ES2946697T3 - Una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a una población de células para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende células dendríticas CD1c (BDCA-1)+/CD19-, en la que las células dendríticas CD1c(BDCA-1)+/CD19- están empobrecidas en células CD1c (BDCA-1)+/CD197CD14+. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer
La invención se refiere a una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente según la reivindicación 1 y al uso de un kit para producir dicha población celular según la reivindicación 8.
El documento US 5.849.589 A describe el cultivo de monocitos con IL-4, TNF-alfa y GM-CSF para inducir diferenciación a células dendríticas. El documento WO 98/53048 A1 divulga procedimientos y composiciones para producir células dendríticas a partir de poblaciones expandidas de monocitos y para activar células T. Se conocen subconjuntos de células dendríticas derivadas de monocitos por el documento W o 01/51617 A1.
Introducción
Las células dendríticas (DC) son actores principales en las respuestas inmunitarias. Como células presentadoras de antígenos profesionales, las DC toman muestras del microentorno tisular y fagocitan tanto los productos derivados de patógenos como las células huésped moribundas, incluidas las células tumorales (Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392:245-252 Las DC tienen la capacidad única de atraer y activar células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno (tumor) vírgenes. La inmunoterapia basada en DC aprovecha esta propiedad de las DC: se inyectan DC cargadas con antígeno tumoral en pacientes con cáncer para estimular las células T e iniciar la erradicación del tumor (Figdor CG, de Vries IJM, Lesterhuis WJ, Melief CJM. Dendritic cell immunotherapy: mapping the way. Nature Medicine 2004; 10:475-480; Tacken PJ, de Vries IJM, Torensma R, Figdor CG. Dendritic-cell immunotherapy: from ex vivo loading to in vivo targeting. Nat.Rev.lmmunol. 2007; 7:790-802) Las DC para inmunoterapia se preparan comúnmente in vitro a partir de precursores monocíticos. El prolongado periodo de cultivo (8 a 9 días) y los compuestos necesarios para diferenciarlos en DC pueden afectar negativamente a su potencial inmunológico.
En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de enfoques alternativos de inmunoterapia basados en DC. Breve descripción de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente que comprende, o consiste en, células dendríticas CD1c+/CD19-, en la que una cantidad inferior o igual al 25% de estas células dendríticas CD1c+/CD19- son células CD1c+/CD19-/CD14+.
Dicha población celular puede además comprender, o consistir en, células que también son CD304 (BDCA-4). En una forma de realización, al menos el 50% de las células están cargadas con un antígeno tumoral o un péptido tumoral.
Las células pueden purificarse a partir de sangre, en particular de la sangre de un paciente que necesita un tratamiento contra el cáncer. El cáncer puede ser un cáncer sólido, tal como leucemia mieloide crónica, melanoma o cáncer de próstata.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit para producir dicha población celular para el tratamiento de cáncer en un paciente. Dicho kit comprende, o consiste en, los componentes siguientes:
• Un anticuerpo capaz de unirse a CD1c (BDCA-1),
• Un anticuerpo capaz de unirse a un marcador expresado en un monocito, preferentemente a DC supresoras, • Un anticuerpo capaz de unirse a un marcador expresado en una célula B, en particular CD19 o CD20 y, opcionalmente
• Un anticuerpo capaz de unirse a células dendríticas plasmocitoides.
Descripción detallada de la invención
En la sangre periférica humana se pueden distinguir dos poblaciones principales de DC que circulan de forma natural: DC mieloides (mDC) caracterizadas por la expresión de CD1c y la falta de expresión de CD19 (CD1c+ (BDCA-1) CD19-) y DC plasmocitoides (pDC) caracterizadas por la expresión de CD304 (CD304+ (BDCA-4)). Estos subtipos difieren en función, localización y fenotipo. Las mDC migran principalmente hacia la zona marginal de los ganglios linfáticos, o residen en la misma, y se cree que reconocen antígenos bacterianos y fúngicos y responden a los mismos. Las pDC, por otra parte, residen principalmente en las zonas de células T de los ganglios linfáticos y parecen estar especializadas en el reconocimiento de antígenos víricos (Liu YJ. Dendritic cell subsets and lineages, and their
functions in innate and adaptive immunity. Cell 2001 ;106:259-262). Tanto las mDC como las pDC tienen la capacidad de iniciar respuestas de células T adecuadas, dependiendo de los patógenos que encuentren.
La presente invención se refiere a una vacuna de DC antitumoral (una población celular según la reivindicación 1) para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente y al uso de un kit para producir dicha vacuna. Los inventores han identificado una nueva población de células mieloides sanguíneas, distinta con respecto a la coexpresión del marcador de DC CD1c (BDCA-1) y el marcador monocítico CD14. Esta población de BDCA-1+ CD14+ ejerce una inmunosupresión específica de antígeno. Las células BDCA-1+ CD14+ son inductores débiles de las células T. Por lo tanto, la focalización en esta nueva población en pacientes con cáncer y/o la preparación de vacunas de DC desprovistas de células BDCA1+ CD14+ mejora la eficacia clínica de las vacunas antitumorales basadas en DC.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CD14+" se refiere a células que expresan el gen CD14 que es un componente del sistema inmunitario innato. La proteína CD14, una proteína con un peso molecular de 55 kD, está anclada a la membrana celular por una cola de glicosilfosfatidilinositol. Generalmente el término CD14+ comprende todas las células que pueden teñirse cuando se ponen en contacto con un anticuerpo anti-CD14 marcado o un fragmento del mismo, a saber, células CD14high y células CD14low.
CD14high se refiere a células que se tiñen de forma brillante cuando se ponen en contacto con el anticuerpo anti-CD14 marcado. Este nivel de expresión corresponde al nivel que se expresa por monocitos CD14high CD16- clásicos de sangre periférica humana, que representan el subconjunto principal de monocitos sanguíneos y expresan CD14 en el nivel más alto de todas las células sanguíneas (Ziegler-Heitbrock et al., BLOOD, 21 DE OCTUBRE DE 2010 VOLUMEN 116, NÚMERO 16). CD14low se refiere a células que se tiñen de forma menos brillante cuando se ponen en contacto con el anticuerpo anti-CD14 marcado. Las células CD14low muestran un nivel de expresión entre las células CD14high y las células CD14-, que corresponde al nivel expresado por monocitos CD14+ CD16high no clásicos de sangre periférica humana (Ziegler-Heitbrock et al., BLOOD, 21 DE OCTUBRE DE 2010 VOLUMEN 116, NÚMERO 16).
En un aspecto, la invención se refiere a una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente, en el que la población celular comprende, o consiste en, células CD1c (BDCA-1)+/CD19-. El término "consiste" se refiere en este contexto a una población celular en la que al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% de todas las células, preferentemente, el 95%, 98% o 99%, o el 99,9% de todas las células CD1c+ de la población son CD19-.
Según la invención, las células dendríticas (mDC) CD1c (BDCA-1)+/CD19- se empobrecen en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+. Preferentemente, las células CD14+ se empobrecen en al menos el 75%.
En otras palabras, la invención se refiere en un aspecto a una población celular que consiste en, o comprende, células dendríticas CD1c+/CD19-, en la que una cantidad inferior o igual al 25% (< 25%) de estas células dendríticas CD1c+/CD19- son células CD1c+/CD19-/CD14+; las células dendríticas CD1c+/CD19- se empobrecen en células CD1c+/CD19-/CD14+ de manera que la población celular de células CD1c+/CD19- comprende una cantidad inferior a igual al 25% (< 25%) de células CD1c+/CD19-/CD14+.
En formas de realización preferidas, la población celular de células dendríticas CD1c+/CD19- comprende menos del 20%, preferentemente menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, o de forma más preferida, menos del 1% de células CD1c+/CD19-/CD14+.
Dado que las células CD1c+/CD19-/CD14- también son FcsR1+, este marcador también se puede usar para distinguir estas células de las células CD1c+/CD19-/CD14+.
