ES2944889T3 - Variantes de alfa-galactosidasa humana - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados genéticamente y composiciones de los mismos. Los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados por ingeniería genética se han optimizado para proporcionar una estabilidad mejorada tanto en condiciones ácidas (pH <4,5) como básicas (pH >7). La invención también se refiere al uso de las composiciones que comprenden los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificada por ingeniería genética para fines terapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de alfa-galactosidasa humana

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención proporciona polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados y composiciones de los mismos. Los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana de ingeniería se han optimizado para proporcionar una estabilidad mejorada tanto en condiciones ácidas (pH <4,5) como básicas (pH >7). La invención también se refiere al uso de las composiciones que comprenden los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados para fines terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La alfa galactosidasa humana ("GLA"; EC 3.2.1.22) es una glicoproteína lisosomal responsable de hidrolizar las fracciones terminales de alfa galactosilo de glicolípidos y glicoproteínas. Actúa sobre muchos sustratos presentes en diversos tejidos humanos. La enfermedad de Fabry (también denominada angioqueratoma corporis diffusum, enfermedad de Anderson-Fabry, lipidosis distópica hereditaria, deficiencia de alfa-galactosidasa A, deficiencia de GLA y deficiencia de ceramida trihexosidasa) es un error congénito ligado al cromosoma X del catabolismo de glicoesfingolípidos que resulta de la actividad deficiente o ausente de la alfa-galactosidasa A. Los pacientes afectados por la enfermedad de Fabry acumulan globotriosilceramida (Gbs) y glicoesfingolípidos relacionados en el plasma y en los lisosomas celulares de los vasos sanguíneos, tejidos y órganos (Véase por ejemplo, Nance et al., Arch. Neurol., 63:453-457 [2006]). A medida que el paciente envejece, los vasos sanguíneos se estrechan progresivamente, debido a la acumulación de estos lípidos, lo que provoca una disminución del flujo sanguíneo y de la nutrición de los tejidos, especialmente en la piel, los riñones, el corazón, el cerebro y el sistema nervioso. Así pues, la enfermedad de Fabry es un trastorno sistémico que se manifiesta como insuficiencia renal, enfermedad cardiaca, enfermedad cerebrovascular, neuropatía periférica de fibras pequeñas y lesiones cutáneas, así como otros trastornos (Véase, por ejemplo, Schiffmann, Pharm. Ther., 122:65-77 [2009]). Los pacientes afectados presentan síntomas como dolor en manos y pies, grupos de pequeñas manchas de color rojo oscuro en la piel, disminución de la capacidad para sudar, opacidad corneal, problemas gastrointestinales, tinnitus y pérdida de audición. Entre las complicaciones potencialmente mortales figuran el daño renal progresivo, los infartos de miocardio y los accidentes cerebrovasculares. Se calcula que esta enfermedad afecta a 1 de cada 40.000-60.000 varones, pero también se da en mujeres. De hecho, las mujeres heterocigotas con enfermedad de Fabry experimentan importantes afecciones potencialmente mortales que requieren tratamiento médico, como anomalías del sistema nervioso, dolor crónico, fatiga, hipertensión, cardiopatías, insuficiencia renal e ictus (véase, por ejemplo, Want et al., Genet. Med., 13:457-484 [2011 ]). Los signos de la enfermedad de Fabry pueden aparecer en cualquier momento a partir de la infancia, y suelen empezar a manifestarse entre los 4 y los 8 años, aunque algunos pacientes presentan una enfermedad más leve y de aparición más tardía. El tratamiento suele ser de apoyo y no existe cura para la enfermedad de Fabry, por lo que sigue siendo necesario un tratamiento seguro y eficaz.

El documento US 2011/280856 se refiere a la producción de alfa galactosidasa A y métodos para purificarla; preparaciones de alfa galactosidasa A con carga alterada; preparaciones de alfa galactosidasa A que pueden tener una semivida circulante prolongada en un huésped mamífero; y posibles métodos y dosis para administrar una preparación de alfa galactosidasa A a un sujeto.

