JP2023182587A - 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 - Google Patents
多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023182587A JP2023182587A JP2023144942A JP2023144942A JP2023182587A JP 2023182587 A JP2023182587 A JP 2023182587A JP 2023144942 A JP2023144942 A JP 2023144942A JP 2023144942 A JP2023144942 A JP 2023144942A JP 2023182587 A JP2023182587 A JP 2023182587A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- imgl
- medium
- cells
- human
- microglia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 155
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 60
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 213
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 claims abstract description 91
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 126
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 claims description 114
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 77
- -1 RSG10 Proteins 0.000 claims description 36
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 36
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 34
- 102100020997 Fractalkine Human genes 0.000 claims description 34
- 101000854520 Homo sapiens Fractalkine Proteins 0.000 claims description 34
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 34
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 34
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 32
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 32
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 32
- 101150059463 P2RY12 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101000795117 Homo sapiens Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 Proteins 0.000 claims description 28
- 102100029678 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 Human genes 0.000 claims description 28
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 claims description 27
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 25
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 25
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 25
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 23
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 23
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 22
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 21
- 108090000835 CX3C Chemokine Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 102100039196 CX3C chemokine receptor 1 Human genes 0.000 claims description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 20
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 19
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 19
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 19
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 19
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 19
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 claims description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 18
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 17
- 101001120086 Homo sapiens P2Y purinoceptor 12 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 17
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 claims description 16
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 claims description 16
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 16
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 claims description 16
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 claims description 16
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 claims description 15
- 102100026171 P2Y purinoceptor 12 Human genes 0.000 claims description 15
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 claims description 15
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims description 15
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims description 15
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 claims description 14
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 14
- 102100040347 TAR DNA-binding protein 43 Human genes 0.000 claims description 13
- 210000003568 synaptosome Anatomy 0.000 claims description 13
- 108010020246 Leucine-Rich Repeat Serine-Threonine Protein Kinase-2 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100032693 Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2 Human genes 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 101000891092 Homo sapiens TAR DNA-binding protein 43 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000013138 pruning Methods 0.000 claims description 11
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 11
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 10
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 claims description 10
- 102100024119 CDK5 and ABL1 enzyme substrate 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 101000910461 Homo sapiens CDK5 and ABL1 enzyme substrate 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000577630 Homo sapiens Vitamin K-dependent protein S Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 9
- 102100028885 Vitamin K-dependent protein S Human genes 0.000 claims description 9
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 9
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100033456 TGF-beta receptor type-1 Human genes 0.000 claims description 8
- 108010011702 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 8
- 102100040999 Catechol O-methyltransferase Human genes 0.000 claims description 7
- 108020002739 Catechol O-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 claims description 7
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 claims description 7
- 101000795107 Homo sapiens Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100029681 Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 7
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 7
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 claims description 6
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 claims description 6
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 claims description 6
- 101001009552 Homo sapiens Probable G-protein coupled receptor 34 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 claims description 6
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010050345 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102100030157 Microphthalmia-associated transcription factor Human genes 0.000 claims description 6
- 102100030263 Probable G-protein coupled receptor 34 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 claims description 6
- 101150053137 AIF1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100030516 Beta-crystallin B1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 claims description 5
- 108700030955 C9orf72 Proteins 0.000 claims description 5
- 101150014718 C9orf72 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100026190 Class E basic helix-loop-helix protein 41 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039577 ETS translocation variant 5 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100031487 Growth arrest-specific protein 6 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100029301 Guanine nucleotide exchange factor C9orf72 Human genes 0.000 claims description 5
- 101100218714 Homo sapiens BHLHE41 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101000919505 Homo sapiens Beta-crystallin B1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000813745 Homo sapiens ETS translocation variant 5 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001049697 Homo sapiens Early growth response protein 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000923005 Homo sapiens Growth arrest-specific protein 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000970561 Homo sapiens Myc box-dependent-interacting protein 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000583474 Homo sapiens Phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038235 Large neutral amino acids transporter small subunit 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100021970 Myc box-dependent-interacting protein 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010015181 PPAR delta Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038824 Peroxisome proliferator-activated receptor delta Human genes 0.000 claims description 5
- 102100031014 Phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein Human genes 0.000 claims description 5
- 102100022036 Presenilin-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 108091006238 SLC7A8 Proteins 0.000 claims description 5
- 108091006686 SLCO2B1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027264 Solute carrier organic anion transporter family member 2B1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038836 Superoxide dismutase [Cu-Zn] Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 claims description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 claims description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 5
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001139146 Homo sapiens Krueppel-like factor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 4
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 4
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 claims description 4
- 102100026423 Adhesion G protein-coupled receptor E5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023226 Early growth response protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033864 G-protein coupled receptor 84 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000718243 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001069589 Homo sapiens G-protein coupled receptor 84 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001046683 Homo sapiens Integrin alpha-L Proteins 0.000 claims description 3
- 101000956317 Homo sapiens Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 4A Proteins 0.000 claims description 3
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038556 Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 4A Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 claims description 3
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 3
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 3
- 102100030886 Complement receptor type 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038795 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM4 Human genes 0.000 claims description 2
- 101100165826 Homo sapiens CABLES1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000727061 Homo sapiens Complement receptor type 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000664604 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710127797 Macrophage colony-stimulating factor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091006442 Mitochondrial phosphate transporters Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 2
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 claims description 2
- 102100035290 Fibroblast growth factor 13 Human genes 0.000 claims 12
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 claims 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims 2
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 claims 1
- 108010080192 Purinergic Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102000000033 Purinergic Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 claims 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 abstract description 48
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 103
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 39
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 36
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 31
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 30
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 25
- 102100040243 Microtubule-associated protein tau Human genes 0.000 description 25
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 24
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 22
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 22
- 230000006870 function Effects 0.000 description 22
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 20
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 18
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 17
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 17
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 15
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 11
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 10
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 description 9
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 102100037632 Progranulin Human genes 0.000 description 9
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 102100027286 Fanconi anemia group C protein Human genes 0.000 description 8
- 102100026145 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Human genes 0.000 description 8
- 108010027273 Valosin Containing Protein Proteins 0.000 description 8
- 210000005208 blood dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 101000598051 Homo sapiens Transmembrane protein 119 Proteins 0.000 description 7
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 7
- 101100099732 Mus musculus Tmem119 gene Proteins 0.000 description 7
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 7
- 102100022356 Tyrosine-protein kinase Mer Human genes 0.000 description 7
- 108010018804 c-Mer Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 7
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 7
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 7
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 6
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 6
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 6
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 6
- 101000929663 Homo sapiens Phospholipid-transporting ATPase ABCA7 Proteins 0.000 description 6
- 102100036620 Phospholipid-transporting ATPase ABCA7 Human genes 0.000 description 6
- 102100037029 Transmembrane protein 119 Human genes 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 5
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 5
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710163391 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase Proteins 0.000 description 4
