ES2946934T3 - Biomarcadores para células fotoreceptoras - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la identificación de fotorreceptores o fotorreceptores de cono en poblaciones de células. En particular, la presente invención se refiere a métodos de identificación de fotorreceptores o fotorreceptores de cono y métodos de aislamiento de fotorreceptores o fotorreceptores de cono. Los fotorreceptores o fotorreceptores de cono aislados por los métodos de la presente invención son útiles para el trasplante y el tratamiento de distrofias retinianas. También se reivindican poblaciones de células humanas enriquecidas para fotorreceptores o fotorreceptores de cono y kits para identificar fotorreceptores o fotorreceptores de cono. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores para células fotoreceptoras

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de fotorreceptores o fotorreceptores conos en poblaciones de células. En particular, la presente invención se refiere a métodos de identificación de fotorreceptores o fotorreceptores conos y métodos para aislar los fotorreceptores o fotorreceptores conos. Los fotorreceptores o fotorreceptores conos aislados por los métodos de la presente invención son útiles para el trasplante y el tratamiento de distrofias retinianas. También se reivindican poblaciones celulares humanas enriquecidas en fotorreceptores o fotorreceptores conos.

Antecedentes de la invención

Los fotorreceptores bastones y conos, que se encuentran en la capa nuclear externa dentro de la retina, son las células sensoriales primarias del sistema visual de los mamíferos. La estimulación por la luz da como resultado el inicio de la cascada de transducción visual, cuya información se transmite a las células bipolares, procesadas por las interneuronas horizontales y amacrinas, y finalmente enviadas por las células ganglionares de la retina a los centros de procesamiento visual en el cerebro. Puesto que el sistema nervioso de los mamíferos tiene una capacidad regenerativa limitada, cualquier enfermedad o lesión de los fotorreceptores de la retina conduce inevitablemente a una discapacidad visual o incluso a la ceguera. En los países industrializados, las condiciones degenerativas que afectan a los fotorreceptores, tales como la retinitis pigmentosa (RP), la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) o amaurosis congénita de Leber, son una de las principales causas de ceguera.

Sin embargo, las terapias actuales pueden, en el mejor de los casos, ralentizar la progresión de la enfermedad, pero no curar la afección ni revertir sus efectos. Esto se debe principalmente al hecho de que los detalles de la histogénesis retiniana, el mantenimiento y la patología no se entienden suficientemente bien, para el desarrollo de terapias eficaces. No obstante, en la última década, han surgido nuevos paradigmas de tratamiento, entre los que se incluyen la terapia génica, la protección neurotrófica y la terapia de reemplazo celular. Es importante destacar que, mientras continúa la muerte de los fotorreceptores conos y bastones, la arquitectura interna de la retina permanece inalterada durante algún tiempo, proporcionando una oportunidad para reintroducir células fotosensibles a través del trasplante de células.

La retina humana contiene fotorreceptores bastones y tres tipos diferentes de fotorreceptores conos, constituyendo los bastones el 95 % de las células fotorreceptoras en la retina. Los bastones suelen encontrarse concentrados en los bordes exteriores de la retina y se utilizan en la visión periférica. De media, hay aproximadamente 90 millones de bastones en la retina humana. Los fotorreceptores bastones son más sensibles que los fotorreceptores conos y son casi totalmente responsables de la visión nocturna. Aproximadamente el 5-10 % de la población de fotorreceptores conos expresa S-opsina, mientras que la mayoría de los conos (90-95 %) expresan proteínas fotosensibles L-opsina o M-opsina. Aunque los fotorreceptores conos son una población rara, que forman el 2-4 % del total de células retinianas, los humanos dependen de estas células para tener una visión diurna óptima.

La pérdida de células fotorreceptoras está asociada a distrofias retinianas y afecciones que implican daño al ojo. Asimismo, la pérdida de células fotorreceptoras conos, que son cruciales para la detección de color, la visión central y la alta agudeza visual tienen un gran impacto en la vista en las enfermedades degenerativas de la retina.

La terapia de reemplazo celular es una de varias opciones de tratamiento futuras prometedoras que actualmente se encuentran bajo intensa investigación, cuyo objetivo es la reintroducción de células fotorreceptoras conos y bastones sanas en la retina degenerada del paciente.

Sin embargo, existen muchos desafíos críticos que impiden el desarrollo de terapias de reemplazo celular para reemplazar fotorreceptores o fotorreceptores conos, incluidos los desafíos en el desarrollo de las estrategias requeridas para la identificación y purificación de fotorreceptores o fotorreceptores conos para permitir la terapia celular o el trasplante en el ojo.

Asimismo, dado que las células del donante siempre se producen junto con otras poblaciones celulares, algunas con propiedades potencialmente perjudiciales, el traslado exitoso de este enfoque a la clínica depende del desarrollo de métodos rigurosos de selección y purificación de células. Por ejemplo, mientras que la inclusión en las preparaciones de células donantes de no fotorreceptores puede impedir o dificultar el establecimiento de la conectividad con los circuitos de la retina del huésped, la presencia de tipos celulares mitóticamente activos plantea el riesgo de formación de tumores en la retina del huésped después del trasplante.

Actualmente, no hay métodos de purificación de fotorreceptores o fotorreceptores conos disponibles que sean adecuados para uso humano, ya que los métodos actuales requieren manipulación genética para aislar las células requeridas.

Un método de purificación que incluye la selección de biomarcadores CD15-SSEA1- y CD73+ se informó previamente en modelos de ratón. Sin embargo, experimentos posteriores con tejido retiniano humano demostraron que la combinación de marcadores desarrollados en el modelo de ratón no se trasladaba directamente al sistema humano, debido, por un lado, a las diferencias en la expresión de antígenos de superficie celular entre la retina humana y la de ratón, y, por otro lado, a la expresión más ubicua de biomarcadores tales como CD73 en los cultivos heterogéneos de diferenciación de células madre humanas, en comparación con la retina fetal humana aislada.

Lakowski et al. (2011, STEM CELLS, 29: 1391-1404) describe el trasplante de células precursoras de fotorreceptores seleccionadas a través de la expresión de antígenos de superficie celular.

Lakowski et al. (2015, STEM CELLS, 33; 2469-2482) describe el trasplante de células precursoras de fotorreceptores seleccionadas a través de un panel de biomarcadores de superficie celular a partir de retina autoformada derivada de células madre embrionarias.

El documento US 2014/294778 describe fotorreceptores y progenitores de fotorreceptores producidos a partir de células madre pluripotentes.

Eberle et al. (2014, J. Vis. Exp. (84), e50932) describe el trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores purificadas por MACS en la retina de un ratón adulto.

Eberle et al. (2011, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011;52(9): 6462-6471) describe una mayor integración de precursores de fotorreceptores positivos para CD73 trasplantados en la retina de ratones adultos.

El documento EP1589097 describe el aislamiento y cultivo de una población de células fotorreceptoras conos de alta pureza y sus aplicaciones biológicas.

Sumario de la invención

A través de cribados de anticuerpos (usando BD Lyoplates) en retina fetal humana y tejido retiniano adulto, así como en cultivos de diferenciación retiniana de célula madre pluripotente humana, los inventores han identificado nuevos biomarcadores expresados en la retina. Encontraron 72 biomarcadores que marcaban células de retina fetal humana y 21 biomarcadores que marcaban poblaciones de células discretas. El comarcaje con vectores virales AAV2/9 pR2.1.GFP identificó 20 marcadores que marcan los fotorreceptores conos fetales. Utilizando estos nuevos datos, los inventores descubrieron un panel de biomarcadores de superficie celular expresados de forma endógena que pueden aprovecharse para aislar con cuidado células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos. Ejemplos de métodos de clasificación celular que se pueden utilizar para aislar las células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos incluyen la citometría de flujo (FACS) o la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS).

La ventaja de los enfoques de purificación de biomarcadores de superficie de la invención es su amplia aplicabilidad en diferentes plataformas de producción de células, compatibilidad con las "buenas prácticas de fabricación" y facilidad de uso. Ya que se basan en biomarcadores o epítopos de superficie celular endógenamente presentes, estos métodos no requieren manipulación genética de las células diana, lo cual, antes de la presente invención, era la única alternativa disponible.

Los inventores desarrollaron un panel de biomarcadores de superficie celular expresados endógenamente que se puede aprovechar para aislar con cuidado las células fotorreceptoras. Una realización preferida del panel de selección de biomarcadores de fotorreceptores comprende dos biomarcadores para la reducción celular, CD29 y CD15-SSEA1, que identifican células que no son de la población de fotorreceptores, y un marcador para la selección positiva de células fotorreceptoras que identifica células de la población de fotorreceptores, CD73.

Asimismo, los inventores desarrollaron un panel de biomarcadores de superficie celular expresados endógenamente que comprende la combinación de tres biomarcadores para la selección positiva de fotorreceptores conos (CD26, CD133 y CD147) y un biomarcador para la selección negativa (CD15-SSEA1) que se puede aprovechar para aislar con cuidado las células fotorreceptoras conos.

La muerte de las células fotorreceptoras en la retina es la causa de la pérdida de visión asociada a las enfermedades degenerativas de la retina que afectan a millones de personas en todo el mundo y, por el momento, no se puede prevenir ni revertir. Esta invención permite el aislamiento y la purificación de células fotorreceptoras o células fotorreceptoras conos a partir de poblaciones de células, tales como los sistemas de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC), así como la retina humana en desarrollo con el fin de terapia de reemplazo celular, exploración de otras aplicaciones terapéuticas, modelado de enfermedades e investigación básica.

Por tanto, la invención proporciona:

[1] Un método para identificar células fotorreceptoras en una población de células humanas, que comprende las etapas de:

a) determinar si las células de la población expresan o no CD29 o CD49 en la superficie celular; b) determinar si las células de la población expresan o no CD73 en la superficie celular; y

c) identificar una célula como célula fotorreceptora si es CD29 o CD49 negativa y CD73 positiva.

[2] Un método para identificar células fotorreceptoras conos en una población de células humanas, que comprende las etapas de:

a) determinar si las células de la población expresan o no CD29 o CD15-SSEA1 en la superficie celular; b) determinar si las células de la población expresan o no:

i) al menos dos de CD26, CD133 y CD147 en la superficie celular; o

ii) al menos dos de CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165 en la superficie celular; y

c) identificar una célula como célula fotorreceptora cono si es negativa para CD29 o CD15-SSEA1 y positiva para:

i) al menos dos de CD26, CD133 y CD147; o

ii) al menos dos de CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165.