El documento US 5.356.804 se refiere a la producción de alfa galactosidasa A humana mediante la clonación y expresión de la secuencia codificante de la alfa galactosidasa A en sistemas de expresión de células huésped eucariotas.

El documento US 2012/328592 se refiere a la alfa galactosidasa estabilizada y sus usos. En particular, se refiere a estructuras proteicas multiméricas que comprenden al menos dos monómeros de alfa galactosidasa unidos covalentemente entre sí mediante una fracción de enlace.

El documento WO 2013/156552 se refiere a métodos para la producción de variantes de proteínas con una propensión a la agregación reducida sin afectar a la estabilidad termodinámica de la variante con respecto a la proteína de tipo salvaje.

RESUMEN

[0003] La presente invención proporciona una alfa galactosidasa A recombinante y/o un fragmento de alfa galactosidasa A recombinante biológicamente activo que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N°:5, donde dicha alfa galactosidasa A comprende una mutación en la posición 206, donde la posición se numera con referencia a SEQ ID N°:5.

[0004] La presente invención también proporciona una alfa galactosidasa A recombinante que comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID N°: 15, 13, 10, 18, 40, 42, 44, o 46.

[0005] La presente invención proporciona además una composición que comprende al menos una alfa galactosidasa A recombinante de la invención.

[0006] La presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica recombinante que codifica al menos una alfa galactosidasa A recombinante de la invención, opcionalmente en la que dicha secuencia polinucleotídica está optimizada en codones.

[0007] La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia polinucleotídica recombinante de la invención, opcionalmente en la que dicha secuencia polinucleotídica recombinante está operablemente unida a una secuencia de control, por ejemplo en la que dicha secuencia de control es un promotor, opcionalmente en la que dicho promotor es un promotor heterólogo.

[0008] La presente invención proporciona además una célula huésped que comprende el vector de expresión de la invención, opcionalmente en la que dicha célula huésped es eucariota.

[0009] La presente invención proporciona un método de producción de una variante de alfa galactosidasa A, que comprende el cultivo de la célula huésped de la invención, en condiciones en las que se produce dicha alfa galactosidasa A codificada por dicho polinucleótido recombinante.

[0010] La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición enzimática de la invención.

[0011] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de los síntomas de la enfermedad de Fabry en un sujeto.

[0012] La presente invención proporciona una composición de la invención para su uso como medicamento.

[0013] La presente invención proporciona un uso no terapéutico de la composición de la invención como suplemento nutricional.

Los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana de ingeniería se han optimizado para proporcionar una estabilidad mejorada tanto en condiciones ácidas (pH <4,5) como básicas (pH >7). La invención también se refiere a composiciones que comprenden los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados para su uso con fines terapéuticos.

[0014] La alfa galactosidasa A comprende al menos una mutación en al menos una posición como se proporciona en las Tablas 2.2, 2.4, y/o 2.5, i.e., al menos una mutación en la posición 206 (como se muestra en las Tablas 2.2, 2.3, 2.4 y/o 2.5) y en donde las posiciones se numeran con referencia a SEQ ID N°:5. La alfa galactosidasa A recombinante se deriva de una alfa galactosidasa A humana. En algunas otras formas de realización, la alfa galactosidasa A recombinante comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID N°: 15, 13, 10, o 18. En algunas formas de realización adicionales, la alfa galactosidasa A recombinante es más termoestable que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5. En algunas formas de realización adicionales, la alfa galactosidasa A recombinante es más estable a pH 7,4 que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5, mientras que en formas de realización adicionales, la alfa galactosidasa A recombinante es más estable a pH 4,3 que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5. En algunas formas de realización, la alfa galactosidasa A recombinante es más estable a pH 7,4 y pH 4,3 que la alfa galactosidasa A de la SEQ ID N°:5. En algunas formas de realización, la alfa galactosidasa A recombinante es una alfa galactosidasa A desinmunizada. En algunas formas de realización, la alfa galactosidasa A recombinante es una alfa galactosidasa A desinmunizada proporcionada en la Tabla 7.1, como se define en la reivindicación 4(d) de las reivindicaciones anexas. En algunas formas de realización adicionales, la alfa galactosidasa A recombinante se purifica. En algunas formas de realización, la alfa galactosidasa A recombinante presenta al menos una propiedad mejorada seleccionada de entre: i) actividad catalítica mejorada; ii) mayor tolerancia a pH 7,4; iii) mayor tolerancia a pH 4,3; o iv) inmunogenicidad reducida; o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), o iv), en comparación con una secuencia de referencia. En algunas formas de realización, la secuencia de referencia es SEQ ID N°:5, mientras que, en algunas formas de realización alternativas, la secuencia de referencia es SEQ ID N°: 10.