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- 102100040133 Free fatty acid receptor 2 Human genes 0.000 description 4
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 4
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 4
- 101000890668 Homo sapiens Free fatty acid receptor 2 Proteins 0.000 description 4
- 101001027324 Homo sapiens Progranulin Proteins 0.000 description 4
- 101000836877 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 11 Proteins 0.000 description 4
- 101000680652 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 14 Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 101150059802 KU80 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150082854 Mertk gene Proteins 0.000 description 4
- 101100074054 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mus-52 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100074057 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pku80 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100027125 Sialic acid-binding Ig-like lectin 11 Human genes 0.000 description 4
- 102100027093 Sialic acid-binding Ig-like lectin 12 Human genes 0.000 description 4
- 101710143288 Sialic acid-binding Ig-like lectin 12 Proteins 0.000 description 4
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 4
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 4
- 102100022350 Tripartite motif-containing protein 14 Human genes 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 101000823089 Equus caballus Alpha-1-antiproteinase 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 3
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 3
- 102000058080 Glucose Transporter Type 5 Human genes 0.000 description 3
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 3
- 101001015059 Homo sapiens Integrin beta-5 Proteins 0.000 description 3
- 101000651211 Homo sapiens Transcription factor PU.1 Proteins 0.000 description 3
- 102100033010 Integrin beta-5 Human genes 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108091006301 SLC2A5 Proteins 0.000 description 3
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 description 3
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 description 3
- 102100027654 Transcription factor PU.1 Human genes 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 108010045676 holotransferrin Proteins 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 3
- 210000004980 monocyte derived macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 3
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031934 Adhesion G-protein coupled receptor G1 Human genes 0.000 description 2
- 108010017009 CD11b Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100027209 CD2-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100028284 Collagen alpha-1(XXVI) chain Human genes 0.000 description 2
- 102100023227 E3 SUMO-protein ligase EGR2 Human genes 0.000 description 2
- 102100021758 E3 ubiquitin-protein transferase MAEA Human genes 0.000 description 2
- 102100021717 Early growth response protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 229920002306 Glycocalyx Polymers 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000775042 Homo sapiens Adhesion G-protein coupled receptor G1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914499 Homo sapiens CD2-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 101000860862 Homo sapiens Collagen alpha-1(XXVI) chain Proteins 0.000 description 2
- 101001049692 Homo sapiens E3 SUMO-protein ligase EGR2 Proteins 0.000 description 2
- 101000616009 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein transferase MAEA Proteins 0.000 description 2
- 101000896450 Homo sapiens Early growth response protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000598002 Homo sapiens Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000916644 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000956320 Homo sapiens Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 6A Proteins 0.000 description 2
- 101001109700 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001086535 Homo sapiens Olfactomedin-like protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101001120082 Homo sapiens P2Y purinoceptor 13 Proteins 0.000 description 2
- 101000788823 Homo sapiens Zinc finger CW-type PWWP domain protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 2
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100038555 Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 6A Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 2
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- 102100022679 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100032750 Olfactomedin-like protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100026168 P2Y purinoceptor 13 Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710150875 TAR DNA-binding protein 43 Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 102100025363 Zinc finger CW-type PWWP domain protein 1 Human genes 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 2
- 230000013629 beta-amyloid clearance Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 230000021617 central nervous system development Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 210000002074 inflammatory monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 2
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000036068 sialic acid binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091000315 sialic acid binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 2
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 2
- ABKJCDILEUEJSH-MHWRWJLKSA-N 2-[(e)-(6-carboxyhexanoylhydrazinylidene)methyl]benzoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(=O)N\N=C\C1=CC=CC=C1C(O)=O ABKJCDILEUEJSH-MHWRWJLKSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094083 24 gene Proteins 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVYPYYPTFNVREL-UHFFFAOYSA-N 7-(2-cyclopentylidenehydrazinyl)-7-oxoheptanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(=O)NN=C1CCCC1 CVYPYYPTFNVREL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Substances C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010173 Alzheimer-disease mouse model Methods 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000056162 CELF1 Human genes 0.000 description 1
- 108700015925 CELF1 Proteins 0.000 description 1
- 101150107790 CELF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035605 Cas scaffolding protein family member 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 101000746263 Conus leopardus Conotoxin Lp5.1 Proteins 0.000 description 1
- 101100193633 Danio rerio rag2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102100034578 Desmoglein-2 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031690 Erythroid transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 240000008168 Ficus benjamina Species 0.000 description 1
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical group OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100440171 Homo sapiens CLU gene Proteins 0.000 description 1
- 101000947106 Homo sapiens Cas scaffolding protein family member 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000980898 Homo sapiens Cell division cycle-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000924314 Homo sapiens Desmoglein-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001066268 Homo sapiens Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000916628 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001129851 Homo sapiens Paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000616502 Homo sapiens Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000797623 Homo sapiens Protein AMBP Proteins 0.000 description 1
- 101000878540 Homo sapiens Protein-tyrosine kinase 2-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000797332 Homo sapiens Trem-like transcript 2 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036981 Interferon regulatory factor 1 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010018650 MEF2 Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- ACFGRWJEQJVZTM-LEJBHHMKSA-L Magnesium L-ascorbic acid-2-phosphate Chemical compound [Mg+2].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP([O-])([O-])=O)=C1O ACFGRWJEQJVZTM-LEJBHHMKSA-L 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100193635 Mus musculus Rag2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100039229 Myocyte-specific enhancer factor 2C Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101150092239 OTX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031651 Paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100021797 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 102100032859 Protein AMBP Human genes 0.000 description 1
- 102100037787 Protein-tyrosine kinase 2-beta Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035773 Regulator of G-protein signaling 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710148338 Regulator of G-protein signaling 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100027164 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710143293 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032990 Trem-like transcript 2 protein Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 101710202239 Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000007792 alzheimer disease pathology Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000004193 beta-amyloid degradation Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009460 calcium influx Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000031154 cholesterol homeostasis Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005031 cortical microglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000005257 cortical tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007878 drug screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N fura-2-acetoxymethyl ester Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=CC2=C1OC(C=1OC(=CN=1)C(=O)OCOC(C)=O)=C2 VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000004547 gene signature Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 102000046699 human CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102000044493 human CDCA4 Human genes 0.000 description 1
- 102000053925 human CSF1 Human genes 0.000 description 1
- 102000044740 human Tmem119 Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 1
- 210000004713 immature microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000006775 microglial inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000027317 positive regulation of immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003999 primitive hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000008741 proinflammatory signaling process Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- MHQHHBYRYFICDV-UHFFFAOYSA-M sodium;pyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].O=C1CC(=O)[N-]C(=O)N1 MHQHHBYRYFICDV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 201000008914 temporal lobe epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012301 transgenic model Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2334—Interleukin-34 (IL-34)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】ミクログリア細胞を取得する技術を提供する。【解決手段】多能性幹細胞(PSC)からヒトミクログリア様細胞(iMGL)を産生する方法であって、(i)造血分化因子を補充した培地を使用してPSCを分化させて誘導造血始原細胞(iHPC)を産生する工程と、(ii)ミクログリア分化培地を使用してCD43+iHPCをヒトミクログリア様細胞(iMGL)に分化させる工程とを含む方法を提供する。さらに、アルツハイマー病の試験など、様々な神経障害を試験する方法、CNSおよび脳の様々な生理学的および病理学的環境におけるミクログリア細胞の遺伝子型および表現型による効果を調査する方法が提供される。【選択図】図1-1
Description
関連出願
本出願は、2017年2月28日に出願された米国仮出願第62/464,925号の優先権を主張する。上述の出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
本出願は、2017年2月28日に出願された米国仮出願第62/464,925号の優先権を主張する。上述の出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けたR&Dの記載
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられたAG048099の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられたAG048099の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本明細書には、(i)ヒトミクログリア様細胞(iMGL)および(ii)iMGLを作製する方法の実施形態が記載されている。
ミクログリア細胞は、CNSの先天性免疫細胞であり、CNSの生理学的発達に役割を果たすことが知られている。さらに、ミクログリア細胞はアルツハイマー病などの神経障害において役割を果たすことが知られている。CNSの発達および神経障害においてミクログリア細胞が果たす役割をさらに調査するためにミクログリア細胞を取得する技術には、欠陥がある。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞(PSC)からヒトミクログリア様(iMGL)を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、(i)造血分化因子を補充した培地を使用してPSCを分化させて誘導造血始原細胞(iHPC)を産生する工程と、(ii)CD43+ iHPCを単離する工程と、(iii)ミクログリア分化培地を使用してCD43+ iHPCをiMGLに分化させる工程と、(iv)iMGLを成熟させる工程とを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、(i)造血分化因子を補充した培地を使用してPSCを分化させる工程と、(ii)ミクログリア分化培地を使用してCD43+ iHPCをiMGLに分化させる工程とを含む。
いくつかの実施形態では、第1の型の細胞からヒトミクログリア様(iMGL)細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、(i)第1の型の細胞を誘導造血始原細胞(iHPC)に分化させる工程と、(ii)iHPCを分化させてiMGLを産生する工程とを含む。
いくつかの実施形態では、PSCは胚様体に由来しない。いくつかの実施形態では、PSCは単一細胞PSCを含む。
いくつかの実施形態では、PSCは誘導PSC(iPSC)を含む。いくつかの実施形態では、PSCは胚性幹細胞(ESC)を含む。いくつかの実施形態では、PSCは哺乳動物のPSCを含む。いくつかの実施形態では、PSCはヒト起源のものである。いくつかの実施形態では、PSCはマウスPSCである。
いくつかの実施形態では、PSCからiMGLを産生する方法であって、(i)PSCをiHPCに分化させる工程と、(ii)iHPCをiMGLに分化させる工程とを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子:RUNX1、SPI1、CSF1FR、CX3CR1、TGFBR1、RSG10、GAS6、MERTK、PSEN2、PROS1、P2RY12、P2RY13、GPR34、C1Q、CR3、CABLES1、BHLHE41、TREM2、TYROBP、ITGAM、APOE、SLCO2B1、SLC7A8、PPARD、TMEM119、GPR56、C9orf72、GRN、LRRK2、TARDBP、およびCRYBB1のうちのいずれか1つ、または2つ以上の任意の組み合わせの発現を含むiMGLの組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ケモカイン、サイトカイン、および他の炎症性分子の分泌を評価する方法であって、(i)リポ多糖、IFNγ、またはIL-1βによってiMGLを処理する工程と、(ii)iMGLからケモカイン、サイトカイン、および他の炎症または種々の神経変性疾患状態の潜在的なバイオマーカーとして機能する可能性がある分泌因子を測定する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、iMGLからの炎症性分子の分泌をプロファイリングする方法であって、(i)リポ多糖、IFNγ、TNFα、またはIL-1βによってiMGLを処理することと、(ii)iMGLによって分泌される炎症マーカーを測定することとを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、iMGLの遊走を評価する方法であって、(i)ADPによってiMGLを処理する工程と、(ii)iMGLの遊走を測定する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、iMGLの遊走を評価する方法であって、(i)ADPによってiMGLを処理することと、(ii)化学刺激に応答したiMGLの運動性および遊走を評価することとを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、iMGLにおいてカルシウム移行を生じさせる方法であって、(i)ADPによってiMGLを処理する工程と、(ii)iMGLにおいてカルシウム移行を生じさせる工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、iMGLにおいてカルシウム移行を生じさせる方法であって、(i)ADPによってiMGLを処理することと、(ii)iMGLにおけるカルシウムフラックスシグナルを調べることと、を含み、カルシウムフラックスシグナルが、電気的、生物学的、または化学的刺激に応答して生じる、方法に関する。
