaco depende de la velocidad de disolución, que puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Por otro lado, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo un fármaco en un vehículo oleoso.
Se produce una forma de depósito inyectable formando matrices microencapsuladas de fármacos en polímeros biodegradables, tal como poliactida-poliglicolida. La velocidad de liberación del fármaco puede controlarse dependiendo de la relación de fármaco a polímero y de las propiedades del polímero particular utilizado.
Otros ejemplos del polímero biodegradable comprenden poli(ortoéster) y poli(anhídrido). De manera adicional, una forma farmacéutica inyectable de depósito se prepara encapsulando un fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.
Se puede esterilizar una forma farmacéutica inyectable mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias o incorporando un agente esterilizante en forma de una composición sólida estéril que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso.
La composición descrita en el presente documento puede ser una composición para administración oral, que es una preparación o de liberación sostenida o liposomas.
La composición descrita en el presente documento puede ser una composición para administración parenteral y está en una forma farmacéutica de liposomas o una preparación de liberación sostenida.
Cuando la composición farmacéutica descrita en el presente documento se prepara en una forma farmacéutica para administración oral, así como una forma farmacéutica para administración parenteral (preferentemente, administración intravenosa), la composición farmacéutica está en una forma farmacéutica de liposomas o de una preparación de liberación sostenida.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede encapsular en un liposoma para proporcionar la estabilidad de una forma farmacéutica para el suministro de fármacos. Los liposomas utilizados pueden prepararse mediante mezclas que comprenden polioles, tensioactivos, fosfolípidos, ácidos grasos y agua (Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, (XIV), p. ej.33 y ss. (1976)).
Los polioles usados en los liposomas no están particularmente limitados, y los ejemplos preferidos de los mismos comprenden propilenglicol, dipropilenglicol, 1,3-butilenglicol, glicerina, metilpropanodiol, isoprenglicol, pentilenglicol, eritritol, xilitol y sorbitol, más preferentemente propilenglicol.
El tensioactivo utilizado en la preparación de liposomas puede ser cualquier tensioactivo conocido en la técnica, y sus ejemplos comprenden un tensioactivo aniónico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo anfótero y un tensioactivo no iónico, preferentemente un tensioactivo aniónico y un tensioactivo no iónico.
Los ejemplos específicos del tensioactivo aniónico comprenden alquilacilglutamatos, alquilfosfatos, alquilactatos, dialquilfosfatos y trialquilfosfatos. Los ejemplos específicos del tensioactivo no iónico comprenden éteres de alquilo alcoxilados, ésteres de alquilo alcoxilados, poliglucósidos de alquilo, ésteres de poliglicerilo y ésteres de azúcar. Lo más preferentemente, se utilizan polisorbatos pertenecientes a los tensioactivos no iónicos.
Un fosfolípido, que es otro componente utilizado en la preparación de liposomas, es un lípido anfótero, y sus ejemplos comprenden fosfolípidos naturales (por ejemplo, lecitina de yema, lecitina de soja o esfingomielina) y fosfolípidos sintéticos (por ejemplo, dipalmitoilfosfatidilcolina o lecitina hidrogenada), y un ejemplo preferido de los mismos es lecitina. Más preferentemente, la lecitina es lecitina insaturada o lecitina saturada de origen natural extraída de soja o yema de huevo. En general, la lecitina de origen natural comprende un 23-95 % de fosfatidilcolinas y un 20 % o más de fosfatidiletanolaminas.
Los ácidos grasos usados en la preparación de liposomas son ácidos grasos superiores, y los ejemplos preferidos de los mismos comprenden ácidos grasos saturados o insaturados de cadenas de alquilo C12-22, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico y ácido linoleico. En general, el agua utilizada en la preparación de liposomas es agua destilada desionizada.
Los liposomas se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica, pero de la manera más preferente, puede prepararse aplicando una mezcla que comprende los ingredientes a un homogeneizador de alta presión.
Los sistemas de liposomas así preparados tienen la ventaja de que los sistemas pueden maximizar el suministro de fármacos al disolver diversos materiales poco solubles y estabilizar materiales inestables.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede preparar en una preparación de liberación sostenida para mantener continuamente un nivel sanguíneo eficaz del ingrediente eficaz, reduciendo así el número de veces que se toman los medicamentos para mejorar el cumplimiento del tratamiento con el fármaco.
Las preparaciones de liberación sostenida se formulan para que comprendan un transportador de liberación sostenida y otros adyuvantes además del principio activo descrito en el presente documento. El transportador de liberación sostenida puede comprender varios transportadores de liberación sostenida conocidos en la técnica, y preferentemente óxido de polietileno.
De manera adicional, la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender, como el otro adyuvante, un transportador diluyente que se encuentra comúnmente en el campo farmacéutico. Los ejemplos del transportador diluyente utilizado para este fin incluyen lactosa, dextrina, almidón, celulosa microcristalina, hidrogenofosfato de calcio, carbonato de calcio, azúcar y dióxido de silicio. De manera adicional, la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender un deslizante para mejorar la fluidez, tales como estearato de zinc o estearato de magnesio, y el otro adyuvante que pueda utilizarse en el campo farmacéutico.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede usar sola, pero puede comprender además principios activos típicos que se utilizan para enfermedades neurológicas, enfermedad vascular, envejecimiento y pérdida de masa muscular, que se han mencionado en la presente técnica, y en estos casos, la composición farmacéutica se puede utilizar como una composición más eficaz por efectos sinérgicos.
La composición descrita en el presente documento se puede preparar en forma de composición cosmética. La composición cosmética descrita en el presente documento puede formularse en cualquier forma farmacéutica que se prepare de manera convencional, y los ejemplos de la misma pueden comprender soluciones, suspensiones, emulsiones, pastas, geles, cremas, lociones, polvos, jabones, limpiadores que contienen tensioactivos, aceites, bases en polvo, bases en emulsión, bases de cera y pulverizaciones, pero sin limitarse a los mismos. Más específicamente, la composición cosmética puede prepararse en la forma farmacéutica de loción emoliente, loción nutritiva, crema nutritiva, crema para masaje, una esencia, crema para los ojos, crema limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, compresa, pulverización o polvo.
Se puede utilizar aceite animal, aceite vegetal, cera, parafina, almidón, goma tragacanto, un derivado de celulosa, polietilenglicol, silicona, bentonita, sílice, talco u óxido de zinc como ingrediente transportador en los casos en que la forma farmacéutica sea una pasta, crema, loción o gel.
Se puede utilizar lactosa, talco, sílice, hidróxido de aluminio, silicato de calcio o un polvo de poliamida como ingrediente transportador en los casos en que la forma farmacéutica descrita en el presente documento es un polvo o pulverización. Especialmente, en los casos en que la forma farmacéutica sea una pulverización, la pulverización puede comprender además un propulsor, tal como clorofluorohidrocarburo, propano/butano o dimetiléter.
Se puede utilizar un disolvente, un solubilizante o un emulsionante como componente transportador en los casos en que la forma farmacéutica descrita en el presente documento es una solución o emulsión, y los ejemplos de los mismos comprenden agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, aceite de 1,3-butilglicol, éster alifático de glicerol, polietilenglicol y éster de ácidos grasos de sorbitán.
Se puede utilizar un diluyente líquido (tal como agua, etanol o propilenglicol), un agente de suspensión (tal como alcohol isoestearílico etoxilado, éster de polioxietilensorbitol o éster de polioxietilén sorbitán), celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar o tragacanto como ingrediente transportador en los casos en que la forma farmacéutica descrita en el presente documento es una suspensión.
Se pueden utilizar sulfato de alcohol alifático, éter sulfato de alcohol alifático, monoéster de sulfosuccinato, isetionato, derivados de imidazolio, taurato de metilo, sarcosinato, éter sulfato de amida de ácidos grasos, alquil amido betaína, alcohol alifático, glicérido de ácidos grasos, dietanolamida de ácidos grasos, aceite vegetal, derivados de lanolina o éster de ácido graso de glicerol etoxilado como ingrediente transportador en los casos en los que la forma farmacéutica descrita en el presente documento es un limpiador que contiene tensioactivos.
Los ingredientes que se encuentran en la composición cosmética descrita en el presente documento comprenden ingredientes que normalmente se usan en la composición cosmética, además del principio activo y los ingredientes transportadores, y por ejemplo, puede comprender adyuvantes comunes, tales como antioxidantes, estabilizantes, solubilizantes, vitaminas, pigmentos y agentes aromatizantes.
En los casos en que la composición descrita en el presente documento se prepara en una composición alimenticia (o composición nutracéutica), la composición alimentaria comprende el compuesto de fórmula general I como principio activo e ingredientes que normalmente se añaden en el momento de la fabricación del alimento, y los ejemplos de los mismos pueden comprender proteínas, carbohidratos, grasas, nutrientes, condimentos y agentes aromatizantes. Los ejemplos del carbohidrato comprenden monosacáridos, por ejemplo, glucosa, fructosa, etc.; disacáridos, por ejemplo, maltosa, sacarosa, oligosacárido, etc.; y polisacáridos, tales como azúcares (por ejemplo, dextrina, ciclodextrina, etc.) y alcoholes de azúcar (por ejemplo, xilitol, sorbitol, eritritol, etc.). Los ejemplos del agente aromatizante pueden comprender agentes aromatizantes naturales (taumatina y extracto de stevia (p. ej., rebaudiósido A, glicirricina, etc.) y agentes aromatizantes sintéticos (sacarina, aspartamo, etc.).
Por ejemplo, cuando la composición alimenticia descrita en el presente documento se prepara en una bebida, la composición alimenticia puede comprender adicionalmente, además del compuesto de fórmula general I, ácido cítrico, fructosa licuada, azúcar, glucosa, ácido acético, ácido málico, zumo de frutas, un extracto de Eucommia ulmoides, un extracto de jujube y un extracto de regaliz.
La composición descrita en el presente documento se puede incorporar en un sistema de suministro citológico, cosmético o farmacéutico o en un sistema de liberación sostenida seleccionado del grupo que consiste en liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, medios lipídicos nanoestructurados, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas de tensioactivo-fosfolípido, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas y nanopartículas lipídicas sólidas.
Las nanocápsulas descritas en el presente documento pueden comprender microemulsiones.
La composición descrita en el presente documento puede ser para aplicación tópica, oral o parenteral. Específicamente, por ejemplo, la administración tópica comprende la administración dérmica.
La aplicación tópica, específicamente, por ejemplo, la administración dérmica puede realizarse por iontoforesis, ultrasonoforesis, electroporación, presión mecánica, gradiente de presión osmótica, cura oclusiva, microinyección, inyección sin aguja por presión, uso de microelectroparches, uso de mascarillas, o cualquier combinación de los mismos, pero sin limitación a los mismos.
La composición descrita en el presente documento puede aumentar la expresión de PGC-1a.
Según la presente invención, la composición de la presente invención es para su uso en la reducción del volumen del tejido adiposo o en la reducción del contenido de triglicéridos en el tejido adiposo.
Más específicamente, por ejemplo, el tejido adiposo es tejido adiposo subcutáneo.
En una realización de la presente invención, el tejido adiposo subcutáneo es el tejido adiposo subcutáneo de la región femoral, el pecho, una parte inferior del cuello, el escote, las nalgas, la cara, los labios, las mejillas, los párpados y/o las manos.