[0015] En algunas formas de realización, la secuencia polinucleotídica recombinante está optimizada para codones.

[0016] En algunas formas de realización, la secuencia polinucleotídica recombinante está operablemente unida a una secuencia de control. En algunas formas de realización adicionales, la secuencia de control es un promotor. En algunas otras formas de realización, el promotor es un promotor heterólogo. En algunas formas de realización, el vector de expresión comprende además una secuencia señal, tal como se proporciona en el presente documento.

[0017] La presente invención también proporciona células huésped que comprenden al menos un vector de expresión tal como se proporciona en el presente documento. En algunas formas de realización, la célula huésped es eucariota.

[0018] La presente invención también proporciona métodos de producción de una variante de alfa galactosidasa A, que comprenden el cultivo de una célula huésped proporcionada en el presente documento, en condiciones en las que se produce la alfa galactosidasa A codificada por el polinucleótido recombinante. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además el paso de recuperar la alfa galactosidasa A. En algunas formas de realización adicionales, los métodos comprenden además el paso de purificar la alfa galactosidasa A.

[0019] En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas. En algunas formas de realización adicionales, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, que comprenden una composición enzimática proporcionada en el presente documento. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden además un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización adicionales, la composición farmacéutica es adecuada para inyección parenteral o infusión a un humano.

[0020] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento y/o prevención de los síntomas de la enfermedad de Fabry en un sujeto. En algunas formas de realización, los síntomas de la enfermedad de Fabry mejoran en el sujeto. En algunas formas de realización adicionales, el sujeto al que se ha administrado la composición farmacéutica de la presente invención es capaz de seguir una dieta menos restringida en su contenido graso que las dietas requeridas por los sujetos que presentan los síntomas de la enfermedad de Fabry. En algunas formas de realización, el sujeto es un lactante o un niño, mientras que, en algunas formas de realización alternativas, el sujeto es un adulto o un adulto joven.

[0021] La presente invención también prevé el uso de las composiciones aquí proporcionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0022]

La figura 1 muestra la actividad relativa de diferentes construcciones de GLA en S. cerevisiae tras 2-5 días de cultivo. En la Figura 2 se presentan gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA tras la incubación a distintos pH.

En la Figura 3 se presentan gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA tras la incubación a distintas temperaturas.

La Figura 4 proporciona gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A&B) y relativa (Panel C&D) de las variantes de GLA tras la exposición con tampones que contienen cantidades crecientes de suero.

La Figura 5 muestra la actividad relativa de las variantes de GLA expresadas en células HEK₂93T.

La Figura 6 muestra la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA expresadas en células HEK293T, normalizadas para la actividad e incubadas a distintos pH.

En la Figura 7 se presentan gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA expresadas en células HEK293T, normalizadas para la actividad, e incubadas a diversas temperaturas. En la Figura 8 se muestran gráficos que muestran la actividad de la variante GLA restante tras la incubación en soluciones ácidas (Panel A) o básicas (Panel B).