[3] El método de [1] o [2], que comprende además:

i) cultivar la población de células antes de las etapas de identificación, para permitir la diferenciación de células a las poblaciones de fotorreceptores o fotorreceptores conos; y/o

ii) una etapa para aislar las células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos identificadas de la población de células; opcionalmente, en donde la etapa de aislamiento es por clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

[4] Una población de células fotorreceptoras conos o fotorreceptoras humanas obtenida u obtenible mediante el método de [3], en donde:

tanto CD29 como CD15-SSEA1 se utilizan como selectores negativos de células fotorreceptoras y CD73 se utiliza como selector positivo de células fotorreceptoras; y CD15-SSEA1 se utiliza como selector negativo de células fotorreceptoras conos y al menos CD26, CD133 y CD147 se utilizan como selectores positivos de células fotorreceptoras conos.

[5] La población celular humana de la invención, para su uso en terapia.

[6] La población celular humana de la invención, para su uso en trasplantes.

[7] La población celular humana de la invención, para su uso en un método para tratar la distrofia retiniana o una afección asociada a la pérdida celular o daño celular en un ojo humano.

Breve descripción de las figuras

Figura 1-Panel de biomarcadores de superficie celular para el aislamiento de células fotorreceptoras humanas. (A) Estrategia de clasificación para el aislamiento de células fotorreceptoras humanas a partir de retinas fetales y cultivos de organoides retinianos derivados de células madre pluripotentes (hPSC). Las muestras se sometieron a selección negativa doble basada en CD29/CD15-SSEA1, seguido de selección positiva por CD73 solo o junto con CD133. (B) Análisis inmunocitoquímico para marcadores fotorreceptores CRX y RECOVERIN en células clasificadas por biomarcador derivadas de retinas fetales humanas u organoides retinianos derivados de hPSC. (C-D) Sumario del enriquecimiento de fotorreceptores después de la clasificación por biomarcador. La elección negativa doble basada en FACS (CD29, CD15-SSEA1) o la selección negativa doble seguida de una selección positiva con CD73 dio como resultado un enriquecimiento significativo de los fotorreceptores humanos en comparación con las muestras sin clasificar de retinas fetales humanas (sin clasificar 23,14 % ± 13,7;

CD29/CD15-, 56,83 % ± 15,2; CD29-/CD15-/CD73+, 80,64 % ± 9,44; Media ± DT), así como cultivos de diferenciación de hPSC (sin clasificar 16,5 % ± 11,64; CD29-/CD15-, 60,82 % ± 14,8; CD29-/CD15-/CD73+, 76,9 % ±17,4). (D) panel derecho. Ki67 positivo, las células mitóticamente activas están virtualmente ausentes después de la selección negativa doble de CD29/CD15-SSEA1 en el día 100 de cultivos de diferenciación derivados de hPSC (sin clasificar 13 % 5; CD29-/CD15-, <0,1 %). Los análisis se llevaron a cabo utilizando retinas fetales que oscilaban entre 10 y 22 semanas después de la concepción (pcw) y cultivos de diferenciación de hPSC de 100 a 250 días.

Figura 2- Expresión del marcador de superficie celular en células fetales humanas marcadas con AAV2/9.pR2.1.GFP. Se disociaron muestras de retina fetal humana marcadas con el indicador AAV2.9.pR2.1.GFP y se aplicaron a paneles de cribado de lyoplate BD humanos que contenían 242 anticuerpos marcadores de superficie celular diferentes. Los criterios para los marcadores de superficie celular que marcan las células pR2.1.GFP+ve incluyeron al menos un cambio discreto del 50 % de la población celular y un pequeño cambio en las células GFP-ve. (A) La tabla muestra los 14 marcadores de superficie celular identificados para marcar células pR2.1.GFP+ve de una retina fetal humana de 17 pcw (+7DIV(días in vitro)). Los 6 marcadores de superficie celular identificados para marcar células pR2.1.GFP+ve del experimento de feto humano temprano de 12 pcw (+7DIV) también se expresaron en las muestras de retina fetal tardía. Los marcadores de superficie celular de interés incluyen CD26 y CD147 (recuadro negro), que marcan un alto porcentaje de células pR2.1.GFP+ve y una baja proporción de células GFP-ve en las muestras fetales tardías. (B) y (C) muestran las señales de la citometría de flujo de los marcadores de superficie celular que marcan las células pR2.1.GFP+ve en las muestras de retina fetal temprana y tardía. CD26 y CD147 (recuadro negro) muestran un cambio claro en las células pR2.1.GFP+ve para la etapa fetal tardía. (D) El marcador de superficie celular, CD133, también cambia discretamente las células pR2.1.GFP+ve de muestras de retina fetal humana (+7DIV) a nivel de proteína. (E) Imágenes representativas de retina fetal humana disociada (17 pcw-19 pcw) que muestran el comarcaje de células L/M-opsina+ con CD26, CD133 y CD147 (la flecha más inferior en la imagen de CD26, las flechas centrales en las imágenes de CD133 y CD147). No todas las células L/M-opsina+ve expresan los marcadores CD (la flecha más superior en cada imagen) y los marcadores CD marcan células adicionales que son negativas para la expresión de L/M-opsina (las flechas más inferiores en las imágenes de CD133 y CD147).

Figura 3. Identificación y perfilado del panel de biomarcadores de superficie de los conos en la retina fetal humana. Señales de clasificación FAC únicas representativas de marcadores de superficie de cono para L/M-opsina, (A) CD26 (2,9 % ± 1,6), (B) CD147 (63,6 % ± 12,4) y (C) CD133 (71,1 %± 7,2) en muestras de retina fetal humana (18 pcw-22 pcw; n = 4). (D-F) El recuento de células que expresan CRX y L/M-opsina doble positivas revela que un porcentaje mayor de estas células está presente en la población de marcador CD+ve para CD26 (4,9 %±2,2), CD133 (1,4 %±0,4) y CD147 (1,7 %±1,5) en comparación con poblaciones celulares sin clasificar y marcador CD-ve. Se muestran imágenes representativas de la clasificación de una retina fetal humana de 19 pcw solo con CD26, visualmente muestra el enriquecimiento de células L/M-opsina y CRX+ve en la población de células CD26+ve (G) en comparación con la población CD26-ve (H) y células sin clasificar (I). (J) La combinación de los tres marcadores de superficie celular identificados en los conos con L/M -opsina juntos para la clasificación FAC revela una población de células triple positivas dentro de la retina fetal humana (P4; n = 4). Las células retinianas (17 pwc-22 pcw) se clasificaron primero en función de los marcadores CD133 y CD26: (i) una gran proporción de las células son CD133+ve (P5; 52,3 %±7,2) y todas las CD26+ve son adicionalmente CD133+ve, lo que crea una población de células doble positivas (P3; 0,6 % ±0,3). A partir de esta población celular doble positiva, los tipos incluyen triple negativo (CD133-, CD26-, CD147-), células solo CD133+, (CD133+, CD26-, CD147-) y células triple positivas (CD133+, CD26+, CD147+). El análisis de estas tres poblaciones, además de las células retinianas sin clasificar, revela un enriquecimiento de células L/M-opsina/CRX+ en la población celular triple positiva (8,7 %±9,6) en comparación con todas las otras poblaciones celulares (K). Imágenes representativas que muestran la tinción con L/M-opsina+ve CRX+ve de una población celular sin clasificar (L) en comparación con la población celular triple positiva (CD26+/CD133+/CD147+) (M).

Figura 4-A-D Identificación y perfilado del panel de biomarcadores de superficie de conos en la retina fetal humana. (A) Señal de FACS representativa de muestras de retina fetal humana (n = 4) clasificadas con el panel de biomarcadores de superficie de conos, utilizando SSEA1 como selector negativo (Ai) y CD26, CD133 y CD147 para selección positiva (Aii-iii). El porcentaje más alto de células L/M-opsina/CRX+ve dentro de las poblaciones de células recolectadas (P7; SSEA1+, P6; CD26-CD133-CD147-/SSEA1-, P5 CD133+CD26-CD147-/SSEA1- y P4; CD26+CD133+CD147+/SSEA1-) se observó dentro de P4 (30,25 %±19,7; B). Imágenes representativas de células L/M-opsina y CRX+ve dentro de las poblaciones sin clasificar (C) y P4 CD26+CD133+CD147+/SSEA1-(D) enriquecidas.

Figura 4E-H- Aplicación del panel de biomarcadores de superficie de conos en cultivos de diferenciación retiniana derivados de hESC. Se clasificó un cultivo de diferenciación retiniana derivado de células madre embrionarias humanas disociadas (hESC) en la semana 17,5 (n = 1) utilizando el panel de biomarcadores de superficie de conos (CD26/CD133/CD147/CD15-SSEA1), que mostró señales de clasificación FAC similares a la retina fetal humana (Ei-iii). El porcentaje de células arrestina de cono (ARR3) y CRX+ve dentro de la población celular CD26+CD133+CD147+/SSEA1- mostró un enriquecimiento de conos en comparación con la población celular sin clasificar (F). Las imágenes confocales representativas muestran conos arrestina/CRX+ve dentro de las poblaciones celulares sin clasificar (G) y poblaciones celulares P4 CD26+CD133+CD147+/SSEA1-(H).

Descripción detallada de la invención

Debe entenderse que las diferentes aplicaciones de los métodos divulgados pueden adaptarse a las necesidades específicas en la técnica. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento solo tiene el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no pretende ser limitante.

Además, como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias al plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "población celular" incluye "poblaciones celulares", la referencia a "biomarcador" incluye dos o más de tales biomarcadores y similares.

A lo largo de la presente memoria descriptiva CD15, CD15-SSEA1 y SSEA1 se utilizan indistintamente para referirse al mismo biomarcador.

La presente invención proporciona un método para la identificación de fotorreceptores en una población de células humanas. La presente invención también proporciona un método para la identificación de fotorreceptores conos en una población de células humanas.

La población celular de la invención puede ser derivada de células madre pluripotentes humanas, derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos, derivada de células madre embrionarias humanas, derivada de células de retina fetal humana o derivada de poblaciones de células somáticas humanas convertidas directamente. Mertens et al 2016, por ejemplo, proporciona una definición de conversión directa. La conversión directa se puede resumir como la conversión de un tipo de célula somática a otro sin la etapa de producir células madre pluripotentes inducidas.