En otra realización más de la presente invención, el tejido adiposo es cualquier tejido adiposo que se pueda formar en el cuerpo, incluyendo tejido adiposo formado por embolia grasa.
Una composición citológica, cosmética o farmacéutica puede comprender una cantidad citológica, cosmética o farmacéuticamente eficaz de al menos un compuesto de fórmula general I o sal aceptable según otros aspectos descritos en el presente documento, y al menos un excipiente o adyuvante citológica, cosmética o farmacéuticamente aceptable.
El compuesto de fórmula general I, una mezcla del mismo y/o una sal citológica, cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo puede confirmarse en un estado de adsorción en un polímero orgánico sólido o soporte mineral sólido citológica, cosmética o farmacéuticamente aceptable, que está formado por talco, bentonita, sílice, almidón y maltodextrina.
La composición descrita en el presente documento se puede proporcionar en una forma farmacéutica seleccionada del grupo que consiste en cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, sueros, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barritas, lápices, pulverizaciones, aerosoles, cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, cápsulas duras, comprimidos, comprimidos recubiertos con azúcar, gránulos, goma de mascar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires, películas de polisacáridos, jaleas y gelatinas.
La composición descrita en el presente documento se puede confirmar en un estado de incorporación en un producto seleccionado del grupo que consiste en correctores de ojeras, bases de maquillaje, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, sombras de ojos, barras de labios, brillos de labios, protectores labiales y polvos.
El compuesto de fórmula general I, una mezcla del mismo y/o una sal citológica, cosmética o farmacéuticamente aceptable del mismo puede pueden incorporarse a los materiales textiles, material textil no tejidos o aparatos médicos.
Los materiales textiles, materiales textiles no tejidos o los aparatos médicos descritos en el presente documento pueden seleccionarse del grupo que consiste en vendajes, gasas, camisetas, medias, calcetines, ropa interior, fajas, guantes, pañales, compresas higiénicas, apósitos, cobertores, toallitas húmedas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microeléctricos y mascarillas.
La composición descrita en el presente documento puede comprender además un cantidad citológica, cosmética o farmacéuticamente eficaz de al menos un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en otros reguladores de PGC-1a, otros reguladores de PPARy, preparaciones para reducir los triglicéridos de los adipocitos, preparaciones para retrasar la diferenciación de adipocitos, agentes lipolíticos o estimulantes de la lipólisis, agentes anticelulíticos, agentes adipogenéticos, inhibidores de la agrupación de receptores de acetilcolina, inhibidores de la contracción muscular, agentes anticolinérgicos, inhibidores de la elastasa, inhibidores de metaloproteinasas de la matriz, estimulantes o inhibidores de la síntesis de melanina o agentes despigmentantes, agentes propigmentantes, agentes autobronceadores, agentes antienvejecimiento, inhibidores de la NO sintasa, inhibidores de la 5a-reductasa, inhibidores, inhibidores de lisil hidroxilasa y/o prolil hidroxilasa, agentes antioxidantes, depuradores de radicales libres y/o agentes anticontaminantes atmosféricos, depuradores de especies reactivas de carbonilo, agentes antiglucación, agentes antihistamínicos, agentes antivirales, agentes antiparasitarios, emulsionantes, emolientes, disolventes orgánicos, propulsores líquidos, acondicionadores de piel, agentes humectantes, sustancias que retienen la humedad, a-hidroxiácidos y p-hidroxiácidos, agentes hidratantes, hidrolasas dérmicas, vitaminas, aminoácidos, proteínas, pigmentos o colorantes, tintes, biopolímeros, polímeros gelificantes, agentes que aumentan la viscosidad, tensioactivos, agentes suavizantes, aglutinantes, conservantes, agentes antiarrugas, agentes capaces de reducir o tratar las bolsas debajo de los ojos, agentes exfoliantes, agentes descamantes, agentes queratolíticos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes fungistáticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostáticos, dérmicos o estimulantes, estimulantes de la síntesis de elastina, estimulantes de la síntesis de decorina, estimulantes de la síntesis de laminina, estimulantes de defensina, estimulantes de chaperonas, estimulantes de la síntesis de cAMP, proteínas de choque térmico, estimulantes de la síntesis de HSP70, estimulantes de la síntesis de proteínas de choque térmico, estimulantes de la síntesis de acuaporina, estimulantes de la síntesis de ácido hialurónico, estimulantes de la síntesis de fibronectina, estimulantes de la síntesis de sirtuina, agentes que estimulan la síntesis de componentes y lípidos del estrato córneo, ceramidas, ácidos grasos, inhibidores de la degradación del colágeno, inhibidores de la degradación de elastina, inhibidores de serina proteasa, estimulantes de la proliferación de fibroblastos, estimulantes de la proliferación de queratinocitos, estimulantes de la proliferación de melanocitos, estimulantes de la diferenciación de queratinocitos, inhibidores de acetilcolinesterasa, relajantes de la piel, estimulantes de la síntesis de glucosaminoglucanos, inhibidores de la hiperqueratosis, agentes comedolíticos, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, estabilizantes, agentes antipruriginosos, agentes para el tratamiento y/o cuidado de pieles sensibles, agentes reafirmantes, agentes redensificantes, agentes de reestructuración, agentes antiestrías, reguladores de la producción de sebo, agentes antisudoríficos, estimulantes de la cicatrización, agentes coadyuvantes de la cicatrización, estimulantes de reepitelización, agentes coadyuvantes de la reepitelialización, factores de crecimiento de citocinas, agentes sedantes, agentes antiinflamatorios, agentes anestésicos, agentes que actúan sobre la circulación capilar y/o la microcirculación, inhibidores de la permeabilidad vascular, agentes venotónicos, agentes que actúan sobre metabolismo celular, agentes para mejorar la unión dermoepidérmica, inductores o retardantes del crecimiento del cabello, agentes saborizantes, agentes quelantes, extractos vegetales, aceites esenciales, extractos marinos, agentes obtenidos de procesos de fermentación biológica, sales minerales, extractos celulares, filtros solares, y agentes fotoprotectores orgánicos o minerales con actividad frente a UV A y/o B, y mezclas de los mismos.
El adyuvante descrito en el presente documento puede proceder de origen de síntesis, extractos vegetales, procesos de fermentación biológica, o una combinación de procesos de síntesis o biotecnológicos.
El adyuvante descrito en el presente documento puede seleccionarse del grupo que consiste en agentes para aumentar o disminuir el contenido de triglicéridos en el tejido adiposo, agentes para aumentar o retrasar la diferenciación de adipocitos, agentes lipolíticos y/o agentes venotónicos.
Los agentes para aumentar o disminuir el contenido de triglicéridos en el tejido adiposo, agentes para retrasar la diferenciación de adipocitos, agentes anticelulíticos, agentes lipolíticos y/o agentes venotónicos descritos en el presente documento pueden seleccionarse del grupo que consiste en forskolina, cafeína, escina, carnitina, coenzima A, lipasa, glaucina, esculina, visnadina, sarsasapogenina, extractos de Coffea Arabica, extractos de Coleus forskohlii, extractos de Anemarrhena apshodeloides, y una mezcla de agua, glicerina, lecitina, cafeína, extractos de escoba de carnicero (Ruscus Aculeatus), maltodextrina, sílice, hidroyoduro de trietanolamina, propilenglicol, extractos de hiedra (Hedera helix), carnitina, escina, tripéptido-1, goma xantana, carragenina (Chondrus crispus) y EDTA disódico.
El adyuvante descrito en el presente documento se puede seleccionar del grupo que consiste en agentes reafirmantes, agentes redensificantes y agentes reestructurantes.
Los agentes reafirmantes, agentes redensificantes y agentes reestructurantes descritos en el presente documento pueden seleccionarse del grupo que consiste en extractos fermentados de Pseudoalteromonas, tripéptido-10 citrulina, acetilarginiltriptofil difenilglicina, hexapéptido-10 y una mezcla de extractos de fermentación de Pseudoalteromonas, proteínas de trigo hidrolizadas, proteínas de soja hidrolizadas, tripéptido-10 citrulina y tripéptido-1.
El adyuvante descrito en el presente documento puede seleccionarse entre agentes antiestrías. Más específicamente, por ejemplo, los agentes antiestrías descritos en el presente documento se seleccionan del grupo que consiste en extractos de Centella asiatica, extractos de Rosa canina, extractos de Rosa moschata, extractos de Rosa rubiginosa, y una mezcla de agua, glucósido caprilílico/caprílico, lecitina, glicerina, extracto de fermento de Pseudoalteromonas, acetil tripéptid0-30 citrulina, pentapéptido-18, goma xantana y caprilil glicol.
El adyuvante descrito en el presente documento puede seleccionarse entre agentes antiarrugas o agentes antienvejecimiento.
Los agentes antiarrugas o antienvejecimiento descritos en el presente documento pueden seleccionarse del grupo que consiste en: acetil heptapéptido-8; acetil heptapéptido-4; acetil octapéptido-3; pentapéptido-18; acetil hexapéptid0-30; una mezcla de proteínas de trigo hidrolizadas, proteínas de soja hidrolizadas y tripéptido-1 ; una mezcla de diaminopropionil tripéptido-33, tripéptido-10 citrulina, extracto de fermentación de Pseudoalteromonas, proteínas de trigo hidrolizadas, proteínas de soja hidrolizadas y tripéptido-10 citrulina y tripéptido-1 ; una mezcla de acetil tetrapéptido-5, acetil tripéptid0-30 citrulina, acetilarginiltrifenildifenilglicina, acetil tetrapéptido-22, dimetilmetoxi cromanol, palmitato de dimetilmetoxicromanilo, extracto de fermentación de Pseudoalteromonas, clorhidrato de lisina, lecitina y tripéptido-9 citrulina; y una mezcla de clorhidrato de lisina, lecitina y tripéptido 10 citrulina.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1a, 1b y 1c muestran los cambios en la expresión génica en órganos (figura 1a), músculos esqueléticos (figura 1b) y grasa abdominal (figura 1c) por el tratamiento con 6'-sialilactosa (SL) en modelos de ratones normales. Las figuras 1d, 1e y 1f muestran los cambios en la expresión génica en órganos (figura 1d), músculos esqueléticos (figura 1e) y grasa abdominal (figura 1f) por el tratamiento con 3'-SL en modelos de ratones normales.
Las figuras 2a y 2b muestran los valores numéricos (figura 2a) y transferencias Western (figura 2b) de los cambios en la expresión de la proteína PGC-1a en el cerebro y el hipocampo.
La figura 3 muestra los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones con SL (3'-SL y 6'-SL) en células nerviosas.
La figura 4 muestra los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones con SL (3'-SL y 6'-SL) en células musculares inmaduras C2C12.
Las figuras 5a y 5b muestran los valores numéricos de (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer))/nivel de expresión génica del grupo de control), (nivel de expresión génica del grupo (modelo la enfermedad de Alzheimer 3'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) y (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) en los órganos correspondientes con respecto a los cambios en la expresión génica relativa en el cerebro y el hipocampo en comparación con el grupo de control.
La figura 6 muestra el valor numérico del tiempo de elusión en la prueba de capacidad cognitiva cuando un grupo de control, un grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer), un grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 3'-SL) y un grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL) se sometieron a la prueba de capacidad cognitiva (laberinto acuático de Morris) durante 7 días.