La Figura 9 muestra un gráfico de la actividad de GLA recuperada en suero de rata tras la administración de variantes de GLA.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0023] Los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana de ingeniería se han optimizado para proporcionar una estabilidad mejorada tanto en condiciones ácidas (pH <4,5) como básicas (pH >7). La invención también se refiere a composiciones que comprenden los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados para su uso con fines terapéuticos.

[0024] En algunas formas de realización, los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana de ingeniería se han optimizado para proporcionar una estabilidad mejorada a varios niveles. La invención también se refiere a composiciones que comprenden los polipéptidos de alfa-galactosidasa humana modificados para su uso con fines terapéuticos.

[0025] Terapia de sustitución enzimática para el tratamiento de la enfermedad de Fabry (por ejemplo. Fabrazyme® agalsidasa beta; Genzyme) está disponible y se considera para individuos elegibles. Las terapias de sustitución enzimática utilizadas actualmente son formas expresadas recombinantemente del GLA humano de tipo salvaje. Se sabe que el GLA administrado por vía intravenosa circula, se endocitosta y viaja a los endosomas/lisosomas de los órganos diana, donde reduce la acumulación de Gb3. Estos fármacos no alivian por completo los síntomas del paciente, ya que el dolor neuropático y los ataques isquémicos transitorios siguen produciéndose a tasas reducidas. Además, la captación de GLA por la mayoría de los órganos diana es escasa en comparación con el hígado, y la enzima es inestable al pH de la sangre y los lisosomas. Por lo tanto, siguen existiendo problemas con los tratamientos disponibles. Además, los pacientes pueden desarrollar una respuesta inmunitaria (anticuerpos IgG e IgE dirigidos contra el fármaco administrado) y sufrir reacciones alérgicas graves (anafilácticas), reacciones graves a la infusión e incluso la muerte. La presente invención pretende proporcionar enzimas más estables adecuadas para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, pero con efectos secundarios reducidos y mejores resultados, en comparación con los tratamientos actualmente disponibles. De hecho, la presente invención pretende proporcionar enzimas GLA recombinantes que tengan una mayor estabilidad en sangre (pH 7,4), que la enzima encuentra al inyectarse en el torrente sanguíneo. Además, la enzima tiene una mayor estabilidad en el pH del lisosoma (pH 4,3), el lugar donde la enzima está activa durante la terapia. Así pues, se utilizó la evolución dirigida de GLA humana expresada recombinantemente en Saccharomyces cerevisiae, empleando el cribado de alto rendimiento de diversas bibliotecas de variantes enzimáticas, para proporcionar nuevas variantes de GLA con las propiedades de estabilidad deseadas. Además, se examinaron enzimas variantes y se determinó su secuencia de aminoácidos con el fin de identificar nuevas variantes de GLA con una inmunogenicidad reducida prevista. Al proporcionar variantes de GLA con mayor estabilidad de pH e inmunogenicidad reducida, la presente invención proporciona composiciones y métodos adecuados para su uso en pacientes aumentando la tolerancia del tratamiento por parte del paciente y proporcionando flexibilidad en la dosificación y formulación para mejorar los resultados del paciente.

Abreviaturas y Definiciones:

[0026] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen generalmente el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. En general, la nomenclatura empleada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, microbiología, bioquímica, química orgánica, química analítica y química de ácidos nucleicos que se describen a continuación son los conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Estas técnicas son bien conocidas y se describen en numerosos textos y obras de referencia bien conocidos por los expertos en la técnica. Para las síntesis químicas y los análisis químicos se utilizan técnicas estándar o sus modificaciones.

[0027] Aunque cualesquiera métodos y materiales adecuados similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden utilizarse en la práctica de la presente invención, en el presente documento se describen algunos métodos y materiales. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos, ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en que son utilizados por los expertos en la técnica. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se describen con más detalle haciendo referencia a la solicitud en su conjunto.