En otro aspecto, la invención se refiere a una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente, en el que la población celular comprende, o consiste en, células dendríticas CD1c (BDCA-1)+/CD19-, en la que las células dendríticas CD1c (Bd Ca -1)+/C d 19- se empobrecen en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+, preferentemente se empobrecen en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14high. En otra forma de realización, el empobrecimiento de células dendríticas CD1c (BDCA-1)+/CD19- en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+, preferentemente en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14high, da lugar a una población celular en la que una cantidad inferior o igual al 25% de las células dendríticas CD1c+/CD19- son CD1c(BDCA-1 )+/CD19-/CD14+.
En la sangre, CD1c (BDCA-1) se expresa además de a partir de mDC también en una subpoblación de linfocitos B pequeños CD19+ en reposo. Por esta razón, para el aislamiento de mDC CD1c (BDCA-1), se realiza un empobrecimiento en células B, por ejemplo utilizando el marcador CD19 y/o CD20 antes del enriquecimiento de mDC. Para el aislamiento del subconjunto de mDC CD1c (BDCA-1)+ CD14-, se realiza un empobrecimiento en células CD14+, por ejemplo utilizando el marcador CD14 antes del enriquecimiento de mDC. Después del empobrecimiento en células B y células CD14+, las mDC se pueden marcar (por ejemplo, usando un anticuerpo capaz de unirse a CD1c), preferentemente marcado magnéticamente (cuando el anticuerpo CD1c se acopla directamente a una microperla magnética o indirectamente usando anticuerpo CD1c conjugado con biotina y anticuerpo anti-biotina acoplado a una microperla magnética) y enriquecerse de acuerdo con la expresión específica de CD1c (BDCA-1).
Las células CD1c+/CD19- que son CD14- también son CD11b- y CCR5low/-. Por el contrario, las células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+, que ejercen una inmunosupresión específica de antígeno, expresan los marcadores moleculares CD14, CD11b o CCR5 y se denominan en el presente documento "células dendríticas (DC) supresoras".
En una forma de realización de la invención, la población celular comprende, o consiste en, células dendríticas CD1c+/CD19, en la que una cantidad inferior o igual al 25% (< 25%) de estas células dendríticas CD1c+/CD19- son células CD1c+/CD19-/CD14+ junto con células que son CD304 (BDCA-4)+ (DC plasmocitoides).
Las mDC CD1c (BDCA-1)+ se caracterizan por ser: CD1c (BDCA-1)+, CD11b-, CCR5low/-, CD19, CD11c-high, CD123-low, CD4+, CD45RO+, CD2+, CD16-, CD141 (BDCA-3)low, CD303 (BDCA-2)-, CD304 (BDCA-4)-. Carecen de expresión de marcadores de linaje (CD3, CD16, CD19, CD20) y expresan marcadores mieloides, tales como CD13 y CD33 y receptores Fc, tales como CD32, CD64 o FcsRI.
En una forma de realización de la descripción, las mDC se purifican a partir de la sangre del paciente que necesita un tratamiento contra el cáncer. Esto permite la generación de una población celular de mDC autólogas, que puede administrarse al paciente sin causar efectos secundarios significativos. En una forma de realización, la sangre del paciente está sometida a aféresis, tal como se sabe en la técnica. En una forma de realización de la invención, las mDC se activan y se cargan con antígeno tumoral antes de la administración a un paciente.
Las pDC y mDC complementan sus funciones y actúan sinérgicamente para lograr respuestas inmunitarias óptimas. La administración conjunta de mDC y pDC sanguíneas a menudo genera respuestas inmunitarias antitumorales más potentes y duraderas en pacientes con cáncer en comparación con la vacunación con DC derivadas de monocitos diferenciadas ex vivo . Por lo tanto, una vacunación de pacientes con cáncer mediante la administración conjunta de pDC y mDC junto con la población celular que comprende, o consiste en, células dendríticas CD1c+/CD19-, en la que una cantidad inferior o igual al 25% (< 25%) de estas células dendríticas CD1c+/CD19- son células CD1c+/CD19-/CD14+, constituye una forma de realización preferida de la invención.
Por lo tanto, la composición celular de la invención comprende además, en una forma de realización, también pDC (que son CD304 (BDCA-4)+) que se purificaron a partir de la sangre del paciente que necesita un tratamiento contra el cáncer. En consecuencia, las pDC son autólogas para el paciente al que se van a administrar.
En otra forma de realización, la composición celular de la invención comprende además también células CD303 (BDCA-2)+ (en particular células aisladas antes del cultivo) que se purificaron a partir de la sangre del paciente que necesita un tratamiento contra el cáncer (autólogo).
Las pDC CD304 (BDCA-4/Neuropilina-1)+ se caracterizan por ser CD11c-, CD123high, CD4+, CD45RA+, CD303 (Bd Ca -2)+, CD141 (BDCA-3)dim, CD1c (BDCA-1)- y CD2-. Carecen de la expresión de marcadores de linaje (CD3, CD14, c D16, CD19, CD20, CD56) y no expresan marcadores mieloides, tales como CD13 y CD33, ni FcsRI, pero son positivas a TLR7 y TLR9.
La población celular de la invención se puede preparar como una composición farmacéutica. Para este fin, la composición celular de la invención se suspende, por ejemplo, en una solución salina fisiológica.
En una forma de realización de la invención, las células dendríticas de la población celular se cargan con un antígeno tumoral o un péptido tumoral. En otra forma de realización, las células dendríticas de la población celular se cargan con un antígeno o péptido tumoral que se une a HLA.
La invención no se limita a un tipo particular de cáncer. Por el contrario, la población celular de la invención se puede usar para tratar cualquier tipo de cáncer. En una forma de realización, la población celular se usa para el tratamiento de melanoma, cáncer de ovario o cáncer de próstata en un paciente.
El cáncer que hay que tratar puede ser, por ejemplo, un melanoma, en particular un melanoma en todos los estadios, en particular en los estadios III y IV, según el sistema de estadiaje de The American Joint Committee on Cancer. El cáncer que hay que tratar también puede ser, por ejemplo, un cáncer de próstata, en particular un cáncer de próstata en todos los estadios, en particular en los estadios III y IV, según el sistema de estadiaje de The American Joint Committee on Cancer.
En otro aspecto, la invención se refiere a una población celular de células dendríticas que consiste en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-, en el que la población celular de células CD1c+/CD19- contiene una cantidad inferior al 25% de células CD1c+/CD19-/CD14+. En formas de realización preferidas, la población celular comprende menos del 20%, preferentemente menos del 15%, menos del 10%, menos del 5% o, de la forma más preferida, menos del 1% de células CD1c+/CD19-/CD14+ de todas las células dendríticas CD1c+/CD19- de la población.
Se describe un procedimiento para producir una población celular para tratar cáncer en un paciente, que comprende las etapas de purificar las células dendríticas e incubarlas con un antígeno o péptido tumoral.
El procedimiento puede comprender las etapas siguientes:
• Purificación de células dendríticas (células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14-) a partir de la sangre de un paciente (autólogo) que necesita tratamiento o terapia contra el cáncer. De ese modo, se obtiene una población celular de mDC autólogas. Esta purificación se realiza utilizando anticuerpos, a saber
o al menos un primer anticuerpo capaz de unirse a CD1c (BDCA-1) para realizar un enriquecimiento en células CD1c+,
o al menos un segundo anticuerpo capaz de unirse a linfocitos B, y
o al menos un tercer anticuerpo capaz de unirse a una DC supresora.
Al realizar la clasificación de células magnéticas (MACS), en primer lugar se realiza un empobrecimiento en células B y células CD14+; posteriormente se realiza un enriquecimiento en las mDC con un anticuerpo CD1c. Para la clasificación por flujo, la secuencia de etapas es irrelevante.
El, al menos un, segundo anticuerpo capaz de unirse a los linfocitos B se selecciona en una forma de realización del grupo que consiste en anticuerpos capaces de unirse a CD19 o CD20.