La población celular puede cultivarse antes de los métodos de identificación descritos. El cultivo de la población de células puede permitir la diferenciación de las células al linaje de fotorreceptores o fotorreceptores conos. Los métodos de cultivo de las poblaciones de células descritas en el presente documento son conocidos por el experto en la materia.

En los métodos de identificación de la invención, se determina que las células de una población son positivas o negativas para la expresión de determinados biomarcadores de superficie celular. Determinadas combinaciones de biomarcadores de superficie celular positivos y negativos permiten la identificación de una célula como un fotorreceptor o un fotorreceptor cono. Un biomarcador se define como un selector positivo para la identidad de fotorreceptor o fotorreceptor cono si es posible utilizar el biomarcador como un antígeno que identifica las células del linaje de fotorreceptor y fotorreceptor cono en un método de aislamiento de células en una población. Por ejemplo, un anticuerpo se une al antígeno biomarcador y permite que las células del linaje de fotorreceptores y fotorreceptores conos se aíslen y retengan.

Un biomarcador se define como un selector negativo para la identidad de fotorreceptor o fotorreceptor cono si es posible utilizar el biomarcador como un antígeno que identifica células que no son de linaje de fotorreceptor y fotorreceptor cono en un método de aislamiento de células en una población. Por ejemplo, un anticuerpo se une al antígeno biomarcador y permite que se eliminen las células que no son del linaje de fotorreceptores y fotorreceptores conos.

Por tanto, en los métodos de identificación de la invención, se determina si las células de una población expresan o no determinados biomarcadores en su superficie celular. Una célula se identifica como fotorreceptor o fotorreceptor cono si es positiva para la expresión de determinados biomarcadores de la superficie celular y negativa para la expresión de otros biomarcadores de la superficie celular.

Los biomarcadores de superficie celular utilizados como selectores negativos de células fotorreceptoras en el método de identificación de fotorreceptores de la invención incluyen CD29 (también conocido como proteína integrina beta1), CD49 o CD15-SSEA1.

En el presente documento se divulga un método de aislamiento de fotorreceptores que comprende determinar si las células de una población expresan o no CD29 y CD15-SSEA1 en la superficie celular e identificar una célula como célula fotorreceptora si es tanto CD29 como CD15-SSEA1 negativa.

Los biomarcadores utilizados como selectores positivos de células fotorreceptoras en el método de identificación de fotorreceptores de la invención incluyen CD73. En una realización preferida de la invención, se utiliza CD29 como selector negativo y se utiliza CD73 como selector positivo. En una realización especialmente preferida, tanto CD29 como CD15-SSEA1 se utilizan como selectores negativos.

Los biomarcadores de superficie celular utilizados como selectores negativos de células fotorreceptoras conos en el método de identificación de fotorreceptores conos de la invención incluyen CD29 o CD15-SSEA1. Los biomarcadores de superficie celular utilizados como selectores positivos de células fotorreceptoras conos en el método de identificación de fotorreceptores conos de la invención incluyen CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165. En el método de identificación de fotorreceptores conos de la invención, en la etapa de selección positiva, se utilizan al menos dos de CD26, CD133, CD147 o al menos dos de CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165. En una realización preferida de la invención, se utiliza CD15-SSEA1 como selector negativo y se utilizan al menos dos de CD26, CD133, CD147 o al menos dos de CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165 como selectores positivos. En una realización especialmente preferida de la invención, CD15-SSEA1 se utiliza como selector negativo y se utilizan al menos CD26, CD133 y CD147 como selectores positivos.

El método de identificación de la invención puede comprender además una etapa de aislamiento de las células fotorreceptoras humanas o fotorreceptoras conos humanos identificadas de la población de células. En una realización preferida, el método de aislamiento es por clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los métodos de aislamiento adecuados pueden implicar la unión de anticuerpos a los biomarcadores de superficie celular utilizados para identificar las células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos, utilizando dichos anticuerpos como un medio para separar los fotorreceptores o fotorreceptores conos del resto de la población de células.

El método de identificación de la invención también puede comprender etapas de cultivo de las células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos identificadas después de haber sido aisladas. Las etapas de cultivo posteriores al aislamiento pueden permitir que las células se diferencien en fotorreceptores maduros o fotorreceptores conos. Dichos métodos de cultivo de poblaciones celulares de fotorreceptores o fotorreceptores conos son conocidos por el experto en la materia.

La invención también proporciona células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos o poblaciones celulares obtenidas u obtenibles mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento.

Se divulgan poblaciones de células humanas enriquecidas en células fotorreceptoras, en donde las células fotorreceptoras constituyen al menos el 50 %, al menos el 60 % o al menos el 70 % de las células de la población, y en donde las células fotorreceptoras no han sido manipuladas genéticamente para ayudar al enriquecimiento. Por ejemplo, en el presente documento se divulgan poblaciones celulares humanas enriquecidas en células fotorreceptoras, en donde las células fotorreceptoras constituyen al menos el 80 % de las células de la población, y en donde las células fotorreceptoras no se han manipulado genéticamente para ayudar al enriquecimiento. También se divulgan poblaciones de células humanas enriquecidas en células fotorreceptoras, en donde las células fotorreceptoras constituyen al menos el 90 % de las células de la población.

Se divulgan poblaciones celulares humanas enriquecidas en células fotorreceptoras conos, en donde las células fotorreceptoras conos constituyen al menos el 20 %, al menos el 30 % o al menos el 40 % de las células de la población, y en donde las células fotorreceptoras conos no han sido manipuladas genéticamente para ayudar al enriquecimiento. Por ejemplo, en el presente documento se divulgan poblaciones de células humanas enriquecidas en células fotorreceptoras conos, en donde las células fotorreceptoras conos constituyen al menos el 50 % de las células de la población, y en donde las células fotorreceptoras conos no se han manipulado genéticamente para ayudar al enriquecimiento. También se divulgan poblaciones celulares humanas enriquecidas en células fotorreceptoras conos, en donde las células fotorreceptoras conos constituyen al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 % de las células de la población.

Las poblaciones celulares humanas enriquecidas en fotorreceptores o fotorreceptores conos de la invención se proporcionan como resultado de los métodos de la presente invención. De esta forma, los fotorreceptores o fotorreceptores conos no han tenido que ser modificados genéticamente para identificarlos y aislarlos de una población de células, es decir, no han sido modificados genéticamente para ayudar a su enriquecimiento. Antes de la presente invención, no había forma de identificar y aislar fotorreceptores humanos o fotorreceptores conos sin recurrir a la manipulación genética de las células. Por tanto, las poblaciones celulares humanas enriquecidas en fotorreceptores o fotorreceptores conos de la invención son nuevas. Asimismo, no había ninguna sugerencia en el estado de la técnica anterior a la presente invención de que las poblaciones celulares humanas enriquecidas en fotorreceptores con al menos el 80 % de pureza o fotorreceptores conos con al menos el 50 % de pureza pudieran aislarse sin modificación genética.

Las células o poblaciones celulares descritas pueden formularse con cualquier diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las células o poblaciones celulares pueden estar presentes en suspensión. Las células o poblaciones celulares pueden crecer en una estructura o sustrato.

Las células o poblaciones celulares pueden formularse con agentes farmacéuticos adicionales, incluyendo agentes inmunosupresores o factores de crecimiento. Las células o poblaciones celulares pueden combinarse con agentes conocidos por plastificar el sistema nervioso, lo que puede mejorar la capacidad de las células o las poblaciones celulares para conectarse al sistema nervioso y crecer dentro del ojo.

En el presente documento se describe un método de terapia que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de las células o poblaciones celulares descritas. También se describe un método de trasplante que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de las células o poblaciones celulares descritas. La divulgación incluye un método para tratar la distrofia retiniana o una afección asociada a la pérdida o el daño celular en un ojo humano que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de las células o poblaciones celulares descritas. Ejemplos de distrofias o afecciones retinianas incluyen: lesión o trauma de la retina, degeneración de la retina, distrofia retiniana hereditaria, retinitis pigmentosa, degeneración macular asociada a la edad y amaurosis congénita de Leber. Las células o poblaciones celulares pueden administrarse mediante inyección en el espacio subretiniano.

La población celular humana de la invención puede utilizarse en terapia. La población celular humana de la invención puede utilizarse en trasplantes. La población celular humana de la invención puede utilizarse en un método para tratar la distrofia retiniana o una afección asociada a la pérdida de células o daño celular en un ojo humano. Ejemplos de distrofias o afecciones retinianas incluyen: lesión o trauma de la retina, degeneración de la retina, distrofia retiniana hereditaria, retinitis pigmentosa, degeneración macular asociada a la edad y amaurosis congénita de Leber.

Las células o poblaciones celulares pueden ser células autólogas (derivadas del ojo que se va a tratar), células heterólogas almacenadas en un banco de células, o líneas celulares modificadas genéticamente derivadas de estas células. El número de células que se van a utilizar variará dependiendo de la naturaleza y la extensión del daño. Normalmente, el número de células utilizadas en los métodos de tratamiento o usos médicos de la invención estará en el intervalo de aproximadamente 100.000 a varios millones. El tratamiento no necesita estar restringido a una sola dosis o trasplante. Se pueden proporcionar dosis adicionales o se pueden llevar a cabo trasplantes para mejorar aún más la función.

Las células o la población de células divulgadas en el presente documento se pueden utilizar como agentes para tratar la distrofia retiniana o una afección asociada a la pérdida de células o al daño celular en un ojo humano.

Las células o la población de células divulgadas en el presente documento se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la distrofia retiniana o una afección asociada a la pérdida de células o al daño celular en un ojo humano.

No forman parte de la invención los kits para el aislamiento de células fotorreceptoras que comprenden un anticuerpo que se une a CD29 y un anticuerpo que se une a CD73. Los kits de la divulgación también pueden incluir un anticuerpo que se une a CD15-SSEA1.

No forman parte de la invención los kits para el aislamiento de células fotorreceptoras conos que comprenden un anticuerpo que se une a CD15-SSEA1, un anticuerpo que se une a CD26, un anticuerpo que se une a CD133 y un anticuerpo que se une a CD147.