いくつかの実施形態では、iMGLにおける遺伝子発現を差次的に制御する方法であって、(i)iMGLをニューロンまたは星状細胞と共培養する工程と、(ii)iMGLにおいて遺伝子を差次的に制御する工程とを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、iMGLをCNS/脳(例えば、ニューロン)環境に組み込む方法であって、(i)iMGLをhiPSC 3D脳オルガノイド(BORG)と共培養する工程と、(ii)iMGLをBORGに侵入させる工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、iMGLを3D CNS環境に組み込む方法であって、iMGLをhiPSC 3D脳オルガノイド(BORG)と共培養することを含み、iMGLはBORGに遊走し、BORGに集合するか、またはBORGに組み込まれる、方法に関する。
いくつかの実施形態では、iMGLにおける遺伝子発現を差次的に制御する方法であって、(i)iMGLを、以下の化合物:Aβ、タウ、蛍光標識Aβ、pHrodo標識脳由来タウオリゴマー、および神経変性疾患に関係する他の脳由来タンパク質、すなわち、シヌクレイン、ハンチンチン、プリオンのいずれかに曝露する工程と、(ii)iMGLにおいて遺伝子を差次的に制御する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、iMGLのインビボ(in vivo)状態に類似するiMGL遺伝子発現プロファイルを確立する方法であって、iMGLをニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養し、それにより、iMGLがニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養されていない場合にiMGLに関して存在するよりもiMGLに関してよりインビボの状態を再現することとを含む方法に関する。いくつかの実施形態は、iMGLを使用して健康および疾患におけるミクログリア制御不全を試験する方法であって、(i)iMGLを、Aβ、タウ、蛍光標識Aβ、pHrodo標識脳由来タウオリゴマー、およびアルファ-シヌクレインからなる群から選択される化合物に曝露することと、(ii)RNA-seq、プロテオミクス、メタボロミクス、およびリピドミクスから選択されるiMGLオミックシグネチャをプロファイリングすることとを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、iMGLにおけるヒトシナプトソーム(hS)を貪食する方法であって、(i)iMGLをhSに曝露する工程と、(ii)hSの貪食を測定する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、化合物のミクログリア貪食を試験する方法であって、(i)iMGLを、Aβ、タウ、蛍光標識Aβ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーからなる群から選択される化合物に曝露し、化合物がiMGLによって、貪食、エンドサイトーシス、または摂取されることと、(ii)化合物の貪食、エンドサイトーシス、または摂取を測定することとを含む方法に関する。
いくつかの実施形態は、シナプス刈り込みおよびシナプス可塑性におけるミクログリアの役割を調査する方法であって、(i)iMGLをヒトシナプトソームに曝露することと、(ii)iMGLによるヒトシナプトソーム貪食を評価することとを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、遺伝子制御を決定する方法であって、(i)iMGLを、任意の組み合わせの、因子、CX3CL1、CD200、およびTGFβのうちの1つ以上に曝露することと、(ii)任意の組み合わせの、差次的に制御される遺伝子:P2ry12、EGR1、TGFβ1、ETV5、CX3CR1、APOE、BIN1、CD33、GPR84、COMT、APP、PSEN1、PSEN2、HTT、GRN、FUS、TARDP、VCP、SNCA、C9ORF72、LRRK2、およびSOD1のうちの任意の1つ以上を評価することとを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、iMGLの神経組織(例えば、皮質)への生着を評価する方法であって、(i)iMGLを神経組織に移植することと、(ii)iMGLの神経組織への生着を評価することとを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、iMGLのADニューロパシーとの相互作用を評価する方法であって、(i)iMGLを海馬に移植することと、(ii)海馬におけるiMGLの相互作用を評価することとを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、3D神経環境でヒトミクログリアを試験する方法であって、iMGLを哺乳動物の脳に移植することを含む方法が提供される。
本明細書において提供される方法、キット、および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトiHPCの生成を支持するための培地であって、FGF2、BMP4、アクチビンA、およびLiClのうちの1つ以上を含む培地に関する。本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトiHPCの生成を支持するための培地であって、FGF2およびVEGFのうちの1つ以上を含む培地に関する。本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトiHPCの生成を支持するための培地であって、FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6のうちの1つ以上を含む培地に関する。いくつかの実施形態は、ヒトiHPCの生成を支持するためのキットであって、FGF2、BMP4、アクチビンA、およびLiClのうちの1つ以上を含む培地を含むキットに関する。いくつかの実施形態は、iHPCの生成を支持するためのキットであって、FGF2およびVEGFのうちの1つ以上を含む培地を含むキットに関する。いくつかの実施形態は、ヒトiHPCの生成を支持するためのキットであって、FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6のうちの1つ以上を含む培地を含むキットに関する。
本明細書において提供される方法、キット、および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトiMGLの生成を支持するための培地であって、CSF-1、IL-34、およびTGFβ1のうちの1つ以上を含む培地に関する。いくつかの実施形態は、ヒトiMGLの生成を支持するためのキットであって、CSF-1、IL-34、およびTGFβ1のうちの1つ以上を含む培地を含むキットに関する。
本明細書において提供される方法、キット、および組成物のいくつかの実施形態は、iMGLの成熟または維持を支持するため培地であって、CD200およびCX3CL1のうちの1つ以上を含む培地に関する。いくつかの実施形態は、iMGLの成熟または維持を支持するためのキットであって、CD200およびCX3CL1のうちの1つ以上を含む培地を含むキットに関する。
上述のように要約され、以下でさらに詳述される組成物および関連する方法は、開業医によってとられる特定の行動を説明するが、別の当事者によるこれらの行動の指示を含めることもできることを理解されたい。したがって、「iMGLを哺乳動物の脳に移植すること」などの行動には、「iMGLの哺乳動物の脳への移植を指示すること」が含まれる。
ミクログリアはCNSの先天性免疫細胞であり、シナプス可塑性、神経新生、恒常性機能、および免疫活性において重要な役割を果たす。ミクログリアはまた、ADを含む神経障害において重要な役割を果たしており、健康と疾患の両方におけるそれらの機能の理解を改善する必要性を強調している。いまだに、ヒトのミクログリアの試験は、ヒトの胎児または成人のCNS組織から初代培養細胞を取得することがまれであり難しいため、困難である。したがって、誘導多能性幹細胞(iPSC)および胚性幹細胞(ESC)を含む、多能性幹細胞(PSC)などからのヒトミクログリアの再生可能な供給源の開発が急務である。
iPSCからミクログリアを生成する際の課題は、その独自の発生起源に起因する。明解な系統追跡試験は、ミクログリアが原始造血中に生成された卵黄嚢赤血球始原細胞(EMP)に由来することを示している。EMPは、初期の原始マクロファージにさらに発達し、発達中の神経管に遊走し、ミクログリア始原細胞になる。その後、ミクログリア始原細胞は成熟し、その環境を監視し、CNSの発達を促進し、シナプス可塑性を調節し、CNS損傷および病理に応答するために使用される分岐突起を発達させる。
患者由来のiPSCの生成により、遺伝的リスク因子と疾患の関係を検査する新たな機会が促進された。最近、ゲノムワイド関連研究(GWAS)は、遅発性AD(LOAD)を発症するリスクに関連するミクログリアによって発現されるいくつかの遺伝子を同定した。ミクログリアの機能とADにおけるこれらの遺伝子の役割は、マウスモデルで検査し始めたばかりであるが、本明細書において記載されるようなヒトミクログリア様細胞の生成により、マウスではモデル化できないヒト特異的遺伝子を調べることが可能になる。
ADでは、ベータアミロイド斑の周囲のミクログリアクラスターが、ベータアミロイドのクリアランスにおけるそれらの非効率性を強調している。ミクログリアはまた、疾患の病理を悪化させるサイトカイン/ケモカイン分泌を含む、AD病因の神経炎症性成分にも関与している。さらに、TREM2およびCD33のようなAD GWAS遺伝子は、ADの病理の影響を受け、ADの進行に関与している可能性がある。ミクログリアは、脳の発達、神経の恒常性、および多くの神経障害の主要な調節因子でもある。したがって、ヒトのミクログリアおよびミクログリアの機能に対する病理と疾患関連遺伝子の両方の影響についての理解をさらに深めることが急務である。
本明細書に記載される実施形態のいくつかは、胎児および成人のミクログリアに類似するヒトiPSCミクログリア様細胞(iMGL)の効果的かつ堅牢な生成のための方法を提供する。これらの方法は、ADのような神経疾患の調査に有用なiMGLを産生する。本明細書に記載される実施形態のいくつかでは、ミクログリア様細胞(iMGL)をiPSCから分化させて、アルツハイマー病(AD)などの神経疾患における機能を試験する。
本明細書に記載されるiMGLは、インビボのミクログリアと同様にインビトロで発達する。トランスクリプトーム全体の分析は、それらが成人および胎児のヒトミクログリアに非常に類似していることを示す。これらのiMGLの機能評価は、それらが炎症性刺激に応答してサイトカインを分泌し、遊走し、カルシウム移行を起こし、成人/胎児ミクログリアと同様にCNS基質を堅牢に貪食することを明らかにする。
これらのiMGLを使用して、数ある使用の中でも、(i)AD関連遺伝子発現に対する線維性Aβおよび脳由来タウオリゴマーの効果を検査し、(ii)シナプス刈り込みに関与するメカニズムを同定する。さらに、iMGLはミクログリア機能のハイスループット試験で使用でき、ヒトの神経疾患に対する重要な新しい洞察を提供する。
以下のセクションでは、iMGLを産生する方法の様々な実施形態、およびiMGLの構造と機能の様々な実施形態を提供する。さらに、iMGLの使用方法も提供される。また、方法の非限定的な詳細な説明も提供される。
iMGLの作製方法:
iMGLの作製方法:
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞(PSC)からヒトミクログリア様細胞(iMGL)を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、(i)造血分化因子を補充した培地を使用してPSCを分化させて誘導造血始原細胞(iHPC)を産生する工程と、(ii)CD43+ iHPCを単離する工程と、(iii)ミクログリア分化培地を使用してCD43+ iHPCをヒトミクログリア様細胞(iMGL)に分化させる工程と、(iv)iMGLを成熟させる工程とを含む。いくつかの実施形態では、HPC生成技術は、前駆細胞が濃縮され、CD43+ iHPCを単離することなく(iii)が実行される培地の収集を可能にする。
いくつかの実施形態では、方法は、(i)造血分化因子を補充した培地を使用してPSCを分化させる工程と、(ii)ミクログリア分化培地を使用してCD43+ iHPCをiMGLに分化させる工程とを含む。
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、第1の型の細胞からヒトiMGLを産生する方法であって、(i)第1の型の細胞をiHPCに分化させる工程と、(ii)iHPCを分化させてiMGLを産生する工程とを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、第1の型の細胞は、PSCでもESCでもない。
いくつかの実施形態では、PSCは胚様体に由来しない。いくつかの実施形態では、PSCは単一細胞PSCを含む。いくつかの実施形態では、PSCは分化前にCD43+ではない。いくつかの実施形態では、PSCは分化前にCD34+ではない。いくつかの実施形態では、PSCはCD31+ではない。いくつかの実施形態では、PSCは分化前にはCD45+ではない。
いくつかの実施形態では、PSCは誘導PSC(iPSC)であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、PSCは胚性幹細胞(ESC)であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、PSCは哺乳動物のPSCである。いくつかの実施形態では、PSCはヒトPSCである。いくつかの実施形態では、PSCはマウスPSCである。
単一細胞PSCを分化させる
いくつかの実施形態では、PSCを分化させてiHPCを産生することは、5~15日の間のインキュベーション期間を含む。例えば、インキュベーション期間は、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、または15日である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は10日である。いくつかの実施形態では、PSCが曝露される酸素のパーセンテージは、10日の期間で変動する。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間中に、iPSCは低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間の1~10日目に、PSCが低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第1の部分で、PSCが3%~7%の酸素環境に曝露される。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第1の部分が4日(1~4日目)であり、酸素環境が5%である。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第2の部分で、PSCが15%~25%の間の酸素環境に曝露される。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第2の部分が6日(5~10日目)であり、PSCが曝露される酸素環境が20%である。いくつかの実施形態では、PSCを分化させてiHPCを産生することは、3~21日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は28日までである。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は28日を超える。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は3日未満である。
いくつかの実施形態では、PSCを分化させてiHPCを産生することは、5~15日の間のインキュベーション期間を含む。例えば、インキュベーション期間は、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、または15日である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は10日である。いくつかの実施形態では、PSCが曝露される酸素のパーセンテージは、10日の期間で変動する。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間中に、iPSCは低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間の1~10日目に、PSCが低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第1の部分で、PSCが3%~7%の酸素環境に曝露される。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第1の部分が4日(1~4日目)であり、酸素環境が5%である。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第2の部分で、PSCが15%~25%の間の酸素環境に曝露される。いくつかの実施形態では、10日の期間のうちの第2の部分が6日(5~10日目)であり、PSCが曝露される酸素環境が20%である。いくつかの実施形態では、PSCを分化させてiHPCを産生することは、3~21日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は28日までである。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は28日を超える。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は3日未満である。
いくつかの実施形態では、PSCを分化させるために使用される造血分化因子は、FGF2、BMP4、アクチビンA、LiCl、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6を含む。培地は、これらの因子のうちのいずれか1つ以上を任意の組み合わせで含む。いくつかの実施形態では、PSCは、PSC分化工程のインキュベーション期間を通して異なる培地でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、1日目に、培地がFGF2、BMP4、アクチビンA、およびLiClを含み、3日目および4日目に、培地がFGF2およびVEGFを含み、5~10日目に、培地がFGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6を含む、10日のインキュベーション期間が提供される。いくつかの実施形態は、因子FGF2、BMP4、アクチビンA、LiCl、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6のうちのいずれか1つまたは組み合わせを含む培地に関する。いくつかの実施形態は、因子FGF2、BMP4、アクチビンA、およびLiClのうちのいずれか1つまたは組み合わせを含む培地に関する。いくつかの実施形態は、因子FGF2およびVEGFのうちのいずれか1つまたは組み合わせを含む培地に関する。いくつかの実施形態は、因子FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6のうちのいずれか1つまたは組み合わせを含む培地に関する。
いくつかの実施形態では、培地中の因子、FGF2、BMP4、VEGF、TPO、SCF、IL-3、およびIL6の各々の濃度が、5ng/ml~100ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中の因子、FGF2、BMP4、VEGF、TPO、SCF、IL-3、およびIL6の各々の濃度が、30ng/ml~70ng/mlの間または40ng/ml~60ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中の因子、FGF2、BMP4、VEGF、TPO、SCF、IL-3、およびIL6の各々の濃度が、50ng/mlである。いくつかの実施形態では、培地中のアクチビンAの濃度が、9ng/ml~16ng/mlの間または11ng/ml~14ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のアクチビンAの濃度が、12.5ng/mlである。いくつかの実施形態では、培地中のLiClの濃度が、1nM~3nMの間である。いくつかの実施形態では、培地中のLiClの濃度が、1mM~3mMの間である。いくつかの実施形態では、培地中のLiCLの濃度が2mMである。
iHPCの単離
当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、iHPCまたはCD43+ iHPCを単離する。いくつかの実施形態では、iHPCまたはCD43+ iHPCを単離するために使用される方法はFACSである。いくつかの実施形態では、単離工程は、CD43+マーカーを選択することを含む。いくつかの実施形態では、CD43+以外のマーカーを使用して、HPCを単離する。いくつかの実施形態では、単離工程は、CD34+細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、単離工程は、CD31+細胞またはCD45+細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、単離工程は、iHPCを同定することが知られている別のマーカーを選択することを含む。
当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、iHPCまたはCD43+ iHPCを単離する。いくつかの実施形態では、iHPCまたはCD43+ iHPCを単離するために使用される方法はFACSである。いくつかの実施形態では、単離工程は、CD43+マーカーを選択することを含む。いくつかの実施形態では、CD43+以外のマーカーを使用して、HPCを単離する。いくつかの実施形態では、単離工程は、CD34+細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、単離工程は、CD31+細胞またはCD45+細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、単離工程は、iHPCを同定することが知られている別のマーカーを選択することを含む。
いくつかの実施形態では、iHPCを単離することによって、80%を超える純度、例えば90%を超える純度のiHPCが単離される。いくつかの実施形態では、CD43+ iHPCを単離することによって、80%を超える純度、例えば90%を超える純度のCD43+ iHPCが単離される。
iHPCをiMGLに分化させる
ミクログリア細胞を成熟させるための当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、iMGLを成熟させることができる。
ミクログリア細胞を成熟させるための当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、iMGLを成熟させることができる。
いくつかの実施形態では、CD43+ iHPCをiMGLに分化させることは、20~30日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は25日である。
いくつかの実施形態では、iHPCをiMGLに分化させるために使用される培地は、因子CSF-1、IL-34、およびTGFβ1のうちのいずれか1つまたは組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、因子CSF-1、IL-34、およびTGFβ1のうちの全てを含む。いくつかの実施形態では、培地中のCSF-1の濃度が、5ng/ml~50ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のCSF-1の濃度が、15ng/ml~35ng/mlの間または20ng/ml~30ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のCSF-1の濃度が25ng/mlである。いくつかの実施形態では、培地中のIL-34の濃度が、25ng/ml~125ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のIL-34の濃度が、80ng/ml~120ng/mlの間または90ng/ml~110ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のIL-34の濃度が100ng/mlである。いくつかの実施形態では、培地中のTFGβ-1の濃度が、2.5ng/ml~100ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のTFGβ-1の濃度が、30ng/ml~70ng/mlの間または40ng/ml~60ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のTGFβ-1の濃度が50ng/mlである。いくつかの実施形態は、因子CSF-1、IL-34、およびTGFβ1のうちのいずれか1つまたは組み合わせを含む培地に関する。
いくつかの実施形態では、iHPCをiMGLに分化させるために使用される培地は、TFGβ-2を含む。いくつかの実施形態では、培地中のTFGβ-2の濃度が、2.5ng/ml~100ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のTFGβ-2の濃度が、30ng/ml~70ng/mlの間または40ng/ml~60ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のTGFβ-2の濃度が50ng/mlである。
いくつかの実施形態では、iHPCをiMGLに分化させるために使用される培地は、TFGβ模倣物を含む。TGFβ模倣物の例には、IDE-1およびIDE-2が含まれる。いくつかの実施形態では、TFGβ模倣物は、1つ以上のオフターゲット効果を有し、および/またはSOXシグナル伝達経路に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、培地中のTFGβ模倣物の濃度が、2.5ng/ml~100ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のTFGβ模倣物の濃度が、30ng/ml~70ng/mlの間または40ng/ml~60ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、TGFβ模倣物は、TGFβシグナル伝達経路を活性化する。
いくつかの実施形態では、iHPCをiMGLに分化させるために使用される培地は、無血清培地である。
iMGLの成熟
いくつかの実施形態では、iMGLを成熟させることは、1~5日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、iMGLを成熟させるためのインキュベーション期間は、3日である。
いくつかの実施形態では、iMGLを成熟させることは、1~5日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、iMGLを成熟させるためのインキュベーション期間は、3日である。
いくつかの実施形態では、成熟させる工程は、CD200とCX3CL1のいずれかまたは両方を含む培地中でiMGLをインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、CD200はヒト組換えCD200であり、CX3CL1はヒト組換えCX3CL1である。
いくつかの実施形態では、培地中のCD200およびCX3CL1の各々の濃度は、1ng/ml~1μg/mlの間である。いくつかの実施形態では、培地中のCD200およびCX3CL1の各々の濃度が、80ng/ml~120ng/mlの間または90ng/ml~110ng/mlの間である。いくつかの実施形態では、CD200およびCX3CL1の各々の濃度が、100ng/mlである。
産生されたiMGLの特性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生されたiMGLは、70%純度~100%純度の間のiMGLの純粋な集団をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生されたiMGLは、80%純度~100%純度の間のiMGLの純粋な集団をもたらす。例えば、iMGLの集団は、80%純度、81%純度、82%純度、83%純度、84%純度、85%純度、86%純度、87%純度、88%純度、89%純度、90%純度、91%純度、92%純度、93%純度、94%純度、95%純度、または96%純度、97%、98%、99%、99%、または100%であろう。いくつかの実施形態では、産生されるiMGLの集団は、96%を超える。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生されたiMGLは、70%純度~100%純度の間のiMGLの純粋な集団をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生されたiMGLは、80%純度~100%純度の間のiMGLの純粋な集団をもたらす。例えば、iMGLの集団は、80%純度、81%純度、82%純度、83%純度、84%純度、85%純度、86%純度、87%純度、88%純度、89%純度、90%純度、91%純度、92%純度、93%純度、94%純度、95%純度、または96%純度、97%、98%、99%、99%、または100%であろう。いくつかの実施形態では、産生されるiMGLの集団は、96%を超える。
iMGLの純度の評価は、ミクログリア細胞の純度を決定する当該技術分野で公知の任意の方法を利用することにより達成される。いくつかの実施形態では、純度レベルは、因子P2RY12およびTREM12の発現および/または共局在化によって評価される。いくつかの実施形態では、純度レベルは、Trem2、Iba1、および/またはPu1の発現および/または共局在化によって評価される。
本明細書に記載される方法のいずれかによって産生されるiMGLは、典型的なミクログリア細胞が発現する任意の因子または因子の任意の組み合わせを発現するであろう。いくつかの実施形態では、産生されるiMGLは、c-kit-/CD45+である。いくつかの実施形態では、c-kit-/CD45+ iMGLが、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、qPCR、RNA-seq、またはプロテオミクスを使用して検出される。いくつかの実施形態では、他の細胞型が、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、qPCR、RNA-seq、またはプロテオミクスを使用して検出される。いくつかの実施形態では、産生されるiMGLは、2つの別個のiMGLの集団:(1)CD45+/CX3CR1-および(2)CD45+/CX3CR1+を含む。いくつかの実施形態では、産生されるiMGLは、CD43+、CD235a+、またはCD41+である。いくつかの実施形態では、産生されるiMGLは、CD43+/CD235a+/CD41+である。