El, al menos un, tercer anticuerpo capaz de unirse a una DC supresora se selecciona en una forma de realización del grupo que consiste en anticuerpos capaces de unirse a CD14, CD11b o CCR5. Los marcadores CD14, CD11b y CCR5 se coexpresan en DC supresoras. Por lo tanto, el empobrecimiento en DC supresoras se puede realizar utilizando cualquiera de los tres marcadores. En una forma de realización, el empobrecimiento se realiza usando dos o los tres marcadores del grupo que consiste en CD14, CD11b y CCR5.
En el procedimiento, las células dendríticas CD1c (BDCA-1)+/CD19- se empobrecen en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+, preferentemente de forma que se produzca un empobrecimiento en células CD14+ de al menos el 75%. En determinadas formas de realización, se produce un empobrecimiento de al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% en células CD14+. Alternativamente, en el procedimiento las células dendríticas CD1c (BDCA-1)+/CD19- se empobrecen en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+ de tal manera que una cantidad inferior o igual al 25% (< 25%) de estas células dendríticas CD1c+/CD19- sean células CD1c+/CD19-/CD14+.
Por ejemplo, las mDC se pueden aislar directamente a partir de los productos de aféresis. Para ello, puede utilizarse un anticuerpo primario que sea capaz de unirse a CD1c (BDCA-1)+; este anticuerpo puede conjugarse con biotina u otra molécula, que puede unirse a un anticuerpo secundario. Un soporte sólido, tal como una perla, en particular una perla magnética (MicroBead), se conjuga con un anticuerpo anti-biotina secundario capaz de unirse a biotina o con un anticuerpo secundario capaz de unirse a la molécula, que está acoplada al anticuerpo primario CD1c. El uso de una perla magnética conjugada con el anticuerpo anti-biotina secundario permite la separación magnética de las mDC unidas al anticuerpo biotinilado anti-CD1c (BDCA-1). En una forma de realización, el anticuerpo CD1c (BDCA-1) se puede conjugar directamente con un soporte sólido tal como una perla, en particular una perla magnética (MicroBead). En otra forma de realización, se usa el sistema de aislamiento CliniMACS inmunomagnético completamente cerrado (Miltenyi Biotec GmbH) para aislar mDC.
El término anticuerpos, tal como se utiliza en el presente documento, significa moléculas de inmunoglobulina intactas, así como porciones, fragmentos, péptidos y derivados de las mismas tales como, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 , Fv, regiones CDR, paratopos o cualquier porción o secuencia peptídica de un anticuerpo que sea capaz de unirse a un antígeno o epítopo, e incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanizados, anticuerpos recombinantes y anticuerpos monoclonales producidos por animales transgénicos o porciones, fragmentos, péptidos y derivados de los mismos. Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir así la molécula al anticuerpo. Numerosos anticuerpos han sido aprobados para su uso en seres humanos. Véase, por ejemplo, Walden, 9 Nat. Med. 269 (2004)) o http://www.immunologylink.com/FDA-app-Abs.html.
El procedimiento comprende además la etapa de incubar las células dendríticas obtenidas después de realizar las etapas de purificación descritas anteriormente con un antígeno o péptido tumoral.
Por ejemplo, se realiza en primer lugar un empobrecimiento en células B usando un anticuerpo que es capaz de unirse a CD19, por ejemplo anticuerpos anti-CD19 acoplados a perlas magnéticas. Se realiza un empobrecimiento en células CD14+ utilizando microperlas CD14 (es decir, con un anticuerpo capaz de unirse a CD14, en el que el anticuerpo está unido a una microperla, en particular una microperla clasificable magnéticamente). Posteriormente, se seleccionan positivamente mDC CD1c (BDCA-1)+. Para este fin se utiliza un anticuerpo que es capaz de unirse a CD1c/BDCA-1 (anticuerpo anti-CD1c/BDCA-1). Esto se puede realizar, por ejemplo, con anticuerpos primarios anti-CD1c recubiertos con biotina y un anticuerpo secundario anti-biotina acoplado a una perla magnética.
Después del aislamiento de mDC, se pueden cultivar mDC, por ejemplo durante toda la noche, preferentemente a una concentración de aproximadamente 0,1 x 106 células/ml a 2 x 106 células/ml, en condiciones que permitan la maduración de mDC. Dichas mDC pueden caracterizarse por los criterios siguientes: aumento de la expresión de MHC de clase I, MHC de clase II, CD83 y CD86 en comparación con mDC antes de la etapa de cultivo de maduración.
En una forma de realización, el procedimiento comprende además del aislamiento de mDC CD1c+/CD19- la etapa adicional de purificar células dendríticas plasmocitoides a partir de la sangre del paciente que necesita tratamiento contra el cáncer usando, por ejemplo, anticuerpos CD304 (BDCA-4).
El procedimiento comprende además, en al menos una forma de realización, la etapa de inducir la maduración de las células dendríticas purificadas. Esta inducción se puede realizar por medio de cualquier estimulación conocida en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un agonista del receptor tipo toll (TLR) o cualquier otro estímulo que permita la maduración de DC. En una forma de realización, se usa como estímulo el complejo de ARN-protamina.
De acuerdo con un ejemplo, el procedimiento se realiza usando las etapas siguientes:
En primer lugar, las células de aféresis de un paciente que necesita terapia contra el cáncer se marcan magnéticamente para aislar las células de interés. En particular, el marcaje se realiza utilizando anti-CD1c-biotina (es decir, con un anticuerpo capaz de unirse a CD1c, estando el anticuerpo marcado con biotina), microperlas CD14 (es decir, con un anticuerpo capaz de unirse a CD14, estando el anticuerpo unido a una microperla, en particular una microperla clasificable magnéticamente) y microperlas CD19 (es decir, con un anticuerpo capaz de unirse a CD19, estando el anticuerpo unido a una microperla, en particular una microperla clasificable magnéticamente). El marcador CD19 se usa para realizar un empobrecimiento en células B, tal como se ha explicado anteriormente.
En segundo lugar, se realiza un empobrecimiento en células CD14+ y CD19+ a partir de la composición celular inicial. Para este fin, las microperlas CD14 y las microperlas CD19 se incuban con las células del paciente y se retiran las células B y las células CD14+ marcadas magnéticamente (a las que están unidas respectivamente las microperlas CD14 y las microperlas CD19). Si las microperlas son magnéticas, la retirada de las células unidas a las mismas se realiza utilizando un sistema de clasificación magnética (tal como el proporcionado por Miltenyi Biotech GmbH).
En tercer lugar, se añaden microperlas anti-biotina (es decir, con un anticuerpo capaz de unirse a biotina, estando el anticuerpo unido a una microperla, en particular una microperla clasificable magnéticamente) a las células magnéticamente negativas restantes. Opcionalmente, para el aislamiento simultáneo de mDC CD1c+/CD19- y pDC CD304+, se añaden microperlas anti-biotina y microperlas CD304 (BDCA-4) (es decir, con un anticuerpo capaz de unirse a CD304 (BDCA-4), estando el anticuerpo unido a una microperla, en particular una microperla clasificable magnéticamente) a las células remanentes.
En la cuarta etapa, se realiza un enriquecimiento en células CD1c (BDCA-1)+ y, opcionalmente, CD1c (BDCA-1)+ y CD304 (BDCA-4)+, es decir, se aíslan de la población de células sanguíneas.
En una forma de realización de la invención, las células dendríticas CD1c (BDCA-1)+/CD19- se empobrecen en células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14+, de modo que la población celular de células CD1c+/CD19- no contenga más del 25% de células CD1c+/CD19-/CD14+. En formas de realización alternativas, se realiza un empobrecimiento de al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% en células CD14+, de tal manera que la población celular de células CD1c+/CD19- no contenga más del 25% de células CD1c+/CD19-/CD14+.
En una forma de realización de la invención, las pDC y las mDC se cargan con diferentes antígenos o péptidos o fragmentos de los mismos.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit para producir la población celular de la reivindicación 1 para tratar cáncer en un paciente, en particular en un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente y en el presente documento. Dicho kit comprende, o consiste en, los componentes siguientes:
• Un anticuerpo capaz de unirse a CD1c (BDCA-1),
• Un anticuerpo capaz de unirse a un monocito, preferentemente a DC supresoras,
• Un anticuerpo capaz de unirse a una célula B y, opcionalmente,
• Un anticuerpo capaz de unirse a CD304 (BDCA-4).