[0028] Asimismo, tal como se utilizan en el presente documento, los singulares "un/una" y "el/la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0029] Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. Por lo tanto, cada rango numérico divulgado aquí pretende abarcar cada rango numérico más estrecho que cae dentro de dicho rango numérico más amplio, como si dichos rangos numéricos más estrechos estuvieran todos expresamente escritos aquí. También se pretende que toda limitación numérica máxima (o mínima) aquí expuesta incluya toda limitación numérica inferior (o superior), como si dichas limitaciones numéricas inferiores (o superiores) estuvieran expresamente escritas en el presente documento.

[0030] El término "aproximadamente" significa un error aceptable para un valor particular. En algunos casos, "aproximadamente" significa dentro del 0,05%, 0,5%, 1,0% o 2,0% de un intervalo de valores determinado. En algunos casos, "aproximadamente" significa dentro de 1, 2, 3 o 4 desviaciones estándar de un valor dado.

[0031] Además, los epígrafes proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o formas de realización de la invención que pueden tenerse por referencia a la solicitud en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más detalladamente en relación con la solicitud en su conjunto. No obstante, para facilitar la comprensión de la invención, a continuación, se definen una serie de términos.

[0032] A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respectivamente.

[0033] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "que comprende" y sus equivalentes se emplean en su sentido inclusivo (i.e., equivalente al término "que incluye" y sus equivalentes correspondientes).

[0034] El número "EC" se refiere a la Nomenclatura Enzimática del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB). La clasificación bioquímica IUBMB es un sistema de clasificación numérica de las enzimas basado en las reacciones químicas que catalizan.

[0035] "ATCC" se refiere a la American Type Culture Collection cuya colección de biorrepositorios incluye genes y cepas.

[0036] "NCBI" se refiere al National Center for Biological Information y a las bases de datos de secuencias que contiene.

[0037] "Proteína", "polipéptido" y "péptido" se utilizan indistintamente en el presente documento para denotar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de su longitud o modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación).

[0038] En el presente documento se hace referencia a los "aminoácidos" por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden designarse por sus códigos comúnmente aceptados de una sola letra.

[0039] Los términos "manipulado", "recombinante", "de origen no natural" y "variante", cuando se utilizan con referencia a una célula, un polinucleótido o un polipéptido, se refieren a un material o a un material correspondiente a la forma natural o nativa del material que ha sido modificado de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es idéntico al mismo, pero producido o derivado de materiales sintéticos y/o mediante manipulación utilizando técnicas recombinantes.

[0040] Tal y como se utilizan aquí, "de tipo salvaje" y "de origen natural" se refieren a la forma que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos de tipo salvaje es una secuencia presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por la manipulación humana.

[0041] "Desinmunizado", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la manipulación de una secuencia proteica para crear una variante que se predice que no es tan inmunogénica como la proteína de tipo salvaje o de referencia. En algunas formas de realización, la desinmunización prevista es completa, en el sentido de que se prevé que la proteína variante no estimulará una respuesta inmunitaria en los pacientes a los que se administre la proteína variante. Esta respuesta puede medirse por diversos métodos, entre otros, la presencia o abundancia de anticuerpos antifármaco, la presencia o abundancia de anticuerpos neutralizantes, la presencia de una respuesta anafiláctica, la presentación del péptido en las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad-II (MHC-II), o la prevalencia o intensidad de la liberación de citocinas tras la administración de la proteína. En algunas formas de realización, la proteína variante es menos inmunogénica que la proteína de tipo salvaje o de referencia. En algunas formas de realización, la desinmunización implica modificaciones de subsecuencias de proteínas (por ejemplo, epítopos) que son reconocidas por receptores de antígenos leucocitarios humanos (HLA). En algunas formas de realización, estos epítopos se eliminan cambiando sus secuencias de aminoácidos para producir una proteína variante desinmunizada en la que dichas subsecuencias ya no son reconocidas por los receptores HLA. En algunas otras formas de realización, estos epítopos conservan afinidad de unión con los receptores HLA, pero no se presentan. En algunas formas de realización, la proteína desinmunizada muestra niveles inferiores de respuesta en predictores bioquímicos y celulares-biológicos de respuestas inmunológicas humanas, incluyendo ensayos de activación de células T dendríticas, o ensayos de unión a péptidos (HLA). En algunas formas de realización, estos epítopos se eliminan cambiando su secuencia de aminoácidos para producir una proteína variante desinmunizada en la que los epítopos ya no son reconocidos por los receptores de células T. En otras formas de realización, la proteína desinmunizada induce anergia en las células T correspondientes, activa las células reguladoras T o provoca la deleción clonal de las células B reconocidas.