Las figuras 7a y 7b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad de Parkinson.
La figura 8 muestra los resultados de la prueba de comportamiento en modelos animales de la enfermedad de Parkinson.
Las figuras 9a y 9b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL en modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión.
Las figuras 10a y 10b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad de Huntington.
La figura 11 muestra los resultados de la prueba de recorrido en el cilindro giratorio en modelos de enfermedad de Huntington.
La figura 12 muestra los resultados de la observación del volumen isquémico en modelos isquémicos.
La figura 13 muestra los cambios en la puntuación de la prueba MLPT por tratamiento con SL (3'-SL y 6'-SL) después de la inducción de ISQ.
La figura 14 muestra los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL en modelos de ratón.
La figura 15 muestra los efectos de reducción de grasa subcutánea cuando las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se administraron por vía tópica en modelos de ratón.
Las figuras 16a y 16b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos estimulantes del envejecimiento.
Las figuras 17a y 17b muestran los resultados de la medición de H2O2 intercelular (valores de ROS) (figura 17a) y los resultados de medición de la producción de superóxido mitocondrial (figura 17b).
Las figuras 18a y 18b muestran los resultados de la medición de la actividad telomerasa mediante la administración de composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL).
Las figuras 19a y 19b muestran los resultados de la medición de H2O2 intercelular (valores de ROS) (figura 19a) y los resultados de medición de la producción de superóxido mitocondrial (figura 19b).
Las figuras 20a y 20b muestran los resultados del análisis de la actividad telomerasa por el tratamiento de modelos de arteriosclerosis (ApoE^; figura 20a) y MASM (figura 20b) con SL (3'-SL y 6'-SL).
Las figuras 21a y 21b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de prueba cutánea.
Las figuras 22a y 22b muestran los cambios en la grasa intercelular cuando se administraron 6'-sialilactosa (figura 22a) y 3'-sialilactosa (figura 22b) en adipocitos diferenciados.
Las figuras 23a y 23b muestran las imágenes de microscopía óptica de células, que muestran los cambios en la grasa intercelular cuando se administraron 6'-sialilactosa (figura 23a) y 3'-sialilactosa (figura 23b) en adipocitos diferenciados. La figura 24 muestra el efecto de la 6'-sialilactosa sobre la viabilidad celular en adipocitos diferenciados.
La figura 25 muestra los cambios en la secreción de glicerol por sialilactosa en adipocitos diferenciados.
Las figuras 26a y 26b muestran los cambios en la piel de ratones con una dieta rica en grasas mediante inyección subcutánea de sialilactosa.
Modo para realizar la invención
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención de manera más específica, y será evidente para los expertos en la materia que el alcance de la presente invención no está limitado por estos ejemplos.
Ejemplo 1: Evaluación de la estimulación de la expresión génica mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de ratones normales
Para investigar los cambios en la expresión génica relativa por órganos en comparación con antes de la administración de SL (3'-SL y 6'-SL), se adquirieron ratones C57BL/6 de 4 semanas de edad de Dooyeul Biotech (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante dos semanas. A las 6 semanas de edad, los ratones (peso corporal inicial, promedio 21.4 ± 1.1 g) se dividieron aleatoriamente en tres grupos (compuestos por ocho ratones para cada grupo) a continuación, y las dietas se mantuvieron durante 10 semanas (un total de 24 animales):
- Grupo de control: grupo de ratones con dieta normal
- Grupo con administración de 3'-SL: administración separada con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal
- Grupo con administración de 6'-SL: administración separada con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal
Se administró por vía oral diariamente sialilactosa o agua desionizada. Los ratones se mantuvieron en salas de animales durante 10 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por la administración de las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en ocho órganos principales (corazón, hipocampo, cerebro, médula espinal, pulmón, hígado, bazo y riñón, en tres músculos esqueléticos (músculo sóleo, músculo cuádriceps femoral y músculo gastrocnemio) y en grasa abdominal. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado, y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 1.
En la figura. 1, los cambios en la expresión génica relativa por órganos en comparación con antes de la administración de SL (3'-SL y 6'-SL) se expresaron mediante valores de (niveles de expresión génica de los grupos con administración de SL)/(nivel de expresión génica del grupo de control). En cuanto a 6'-SL, como puede observarse en la mayoría de los órganos (figura 1 a), músculos esqueléticos (figura 1 b) y grasa abdominal (figura 1 c), los grupos con administración de 6'-SL fueron más altos que el grupo de control negativo en vista de la niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra y UCP1) incluyendo PGC-1a en varias partes del cuerpo. Es decir, se pudo confirmar que 6'-SL estimuló la expresión de PGC-1a y genes relacionados en varios órganos, músculos y grasa de ratones normales. En cuanto a 3'-SL, como puede observarse en la mayoría de los órganos (figura 1d), músculos esqueléticos (figura 1e) y grasa abdominal (figura 1f), los grupos con administración de 3'-SL fueron más altos que el grupo de control negativo en vista de la niveles de expresión de varias dianas de análisis en varias partes del cuerpo, pero fueron menos eficaces que los grupos con administración de 6'-SL.
Las figuras 1a, 1b y 1c muestran los cambios en la expresión génica en órganos (figura 1a), músculos esqueléticos (figura 1b) y grasa abdominal (figura 1c) por el tratamiento con 6'-SL en modelos de ratones normales. Las figuras 1d, 1e y 1 f muestran los cambios en la expresión génica en órganos (figura 1 d), músculos esqueléticos (figura 1e) y grasa abdominal (figura 1f) por el tratamiento con 3'-SL en modelos de ratones normales. En las figura 1a a 1f, los ejes verticales representan la relación de expresión génica relativa en comparación con el grupo de control.
Ejemplo 2: Evaluación de la estimulación de la expresión de la proteína PGC-1a por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en el cerebro y el hipocampo de modelos de ratón mayores
Para investigar la expresión relativa de proteínas en el cerebro en comparación con antes de la administración de SL (3'-SL y 6'-SL), se adquirieron ratones iCr de 4 semanas de edad de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante dos semanas. A las 6 semanas de edad, los ratones (peso corporal inicial, promedio 20,3 ± 1,5 g) se dividieron aleatoriamente en tres grupos (compuestos por ocho ratones para cada grupo) a continuación, y las dietas se mantuvieron durante 42 semanas (un total de 24 animales).
- Grupo de control: grupo de ratones con dieta normal
- Grupo con administración de 3'-SL: Tratamiento con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal
- Grupo con administración de 6'-SL: Tratamiento con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal
La sialilactosa o AD se administró por vía oral diariamente. Los ratones se mantuvieron en salas de animales durante 42 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
La figura 2 muestra valores numéricos (figura 2a) y transferencias Western (figura 2b) de cambios en la expresión de la proteína PGC-1a en el cerebro y el hipocampo. En la figura 2b, BB1 6' representa 6'-SL. Se cuantificó el "nivel de expresión de la proteína PGC-1a" y el "nivel de expresión de la proteína GAPDH" en cada lugar, y la relación relativa de los valores, nivel de expresión de la proteína PGC-1a)/(nivel de expresión de la proteína GAPDH) se expresó numéricamente para el grupo de control, grupo con administración de 3'-SL y grupo con administración de 6'-SL. El nivel de expresión de PGC-1a fue mucho mayor en el grupo de administración de 6'-SL que en el grupo de control negativo tanto en el cerebro como en el hipocampo. Es decir, se pudo confirmar que 6'-SL estimuló la expresión de la proteína PGC-1a en varios lugares del cerebro de ratones normales.
La figura 2 muestra los cambios en la expresión de la proteína PGC-1a en el cerebro y el hipocampo por la administración de composiciones de SL en modelos de ratones envejecidos. Los ratones ICR macho de 6 semanas de edad se agruparon en el grupo de control y el grupo con administración de 6'-SL (8 animales por grupo), sometiéndoles a continuación a una prueba de control de la dieta durante 42 semanas. Los ratones se sacrificaron y luego se extrajeron el cerebro y el hipocampo. La corteza cerebral se extrajo del cerebro. Los cambios en la expresión de la proteína PGC-1a en el cerebro y el hipocampo extraídos se expresaron mediante valores numéricos (figura 2a) y transferencias Western (figura 2b).
Ejemplo 3: Evaluación de la estimulación de la expresión génica mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en una prueba con células nerviosas
Para investigar si SL (3'-SL y 6'-SL) también tiene el efecto de estimular la expresión del gen PGC-1a y genes relacionados en las células nerviosas, se realizó la siguiente prueba.
Se cultivaron neuroblastos (Neuro-2a, American Type Culture Collection, EE. UU.) en DMEM complementado con suero fetal bovino al 10 %, 100U de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina en cada pocillo de placas de 6 pocillos a 37 °C en condiciones atmosféricas CO2 al 5 %/95 %. Las células Neuro-2a corresponden a la línea celular de neuroblastoma de ratón de rápido crecimiento. Después de sembrar células Neuro-2a a una densidad de 6000 células por pocillo, se añadió SL a una concentración de 0,1 mg/ml en los pocillos mostrando una confluencia de aproximadamente 5x106 células/ml, seguido de incubación durante 24 horas en las mismas condiciones. Los materiales de SL (3'-SL o 6'-SL) eran los mismos que los descritos en el ejemplo 1. A menos que se indique lo contrario, SL (3'-SL o 6'-SL) y sus concentraciones de uso se entienden iguales a las descritas en el ejemplo 1. El grupo de control negativo se trató con solución salina fisiológica al 1/1000 del volumen del medio. Las células tratadas con cada muestra se incubaron a 37 °C durante 24 horas, luego se lavaron dos veces con solución salina fría y se extrajo el ARN con el agente TRIzol (Invitrogen). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 3.
La figura 3 muestra los cambios en la expresión génica por el tratamiento con una composición de SL (3'-SL y 6'-SL) en células nerviosas. Como se muestra en la figura 3, como resultado de la comparación de los grupos con administración, en los que las células Neuro-2a se trataron con SL (3'-SL y 6'-SL) durante 24 horas, y el grupo de control sin el tratamiento, los grupos con administración de SL (3'-SL y '-SL) mostraron aumentos significativos en los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) incluyendo PGC-1a, en comparación con el grupo de control negativo. Se pudo confirmar que 6'-SL estimuló la expresión de PGC-1a y genes relacionados en las células nerviosas, y el efecto de la estimulación de 3'-SL fue menor que el de 6'-SL.
Ejemplo 4: Evaluación de la estimulación de la expresión génica mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en una prueba con células musculares
Para investigar si SL realmente tiene un efecto de estimulación de la expresión del gen PGC-1a en células musculares, se realizó la siguiente prueba.
Se prepararon células musculares inmaduras C2C12 a partir de la adquisición de la American Tissue Culture Collection (ATCC, EE. UU.). Se cultivaron células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Gibco, EE. UU.) complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, EE. UU.) en una estufa de incubación con CO2 al 5 % a 37 °C hasta que las células crecieran hasta una confluencia del 70 %, mientras que el medio se cambió cada dos días. La diferenciación en células musculares se indujo cultivando en un medio que contenía suero de caballo al 2 % (HS, Gibco, EE. UU.). Las células musculares cultivadas en el medio que contenía HS al 2 % durante 4 días se trataron con SL con varias concentraciones. El grupo de control negativo se trató con solución salina fisiológica al 1/1000 del volumen del medio. Las células tratadas con cada muestra se incubaron a 37 °C durante 24 horas, luego se lavaron dos veces con solución salina fría y se extrajo el ARN utilizando agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando 1 μg/μl de ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.).
Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 4.
La figura 4 muestra los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones con SL (3'-SL y 6'-SL) en células musculares inmaduras C2C12. Como se muestra en la figura 4, como resultado de la comparación de los grupos con administración, en los que las células musculares C2C12 inmaduras se trataron con SL (3'-SL y 6'-SL) durante 24 horas, y el grupo de control sin el tratamiento, los grupos con administración de SL (3'-SL y 6'-SL) mostraron aumentos significativos en los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) incluyendo PGC-1a, en comparación con el grupo de control negativo. Se pudo confirmar que 6'-SL estimuló la expresión de PGC-1a y genes relacionados en las células musculares C2C12 inmaduras, y el efecto de la estimulación de 3'-SL fue menor que el de 6'-SL.
Ejemplo 5: Evaluaciones de la estimulación de la expresión génica y la mejora de la capacidad cognitiva por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de Alzheimer
Para investigar los cambios en la expresión génica y la capacidad cognitiva por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de Alzheimer, se adquirieron ratones de 6 semanas de edad de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante dos semanas. A las 8 semanas de edad, los ratones se dividieron en tres grupos (compuestos por ocho ratones por cada grupo): Se utilizaron ocho ratones c57/BL6 macho de 8 semanas de edad (ratones normales; peso corporal inicial promedio 35,6 ± 3,3 g) tratados con una dieta normal para un grupo de control. Los ratones macho modelo de enfermedad de Alzheimer de 8 semanas de edad (3xTg; peso corporal inicial, promedio de 33,9 ± 2,8 g) se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (ocho ratones por grupo) a continuación, y estas dietas se mantuvieron durante 10 semanas (32 animales en total):
- Grupo de control: ratones normales alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer): modelos de enfermedad de Alzheimer alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 3'-SL): modelos de enfermedad de Alzheimer a los que se administra por separado 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL): modelos de enfermedad de Alzheimer a los que se administra por separado 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal (8 animales) La sialilactosa o el AD se administraron por vía oral diariamente. Los ratones se mantuvieron en salas de animales durante 10 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^3)-p-D-Gal-(1^-4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en dos órganos principales (cerebro e hipocampo) asociados con enfermedades cerebrales. La corteza cerebral se utilizó para el cerebro. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GpX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 5.
La figura 5 muestra los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad de Alzheimer. La figura 5 muestra los valores numéricos de (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer))/nivel de expresión génica del grupo de control), (nivel de expresión génica del grupo (modelo la enfermedad de Alzheimer 3'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) y (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) en los órganos correspondientes con respecto a los cambios en la expresión génica relativa en el cerebro y el hipocampo en comparación con el grupo de control. Los ratones macho modelo de enfermedad de Alzheimer (3xTg) de 8 semanas de edad se agruparon en grupos con administración de SL y un grupo sin administración de SL (8 animales por grupo), y luego se sometieron a una prueba de control de la dieta durante 10 semanas, y los niveles de expresión génica en los grupos de prueba se compararon con los de los ratones normales (c57/BL6) con una dieta normal. Como se muestra en la figura 5, basándose en el grupo de control de ratones normales con una dieta normal, los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) que incluyen PGC-1a en el cerebro (figura 5a) y el hipocampo (figura 5b) fueron algo inferiores en el grupo con administración de 6'-SL (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL) en comparación con el grupo de control normal, pero fueron muy altos en el grupo de administración con 6'-SL (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL) en comparación con el grupo sin administración de SL (modelo de enfermedad de Alzheimer). Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica relacionados. Es decir, 6'-SL mostró aumentos significativos en los niveles de expresión de PGC-1a y genes relacionados (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) en el cerebro y el hipocampo de ratones modelo de enfermedad de Alzheimer.
La figura 6 muestra los valores numéricos del tiempo de elusión en la prueba de capacidad cognitiva cuando un grupo de control, un grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer), un grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 3'-SL) y un grupo (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL) se sometieron a la prueba de capacidad cognitiva (laberinto acuático de Morris) durante 7 días. Se pudo observar que el tiempo de elusión en la prueba de capacidad cognitiva fue casi constante sin mejoría incluso después del lapso del tiempo de prueba en el grupo sin administración de SL (modelo de enfermedad de Alzheimer), pero el tiempo de elusión en la prueba en el grupo de administración de 6'-SL (modelo de enfermedad de Alzheimer 6'-SL) fue definitivamente rápido, pero disminuyó algo en comparación con el grupo de control de ratones normales con una dieta normal. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de mejora de la capacidad cognitiva. Es decir, se pudo confirmar que 6'-SL mejoró la capacidad cognitiva mejor en ratones modelo con enfermedad de Alzheimer.
Ejemplo 6: Evaluaciones de la estimulación de la expresión génica y la mejora del comportamiento por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de Parkinson
Para investigar los cambios en la expresión génica y la mejora del comportamiento por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de Parkinson, se adquirieron ratas SD normales de 13 semanas de edad y modelos con enfermedad cerebral de Parkinson de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante una semana. A las 14 semanas de edad, las ratas SD se dividieron en cuatro grupos (compuestos por 8 animales por grupo): Se utilizaron ocho ratas SD macho de 14 semanas de edad (ratas normales; peso corporal inicial promedio 355,6 ± 32,3g) tratadas con una dieta normal para un grupo de control. Los modelos de enfermedad de Parkinson en ratas SD inducidas por 6-OHDA, a las que se administró 6-hidroxidopamina (6-OHDA) a las 8 semanas de edad y se les suministró a las 13 semanas de edad, se dividieron al azar en tres grupos de tratamiento dietético diferentes a continuación (8 animales por grupo), y estas dietas se mantuvieron desde las 14 semanas de edad durante 10 semanas (total 32 animales):
- Grupo de control: ratas normales alimentadas con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Parkinson): modelos de enfermedad de Parkinson alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Parkinson 3'-SL): modelos de enfermedad de Parkinson tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de rata por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Parkinson 6'-SL): modelos de enfermedad de Parkinson tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de rata por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
La sialilactosa o AD se administró por vía oral diariamente. Las ratas se mantuvieron en salas de animales durante 10 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en dos órganos principales (cerebro e hipocampo) asociados con enfermedades cerebrales. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en las figuras 7a y 7b.
Las figuras 7a y 7b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad de Parkinson. Los modelos de enfermedad de Parkinson en ratas SD inducidas por 6-OHDA, a las que se administró 6-OHDA a las 8 semanas de edad y se suministraron a las 13 semanas de edad, se agruparon en grupos con administración de SL (3'-SL y 6'-SL) y un grupo sin administración de SL (8 animales por grupo), y luego se sometieron a una prueba de control de la dieta durante 8 semanas, y los niveles de expresión génica de los grupos de prueba se compararon con los del grupo de control en el que se alimentaron ratas SD macho (normales) de 13 semanas de edad con una dieta normal. Las figuras 7a y 7b muestran los valores numéricos de (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Parkinson))/nivel de expresión génica del grupo de control), (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Parkinson 3'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) y (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Parkinson 6'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) en los órganos correspondientes con respecto a los cambios de expresión génica en el cerebro y el hipocampo en comparación con las ratas normales. Como resultado, como se muestra en las figura 7a y 7b, basándose en el grupo de control de ratas normales con una dieta normal, los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) que incluyen PGC-1a en el cerebro (figura 7a) y el hipocampo (figura 7b) fueron algo inferiores en el grupo con administración de 6'-SL (modelo de enfermedad de Parkinson 6'-SL) en comparación con el grupo de control normal, pero fueron muy altos en el grupo con administración de 6'-SL en comparación con el grupo sin administración de SL (modelo de enfermedad de Parkinson). Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica. Es decir, 6'-SL mostró aumentos significativos en los niveles de expresión de PGC-1a y genes relacionados en el cerebro y el hipocampo de ratas modelo con enfermedad de Parkinson.
La figura 8 muestra los resultados de la prueba de comportamiento en modelos de enfermedad de Parkinson. En la figura. 8, el eje vertical representa el tiempo de giro en esquina y el tiempo de descenso como resultado de la realización de pruebas de capacidad de comportamiento (giro en esquina y descenso) utilizando un dispositivo de rejilla vertical en un grupo de control, grupo (modelo de enfermedad de Parkinson), grupo (modelo de enfermedad de Parkinson 3'-SL), y grupo (modelo de enfermedad de Parkinson 6'-SL). El dispositivo de rejilla vertical tenía la forma de una caja abierta de 5 cm X 55 cm X 8 cm, y la cara frontal estaba formada por un cableado de 0,8 cm X 0,8 cm y las otras superficies estaban formadas por plexiglás negro. El fondo se hizo 5 cm más largo por seguridad. En la prueba, los ratones se colocaron en dirección hacia arriba a una distancia de 3 cm de la parte superior del dispositivo y se les permitió aclimatarse al dispositivo tres veces durante dos días antes de la prueba. El procedimiento anterior se repitió si la rata no podía bajar en 60 segundos. El tiempo de giro en esquina es el tiempo que tarda una rata que mira hacia arriba en girar hacia abajo, y el tiempo de descenso es el tiempo obtenido al restar el tiempo de giro en esquina del tiempo total de la prueba durante el cual la rata gira en la esquina y desciende hasta el fondo.
Como se muestra en la figura 8, el tiempo de giro en esquina y el tiempo de descenso en el grupo sin administración de SL (modelo de enfermedad de Parkinson) fueron dos o tres veces más largos que los del grupo de control de ratas normales con una dieta normal, y el tiempo de giro en esquina y el tiempo de descenso en el grupo con administración de 6'-SL (modelo de enfermedad de Parkinson 6'-SL) fueron casi similares a los del grupo de control. Es decir, se pudo confirmar que 6'-SL mejoró la capacidad conductual (giro en esquina o descenso) en ratas modelo de enfermedad de Parkinson. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de mejora de la capacidad conductual.
Ejemplo 7: Evaluación de la estimulación de la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedades cerebrales de epilepsia/convulsión
Con el fin de investigar los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión, se adquirieron ratas SD normales de 4 semanas de edad y modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión (rata epiléptica Noda, NER) de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante dos semanas. A las 6 semanas de edad, las ratas SD se dividieron en cuatro grupos (compuestos por 8 animales por grupo): Se utilizaron ocho ratas SD macho de 6 semanas de edad (ratas normales; peso corporal inicial promedio 176,3 ± 13,3g) tratadas con una dieta normal para un grupo de control. Los modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión de machos de 6 semanas de edad (peso corporal inicial, promedio de 181,8 ± 11,3 g) se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (8 animales por grupo) a continuación, y estas dietas se mantuvieron a partir de las 6 semanas de edad durante 10 semanas (total 32 animales):
- Grupo de control: ratas normales alimentadas con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión): modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión 3'-SL): modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de rata por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión 6'-SL): modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de rata por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
La sialilactosa o AD se administró por vía oral diariamente. Las ratas se mantuvieron en salas de animales durante 10 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en dos órganos principales (cerebro e hipocampo) asociados con enfermedades cerebrales. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, 999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 9.