Un anticuerpo capaz de unirse a DC supresoras puede seleccionarse del grupo que consiste en CD14, CD11b y CCR5. Un anticuerpo capaz de unirse a una célula B puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos capaces de unirse a CD19 o CD20.
En una forma de realización de dicho uso, comprende además un antígeno tumoral de unión a HLA. El antígeno tumoral (por ejemplo, un péptido tumoral) debe elegirse de acuerdo con el cáncer que se va a tratar.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un procedimiento para tratar cáncer que comprende la etapa de administrar una población celular tal como se describe en el presente documento a un paciente humano con cáncer que necesita dicho tratamiento. De acuerdo con una forma de realización del procedimiento, se administra una población de células dendríticas sanguíneas (por ejemplo, células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14- o células CD1c+/CD19- con una cantidad inferior o igual al 25% de células CD1c+/CD19-/CD14+ y preferentemente células CD1c (BDCA-1)+/CD19-/CD14-, o células CD1c+/CD19- con una cantidad inferior o igual al 25% de células CD1c+/CD19-/CD14+ además de células CD304 (BDCA-4)+) a un paciente que padece cáncer.
La tasa de dosificación de DC que se va a administrar se encuentra habitualmente entre 103 y 109, preferentemente entre 105 y 107 por inyección, pero debe adaptarse al paciente que se va a tratar. Las DC cargadas con antígeno tumoral o péptido tumoral pueden administrarse por vía intraganglionar en una región de ganglio linfático, preferentemente bajo una guía de ultrasonido.
Por lo general, se pueden administrar de dos a cuatro inyecciones intraganglionares una vez cada una a cuatro semanas, seguidas opcionalmente de una provocación con DTH (DTH = hipersensibilidad de tipo retardado). Una respuesta de DTH es una medida de la capacidad de inmunizar a un paciente contra una célula tumoral o un antígeno tumoral específico y sirve a este respecto como control. En ausencia de progresión de la enfermedad, los pacientes pueden ser elegibles para ciclos de mantenimiento que consisten en vacunas adicionales y posiblemente una provocación con DTH, cada uno, por ejemplo, con un intervalo de 3 a 7 meses, preferentemente con un intervalo de 6 meses.
Normalmente, se administran entre 1x105 y 1 x107 células de una población de mDC y pDC.
Las mDC y pDC son habitualmente inmaduras (mostrando un bajo nivel de expresión de CD83, CD86, MHC clase I y MHC clase II) cuando se aíslan de la sangre de un paciente. Por lo tanto, en una forma de realización, las mDC se cultivan y se hacen madurar mediante estimulación, por ejemplo con ARN-protamina (regulación al alza de la expresión de CD83, CD86, MHC clase I y MHC clase II).
En una forma de realización, las mDC se aíslan directamente de los productos de aféresis usando el sistema de aislamiento CliniMACS inmunomagnético completamente cerrado que incluye anticuerpos acoplados a perlas magnéticas (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Aislamiento celular: A fin de aislar los diferentes subconjuntos, en primer lugar se aislaron PBMC de donantes sanos o pacientes con melanoma en estadio III o estadio IV usando un gradiente de Ficoll-Paque (Lucron Bioproducts). Cuando se indicó, la población total que expresa BDCA1 (que incluye DC BDCA1+ y población de BDCA1+ CD14+) se aisló a partir de PBMC utilizando el kit de aislamiento de DC BDCA1+ (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania), seguido del aislamiento de monocitos mediante la aplicación de microperlas anti-CD14 (Miltenyi Biotec). Los dos subconjuntos que expresan BDCA1 se discriminaron posteriormente en función de la expresión de CD14, mediante el uso de anti-CD14-PerCP (BD Biosciences, San Jose, CA).
Para aislar por separado las DC BDCA1+, las células BDCA1+ CD14+, los monocitos y las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), recurrimos a FACS, que estuvo precedido por un empobrecimiento en células T, B y NK de las PBMC. En primer lugar, las PBMC se trataron con un bloqueador de FcR (Miltenyi Biotec) para evitar cualquier unión inespecífica de anticuerpos, después las PBMC se trataron con anti-CD3-FITC, anti-CD20-FITC, anti-CD56-FITC (todos de BD Biosciences) y anti-CD19-FITC (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) seguidos de tratamiento con microperlas anti-FITC (Miltenyi Biotec) y clasificación celular activada magnéticamente. A continuación, las PBMC empobrecidas se prepararon para la clasificación de células activadas por flujo (FACS) marcándolas con los anticuerpos siguientes: cóctel de linaje-FITC, anti-CD14-PerCP, anti-HLA-DR-PE-Cy7 (todos de BD Biosciences) y anti-BDCA1-PE (Miltenyi Biotec). Los cuatro subconjuntos se aislaron utilizando FACS Aria (BD Biosciences). La estrategia de activación de FACS se muestra en la figura 8.
La población de células T CD4+ vírgenes se aisló a partir de PBMC aislando en primer lugar la población total de células T CD4+ utilizando el kit de aislamiento de células T CD4+ MACS (Miltenyi Biotech). Posteriormente, las células T CD4+ CD45RA+CD45RO- vírgenes se separaron de las células T de memoria mediante la aplicación de perlas anti-CD45RO-PE (Dako Cytomation) y anti-PE (Miltenyi Biotech). Se lograron niveles de pureza superiores al 98%, determinados por citometría de flujo.
Fenotipo: El fenotipo de las DC BDCA1+, las células BDCA1+ CD14+ y las MDSC se comparó mediante citometría de flujo. La población total de BDCA1+ y la población de monocitos se aislaron mediante MACS tal como se ha descrito anteriormente. Las células BDCA1+ CD14+ se diferenciaron de las DC BDCA1+ mediante marcaje con anti-CD14-PerCP (BD Biosciences). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para determinar el fenotipo: anti-CD1a-FITC, anti-CD33-APC, anti-CD206-PE (todos de BD Biosciences), anti-CD16-APC (Miltenyi Biotec) y anti-CD209-PE (Beckman Coulter).
Ensayo de captación: La capacidad de captación de antígeno de las DC BDCA1+, las células BDCA1+ CD14+ y los monocitos se determinó midiendo en qué medida pueden captar la albúmina de suero bovino (BSA) marcada con Alexa-488. Se cultivaron 100x103 células BDCA1+ (aisladas por MACS tal como se ha descrito anteriormente) o monocitos en medio X-VIVO 15 (Lonza) en presencia o ausencia de 1 mg/ml de BSA-Alexa-488 a 37 °C durante 5, 15, 30 o 60 minutos. Se realizaron cultivos similares a 4 °C para medir las lecturas de fondo resultantes de la unión espontánea de BSA. Después del periodo de cultivo, las células BDCA1+ se tiñeron con anti-CD14-PerCP, para discriminar las células BDCA1+ CD14+ de las DC BDCA1+. La captación de BSA-Alexa 488 por diferentes subconjuntos de células se midió mediante citometría de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences).
Activación de subconjunto celular: Después del aislamiento, los subconjuntos celulares se cultivaron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (50 x 103 células para la detección de citocinas y 10 x 103 para el cocultivo con células T) utilizando medio X-VIVO 15 suplementado con suero humano al 5% (HS, banco de sangre, Rivierenland). Estas células se dejaron sin estimular o se estimularon con GM-CSF, LPS o poli IC (todos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos) y se incubaron durante toda la noche a 37 °C. La expresión de moléculas coestimuladoras después de la activación se determinó usando anti-CD80-APC y anti-CD86-APC (ambos de BD Biosciences). La producción de citoquinas por estos subconjuntos se determinó midiendo IL-6, IL-12, TNF-a e IL-10 utilizando un ELISA de tipo sándwich estándar.