本明細書に記載されるiMGLを産生する方法のいずれかは、分化プロセスの初期にミクログリア系統への細胞の拘束性があるCD43+ iHPCの分化工程をもたらす。いくつかの実施形態では、c-kit-/CD45+であるiMGLは、CD43+ iHPCをiMGLに分化させるために使用されるインキュベーション期間の14日目に検出される。iMGL系統への拘束性があるかどうかの判定は、ミクログリアの運命への拘束された細胞のマーカーであることが知られている任意の因子の発現を試験することによって行われる。いくつかの実施形態では、細胞がiMGL系統に拘束されているかどうかは、転写因子PU.1および/またはミクログリア濃縮タンパク質Trem2の発現を評価することにより判定される。いくつかの実施形態では、細胞マーカーが、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、qPCR、RNA-seq、またはプロテオミクスを使用して検出される。
いくつかの実施形態では、誘導PSCからiMGLを産生する方法であって、(i)PSCを誘導造血始原細胞(iHPC)に分化させる工程と、(ii)iHPCを分化させてiMGLを産生する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、工程(ii)から産生されたiMGLを成熟させる工程(iii)をさらに含む。いくつかの実施形態では、PSCは、誘導PSC(iPSC)または胚性幹細胞(ESC)を含む。いくつかの実施形態では、PSCは、ヒトまたはマウスなどからの哺乳動物のPSCである。
いくつかの実施形態では、TRIM14、CABLES1、MMP2、SIGLEC 11および12、MITF、および/またはSLC2A5のmRNAおよび/またはタンパク質の発現が、産生されたiMGLにおいて濃縮されている。いくつかの実施形態では、COMT、EGR2、EGR3、および/またはFFAR2のmRNAおよび/またはタンパク質の発現が、産生されたiMGLにおいて濃縮されている。
iMGLの組成物
iMGLの遺伝子発現
いくつかの実施形態では、特定の遺伝子プロファイルを発現するiMGLが提供される。本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、ミクログリア細胞に類似した遺伝子発現プロファイルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のiMGLの組成物のいずれかは、以下の遺伝子:RUNX1、PU.1、CSF1FR、CX3CR1、TGFBR1、RSG10、GAS6、PROS1、P2RY12、GPR34、C1Q、CR3、CABLES1、BHLHE41、TREM2、ITAM、APOE、SLCO2B1、SLC7A8、PPARD、C9orf72、GRN、LRRK2、TARDBP、およびCRYBB1のうちのいずれかの発現を含む。本明細書に開示されるiMGLのいずれかは、これらの遺伝子のいずれかの発現を任意の組み合わせで含む。
iMGLの遺伝子発現
いくつかの実施形態では、特定の遺伝子プロファイルを発現するiMGLが提供される。本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、ミクログリア細胞に類似した遺伝子発現プロファイルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のiMGLの組成物のいずれかは、以下の遺伝子:RUNX1、PU.1、CSF1FR、CX3CR1、TGFBR1、RSG10、GAS6、PROS1、P2RY12、GPR34、C1Q、CR3、CABLES1、BHLHE41、TREM2、ITAM、APOE、SLCO2B1、SLC7A8、PPARD、C9orf72、GRN、LRRK2、TARDBP、およびCRYBB1のうちのいずれかの発現を含む。本明細書に開示されるiMGLのいずれかは、これらの遺伝子のいずれかの発現を任意の組み合わせで含む。
RUNX1、SPI1、CSF1FR、CX3CR1、TGFBR1、RSG10、GAS6、MERTK、PSEN2、PROS1、P2RY12、P2RY13、GPR34、C1Q、CR3、CABLES1、BHLHE41、TREM2、TYROBP、ITGAM、APOE、SLCO2B1、SLC7A8、PPARD、TMEM119、GPR56、C9orf72、GRN、LRRK2、TARDBP、およびCRYBB1。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるiMGLの組成物のいずれにおいても、TREM2とP2RY12は共発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるiMGLの組成物のいずれも、遺伝子KLF2、TREM1、MPT、ITGAL、およびADGRE5のうちのいずれか1つ以上を発現しない。
iMGLの機能特性とiMGLの使用方法
ケモカイン分泌
本明細書に記載されるiMGLはいずれも、ミクログリア細胞内のケモカインを刺激することが当該技術分野において公知の任意の刺激に応答して、ミクログリア細胞と同様のケモカインプロファイルを分泌するであろう。いくつかの実施形態では、分泌されるケモカインは、TNFα、CCL2、CCL4、およびCXCL10のうちのいずれか1つ以上の任意の組み合わせであり、リポ多糖、IFNγ、またはIL-1βによる刺激に応答して分泌される。
ケモカイン分泌
本明細書に記載されるiMGLはいずれも、ミクログリア細胞内のケモカインを刺激することが当該技術分野において公知の任意の刺激に応答して、ミクログリア細胞と同様のケモカインプロファイルを分泌するであろう。いくつかの実施形態では、分泌されるケモカインは、TNFα、CCL2、CCL4、およびCXCL10のうちのいずれか1つ以上の任意の組み合わせであり、リポ多糖、IFNγ、またはIL-1βによる刺激に応答して分泌される。
いくつかの実施形態では、iMGLからのケモカイン分泌を刺激する方法が提供される。この方法は、(i)ミクログリア細胞におけるサイトカイン分泌を刺激するために当該技術分野において公知の任意の因子によってiMGLを処理することと、(ii)ミクログリア細胞からケモカインを分泌することとを含む。いくつかの実施形態では、iMGLを処理するために使用される因子は、リポ多糖、INFγ、またはIL-1βである。分泌されるケモカインは、ミクログリア細胞によって分泌されることが知られている任意のケモカインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、分泌されるケモカインは、TNFα、CCL2、CCL4、およびCXCL10のうちの任意の1つ以上を含む。
遊走とカルシウム移行
本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、ADP処理に応答して遊走し、および/またはADP処理がカルシウム移行を誘発する。いくつかの実施形態では、P2ry12の阻害は、ADP媒介性のiMGLの遊走および/またはADP媒介性のカルシウム移行を無効にする。いくつかの実施形態では、P2ry12の阻害は、阻害剤PSB0739を介して起こる。
本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、ADP処理に応答して遊走し、および/またはADP処理がカルシウム移行を誘発する。いくつかの実施形態では、P2ry12の阻害は、ADP媒介性のiMGLの遊走および/またはADP媒介性のカルシウム移行を無効にする。いくつかの実施形態では、P2ry12の阻害は、阻害剤PSB0739を介して起こる。
いくつかの実施形態では、iMGLを遊走させる方法が提供される。この方法は、(i)ADPによってiMGLを処理することと、(ii)iMGLを遊走させることとを含む。いくつかの実施形態では、カルシウム移行を生じさせる方法が提供される。この方法は、(i)ADPによってiMGLを処理することと、(ii)iMGLにおいてカルシウム移行を生じさせることとを含む。
iMGLによる貪食
本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、貪食が可能である。本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、ミクログリアが貪食することができる当該技術分野において公知の任意の因子を貪食することができる。いくつかの実施形態では、iMGLが貪食する因子には、Aβ、蛍光標識Aβ、タウ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか1つ以上が含まれる。
本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、貪食が可能である。本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、ミクログリアが貪食することができる当該技術分野において公知の任意の因子を貪食することができる。いくつかの実施形態では、iMGLが貪食する因子には、Aβ、蛍光標識Aβ、タウ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか1つ以上が含まれる。
いくつかの実施形態では、iMGL貪食の方法が提供される。この方法は、(i)iMGLを化合物:Aβ、蛍光標識Aβ、タウ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか1つ以上に曝露することと、(ii)化合物を貪食することとを含む。
本明細書で提供されるiMGLのいずれかは、ヒトシナプトソーム(hS)を貪食することができる。いくつかの実施形態では、iMGLがhSを貪食する方法が提供される。この方法は、(i)iMGLをhSに曝露することと、(ii)hSを貪食することと、を含む。いくつかの実施形態では、hSは蛍光標識されている。
アルツハイマー病の試験におけるiMGLの有用性
本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、異なる刺激に応答して遺伝子発現を制御することができる。いくつかの実施形態では、刺激は、ニューロン、例えばラット海馬ニューロンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているiMGLのいずれかは、遺伝子:CABLES、TRIM4、MITF、MMP2、およびSLCA25のうちのいずれか1つ以上を差次的に制御することができる。いくつかの実施形態では、iMGLは、遺伝子:TYROPB、CD33、およびPICALMのうちのいずれか1つ以上を上方制御する。
本明細書に記載されるiMGLのいずれかは、異なる刺激に応答して遺伝子発現を制御することができる。いくつかの実施形態では、刺激は、ニューロン、例えばラット海馬ニューロンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているiMGLのいずれかは、遺伝子:CABLES、TRIM4、MITF、MMP2、およびSLCA25のうちのいずれか1つ以上を差次的に制御することができる。いくつかの実施形態では、iMGLは、遺伝子:TYROPB、CD33、およびPICALMのうちのいずれか1つ以上を上方制御する。
いくつかの実施形態では、iMGLにおける遺伝子発現を制御する方法が提供される。この方法のうちの1つは、(i)iMGLをニューロンと共培養することと、(ii)iMGLにおいて遺伝子を差次的に制御することとを含む。iMGLと共培養されるニューロンは、あらゆる種の任意のニューロンを含む。いくつかの実施形態では、ニューロンはラット海馬ニューロンである。
別の方法は、(i)iMGLを、化合物:Aβ、蛍光標識Aβ、タウ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか1つ以上に曝露することと、(ii)差次的に遺伝子を制御することとを含む。差次的に制御される遺伝子は、Aβ、蛍光標識Aβ、タウ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーに応答してミクログリアにおいて差次的に制御される遺伝子の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、差次的に制御される遺伝子は、CD33、TYROPB、およびPICALMのうちのいずれか1つ以上を任意の組み合わせで含む上方制御された遺伝子である。
iMGLの使用方法
いくつかの実施形態では、ニューロンのキューに応答してiMGLにおいて遺伝子発現を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、この方法は、(i)iMGLを、任意の組み合わせの、因子CX3CL1、CD200、およびTGFβのうちの1つ以上に曝露することと、(ii)任意の組み合わせの、差次的に制御される遺伝子:P2ry12、EGR1、TGFβ1、ETV5、CX3CR1、APOE、BIN1、CD33、GPR84、COMT、APP、PSEN1、PSEN2、HTT、GRN、FUS、TARDP、VCP、SNCA、C9ORF72、LRRK2、およびSOD1のうちの1つ以上を評価することとを含む。
いくつかの実施形態では、ニューロンのキューに応答してiMGLにおいて遺伝子発現を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、この方法は、(i)iMGLを、任意の組み合わせの、因子CX3CL1、CD200、およびTGFβのうちの1つ以上に曝露することと、(ii)任意の組み合わせの、差次的に制御される遺伝子:P2ry12、EGR1、TGFβ1、ETV5、CX3CR1、APOE、BIN1、CD33、GPR84、COMT、APP、PSEN1、PSEN2、HTT、GRN、FUS、TARDP、VCP、SNCA、C9ORF72、LRRK2、およびSOD1のうちの1つ以上を評価することとを含む。
いくつかの実施形態では、皮質へのiMGLの生着を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、この方法は、(i)iMGLを皮質に移植することと、(ii)皮質へのiMGLの生着を評価することとを含む。いくつかの実施形態では、工程(ii)は、工程(i)の少なくとも2週間後に、例えば、工程(i)の少なくとも3週間後に、工程(i)の少なくとも4週間後に、工程(i)の少なくとも5週間後に、工程(i)の少なくとも6週間後に、工程(i)の少なくとも7週間後に、工程(i)の少なくとも8週間後に、工程(i)の少なくとも9週間後に、工程(i)の少なくとも10週間後に、工程(i)の少なくとも11週間後に、工程(i)の少なくとも12週間後に、工程(i)の少なくとも13週間後に、工程(i)の少なくとも14週間後に、工程(i)の少なくとも15週間後に、工程(i)の少なくとも16週間後に、(i)の少なくとも17週間後に、工程(i)の少なくとも18週間後に、工程(i)の少なくとも19週間後に、または工程(i)の少なくとも20週間後に、起こる。いくつかの実施形態では、工程(ii)は工程(i)の2か月後に起こる。いくつかの実施形態では、この方法は、iMGLをマウスの皮質に移植することをさらに含む。いくつかの実施形態では、マウスは、MITRGマウスである。
いくつかの実施形態では、ADニューロパシーとiMGLの相互作用を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、(i)iMGLを海馬に移植することと、(ii)海馬におけるiMGLの相互作用を評価することとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、斑へのiMGLの遊走を評価することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、線維性AβのiMGLによる貪食を評価することを含む。
いくつかの実施形態では、3D神経環境でヒトミクログリアを試験する方法であって、iMGLを哺乳動物の脳に移植することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、哺乳動物の脳はマウスの脳である。いくつかの実施形態では、iMGLはマウスの脳の海馬に移植される。いくつかの実施形態では、マウスは野生型マウスである。いくつかの実施形態では、マウスはADマウス系統である。
上述の実施形態のいくつかの態様は、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の実施例においてさらに詳細に開示される。
誘導多能性幹細胞(iPSC)からのヒトミクログリア様(iMGL)細胞の産生
わずか5週間でiPSCからミクログリア様細胞(iMGL)を首尾よく生成するために、2段階の完全に定義されたプロトコールが開発された(図1A)。このおよび他の実施例の方法およびプロトコールを同様の方法で使用して、ESCを含む他のPSCからiMGLを生成することができる。このアプローチを利用して、10を超える独立したiPSC株からiMGLを首尾よく生成した。第1に、iPSCは、造血始原細胞(iHPC)に分化し、iHPCが発達中にミクログリアを生じる卵黄嚢に由来する初期原始造血細胞を表すため、これはミクログリアの個体発生を再現する。このプロトコール(図1Bi)は、10日後に、CD43+/CD235a+/CD41+である原始iHPCをもたらした。CD43+細胞のFACS選別は、このアプローチが、90%を超える純度で、iHPCを産生したことを明らかにした(図1Bii)。
わずか5週間でiPSCからミクログリア様細胞(iMGL)を首尾よく生成するために、2段階の完全に定義されたプロトコールが開発された(図1A)。このおよび他の実施例の方法およびプロトコールを同様の方法で使用して、ESCを含む他のPSCからiMGLを生成することができる。このアプローチを利用して、10を超える独立したiPSC株からiMGLを首尾よく生成した。第1に、iPSCは、造血始原細胞(iHPC)に分化し、iHPCが発達中にミクログリアを生じる卵黄嚢に由来する初期原始造血細胞を表すため、これはミクログリアの個体発生を再現する。このプロトコール(図1Bi)は、10日後に、CD43+/CD235a+/CD41+である原始iHPCをもたらした。CD43+細胞のFACS選別は、このアプローチが、90%を超える純度で、iHPCを産生したことを明らかにした(図1Bii)。
第2に、CD43+ iHPCは、CSF-1、IL-34、およびTGFβ1を含む無血清分化培地(実験室で配合)で増殖した。14日目までに、細胞は、骨髄関連転写因子PU.1およびミクログリアで濃縮されるタンパク質TREM2(図1A iii)を発現し、ミクログリアの運命への初期の拘束性を実証した。このプロトコールでは大量のiMGLをもたらしたため、それらの発達に続いて、フローサイトメトリーにより4日ごとにiMGLのインビトロでの特性評価をした。14日目の初期iMGLは、c-kit-/CD45+であり(図1C)、骨髄系統への拘束性が示唆された。さらに、細胞は、CD45+/CX3CR1-(A1)およびCD45+/CX3CR1+(A2)の集団にさらに細分化された。CD45の発現は、発達しているiMGLにおいて一貫してモニターされ、単球由来マクロファージ(MD-Mφ)と比較された。CD45の発現は成熟とともに増加したが、レベルはマクロファージのレベルに達することはなく(図1D)、マウスの発達と一致した。iMGLの小集団(約10%)もまた14日目までに中間のCD11bレベルを発現し、これも細胞の成熟に伴い増加したが、同様にマクロファージのレベルに達することはなかった(図1Eおよび1F)。
38日目までに、プリン受容体P2RY12およびTREM2の共局在化および定量化(>96%)によって評価されるように、iMGLは高純度を示した(図1H)。100万個のiPSCが、このプロトコールによって3,000万~4,000万個のiMGLを産生し、このアプローチがハイコンテントスクリーニングのために容易にスケールアップできることを示唆している。得られるiMGLは、サイトスピン/ギムザ染色(図1G)およびタンパク質発現(図1I)によると、ヒトミクログリアに類似するが、単球またはマクロファージには類似しない。インビボでのマウスのミクログリアの発達と同様に、インビトロで発達したiMGLは、PU.1、TREM2、およびCD11bint/CD45lowを発現し、胎児ミクログリアに類似する。iMGLがインビトロで成熟するにつれて、インビボのミクログリアと同様に、より分岐した(図1A iv)。
iMGLのトランスクリプトーム分析
iMGLのトランスクリプトームは、ヒト初代培養胎児ミクログリア(胎児MG)および成人ミクログリア(成人MG)と比較してプロファイリングされた。CD14+/CD16-単球(CD14 M)、CD14+/CD16+炎症性単球(CD16 M)、骨髄樹状細胞(血液DC)、iHPC、およびiPSCもまた、幹細胞および他の骨髄分子シグネチャと比較するために検査された。相関分析および主成分分析(PCA)により、iMGLの胎児MGおよび成人MGとの顕著な類似性が明らかになった(胎児MGおよび成人MGは、図2Aの同一の円で囲まれたクラスター内に位置する;図9Aも参照されたい)。さらに、第1の主成分PC1(21.3%分散、図2A矢印)は、iPSCからiHPCを介してiMGL細胞への分化の時系列を定義し、PC2とPC3はそれぞれ樹状突起と単球の軌跡を定義した。
iMGLのトランスクリプトームは、ヒト初代培養胎児ミクログリア(胎児MG)および成人ミクログリア(成人MG)と比較してプロファイリングされた。CD14+/CD16-単球(CD14 M)、CD14+/CD16+炎症性単球(CD16 M)、骨髄樹状細胞(血液DC)、iHPC、およびiPSCもまた、幹細胞および他の骨髄分子シグネチャと比較するために検査された。相関分析および主成分分析(PCA)により、iMGLの胎児MGおよび成人MGとの顕著な類似性が明らかになった(胎児MGおよび成人MGは、図2Aの同一の円で囲まれたクラスター内に位置する;図9Aも参照されたい)。さらに、第1の主成分PC1(21.3%分散、図2A矢印)は、iPSCからiHPCを介してiMGL細胞への分化の時系列を定義し、PC2とPC3はそれぞれ樹状突起と単球の軌跡を定義した。
300個のミクログリア、マクロファージ、およびこれまでの研究から適応した他の免疫関連遺伝子を使用したバイクラスタリング分析により、群間の類似性が同定され、一般的な遺伝子クラスターが強調された。この分析は、iMGLがミクログリアとクラスター化するが、他の骨髄細胞、iHPC、およびiPSCとは異なることを再び示した(図2B)。重要なことに、iMGL、胎児MG、および成人MGは、P2RY12、GPR34、C1Q、CABLES1、BHLHE41、TREM2、ITAM PROS1、APOE、SLCO2B1、SLC7A8、PPARD、およびCRYBB1などの標準的なミクログリア遺伝子を発現していた(図2C;表1)。単球と比較するとき、iMGLは骨髄性遺伝子RUNX1、PU.1、およびCSF1Rを発現していたが(図8A)、単球特異的転写因子IRF1、KLF4、NR4A1を発現していなかった(図8B)。iMGL、CD14 M、およびCD16 Mの差次的分析(図8Dおよび8E)は、iMGLがCX3CR1、TGFBR1、RGS10、およびGAS6を含むミクログリア遺伝子(2倍より大きい変化かつp<0.001)を主に発現していたが、単球およびマクロファージ遺伝子KLF2、TREM1、MPO、ITGAL、およびADGRE5を発現していなかったことをさらに強調した。タンパク質レベルでは、初代培養ミクログリアのように、iMGLはCD45hi MD-Mφと比較してCD45loであり、ミクログリア表面タンパク質CX3CR1、TGFBR1、およびPROS1を発現していた(図10A、10B、および10C)。表2は、胎児MGおよびiMGLと比較して、成人MGにおいて濃縮された上位GO経路を示している。表3は、成人MGおよびiMGLと比較して、胎児MGにおいて濃縮されたGO経路を示している。表4は、胎児MGおよび成人MGと比較して、iMGLにおいて濃縮されたGO経路を示している。集合的に、偏りのない全トランスクリプトーム分析により、iMGLが、ヒトの健康と疾患におけるミクログリアの生理学と機能を試験するために使用できる主要なヒトミクログリアに非常に類似した細胞モデルとして強力に確立された。
iMGLの機能分析
iMGLは、機能的アッセイと生理学的アッセイの両方を使用して、ミクログリアの代替物として検証された。リポ多糖(LPS)により刺激された、ならびにIL-1βおよびIFNγにより刺激された(AD患者およびマウスモデルで上昇する2つのサイトカイン)iMGLによるサイトカイン/ケモカイン分泌を測定した。結果は、iMGLが、10個の検査されたサイトカインを低いが検出可能なレベルで分泌したことを示している(表5)。しかしながら、IFNγまたはIL-1βに応答して、iMGLはTNFα、CCL2、CCL4、およびCXCL10を含む8個の異なるケモカインを分泌した。予想されたとおり、iMGLはCCL3を除く全ての測定されたサイトカインの誘導によって、LPSに堅牢に応答した(値については表5を参照されたい)。まとめると、このデータは、iMGLが細胞表面受容体刺激に基づいてサイトカイン/ケモカインを差次的に放出することを示しており、これは、急性に単離された初代培養ミクログリアで観察される応答(Rustenhoven et al., 2016)に密接に一致する発見である。
iMGLは、機能的アッセイと生理学的アッセイの両方を使用して、ミクログリアの代替物として検証された。リポ多糖(LPS)により刺激された、ならびにIL-1βおよびIFNγにより刺激された(AD患者およびマウスモデルで上昇する2つのサイトカイン)iMGLによるサイトカイン/ケモカイン分泌を測定した。結果は、iMGLが、10個の検査されたサイトカインを低いが検出可能なレベルで分泌したことを示している(表5)。しかしながら、IFNγまたはIL-1βに応答して、iMGLはTNFα、CCL2、CCL4、およびCXCL10を含む8個の異なるケモカインを分泌した。予想されたとおり、iMGLはCCL3を除く全ての測定されたサイトカインの誘導によって、LPSに堅牢に応答した(値については表5を参照されたい)。まとめると、このデータは、iMGLが細胞表面受容体刺激に基づいてサイトカイン/ケモカインを差次的に放出することを示しており、これは、急性に単離された初代培養ミクログリアで観察される応答(Rustenhoven et al., 2016)に密接に一致する発見である。
iMGLは、変性ニューロンから漏出した細胞外ヌクレオチドを感知することができ、ミクログリアの恒常性機能に重要であることが示されているミクログリアにおいて濃縮されたプリン受容体P2ry12を発現するため(図1Hおよび2C)、ADP-P2ry12媒介性の走化性およびカルシウム移行が評価された。ADPに応答してiMGLが堅牢に遊走し、ADPがカルシウム移行を誘発することが判定され(図3Dおよび3E)、これは、P2ry12特異的阻害剤PSB0739によって無効にすることができる。これらの生理学的発見は、iMGLが機能的表面受容体を発現し、ミクログリアの生理学の定量分析を可能にすることをさらに明確にする。
ミクログリアは星状細胞とともに、シナプス刈り込みにも重要な役割を果たす。インビトロシナプトソーム貪食アッセイは刈り込みを試験するための確立された代替物であるため、iMGLのヒトシナプトソーム(hS)を貪食する能力を定量的に評価した。MD-Mφと比較して、pHrodo標識hSのiMGLによる貪食はそれほど堅牢ではなかった(図3F 3G)。しかしながら、iMGLはイー・コリ(E. coli)粒子と比較してhSを優先的に内部移行し、MD-Mφ(図10Dおよび10E)に対して標準化すると、iMGLおよびミクログリアはMD-Mφよりも恒常性機能に偏っているという概念を支持する。
ミクログリア(およびiMGL)はC1qとCR3(CD11b/CD18二量体)の両方を発現するため、iMGLを使用して、ヒトミクログリアにおけるシナプス刈り込みが主にこの経路に関与するかどうかを評価した。無添加のCD11b抗体を使用すると、hSのiMGLによる貪食が有意に低下した(-40.0%、***p<0.0001)(図3Hおよび3I)。対照的に、シナプス刈り込みにも関与しているMERTKの阻害剤(UNC569)は、iMGLによるhS貪食をわずかに減少させたのみであった(-12.6%、*p<0.05)(図3Hおよび3I)。マウスKO試験の試験と同様に、そのデータはMERTKがヒトのミクログリア媒介性シナプス刈り込みに小さな役割を果たしていることを示し、C1q/CR3がヒトのミクログリア媒介性シナプス刈り込みに不可欠であることを実証している。
iMGLを使用してアルツハイマー病を試験することの有用性を検証する
これまでの報告では、ベータ-アミロイド(Aβ)のミクログリアクリアランスの障害がADの病態生理に関与していることが示されている。したがって、iMGLを検査して、2つの特徴的なAD病理であるAβまたはタウを貪食できるかどうかを判定した。初代培養ミクログリアと同様に、iMGLは蛍光標識された線維性Aβを内部移行した(図4B、下)。iMGLはまた、pHrodo標識された脳由来タウオリゴマー(BDTO)を認識し、内部移行した(図4B、上)。放射された蛍光は、酸性リソソーム区画へのpHrodoコンジュゲートBDTOの輸送を示し、iMGLが神経細胞死中に放出される可能性のある細胞外タウを積極的に摂取できることを示した。これらのデータは、ミクログリアがADおよび他のタウオパシーのタウ伝播に役割を果たす可能性があるという最近の発見を支持する。まとめると、これらの発見は、Aβ分解を強化するか、またはエキソソーム媒介性タウ放出を遮断するハイスループット薬物スクリーニングアッセイで化合物を同定するためにiMGLを利用できることを示唆している。
これまでの報告では、ベータ-アミロイド(Aβ)のミクログリアクリアランスの障害がADの病態生理に関与していることが示されている。したがって、iMGLを検査して、2つの特徴的なAD病理であるAβまたはタウを貪食できるかどうかを判定した。初代培養ミクログリアと同様に、iMGLは蛍光標識された線維性Aβを内部移行した(図4B、下)。iMGLはまた、pHrodo標識された脳由来タウオリゴマー(BDTO)を認識し、内部移行した(図4B、上)。放射された蛍光は、酸性リソソーム区画へのpHrodoコンジュゲートBDTOの輸送を示し、iMGLが神経細胞死中に放出される可能性のある細胞外タウを積極的に摂取できることを示した。これらのデータは、ミクログリアがADおよび他のタウオパシーのタウ伝播に役割を果たす可能性があるという最近の発見を支持する。まとめると、これらの発見は、Aβ分解を強化するか、またはエキソソーム媒介性タウ放出を遮断するハイスループット薬物スクリーニングアッセイで化合物を同定するためにiMGLを利用できることを示唆している。
ミクログリア遺伝子は遅発性ADに関与しているが、疾患のリスクをどのように修正するかはほとんどわかっていない。したがって、iMGLを調査して、これらの遺伝子がミクログリアの機能とADリスクにどのように影響し得るかを判定した。これらの25個のAD-GWAS遺伝子のみを使用した階層的クラスタリングは、iMGLがミクログリアに類似し、末梢骨髄細胞に類似しないことを実証した(図4A)。調査した基底状態では、iMGLとミクログリアは、マウスのオーソログを持たないもの、すなわちCD33、MS4A4A、CR1を含む多くのAD-GWAS関連遺伝子を発現していた。したがって、iMGLを使用して、トランスジェニックマウスでは再現できない方法において、これらの遺伝子の発現の変化がミクログリアの表現型にどのように影響するかを試験することができる。次に、fAβまたはBDTO処理を調査して、ミクログリアにおけるAD-GWAS遺伝子発現にどのように影響するかを判定した。fAβ曝露後、iMGLは、ABCA7(5.79±0.44)、CD33(6.02±0.41)、TREM2(4.86±0.50)、およびAPOE(2.52±0.19)、Aβクリアランス/分解に関与する遺伝子を含む10個の遺伝子(表6)の発現を増加させた。BDTOは、これまでにタウ媒介性毒性に関与していたCD2AP(4.62±0.45)を含む4個の遺伝子の発現を増加させた。さらに、BDTOと比較して、fAβにおいて6個の遺伝子が差次的に上昇した(表6)。さらに、ベースライン時に他の骨髄細胞でより濃縮されていた遺伝子であるCD33、TYROBP、およびPICALMは、fAβおよびBDTOによって上方制御され、タンパク質症がミクログリアの表現型を変化させて浸潤性末梢骨髄細胞に類似するようにしている可能性を示唆する(Stalder et al., 2005、Prinz et al., 2011、Chan et al., 2007)。AD-GWAS遺伝子に加えて、iMGLはC9orf72、GRN、LRRK2、およびTARDBPを発現し、ミクログリアが病因において顕著な役割を果たすALS、FTD、およびDLBなどの他の神経疾患の試験に使用することができる(図11)。