Las figuras 9a y 9b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL en modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión. En las figuras 9a y 9b, los ejes verticales representan los valores numéricos de (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión))/nivel de expresión génica del grupo de control), (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión 3'-SL)/nivel de expresión génica del grupo de control) y (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión 6'-SL)/nivel de expresión génica del grupo de control) en los órganos correspondientes con respecto a los cambios de expresión génica relativa en el cerebro o el hipocampo en comparación con el grupo de control. Los modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión de 6 semanas de edad se agruparon en grupos con administración de SL y un grupo sin administración de SL (8 animales por grupo), y luego se sometieron a una prueba de control de la dieta durante 10 semanas, y los niveles de expresión génica en los grupos de prueba se compararon con los del grupo de control en el que se alimentaron ratas SD macho (normales) de 6 semanas de edad con una dieta normal. Como resultado, como se muestra en las figura 9a y 9b, basándose en el grupo de control de ratas normales con una dieta normal, los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) que incluyen PGC-1a en el cerebro (figura 9a) y el hipocampo (figura 9b) fueron algo inferiores en los grupos con administración de SL (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión SL) en comparación con el grupo de control normal, pero fueron muy altos en los grupos con administración de SL en comparación con el grupo sin administración de SL (modelo de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión). Es decir, 6'-SL mostró aumentos significativos en los niveles de expresión de PGC-1a y genes relacionados en el cerebro y el hipocampo de ratas modelos de enfermedad cerebral de epilepsia/convulsión. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica.
Ejemplo 8: Evaluaciones de la estimulación de la expresión génica y la mejora del tiempo de recorrido en el cilindro giratorio mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de Huntington
Para investigar los cambios en la expresión génica y la capacidad cognitiva por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad cerebral de Huntington, se adquirieron ratones de 4 semanas de edad de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante una semana. A las 5 semanas de edad, los ratones se dividieron en tres grupos (compuestos por ocho ratones por cada grupo): Se utilizaron ocho ratones c57/BL6 macho de 5 semanas de edad (ratones normales; peso corporal inicial promedio 25,3 ± 4,3g) tratados con una dieta normal para un grupo de control. Los ratones HD transgénicos macho modelo de enfermedad de Huntington de 5 semanas de edad (R6/2 series(BpCBATg(HDexon1)62Gpb/3J, 111 CAG); peso corporal inicial promedio 26,9 ± 4,8 g) se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (ocho ratones por grupo), y estas dietas se mantuvieron durante 10 semanas (total 32 animales):
- Grupo de control: ratones normales alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Huntington): modelos de enfermedad de Huntington alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Huntington 3'-SL): modelos de enfermedad de Huntington tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
- Grupo (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL): modelos de enfermedad de Huntington tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
La sialilactosa o AD se administró por vía oral diariamente. Los ratones se mantuvieron en salas de animales durante 10 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en dos órganos principales (cerebro e hipocampo) asociados con enfermedades cerebrales. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 10.
Las figuras 10a y 10b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de enfermedad de Huntington. Las figuras 10a y 10b muestran los valores numéricos de (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Huntington))/nivel de expresión génica del grupo de control), (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Huntington 3'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) y (nivel de expresión génica del grupo (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL))/nivel de expresión génica del grupo de control) en los órganos correspondientes con respecto a los cambios de expresión génica en el cerebro y el hipocampo en comparación con el grupo de control de ratones normales. Los ratones macho modelo de enfermedad de Huntington de 5 semanas de edad se agruparon en grupos con administración de SL (3'-SL y 6'-SL) y un grupo sin administración de SL (8 animales por grupo), y luego se sometieron a una prueba de control de la dieta durante 10 semanas, y los niveles de expresión génica en los grupos de prueba se compararon con los de los ratones normales (c57/BL6) con una dieta normal. Como resultado, como se muestra en las figura 10a y 10b, basándose en el grupo de control de ratones normales con una dieta normal, los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, Erra, UCP1, BDNF, SOD2 y GPX1) que incluyen PGC-1a en el cerebro (figura 10a) y el hipocampo (figura 10b) fueron algo inferiores en el grupo con administración de 6'-SL (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL) en comparación con el grupo de control normal, pero fueron muy excelentes en el grupo con administración de 6'-SL en comparación con el grupo (modelo de enfermedad de Huntington) sin administración de SL. Es decir, 6'-SL mostró aumentos significativos en los niveles de expresión de PGC-1a y genes relacionados en el cerebro y el hipocampo de ratones modelo de enfermedad de Huntington. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica.
De manera adicional, la mejora del comportamiento se evaluó a través de los cambios en el tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington), grupo (modelo de enfermedad de Huntington 3'-SL), y grupo (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL, en comparación con el de ratón normal con una dieta normal. La prueba de recorrido en el cilindro giratorio es para investigar los cambios de los valores numéricos de (tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington))/tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo de control), (tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington 3'-SL))/tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo de control), y (tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL))/tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo de control). El tiempo de recorrido en el cilindro giratorio se midió utilizando un dispositivo de cilindro giratorio (rodillo que acelera a una velocidad de revolución de 4-40 rpm durante 3 minutos, Jungdo Instruments, Corea). Después de poner en práctica la prueba en el cilindro giratorio con ratones de 4 semanas de edad, se realizó la prueba en el cilindro giratorio a partir de las 5 semanas de edad y se midió el tiempo medio hasta la caída.
La figura 11 muestra los resultados de la prueba de recorrido en el cilindro giratorio en modelos de enfermedad de Huntington. En la figura. 11, el eje vertical representa los valores numéricos de (tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington))/tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo de control), (tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington 3'-SL))/tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo de control), y (tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL))/tiempo de recorrido en el cilindro giratorio del grupo de control). Como resultado, como se muestra en la figura 11, cuando las pruebas de tiempo de recorrido en el cilindro giratorio para el grupo (modelo de enfermedad de Huntington), grupo (modelo de enfermedad de Huntington 3'-SL), y grupo (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL) se compararon con el grupo de control de ratones normales con una dieta normal, el tiempo de recorrido en el cilindro giratorio aumentó en el grupo con administración de 6'-SL (modelo de enfermedad de Huntington 6'-SL) en comparación con el grupo sin administración de SL grupo (modelo de enfermedad de Huntington), y el efecto de aumento del tiempo de recorrido en el cilindro giratorio de 3'-SL fue menor que el de 6'-SL. Es decir, se pudo confirmar que 6'-SL estimuló mejor la mejora del comportamiento en modelos de enfermedad de Huntington.
Ejemplo 9: Cambios en la volemia isquémica y puntuación MLPT por tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de accidentes cerebrovasculares
Para investigar los cambios en la volemia isquémica y la puntuación de la prueba de colocación de extremidades modificada (MLPT, por sus siglas en inglés) mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de accidentes cerebrovasculares, se adquirieron ratones de 4 semanas de edad de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante una semana. Se fabricaron modelos de accidente cerebrovascular que implicaban oclusión temporal y permanente de la arteria cerebral media (MCA, por sus siglas en inglés) y hemorragia intracerebral (ICH, por sus siglas en inglés) utilizando ratas Sprague-Dawley macho de 6 semanas de edad (peso, promedio de 185,3 ± 15,8 g) y ratones BALB/c macho (peso, promedio 24,6 ± 3,8 g). Para la comparación de los efectos de la administración de SL, los ratones, una hora después de la inducción del accidente cerebrovascular, se agruparon aleatoriamente en tres grupos diferentes de administración intraperitoneal (8 animales por grupo, 24 animales en total) a continuación, y luego se administraron por vía intraperitoneal:
- Grupo de control: grupo de control con tampón de lisis, grupo de administración intraperitoneal media (8 animales)
- Tratamiento con 3'-SL: grupo con administración intraperitoneal del medio tampón de lisis de 3'-SL (8 animales)
- Tratamiento con 6'-SL: grupo con administración intraperitoneal del medio tampón de lisis de 6'-SL (8 animales)
Se usaron modelos de ratones con infarto cerebral local como modelos adicionales de infarto cerebral, y en estos modelos, se administró SL (3'-SL y 6'-SL) por vía intraperitoneal 3 horas después de la introducción del infarto cerebral:
- Grupo de control: grupo de control con tampón de lisis, grupo de administración intraperitoneal media (8 animales)
- Tratamiento con 3'-SL: grupo con administración intraperitoneal del medio tampón de lisis de 3'-SL (8 animales)
- Tratamiento con 6'-SL: grupo con administración intraperitoneal del medio tampón de lisis de 6'-SL (8 animales)
La medición de la volemia isquémica se realizó midiendo el volumen del área isquémica (infarto y región límite del mismo) utilizando cloruro de 2,3,7-trifeniltetrazolio (TTC), 24 horas después de la inducción isquémica, como se indica a continuación. Después de la extracción del cerebro, la extracción, la punta frontal se cortó en 1 mm de espesor y se sumergió en una solución de TCC al 2 %. A continuación, los cortes teñidos se fijaron con PBS-paraformaldehído al 4 % y se midió el sitio isquémico y la región hemisférica de cada corte mediante un sistema de análisis de imágenes. Los valores debidos al edema cerebral se corrigieron de la siguiente manera: valor de la volemia isquémica corregido: área isquémica medida x 1-{[(área del hemisferio ipsolateral-área del hemisferio contralateral)/hemisferio contralateral]}. La volemia isquémica se expresó como porcentaje del volumen hemisférico total.
La figura 12 muestra el resultado de la observación de la volemia isquémica en modelos isquémicos. La figura 12 muestra los resultados de la observación de los efectos protectores del daño neuronal isquémico in vivo de SL cuando los modelos de ratón con oclusión temporal y permanente de la arteria cerebral media (MCA) se trataron con 3'- o 6'-SL. Como se muestra en la figura 12, la reducción de la volemia isquémica por el tratamiento con 6'-SL fue aproximadamente del 50 % en todos los modelos de isquemia cerebelosa local permanente (50 %), modelos de isquemia cerebelosa local temporal (60 %) y modelos de oclusión cerebral local permanente (40 %). Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos protectores del daño neuronal isquémico.
De manera adicional, para investigar la inhibición de la neurodegeneración por SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de ICH, se realizó la prueba m LpT. La prueba MLPT se realizó un día antes, un día después y tres días después de la inducción de ICH. El modelo se suspendió a 10 cm por encima de una mesa y se puntuó el estiramiento de las extremidades anteriores hacia la mesa (0 puntos por estiramiento normal y 1 punto por flexión anormal). Después, se permitió que las extremidades anteriores del modelo se movieran a través del borde, y se tiró de cada extremidad hacia abajo suavemente, y se verificó la recuperación y colocación (extremidad anterior, segunda tarea; miembro posterior, tercera tarea). Finalmente, la rata se colocó hacia el borde de la mesa para comprobar la colocación lateral de las extremidades anteriores. Los resultados de la evaluación de tres tareas se puntuaron de la siguiente manera: 0 puntos por ejecución normal, 1 punto por ejecución con retraso (al menos 2 segundos) o ejecución incompleta, y 2 puntos por no ejecución. Un total de siete puntos indica un déficit neurológico máximo y una puntuación de 0 puntos indica una ejecución normal.