Reacción mixta de linfocitos (MLR): La capacidad de los subconjuntos para inducir la proliferación de células T y la producción de citoquinas se evaluó en una MLR. Se añadieron 10x103 células sin estimular o estimuladas (como anteriormente) a 100 x 103 linfocitos de sangre periférica (PBL) no adherentes alogénicos recién aislados de un donante sano. La producción de IFN-y e IL-10 por esas células T se determinó en sobrenadantes de 48 horas mediante un ELISA de tipo sándwich estándar. La proliferación se determinó mediante la incorporación de [3H]-timidina. La [3H]-timidina incorporada se midió después de 16 h mediante espectroscopia de centelleo líquido.
La capacidad de los subconjuntos para inducir la proliferación de células T CD4+ vírgenes se determinó cocultivando 10x103 células sin estimular o estimuladas (como anteriormente) con 50x103 células T CD4+ vírgenes alogénicas. Cuando se mencionó, se añadieron anticuerpos anti-PD-L1 (R&D Systems) o de control de isotipo. La proliferación de células T se determinó mediante la incorporación [3H]-timidina después de 3 a 4 días de cocultivo.
Ensayo supresor específico de KLH: Se aislaron DC BDCA1+, células BDCA1+ CD14+, monocitos y MDSC mediante FACS de pacientes con melanoma tal como se ha indicado anteriormente. Se cultivaron 20x103 células de cada subconjunto, por triplicado, durante toda la noche a 37 °C en X-VIVO con el 5% de HS. Mientras tanto, los monocitos extra se pulsaron por KLH durante toda la noche a 37 °C. La población autóloga de CD4+ también se aisló mediante el kit de aislamiento de células T CD4+ MACS (Miltenyi Biotech) y se mantuvo en X-VIVO con el 5% de HS a 4 °C. Al día siguiente, las células T CD4+ aisladas, que incluyen células T específicas de KLH, se estimularon con monocitos pulsados con KLH en presencia o ausencia de uno de los cuatro subconjuntos. La proliferación de células T se determinó mediante la incorporación de [3H]-timidina después de 24 a 48 horas de cocultivo.
Resultados
Un subconjunto mieloide único caracterizado por la coexpresión de CD1c (BDCA1) y CD14 está asociado con tumores
Para determinar si los tumores progresivos pueden influir en recuentos de DC BDCA1 en circulación, los porcentajes de esta población se evaluaron en sangre periférica de pacientes con melanoma en estadio III/IV y donantes sanos. Se observó una tendencia de menores porcentajes de DC BDCA1+ en pacientes con melanoma, aunque no fue significativa (figura 1A). Curiosamente, un subconjunto de población de BDCA1+ CD11c+ HLA-DRhi que coexpresa el marcador monocítico CD14 (para la estrategia de activación, véase también la figura 8) fue significativamente elevado en pacientes con melanoma en comparación con donantes sanos (figura 1A). El aumento observado de esta población de BDCA1+ CD14+ coincidió con un aumento significativo en los porcentajes de células supresoras derivadas de mieloides circulantes (MDSC), caracterizadas como CD14+ HLA-DRlow (para la estrategia de activación, véase también la figura 8). La presencia de la población de BDCA1+ CD14+ no está restringida a la circulación ya que esta población también se detectó en ascitis tumoral inflamatoria de pacientes con cáncer de ovario. De hecho, el material de ascitis mostró un contenido significativamente mayor de población de BDCA1+ CD14+ en comparación con DC BDCA1 (figura 1B).
Aunque la existencia de un subconjunto de DC CD14+ se ha descrito ampliamente en el compartimento dérmico de la piel, dicha población nunca se ha investigado en la sangre. Para determinar si esta población de BDCA1+ CD14+ es
en realidad otro subconjunto de DC mieloide, el fenotipo de esta población se analizó en comparación con DC BDCA1 y monocitos. Además de la alta expresión de CD11c y HLA-DR (no mostrados), típica de DC BDCA1 (línea azul, línea izquierda), la población de BDCA1 CD14+ (línea verde, línea media) también expresó el marcador monocítico CD11b en niveles más altos que DC BDCA1+ pero más bajos que los monocitos (línea naranja, línea derecha) (figura 1C). Además, la población de BDCA1+ CD14+ carecía de la expresión de CD16 que es característica de un subconjunto de monocitos y subconjunto CD16+ de DC mieloides. Las tres poblaciones compartían una alta expresión del marcador mieloide CD33 y una expresión casi nula de CD1 a, DC-SIGN y CD206 (receptor de manosa) (figura 1C). En conjunto, estos datos muestran claramente una nueva población celular que está asociada con tumores progresivos y muestra similitudes fenotípicas tanto con con DC BDCA1+ como con monocitos.
El análisis de micromatrices de anticuerpos y transcriptomas de células BDCA1 CD14+ revela una población distinta que está estrechamente relacionada con DC BDCA1
Dado que la población de BDCA1+ CD14+ comparte la expresión de marcadores específicos con monocitos y DC BDCA1+, se requirió un análisis adicional para determinar la singularidad de esta población y que no es simplemente una subpoblación de DC o de monocitos. Para abordar esta cuestión, los transcriptomas de células BDCA1 CD14+, DC BDCA1+, monocitos y MDSC aislados de la sangre de 3 donantes sanos se compararon mediante secuenciación de ARN. El agrupamiento jerárquico de las diferentes muestras utilizando los 5000 genes más altamente expresados representa claramente células BDCA1+ CD14+ como una población única. Aunque esta población comparte, en diversos grados, la expresión génica con los otros tres tipos celulares, la población de BDCA1+ CD14+ estaba más estrechamente relacionada con DC BDCA1+ que con otras poblaciones (figura 2A). Para obtener más información sobre el origen y el desarrollo de células BDCA1+ CD14+, los inventores evaluaron la expresión de factores de transcripción (figura 2B) y receptores de factores de crecimiento (figura 2C) que se describió que estaban involucrados en el desarrollo mieloide en ratones. Aunque la expresión de ARN de IRF4, BATF3 y FLT3, todos cruciales para el desarrollo de DC en ratones, fue más alta en DC BDCA1+ (barras azules, primeras desde la izquierda), las células BDCA1+ CD14+ (barras verdes, segundas desde la izquierda) tenían una mayor expresión en comparación con los monocitos (barras naranjas, terceras desde la izquierda) y MDSC (barras moradas, cuarta barra desde la izquierda). La expresión de ARN de IRF8, otro factor importante para el desarrollo de DC, fue uniforme en las cuatro poblaciones. De manera similar, la expresión de ARN de ZBTB46 y ZNF366 (DC-SCRIPT), ambos factores de transcripción que son específicos para el linaje de DC en ratones y seres humanos, fue más alta en DC BDCA1+, seguidas de células BDCA1+ CD14+. Además, del ARN largo no codificante LOC645638 (Inc-DC), que se reveló que se expresa específicamente en las DC24, fue expresado casi exclusivamente por DC BDCA1 . Por el contrario, las células BDCA1 CD14+, los monocitos y las MDSC tenían igualmente una expresión de ARN de MAFB, EGR1 y EGR2, todos factores de transcripción involucrados en la diferenciación de macrófagos en ratones, más alta que DC BDCA1+. Además, la expresión de ARN de CSF1R, también implicada en la diferenciación de macrófagos en ratones, fue la más alta en células BDCA1+ CD14+, mientras que otra población tenía niveles de expresión iguales. En conclusión, las células BDCA1+ CD14+ forman una población distinta con un perfil de expresión génica único.
Además del análisis de expresión de ARN, se estudió la expresión diferencial de proteínas de moléculas de CD, moléculas de HLA, quimiocinas y citocinas (tabla 1) en las tres poblaciones celulares utilizando micromatrices de anticuerpos (análisis Multiplex). El agrupamiento jerárquico de proteínas expresadas diferencialmente reveló un patrón similar a los datos de expresión de a Rn con agrupamiento de células BDCA1+ CD14+ más cerca de DC BDCA1 (figura 3). Por lo tanto, el análisis de proteínas respalda aún más la singularidad de la población de BDCA1+ CD14+.