Los anticuerpos presentes en los kits pueden ser específicos para proteínas humanas. Los anticuerpos presentes en los kits pueden conjugarse con agentes que ayudan en el aislamiento de células en métodos tales como MACS o FACS. Los agentes pueden ser fluoróforos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Identificación de fotorreceptores

MÉTODOS

Animales

Los ratones experimentales se mantuvieron en las instalaciones para animales del University College London y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la "Animals (Scientific Procedures) Act 1986" y "Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research". Se obtuvieron ratones receptores C57BI/6J, y C3H/HeNCrl (RD1; Pde6brd1lrd1) de 3 semanas de vida en el momento del trasplante del Charles Rivers laboratory.

Cultivo de células madre pluripotentes humanas

Todas las células madre pluripotentes se mantuvieron como se ha descrito previamente para cultivos de hESC. Se cultivaron células madre embrionarias humanas y células pluripotentes inducidas en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón irradiado en medio de células madre embrionarias (DMEM/F12 (1:1), un 20 % de suero sustituto Knockout, mercaptoetanol 0,1 mM, L-glutamina 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM y 4 ng/ml de FGF2) o en condiciones sin alimentador utilizando medios mTesR1 (Matrigel) o Nutristem (Laminin 521). Para el cultivo dependiente del alimentador, las hPSC se pasaron cada 5-6 días utilizando Dispasa y Colagenasa, y las células diferenciadas morfológicamente identificables se eliminaron mecánicamente en cada paso. Las hPSC cultivadas en mTeSR1 en sustrato Matrigel se pasaron con el reactivo RelesR, mientras que las células mantenidas en Nutristem en Laminina 521 se pasaron con 1xEDTA según lo recomendado por el fabricante.

Diferenciación retiniana de cultivos de hESC e hiPSC

El método para diferenciar las células hiPSC hacia un destino retiniano se llevó a cabo de acuerdo con un protocolo descrito previamente (Meyer et al 2009) pero con algunas modificaciones. La línea de tiempo de diferenciación y el resultado fueron aproximadamente los mismos entre diferentes líneas celulares e independientes de las condiciones de mantenimiento. Brevemente, los cultivos de hiPSC se levantaron enzimáticamente utilizando dispasa (1 mg/ml) y crecieron como agregados/cuerpos embrioides en medios de CE durante 4 días sin FGF2. A continuación, los cuerpos embrioides se transfirieron a un medio de inducción neural definido, que consistía en DMEMIF 12, suplemento de N₂ al 1 %, aminoácidos no esenciales MEM y 2 g/ml de heparina. En el día 6 de la diferenciación, se permitió que los CE se asentaran en placas de cultivo de tejidos recubiertas con laminina (6 pocillos) y permanecieron en esta configuración durante el resto del experimento. Después de 10 días después de levantar el cultivo, eran visibles dentro de los cultivos estructuras neuroepiteliales. El día 16, los cultivos donde se cambiaron a medios de diferenciación retiniana químicamente definidos que consistían en DMEM, F12 (3:1) suplementado con B27 al 1 %. En contraste con el protocolo descrito originalmente, las estructuras similares a vesículas ópticas no se levantaron cortando, sino que permanecieron en el mismo recipiente de cultivo.

Histología e Inmunohistoquímica

Las muestras de organoides retinianos o retinas fetales humanas se fijaron en una solución de formaldehído tamponada con fosfato al 4 % (p/v) a 4 °C durante 15-30 min, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se equilibraron en una solución de sacarosa al 30 % (p/v) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las muestras se transfirieron a un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (RA Lamb) y se congelaron en una suspensión de metilbutano con hielo seco. Se utilizó un criostato Leica CM1900UV para producir secciones de 18 um de espesor, que se recogieron en portaobjetos de vidrio Superfrost™ plus (VWR). Para el análisis inmunoquímico, el compuesto OCT se separó mediante una incubación de 15 min en PBS a 37 °C y las criosecciones se bloquearon con FBS al 10 % (v/v), albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % (p/v) en PBS que contenía Triton X-100 al 0,1 % (v/v) durante una hora a temperatura ambiente. Los siguientes anticuerpos primarios se utilizaron en la misma solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente de 4 °C durante la noche; Recoverina, Millipore, 1:1000; Ki67, Abcam, 1:300; C^rX (clon 4G11), Sigma, 1:1000; Pax6, Covance, 1:1000; RAX, Abcam, 1:1000; OTX2, Abcam, 1:200; BRN3b, Millipore/Upstate; 1:300; AP2a, Hybridoma Bank, 1:100.

El anticuerpo primario se omitió para los controles negativos. A la tinción del anticuerpo primario le siguió 3 lavados con 1xPBS. Posteriormente, las criosecciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario apropiado diluido en la solución de bloqueo (anti-AlexaFluor594 de conejo de cabra, Invitrogen, A-11037, anti-AlexaFluor594 de ratón de cabra, Invitrogen; todo 1:800). Hoechst 33342 (1:3000, Sigma-Aldrich) se aplicó durante 10 min a temperatura ambiente para contrateñir los núcleos, seguido de tres lavados con PBS antes de poner el cubreobjetos con el medio de montaje Citifluor AF-1 (Electron Microscopy Science).

Disociación de retinas humanas/cultivos retinianos derivados de hPSC y citometría de flujo

Se aislaron retinas humanas o cultivos retinianos derivados de hPSC (ESC o iPSC) (por ejemplo, organoides) mediante microdisección y se disociaron en una suspensión de células únicas homogénea utilizando un método enzimático basado en papaína de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Worthington Biochemical, Lorne Laboratories, Reino Unido). Los ojos humanos fetales tenían entre 12 y 22 semanas de gestación, mientras que los cultivos de diferenciación de hPSC se recolectaron el día 100 o el día 200. Las células disociadas se resuspendieron en tampón de bloqueo de citometría de flujo (BSA al 1 %, PBS) y se mantuvieron en hielo durante 30 min. Posteriormente, se agregaron anticuerpos de flujo monoclonal conjugados a las muestras (1*106 células en 100 ml) y se incubaron durante 1 h, protegidos de la luz. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales para el análisis FACS (LSRII) y la clasificación FAC (BD FACS ArialII) según lo recomendado por el proveedor: CD73-PECy7, BD; CD133-PE, Miltenyi; CD29-BV510, BD; SSEA-1APC, BD; CD90-APC, BD; CD9-APC, BD; CD200-V450; CD49f-BV650; EGFR1-PE, BD; GD2-PE, BD; CD184-PE, BD; SSEA-4-PerCP-Cy5.5. Después de teñir, las células se centrifugaron a 300 xg durante 5-10 min a 4 °C y se resuspendieron en tampón de bloqueo de FACS y se mantuvieron en hielo hasta su uso. Las ventanas de FACS se definieron de acuerdo con los controles de isotipo cuando estaban disponibles y se analizaron más de 10.000 células. Las compensaciones se aplicaron utilizando el programa informático Bd FACSDiva utilizando muestras de control teñidas individualmente. Los datos presentados son de al menos 3 réplicas independientes.

Inmunocitoquímica en células de retina fetal y derivadas de células madre pluripotentes humanas disociadas y clasificadas por FAC

Se disociaron cultivos retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas (ESC o iPSC) o retinas humanas fetales (12-22 semanas de gestación) y se clasificaron a través de un panel de biomarcadores como se ha descrito anteriormente. Las células posteriores a la clasificación se centrifugaron a 300 xg durante 15 min a 4 °C y se sembraron en portaobjetos de cámara recubiertos con polilisina/laminina (Labtec) y se permitió que se adhirieran durante 30 min a 37 °C. A continuación, las cámaras se lavaron una vez con PBS y las células adherentes se fijaron con PFA al 4 %/PBS durante no más de 10 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS, las muestras se bloquearon en FBS al 10 %, BSA al 1 %/Pb S que contenía Triton X-100 al 0,1 % (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente. La solución de bloqueo se reemplazó con una solución de tinción que contenía anticuerpo primario en FBS al 10 %, BSA al 1 %/PBS (Triton X-100 al 0,1 % (v/v)). El anticuerpo primario se omitió para los controles negativos. Finalmente, las cámaras con células adherentes se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo (Invitrogen, anti-AlexaFluor594 de conejo de cabra; anti-488 de ratón de cabra) y contratinción durante 5 min con DAPI (Sigma-Aldrich). El porcentaje de células positivas en los grupos experimentales se estableció mediante la función de contador de células, utilizando escaneos de mosaicos confocales; se contaron > 100 células de 3 réplicas biológicas para cada condición.

Cribado de anticuerpos

Los organoides retinianos derivados de feto humano, adulto post-mortem y de hPSC el día 90 se recogieron y se disociaron en suspensiones de células únicas como se ha descrito anteriormente. Para los cribados con lyoplate BD, los inventores siguieron las recomendaciones de los fabricantes. Todas las etapas de centrifugación se llevaron a cabo a 300 xg durante 5 min a 4 °C. Después de la disociación, las células retinianas se resuspendieron en tampón de tinción de BD FACS y se ajustaron a una concentración celular de 10 millones de células por 1 ml, seguido de la transferencia de las células a placas de 96 pocillos de fondo redondo (BD Falcon, N.° de Cat. 351177). A continuación, se añadieron a las células 20 μl de solución de anticuerpo primario reconstituido, se mezclaron e incubaron en hielo durante 30 minutos. A esto le siguieron varias etapas de lavado con tampón de tinción FACS (BD Pharmingen) después de lo cual las células se incubaron durante 30 minutos con el anticuerpo secundario biotinilado apropiado. Después de varios lavados, se añadieron 100 μl de Alexa Fluor® estreptavidina 647 (1:4000, 0,5 ug/ml) a cada pocillo que contenía células teñidas con los anticuerpos secundarios biotinilados y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 30 min. A continuación, las células teñidas se lavaron 3 veces y se analizaron en un BD FACSCalibur. Se recolectaron al menos 30.000 eventos para el análisis utilizando el programa informático FACSDiva.

Microscopía, adquisición de imágenes y procesamiento

Se utilizó un Zeiss LSM710 (Zen2009, Zeiss) para la adquisición de imágenes confocales. Las imágenes se procesaron en Zen2009 (Zeiss), Photoshop CS4 (Adobe), Illustrator CS4 (Adobe) y FIJI. El análisis de doble marcaje se llevó a cabo en Adobe Photoshop CS4.