[0042] "Secuencia codificante" se refiere a la parte de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína.

[0043] El término "porcentaje (%) de identidad de secuencia" se utiliza aquí para referirse a comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (i.e., huecos) en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos aparecen en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Alternativamente, el porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos aparecen en ambas secuencias o una base de ácido nucleico o residuo de aminoácido se alinea con un hueco para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los expertos en la técnica saben que existen muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]), por el algoritmo de alineación homológica de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970), por el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software GCG Wisconsin), o mediante inspección visual, como se conoce en la técnica. Algunos ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad y similitud de secuencias son, entre otros, los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, descritos por Altschul et al. (See, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]; y Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977], respectivamente). Los programas informáticos para realizar análisis BLAST están a disposición del público en el sitio web del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo consiste, en primer lugar, en identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen algún umbral de puntuación de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras del vecindario (véase Altschul et al, supra). Estas palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar la búsqueda de HSP más largas que las contengan. A continuación, las palabras coincidentes se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentar la puntuación acumulada del alineamiento. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada del alineamiento cae en la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Véase, Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]). Para determinar de forma ejemplar la alineación de secuencias y el % de identidad de secuencias se pueden emplear los programas BESTFIT o GAP del paquete de software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), utilizando los parámetros por defecto proporcionados.

[0044] "Secuencia de referencia" se refiere a una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, un segmento de un gen o secuencia polipeptídica de longitud completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 residuos de nucleótidos o aminoácidos de longitud, al menos 25 residuos de longitud, al menos 50 residuos de longitud, al menos 100 residuos de longitud o la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Dado que dos polinucleótidos o polipéptidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa) que es similar entre las dos secuencias, y (2) pueden además comprender una secuencia que es divergente entre las dos secuencias, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos o polipéptidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. En algunas formas de realización, una "secuencia de referencia" puede basarse en una secuencia primaria de aminoácidos, donde la secuencia de referencia es una secuencia que puede tener uno o más cambios en la secuencia primaria. "Ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos unas 20 posiciones contiguas de nucleótidos o residuos de aminoácidos en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos o aminoácidos contiguos y en el que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (i.e, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La ventana de comparación puede ser más larga que 20 residuos contiguos, e incluye, opcionalmente 30, 40, 50, 100, o ventanas más largas.

[0045] "Correspondiente a", "referencia a" o "relativo a" cuando se utiliza en el contexto de la numeración de una secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada se refiere a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia especificada cuando la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada se compara con la secuencia de referencia. En otras palabras, el número de residuo o la posición del residuo de un polímero dado se designa con respecto a la secuencia de referencia en lugar de por la posición numérica real del residuo dentro de la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos dada, como la de un GLA diseñado, puede alinearse con una secuencia de referencia introduciendo huecos para optimizar las coincidencias de residuos entre las dos secuencias. En estos casos, aunque los huecos estén presentes, la numeración del residuo en la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada se realiza con respecto a la secuencia de referencia con la que se ha alineado.