Las células BDCA1+ CD14+ poseen características funcionales de DC
Aunque los análisis de ARN y proteínas insinúan una relación estrecha entre células BDCA1+ CD14+ y DC BDCA1+, las similitudes funcionales entre los dos subconjuntos deben determinarse como una prueba adicional de esta relación estrecha. Las DC, por definición, son células presentadoras de antígenos profesionales que pueden generar respuestas inmunitarias adaptativas mediante la activación de células T. Por lo tanto, los inventores evaluaron inicialmente la capacidad de células BDCA1+ CD14+ para captar antígenos del entorno circundante. Para ello, la captación de albúmina de suero bovino (BSA) marcada con fluorescencia por células BDCA1+ CD14+, DC BDCA1+ o monocitos se determinó mediante citometría de flujo tras la incubación durante diferentes periodos de tiempo a 37 °C. Para evitar cualquier fluorescencia resultante de la unión espontánea de BSA a las células, se tomaron controles de 4 °C para cada punto temporal y los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) medidos en estas muestras de 4 °C se restaron de los medidos en las muestras a 37 °C (AMFI). Tal como se muestra en la figura 4A, las células BDCA1+ CD14+ muestran una capacidad de captación de antígeno significativamente mayor reflejada en valores de AMFI más altos ya después de 15 minutos de incubación con BSA marcado con fluorescencia. Curiosamente, este ensayo de captación reveló que los monocitos son los mejores en este proceso, aunque las diferencias entre las células BDCA1+ CD14+ y los monocitos no fueron significativas (figura 4A, panel izquierdo).
Una característica importante de las DC es su capacidad para detectar señales de peligro y responder a dichas señales expresando moléculas coestimuladoras y secretando citoquinas, un proceso también conocido como maduración. Para determinar en qué medida las células BDCA1 CD14+ poseen esta cualidad, se determinó la expresión diferencial de moléculas coestimuladoras y la producción de citoquinas entre células BDCA1+ CD14+, DC BDCA1+ y monocitos después de la estimulación con GM-CSF, comúnmente utilizado en inmunoterapia contra el cáncer, LPS (ligando TLR4)
y pIC (ligando TLR3). Mientras que las DC BDCA1 respondieron tanto a LPS como a pIC, mediante la regulación al alza de las moléculas coestimuladoras CD86 y CD80, las células BDCA1 CD14+ reaccionaron a esta estimulación regulando al alza únicamente la expresión de CD80. Los monocitos, por otra parte, regularon al alza modestamente la expresión de CD80 solo en respuesta a LPS y de manera menos eficaz que las células BDCA1+ CD14+ y las DC BDCA1+ (figura 4B). Además, las tres poblaciones respondieron secretando un perfil de citoquinas. Mientras que las DC BDCA1+ se caracterizaron por secretar IL-12, de lo que carecían los otros dos subconjuntos, las células BDCA1 CD14+ produjeron cantidades significativamente más altas de TNF-a en comparación con DC BDCA1+ y monocitos (figura 4C). Tanto las células BDCA1+ CD14+ como los monocitos produjeron mayores cantidades de IL-6 que las DC BDCA1+. Las células BDCA1 CD14+ produjeron mayores cantidades de la citoquina inhibidora IL-10 (figura 4C).
Se especula mediante las diferencias observadas en la maduración sobre variaciones funcionales en la activación de las células T. Por lo tanto, la capacidad estimuladora de células T de células BDCA1+ CD14+, DC BDCA1 y monocitos se evaluaron en dos escenarios. El primer escenario es una reacción mixta de leucocitos (MLR), en la que cualquiera de estas poblaciones se usó para desencadenar la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL) alogénicos, que se determinó mediante la incorporación de timidina marcada con 3[H]. Tal como se anticipó a partir de los datos de maduración mencionados anteriormente, la capacidad de células BDCA1+ CD14+ (barras verdes, en el medio de las tres barras) para inducir la proliferación de PBL fue más alta que los monocitos (barras naranjas, derecha) y más baja que las DC BDCA1+ (barras azules, izquierda; figura 5A). Esta observación persiste tanto si las células BDCA1 CD14+ se estimularon por un ligando de TLR o no. La evaluación de los niveles de citocinas en los sobrenadantes de PBL estimulados reveló que los PBL inducidos por células BDCA1 CD14+ produjeron más IFN-y que los PBL inducidos por monocitos y menos que los PBL inducidos por DC BDCA1 , mientras que los PBL inducidos por cualquiera de los subconjuntos celulares produjeron IL-10 en niveles similares (figura 5A). Una alternativa más refinada para evaluar la capacidad estimuladora de células T de los diferentes subconjuntos es determinar en qué medida son capaces de inducir la proliferación de células T CD4+ alogénicas vírgenes. De forma similar al escenario de MLR, las células BDCA1+ CD14+ indujeron una mayor proliferación de células T CD4+ que los monocitos y menor que las DC BDCA1 (figura 5B).
En conjunto, las células BDCA1+ CD14+ están dotadas de características de DC tal como se demuestra mediante una alta capacidad de captación de antígenos, la capacidad de madurar en respuesta a la estimulación de TLR y la inducción de la proliferación de células T, aunque en menor medida en comparación con DC BDCA1 convencionales.
La población de BDCA1+ CD14+ se caracteriza por una expresión elevada de PD-L1 que amortigua su capacidad estimuladora de células T.
La señal coestimuladora II derivada de DC es vital para la activación de las células T. Además de las moléculas coestimuladoras, la señal II también puede estar mediada por moléculas co-inhibidoras expresadas por las DC y que dan lugar a respuestas atenuadas de células T. Entre estas moléculas co-inhibidoras se encuentran PD-L1 y PD-L2. Mientras que PD-L2 no se expresa en ninguno de los subconjuntos, con o sin estimulación (datos no mostrados), PD-L1 se expresa después de la ligación de TLR en todos los subconjuntos. Sin embargo, las células BDCA1+ CD14+ muestran niveles significativamente más altos de PD-L1 en comparación con DC BDCA1+ (figura 6A). Para evaluar el efecto de la expresión de PD-L1 sobre la capacidad estimuladora de células T de células BDCA1+ CD14+, las moléculas PD-L1 se bloquearon por medio de anticuerpos durante la activación de células T CD4+ vírgenes. De hecho, la neutralización de las moléculas de PD-L1 mejoró significativamente la proliferación de células T inducida por células BDCA1+ CD14+ (figura 6B). Por lo tanto, la alta expresión de PD-L1 por células BDCA1+ CD14+ está implicada en obstaculizar la funcionalidad de esta población celular.