Análisis de transcripción por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR)

El ARN total se extrajo de poblaciones celulares humanas sin clasificar o clasificadas por FAC utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Reino Unido). Se llevó a cabo una digestión de ADN en columna para eliminar todas las trazas de ADN genómico de las muestras. Tras la cuantificación del ARN total utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, se generó ADNc por medio de M-MLV-transcriptasa inversa (Promega, EE. UU.). Los niveles de expresión génica se establecieron para biomarcadores candidatos seleccionados utilizando reactivos y sondas de PCR Taqman de Applied Biosystems en un sistema de PCR en tiempo real 7500 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los datos de expresión génica se normalizaron utilizando GAPDH como referencia. El programa informático ABI 75002.0.1. se utilizó para calcular los valores medios de RQ, así como RQmin y RQmáx como medidas de variación.

RESULTADOS

Identificación de biomarcadores de superficie celular expresados en la retina humana madura y en desarrollo y cultivos de organoides derivados de hPSC

Los inventores buscaron identificar un conjunto útil de biomarcadores CD (grupo de diferenciación) humanos para el aislamiento de fotorreceptores humanos aprovechando retinas fetales (9, 12, 14 y 17 semanas de gestación) y adultas post-mortem. Cribaron tejido retiniano completo disociado frente a 242 anticuerpos de CD humanos bien caracterizados utilizando el sistema BD lyoplate como una plataforma de cribado de alto rendimiento de citometría de flujo. Encontraron 46 biomarcadores que se expresaron en retinas humanas en las diversas fases investigadas que mostraban un marcaje sustancial y sólido, incluyendo muchos que delineaban poblaciones celulares particulares, lo que sugería que eran específicas del tipo de célula o de la fase. Algunos de estos marcadores pueden ser útiles para el aislamiento de células no fotorreceptoras. En este caso, centraron sus esfuerzos en identificar biomarcadores únicos o combinados útiles para el enriquecimiento de fotorreceptores conos y bastones.

Generación de organoides retinianos utilizando cultivos de hPSC

Las retinas fetales y adultas humanas legales son la fuente de tejido de referencia para estudiar el desarrollo del sistema visual en el contexto humano. Ya que la calidad fisiológica de estas muestras puede ser variablemente problemática debido a la naturaleza del procedimiento de recolección de tejido (interrupción o post-mortem), los cultivos de organoides retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas representan un sistema modelo útil para generar tipos de células retinianas humanas en un marco de tiempo consistente con el desarrollo retiniano normal, y también proporcionan una fuente celular aplicable para la terapia de reemplazo celular.

Para este estudio, los inventores produjeron organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un protocolo de diferenciación descrito previamente con alguna modificación (Meyer et al 2009). Los organoides retinianos podrían generarse a partir de sistemas de cultivo tanto dependientes del alimentador como sin alimentador con una eficacia comparable.

Después de 3 semanas de diferenciación, las estructuras similares a vesículas ópticas (VO) se hicieron visibles dentro de los cultivos y la pigmentación comenzó a aparecer en las células circundantes que crecieron adheridas al recipiente de cultivo. A las 8 semanas de cultivo, las VO mostraron signos de laminación interna y una fuerte pigmentación ahora estaba muy extendida en la placa de cultivo. El análisis de transcripciones reveló que muchos de las piezas clave del compromiso retiniano, tales como PAX6, VSX2, MITF y SIX6, se expresaron fuertemente en los cultivos de diferenciación. Además, también se detectaron sólidamente marcadores de diferenciación de fotorreceptores, por ejemplo, CRX, RECOVERIN y OTX2 tanto a nivel de transcrito como de proteína. Los precursores de fotorreceptores que expresan CRX/RECOVERIN poblaron los lados externos de los organoides retinianos en este sistema de cultivo, mientras que las células amacrinas que expresan AP2a y las células ganglionares positivas para BRN3b se limitaron a la superficie interna de las estructuras. Si bien los tipos celulares de la retina a menudo se organizaban en organoides laminados, una proporción sustancial de fotorreceptores y otras neuronas retinianas se ubicaron en parches en toda la placa de cultivo, a menudo rodeado de células epiteliales pigmentadas de la retina.

Enriquecimiento de células fotorreceptoras de cultivos de organoides derivados de hPSC utilizando biomarcadores de superficie celular

Con el fin de identificar biomarcadores humanos útiles para el enriquecimiento de fotorreceptores a partir de fuentes de células madre humanas, los inventores ensayaron marcadores candidatos identificados en el cribado de anticuerpos utilizando la plataforma de diferenciación retiniana hPSC mencionada anteriormente. Centraron sus esfuerzos en los biomarcadores que habían mostrado patrones de tinción sólidos de poblaciones de células retinianas bien delineadas, ya que los inventores razonaron que los marcadores expresados de manera demasiado amplia o demasiado estrecha no tendrían el efecto de enriquecimiento deseado. De los 16 marcadores candidatos considerados (GD2, CD29, SSEA-1, SSEA-4, CD9, CD73, CD133, EGFR, CD90, CD200, CD49f, CD147, CD184, CD107b, CD321, CD142), ninguno mostró propiedades de enriquecimiento de fotorreceptor en su enfoque de cribado basado en clasificación FAC cuando se utilizó solo y para selección positiva. Curiosamente, CD73, un biomarcador previamente descrito por los inventores (Lakowski et al 2011), y otros (Eberle et al 2011, Eberle et al 2012), como una buena herramienta para el aislamiento de fotorreceptores bastones en el sistema de ratón, no fue eficaz para este fin que utilizaba cultivos de diferenciación retiniana derivados de hPSC. De hecho, la selección positiva con CD73 dio como resultado una reducción significativa de los fotorreceptores en las condiciones de diferenciación en comparación con la muestra sin clasificar (2,7 %±5,3 y 16,5 %±11,6, respectivamente). De igual manera, la clasificación FAC para CD133, otro biomarcador con expresión conocida en los fotorreceptores, no produjo un mayor número de fotorreceptores después de la selección (CD133+: 19,6 % ± 21; CD133-; 15 %±14).

Sin embargo, los inventores notaron que varios biomarcadores, incluidos CD29 y SSEA-1, enriquecieron significativamente células que expresan CRX/RECOVERIN en sus fracciones de células negativas después de la clasificación FAC (49,3 %±18 y 35,6 %±21, respectivamente, frente al 16,5 %±11 de células sin clasificar, n>9) (Figura 1). Mientras que CD29 siempre marcó la mayoría de las células en el sistema de diferenciación, la expresión de SSEA-1 fue más dinámica y se expresó en el 30 % de las células en el día 100 de diferenciación y solo en el 2 % de las células en el día 200, explicando las propiedades superiores de enriquecimiento de fotorreceptores mostradas por la selección de células negativas utilizando CD29. Utilizando el análisis FACS, los inventores observaron que mientras que las células que expresan SSEA-1 se marcaron conjuntamente en gran medida con CD29, una fracción de células positivas para SSEA-1 fueron consistentemente negativas para CD29, indicando una población celular distinta. Por lo tanto, a continuación, los inventores ensayaron si la combinación de CD29 y SSEA-1 para la selección de células doble negativas utilizando la clasificación FAC conduciría a un enriquecimiento sólido de fotorreceptores positivos para CRX/RECOVERIN a partir de cultivos de organoides retinianos. Utilizando este enfoque, los inventores observaron un mayor enriquecimiento de fotorreceptores en la población de CD29-/SSEA-1 (60,8 %±14). Por otro lado, las fracciones de células doble positivas CD29/SSEA-1 estaban significativamente desprovistas de fotorreceptores en comparación con las muestras sin clasificar (6,1 %±6 frente a 16,5 %±11).

Por último, los inventores plantearon la hipótesis de que, mientras que CD73 por sí solo no pudo aumentar los rendimientos de los fotorreceptores, la combinación con la selección doble negativa basada en CD29/SSEA-1 puede aumentar el enriquecimiento de fotorreceptores a partir de cultivos de diferenciación de células madre. Los inventores encontraron que el 0,1-1,5 % de la población celular en el día 100 y 200 mostró un perfil CD29-/SSEA1-/CD73+, donde las células positivas para CD73 constituyeron el 5 % y el 35 % de la población celular total en los días 100 y 200, respectivamente. La adición de la etapa de selección positiva utilizando CD73 (CD73+/CD29-/SSEA1-) al protocolo de purificación, produjo un mayor enriquecimiento de fotorreceptores (77 %±17) en comparación con CD29 solo (49,3 %±18), pero no significativamente superior a la selección doble negativa CD29-/SSEA-1-(60,8 %±14), lo que da una fracción celular ya muy enriquecida en fotorreceptores. El modo de selección de células que utilizó los tres biomarcadores dio como resultado rendimientos inferiores de células positivas para CRX/RECOVERIN que la selección doble negativa CD29-/SSEA-1, ya que el número de fotorreceptores que expresan CD73 (CD73+/CD29-/SSEA1-) fue bajo en el sistema de cultivo en las fases ensayadas, consistente con una fase menos madura de diferenciación de fotorreceptores (Figura 1).

Verificación de biomarcadores candidatos en la retina humana madura y en desarrollo

Los inventores también ensayaron los biomarcadores candidatos en cuanto a su capacidad para enriquecer fotorreceptores inmaduros a partir de tejido retiniano humano fetal de 10 a 22 semanas de gestación. A diferencia del sistema de cultivo de organoide derivado de hPSC, ni la selección negativa de CD29 ni de SSEA-1 por sí sola dio como resultado un enriquecimiento significativo de fotorreceptores positivos para CRX/RECOVERIN después de la clasificación FAC (14,6 %±2,2 y 13,6±1,7, respectivamente, frente a 23,1±13 sin clasificar). Por el contrario, la clasificación FAC para CD73 enriqueció significativamente las células fotorreceptoras, aunque marcó menos del 5 % de las células de la retina durante el período de desarrollo de 10 a 22 semanas (56,6 ± 30). Al igual que en el sistema de diferenciación hPSC, la selección doble negativa CD29-/SSEA-1- con o sin selección positiva CD73+ adicional produjo mayores rendimientos de fotorreceptores de esta fuente de células. La combinación de los tres biomarcadores fue superior en términos de enriquecimiento de células fotorreceptoras en comparación con la selección doble negativa utilizando solo CD29/SSEA-1 (80,6±9 frente a 56,8±15, respectivamente), aunque se redujeron las eficacias generales de rendimiento celular (Figura 1).