La figura 13 muestra los cambios en la puntuación de la prueba MLPT por el tratamiento con SL (3'-SL y 6'-SL) después de la inducción de ICH. Como se muestra en la figura 13, como se puede observar en los resultados del primer y tercer día después de la inducción del modelo de IHC, la puntuación de la prueba MLPT fue menor cuando los modelos de ICH se trataron con 6'-SL en comparación con el grupo de control. Es decir, se observaron los efectos inhibidores de la neurodegeneración por el tratamiento con 6'-SL. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos inhibidores de la neurodegeneración.
Ejemplo 10: Cambios en la expresión de genes de grasa abdominal y evaluación de eliminación de grasa tópica mediante tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL)
Para investigar los cambios en la expresión génica y los efectos de eliminación de grasa tópica mediante el tratamiento con la composición de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de ratón, se adquirieron modelos de ratón ob macho de 4 semanas de edad (C57BL/6J-ob/ob) de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se suministró una dieta rica en grasas (dieta para roedores con 60 kcal% de grasa) durante dos semanas. Los modelos de ratones ob machos de 6 semanas de edad (C57BL/6J-ob/ob) (peso corporal inicial, promedio de 34,2 ± 3,7 g) se agruparon aleatoriamente en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (8 animales por grupo) a continuación, y estas dietas se mantuvieron durante 10 semanas (un total de 24 animales):
- Grupo de control: modelos alimentados con una dieta rica en grasas (dieta para roedores con 60 kcal% de grasa) sin tratamiento con SL (8 animales)
- Grupo con administración de 3'-SL: modelos tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo de dieta rica en grasas (8 animales)
- Grupo con administración de 6'-SL: modelos tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo de dieta rica en grasas (8 animales)
La sialilactosa o AD se administró por vía oral diariamente. Los ratones se mantuvieron en salas de animales durante 10 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6'-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en la zona abdominal. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 14.
La figura 14 muestra cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL en modelos de ratón. En la figura. 14, el eje vertical representa la relación de la expresión del gen de la grasa abdominal en los modelos alimentados con una dieta rica en grasas en comparación con la administración de SL, que muestran los valores numéricos de (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 3'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control) y (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 6'-SL/el nivel de expresión génica del grupo control) en la grasa abdominal. Los ratones macho de 6 semanas de edad se dividieron en el grupo de control y los grupos con administración de SL (8 animales por grupo), que se sometieron a una prueba de control de la dieta rica en grasas durante 10 semanas. Como resultado, como se muestra en la figura 14, el grupo con administración de 6'-SL mostró aumentos significativos de dos veces en los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1) en comparación con el grupo de control negativo. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de estimulación de la expresión de PGC-1a y genes relacionados.
De manera adicional, en los modelos de ratones ob (C57BL/6J-ob/ob) alimentados con una dieta rica en grasas sin tratamiento con SL, se investigó el efecto de eliminación de grasa tópica mediante la administración de SL (3'-SL y 6'-SL) utilizando un meso roller (0,5 mm, INTO MR, Intomedi Inc.). Específicamente, se afeitó el pelo en el lado dorsal de la rata, y se aplicó a la piel SL 0,1 M en el tampón de solución salina, y se absorbió en la piel frotando con el meso roller. El grupo de control se sometió a prueba con el mismo método excepto que el tampón se usó sin SL. Los resultados se muestran en la figura 15. La figura 15 muestra los cambios en la expresión génica cuando las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se administraron tópicamente en los modelos de ratón. En la figura 15, 3'-SL, 6'-SL y CTL representan el grupo con administración de 3'-SL, el grupo con administración de 6'-SL y el grupo de control, respectivamente. Después de alimentarlos con una dieta rica en grasas durante 10 semanas, las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se administraron tópicamente el día 0 y el día 4 usando el meso roller, y luego se llevó a cabo la observación dermatoscópica el día 7. Se muestran los resultados de la observación.
Como resultado, como se muestra en la figura 15, se pudo confirmar que la grasa tópica se eliminó en la porción en la que se administró 6'-SL utilizando el meso roller en comparación con la porción de control negativo. Se pudo ver que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de eliminación de grasa tópica.
Ejemplo 11: Cambios en la expresión génica por partes del cuerpo y efecto de prevención de enfermedades crónicas relacionadas con el envejecimiento a través de las funciones de los telómeros y el control de ROS mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de estimulación del envejecimiento
Para investigar los cambios en la expresión génica por partes del cuerpo por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de estimulación del envejecimiento, se adquirieron ratones moche modelo de estimulación del envejecimiento de 4 semanas de edad (SAM P1/Sku Sic) de Central Lab Animal (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante una semana. Los ratones macho modelo de estimulación del envejecimiento de 6 semanas de edad (peso corporal inicial, promedio de 28,8 ± 2,3g) se agruparon aleatoriamente en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (8 animales por grupo) a continuación, y estas dietas se mantuvieron durante 12 semanas (un total de 24 animales):
- Grupo de control: ratones normales alimentados con una dieta normal sin administración de SL (8 animales)
- Grupo con administración de 3'-SL: modelos de estimulación del envejecimiento tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal (8 animales) - Grupo con administración de 6'-SL: modelos de estimulación del envejecimiento tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo con dieta normal (8 animales)
La sialilactosa o AD se administró por vía oral diariamente. Los ratones se mantuvieron en salas de animales durante 14 semanas, se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se sacrificaron. La ingesta dietética y el cambio de peso corporal se midieron cada 5 días. Se adquirió 3'-sialilactosa (3'-N-acetilneuraminil-D-lactosa, 3'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^-3)-p-D-Gal-(1^4)-DGlc) o 6-sialilactosa (6'-N-acetilneuraminil-lactosa, 6'-sialil-D-lactosa, o a-NeuNAc-(2^6)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc) de Sigma-Aldrich.
Los cambios en la expresión génica por la administración de las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en ocho órganos principales (corazón, hipocampo, cerebro, médula espinal, pulmón, hígado, bazo y riñón, en tres músculos esqueléticos (músculo sóleo, músculo cuádriceps femoral y músculo gastrocnemio), y similares. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. Uu.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en la figura 16.
Las figuras 16a y 16b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos estimulantes del envejecimiento. Los ratones macho modelo de estimulación del envejecimiento de 6 semanas de edad (SAM P1/Sku Sic) se agruparon en el grupo de control, grupo con administración de 3'-SL y grupo con administración de 6'-SL (8 animales por grupo), y luego se sometieron a una prueba de control de la dieta durante 12 semanas. En las figuras 16a y 16b, los ejes verticales representan los cambios en la expresión génica relativa por partes del cuerpo en comparación con antes de la administración de SL (3'-SL y 6'-SL), que muestran los valores numéricos de (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 3'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control) y (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 6'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control) en las correspondientes partes del cuerpo. Como resultado, como se muestra en las figura 16a y 16b, tanto de 3'-SL (figura 16a) como de 6'-SL (figura 16b) mostraron aumentos significativos en los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1) en la mayoría de los órganos y músculos esqueléticos, y 3'-SL fue relativamente baja en comparación con 6'-SL en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica de las dianas de análisis.
De manera adicional, para pruebas a nivel celular, se aislaron células de músculo liso aórtico de ratón (MASM, por sus siglas en inglés) del grupo de control alimentado con una dieta rica en grasas (dieta de roedores con 60 kcal% de grasa) sin administración de SL (Griendling et al., 1991), y se añadieron las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) al líquido de cultivo, seguido de incubación. Para la medición de H2O2 intracelular (valores de ROS), las células se cultivaron en placas de cultivo de 12 pocillos sumergidas en suero bovino de ternera al 0,1 %. Los valores de ROS intracelulares se midieron utilizando H2DCFDA. Para el ensayo, las células se cultivaron junto con H2DCFDA en tampón HBSS durante 30 minutos. Las células se tripsinizaron, lavaron y lisaron en HBSS. Los valores de fluorescencia se midieron inmediatamente mediante un lector de placas CytoFluor (figura 17a).
Para la medición de la producción de superóxido mitocondrial, se midió el ROS mitocondrial usando MitoSOX Red (marcador fluorescente de superóxido mitocondrial). Se extrajeron las MASM y se incubaron con MitoSOX (4 μM) en la oscuridad a 37 °C durante 20 minutos. La fluorescencia de MitoSOX se cuantificó mediante la lectura de la intensidad de fluorescencia celular utilizando un lector de placas fluorescentes (excitación a 480 nm/emisión a 580 nm) (figura 17b).
En las figuras 17a y 17b, las MASM se extrajeron del grupo de control de ratones modelo de estimulación del envejecimiento, y las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se agregaron al líquido de cultivo para realizar la comparación. Para la medición de H2O2 intracelular (valores de ROS), las células se cultivaron junto con H2DCFDA (figura 17a), y para la medición de ROS mitocondriales, las células se cultivaron junto con MitoSOX Red (marcador fluorescente de superóxido mitocondrial (figura 17a). El H2O2 intracelular y la producción de superóxido mitocondrial se cuantificaron mediante un lector de placas de fluorescencia. Se pudo ver que las composiciones redujeron los valores de ROS e inhibieron la producción de superóxido mitocondrial.
Las figuras 17a y 17b muestran los resultados de la medición de H2O2 intercelular (valores de ROS) (figura 17a) y los resultados de medición de la producción de superóxido mitocondrial (figura 17b). Las MASM se extrajeron de los ratones modelo de estimulación del envejecimiento (SAM Pl/Sku Slc), y las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se añadieron al líquido de cultivo Para realizar una comparación para la medición de H2O2 intracelular, las células se cultivaron junto con H2DCFDA (figura 17a), y para la medición de ROS mitocondriales, las células se cultivaron junto con MitoSOX Red (marcador fluorescente de superóxido mitocondrial (figura 17a). El H2O2 intracelular y la producción de superóxido mitocondrial se cuantificaron mediante un lector de placas de fluorescencia. Se pudo ver que las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) redujeron los valores de rOs e inhibieron la producción de superóxido mitocondrial.
En las figuras 18a y 18b, la actividad telomerasa se midió utilizando el protocolo TRAP (Wright et al., 1995). Resumiendo, los sedimentos celulares se lisaron en disolvente de lisis CHAPS (que contiene inhibidor de ribonucleasa), seguido de incubación a 4 °C durante 30 minutos. Los extractos celulares (1 mg) fueron mezcla de reacción TRAPeze (cebador de sustrato de telomerasa (TS), cebador (inverso) RP marcado con fluorescencia, plantilla patrón de control y cebador K2 patrón marcado con sulforrodamina). El cebador de TS se alargó a 30 °C durante 30 minutos y luego se realizó la p Cr . La fluorescencia del producto TRAP así obtenido se midió utilizando un lector de placas fluorescentes para cuantificar la actividad telomerasa. La actividad relativa de la telomerasa se normalizó mediante la relación de fluorouracilo natural a sulforrodamina (patrón de control interno), expresada como un porcentaje. La fluoresceína (M0250) se adquirió de Marker Gene Technologies, Inc. El diacetato de H2-diclorofluoresceína (DCFDA) se adquirió de Molecular Probes. Se adquirieron MitoSOXTM Red, MitoTracker Green FM y MitoTracker® Orange CTMMRos (MTO) de Invitrogen. Se adquirió colorante 10.000x SYBR® Gold de Molecular Probes, Inc. El kit de fraccionamiento nuclear/citosol (K266-100) se adquirió de BioVision. El kit de detección de telomerasa TRAPeze® XL (S7707) se adquirió de MILLIPORE. El kit telomere PNA FISH Kit/Cy3 (K5326) se adquirió de Dako.