La población de células BDCA1+ CD14+ se asocia con una menor respuesta hacia vacunas basadas en DC BDCA1+ en pacientes con melanoma
En un ensayo clínico, se utilizaron vacunas de DC BDCA1+ para tratar pacientes con melanoma. Las DC BDCA1 utilizadas en estas vacunas se aislaron de la sangre periférica de los pacientes mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Este procedimiento de aislamiento depende de la selección positiva de células que expresan BDCA1 después del empobrecimiento en linfocitos B. Así, la población de BDCA1 aislada incluye tanto Dc BDCA1+ como células BDCA1+ CD14+. El porcentaje de estas últimas varió entre el 6% y hasta el 45% del total del preparado vacunal. En base a esto, los pacientes que reciben vacuna de DC BDCA1+ se dividieron en dos grupos: un grupo que recibió vacunas con un contenido celular de BDCA1+ CD14+ inferior al 25% y un grupo que recibió vacunas con un contenido celular de BDCA1 CD14+ superior al 25%. Las células BDCA1 utilizadas en la vacuna se cargaron con los antígenos específicos de melanoma gp-100 y tirosinasa y con hemocianina de lapa californiana (KLH) como antígeno de control inmunogénico. Al comparar la respuesta inmunitaria hacia KLH entre los dos grupos, los pacientes que recibieron vacunas BDCA1+ con bajo contenido de células BDCA1+ CD14+ mostraron respuestas de células T específicas de KLH significativamente más altas en comparación con los pacientes que recibieron vacunas con más del 25% de células BDCA1+ CD14+ (figura 7A). Esta respuesta inmunitaria atenuada puede atribuirse a la débil capacidad estimuladora de células T de las células BDCA1+ CD14+ (figura 5). Sin embargo, una ruta alternativa para amortiguar las respuestas inmunitarias de las células T es mediante la supresión activa de estas respuestas de forma análoga a las MDSC. Para analizar esta hipótesis, se compararon las cualidades supresoras de células BDCA1 CD14+, MDSC, monocitos y DC BDCA1+. Mientras que ninguno de estos subconjuntos pudo suprimir la proliferación
inducida por aCD3/aCD28 de células T CD4+ autólogas cuando se aislaron de donantes sanos, solo las MDSC mostraron amortiguación de células T cuando estas células se aislaron de pacientes con melanoma (figura 7C). Sorprendentemente, cuando se estimularon células T CD4+ con monocitos cargados con KLH, solo las células BDCA1 CD14+ fueron capaces de suprimir la proliferación de células T CD4+ específicas de KLH. (figura 7B, panel superior). Curiosamente, esta supresión impuesta se suprime en presencia de oxaliplatino, un producto quimioterapéutico a base de platino (figura 7B, panel inferior). Así, BDCA1+ CD14+ solo son capaces de oprimir respuestas de las células T de manera específica de antígeno, lo que puede explicar las respuestas atenuadas de KLH en pacientes con melanoma que reciben vacunas DC BDCA1+ con alto contenido en células BDCA1+ CD14+.
La población de células BDCA1+ CD14+ se puede caracterizar por una estrategia de activación específica
Las células dendríticas de sangre periférica humana se caracterizan por un alto nivel de expresión de moléculas MHC de clase II (por ejemplo, HLA-DR) y la falta de expresión de los denominados marcadores de linaje, incluidos, por ejemplo, CD3 (para células T), CD14 (para monocitos), CD19 (para células B) y CD56 (para células NK). Dentro de las células HLA-DR+ Lin-, se incluye un subconjunto de DC CD1c+CD14- sanguíneas (figura 8). Las células Lin+ contienen células CD14+, que se pueden dividir según el nivel de su expresión de CD1c. CD1c+ corresponde a las células CD1c+CD14+ con la función supresora descrita anteriormente. Las células CD1c-CD14+ contienen dos subconjuntos más, que se pueden distinguir según su nivel de expresión de HLA-DR. El primero que expresa un alto nivel de HLA-DR corresponde a monocitos, mientras que el subconjunto de HLA-DRlow corresponde a MDSC (figura 8). De acuerdo con este hallazgo, las células CD1c+ enriquecidas expresan CD14 en un nivel diferente (figura 9). Las células CD1c+CD14high (figura 9, R3) expresan CD14 al mismo nivel que los monocitos CD14+ (figura 9, R4), lo que está de acuerdo con la estrategia de activación que se muestra en la figura 8. Dependiendo del brillo del conjugado de CD14-fluoróforo, se puede distinguir un subconjunto adicional de CD1c+ que expresa CD14 a un nivel intermedio entre DC CD1c+CD14- y células CD1c+CD14high. Estas células se pueden designar como CD1c+CD14low y se incluyen en la región R2 de la figura 9. Las células CD1c+CD14low y las células CD1c+CD14high juntas constituyen el subconjunto CD1c+CD14+ tal como se ha descrito anteriormente y se muestra en la figura 8. Las DC CD1c+CD14-se muestran en R1.
Tabla 1
Discusión
La evasión inmunitaria es el talón de Aquiles de las respuestas inmunitarias naturales y la inmunoterapia contra el cáncer. La habilidad de los tumores para escapar de la inmunidad se refleja en la plétora de mecanismos de protección que desarrollan. Se ha sugerido que los tumores interrumpen los circuitos de quimiocinas que son fundamentales para la atracción de células T. Además, la evidencia creciente indica que los tumores manipulan el endotelio vascular para formar una barrera física frente a las células T reactivas al tumor y para suprimir activamente estas células. Una vez que las células T logran transmigrar a través de la barrera endotelial, estas células T tienen que superar un estroma tumoral inmunosupresor hostil antes de encontrar células tumorales De hecho, los tumores reclutan y promueven la expansión de poblaciones de leucocitos inmunosupresores tales como células Treg, MDSC y macrófagos M2. En este estudio, los inventores introducen un nuevo miembro en la familia de leucocitos inmunosupresores; células BDCA1 CD14+. Aunque los inventores caracterizaron principalmente esta nueva población en sangre periférica, pudieron rastrear esta población en líquido de ascitis de pacientes con cáncer de ovario. De manera similar a las MDSC, esta población se encuentra significativamente elevada en la sangre periférica de pacientes con melanoma, lo que respalda la idea de que los tumores promueven la acumulación de elementos supresores en los tejidos periféricos. Una característica común entre MDSC y células BDCA1 CD14+ es la expresión de CD14, lo que puede implicar un origen conjunto. Sin embargo, estas dos poblaciones supresoras varían en el modo de supresión. Mientras que las MDSC suprimen universalmente la proliferación de células T transeúntes, las células BDCA1 CD14+ solo suprimen las células T de una manera específica de antígeno. Esta diferencia puede estar relacionada con los niveles de expresión de HLA-DR importantes para la presentación de antígenos a células T CD4+. Mientras que las MDSC son por definición HLA-DRlow, las células BDCA1+ CD14+ expresan HLA-DR a altos niveles equivalentes a la expresión por DC BDCA1+. De acuerdo con esto, Nagaraj y sus colaboradores encontraron que en un modelo especial de ratón con cáncer (MC38) se observó tolerancia de células T CD4+ y se atribuyó a un tipo especial de MDSC que expresan niveles sustanciales de MHC-II. Basándose en ello, las células BDCA1 CD14+ podrían clasificarse como un subconjunto MHC-IIhi de MDSC. Sin embargo, las grandes diferencias en los perfiles de expresión de ARN entre estos dos subconjuntos argumentan en contra de dicha clasificación de células BDCA1+ CD14+ como MDSC. El análisis del transcriptoma también reveló una posible relación entre células BDCA1+ CD14+ y macrófagos como se demuestra mediante la expresión de genes que son fundamentales para la diferenciación de macrófagos en ratones. Sin embargo, también se informó que CSF1R estaba altamente expresado por DC inflamatorias (infDC) tanto en ratones como en seres humanos. Además, el hecho de que los macrófagos sean, por definición, células residentes en tejidos, mientras que las células BDCA1+ CD14+ se encuentran tanto en circulación como en tejidos destaca otra discrepancia entre los dos subconjuntos de células y argumenta en contra de clasificarlas en el mismo grupo. Sin embargo, las similitudes potenciales entre células BDCA1 CD14+ y macrófagos instan a una mayor delimitación del vínculo entre ambos.
La expresión de CD14 no está restringida a los monocitos ya que las DC en determinados compartimentos o en determinadas condiciones expresan CD14. De hecho, la dermis humana en estado estacionario alberga un subconjunto CD14+ de DC dérmicas (DDC). De forma similar a la población de BDCA1+ CD14+, las DDC CD14+ expresan BDCA1, lo que permite su distinción de los macrófagos dérmicos. Esta similitud fenotípica entre estos dos subconjuntos se ve respaldada por cualidades funcionales superpuestas. En analogía con células BDCA1 CD14+, se demostró que las DDC CD14+ expresan niveles bajos de moléculas coestimuladoras, lo que los convierte en inductores deficientes de la proliferación de células T vírgenes. Además, las DDC CD14+ se han implicado en la inducción de tolerancia inmunitaria al promover el desarrollo de células Treg. Los rasgos compartidos entre células BDCA1+ CD14+ y DDC CD14+ sugieren intensamente un vínculo entre las dos poblaciones, una cuestión que requiere una mayor investigación. Además de DDC CD14+, la expresión de CD14 regulada al alza por DC también se observa después de su tratamiento con reactivos inmunomoduladores tales como vitamina D, dexametasona e IL-10. La característica común entre todas estas DC CD14+ es la baja expresión de moléculas coestimuladoras, la deficiente inducción de respuestas de células T y la promoción de tolerancia inmunitaria. Esto postula intensamente que la población de BDCA1+ CD14+ de la sangre puede ser de hecho un subconjunto de DC inhibidor circulante, una noción que está corroborada por el perfil de expresión de ARN cercano entre células BDCA1+ CD14+ y DC BDCA1+.