Eliminación de células mitóticamente activas a través de la selección de biomarcadores

La inclusión de poblaciones de células proliferativas tales como células madre pluripotentes no diferenciadas o células progenitoras en preparaciones celulares para aplicaciones de terapia celular presenta un alto riesgo de seguridad debido a su capacidad para dividirse rápidamente y formar tumores en el espacio subretiniano de los pacientes después del trasplante. Por lo tanto, es importante que cualquier estrategia de selección de células deba garantizar que estas células se eliminen antes del trasplante en pacientes con distrofia retiniana, no solo para excluir el riesgo de formación de tumores, sino también para facilitar mejor la conectividad sináptica de los fotorreceptores del injerto con las células bipolares del huésped. Los inventores ensayaron la capacidad del panel de biomarcadores humanos para eliminar células mitóticamente activas de cultivos de organoides de hPSC en el día 100 de diferenciación. En estos experimentos, el 13,6 %±5 de células en los cultivos de diferenciación se tiñeron positivas para Ki67, un marcador de células en división activa que eran mutuamente exclusivos con el marcador fotorreceptor CRX (Figura 1D). La clasificación FAC utilizando solo la selección doble negativa para CD29/SSEA-1 fue suficiente para eliminar el 98 % (0,29 %±0,19) de las células mitóticas de la suspensión celular, mientras que las células restantes expresaron casi en su totalidad el factor de transcripción CRX. Estos datos muestran que las células mitóticamente activas se pueden eliminar de manera eficaz de las preparaciones de células de donantes derivadas de hPSC, antes del trasplante, mediante el uso de la combinación de biomarcadores de superficie celular fotorreceptora para la selección celular negativa.

CONCLUSIONES

La selección de solo CD73+ no alcanza niveles de pureza suficientes (véase la Figura 1). Además, la selección de CD15- conocida también está limitada ya que el nivel de expresión de CD15 es modesto y disminuye con la madurez de las muestras, mientras que el nuevo marcador CD29 marca la mayoría de las células en todo momento. Los datos muestran que CD29 es el principal impulsor del enriquecimiento de fotorreceptores cuando se utiliza para la reducción celular, y la combinación con SSEA-1 como segundo selector negativo o con CD73 para la selección positiva confiere una mayor pureza de fotorreceptores, aunque con rendimientos generales inferiores.

El nivel de pureza de las células fotorreceptoras alcanzado para las células humanas es adecuado para su aplicación clínica: 80,64 %±9,44 (media±DT).

Los inventores también han demostrado que las células donantes clasificadas por biomarcadores aisladas de cultivos de organoides derivados de hPSC sobreviven después del trasplante subretiniano en retinas de ratón mutante RD1 y de tipo silvestre.

Ejemplo 2

Identificación de fotorreceptores conos

MÉTODOS

Preparación de tejido fetal humano

Los ojos fetales humanos se obtuvieron del "Wellcome Trust and Medical Research Council Funded Human Developmental Biology Resource" (http://www.hdbr.org/). Los ojos de adultos humanos se obtuvieron de Moorfields BioBank.

Cultivos de explantes de retina fetal humana

Se disecaron ojos fetales humanos en condiciones estériles y se separó todo el tejido ocular para obtener la retina. La retina fetal humana intacta se cultivó en flotación libre en placas de 12 pocillos con medios de diferenciación retiniana (RDM) que contenían DMEM-F12, Glutamax, 1 * N₂, 1 * B27 suplementos neurales (Invitrogen), FBS al 10 % (Invitrogen) y 1,5x penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Los medios de cultivo celular se cambiaron cada 2 días.

iPSC mantenimiento y diferenciación retiniana

Las iPSC humanas se cultivaron en placas de 6 pocilios en gelatina con una capa de fibroblastos embrionarios de ratón irradiado (IRR MEF; GlobalStem; 150.000 |Rr MEF por pocillo) y se pasó utilizando un tratamiento enzimático de colagenasa y dispasa. El medio de suero sustituto Knockout (KSR) con 4 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico (FGF) se reemplazó todos los días. La diferenciación retiniana de iPSC se basó en el protocolo desarrollado por el laboratorio Gamm laboratory (Meyer et al., 2009) pero sin levantar las estructuras de vesículas ópticas. Brevemente, las iPSC se levantaron el Día 0 y se transfirieron a matraces T25 que contenían medio KSR sin FGF para inducir la formación de cuerpos embrioides (CE). El medio se cambió diariamente antes de sustituirlo por medio de inducción neural (NIM) que contenía DMEM/F12 1:1 (Gibco), aminoácidos no esenciales MEM el Día 4. Para promover la formación de rosetas neurales, los CE se transfirieron a placas recubiertas con laminina (30 %) en NIM el Día 6. Los CE normalmente se unían a placas recubiertas de laminina y formaban rosetas neurales el Día 8/9. A continuación, los cultivos se alimentaron cada 2 días con NIM hasta el Día 16, donde los medios se sustituyeron por medios de diferenciación retiniana (RDM). La estructura de la vesícula óptica fue visible desde el Día 18-20 en adelante y el medio se cambió cada 2-3 días. Se agregó FBS a los cultivos en la semana 14 para los cultivos en etapa tardía.

Producción y aplicación de AAV2/9.pR2.1:GFP

Las células 293T se cultivaron en medio D10 que contenía DMEM+Glutamax, FBS al 10 % y 1 * penicilina/estreptomicina en placas de 150 cm y cultivadas hasta un 80 % de confluencia. Maxiprep pd10-ML-eGFP, vector auxiliar pHGT1, la cápside de AAV2/9 se sometieron a transfección en células 293T utilizando polietilenimina (PEI) en DMEM y se cultivó durante 24 horas. Después de 72 horas, las células transfectadas se recogieron y se sometieron a cuatro ciclos de descongelación-vórtice-congelación para liberar el virus. El lisado de virus se sometió a tratamiento con benzonasa y se preparó para purificaciones a través de múltiples etapas de centrifugación y filtración secuencial con filtros de 5 μm, membranas de PES de 0,45 μm y 0,22 μm. El virus se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico y se concentró utilizando un concentrador Vivaspin 4. El título genómico viral se determinó a través de qPCR y el título viral utilizado en este estudio osciló entre 1,48*1013-1,01*1014.

Se agregó virus a explantes de retina fetal humana y cultivos de diferenciación de retina derivados de iPSC a una MOI entre 40.000 y 45.000 en un volumen mínimo de medio (250 μl para explantes fetales y 1 ml para cultivos de retina derivados de iPSC) y se cultivaron durante la noche. Se agregó medio de cultivo adicional después de 12 horas y se reemplazó por completo después de 36 horas de cultivo. Se cultivó tejido humano durante 7 días en total, con medios reemplazados cada 2 días.

Secuenciación de ARN

Para el ARN, el tejido retiniano se procesó con el kit de extracción de ARN mirVana de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A continuación, las muestras se analizaron en el Bioanalyser o Tapestation para evaluar la concentración y la calidad del ARN. Todas las muestras de ARN se amplificaron con el kit de ARN de entrada ultra baja SMART-Seq v4 (Clontech Laboratories) y las genotecas de ADNc se prepararon con el kit de preparación de genotecas de ADN Nextera XT (Illumina). La calidad del ADNc se evaluó con Qubit y se normalizó antes de la secuenciación con el sistema Illumina NextSeq500; se realizó una profundidad de secuenciación de 17 millones de lecturas de final emparejado de 43 pb para todas las muestras. Los archivos FASTQ que contenían datos de secuenciación de ARN sin procesar se alinearon con la herramienta de alineación Illumina RNA Seq STAR (versión 1.1.0) para hacer referencia al genoma hg 19, para generar archivos BAM, que fueron importados a NGS Strand. Todas las muestras se normalizaron con el método DeSeq dentro de NGS Strand y todos los datos de secuenciación de ARN se completaron con el mismo programa informático.

Histología e Inmunohistoquímica

Para la criosección, todo el ojo humano sin el cristalino se fijó durante la noche a 4 °C en PFA al 4 %, antes de lavar tres veces con solución salina tamponada con fosfato y equilibrar en una solución de sacarosa al 30 % (p/v) para la crioprotección a temperatura ambiente hasta que se hundan los ojos. A continuación, las muestras se incrustaron en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) y se orientaron, antes de congelar en una suspensión de hielo seco con metilbutano. Se cortaron secciones de tejido a un grosor de 12-16 μm utilizando el criostato UV Leica CM1900 y se recogieron en portaobjetos de vidrio SuperfrostTM plus (VWR). Para la inmunohistoquímica, las secciones de retina se lavaron en PBS durante 10-15 minutos a 37 °C para eliminar el compuesto OCT y se incubaron en una solución de bloqueo (10 % de suero de cabra o feto bovino, 1 % de albúmina de suero bovino en PBS con Triton X-100 al 0,1 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Se omitió el anticuerpo primario para las secciones de control negativo. Las secciones se lavaron tres veces en PBS durante 5 minutos, antes de aplicar el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron 3 veces con PBS durante 5 minutos antes de la incubación con DAPI (1:3000) a temperatura ambiente durante 3-5 minutos, que permite la visualización de núcleos celulares. Las secciones se lavaron nuevamente en PBS, antes de aplicar con medio de montaje Citifluor AF-1 y 1,5 cubreobjetos. El mismo procedimiento de inmunotinción se realizó con retina fetal completa, sin embargo, las muestras flotaron libremente durante todo el procedimiento, antes de ser transferidas a portaobjetos de microscopio para obtener imágenes.

Inmunocitoquímica

Las células retinianas se fijaron en PFA al 4 % durante 5 minutos a 37 °C antes de incubar otros 15 minutos en PFA al 2 %/sacarosa al 30 % a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces en PBS y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en BSA al 1 % (p/v) en PBS. Se añadieron anticuerpos primarios (L/M-opsina, Millipore, 1:400, CRX, Abcam, 1:800; arrestina de cono, Novusbio, 1:100) a las células y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la tinción de marcador CD (CD26 conjugado con PE, 1:500, BD Biosciences; CD133 conjugado con PE- Vio770, 1:500, Miltenyi Biotec; CD147 conjugado con PerCP-Cy5.5, clon 1:500, BD Biosciences) en células disociadas, se omitió Triton X-100 de la solución de bloqueo. Las células se lavaron tres veces en PBS y se incubaron durante una hora más con anticuerpos secundarios (anti-AlexaFluor 594 de conejo de cabra o anti-488 de ratón de cabra, Invitrogen, 1/800). El procedimiento de incubación y montaje de DAPI se realizó como se ha descrito previamente en la sección de inmunohistoquímica.