Las figuras 18a y 18b muestran los resultados de la medición de la actividad telomerasa mediante la administración de composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL). A través de estos valores, se podría deducir la activación de TERT y de la vía nerviosa de elementos sensibles a antioxidantes/electrófilos (ARE/ERE, por sus siglas en inglés) (Xiong et al., 2015, Cell Reports 12, 1391-1399). Los modelos de estimulación del envejecimiento (figura 18a) y MASM (figura 18b) se trataron con SL (3'-SL y 6'-SL) para analizar la actividad telomerasa.
La figura 18a muestra los datos del análisis de la actividad telomerasa in vivo en la muestra de aorta extraída del grupo control, grupo con administración de 3'-SL y grupo con administración de 6'-SL. La figura 18b muestra los datos del análisis de la actividad telomerasa in vitro cuando se aislaron las células del músculo liso del grupo de control (Griendling et al., 1991) y las MASM se cultivaron durante 1 día en placas de cultivo de 12 pocillos tratadas con SL (3'-SL y 6'-SL). Los resultados de la prueba mostraron que la administración de las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) aumentó la actividad telomerasa. Estos resultados sugieren que las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) pueden estar asociadas con disfunción de la TERT disfunción y recuperación del daño del ADN (aumento de la actividad telomerasa -expresión de TERT) a través del aumento de PGC-1a.
Ejemplo 12: Efecto de prevención de enfermedades crónicas relacionadas con el envejecimiento a través de las funciones de los telómeros y el control de ROS mediante el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de arteriosclerosis
Recientemente se ha informado que la eliminación del gen PGC-1a da como resultado el envejecimiento vascular, ateroesclerosis, disfunción y reducción de la longitud de los telómeros, daño en el ADN, disminución de la expresión y la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT), y aumento de p53 (Xiong et al., 2015, Cell Reports 12, 1391-1399).
En general, los ratones ApoE^ aumentan la sensibilidad al estrés oxidativo y la inflamación y presentan rápidamente heridas de aterosclerosis observadas en personas, por lo que los ratones se utilizaron como modelos representativos de arteriosclerosis (Weiss et al., 2001). Por consiguiente, se adquirieron ratones ApoE'/_ (basados en C57BL/6) de Jackson Laboratory. El genotipo se identificó por PCR usando ADN de cola.
Para investigar el efecto de prevención de enfermedades crónicas relacionadas con el envejecimiento mediante el control de las funciones de la telomerasa y el daño del ADN por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de arteriosclerosis, se agruparon dos tipos de ratones macho modelo de 24 semanas de edad (PGC-1a+/+ApoE'/') aleatoriamente en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (8 animales por grupo) a continuación, y las dietas se mantuvieron durante 6 semanas (un total de 24 animales):
- Grupo de control: modelos de arteriesclerosis alimentados con una dieta rica en grasas (dieta para roedores con 60 kcal% de grasa) (8 animales)
- Grupo con administración de 3'-SL: modelos de arteriesclerosis tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo de dieta rica en grasas (8 animales)
- Grupo con administración de 6'-SL: modelos de arteriesclerosis tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo de dieta rica en grasas (8 animales)
Para pruebas a nivel celular, se aislaron células de músculo liso aórtico de ratón (MASM, por sus siglas en inglés) del grupo de control alimentado con una dieta rica en grasas (dieta de roedores con 60 kcal% de grasa) sin administración de SL (Griendling et al., 1991), y se añadieron las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) al líquido de cultivo, seguido de la comparación. Para la medición de H2O2 intracelular (valores de ROS), las células se cultivaron en placas de cultivo de 12 pocillos sumergidas en suero bovino de ternera al 0,1 %. Los valores de ROS intracelulares se midieron utilizando H2DCFDA. Para el ensayo, las células se cultivaron junto con H2DCFDA en tampón HBSS durante 30 minutos. Las células se tripsinizaron, lavaron y lisaron en HBSS. Los valores de fluorescencia se midieron inmediatamente mediante un lector de placas CytoFluor (figura 19a).
Para la medición de la producción de superóxido mitocondrial, se midió el ROS mitocondrial usando MitoSOX Red (marcador fluorescente de superóxido mitocondrial). Se extrajeron las MASM y se incubaron con MitoSOX (4 j M) en la oscuridad a 37 °C durante 20 minutos. La fluorescencia de MitoSOX se cuantificó mediante la lectura de la intensidad de fluorescencia celular utilizando un lector de placas fluorescentes (excitación a 480 nm/emisión a 580 nm) (figura 19b).
En las figuras 19a y 19b, las MASM se extrajeron del grupo de control de modelo de ratón (PGC-1a+/+ApoE'/-) y las composiciones de Sl (3'-SL y 6'-SL) se añadieron al líquido de cultivo para realizar la comparación. Para la medición de H2O2 intracelular (valores de ROS), las células se cultivaron junto con H2DCFDA (figura 19a), y para la medición de ROS mitocondriales, las células se cultivaron junto con MitoSOX Red (marcador fluorescente de superóxido mitocondrial (figura 19a). El H2O2 intracelular y la producción de superóxido mitocondrial se cuantificaron mediante un lector de placas de fluorescencia. Se pudo ver que las composiciones redujeron los valores de ROS e inhibieron la producción de superóxido mitocondrial.
Las figuras 19a y 19b muestran los resultados de la medición de H2O2 intercelular (valores de ROS) (figura 19a) y los resultados de medición de la producción de superóxido mitocondrial (figura 19b). Las MASM se extrajeron de los ratones modelo (PGC-1a+/+ApoE'/_) y las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se añadieron al líquido de cultivo para realizar la comparación. Para la medición de H2O2 intracelular, las células se cultivaron junto con H2DCFDA (figura 19a), y para la medición de ROS mitocondriales, las células se cultivaron junto con MitoSOX Red (marcador fluorescente de superóxido mitocondrial (figura 19a). El H2O2 intracelular y la producción de superóxido mitocondrial se cuantificaron mediante un lector de placas de fluorescencia. Se pudo ver que las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) redujeron los valores de ROS e inhibieron la producción de superóxido mitocondrial.
En la figura. 20, la actividad telomerasa se midió utilizando el protocolo TRAP (Wright et al., 1995). Resumiendo, los sedimentos celulares se lisaron en disolvente de lisis CHAPS (que contiene inhibidor de ribonucleasa), seguido de incubación a 4 °C durante 30 minutos. Los extractos celulares (1 mg) fueron mezcla de reacción TRAPeze (cebador de sustrato de telomerasa (TS), cebador (inverso) RP marcado con fluorescencia, plantilla patrón de control y cebador K2 patrón marcado con sulforrodamina). El cebador de TS se alargó a 30 °C durante 30 minutos y luego se realizó la PCR. La fluorescencia del producto TRAP así obtenido se midió utilizando un lector de placas fluorescentes para cuantificar la actividad telomerasa. La actividad relativa de la telomerasa se normalizó mediante la relación de fluorouracilo natural a sulforrodamina (patrón de control interno), expresada como un porcentaje. La fluoresceína (M0250) se adquirió de Marker Gene Technologies, Inc. El diacetato de H2-diclorofluoresceína (DCFDA) se adquirió de Molecular Probes. Se adquirieron MitoSOXTM Red, MitoTracker Green FM y MitoTracker® Orange CTm Mros (MTO) de Invitrogen. Se adquirió colorante 10.000x SYBR® Gold de Molecular Probes, Inc. El kit de fraccionamiento nuclear/citosol (K266-100) se adquirió de BioVision. El kit de detección de telomerasa TRAPeze® XL (S7707) se adquirió de MILLIPORE. El kit telomere PNA FISH Kit/Cy3 (K5326) se adquirió de Dako.
Las figuras 20a y 20b muestran los resultados de la medición de la actividad telomerasa mediante la administración de composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL). A través de estos valores, se podría deducir la activación de TERT y de la vía nerviosa de elementos sensibles a antioxidantes/electrófilos (ARE/ERE, por sus siglas en inglés) (Xiong et al., 2015, Cell Reports 12, 1391-1399).
Las figuras 20a y 20b muestran los resultados del análisis de la actividad telomerasa por el tratamiento de modelos de arteriosclerosis (ApoE'/_; figura 20a) y MASM (figura 20b) con SL (3'-SL y 6'-SL). La figura 20a muestra los datos del análisis de la actividad telomerasa in vivo en la muestra de aorta extraída del grupo control, grupo con administración de 3'-SL y grupo con administración de 6'-SL. La figura 20b muestra los datos del análisis de la actividad telomerasa in vitro cuando se aislaron las células del músculo liso del grupo de control (Griendling et al., 1991) y las MASM se cultivaron durante 1 día en placas de cultivo de 12 pocillos tratadas con SL (3'-SL y 6'-SL). Los resultados de la prueba mostraron que la administración de las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) aumentó la actividad telomerasa. Estos resultados sugieren que las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) pueden estar asociadas con disfunción de la TERT disfunción y recuperación del daño del ADN (aumento de la actividad telomerasa -expresión de TERT) a través del aumento de PGC-1a.
Ejemplo 13: Cambios en la expresión génica por partes del cuerpo por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en prueba cutánea
Para investigar los cambios en la expresión génica por partes del cuerpo por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de pruebas cutáneas, se agruparon aleatoriamente ratones (HRM2) macho modelo de prueba cutánea de 6 semanas de edad (aspecto sin pelo que contenía melanina) en tres grupos de tratamiento dietético diferentes (8 animales por grupo, un total de 24 animales) a continuación, y las dietas (AIN-76A, Dyets, EE. UU.) se mantuvieron durante 10 semanas. La radiación UV (punto negro, prueba de arrugas), prueba de sensibilidad cutánea, prueba de irritación cutánea, pruebas de absorción subcutánea o similares se realizaron utilizando un medidor de diferencia de color portátil (CR-10, Minolta, Japón):
- Grupo de control: grupo alimentado con dieta normal (8 animales)
-- Grupo con administración de 3'-SL: modelos tratados con 3'-sialilactosa (3'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo de dieta normal (8 animales)
-- Grupo con administración de 6'-SL: modelos tratados con 6'-sialilactosa (6'-SL, Sigma) (administración oral de 0,1 mg por kg de peso de ratón por día) además del grupo de dieta normal (8 animales)
Se pudo observar que los grupos con administración de SL (3'-SL y 6'-SL) mostraron una piel mucho mejor en comparación con el grupo de control en vista de la radiación UV (punto negro, prueba de arrugas), prueba de sensibilidad cutánea, prueba de irritación cutánea, prueba de absorción subcutánea, o similares. Los cambios en la expresión génica por la administración de las composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) se compararon cuantitativamente en ocho órganos principales (corazón, hipocampo, cerebro, médula espinal, pulmón, hígado, bazo y riñón, en tres músculos esqueléticos (músculo sóleo, músculo cuádriceps femoral y músculo gastrocnemio), y similares. El ARN se extrajo con el agente TRIzol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando ARN, que se ha extraído como se describe anteriormente y cuantificado y un sistema de transcripción inversa (Promega, EE. UU.). Los patrones de expresión de PGC-1a y genes relacionados se midieron utilizando cebadores y sondas diseñados previamente (Applied Biosystems; PGC-1a, Mm00447181_m1, GAPDH y Mm99999915_q1) para el ADNc sintetizado y las dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1). Se utilizó el sistema Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para la reacción y el análisis de PCR, y los resultados se muestran en las figuras 21a y 21b.