La maquinaria inmunosupresora asociada con el tumor funciona en parte a través de moléculas inmunoinhibidoras que mitigan las respuestas inmunitarias específicas del tumor mediante la ligación de sus receptores afines en las células inmunitarias, lo que las vuelve disfuncionales. Entre estas rutas inhibidoras, también denominadas puntos de control, se encuentra la vía PD-1/PD-L1. PD-1 es un miembro de la familia CD28 que se expresa en células T y B activadas y posee dos ligandos PD-L1 y PD-L2, que tienen una expresión variable en DC, macrófagos y células T. La activación de PD-1 por uno de sus ligandos durante la señalización del receptor de células T puede bloquear la proliferación de células T, la producción de citoquinas y la actividad citolítica y afectar a la supervivencia de las células T. Estos efectos inhibitorios se atribuyen al motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) y al motivo
de cambio basado en tirosina del inmunorreceptor (ITSM) dentro del dominio intracelular de PD-145. Los tumores pueden secuestrar los efectos inhibidores de la vía PD-L1/PD-1 para evadir las respuestas inmunitarias antitumorales. La expresión de PD-L1 se ha confirmado en muchos tumores, incluidos glioblastomas y melanomas, así como en cánceres de cabeza y cuello, pulmón, ovario, colon, estómago, riñón y mama. Se han asociado niveles altos de expresión de PD-L1 por células tumorales, linfocitos infiltrantes en el tumor o ambos con un comportamiento tumoral agresivo, mal pronóstico y riesgo elevado de mortalidad. Además, los inventores han descrito en el presente documento que la población de BDCA1+ CD14+ se caracteriza por una expresión elevada de PD-L1, que es parcialmente responsable de su deficiente capacidad estimuladora de células T. Por tanto, el punto de control PD-L1/PD-1 es una diana muy interesante para neutralizar la maquinaria inmunosupresora tumoral. De hecho, atacar esta vía mediante el bloqueo de anticuerpos contra PD-1 o PD-L1 no solo resultó tolerable, sino que mostró respuestas antitumorales duraderas en hasta el 28% de todos los pacientes tratados. Recientemente se notificó que otro mAb anti-PD-1 desarrollado por Merck (MK-3475) logra una tasa de respuesta clínica de hasta el 50% de los pacientes con melanoma avanzado tratado. Por lo tanto, los inhibidores de puntos de control tienen un futuro prometedor en la inmunoterapia contra el cáncer, especialmente cuando se combinan con otras formas de inmunoterapia tales como las vacunas DC.
En conjunto, los inventores han descubierto un nuevo subconjunto celular mediante el cual los tumores mantienen un estado sistémico de supresión inmunitaria, prohibiendo cualquier respuesta inmunitaria antitumoral activa. Las funciones inhibidoras de esta población de BDCA1+ CD14+ la convierte en una diana para la inmunoterapia contra el cáncer.
Figuras
Las figuras muestran:
Figura 1: Las DC BDCA1+CD14+ están asociadas con el cáncer.
Figura 1A. El porcentaje de células BDCA1+CD14+ está aumentado en pacientes con cáncer.
Figura 1B. Mayores porcentajes de BDCA1+CD14+ en ascitis por cáncer de ovario.
Figura 1C. Fenotipado de diferentes subconjuntos celulares.
Figura 2A. La población de BDCA1+ CD14+ es un subconjunto único, tal como se muestra en el análisis del transcriptoma.
Figura 2B. Expresión de factores de transcripción que se ha descrito que están involucrados en el desarrollo mieloide en ratones.
Figura 2C. Expresión de receptores de factores de crecimiento que se ha descrito que están involucrados en el desarrollo mieloide en ratones.
Figura 3. La población de BDCA1+ CD14+ es un subconjunto único, tal como se muestra en el análisis multiplex.
Figura 4: Las células BDCA1+CD14+ poseen características de DC.
Figura 4A. Las células BDCA1+CD14+ las células son muy eficaces en la captación de antígenos.
Figura 4B. Las células BDCA1+CD14+ regulan al alza la molécula coestimuladora CD80 tras la estimulación con ligandos TLR.
Figura 4C. Las células BDCA1+CD14+ poseen un perfil de citoquinas inflamatorias único.
Figura 5A. MLR
Figura 5B. Capacidad estimulante de células T vírgenes.
Figura 6: La actividad reducida de las células BDCA1+CD14+ está provocada por la expresión de PD-L1 y MERTK.
Figura 6A: Las DC BDCA1+CD14+ regulan al alza PD-L1 en respuesta a la estimulación de TLR.
Figura 6B: El bloqueo de PD-L1 mejora la capacidad estimuladora de células T de BDCA1+CD14+.
Figura 7: Las células BDCA1+CD14+ se asocian con una menor respuesta a la inmunoterapia contra el cáncer en pacientes con melanoma.
Figura 7A: Los porcentajes más altos de células BDCA1+CD14+ en la inmunoterapia con DC mieloides se correlacionan con respuestas más bajas en los pacientes.
Figura 7B: Las DC BDCA1+CD14+ suprimen la proliferación de células T CD4+ específicas de KLH.
Figura 7B: El oxaliplatino inhibe la capacidad supresora de DC BDCA1+CD14+.
Figura 7C: Las DC BDCA1+CD14+ no suprimen la proliferación de células T policlonales.
Figura 8: Una posible estrategia de clasificación.
Figura 9: Una composición de la invención es la población celular "enriquecida en BDCA-1". De acuerdo con la invención, la fracción de BDCAL CD14+ debe disminuirse a una cantidad inferior al 25% del total de células para obtener una población celular para su administración a un paciente que padece cáncer.
Claims (10)
- REIVINDICACIONESI .Una población celular para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente, que comprende células dendríticas CD1c+/CD19-, en la que una cantidad inferior o igual al 25% de las células dendríticas CD1c+/CD19- son CD1c+/CD19-/CD14+.
- 2. La población celular para su uso según la reivindicación 1, en la que la población celular además comprende, o consiste en, células que también son CD304+ (BDCA-4+).
- 3. La población celular para su uso según la reivindicación 1 o 2, en la que al menos el 50% de las células están cargadas con un antígeno tumoral o un péptido tumoral.
- 4. La población celular para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las células se purifican a partir de sangre, en particular de la sangre de un paciente que necesita un tratamiento contra el cáncer.
- 5. La población celular para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el cáncer es un cáncer sólido o un cáncer sanguíneo.
- 6. La población celular para su uso según la reivindicación 5, en la que el cáncer sanguíneo es leucemia mieloide crónica.
- 7. La población celular para su uso según la reivindicación 5, en la que el cáncer sólido es melanoma o cáncer de próstata.
- 8. Uso de un kit para producir una población celular definida por las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el kit - Un anticuerpo capaz de unirse a CD1c (BDCA-1),- Un anticuerpo capaz de unirse a un marcador expresado en monocitos,- Un anticuerpo capaz de unirse a un marcador expresado en linfocitos B, en particular CD19 o CD20, y, opcionalmente - Un anticuerpo capaz de unirse a células dendríticas plasmocitoides.
- 9. El uso según la reivindicación 8, en el que el marcador de monocitos se selecciona del grupo que consiste en CD14, CD11b y CCR5.
- 10. El uso según la reivindicación 8 o 9, en el que el marcador de células B se selecciona del grupo que consiste en CD19 y CD20.I I .El uso según la reivindicación 8 a 10, que además comprende un antígeno tumoral o un péptido tumoral.
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