Disociación de muestras de retina vivas y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células retinianas fetales marcadas con AAV2/9.pR2.1:GFP

El tejido humano fue disociado utilizando el sistema de disociación de papaína (Worthington Biochemical, Lorne Laboratories, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los explantes de retina humana fetal electroporados o infectados con construcciones indicadoras de cono se disociaron mediante el método de disociación con papaína y se resuspendieron en 500 μl de suero bovino fetal al 1 % (FBS)/DMEM. Se añadió DAPI a las muestras antes de la clasificación para permitir la determinación de la población de células vivas. El clasificador de células MoFlo XDP (Beckman Coulter) se utilizó para aislar células GFP+ vivas, las cuales fueron recolectadas en 3 ml de 50 % de FBS/DMEM. A continuación, las células se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos a 4 °C y se extrajo el ARN.

Protocolo del panel de cribado de lyoplate BD

Las muestras de retina se disociaron utilizando el kit de disociación de papaína como se ha descrito previamente y se resuspendieron en tampón de tinción BD Pharmingen EDTA. A continuación, se siguió el protocolo del proveedor para completar los experimentos de lyoplate. El número recomendado de células para el análisis de citometría de flujo es de 500.000 a 1.000.000 de células por pocillo, sin embargo, los inventores pudieron realizar significativamente menos. Todas las etapas de lavado del protocolo implicaron la adición de 100 μl de tampón de tinción BD Pharmingen EDTA y la centrifugación a 300 xg durante 5 minutos. A continuación, se repitió esta etapa, pero con 200 μl de tampón de tinción BD Pharmingen EDTA.

Las células se dividieron en alícuotas en 3x placas de 96 pocillos de fondo redondo (100 μl por pocillo). Los anticuerpos primarios del panel de cribado de lyoplate se reconstituyeron en 1x PBS y, a continuación, se añadieron 20 μl de cada anticuerpo a las células y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Se omitió el anticuerpo primario para el control negativo y se asignaron pocillos para el control positivo de IgG/IgM. A continuación, se lavaron las células, se resuspendieron en 100 μl de solución de anticuerpo secundario y se incubaron en hielo durante 30 minutos en oscuridad. Posteriormente, las células se lavaron y centrifugaron antes de ser resuspendidas en 150 μl de tampón de tinción BD Pharmingen EDTA. A continuación, las muestras se analizaron con el BD FACSCabilur. Se recopilaron entre 15.000 y 20.000 eventos por pozo y los resultados se analizaron con el programa informático FlowJo.

Citometría de flujo y FACS

Para la clasificación del marcador CD de cono, las células se recontaron y se resuspendieron en una solución de bloqueo a una concentración de 1*106 células por 100 μl. Después de incubar las células durante 1 hora en hielo, los anticuerpos conjugados (CD26 conjugado con PE, clon m-a261, BD Biosciences; CD133 conjugado con PE-Vio770, clon 293c3, Miltenyi Biotec; CD147 conjugado con PerCP-Cy5.5, clon HIM6, BD Biosciences) o controles de isotipo se agregaron a las células utilizando las recomendaciones del fabricante y se incubaron durante 1 hora más en hielo en oscuridad. Posteriormente, las células se centrifugaron a 200 xg durante 5 minutos a 4 °C, antes de lavar en PBS y resuspender en solución de bloqueo para su clasificación. El clasificador de células MoFlo XDP (Beckman Coulter) se utilizó para aislar células, que se recogieron en medios 50 % de FBS/DMEM. Se utilizaron controles de isotipo y sin teñir para establecer las ventanas y aplicar la compensación necesaria. Después de la clasificación, a continuación, las células se centrifugaron a 300 xg durante 15 minutos a 4 °C y las células para inmunocitoquímica se sembraron en placas en portaobjetos de cámara de poli-L-lisina (Sigma) y laminina (Sigma) recubiertos previamente a una densidad celular de 150.000-200.000 células. Para las poblaciones en las que se había obtenido un pequeño número de células, todas las células se sembraron en placa.

Microscopía y procesamiento de imágenes

La tinción de inmunofluorescencia se analizó utilizando Axiovert 135 (Zeiss) con una cámara digital ProgRes C14 utilizando el programa informático OpenLab (PerkinElmer Life). Las imágenes de campo claro y fluorescentes se capturaron utilizando un microscopio invertido Olympus IX71 (Carl Zeiss, Jena, Alemania) con una cámara digital Hamamatsu ORCA-ER (Hamamatsu Corp., Bridgewater, Nueva Jersey). Se capturaron imágenes de campo claro de cultivos de diferenciación retiniana utilizando el sistema de imagen XL Core EVOS® (Life technologies). Se adquirieron imágenes de proyección Z-28 de secciones de retina y montajes completos utilizando el Zeiss LSM710 (Zen2009, Zeiss). Las imágenes se procesaron utilizando Zen2009 (Zeiss), ImageJ e Illustrator CS6 (Adobe).

RESULTADOS

Identificación de marcadores de superficie celular expresados en conos con L/M opsina humanos

Los inventores definieron la aparición progresiva de conos humanos que expresan L/M-opsina en la retina fetal humana y la escasez de marcadores de conos humanos tempranos y buscaron aislar y caracterizar el transcriptoma completo de estas células. Utilizaron un sistema de virus adenoasociado (pseudotipo 2/9) para administrar una construcción indicadora de GFP impulsada por el promotor pR2.1 previamente caracterizado a muestras de retina fetal humana para etiquetar fotorreceptores conos con L/M opsina. El promotor pR2.1 consiste en una región de control de locus (LCR) altamente conservada y regiones potenciadoras adicionales que se encuentran en dirección 5' de los genes de opsina L y M ubicados en el cromosoma X en una matriz en tándem (Nathans et al., 1989, Wang et al., 1992). Se ha demostrado previamente que el promotor pR2.1 impulsa la expresión del indicador específico en los fotorreceptores conos con L/M-opsina de la retina canina (Komaromy et al., 2008) y de rata (Li et al., 2008), pero también dentro de los conos con S-opsina de la retina del ratón (Wang et al., 1992, Fei y Hughes, 2001).

Las criosecciones de explantes de retina de 12 pcw y 14 pcw (+7 DIV) revelaron las células marcadas con la construcción AAV2/9.pR2.1.GFP de la ONL, que comarcan específicamente con la L/M-opsina. Estas células también fueron positivas para el marcador de fotorreceptor, marcadores específicos de conos tempranos, RXRG, pero fueron negativos para S-opsina y NR2E3, marcadores de S-conos y fotorreceptores bastones y el marcador de proliferación Ki67, lo que indica la especificidad del virus indicador para las células de cono con L/M-opsina posmitóticas.

Los inventores marcaron muestras de retina fetal humana temprana (n = 4) y tardía (n = 4) con el virus AAV2/9 pR2.1:GFP y utilizaron clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar células GFP+ve y GFP-ve para secuenciación de ARN para identificar los genes altamente expresados y enriquecidos del transcriptoma del cono con L/M-opsina humano.

Los datos de la secuenciación de ARN generados se utilizaron para identificar los marcadores de superficie celular de los conos en desarrollo, ya que estos proporcionan herramientas para mejorar la generación, identificación y purificación de fotorreceptores conos humanos. Se analizaron conjuntos de genes significativamente regulados al alza de muestras de GFP+ve fetales humanas utilizando herramientas bioinformáticas, que revelaron 31 marcadores de superficie celular potenciales expresados en las células GFP+ve fetales tardías. Los inventores también buscaron directamente dentro de este conjunto de genes marcadores CD conocidos. Este análisis identificó marcadores CD y no marcadores CD, marcadores de superficie celular potenciales.

Además del análisis transcriptómico para marcadores de superficie, los inventores utilizaron un enfoque proteómico para evaluar qué genes de marcador CD dieron lugar a epítopos, que pueden ser reconocidos por anticuerpos monoclonales. Los inventores cribaron 242 anticuerpos de marcador CD diferentes que podrían expresarse en conos fetales con L/M-opsina humanos mediante la aplicación de retinas fetales humanas de 12 pcw y 17 pcw marcadas con el indicador AAV2/9 pR2.1.GFP en paneles de cribado de anticuerpo-antígeno de alto rendimiento BD lyoplate.

Los inventores definieron la detección de marcadores CD que marcan células pR2.1 GFP+ve como: i) marcaje de al menos el 50 % de la población de células pR2.1 GFP+ve y; ii) provoca un cambio discreto de las células pR2.1 GFP+ve. Este método de cribado reveló 6 marcadores CD que cambiaron la población de células pR2.1.GFP+ve de 12 pcw (CD57, CD47, CD59, CD151, CD200, CD98; Figura 2^a y B), mientras que se descubrieron 14 marcadores CD marcando células pR2.1.GFP+ve de 17 pcw (CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD26, CD147, CD120a, CD81, CD49c, CD90, CD165; Figura 2A y C).

Todos los marcadores CD presentes en la población de células pR2.1.GFP+ve de 12 pcw se expresaron en las células pR2.1.GFP+ve de 17 pcw, sin embargo, estos marcadores parecían marcar la mayoría de las poblaciones celulares tanto GFP+ve como GFP-ve. Se detectaron marcadores adicionales en la muestra fetal tardía, lo que sugiere que la expresión de marcadores CD expresados en conos aumenta durante el desarrollo (Figura 2A).

Especialmente, algunos de estos marcadores CD mostraron una mayor especificidad para las células marcadas con pR2.1.GFP en los puntos de tiempo fetales tardíos, es decir, marcaje de un porcentaje mayor de células GFP+ve y un porcentaje inferior de células GFP-ve, que incluyen los marcadores CD26 y CD147 (Figura 2A y C; recuadros negros). Ambos marcadores mostraron un marcaje discreto y un cambio de la población de células pR2.1.GFP (CD26 GFP+ve 73.3 %, GFP-ve 6,83 %; CD147 GFP+ve 68,9 %, GFP-ve 39,6 %), en comparación con otros marcadores tales como CD81 y CD49c que, aunque muestran marcaje de células pR2.1.GFP, no provocan un cambio discreto (Figura 2C). CD26 y CD147 se regularon al alza en las células fetales tardías marcadas con pR2.1.GFP a partir de los datos de secuenciación de ARN total.

Los datos de citometría de flujo revelaron Prominina-1 (CD133), que apareció en los genes significativamente regulados al alza de los datos del transcriptoma pR2.1.GFP+ve fetal humano tardío y se ha utilizado previamente en un panel de biomarcadores en la retina de ratón para aislar células fotorreceptoras (Lakowski et al 2015), también cambia sólidamente células pR2.1.GFP de 13 pcw y 14 pcw a nivel de proteína (Figura 2D).