神経環境におけるiMGLの相互作用と機能
脳では、ニューロンとグリアがミクログリアと相互作用し、機能と遺伝子発現に影響する。したがって、iMGLをラット海馬ニューロン(21 div)とともに培養して、iMGLがニューロンのキューにどのように応答するかを評価した(図5A)。ラット海馬ニューロンは、培養においてシナプスを容易に形成し、限られた変動で生成できるために使用された。その後、iMGLは、ヒト特異的CD45およびCD11b抗体によるFACsによってニューロンから分離され、トランスクリプトームレベルでプロファイリングされた(図5B)。差次的遺伝子発現分析により、ニューロンの共培養が156個のiMGL遺伝子を上方制御し、244個のiMGL遺伝子を下方制御したことが明らかになった(図5Cおよび5D)。FFAR2とCOL26A1は、定義された因子のみで培養されたiMGLで差次的に発現する2個の遺伝子であり、発生的にプライムされたミクログリアプロファイルを示す。対照的に、ニューロンとのミクログリアの共培養は、ニューロンのグリコカリックスと相互作用するヒト特異的シアル酸結合タンパク質であるSiglec11および12の発現を増加させた。さらに、ミクログリア遺伝子CABLES1、TRIM14、MITF、MMP2、およびSLCA25の発現増加は、ミクログリアの成熟におけるニューロン表面のキューと可溶性因子の両方に関与している(図5Eおよび12)。
脳では、ニューロンとグリアがミクログリアと相互作用し、機能と遺伝子発現に影響する。したがって、iMGLをラット海馬ニューロン(21 div)とともに培養して、iMGLがニューロンのキューにどのように応答するかを評価した(図5A)。ラット海馬ニューロンは、培養においてシナプスを容易に形成し、限られた変動で生成できるために使用された。その後、iMGLは、ヒト特異的CD45およびCD11b抗体によるFACsによってニューロンから分離され、トランスクリプトームレベルでプロファイリングされた(図5B)。差次的遺伝子発現分析により、ニューロンの共培養が156個のiMGL遺伝子を上方制御し、244個のiMGL遺伝子を下方制御したことが明らかになった(図5Cおよび5D)。FFAR2とCOL26A1は、定義された因子のみで培養されたiMGLで差次的に発現する2個の遺伝子であり、発生的にプライムされたミクログリアプロファイルを示す。対照的に、ニューロンとのミクログリアの共培養は、ニューロンのグリコカリックスと相互作用するヒト特異的シアル酸結合タンパク質であるSiglec11および12の発現を増加させた。さらに、ミクログリア遺伝子CABLES1、TRIM14、MITF、MMP2、およびSLCA25の発現増加は、ミクログリアの成熟におけるニューロン表面のキューと可溶性因子の両方に関与している(図5Eおよび12)。
ミクログリアの基本的な特性は、高度に分岐した突起によるCNS環境の監視である。CNS環境においてiMGLがどのように相互作用し得るかを調査するために、iMGLをヒトiPSC(hiPSC)3D脳オルガノイド(BORG)と培養した。BORGには、皮質様ネットワークに自己組織化するニューロンおよび星状細胞が含まれるが、ミクログリアを欠く(図6、パネルB)。ミクログリアが発達中の神経管に入る方法と同様に、iMGLがBORGに侵入するかどうかを試験するために、iMGLがBORG培養に追加された。3日目までに、iMGLはBORGSに埋め込まれ、培地内でもはや検出できなくなり、ニューロンのキューに対する急速なiMGLの走化性を示唆した(図6、パネルA)。また、iMGLは、3Dオルガノイド環境において様々な程度の分岐突起をタイリングおよび伸長した(図6、パネルB)。iMGL突出は、大多数の細胞で観察され、インビボのミクログリアと同様の形態を示した(図6、パネルB)。一部のiMGLのIMARIS 3D画像再構成は、BORGにおいて分岐したiMGLの発達を強調している。iMGLが神経損傷に応答するかどうかを判定するために、BORGに25ゲージの針を突き刺した(白い長い矢印、図6、パネルC)。損傷後、iMGLは損傷部位の近くおよびBORGの縁部にクラスター化し(図6、パネルC)、よりアメーバ様の形態を採用し、損傷または疾患の脳に見出される「活性化」ミクログリアに類似する(図6、パネルC)。まとめると、これらのデータは、iMGLが3D脳環境内に組み込まれ、成熟し、分岐し、脳ミクログリアと同様に、損傷に応答できることを示している。
脳内のニューロン、星状細胞、および内皮細胞とのiMGLの相互作用
脳内のニューロン、星状細胞、および内皮細胞は、ミクログリアと相互作用して、遺伝子発現および機能に影響を与える。分化プロトコールは、CX3CL1、CD200、TGFβを含むこれらの他の細胞型に由来するシグナルを含めることにより、脳に存在するCNSキューを再現しようとした。全トランスクリプトームRNA-seq分析により、インビトロにおいてミクログリアを確立するためのこれらの因子の重要性が確認された(図16A~Eおよび17A~E)。グリア由来のサイトカインであるTGFβは、マウスのミクログリアのインビボにおける発達およびミクログリア特異的なトランスクリプトームシグネチャの維持に必要である。差次的遺伝子発現分析により、ヒトミクログリアのトランスクリプトームシグネチャの維持におけるTGFβの役割が確認され、TGFβによってiMGLにおいて、1262個の遺伝子が差次的に発現したが、TGFβを除去した後(24時間)、iMGLにおいて1517個の遺伝子が差次的に発現した。差次的に発現される遺伝子の多くは、P2RY12、TGFβR1、およびCD33、転写因子EGR1およびETV5、およびAPOEを含むコアミクログリアシグネチャ標的として同定されている(図16A~C)。遺伝子オントロジーの検査により、TGFβ依存性のAD、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患経路が強調された(図16D)。さらに、TGFβの除去により、TREM2、APOE、ABCA7、SPI1(CELF1遺伝子座)、PILRA(ZCWPW1遺伝子座)、ならびにHLA-DRおよびMS4A遺伝子クラスターを含むAD GWAS遺伝子座遺伝子(Karch et al.、2016)としても同定される多くのヒトミクログリア恒常性標的に顕著な変化がもたらされ、多くの同定されたAD GWAS遺伝子がミクログリアの恒常性の維持に機能することを示唆し(図16E)、AD GWAS遺伝子機能を調べるためのiMGLの有用性を明確にしている。
脳内のニューロン、星状細胞、および内皮細胞は、ミクログリアと相互作用して、遺伝子発現および機能に影響を与える。分化プロトコールは、CX3CL1、CD200、TGFβを含むこれらの他の細胞型に由来するシグナルを含めることにより、脳に存在するCNSキューを再現しようとした。全トランスクリプトームRNA-seq分析により、インビトロにおいてミクログリアを確立するためのこれらの因子の重要性が確認された(図16A~Eおよび17A~E)。グリア由来のサイトカインであるTGFβは、マウスのミクログリアのインビボにおける発達およびミクログリア特異的なトランスクリプトームシグネチャの維持に必要である。差次的遺伝子発現分析により、ヒトミクログリアのトランスクリプトームシグネチャの維持におけるTGFβの役割が確認され、TGFβによってiMGLにおいて、1262個の遺伝子が差次的に発現したが、TGFβを除去した後(24時間)、iMGLにおいて1517個の遺伝子が差次的に発現した。差次的に発現される遺伝子の多くは、P2RY12、TGFβR1、およびCD33、転写因子EGR1およびETV5、およびAPOEを含むコアミクログリアシグネチャ標的として同定されている(図16A~C)。遺伝子オントロジーの検査により、TGFβ依存性のAD、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患経路が強調された(図16D)。さらに、TGFβの除去により、TREM2、APOE、ABCA7、SPI1(CELF1遺伝子座)、PILRA(ZCWPW1遺伝子座)、ならびにHLA-DRおよびMS4A遺伝子クラスターを含むAD GWAS遺伝子座遺伝子(Karch et al.、2016)としても同定される多くのヒトミクログリア恒常性標的に顕著な変化がもたらされ、多くの同定されたAD GWAS遺伝子がミクログリアの恒常性の維持に機能することを示唆し(図16E)、AD GWAS遺伝子機能を調べるためのiMGLの有用性を明確にしている。
iMGL表現型に対するCX3CL1およびCD200の効果
CX3CL1とCD200は、内因性ミクログリア表現型に向けてiMGLをさらに教育できる、ニューロンおよび内皮由来のキューである。CX3CL1とCD200を試験して、これらの因子の包含または除外がiMGL表現型をどのように調節するかを判定した。iMGLへのCD200とCX3CL1の添加により、COMT(図16B)、Siglec-10に結合し、ミクログリアセンソームの一部としてDAP12と相互作用する細胞表面受容体であるCD52、ADに関与するMHC II複合体の一員である、HLADRB5などの選択された遺伝子の発現を増加させたが、コアミクログリア遺伝子(例えば、P2RY12、TYROBP、OLFML3)およびADリスク遺伝子の同様の発現レベルを維持した(図17A)。結果は、CD200およびCX3CL1が、fAβなどのCNS刺激に対するiMGLの応答を調節することを示した。CD200とCX3CL1の非存在下で、fAβは、ミスフォールディングしたフォールディングしたタンパク質、表面受容体、またはCLU(APOJ)などの抗アポトーシス事象との相互作用に関与するAD-GWAS遺伝子の発現を刺激した。これらの2つの因子に曝露された細胞は、fAβに差次的に応答するが、MS4A遺伝子、TREM2、TYROBP、CD33、およびABCA7を含む、ニューロンモチーフの細胞表面認識またはCNS基質の貪食に関与する遺伝子の発現を増加させる(図178B)。これらの試験は、CD200-CD200R1および/またはCX3CL1-CX3CR1軸がミクログリアを調節して神経変性状態に応答させることができるという概念をさらに支持する。したがって、CD200およびCX3CL1などの可溶性CNS因子への曝露により、ミクログリア特異的転写制御エレメントへのアクセスが可能になる可能性がある。
CX3CL1とCD200は、内因性ミクログリア表現型に向けてiMGLをさらに教育できる、ニューロンおよび内皮由来のキューである。CX3CL1とCD200を試験して、これらの因子の包含または除外がiMGL表現型をどのように調節するかを判定した。iMGLへのCD200とCX3CL1の添加により、COMT(図16B)、Siglec-10に結合し、ミクログリアセンソームの一部としてDAP12と相互作用する細胞表面受容体であるCD52、ADに関与するMHC II複合体の一員である、HLADRB5などの選択された遺伝子の発現を増加させたが、コアミクログリア遺伝子(例えば、P2RY12、TYROBP、OLFML3)およびADリスク遺伝子の同様の発現レベルを維持した(図17A)。結果は、CD200およびCX3CL1が、fAβなどのCNS刺激に対するiMGLの応答を調節することを示した。CD200とCX3CL1の非存在下で、fAβは、ミスフォールディングしたフォールディングしたタンパク質、表面受容体、またはCLU(APOJ)などの抗アポトーシス事象との相互作用に関与するAD-GWAS遺伝子の発現を刺激した。これらの2つの因子に曝露された細胞は、fAβに差次的に応答するが、MS4A遺伝子、TREM2、TYROBP、CD33、およびABCA7を含む、ニューロンモチーフの細胞表面認識またはCNS基質の貪食に関与する遺伝子の発現を増加させる(図178B)。これらの試験は、CD200-CD200R1および/またはCX3CL1-CX3CR1軸がミクログリアを調節して神経変性状態に応答させることができるという概念をさらに支持する。したがって、CD200およびCX3CL1などの可溶性CNS因子への曝露により、ミクログリア特異的転写制御エレメントへのアクセスが可能になる可能性がある。
CNS環境とのiMGLの直接接触がiMGL成熟に与える影響を検査する
次に、CNS環境と直接接触することによってiMGLの成熟を達成できるかどうかを検査した。iMGLをラット海馬ニューロン(21 DIV)とともに培養して、iMGLがニューロン表面のキューにどのように応答するかを評価した(図5A)。ラット海馬ニューロンは、培養においてシナプスを容易に形成し、限られた変動で生成できるために使用された。その後、iMGLは、ヒト特異的CD45およびCD11b抗体によるFACsによってニューロンから分離され、トランスクリプトームレベルでプロファイリングされた(図5B)。差次的遺伝子発現分析により、ニューロンの共培養が156個のiMGL遺伝子を上方制御し、244個のiMGL遺伝子を下方制御したことが明らかになった(図5CおよびD)。FFAR2とCOL26A1は、定義された因子のみで培養されたiMGLで差次的に発現する2個の遺伝子であり、発生的にプライムされたミクログリアプロファイルを示す。対照的に、ニューロンとのミクログリアの共培養は、ニューロンのグリコカリックスと相互作用し、神経保護において機能し、炎症誘発性シグナル伝達を抑制し、それによりミクログリアの恒常性状態を維持する、ヒト特異的シアル酸結合タンパク質であるSiglec11および12の発現を増加させた。さらに、ミクログリア遺伝子CABLES1、TRIM14、MITF、MMP2、およびSLC2A5の発現の増加が観察された。全体として、これらの結果は、ミクログリアの成熟における因子として、可溶性および表面の両方のCNSキューを暗示している(図5A~F)。
次に、CNS環境と直接接触することによってiMGLの成熟を達成できるかどうかを検査した。iMGLをラット海馬ニューロン(21 DIV)とともに培養して、iMGLがニューロン表面のキューにどのように応答するかを評価した(図5A)。ラット海馬ニューロンは、培養においてシナプスを容易に形成し、限られた変動で生成できるために使用された。その後、iMGLは、ヒト特異的CD45およびCD11b抗体によるFACsによってニューロンから分離され、トランスクリプトームレベルでプロファイリングされた(図5B)。差次的遺伝子発現分析により、ニューロンの共培養が156個のiMGL遺伝子を上方制御し、244個のiMGL遺伝子を下方制御したことが明らかになった(図5CおよびD)。FFAR2とCOL26A1は、定義された因子のみで培養されたiMGLで差次的に発現する2個の遺伝子であり、発生的にプライムされたミクログリアプロファイルを示す。対照的に、ニューロンとのミクログリアの共培養は、ニューロンのグリコカリックスと相互作用し、神経保護において機能し、炎症誘発性シグナル伝達を抑制し、それによりミクログリアの恒常性状態を維持する、ヒト特異的シアル酸結合タンパク質であるSiglec11および12の発現を増加させた。さらに、ミクログリア遺伝子CABLES1、TRIM14、MITF、MMP2、およびSLC2A5の発現の増加が観察された。全体として、これらの結果は、ミクログリアの成熟における因子として、可溶性および表面の両方のCNSキューを暗示している(図5A~F)。
ヒトの脳環境におけるiMGL相互作用
ミクログリアの基本的な特性は、高度に分岐した突起によるCNS環境の監視である。ヒトの脳環境においてiMGLがどのように相互作用し得るかを調査するために、iMGLをhiPSC 3D脳オルガノイド(BORG)と培養した。BORGには、皮質様ネットワークに自己組織化するニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトが含まれるが、ミクログリアを欠く(図6)。ミクログリアが発達中の神経管に入る方法と同様に、iMGLがBORGに侵入するかどうかを試験するために、iMGLがBORG培養に追加された。3日目までに、iMGLはBORGに埋め込まれ、培地内でもはや検出できなくなり、CNSのキューに対する急速なiMGLの走化性を示唆した(図6、パネルA~C)。また、7日目までに、iMGLは、3Dオルガノイド環境において様々な程度の分岐突起をタイリングおよび伸長した(図6、パネルD~F)。iMGLが神経損傷に応答するかどうかを判定するために、BORGに25ゲージの針を突き刺した。損傷後、iMGLは損傷部位の近くにクラスター化し、よりアメーバ様の形態を採用し、損傷または疾患の脳に見出される「活性化」ミクログリアに類似する(図6、パネルG~I)。まとめると、これらのデータは、iMGLがインビトロ3D脳およびCNS環境内に組み込まれ、そこでiMGLは、成熟し、分岐し、脳ミクログリアと同様に、損傷に応答できることを示している。
ミクログリアの基本的な特性は、高度に分岐した突起によるCNS環境の監視である。ヒトの脳環境においてiMGLがどのように相互作用し得るかを調査するために、iMGLをhiPSC 3D脳オルガノイド(BORG)と培養した。BORGには、皮質様ネットワークに自己組織化するニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトが含まれるが、ミクログリアを欠く(図6)。ミクログリアが発達中の神経管に入る方法と同様に、iMGLがBORGに侵入するかどうかを試験するために、iMGLがBORG培養に追加された。3日目までに、iMGLはBORGに埋め込まれ、培地内でもはや検出できなくなり、CNSのキューに対する急速なiMGLの走化性を示唆した(図6、パネルA~C)。また、7日目までに、iMGLは、3Dオルガノイド環境において様々な程度の分岐突起をタイリングおよび伸長した(図6、パネルD~F)。iMGLが神経損傷に応答するかどうかを判定するために、BORGに25ゲージの針を突き刺した。損傷後、iMGLは損傷部位の近くにクラスター化し、よりアメーバ様の形態を採用し、損傷または疾患の脳に見出される「活性化」ミクログリアに類似する(図6、パネルG~I)。まとめると、これらのデータは、iMGLがインビトロ3D脳およびCNS環境内に組み込まれ、そこでiMGLは、成熟し、分岐し、脳ミクログリアと同様に、損傷に応答できることを示している。
インビボのCNS環境の状況におけるiMGLの調査
iMGLは、インビボのCNS環境の状況において検査された。iMGL(38日目)は、Rag2欠損マウスおよびIL2rγ欠損マウスであり、ノックインされた4つのサイトカイン(M-CSFh;IL-3/GM-CSFh;TPOh)のヒト型も発現し、骨髄および他の白血球の異種移植および生存を可能にするMITRGマウスの皮質に移植された(図13)。移植の2カ月後、MITRG皮質の生着の程度を免疫組織化学により評価した。それぞれヒト特異的核または細胞質マーカーである、ku80(hNuclei)およびSC121(hCyto)を使用して、ヒトiMGLを内因性ミクログリアと区別した。P2ry12およびヒト特異的Tmem119抗体を使用して、移植されたミクログリアの恒常性状態と同一性を評価した。ku80とP2ry12の両方を共発現する移植されたヒトiMGLは、MITRG脳内に豊富であり、長期生着可能性を示唆した(図13パネルA~D)。より高倍率の画像は、膜分布がより微細な伸長突起を強調する静止皮質ミクログリアに類似する高度に分岐したiMGLにおけるP2ry12発現を示した(図13パネルB~D)。Tmem119はまた、hCyto+細胞体と高度に樹状化されたiMGLの突起の両方で発現していた(図13パネルE~H)。hCyto+細胞の高倍率画像は、Tmem119が主に膜に結合しており、発表された研究と一致していることを示す。まとめると、これらの発見は、iMGLの長期生存と生着により、Iba1、P2ry12、およびTmem119を発現し(図13パネルI~L)、内因性静止ミクログリアに類似している、高度に分岐したミクログリア様細胞が生じることを示唆している。また、恒常性P2ry12受容体の形態と高発現は、移植されたiMGLがマウスCNS疾患モデルにおけるヒトミクログリアの試験における潜在的な使用に変換される神経環境を活動的に監視していることを示唆している。
iMGLは、インビボのCNS環境の状況において検査された。iMGL(38日目)は、Rag2欠損マウスおよびIL2rγ欠損マウスであり、ノックインされた4つのサイトカイン(M-CSFh;IL-3/GM-CSFh;TPOh)のヒト型も発現し、骨髄および他の白血球の異種移植および生存を可能にするMITRGマウスの皮質に移植された(図13)。移植の2カ月後、MITRG皮質の生着の程度を免疫組織化学により評価した。それぞれヒト特異的核または細胞質マーカーである、ku80(hNuclei)およびSC121(hCyto)を使用して、ヒトiMGLを内因性ミクログリアと区別した。P2ry12およびヒト特異的Tmem119抗体を使用して、移植されたミクログリアの恒常性状態と同一性を評価した。ku80とP2ry12の両方を共発現する移植されたヒトiMGLは、MITRG脳内に豊富であり、長期生着可能性を示唆した(図13パネルA~D)。より高倍率の画像は、膜分布がより微細な伸長突起を強調する静止皮質ミクログリアに類似する高度に分岐したiMGLにおけるP2ry12発現を示した(図13パネルB~D)。Tmem119はまた、hCyto+細胞体と高度に樹状化されたiMGLの突起の両方で発現していた(図13パネルE~H)。hCyto+細胞の高倍率画像は、Tmem119が主に膜に結合しており、発表された研究と一致していることを示す。まとめると、これらの発見は、iMGLの長期生存と生着により、Iba1、P2ry12、およびTmem119を発現し(図13パネルI~L)、内因性静止ミクログリアに類似している、高度に分岐したミクログリア様細胞が生じることを示唆している。また、恒常性P2ry12受容体の形態と高発現は、移植されたiMGLがマウスCNS疾患モデルにおけるヒトミクログリアの試験における潜在的な使用に変換される神経環境を活動的に監視していることを示唆している。
海馬へとiMGLを移植して、iMGLがAD神経病理とどのように相互作用するかを判定する
iMGLは、これまでに生成され特性評価された異種移植適合性ADマウスの海馬に移植されて、インビボでiMGLがAD神経病理とどのように相互作用するかを検査した(図13パネルM~Pおよび図18)。移植されたiMGLは、発達中のミクログリアと同様に、白質路に沿って生着および遊走する(図13パネルM)。多くの場合、iMGLは、Aβ斑に向かって遊走し、突起を伸長させ、それらを壁で囲い始めた(図13パネルN~P)。多数のiMGLも線維性Aβを貪食し始めた(図13パネルN~P、図18パネルE~H)。同様に、ヒト胎児ミクログリアは、同一のADトランスジェニックモデルに移植されると、Aβに向かって遊走し、突起を伸長し、Aβを貪食した(図18パネルA~D)。
iMGLは、これまでに生成され特性評価された異種移植適合性ADマウスの海馬に移植されて、インビボでiMGLがAD神経病理とどのように相互作用するかを検査した(図13パネルM~Pおよび図18)。移植されたiMGLは、発達中のミクログリアと同様に、白質路に沿って生着および遊走する(図13パネルM)。多くの場合、iMGLは、Aβ斑に向かって遊走し、突起を伸長させ、それらを壁で囲い始めた(図13パネルN~P)。多数のiMGLも線維性Aβを貪食し始めた(図13パネルN~P、図18パネルE~H)。同様に、ヒト胎児ミクログリアは、同一のADトランスジェニックモデルに移植されると、Aβに向かって遊走し、突起を伸長し、Aβを貪食した(図18パネルA~D)。
実験方法および材料
試薬
別段の記載がない限り、全ての細胞培養フラスコ、試薬、サプリメント、サイトカイン、および一般的な試薬は、ThermoFisher(Carlsbad, CA)から購入した。
試薬
別段の記載がない限り、全ての細胞培養フラスコ、試薬、サプリメント、サイトカイン、および一般的な試薬は、ThermoFisher(Carlsbad, CA)から購入した。
ヒト多能性幹細胞(hPSC)の維持と培養
全ての幹細胞試験は、UCアーバインヒト幹細胞研究監視(hSCRO)およびIBC委員会の承認を得て実施された。ヒト組織の使用は、治験審査委員会(IRB)の順守と承認によって行われた。ヒトiPSC細胞株ADRC F5およびADRC F14(対照対象)は、非組み込みセンダイウイルス(Cytotune)を使用して、UCI ADRC誘導多能性幹細胞コアによって生成された。iPSCは、Gバンドにより核型が正常であること、無菌性、およびPluritest(UCLA)分析により多能性であることが確認された。iPSCは、加湿インキュベーター(5%CO2、37℃)で完全なTeSR-E8培地(Stemcell Technologies)のマトリゲル(MTG)上でフィーダーなしで維持された。
全ての幹細胞試験は、UCアーバインヒト幹細胞研究監視(hSCRO)およびIBC委員会の承認を得て実施された。ヒト組織の使用は、治験審査委員会(IRB)の順守と承認によって行われた。ヒトiPSC細胞株ADRC F5およびADRC F14(対照対象)は、非組み込みセンダイウイルス(Cytotune)を使用して、UCI ADRC誘導多能性幹細胞コアによって生成された。iPSCは、Gバンドにより核型が正常であること、無菌性、およびPluritest(UCLA)分析により多能性であることが確認された。iPSCは、加湿インキュベーター(5%CO2、37℃)で完全なTeSR-E8培地(Stemcell Technologies)のマトリゲル(MTG)上でフィーダーなしで維持された。
iPSCの造血始原細胞(iHPC)への分化
ヒトiPSC由来の造血始原細胞は、これまでに公開されたプロトコールにいくつかの修正を加えた定義された条件を使用して生成された(Kennedy et al., 2007、Sturgeon et al., 2014)。簡潔に述べると、iPSCを粉砕して単一細胞懸濁液を生成し、E8培地+Y-27632 ROCK阻害剤(10μM;R&D Systems)中で1ウェルあたり1~6×105細胞で6ウェルプレートに播種した。いくつかの実施形態では、Y-27632はチアゾビビン(R&D systems)に置き換えられる。細胞を正常酸素(20%O2)条件下で24時間培養した後、E8培地をベース培地とサイトカイン:IMDM/F12(50:50)、インスリン(0.02mg/ml)、ホロトランスフェリン(0.011mg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(0.0134mg/ml)、L-アスコルビン酸2-リン酸マグネシウム(64μg/ml;Sigma)、モノチオグリセロール(400μM)、PVA(5mg/ml;Sigma)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、既知組成脂質濃縮物(1倍)、非必須アミノ酸(NEAA;1倍)、FGF2(50ng/ml)、BMP4(50ng/ml)、アクチビン-A(12.5ng/ml)、および低酸素(5%O2)におけるLiCl(2mM)からなる分化培地に変更した。2日後、培地をFGF2(50ng/ml)およびVEGF(50ng/ml)を補充したベース培地に変更した。4日目に、培地をFGF2(50ng/ml)、VEGF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、SCF(50ng/ml)、IL-6(50ng/ml)、およびIL-3(50ng/ml)を含む培地に変更した。6日目に、培地に上述の培地を補充した。細胞をさらに4日間(合計10日)培養した後、iMGL分化のためにFACSによりCD43+細胞を単離した。さらに、iPSC由来のHPC(Cellular Dynamics)は、CD43+始原細胞の商用供給源として同定された。
ヒトiPSC由来の造血始原細胞は、これまでに公開されたプロトコールにいくつかの修正を加えた定義された条件を使用して生成された(Kennedy et al., 2007、Sturgeon et al., 2014)。簡潔に述べると、iPSCを粉砕して単一細胞懸濁液を生成し、E8培地+Y-27632 ROCK阻害剤(10μM;R&D Systems)中で1ウェルあたり1~6×105細胞で6ウェルプレートに播種した。いくつかの実施形態では、Y-27632はチアゾビビン(R&D systems)に置き換えられる。細胞を正常酸素(20%O2)条件下で24時間培養した後、E8培地をベース培地とサイトカイン:IMDM/F12(50:50)、インスリン(0.02mg/ml)、ホロトランスフェリン(0.011mg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(0.0134mg/ml)、L-アスコルビン酸2-リン酸マグネシウム(64μg/ml;Sigma)、モノチオグリセロール(400μM)、PVA(5mg/ml;Sigma)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、既知組成脂質濃縮物(1倍)、非必須アミノ酸(NEAA;1倍)、FGF2(50ng/ml)、BMP4(50ng/ml)、アクチビン-A(12.5ng/ml)、および低酸素(5%O2)におけるLiCl(2mM)からなる分化培地に変更した。2日後、培地をFGF2(50ng/ml)およびVEGF(50ng/ml)を補充したベース培地に変更した。4日目に、培地をFGF2(50ng/ml)、VEGF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、SCF(50ng/ml)、IL-6(50ng/ml)、およびIL-3(50ng/ml)を含む培地に変更した。6日目に、培地に上述の培地を補充した。細胞をさらに4日間(合計10日)培養した後、iMGL分化のためにFACSによりCD43+細胞を単離した。さらに、iPSC由来のHPC(Cellular Dynamics)は、CD43+始原細胞の商用供給源として同定された。
iHPCからのミクログリア様細胞の生成
CD43+ iHPCを、1ウェルあたり1~2×105細胞の密度で無血清完全分化培地を含むマトリゲルコートされた6ウェルプレート(BD Biosciences)に播種した。分化培地は、ベース培地(フェノール不含DMEM/F12(1:1)、インスリン(0.2mg/ml)、ホロトランスフェリン(0.011mg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(0.0134mg/ml)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%v/v)、B27(1%v/v)、N2(0.5%、v/v)、モノチオグリセロール(200μM)、および細胞に添加する直前の追加のインスリン(4μg/ml))に添加された、M-CSF(25ng/ml)、IL-34(100ng/ml;Peprotech)、およびTGFβ-1(50ng/ml;Militenyi)からなる。2日ごとに完全な分化培地を細胞に補充した。12日目に、初期のiMGLが収集され(25℃で5分間300×g)、50%の培地交換が行われた。25日のミクログリア分化(iPSCから35日)後、iMGLをCD200(100ng/ml、Novoprotein)およびCX3CL1(100ng/ml;Peprotech)を補充した完全分化培地においてさらに3日間培養し、海馬ニューロンとともに培養したかまたはヒトの脳オルガノイドとともに培養した。