En las figuras 21a y 21b, los cambios en la expresión génica relativa por partes del cuerpo en comparación con antes de la administración de SL (3'-SL y 6'-SL) se expresaron numéricamente mediante (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 3'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control ) y (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 6'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control) en las partes del cuerpo correspondientes. Los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1) que incluyen PGC-1a en varias partes del cuerpo estaban muy en el grupo con administración de 6'-SL en comparación con el grupo de control. Es decir, se pudo confirmar que 6'-SL estimuló la expresión de PGC-1a y genes relacionados en varios órganos y músculos de ratones normales. Se pudo observar que 3'-SL era relativamente baja en comparación con 6'-Sl en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica de las dianas de análisis.
Las figuras 21a y 21b muestran los cambios en la expresión génica por el tratamiento con composiciones de SL (3'-SL y 6'-SL) en modelos de prueba cutánea. Se agruparon aleatoriamente ratones (HRM2) macho modelo de prueba cutánea de 6 semanas de edad en el grupo de control y los grupos con administración de SL (3'-SL y 6'-SL) (8 animales por grupo), y se sometieron a una prueba de control dietético durante 10 semanas. Los cambios en la expresión génica relativa por en comparación con antes de la administración de SL (3-SL y 6 -SL) se expresaron numéricamente mediante (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 3'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control ) y (el nivel de expresión génica del grupo con administración de 6'-SL/el nivel de expresión génica del grupo de control), que son relaciones relativas de los valores obtenidos al cuantificar "el nivel de expresión génica del grupo con administración de SL" y "el nivel de expresión génica del gen del grupo de control" en cada parte del cuerpo. Los aumentos significativos en los niveles de expresión de varias dianas de análisis (Fndc5, PGC-1a, Erra, UCP1, SOD2 y GPX1) se observaron en la mayoría de los órganos y músculos esqueléticos. Se pudo observar que 3'-SL (figura 21a) era relativamente baja en comparación con 6'-SL (figura 21b) en vista de los efectos de estimulación de la expresión génica de las dianas de análisis.
Ejemplo 14: Efectos de la composición de sialilactosa (3'-SL y 6'-SL) sobre adipocitos diferenciados
(1) Cultivo y diferenciación de células 3T3-L1
Los adipocitos 3T3-L1 se adquirieron del Cell Line Bank coreano. Para el cultivo y mantenimiento de adipocitos 3T3-L1, las células se subcultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Welgene, Corea) complementado con suero bovino de ternera al 10 % (FCS, Welgene, Corea) en una estufa de incubación con CO2 al 5 % a 37 °C Los adipocitos 3T3-L1 se dividieron en seis grupos de la siguiente manera: ST; grupo de células diferenciadas normales (grupo de control), grupo de prueba de sialilactosa; grupos de prueba de 1, 10 , 100, 1000 y 10000 |jM tratados con sialilactosa (SL, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Para la diferenciación celular, las células se distribuyeron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 105 células por pocillo y se dejaron crecer hasta un 100 % de confluencia. Después de 2 días, los grupos de prueba se trataron con medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS, Welgene, Corea), solución de Md I (isobutilmetilxantina 0,5 mM (IBMX, Sigma-Aldrich, EE. UU.), dexametasona 1 j M (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y 1 jg/m l de insulina (Sigma-Aldrich, EE. UU.)), y de nuevo se trataron con DMEM que contenía FBS al 10 % y 1 jg/m l de insulina. Posteriormente, las células se diferenciaron en adipocitos mientras se cambiaba el medio por DMEM complementado con FBS al 10 % cada dos días. Al final de la diferenciación, el medio DMEM complementado con FBS al 10 % se trató con 3'-sialilactosa o 6'-sialilactosa a 0, 0,01, 0,1, 1 y 10 mM durante 10 días.
(2) Tinción con Oil-Red O
Después de la diferenciación en placas de 6 pocilios, los adipocitos 3T3-L1 tratados con '-sialilactosa o 6'-sialilactosa se lavaron dos veces con PBS, y luego se les añadió 2 ml de formalina al 10 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para fijar los adipocitos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de secar las células fijadas, las células se trataron con 1 ml de reactivo de tinción Oil Red O (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 20 minutos y luego se lavaron suficientemente cuatro veces con agua destilada para eliminar el reactivo de tinción Oil Red O. Posteriormente, se añadió 1 ml de isopropanol al 100 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para efundir los adipocitos teñidos y luego se midió la cantidad de grasa acumulada usando la absorbancia a 500 nm.
(3) Medición de glicerol libre
El medio, obtenido mediante el tratamiento de adipocitos 3T3-L1 diferenciados en placas de 6 pocillos con 6'-sialil lactosa a concentraciones de 0, 0,01, 0,1, 1 y 10 mM, y cultivo de los adipocitos durante 10 días, se muestreó en un tubo eppendorf, seguido de análisis de glicerol libre utilizando un kit de ensayo basado en células de glicerol (cayman, 10011725, EE. UU.). Se añadieron 100 ul de reactivo de glicerol libre a 25 ul del medio, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se midió la absorbancia a 540 nm.
(4) Medición de viabilidad celular
Después de la diferenciación, se midió la viabilidad celular de los adipocitos 3T3-L1 tratados con 6'-sialilactosa utilizando un kit-8 de recuento de células (Dojindo Molecular Technologies, Inc. EE. UU.). Después del tratamiento farmacológico, se añadieron 10 ul de reactivo CCK-8, seguido de incubación durante 2 horas y la absorbancia se midió a 450 nm.
Como se puede confirmar a partir de las figuras 22 y 23, se redujo la grasa intracelular por la adición de sialilactosa en los adipocitos diferenciados, y sobre todo, la grasa intracelular se redujo considerablemente en los grupos de prueba con 6'-sialilactosa añadida.
Las figuras 22a y 22b muestran los cambios en la grasa intercelular cuando se administraron 6'-sialilactosa (figura 22a) y 3'-sialilactosa (figura 22b) en adipocitos diferenciados. ST representa un grupo de control, y 0,01, 0,1, 1 y 10 mM representan grupos de prueba con 6'-sialilactosa (figura 22a) y 3'-sialilactosa (figura 22b) 0,01, 0,1, 1, 10 mM, respectivamente.
Las figuras 23a y 23b son imágenes de microscopía óptica de células (prueba Oil red O) que muestran cambios en la grasa intercelular cuando se administraron 6'-siallactosa (figura 23a) y 3'-siallactosa sialilactosa (figura 23b) en adipocitos diferenciados. En los dibujos, ST representa un grupo de control, y 0,01,0,1, 1 y 10 mM representan grupos de prueba tratados con 6'-sialilactosa (figura 23a) y 3'-sialilactosa (figura 23b) 0,01, 0,1, 1, 10 mM, respectivamente.
Como puede confirmarse a partir de la figura 24, las sialilactosas no afectaron la viabilidad celular hasta 10 mM en adipocitos diferenciados.
La figura 24 muestra el efecto de la 6'-sialilactosa sobre la viabilidad celular en adipocitos diferenciados. ST representa un grupo de control, y 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 mM representan grupos de prueba tratados con 6'-sialilactosa 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 mM, respectivamente.
Además, como puede confirmarse a partir de la figura 25, las sialilactosas redujeron la grasa intracelular al aumentar la secreción de glicerol de los adipocitos de manera dependiente de la dosis.
Las sialilactosas estimularon la secreción de glicerol independientemente de la viabilidad celular en adipocitos diferenciados, y en especial, la 6'-sialilactosa redujo significativamente la grasa intracelular.
La figura 25 muestra cambios en la secreción de glicerol por sialilactosa en adipocitos diferenciados En los dibujos, ST representa un grupo de control, y 0,01, 0,1, 1 y 10 mM representan grupos de prueba con 3'-sialilactosa 0,01, 0,1, 1, 10 mM, respectivamente.
Ejemplo 15: Cambios en la grasa subcutánea de ratones con dieta rica en grasas mediante inyección subcutánea de composiciones de sialilactosa (3'-SL y 6'-SL)
(1) Ratones con dieta rica en grasa
Se adquirieron ratones C56BL/6 de 4 semanas de edad de Dooyeul Biotech (Corea). El agua era de libre acceso y se administró un alimento en gránulos comercialmente disponible (Dooyeul Biotech, Corea) durante una semana. Se suministró una dieta rica en grasa (60 % de grasa) adquirida en Research Diets (New Brunswick, EE. UU.) durante 28 días para generar ratones con grasa acumulada.
(2) Inyección subcutánea de sialilactosa
Se inyectaron por vía subcutánea 0,5 ml de 3'-sialilactosa o 6'-sialilactosa 100 mM disueltos en un tampón fosfato dos veces (día 0 y día 4) en cuatro o cinco sitios de la región dorsal del ratón con acumulación de grasa inducida por una dieta rica en grasas. En los días 4 y 7, la piel se observó a simple vista y mediante dermatoscopia. Se utilizó un tampón fosfato como grupo de control (CTL).
Como se puede confirmar a partir de las figuras 26a y 26b, la inyección subcutánea de sialilactosas redujo la grasa subcutánea en ratones con dieta rica en grasas, induciendo así las arrugas en la superficie de la piel. Especialmente, la 6'-sialilactosa redujo en gran medida la grasa subcutánea.
Las figuras 26a y 26b muestran cambios en la piel de ratones con una dieta rica en grasas mediante inyección subcutánea de sialilactosas. Los cambios en la piel se confirmaron a simple vista y mediante dermatos
26a y 26b). CTL representa un grupo de control, y 3-sillilactosa (3'-SL) y 6'-sillilactosa (6'-SL) representan grupos de prueba.
REFERENCIAS
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para prevenir o tratar una enfermedad o síntoma asociados con una disminución en la expresión del coactivador 1 -alfa del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PGC-1a), comprendiendo la composición, como principio activo, un compuesto representado por la fórmula general I o una sal, hidrato o solvato del mismo: Fórmula general I: S-(MS)p-(MS)q
en donde S es ácido siálico; y (MS)p y (MS)q son cada uno independientemente un resto de monosacárido, en donde la composición es para su uso en la reducción del volumen del tejido adiposo o en la reducción del contenido de triglicéridos en el tejido adiposo.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el tejido adiposo es tejido adiposo subcutáneo.
3. La composición para su uso según la reivindicación 2, en donde el tejido adiposo subcutáneo es tejido adiposo subcutáneo de la región femoral, el pecho, una parte inferior del cuello, el escote, las nalgas, la cara, los labios, las mejillas, los párpados y/o las manos.
4. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el tejido adiposo es cualquier tejido adiposo que pueda formarse en el cuerpo, incluyendo tejido adiposo formado por embolia grasa.
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