A partir de estos conjuntos de datos transcriptómicos y proteómicos, los inventores seleccionaron marcadores CD c D26, CD147 y CD133, como una combinación de panel de biomarcadores preferida para enriquecer positivamente el fotorreceptor cono con L/M-opsina a través de una estrategia de clasificación celular. Además de esta selección positiva de conos con L/M-opsina, los inventores agregaron además SSEA-1 (CD15) al panel que no mostró expresión por parte de células pR2.1.GFP+ humanas en el experimento de cribado de lyoplate humano y se ha utilizado previamente como marcador de selección negativo para eliminar células no deseables, tales como las células progenitoras retinianas mitóticamente activas (Lakowski et al., 2015).

Para determinar si estos marcadores CD podrían utilizarse en una estrategia de enriquecimiento de conos con L/M-opsina, muestras de retina fetal humana se clasificaron por FAC con anticuerpos marcadores CD conjugados en forma aislada y en combinación, antes de sembrase en la placa, teñirse con el anticuerpo de L/M-opsina y CRX y hacer el recuento (Figura 3). La proporción de células marcador CD+ve marcadas por CD147 (63,6 %±12,4) y CD133 (71,1 %±7,2 %) superó el tamaño esperado de la población de fotorreceptores conos en la retina humana, que en la retina adulta es aproximadamente del 2-3 %, sin embargo, el porcentaje de población de células CD26+ve célula CD26+ve (2,9 % ± 1,6) mostró un tamaño equivalente a la proporción estimada de fotorreceptores conos en la retina humana (Figura 3A-C). Las poblaciones de células CD marcador+ve generalmente mostraron un mayor porcentaje de fotorreceptores conos L/M-opsina y CRX+ve en comparación con las células sin clasificar y las células C^d marcadorve (Figura 3D-F), que podría observarse fácilmente al clasificar muestras de retina humana con CD26 (Figura 3G-I).

La combinación de los tres marcadores de superficie celular identificados en conos con L/M-opsina para la clasificación FAC reveló una población de células triple positivas dentro de la retina fetal humana (P4; n = 4). Las células retinianas (17 pwc-22 pcw) se clasificaron primero en función de los marcadores CD133 y CD26: (Figura 3Ji) una gran proporción de células son CD133+ve (P5; 52,3 %±7,2) y todas las CD26+ve son adicionalmente CD133+ve, lo que crea una población de células doble positivas (P3; 0,6 % ±0,3). A partir de esta población celular doble positiva, los tipos incluyen triple negativo (CD133-, CD26-, CD147-), células solo CD133+, (CD133+, CD26-, CD147-) y células triple positivas (CD133+, CD26+, CD147±). El análisis de estas tres poblaciones, además de las células retinianas sin clasificar, reveló un enriquecimiento de células L/M opsina/CRX+ en la población celular triple positiva (8,7 %±9,6) en comparación con todas las demás poblaciones celulares (Figura 3K).

La adición de CD15-SSEA-1 como marcador de selección negativa junto con selección de conos triple positivos para células de retina fetal humana (Figura 4A) (n=3). Primero se extrajeron células CD15-SSEA1+ve de la muestra de retina (i) P7; 34,8 %±18,5) antes de clasificar con CD26, CD133 y CD147 (i e ii). El uso de los marcadores CD en combinación dentro de un panel de biomarcadores (Figura 4A) mejoró en gran medida la especificidad de las células L/M-opsina y CRX+ (30,2 %±19,7) dentro de la población de células enriquecidas (CD26+ CD133+ CD147+ SSEA-1-), cuando se compara con la población sin clasificar (0,14 %±0,01; Figura 4B-D). Adicionalmente, el porcentaje de células L/M-opsina/CRX+ dentro de las otras poblaciones celulares, incluyendo SSEA-1 , CD133+/CD26+/SSEA1- y CD133-/CD26-/CD147-SSEA1-, fue significativamente inferior en comparación con la población de células CD26+/CD133+CD147+/SSEA-1-, mostrando que se puede lograr un enriquecimiento de conos con L/M-opsina humanos utilizando este panel de biomarcadores (Figura 4B). No se observó marcaje de SSEA-1 de conos con L/M-opsina.

Finalmente, los inventores ensayaron el panel de biomarcadores de conos en cultivos de diferenciación retiniana derivados de células madre embrionarias humanas (ESC) (Figura 4E-H) para evaluar si se pudiera lograr un enriquecimiento similar de conos a partir de un sistema in vitro. Los inventores demostraron que el panel de biomarcadores de cono fue capaz de enriquecer las células doble positivas para ARR3 y CRX desde una población inicial del 7 % (sin clasificar) hasta el 50 % en la población clasificada CD26+/CD133+/CD147+/SSEA1-(Figura 4E-H).

La población purificada estaba muy enriquecida en células que expresan CRX, lo que sugiere la presencia de fotorreceptores menos maduros además de la población que expresa arrestina de cono. El protocolo aisló una población CD26+CD133+CD147+SSEA1- de 22.000 células de 4 millones de células y requeriría una ampliación de 9x para lograr un rendimiento total de 200.000 células para el trasplante de retina (basado en estudios en ratones).

CONCLUSIONES

Los datos muestran que se pueden utilizar combinaciones de biomarcadores de superficie celular selectores positivos y negativos para identificar y aislar fotorreceptores conos de la población de células. El panel de biomarcadores de cono pudo enriquecer las células doble positivas para ARR3 y CRX de una población inicial del 7 % (sin clasificar) hasta el 50 % cuando se utilizó el panel de biomarcadores preferido CD26+/CD133+/CD147+/SSEA1-.

Los marcadores CD divulgados anteriormente son útiles en estrategias de enriquecimiento celular como selectores positivos de conos para la aplicación clínica. Mediante la definición de marcadores CD expresados en conos fetales humanos, los marcadores pueden utilizarse para seleccionar fielmente conos derivados de iPSC o ESC para su uso en terapia o investigación.

Referencias

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar células fotorreceptoras en una población de células humanas, que comprende las etapas de:

a) determinar si las células de la población expresan o no CD29 o CD49 en la superficie celular;

b) determinar si las células de la población expresan o no CD73 en la superficie celular; y

c) identificar una célula como célula fotorreceptora si es CD29 o CD49 negativa y CD73 positiva.

2. El método de la reivindicación 1, en donde:

i. la etapa a) comprende determinar si las células de la población expresan o no CD29, y la etapa c) comprende identificar una célula como célula fotorreceptora cono si es negativa para CD29 y positiva para CD73; y/o ii. el método comprende además determinar si las células expresan o no CD15-SSEA1 en la superficie celular, en donde la célula se identifica como un fotorreceptor si también es negativa para CD15-SSEA1.

3. Un método para identificar células fotorreceptoras conos en una población de células humanas, que comprende las etapas de:

a) determinar si las células de la población expresan o no CD29 o CD15-SSEA1 en la superficie celular;

b) determinar si las células de la población expresan o no:

i) al menos dos de CD26, CD133 y CD147 en la superficie celular; o

ii) al menos dos de CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165 en la superficie celular; y

c) identificar una célula como célula fotorreceptora cono si es negativa para CD29 o CD15-SSEA1 y positiva para:

i) al menos dos de CD26, CD133 y CD147; o

ii) al menos dos de CD26, CD133, CD147, CD57, CD47, CD59, CD200, CD151, CD63, CD98, CD120a, CD81, CD49c, CD90 y CD165.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la etapa b) comprende determinar si las células de la población expresan o no al menos dos de CD26, CD133 y CD147, y la etapa c) comprende identificar una célula como célula fotorreceptora cono si es negativa para CD15-SSEA1 y positiva para al menos dos de CD26, CD133 y CD147; opcionalmente en donde la etapa b) comprende determinar si las células de la población expresan o no CD26, CD133 y CD147, y la etapa c) comprende identificar una célula como célula fotorreceptora cono si es negativa para CD15-SSEA1 y positiva para CD26, CD133 y CD147.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la población celular es:

a) células derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas;

b) células derivadas de células madre embrionarias humanas;

c) células derivadas de células de retina fetal humana; o

d) células derivadas de poblaciones de células somáticas humanas convertidas directamente.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:

i. cultivar la población de células antes de las etapas de identificación, para permitir la diferenciación de células a las poblaciones de fotorreceptores o fotorreceptores conos; y/o

ii. una etapa de aislamiento de las células fotorreceptoras o fotorreceptoras conos identificadas de la población de células; opcionalmente, en donde la etapa de aislamiento es por clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

7. El método de la reivindicación 6, que comprende además una etapa de cultivo de las células identificadas aisladas para permitir que las células se diferencien en fotorreceptores maduros o fotorreceptores conos.

8. Una población de células fotorreceptoras conos o fotorreceptoras humanas obtenida u obtenible mediante el método de la reivindicación 6, en donde:

tanto CD29 como CD15-SSEA1 se utilizan como selectores negativos de células fotorreceptoras y CD73 se utiliza como selector positivo de células fotorreceptoras; y

CD15-SSEA1 se utiliza como selector negativo de células fotorreceptoras conos y al menos CD26, CD133 y CD147 se utilizan como selectores positivos de células fotorreceptoras conos.

9. La población de células fotorreceptoras humanas de la reivindicación 8, en donde:

las células fotorreceptoras constituyen al menos el 80 % de las células de la población; y

las células fotorreceptoras no han sido manipuladas genéticamente para ayudar al enriquecimiento.

10. La población de células fotorreceptoras conos humanas de la reivindicación 8, en donde:

las células fotorreceptoras conos constituyen al menos el 50 % de las células de la población; y

las células fotorreceptoras conos no han sido manipuladas genéticamente para ayudar al enriquecimiento.

11. La población de células humanas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que:

a) está presente en suspensión; o

b) crece en una estructura o sustrato.

12. La población de células humanas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para su uso en terapia.

13. La población de células humanas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para su uso en trasplantes.

14. La población de células humanas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para su uso en un método para tratar la distrofia retiniana o una afección asociada a la pérdida celular o daño celular en un ojo humano.

15. La población celular humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la distrofia o afección retiniana se selecciona de lesión o trauma retiniano, degeneración de la retina, distrofia retiniana hereditaria, retinitis pigmentosa, degeneración macular asociada a la edad y amaurosis congénita de Leber.