CD43+ iHPCを、1ウェルあたり1~2×105細胞の密度で無血清完全分化培地を含むマトリゲルコートされた6ウェルプレート(BD Biosciences)に播種した。分化培地は、ベース培地(フェノール不含DMEM/F12(1:1)、インスリン(0.2mg/ml)、ホロトランスフェリン(0.011mg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(0.0134mg/ml)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%v/v)、B27(1%v/v)、N2(0.5%、v/v)、モノチオグリセロール(200μM)、および細胞に添加する直前の追加のインスリン(4μg/ml))に添加された、M-CSF(25ng/ml)、IL-34(100ng/ml;Peprotech)、およびTGFβ-1(50ng/ml;Militenyi)からなる。2日ごとに完全な分化培地を細胞に補充した。12日目に、初期のiMGLが収集され(25℃で5分間300×g)、50%の培地交換が行われた。25日のミクログリア分化(iPSCから35日)後、iMGLをCD200(100ng/ml、Novoprotein)およびCX3CL1(100ng/ml;Peprotech)を補充した完全分化培地においてさらに3日間培養し、海馬ニューロンとともに培養したかまたはヒトの脳オルガノイドとともに培養した。
ヒト血液からのPBMCの単離
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll-paque(GE Healthcare)勾配分離を使用して健康なドナーから単離された。簡潔に述べると、血液をFicoll-Paqueの上に重ね、ブレーキをかけずにスイングバケットローテーターで遠心分離した(400×g、40分、18℃)。遠心分離後、血漿と上層を除去し、PBMCを層間から単離した。次いで、細胞を氷冷PBSによって1回洗浄し、すぐに使用した。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll-paque(GE Healthcare)勾配分離を使用して健康なドナーから単離された。簡潔に述べると、血液をFicoll-Paqueの上に重ね、ブレーキをかけずにスイングバケットローテーターで遠心分離した(400×g、40分、18℃)。遠心分離後、血漿と上層を除去し、PBMCを層間から単離した。次いで、細胞を氷冷PBSによって1回洗浄し、すぐに使用した。
PBMCからの単球の単離
CD14およびCD16の単球は、製造者の取扱説明書に従って、EasySep(商標)単球濃縮キット(Stemcell Technologies)を使用して、PBMCからのネガティブ選択により単離された。単離された細胞をPBSによって3回洗浄し、RNA配列分析のためにFACsで選別するか、またはさらなるマクロファージ分化に使用した。
CD14およびCD16の単球は、製造者の取扱説明書に従って、EasySep(商標)単球濃縮キット(Stemcell Technologies)を使用して、PBMCからのネガティブ選択により単離された。単離された細胞をPBSによって3回洗浄し、RNA配列分析のためにFACsで選別するか、またはさらなるマクロファージ分化に使用した。
単球由来マクロファージ
単離した単球を、37℃、5%CO2インキュベーターにおいてRPMI-1640培地中の2×106細胞/mlで組織培養処理6ウェル上に播種した。2時間後、培地を吸引して廃棄し、接着した単球をDPBSによって3回洗浄し、RPMI-1640、FBS(10%v/v)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%v/v)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)からなる完全培地と交換した。MD-Mφを生成するために、M-CSF(25ng/ml)をウェルに添加し、細胞を5日間分化させた。
単離した単球を、37℃、5%CO2インキュベーターにおいてRPMI-1640培地中の2×106細胞/mlで組織培養処理6ウェル上に播種した。2時間後、培地を吸引して廃棄し、接着した単球をDPBSによって3回洗浄し、RPMI-1640、FBS(10%v/v)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%v/v)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)からなる完全培地と交換した。MD-Mφを生成するために、M-CSF(25ng/ml)をウェルに添加し、細胞を5日間分化させた。
RNA-seqライブラリー構築
細胞を採取し、DPBSによって3回洗浄し、RNAlater、RNA保存液に保管した。製造者のガイドラインに従ってRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して、全ての細胞型からRNAを抽出した。Bioanalzyer Agilent 2100シリーズを使用して、全ての試料のRNA整合性(RIN)を測定した。分析された全ての配列決定ライブラリーは、RINスコアが9以上と測定されたRNA試料から生成された。Illumina TruSeq mRNA strandedプロトコールを使用して、全ての試料からポリA mRNAを取得した。200ngの単離mRNAを使用してRNA-seqライブラリーを構築した。ライブラリーは、Kapa BiosystemsのLibrary Quantification Kitを使用して定量化および標準化され、Illumina HiSeq 2500プラットフォームによってペアエンド100bpリードとして配列決定された。
細胞を採取し、DPBSによって3回洗浄し、RNAlater、RNA保存液に保管した。製造者のガイドラインに従ってRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して、全ての細胞型からRNAを抽出した。Bioanalzyer Agilent 2100シリーズを使用して、全ての試料のRNA整合性(RIN)を測定した。分析された全ての配列決定ライブラリーは、RINスコアが9以上と測定されたRNA試料から生成された。Illumina TruSeq mRNA strandedプロトコールを使用して、全ての試料からポリA mRNAを取得した。200ngの単離mRNAを使用してRNA-seqライブラリーを構築した。ライブラリーは、Kapa BiosystemsのLibrary Quantification Kitを使用して定量化および標準化され、Illumina HiSeq 2500プラットフォームによってペアエンド100bpリードとして配列決定された。
RNA-seq分析
RNA-seqリードは、STARアライナーを使用してhg38参照ゲノムにマッピングされ、RSEMを使用してGencodeバージョン24遺伝子アノテーションにマッピングされた。全ての試料にわたる発現(<1FPKM)を有する遺伝子は、その後の全ての分析からフィルターされた。EdgeRによって、TMMの標準化された計数に対して、差次的遺伝子発現分析を実行した(Robinson et al., 2010)。複数の生物学的複製が全ての比較分析に使用された。p値≦0.001および発現の2倍の変化を使用して、それぞれの比較について有意に差次的に発現した遺伝子を判定した。Rパッケージrglを使用してPCA分析を実行し、plot3dを使用してプロットした。R hclust2を使用してクラスタリングを実行し、Java Tree View 3.0を使用して可視化した。
RNA-seqリードは、STARアライナーを使用してhg38参照ゲノムにマッピングされ、RSEMを使用してGencodeバージョン24遺伝子アノテーションにマッピングされた。全ての試料にわたる発現(<1FPKM)を有する遺伝子は、その後の全ての分析からフィルターされた。EdgeRによって、TMMの標準化された計数に対して、差次的遺伝子発現分析を実行した(Robinson et al., 2010)。複数の生物学的複製が全ての比較分析に使用された。p値≦0.001および発現の2倍の変化を使用して、それぞれの比較について有意に差次的に発現した遺伝子を判定した。Rパッケージrglを使用してPCA分析を実行し、plot3dを使用してプロットした。R hclust2を使用してクラスタリングを実行し、Java Tree View 3.0を使用して可視化した。
ADP遊走およびカルシウムイメージングアッセイ
ADPへのトランスウェル遊走アッセイは、これまでに記載されているように実行された(De Simone et al., 2010;Moore et al., 2015)。iMGL(5.5×104細胞/ウェル)を、サイトカインを含まない無血清基礎培地において1時間培養した。次に、5%CO2細胞培養インキュベーター内において37℃で、iMGLをDMSOまたはPSB0739(50μM、Tocris)に1時間事前曝露した。次いで、細胞を基礎培地によって3回洗浄し、5%CO2中、37℃で、底部チャンバー内の、アデノシン5’-リン酸(ADP、100μM、Sigma)を含むトランスウェル遊走チャンバー(24ウェルに5μmのポリカーボネートインサート、Corning)中に播種した。4時間後、細胞を3回洗浄し、PFA(4%)において室温で15分間固定した。細胞をHoechst染色で10分間染色して、細胞の核を可視化した。盲検化された観察者は、スライドあたりの総細胞数を計数し、次いで表面から細胞をこすり落とし、PBSによって洗浄し、再集計して遊走した細胞を記録した。遊走は、ウェルあたりの総細胞数に対する遊走したものとして報告された。細胞の蛍光画像は、Olympus IX71倒立顕微鏡を使用して記録された。
ADPへのトランスウェル遊走アッセイは、これまでに記載されているように実行された(De Simone et al., 2010;Moore et al., 2015)。iMGL(5.5×104細胞/ウェル)を、サイトカインを含まない無血清基礎培地において1時間培養した。次に、5%CO2細胞培養インキュベーター内において37℃で、iMGLをDMSOまたはPSB0739(50μM、Tocris)に1時間事前曝露した。次いで、細胞を基礎培地によって3回洗浄し、5%CO2中、37℃で、底部チャンバー内の、アデノシン5’-リン酸(ADP、100μM、Sigma)を含むトランスウェル遊走チャンバー(24ウェルに5μmのポリカーボネートインサート、Corning)中に播種した。4時間後、細胞を3回洗浄し、PFA(4%)において室温で15分間固定した。細胞をHoechst染色で10分間染色して、細胞の核を可視化した。盲検化された観察者は、スライドあたりの総細胞数を計数し、次いで表面から細胞をこすり落とし、PBSによって洗浄し、再集計して遊走した細胞を記録した。遊走は、ウェルあたりの総細胞数に対する遊走したものとして報告された。細胞の蛍光画像は、Olympus IX71倒立顕微鏡を使用して記録された。
カルシウムイメージングについて、iMGLをポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップに播種し、1時間後に、(mMで)NaCl 140、KCl 4.5、CaCl2 2、MgCl2 1、HEPES 10、グルコース10、スクロース5、を含むリンガー溶液pH=7.4で希釈したFura-2-AM(Molecular Probes)カルシウム色素とインキュベートした。1時間のインキュベーション後、リンガー溶液を使用して色素を3回洗浄し、P2RY12阻害剤PSB0739(50μM、Tocris)または媒体(DMSO)で1時間処理し、実験に使用した。ベースラインCa2+シグナル(I340/I380)を、100秒を超えて測定し、ベースライン測定後、定常流下でADP(10μM)を導入した。Ca2+記録は、Zeiss(Axiovert 35)ベースのイメージング設定で実行され、データ取得はMetafluorソフトウェア(Molecular Devices)で実行された。データ分析は、Metafluor、Origin Pro、およびPrism 6.0を使用して実行された。
免疫細胞化学および免疫組織化学
細胞を冷PBSによって洗浄し、25℃で20分間冷PFA(4%)によって固定した後、PBSによって3回洗浄した。0.05%ヤギ血清またはロバ血清のいずれかを含み、Triton X100(0.01%)を含むPBSによって、25℃で1時間、細胞をブロッキングした。一次抗体(1:500)をブロッキング溶液に4℃で一晩添加した。次いで、細胞をPBSによって3回洗浄し、1:400のAlexaFluor(登録商標)コンジュゲート二次抗体で25℃において1時間染色した。二次染色後、細胞を3回洗浄し、続いてDAPI-カウンターステインマウンティングメディア(Fluoromount、southern Biotech)によってカバースリップした。免疫細胞化学分析に使用される一次抗体には:β-3チューブリン(Biolegend)、GFAP(Abcam)、Iba1(Wako)、ITGB5(Abcam)、MMP-9(Novus)、MerTK(Biolegend)、P2RY12(Sigma)、PROS1(Abcam)、PU.1(Cell Signaling Technology)、hCytoplasm(SC121;Takara Bio Inc.)、TREM2(R&D Systems)、TGFβR1(Abcam)が含まれる。
細胞を冷PBSによって洗浄し、25℃で20分間冷PFA(4%)によって固定した後、PBSによって3回洗浄した。0.05%ヤギ血清またはロバ血清のいずれかを含み、Triton X100(0.01%)を含むPBSによって、25℃で1時間、細胞をブロッキングした。一次抗体(1:500)をブロッキング溶液に4℃で一晩添加した。次いで、細胞をPBSによって3回洗浄し、1:400のAlexaFluor(登録商標)コンジュゲート二次抗体で25℃において1時間染色した。二次染色後、細胞を3回洗浄し、続いてDAPI-カウンターステインマウンティングメディア(Fluoromount、southern Biotech)によってカバースリップした。免疫細胞化学分析に使用される一次抗体には:β-3チューブリン(Biolegend)、GFAP(Abcam)、Iba1(Wako)、ITGB5(Abcam)、MMP-9(Novus)、MerTK(Biolegend)、P2RY12(Sigma)、PROS1(Abcam)、PU.1(Cell Signaling Technology)、hCytoplasm(SC121;Takara Bio Inc.)、TREM2(R&D Systems)、TGFβR1(Abcam)が含まれる。
ICCの場合、細胞をDPBS(1倍)によって3回洗浄し、室温で20分間冷PFA(4%w/v)によって固定した後、PBS(1倍)によって3回洗浄した。細胞をブロッキング溶液(1倍PBS、5%ヤギまたはロバ血清、0.2%Triton X-100)によって室温で1時間ブロッキングした。ICC一次抗体をブロッキング溶液中に各希釈(下記参照)で添加し、4℃で一晩静置した。翌日、細胞をPBSによって5分間3回洗浄し、1:400のAlexaFluor(登録商標)コンジュゲート二次抗体で、室温において1時間暗所で染色した。
二次染色後、細胞をPBSによって3回洗浄し、DAPI-カウンターステインマウンティングメディア(Fluoromount、southern Biotech)でカバースリップした。BORG IHCの場合、組織を収集し、室温において30分間PFA(4%w/v)に滴下固定し、PBSによって3回洗浄した。次いで、BORGをスクロース溶液(30%w/v)に一晩静置してから、O.C.T(Tissue-Tek)に埋め込んだ。埋め込んだ組織は、クライオスタットを使用して20μmで切片化され、マウントされたスライドは染色まで-20℃で保菅された。BORG染色の場合、マウントされた組織を保管場所から取り出し、室温に30分間静置して加温した。組織を再水和し、室温のPBS(1倍)によって5分間3回洗浄した。
熱媒介性抗原回復は、クエン酸緩衝液(10mMクエン酸、0.05%Tween 20、pH=6.0)を使用して97℃で20分間行い、次いで室温まで冷却した。抗原回復後、スライドをPBSによって3回洗浄した。次いで、スライドをPBS-A溶液(0.1%Triton X-100を含む1×PBS)によって15分間1回洗浄した。PBS-B溶液(PBS-A、0.2%BSA、および1.5%ヤギまたはロバ血清)を使用して、室温において1時間、組織をブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体を適切な希釈でPBS-B溶液(250~350μl/スライド)に添加し(以下を参照)、室温において一晩インキュベートした。翌日、スライドをPBS-A溶液によって各5分間3回洗浄した。室温においてPBS-B溶液を使用して組織を1時間ブロッキングした。ブロッキング後、スライドを、PBS-B(250~300μl/スライド)中のAlexaFluor(登録商標)コンジュゲート二次抗体(全て1:500)およびHoechst染色(1倍)によって、室温において2時間、暗所でインキュベートした。
二次染色後、スライドをPBSによって5分間5回洗浄した。フルオロマウント(Southern Biotech)を使用してスライドをカバースリップした。マウス脳IHCの場合、脳は上記のように収集、固定、および処理された。浮遊する切片をブロッキング溶液(1×PBS、0.2%Triton X-100、および10%ヤギ血清)中で室温において1時間、穏やかに振とうしながらブロッキングした。ヒトTMEM119染色では、これまでに行われたように、ブロッキングの前に熱媒介性抗原回復が行われた(Bennett et al., 2016)。浮遊する組織抗原の回復は、1mlのクエン酸緩衝液を含む1.5mlのマイクロ遠心チューブに浮遊切片を入れ、100℃に設定された予熱された温度ブロックに静置することで行った。組織を100℃において10分間加熱した後、取り出して20分間室温に戻した後、PBSによって5分間3回洗浄し、その後ブロッキング工程に進んだ。アミロイド斑のADマウス脳染色の場合、浮遊切片を1×Amylo-Glo(登録商標)RTD(商標)(Biosensis)染色溶液に室温において10分間振とうせずに静置した。
染色後、切片を各5分間PBSによって3回洗浄し、MiliQ DI水で簡単にすすいだ後、PBSに戻した後、ブロッキングした。一次抗体を染色溶液(1×PBS、0.2%Triton X-100、1%ヤギ血清)に適切な希釈(以下を参照)で加え、わずかに振とうしながら4℃において一晩インキュベートした。翌日、切片をPBSによって3回洗浄し、1:400のAlexaFluor(登録商標)コンジュゲート二次抗体で、わずかに振とうしながら室温において1時間暗所で染色した。二次染色の後、切片をPBSによって5分間3回洗浄し、スライドガラスにマウントした。マウント後、スライドをDAPIカウンターステインマウンティングメディア(Fluoromount、southern Biotech)によってカバースリップした。一次抗体:
ウサギ抗アミロイド線維(OC)(1:1,000、EMD Millipore、AB2286)
ウサギ抗アミロイドオリゴマー(A11)(1:1,000、EMD Millipore、AB9234)
マウス抗アミロイド1~16aa(6e10)(1:1,000、Biolegend、803001)
マウス抗β3チューブリン(1:500;Biolegend、801201)
マウス抗ヒト細胞質(SC121、1:100;Takara Bio Inc.、Y40410)、
マウス抗ヒト核(ku80、1:100;Abcam、ab79220)
ニワトリ抗GFAP(1:500;Abcam、ab4674)
ウサギ抗Iba1(1:500;Wako;019-19741)
ヤギ抗Iba1(1:100;Abcam ab5076)*Alexa Fluor 488または555二次抗体のみとの使用が推奨される。
マウス抗ITGB5(1:500;Abcam、ab177004)
マウス抗MMP-9(1:500;EMD Millipore、AB19016)
マウス抗ヒトMertk(1:500;Biolegend、367602)
ウサギ抗P2ry12(1:125;Sigma;HPA014518)
ウサギ抗Pros(1:500;Abcam、ab97387)
ウサギ抗PU.1(1:500;Cell Signaling Technology、2266S)
ウサギ抗ヒトTmem119(1:100;Abcam、ab185333)
ヤギ抗ヒトTrem2(1:100;R&D Systems、AF1828)
ウサギ抗Tgfbr1(1:500;Abcam、ab31013)。
ウサギ抗アミロイド線維(OC)(1:1,000、EMD Millipore、AB2286)
ウサギ抗アミロイドオリゴマー(A11)(1:1,000、EMD Millipore、AB9234)
マウス抗アミロイド1~16aa(6e10)(1:1,000、Biolegend、803001)
マウス抗β3チューブリン(1:500;Biolegend、801201)
マウス抗ヒト細胞質(SC121、1:100;Takara Bio Inc.、Y40410)、
マウス抗ヒト核(ku80、1:100;Abcam、ab79220)
ニワトリ抗GFAP(1:500;Abcam、ab4674)
ウサギ抗Iba1(1:500;Wako;019-19741)
ヤギ抗Iba1(1:100;Abcam ab5076)*Alexa Fluor 488または555二次抗体のみとの使用が推奨される。
マウス抗ITGB5(1:500;Abcam、ab177004)
マウス抗MMP-9(1:500;EMD Millipore、AB19016)
マウス抗ヒトMertk(1:500;Biolegend、367602)
ウサギ抗P2ry12(1:125;Sigma;HPA014518)
ウサギ抗Pros(1:500;Abcam、ab97387)
ウサギ抗PU.1(1:500;Cell Signaling Technology、2266S)
ウサギ抗ヒトTmem119(1:100;Abcam、ab185333)
ヤギ抗ヒトTrem2(1:100;R&D Systems、AF1828)
ウサギ抗Tgfbr1(1:500;Abcam、ab31013)。
共焦点顕微鏡と明視野イメージング
Olympus FX1200共焦点顕微鏡を使用して、免疫蛍光切片を可視化し、画像を記録した。非特異的なブリードスルーを回避するために、各レーザーラインは独立して励起および検出された。示されている全ての画像は、単一の共焦点zスライスまたはzスタックを表す。細胞培養の明視野画像をEvos XL Cell Imaging顕微鏡で記録した。
Olympus FX1200共焦点顕微鏡を使用して、免疫蛍光切片を可視化し、画像を記録した。非特異的なブリードスルーを回避するために、各レーザーラインは独立して励起および検出された。示されている全ての画像は、単一の共焦点zスライスまたはzスタックを表す。細胞培養の明視野画像をEvos XL Cell Imaging顕微鏡で記録した。
フローサイトメーター分析
細胞をFACs緩衝液(DPBS、2%BSA、および0.05mM EDTA)に懸濁し、4℃において15分間、ヒトFcブロック(BD Bioscience)によってインキュベートした。ミクログリア表面マーカーの検出のために、細胞を抗CD11b-FITCクローンICRF44、抗CD45-APC/Cy7クローンHI30、抗CX3CR1-APCクローン2A9-1、抗CD115-PEクローン9-4D、および抗CD117-PerCP-Cy5.5クローン104D2によって染色した。生/死細胞は、全てBiolegend(San Diego,CA)からのZombieViolet(商標)生/死染色を使用してゲートされた。細胞をFACs Aria II(BD Biosciences)で実行し、FlowJoソフトウェア(FlowJo)で分析した。
細胞をFACs緩衝液(DPBS、2%BSA、および0.05mM EDTA)に懸濁し、4℃において15分間、ヒトFcブロック(BD Bioscience)によってインキュベートした。ミクログリア表面マーカーの検出のために、細胞を抗CD11b-FITCクローンICRF44、抗CD45-APC/Cy7クローンHI30、抗CX3CR1-APCクローン2A9-1、抗CD115-PEクローン9-4D、および抗CD117-PerCP-Cy5.5クローン104D2によって染色した。生/死細胞は、全てBiolegend(San Diego,CA)からのZombieViolet(商標)生/死染色を使用してゲートされた。細胞をFACs Aria II(BD Biosciences)で実行し、FlowJoソフトウェア(FlowJo)で分析した。
サイトスピンとメイグリュンワルドギムザ染色
1×105細胞を100μlのFACs緩衝液に懸濁し、Shandonスライドガラス(Biomedical Polymers)に加えて、細胞学漏斗装置で組み立てた。細胞を含む組み立てられたスライドは、サイトスピン機器にロードされ、遠心分離された(500rpm、5分)。スライドを2分間風乾し、すぐに100%メイグリュンワルド染色(Sigma)によって5分間染色した。次に、スライドをPBSによって1.5分間洗浄し、すぐに室温において20分間4%ギムザ染色(Sigma)に入れた。スライドを二段蒸留したH2Oによって6回洗浄し、10分間風乾させた。スライドは、ガラス製のカバースリップとパーマウント(Sigma)を使用して保存された。
1×105細胞を100μlのFACs緩衝液に懸濁し、Shandonスライドガラス(Biomedical Polymers)に加えて、細胞学漏斗装置で組み立てた。細胞を含む組み立てられたスライドは、サイトスピン機器にロードされ、遠心分離された(500rpm、5分)。スライドを2分間風乾し、すぐに100%メイグリュンワルド染色(Sigma)によって5分間染色した。次に、スライドをPBSによって1.5分間洗浄し、すぐに室温において20分間4%ギムザ染色(Sigma)に入れた。スライドを二段蒸留したH2Oによって6回洗浄し、10分間風乾させた。スライドは、ガラス製のカバースリップとパーマウント(Sigma)を使用して保存された。
RNA単離およびqPCR分析
細胞をRNAlater安定化試薬に保管し、製造者のガイドラインに従ってQiagen RNeasy Mini Kit(Valencia,CA)を使用してRNAを単離した。ViiA(商標)7 Real-Time PCR SystemおよびTaqman qPCRプライマーを使用して、qPCR分析を実施した。AD-GWAS遺伝子の分析では、以下に記載するプライマーを使用する、カスタムTaqman低密度アレイカードを利用した。
細胞をRNAlater安定化試薬に保管し、製造者のガイドラインに従ってQiagen RNeasy Mini Kit(Valencia,CA)を使用してRNAを単離した。ViiA(商標)7 Real-Time PCR SystemおよびTaqman qPCRプライマーを使用して、qPCR分析を実施した。AD-GWAS遺伝子の分析では、以下に記載するプライマーを使用する、カスタムTaqman低密度アレイカードを利用した。
ラット皮質および海馬ニューロンの単離
全ての手順は、IUCAC承認プロトコールの下で実行された。初代培養の皮質および海馬ニューロン培養は、胚性ラット(E18)に由来した。簡潔に述べると、解剖した組織をトリプシンで解離し、粉砕し、B27(1%v/v)を補充した無血清Neurobasal(NB培地)中でコーティングしたポリ-L-リジンによってコーティングした6ウェルプレートに播種した。細胞を5×106細胞/mlの密度で播種し、使用するまで培養で維持した。
全ての手順は、IUCAC承認プロトコールの下で実行された。初代培養の皮質および海馬ニューロン培養は、胚性ラット(E18)に由来した。簡潔に述べると、解剖した組織をトリプシンで解離し、粉砕し、B27(1%v/v)を補充した無血清Neurobasal(NB培地)中でコーティングしたポリ-L-リジンによってコーティングした6ウェルプレートに播種した。細胞を5×106細胞/mlの密度で播種し、使用するまで培養で維持した。
ラットニューロンとのiMGLの共培養
ラット海馬または皮質ニューロンを、3~4日ごとに50%の培地交換を行いながら21日間培養した。iMGLは、50%iMGLおよび50%NB培地で1:5の比率でニューロン(1×106 iMGL対5×106ニューロン)とともに培養した。3日後、iMGLはRNA単離のために収集された。
ラット海馬または皮質ニューロンを、3~4日ごとに50%の培地交換を行いながら21日間培養した。iMGLは、50%iMGLおよび50%NB培地で1:5の比率でニューロン(1×106 iMGL対5×106ニューロン)とともに培養した。3日後、iMGLはRNA単離のために収集された。
メソスケールマルチプレックスサイトカインおよびケモカインアッセイ
IFNγ(20ng/ml)、IL1β(20ng/ml)、およびLPS(100ng/ml)によって24時間刺激する前に、iMGL培養培地を2時間基礎培地に交換し、その後RNAのために細胞を収集し、培養上清がサイトカイン分泌について評価された。iMGL培養上清から複数のサイトカインおよびケモカイン分析物を同時に評価するために、各処理群からの培養上清を処理し、製造者のプロトコールに従ってV-PLEXヒトサイトカイン30プレックスキット(Mesoscale)を使用して分析した。
IFNγ(20ng/ml)、IL1β(20ng/ml)、およびLPS(100ng/ml)によって24時間刺激する前に、iMGL培養培地を2時間基礎培地に交換し、その後RNAのために細胞を収集し、培養上清がサイトカイン分泌について評価された。iMGL培養上清から複数のサイトカインおよびケモカイン分析物を同時に評価するために、各処理群からの培養上清を処理し、製造者のプロトコールに従ってV-PLEXヒトサイトカイン30プレックスキット(Mesoscale)を使用して分析した。
3D脳オルガノイド細胞培養
ヒト3D脳オルガノイドは、いくつかの修正でこれまでに記載されたように生成され(Lancaster et al., 2013)、修正は補足情報に詳述されている。
ヒト3D脳オルガノイドは、いくつかの修正でこれまでに記載されたように生成され(Lancaster et al., 2013)、修正は補足情報に詳述されている。
線維性Aβの調製。
線維性蛍光アミロイドベータ(fAβ1-42)が生成された。簡潔に述べると、蛍光標識されたAβペプチド(Anaspec;Fremont、CA)を最初に0.1%NH4OH中に1mg/mlまで溶解し、次いでエンドトキシン不含の滅菌水によってさらに希釈し、37℃で7日間インキュベートした。細胞曝露の前にfAβを完全に混合した。
線維性蛍光アミロイドベータ(fAβ1-42)が生成された。簡潔に述べると、蛍光標識されたAβペプチド(Anaspec;Fremont、CA)を最初に0.1%NH4OH中に1mg/mlまで溶解し、次いでエンドトキシン不含の滅菌水によってさらに希釈し、37℃で7日間インキュベートした。細胞曝露の前にfAβを完全に混合した。
BDTOの調製
タウオリゴマーは、AD脳から調製したホモジネートのPBS可溶性画分を使用したT22抗体による免疫沈降により単離された。次いで、これらをPBS(pH 7.4)を使用した高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によって精製した。追加の分析には、単量体タウまたは大きなタウ凝集体(タウ-5、通常はスタッキングゲルの上部に現れる)の混入を検出するウエスタンブロット、およびマウス抗IgGを使用した非特異的バンドの特定が含まれる。続いて、製造者のプロトコールに従ってBDTOをpHrodo-Redにコンジュゲートさせた。
タウオリゴマーは、AD脳から調製したホモジネートのPBS可溶性画分を使用したT22抗体による免疫沈降により単離された。次いで、これらをPBS(pH 7.4)を使用した高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によって精製した。追加の分析には、単量体タウまたは大きなタウ凝集体(タウ-5、通常はスタッキングゲルの上部に現れる)の混入を検出するウエスタンブロット、およびマウス抗IgGを使用した非特異的バンドの特定が含まれる。続いて、製造者のプロトコールに従ってBDTOをpHrodo-Redにコンジュゲートさせた。
ヒトシナプトソーム
ヒト組織試料を剖検で入手し、刻み、10%DMSOを含む0.32Mスクロース中ゆっくりと凍結し、-80℃で保管した。粗シナプトソーム画分を得るために、組織を37℃の水浴で解凍し、ガラス/テフロンホモジナイザー(クリアランス0.1~0.15mm)を使用して、プロテイナーゼ阻害剤(Roche)およびホスファターゼ阻害剤(Sigma-Aldrich)を含む10mmTris緩衝液(pH 7.4)中でホモジナイズした。ホモジネートを4℃において1000gで10分間遠心分離し、上清を除去し、4℃において10000gで20分間再度遠心分離した。得られたペレットをスクロース/トリス溶液に再懸濁し、-80℃で保管した。製造者のプロトコールに従ってシナプトソームをpHrodo-Redにコンジュゲートさせた。
ヒト組織試料を剖検で入手し、刻み、10%DMSOを含む0.32Mスクロース中ゆっくりと凍結し、-80℃で保管した。粗シナプトソーム画分を得るために、組織を37℃の水浴で解凍し、ガラス/テフロンホモジナイザー(クリアランス0.1~0.15mm)を使用して、プロテイナーゼ阻害剤(Roche)およびホスファターゼ阻害剤(Sigma-Aldrich)を含む10mmTris緩衝液(pH 7.4)中でホモジナイズした。ホモジネートを4℃において1000gで10分間遠心分離し、上清を除去し、4℃において10000gで20分間再度遠心分離した。得られたペレットをスクロース/トリス溶液に再懸濁し、-80℃で保管した。製造者のプロトコールに従ってシナプトソームをpHrodo-Redにコンジュゲートさせた。
貪食アッセイ
iMGLとMD-Mφを、マウス抗CD16/32Fc受容体ブロック(2mg/ml;BD Biosciences)とともに4℃において15分間インキュベートした。次いで、細胞を、フローサイトメーター緩衝液中の1:200で、抗CD45-APCクローン(マウス細胞;Tonbo Biosciences;San Diego,CA)によって染色した。次に、Amnis Imagestreamerx Mark II Imaging Flow Cytometer(Millipore)を使用して試料を分析した。イー・コリ、ヒトシナプトソーム、fAβ、およびBDTOの貪食は、Internalization Wizardアルゴリズムを搭載したIDEASソフトウェアを使用して分析した。無添加の抗CD11b抗体(Biolegend)をCD11b遮断に使用した。
iMGLとMD-Mφを、マウス抗CD16/32Fc受容体ブロック(2mg/ml;BD Biosciences)とともに4℃において15分間インキュベートした。次いで、細胞を、フローサイトメーター緩衝液中の1:200で、抗CD45-APCクローン(マウス細胞;Tonbo Biosciences;San Diego,CA)によって染色した。次に、Amnis Imagestreamerx Mark II Imaging Flow Cytometer(Millipore)を使用して試料を分析した。イー・コリ、ヒトシナプトソーム、fAβ、およびBDTOの貪食は、Internalization Wizardアルゴリズムを搭載したIDEASソフトウェアを使用して分析した。無添加の抗CD11b抗体(Biolegend)をCD11b遮断に使用した。
統計分析
Graphpad Prism 6ソフトウェアを使用して統計分析を実施した。一元配置分散分析と後に続くテューキーの事後検定を利用した2つを超える群を含む比較では、複数の比較のために修正されたp値が報告された。2つの群の比較では、両側スチューデントt検定を利用した。p<0.05の場合、全ての差は有意差があるとみなされた。RNA配列決定の統計分析は上記で詳述されており、他の全ての統計分析は図の凡例で報告されている。
Graphpad Prism 6ソフトウェアを使用して統計分析を実施した。一元配置分散分析と後に続くテューキーの事後検定を利用した2つを超える群を含む比較では、複数の比較のために修正されたp値が報告された。2つの群の比較では、両側スチューデントt検定を利用した。p<0.05の場合、全ての差は有意差があるとみなされた。RNA配列決定の統計分析は上記で詳述されており、他の全ての統計分析は図の凡例で報告されている。
ADP遊走およびカルシウムイメージングアッセイ
iMGL(5.5×104細胞/ウェル)を、サイトカインを含まない無血清基礎培地において1時間培養した。次に、5%CO2細胞培養インキュベーター内において37℃で、iMGLをDMSOまたはPSB0739(50μM、Tocris)に1時間事前曝露した。次いで、細胞を基礎培地によって3回洗浄し、5%CO2中、37℃で、底部チャンバー内の、アデノシン5’-リン酸(ADP、100μM、Sigma)を含むトランスウェル遊走チャンバー(24ウェルに5μmのポリカーボネートインサート、Corning)中に播種した。4時間後、細胞を3回洗浄し、PFA(4%)において室温で15分間固定した。細胞をHoechst染色で10分間染色して、細胞の核を可視化した。盲検化された観察者は、スライドあたりの総細胞数を計数し、次いで表面から細胞をこすり落とし、PBSによって洗浄し、再集計して遊走した細胞を記録した。遊走は、ウェルあたりの総細胞数に対する遊走したものとして報告された。細胞の蛍光画像は、Olympus IX71倒立顕微鏡を使用して記録された。
iMGL(5.5×104細胞/ウェル)を、サイトカインを含まない無血清基礎培地において1時間培養した。次に、5%CO2細胞培養インキュベーター内において37℃で、iMGLをDMSOまたはPSB0739(50μM、Tocris)に1時間事前曝露した。次いで、細胞を基礎培地によって3回洗浄し、5%CO2中、37℃で、底部チャンバー内の、アデノシン5’-リン酸(ADP、100μM、Sigma)を含むトランスウェル遊走チャンバー(24ウェルに5μmのポリカーボネートインサート、Corning)中に播種した。4時間後、細胞を3回洗浄し、PFA(4%)において室温で15分間固定した。細胞をHoechst染色で10分間染色して、細胞の核を可視化した。盲検化された観察者は、スライドあたりの総細胞数を計数し、次いで表面から細胞をこすり落とし、PBSによって洗浄し、再集計して遊走した細胞を記録した。遊走は、ウェルあたりの総細胞数に対する遊走したものとして報告された。細胞の蛍光画像は、Olympus IX71倒立顕微鏡を使用して記録された。
3D脳オルガノイド細胞培養
iPSCは、6ウェル組織培養処理プレート(BD Falcon)のVitronectin XF(Stem Cell Technologies)で培養および維持し、TeSR-E8培地(Stem Cell Technologies)によって5%CO2によって37°Cにおいて毎日維持した。およそ80%のコンフルエンシーで、標準のReLeSRプロトコール(Stem Cell Technologies)を使用してiPSCをVitronectin XF基質から分離し、遠心分離、ペレット化、およびKO DMEM/F12(Invitrogen)、KOSR(20%v/v)(v/v)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、NEAA(1倍)、2-メルカプトエタノール(0.1mM)、rhubFGF(4μg/ml)、およびHSA(0.1%v/v)、およびROCK阻害剤(50μM)からなる胚様体(EB)培地によって懸濁し、EBを形成した。EBが96ウェルプレートに付着しないように、リピジュア(1%v/v;AMSBio)でコーティングされた標準V底96ウェルプレートのウェルごとにおよそ1×104個の細胞を播種した。bFGF(4ng/ml)およびROCK阻害剤(50μM)を含むEB培地中で4日間の後、bFGFとROCK阻害剤の両方を中止し、さらに3日間(合計7日)基本的なEB培地に脳オルガノイドを残した。EB培地段階の後、EB培地は、DMEM/F12、N2サプリメント(0.1%v/v)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、MEM-NEAA(0.1%v/v)、ヘパリン溶液(0.2mg/ml;Sigma)からなり、0.22μm PESフィルター(EMD Milipore)を使用して濾過した、神経上皮(NE)培地と交換した。脳オルガノイドは、1mlのNE培地中でウェルあたり1~2個のEBで、切断したP200ピペットチップを使用して、超低付着24ウェルプレート(Corning)に移した。EBをNE培地で5日間神経化し、その後、サイロコナイズドパラフィルムと無菌の空のP200ボックスから作成した型を使用して、マトリゲル(Corning)に移した。脳オルガノイドは、KO DMEM/F12(50%)、神経基礎培地(50%)、N2サプリメント(0.1%v/v)、ビタミンAサプリメントなしのB27(0.1%v/v)、インスリン溶液(0.1%v/v;Sigma)、2-メルカプトエタノール(0.1mM)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、MEM-NEAA(1倍)、およびペニシリン/ストレプトマイシン(0.1%v/v)からなる分化培地によって、6cm懸濁ペトリ皿中に維持された。ビタミンAを含まないB27を含む分化培地に5日間曝露した後、ビタミンAを含まないB27をビタミンAを含むB27に交換する以外は同一の製剤に分化培地を交換し、この時点で、脳オルガノイドは、Sigmacote(Sigma)でシリコン処理した125mlの回転フラスコバイオリアクター(Corning)にも移され、そこで8週間、ビタミンAを含む分化培地が毎週与えられた。12週間後、BorgはiMGLの共培養試験に利用された。
iPSCは、6ウェル組織培養処理プレート(BD Falcon)のVitronectin XF(Stem Cell Technologies)で培養および維持し、TeSR-E8培地(Stem Cell Technologies)によって5%CO2によって37°Cにおいて毎日維持した。およそ80%のコンフルエンシーで、標準のReLeSRプロトコール(Stem Cell Technologies)を使用してiPSCをVitronectin XF基質から分離し、遠心分離、ペレット化、およびKO DMEM/F12(Invitrogen)、KOSR(20%v/v)(v/v)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、NEAA(1倍)、2-メルカプトエタノール(0.1mM)、rhubFGF(4μg/ml)、およびHSA(0.1%v/v)、およびROCK阻害剤(50μM)からなる胚様体(EB)培地によって懸濁し、EBを形成した。EBが96ウェルプレートに付着しないように、リピジュア(1%v/v;AMSBio)でコーティングされた標準V底96ウェルプレートのウェルごとにおよそ1×104個の細胞を播種した。bFGF(4ng/ml)およびROCK阻害剤(50μM)を含むEB培地中で4日間の後、bFGFとROCK阻害剤の両方を中止し、さらに3日間(合計7日)基本的なEB培地に脳オルガノイドを残した。EB培地段階の後、EB培地は、DMEM/F12、N2サプリメント(0.1%v/v)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、MEM-NEAA(0.1%v/v)、ヘパリン溶液(0.2mg/ml;Sigma)からなり、0.22μm PESフィルター(EMD Milipore)を使用して濾過した、神経上皮(NE)培地と交換した。脳オルガノイドは、1mlのNE培地中でウェルあたり1~2個のEBで、切断したP200ピペットチップを使用して、超低付着24ウェルプレート(Corning)に移した。EBをNE培地で5日間神経化し、その後、サイロコナイズドパラフィルムと無菌の空のP200ボックスから作成した型を使用して、マトリゲル(Corning)に移した。脳オルガノイドは、KO DMEM/F12(50%)、神経基礎培地(50%)、N2サプリメント(0.1%v/v)、ビタミンAサプリメントなしのB27(0.1%v/v)、インスリン溶液(0.1%v/v;Sigma)、2-メルカプトエタノール(0.1mM)、L-アラニル-L-グルタミン(2mM)、MEM-NEAA(1倍)、およびペニシリン/ストレプトマイシン(0.1%v/v)からなる分化培地によって、6cm懸濁ペトリ皿中に維持された。ビタミンAを含まないB27を含む分化培地に5日間曝露した後、ビタミンAを含まないB27をビタミンAを含むB27に交換する以外は同一の製剤に分化培地を交換し、この時点で、脳オルガノイドは、Sigmacote(Sigma)でシリコン処理した125mlの回転フラスコバイオリアクター(Corning)にも移され、そこで8週間、ビタミンAを含む分化培地が毎週与えられた。12週間後、BorgはiMGLの共培養試験に利用された。
ヒトの成人ミクログリアおよび胎児ミクログリアの単離
簡潔に述べると、正常に見える皮質組織は、側頭葉てんかんの薬理学的に難治性の非悪性症例から切除された。組織は広範囲に洗浄され、機械的に解離された。ナイロンメッシュフィルターを通過する前に、トリプシンとDNAseを使用して穏やかに酵素消化した後、単一細胞懸濁液を生成した。単一細胞懸濁液は、ミエリンを除去するためのfickle超遠心分離工程を受けた。解離した細胞を遠心分離し、計数し、5%FBS、0.1%P/Sおよび0.1%グルタミンを補充したMEMに2×106細胞/mLで播種した。ミクログリアを3日間増殖させ、収集し、1×105細胞/mLで播種し、6日間培養で維持し、この期間に細胞は3日目と5日目の2回のTGFβ(20ng/mL)処理を受けた。ヒト胎児脳組織は、胎児組織保管所(Albert Einstein College of Medicine,Bronx,NY)から入手した。標準のTrizol(Invitrogen)プロトコールを使用して総RNAを単離し、-80℃で保管した。いくつかの実施形態では、細胞の小さな塊の懸濁液が産生され、単一細胞懸濁液と同様の方法で使用される。
簡潔に述べると、正常に見える皮質組織は、側頭葉てんかんの薬理学的に難治性の非悪性症例から切除された。組織は広範囲に洗浄され、機械的に解離された。ナイロンメッシュフィルターを通過する前に、トリプシンとDNAseを使用して穏やかに酵素消化した後、単一細胞懸濁液を生成した。単一細胞懸濁液は、ミエリンを除去するためのfickle超遠心分離工程を受けた。解離した細胞を遠心分離し、計数し、5%FBS、0.1%P/Sおよび0.1%グルタミンを補充したMEMに2×106細胞/mLで播種した。ミクログリアを3日間増殖させ、収集し、1×105細胞/mLで播種し、6日間培養で維持し、この期間に細胞は3日目と5日目の2回のTGFβ(20ng/mL)処理を受けた。ヒト胎児脳組織は、胎児組織保管所(Albert Einstein College of Medicine,Bronx,NY)から入手した。標準のTrizol(Invitrogen)プロトコールを使用して総RNAを単離し、-80℃で保管した。いくつかの実施形態では、細胞の小さな塊の懸濁液が産生され、単一細胞懸濁液と同様の方法で使用される。
MITRGおよびRag5×fAD脳におけるiMGLの移植
全ての動物の手順は、NIHおよびカリフォルニア大学のガイドラインが承認したIAUCプロトコール(IAUC#2011-3004)に従って実行された。MITRGマウスはJax(The Jackson Laboratory、#017711)から購入し、以前に特性評価されている(Rongvaux et al., 2014)。MITRGマウスは、異種移植を可能にし、ヒト骨髄生着を支持するように設計されている。iMGLは38日目に採取され、注入緩衝液:M-CSF(10ng/ml)、IL-34(50ng/ml)、およびTGFβ-1(25ng/ml)を含む1×HBSSに懸濁された。iMGLは、これまでに記載された定位手術(Blurton-Jones, et al, 2009)を使用して、次の座標を使用して送達された;AP:-0.6、ML:±2.0、DV:-1.65。確立されたプロトコール(Blurton-Jones, et al, 2009)に従って、移植後60日目にマウスから脳を収集した。Rag5×fADマウスはこの実験室で生成され、以前に特性評価された(Marsh et al., 2016)。Rag5×fADマウスは堅牢なベータアミロイド病理を示し、ヒト細胞の異種移植を可能にする。iMGLは、次の座標を使用して海馬に移植された;AP:-2.06、ML:±1.75、DV:-1.95。移植後、マウスを殺傷し、以前に確立されたプロトコールを使用して脳を収集した。簡潔に述べると、マウスをバルビツール酸ナトリウムを使用して麻酔し、4分間冷1×HBSSによって左心室に灌流した。灌流マウスを断頭し、脳を摘出し、PFA(4%w/v)によって4℃において48時間滴下固定した。次いで、脳をPBSによって3回洗浄し、ミクロトーム(Leica)を使用して冠状切片(40μm)の前に48時間スクロース(30%w/v)溶液に沈めた。浮遊する切片は、IHCが実行されるまで、4℃のPBSアジ化ナトリウム(0.05%)溶液に保管された。
全ての動物の手順は、NIHおよびカリフォルニア大学のガイドラインが承認したIAUCプロトコール(IAUC#2011-3004)に従って実行された。MITRGマウスはJax(The Jackson Laboratory、#017711)から購入し、以前に特性評価されている(Rongvaux et al., 2014)。MITRGマウスは、異種移植を可能にし、ヒト骨髄生着を支持するように設計されている。iMGLは38日目に採取され、注入緩衝液:M-CSF(10ng/ml)、IL-34(50ng/ml)、およびTGFβ-1(25ng/ml)を含む1×HBSSに懸濁された。iMGLは、これまでに記載された定位手術(Blurton-Jones, et al, 2009)を使用して、次の座標を使用して送達された;AP:-0.6、ML:±2.0、DV:-1.65。確立されたプロトコール(Blurton-Jones, et al, 2009)に従って、移植後60日目にマウスから脳を収集した。Rag5×fADマウスはこの実験室で生成され、以前に特性評価された(Marsh et al., 2016)。Rag5×fADマウスは堅牢なベータアミロイド病理を示し、ヒト細胞の異種移植を可能にする。iMGLは、次の座標を使用して海馬に移植された;AP:-2.06、ML:±1.75、DV:-1.95。移植後、マウスを殺傷し、以前に確立されたプロトコールを使用して脳を収集した。簡潔に述べると、マウスをバルビツール酸ナトリウムを使用して麻酔し、4分間冷1×HBSSによって左心室に灌流した。灌流マウスを断頭し、脳を摘出し、PFA(4%w/v)によって4℃において48時間滴下固定した。次いで、脳をPBSによって3回洗浄し、ミクロトーム(Leica)を使用して冠状切片(40μm)の前に48時間スクロース(30%w/v)溶液に沈めた。浮遊する切片は、IHCが実行されるまで、4℃のPBSアジ化ナトリウム(0.05%)溶液に保管された。
ドットブロット
タンパク質の連続希釈液(2μl)を、あらかじめ湿らせたニトロセルロース紙にブロットし、乾燥させた。乾燥後、室温において1時間、わずかに振とうしながら、Tween 20(TBST)を含む1×Tris緩衝生理食塩水中の5%BSAによってブロットをブロッキングした。次に、ブロットを一次抗体(下記参照)とともに室温において1時間インキュベートした。その後、ブロットをTBSTによって各5分間3回洗浄した。次いで、ブロットをHRPコンジュゲート二次抗体(Santa Cruz)と1:10,000で、室温において1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。1時間後、ブロットをTBSTによって各5分間、3回洗浄した。洗浄後、ブロットを濾紙上で乾燥させ、暗所において10分間、Pierce ECLウエスタンブロッティング現像基質(Thermo Fisher)とインキュベートした。ブロットはChemiDoc XRS+イメージングシステム(BioRad)でイメージングした。
タンパク質の連続希釈液(2μl)を、あらかじめ湿らせたニトロセルロース紙にブロットし、乾燥させた。乾燥後、室温において1時間、わずかに振とうしながら、Tween 20(TBST)を含む1×Tris緩衝生理食塩水中の5%BSAによってブロットをブロッキングした。次に、ブロットを一次抗体(下記参照)とともに室温において1時間インキュベートした。その後、ブロットをTBSTによって各5分間3回洗浄した。次いで、ブロットをHRPコンジュゲート二次抗体(Santa Cruz)と1:10,000で、室温において1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。1時間後、ブロットをTBSTによって各5分間、3回洗浄した。洗浄後、ブロットを濾紙上で乾燥させ、暗所において10分間、Pierce ECLウエスタンブロッティング現像基質(Thermo Fisher)とインキュベートした。ブロットはChemiDoc XRS+イメージングシステム(BioRad)でイメージングした。
AD-GWAS qPCRプライマー
以下の検証済みで利用可能なTaqmanプライマーを使用した:APOE Hs00171168_m1、CR1 Hs00559342_m1、CD33 Hs01076281_m1、ABCA7 Hs01105117_m1、TREM2 Hs00219132_m1、TREML2 Hs01077557_m1、TYROBP(DAP12) Hs00182426_m1、PICALM Hs00200318_m1、CLU Hs00156548_m1、MS4A6A Hs01556747_m1、BIN1 Hs00184913_m1、CD2AP Hs00961451_m1、CASS4 Hs00220503_m1、MEF2C Hs00231149_m1、DSG2 Hs00170071_m1、MS4A4A Hs01106863_m1、ZCWPW1 Hs00215881_m1、INPP5D Hs00183290_m1、およびPTK2B Hs00169444_m1。
以下の検証済みで利用可能なTaqmanプライマーを使用した:APOE Hs00171168_m1、CR1 Hs00559342_m1、CD33 Hs01076281_m1、ABCA7 Hs01105117_m1、TREM2 Hs00219132_m1、TREML2 Hs01077557_m1、TYROBP(DAP12) Hs00182426_m1、PICALM Hs00200318_m1、CLU Hs00156548_m1、MS4A6A Hs01556747_m1、BIN1 Hs00184913_m1、CD2AP Hs00961451_m1、CASS4 Hs00220503_m1、MEF2C Hs00231149_m1、DSG2 Hs00170071_m1、MS4A4A Hs01106863_m1、ZCWPW1 Hs00215881_m1、INPP5D Hs00183290_m1、およびPTK2B Hs00169444_m1。
上述で開示された実施形態の特定の特徴および態様の様々な組み合わせまたはサブコンビネーションを作製できるが、それでも本発明のうちの1つ以上の範囲内に入ることが企図される。さらに、実施形態に関連する任意の特定の特徴、態様、方法、特性(property)、特性(characteristic)、品質、属性、要素などの本明細書の開示は、本明細書に記載される他の全ての実施形態で使用することができる。したがって、開示された実施形態の様々な特徴および態様は、開示された発明の様々なモードを形成するために互いに組み合わせること、または互いに置き換えることができることを理解されたい。したがって、本明細書において開示される本発明の範囲は、上述の特定の開示される実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な修正および代替形態が可能であるが、その特定の例が図面に示されており、本明細書で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は、開示された特定の形態または方法に限定されるものではなく、反対に、本発明は、記載される様々な実施形態および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にある全ての修正、均等物、および代替物を包含することを理解されたい。本明細書において開示される任意の方法は、言及された順序で実行される必要はない。本明細書において開示される方法は、開業医によってとられる特定の行動を含むが、明示的または暗黙的に、これらの行動の任意の第三者の指示を含めることもできる。例えば、「増殖NK細胞の集団の投与」などの行動には、「増殖NK細胞の集団の投与の指示」が含まれる。さらに、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群で記載される場合、本開示がまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個別のメンバー、またはマーカッシュ群のメンバーのサブグループで記載されていることを、当業者は理解するであろう。
本明細書に開示された範囲はまた、任意のおよび全ての重複、部分範囲、ならびにそれらの組み合わせを包含する。「最大でも」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「間」などの言語には、言及された数字が含まれる。「約」や「およそ」などの用語が前に付いている数字には、言及された数字が含まれている。例えば、「約10ナノメートル」には「10ナノメートル」が含まれる。
iHPC移植により、完全な脳環境におけるヒトのミクログリアの発達を試験することができる。完全なCNS環境におけるヒトミクログリアの正常な発達と老化は、マウスの脳にiHPCを移植することにより試験することができる(図24および25を参照)。
参照文献
参照文献
Claims (109)
- 多能性幹細胞(PSC)からヒトミクログリア様細胞(iMGL)を産生する方法であって、
(i)造血分化因子を補充した培地を使用してPSCを分化させて誘導造血始原細胞(iHPC)を産生する工程と、
(ii)ミクログリア分化培地を使用してCD43+ iHPCをヒトミクログリア様細胞(iMGL)に分化させる工程と
を含む方法。 - 工程(i)が、3日~21日の間のインキュベーション期間を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(i)のインキュベーション期間が10日である、請求項2に記載の方法。
- 前記インキュベーション期間の1~10日目に、前記PSCが低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる、請求項3に記載の方法。
- 前記インキュベーション期間の1日目および2日目に、前記培地がFGF2、BMP4、アクチビンA、LiCl、およびVEGFの造血分化因子を含み;
前記インキュベーション期間の3日目および4日目に、前記培地がFGF2およびVEGFの造血分化因子を含み;
前記インキュベーション期間の5~10日目に、前記培地がFGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6の造血分化因子を含む、
請求項3または4に記載の方法。 - 前記培地中のFGF2、BMP4、VEGF、TPO、SCF、IL-3、およびIL-6の各々の濃度が、5ng/ml~100ng/mlの間であり、
前記培地中のアクチビンAの濃度が、0.1ng/ml~30ng/mlの間である、
請求項5に記載の方法。 - 前記培地中のFGF2、BMP4、VEGF、TPO、SCF、IL-3、およびIL-6の各々の濃度が、約50ng/mlであり、
前記培地中のアクチビンAの濃度が、約12.5ng/mlであり、
LiClの濃度が約2mMである、
請求項6に記載の方法。 - 蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用してCD43+ iHPCを単離することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- CD43+ iHPCを単離することが、CD43+マーカーを選択することによって実行される、請求項8に記載の方法。
- 単離された前記iHPCが、80%を超える純度である、請求項9に記載の方法。
- 単離された前記iHPCが、90%を超える純度である、請求項10に記載の方法。
- 工程(ii)が、20~30日の間のインキュベーション期間をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)が、約25日のインキュベーション期間をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 工程(ii)の前記ミクログリア分化培地が、因子CSF-1、IL-34、およびTGFβ1を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ミクログリア分化培地が無血清である、請求項14に記載の方法。
- 前記培地中のCSF-1の濃度が、5ng/ml~50ng/mlの間であり、
前記培地中のIL-34の濃度が、25ng/ml~125ng/mlの間であり、
前記培地中のTGFβ1の濃度が、2.5ng/ml~100ng/mlの間である、
請求項14または15に記載の方法。 - CSF-1の濃度が約25ng/mlであり、
IL-34の濃度が約100ng/mlであり、
TGFβ1の濃度が約50ng/mlである、
請求項16に記載の方法。 - 工程(ii)が、1~5日の間のインキュベーション期間で前記iMGLを成熟させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)が、約3日のインキュベーション期間で前記iMGLを成熟させることを含む、請求項18に記載の方法。
- 工程(ii)が、CD200およびCX3CL1を含む培地中で前記iMGLをインキュベートすることにより、前記iMGLを成熟させることを含む、請求項19に記載の方法。
- CD200がヒト組換えCD200であり、CX3CL1がヒト組換えCX3CL1である、請求項20に記載の方法。
- 前記培地中のCD200およびCX3CL1の各々の濃度が、1ng/ml~1μg/mlの間である、請求項20または21に記載の方法。
- CD200およびCX3CL1の各々の濃度が、100ng/mlである、請求項22に記載の方法。
- 産生された前記iMGLがc-kit-/CD45+である、請求項1に記載の方法。
- 前記c-kit-/CD45+ iMGLが25日のインキュベーション期間の14日目に検出することができる、請求項24に記載の方法。
- ミクログリアの運命への拘束性に関する既知のマーカーである因子の発現について試験することをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 試験される因子の前記発現がPU.1およびTREM2を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記iMGLが、2つの別個のiMGLの集団:(1)CD45+/CX3CR1-および(2)CD45+/CX3CR1+を含む、請求項1に記載の方法。
- 産生された前記iMGLが少なくとも70%の純度である、請求項1に記載の方法。
- 産生された前記iMGLが少なくとも96%の純度である、請求項29に記載の方法。
- 純度レベルが、プリン受容体、P2ry12の発現、Trem2の発現、Iba1の発現、またはPu1の発現を使用して評価される、請求項29または30に記載の方法。
- 前記CD43+ iHPCがCD235a+/CD41a+である、請求項1に記載の方法。
- 多能性幹細胞(PSC)からヒトミクログリア様細胞(iMGL)を産生する方法であって、
(i)PSCを誘導造血始原細胞(iHPC)に分化させる工程と、
(ii)前記iHPCを分化させてiMGLを産生する工程と
を含む方法。 - CD200およびCX3CL1を含む培地中で前記iMGLをインキュベートすることにより、前記iMGLを成熟させる工程(iii)をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 前記iHPCがCD43+/CD235a+/CD41+である、請求項33に記載の方法。
- 前記iHPCが、工程(ii)において無血清分化培地中に前記iHPCを置くことによって、前記iMGLに分化する、請求項33に記載の方法。
- 前記無血清分化培地が、MCSF、IL-34、およびTGFβ1を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記産生されたiMGLがc-kit-/CD45+である、請求項33に記載の方法。
- 前記iMGLが、2つの別個のiMGLの集団:(1)CD45+/CX3R1-および(2)CD45+/CX3R1+を含む、請求項33に記載の方法。
- 工程(i)が5~15日の間のインキュベーション期間を含み、工程(ii)が20~30日の間のインキュベーション期間を含む、請求項33に記載の方法。
- 工程(i)が10日のインキュベーション期間を含み、工程(ii)が25日のインキュベーション期間を含む、請求項40に記載の方法。
- 工程(iii)が1~5日の間のインキュベーション期間を含む、請求項34に記載の方法。
- 工程(iii)が、3日のインキュベーション期間を含む、請求項42に記載の方法。
- 以下の遺伝子:RUNX1、PU.1、CSF1FR、CX3CR1、TGFBR1、RSG10、GAS6、PROS1、P2RY12、GPR34、C1Q、CR3、CABLES1、BHLHE41、TREM2、ITAM、APOE、SLCO2B1、SLC7A8、PPARD、C9orf72、GRN、LRRK2、TARDBP、およびCRYBB1の任意の組み合わせの発現を含む、iMGLの組成物。
- 前記TREM2とP2RY12とが共局在化している、請求項44に記載の組成物。
- 遺伝子KLF2、TREM1、MPT、ITGAL、およびADGRE5が発現していない、請求項44または45に記載の組成物。
- iMGLが基底状態にある場合にCD33、MS4A4A、およびCR1の発現を含む、iMGLの組成物。
- 前記iMGLが、リポ多糖、IFGγ、またはIL-1βによる刺激に応答して、ケモカイン:TNFα、CCL2、CCL4、およびCXCL10のいずれかの組み合わせを分泌する、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- 前記iMGLが、ADPに応答して遊走する、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- ADP刺激が、前記iMGLにおけるカルシウム移行の生成をもたらす、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- 前記iMGLが、ヒトシナプトソームを貪食することができる、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- 前記iMGLがシナプス刈り込みをすることができる、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- 前記シナプス刈り込みが、C1q/CR3経路に媒介される、請求項52に記載の組成物。
- 前記iMGLが、Aβおよびタウを貪食することができる、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- 前記iMGLが、蛍光標識線維性AβおよびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーを貪食することができる、請求項44~47のいずれかに記載の組成物。
- iMGLからの炎症性分子の分泌をプロファイリングする方法であって、
(i)前記iMGLを、リポ多糖、IFNγ、TNFα、またはIL-1βによって処理することと、
(ii)前記iMGLによって分泌される炎症マーカーを測定することと
を含む方法。 - 前記iMGLによって分泌される前記炎症マーカーが、CCL2、CCL4、およびCXCL10から選択される炎症性マーカーを含む、請求項56に記載の方法。
- iMGLの遊走を評価する方法であって、
(i)前記iMGLをADPによって処理することと、
(ii)化学刺激に応答したiMGLの運動性および遊走を評価することと
を含む方法。 - iMGLにおいてカルシウム移行を生じさせる方法であって、
(i)前記iMGLをADPによって処理することと、
(ii)前記iMGLにおけるカルシウムフラックスシグナルを調べることと
を含み、前記カルシウムフラックスシグナルが、電気的、生物学的、または化学的刺激に応答して生じる、方法。 - 化合物のミクログリア貪食を試験する方法であって、
(i)iMGLを、Aβ、タウ、蛍光標識Aβ、およびpHrodo標識脳由来タウオリゴマーからなる群から選択される化合物に曝露し、前記化合物が前記iMGLによって貪食、エンドサイトーシス、または摂取されることと、
(ii)前記化合物の前記貪食、エンドサイトーシス、または摂取を測定することと
を含む方法。 - iMGLのインビボ状態に類似するiMGL遺伝子発現プロファイルを確立する方法であって、
iMGLをニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養し、それにより、前記iMGLが前記ニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養されていない場合に前記iMGLに関して存在するよりも前記iMGLに関してよりインビボの状態を再現することと
を含む方法。 - 前記ニューロンがラット海馬ニューロンである、請求項61に記載の方法。
- 差次的に制御される遺伝子がCABLES、TRIM4、MITF、MMP2、およびSLCA25であり、前記差次的に制御される遺伝子がiMGLにおいて上方制御されている、請求項61または62に記載の方法。
- iMGLを3D CNS環境に組み込む方法であって、
iMGLをhiPSC 3D脳オルガノイド(BORG)と共培養することを含み、前記iMGLが前記BORGに遊走し、前記BORGに集合するか、または前記BORGに組み込まれる、方法。 - iMGLを使用して健康および疾患におけるミクログリア制御不全を試験する方法であって、
(i)iMGLを、Aβ、タウ、蛍光標識Aβ、pHrodo標識脳由来タウオリゴマー、およびアルファ-シヌクレインからなる群から選択される化合物に曝露することと、
(ii)RNA-seq、プロテオミクス、メタボロミクス、およびリピドミクスから選択されるiMGLオミックシグネチャをプロファイリングすることと
を含む方法。 - 差次的に制御される遺伝子がCD33、TYROPB、およびPICALMであり、前記差次的に制御される遺伝子がiMGLにおいて上方制御されている、請求項65に記載の方法。
- シナプス刈り込みおよびシナプス可塑性におけるミクログリアの役割を調査する方法であって、(i)iMGLをヒトシナプトソームに曝露することと、(ii)前記iMGLによるヒトシナプトソーム貪食を評価することとを含む方法。
- ニューロンのキューに応答するiMGLにおける遺伝子制御を評価する方法であって、
(i)iMGLを、CX3CL1、CD200、およびTGFβからなる群から選択される、中枢神経系に存在する因子に曝露することと、
(ii)P2RY12、EGR1、TGFβR1、ETV5、CX3CR1、APOE、BIN1、CD33、GPR84、COMT、APP、PSEN1、PSEN2、HTT、GRN、FUS、TARDP、VCP、SNCA、C9ORF72、LRRK2、およびSOD1からなる群から選択される遺伝子を含む差次的に制御される遺伝子を評価することと
を含む方法。 - 皮質へのiMGLの生着を評価する方法であって、
(i)iMGLを皮質に移植することと、
(ii)前記皮質への前記iMGLの生着を評価することと
を含む方法。 - 工程(ii)が工程(i)の2か月後に起こる、請求項69に記載の方法。
- iMGLをマウスの皮質に移植することをさらに含む、請求項69または70に記載の方法。
- 前記マウスがMITRGマウスである、請求項71に記載の方法。
- ADニューロパシーとのiMGLの相互作用を評価する方法であって、
(i)iMGLをマウスの脳に移植することと、
(ii)前記マウスの脳と相互作用するiMGLを評価することと
を含む方法。 - 工程(ii)が、斑へのiMGLの遊走を評価することを含む、請求項73に記載の方法。
- 工程(ii)が、線維性AβのiMGLによる貪食を評価することを含む、請求項73に記載の方法。
- 3D神経環境でヒトミクログリアを試験する方法であって、iMGLを哺乳動物の脳に移植することを含む方法。
- 前記哺乳動物の脳がマウスのものである、請求項76に記載の方法。
- 前記iMGLが前記マウスの海馬に移植される、請求項77に記載の方法。
- 前記マウスが野生型マウスである、請求項76または77に記載の方法。
- 前記マウスがADマウス系統である、請求項76または77に記載の方法。
- 前記インキュベーション期間の1~4日目に、前記PSCが5%酸素環境においてインキュベートされ、前記インキュベーション期間の5~10日目に、前記PSCが20%酸素環境においてインキュベートされる、請求項3に記載の方法。
- 前記培地中のFGF2、BMP4、VEGF、TPO、SCF、IL-3、およびIL-6の各々の濃度が、30ng/ml~70ng/mlの間であり、
前記培地中のアクチビンAの濃度が、11ng/ml~14ng/mlの間であり、
LiClが、1mM~3mMである、
請求項5に記載の方法。 - 前記培地中のCSF-1の濃度が、15ng/ml~35ng/mlの間であり、
前記培地中のIL-34の濃度が、80ng/ml~120ng/mlの間であり、
前記培地中のTGFβ1の濃度が、30ng/ml~70ng/mlの間である、
請求項14または15に記載の方法。 - 工程(iii)の前記ミクログリア分化培地が、因子CSF-1、IL-34、およびTGFβ2を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培地中のCSF-1の濃度が、5ng/ml~50ng/mlの間であり、
前記培地中のIL-34の濃度が、25ng/ml~125ng/mlの間であり、
前記培地中のTGFβ1の濃度が、2.5ng/ml~100ng/mlの間である、
請求項84に記載の方法。 - 工程(iii)の前記ミクログリア分化培地が、因子CSF-1、IL-34、およびTGFβ模倣物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TGFβ模倣物が、TGFβシグナル伝達経路を活性化する、請求項86に記載の方法。
- 前記PSCが、単一細胞PSCまたはPSCの小さな塊を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記iMGLを成熟させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PSCが胚様体に由来しない、請求項1または33に記載の方法。
- 前記c-kit-/CD45+ iMGLが、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、qPCR、RNA-seq、またはプロテオミクスを使用して検出される、請求項24に記載の方法。
- 前記PSCが誘導PSC(iPSC)を含む、請求項1または33に記載の方法。
- 前記PSCが胚性幹細胞(ESC)を含む、請求項1または33に記載の方法。
- 前記PSCが哺乳動物のPSCである、請求項1、33、92、または93のいずれかに記載の方法。
- 前記PSCがヒトのPSCである、請求項1、33、92、または93のいずれかに記載の方法。
- 前記PSCがマウスのPSCである、請求項1、33、92、または93のいずれかに記載の方法。
- 前記iHPCがCD34+、CD31+またはCD45+である、請求項35に記載の方法。
- 前記PSCが、分化前に、CD43+、CD235a+、CD41+、CD34+、CD31+、およびCD45+のいずれでもない、請求項1または33に記載の方法。
- 第1の型の細胞からヒトミクログリア様細胞(iMGL)を産生する方法であって、
(i)第1の型の細胞を誘導造血始原細胞(iHPC)に分化させる工程と、
(ii)前記iHPCを分化させてiMGLを産生する工程と
を含む方法。 - ヒトミクログリア様細胞(iHPC)の生成を支持するための培地であって、FGF2、BMP4、アクチビンA、およびLiClを含む培地。
- ヒトミクログリア様細胞(iHPC)の生成を支持するための培地であって、FGF2およびVEGFを含む培地。
- ヒトミクログリア様細胞(iHPC)の生成を支持するための培地であって、FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6を含む培地。
- FGF2、BMP4、アクチビンA、およびLiClを含む、ヒトミクログリア様細胞(iHPC)の生成を支持するための培地を含むキット。
- FGF2およびVEGFを含む、ヒトミクログリア様細胞(iHPC)の生成を支持するための培地を含むキット。
- FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、およびIL6を含む、ヒトミクログリア様細胞(iHPC)の生成を支持するための培地を含むキット。
- ヒトミクログリア様細胞(iMGL)の生成を支持するための培地であって、CSF-1、IL-34、およびTGFβ1を含む培地。
- CSF-1、IL-34、およびTGFβ1を含む、ヒトミクログリア様細胞(iMGL)の生成を支持するための培地を含むキット。
- ヒトミクログリア様細胞(iMGL)の成熟および維持を支持するための培地であって、CD200およびCX3CL1を含む培地。
- CD200およびCX3CL1を含む、ヒトミクログリア様細胞(iMGL)の成熟および維持を支持するための培地を含むキット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762464925P | 2017-02-28 | 2017-02-28 | |
US62/464,925 | 2017-02-28 | ||
PCT/US2018/019763 WO2018160496A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-02-26 | Differentiation and use of human microglia-like cells from pluripotent stem cells and hematopoietic progenitors |
JP2019546831A JP2020513794A (ja) | 2017-02-28 | 2018-02-26 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
JP2023020284A JP2023071728A (ja) | 2017-02-28 | 2023-02-13 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023020284A Division JP2023071728A (ja) | 2017-02-28 | 2023-02-13 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023182587A true JP2023182587A (ja) | 2023-12-26 |
JP2023182587A5 JP2023182587A5 (ja) | 2024-07-01 |
Family
ID=63370557
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019546831A Withdrawn JP2020513794A (ja) | 2017-02-28 | 2018-02-26 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
JP2023020284A Pending JP2023071728A (ja) | 2017-02-28 | 2023-02-13 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
JP2023144942A Pending JP2023182587A (ja) | 2017-02-28 | 2023-09-07 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019546831A Withdrawn JP2020513794A (ja) | 2017-02-28 | 2018-02-26 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
JP2023020284A Pending JP2023071728A (ja) | 2017-02-28 | 2023-02-13 | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200239844A1 (ja) |
EP (2) | EP4272551A3 (ja) |
JP (3) | JP2020513794A (ja) |
CA (1) | CA3054730A1 (ja) |
WO (1) | WO2018160496A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JOP20190248A1 (ar) | 2017-04-21 | 2019-10-20 | Amgen Inc | بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته |
CN113924362A (zh) * | 2019-03-29 | 2022-01-11 | 新加坡科技研究局 | 小胶质细胞充足的脑类器官 |
US20220235322A1 (en) * | 2019-05-30 | 2022-07-28 | President And Fellows Of Harvard College | Reproducible brain organoids and methods of making |
GB2584664B (en) * | 2019-06-10 | 2023-05-24 | Newcells Biotech Ltd | Improved retinal organoids and methods of making the same |
CN110205295B (zh) * | 2019-06-25 | 2021-10-29 | 中国科学院动物研究所 | 一种多能干细胞诱导产生小胶质细胞的方法及试剂盒 |
KR20210077634A (ko) * | 2019-12-17 | 2021-06-25 | 코아스템(주) | 인간 만능 줄기세포로부터 3d 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법 |
CN112011509A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-01 | 南京中医药大学 | 脊髓损伤大鼠原代小胶质细胞分离方法及应用 |
CN114426951B (zh) * | 2020-10-29 | 2024-05-14 | 北京赛尔湃腾科技咨询合伙企业(有限合伙) | 利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法 |
WO2024015933A2 (en) * | 2022-07-13 | 2024-01-18 | The Regents Of The University Of California | Transplanting stem cell-derived microglia to treat leukodystrophies |
WO2024137677A1 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | FUJIFILM Holdings America Corporation | Extracellular vesicle-enriched secretome composition derived from induced pluripotent stem cell derived-microglia and methods of use thereof |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010125107A1 (en) * | 2009-04-28 | 2010-11-04 | Life & Brain Gmbh | Microglial precursor cells for the treatment of malignant neoplasms of the central nervous system |
US10081792B2 (en) * | 2014-12-31 | 2018-09-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Derivation of human microglia from pluripotent stem cells |
EP3240891B1 (en) * | 2014-12-31 | 2021-09-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Human pluripotent stem cell-based models for predictive developmental neural toxicity |
CN114058582A (zh) * | 2015-01-26 | 2022-02-18 | 菲特治疗公司 | 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物 |
WO2016210313A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Culture medium for generating microglia from pluripotent stem cells and related methods |
JP7235507B2 (ja) * | 2016-03-03 | 2023-03-08 | ニューヨーク ステム セル ファウンデーション インコーポレイテッド | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 |
-
2018
- 2018-02-26 EP EP23178750.8A patent/EP4272551A3/en active Pending
- 2018-02-26 EP EP18760945.8A patent/EP3589293A4/en active Pending
- 2018-02-26 US US16/489,338 patent/US20200239844A1/en active Pending
- 2018-02-26 CA CA3054730A patent/CA3054730A1/en active Pending
- 2018-02-26 WO PCT/US2018/019763 patent/WO2018160496A1/en unknown
- 2018-02-26 JP JP2019546831A patent/JP2020513794A/ja not_active Withdrawn
-
2023
- 2023-02-13 JP JP2023020284A patent/JP2023071728A/ja active Pending
- 2023-09-07 JP JP2023144942A patent/JP2023182587A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3054730A1 (en) | 2018-09-07 |
EP4272551A2 (en) | 2023-11-08 |
EP3589293A4 (en) | 2020-12-16 |
EP3589293A1 (en) | 2020-01-08 |
US20200239844A1 (en) | 2020-07-30 |
JP2020513794A (ja) | 2020-05-21 |
EP4272551A3 (en) | 2024-03-06 |
JP2023071728A (ja) | 2023-05-23 |
WO2018160496A1 (en) | 2018-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2023182587A (ja) | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 | |
McQuade et al. | Gene expression and functional deficits underlie TREM2-knockout microglia responses in human models of Alzheimer’s disease | |
d’Errico et al. | Microglia contribute to the propagation of Aβ into unaffected brain tissue | |
Peuhu et al. | Epithelial vimentin plays a functional role in mammary gland development | |
Starost et al. | Extrinsic immune cell-derived, but not intrinsic oligodendroglial factors contribute to oligodendroglial differentiation block in multiple sclerosis | |
Kam et al. | The cellular composition and morphological organization of the rostral migratory stream in the adult human brain | |
Zhu et al. | CXCL12 enhances human neural progenitor cell survival through a CXCR7-and CXCR4-mediated endocytotic signaling pathway | |
JP2022106847A (ja) | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 | |
Park et al. | iPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer | |
Asselin et al. | Mutations in the KIF21B kinesin gene cause neurodevelopmental disorders through imbalanced canonical motor activity | |
Hirose et al. | ATP6AP2 variant impairs CNS development and neuronal survival to cause fulminant neurodegeneration | |
Thamm et al. | Prominin‐1 (CD133) modulates the architecture and dynamics of microvilli | |
Raju et al. | Secretagogin is expressed by developing neocortical GABAergic neurons in humans but not mice and increases neurite arbor size and complexity | |
Wang et al. | The COPII cargo adapter SEC24C is essential for neuronal homeostasis | |
Cuevas et al. | Lin41/Trim71 is essential for mouse development and specifically expressed in postnatal ependymal cells of the brain | |
US20150017134A1 (en) | Emt-inducing transcription factors cooperate with sox9 | |
Nizzardo et al. | iPSC-derived LewisX+ CXCR4+ β1-integrin+ neural stem cells improve the amyotrophic lateral sclerosis phenotype by preserving motor neurons and muscle innervation in human and rodent models | |
Mazzara et al. | Two factor-based reprogramming of rodent and human fibroblasts into Schwann cells | |
US20230357722A1 (en) | Methods for identifying modulators of natural killer cell interactions | |
Morini et al. | Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement | |
Paudel et al. | ADAM10 mediates N‐cadherin ectodomain shedding during retinal ganglion cell differentiation in primary cultured retinal cells from the developing chick retina | |
Parreno et al. | Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells | |
Tanos et al. | Isolation of putative stem cells present in human adult olfactory mucosa | |
Miura et al. | Differential expression of Lutheran/BCAM regulates biliary tissue remodeling in ductular reaction during liver regeneration | |
Haney et al. | APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer’s microglia |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231006 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231006 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20240502 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240617 |