[0046] "Diferencia de aminoácidos" o "diferencia de residuos" se refiere a una diferencia en el residuo de aminoácido en una posición de una secuencia polipeptídica en relación con el residuo de aminoácido en una posición correspondiente en una secuencia de referencia. Las posiciones de las diferencias de aminoácidos generalmente se denominan aquí "Xn", donde n se refiere a la posición correspondiente en la secuencia de referencia en la que se basa la diferencia de residuos. Por ejemplo, una "diferencia de residuos en la posición X93 en comparación con SEQ ID N°:2" se refiere a una diferencia del residuo de aminoácido en la posición del polipéptido correspondiente a la posición 93 de SEQ ID N°:2. Así, si el polipéptido de referencia de SEQ ID N°:2 tiene una serina en la posición 93, entonces una "diferencia de residuos en la posición X93 en comparación con SEQ ID N°:2" una sustitución de aminoácidos de cualquier residuo distinto de la serina en la posición del polipéptido correspondiente a la posición 93 de SEQ ID N°:2. En la mayoría de los casos, la diferencia específica de residuos de aminoácidos en una posición se indica como "XnY", donde "Xn" especifica la posición correspondiente descrita anteriormente, e "Y" es el identificador de una sola letra del aminoácido que se encuentra en el polipéptido modificado (es decir, el residuo diferente al del polipéptido de referencia). En algunos casos (p. ej, en las Tablas 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 y 6.1), la presente divulgación también proporciona diferencias específicas de aminoácidos denotadas por la notación convencional "AnB", donde A es el identificador de una sola letra del residuo en la secuencia de referencia, "n" es el número de la posición del residuo en la secuencia de referencia, y B es el identificador de una sola letra de la sustitución del residuo en la secuencia del polipéptido manipulado. En algunos casos, un polipéptido de la presente divulgación puede incluir una o más diferencias de residuos de aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia, que se indica mediante una lista de las posiciones especificadas en las que están presentes las diferencias de residuos con respecto a la secuencia de referencia. En algunas formas de realización, cuando puede utilizarse más de un aminoácido en una posición de residuo específica de un polipéptido, los diversos residuos de aminoácidos que pueden utilizarse están separados por una "j" (porej., X307H/X307P o X307H/P). En algunas formas de realización, las variantes enzimáticas comprenden más de una sustitución. Estas sustituciones están separadas por una barra para facilitar la lectura (por ejemplo, C143NK₂₀6A). La presente solicitud incluye secuencias polipeptídicas manipuladas que comprenden una o más diferencias aminoacídicas que incluyen sustituciones aminoacídicas conservativas y no conservativas.

[0047] La "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un residuo por un residuo diferente que tenga una cadena lateral similar y, por lo tanto, normalmente implica la sustitución del aminoácido en el polipéptido por aminoácidos dentro de la misma clase definida de aminoácidos o una similar. A modo de ejemplo y no de limitación, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede sustituirse por otro aminoácido alifático (por ejemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina); un aminoácido con una cadena lateral hidroxílica se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral hidroxílica (por ejemplo, serina y treonina); un aminoácido con cadenas laterales aromáticas se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral aromática (por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina); un aminoácido con una cadena lateral básica se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral básica (por ejemplo, lisina y arginina); un aminoácido con una cadena lateral ácida se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral ácida (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico); y/o un aminoácido hidrófobo o hidrófilo se sustituye por otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente.

[0048] "Sustitución no conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido en el polipéptido por un aminoácido con propiedades de cadena lateral significativamente diferentes. Las sustituciones no conservadoras pueden utilizar aminoácidos entre los grupos definidos, en lugar de dentro de ellos, y afectan (a) a la estructura de la espina dorsal del péptido en la zona de la sustitución (por ejemplo, prolina por glicina) (b) a la carga o hidrofobicidad, o (c) a la mayor parte de la cadena lateral. A modo de ejemplo y no de limitación, una sustitución no conservativa ejemplar puede ser un aminoácido ácido sustituido por un aminoácido básico o alifático; un aminoácido aromático sustituido por un aminoácido pequeño; y un aminoácido hidrófilo sustituido por un aminoácido hidrófobo.

[0049] "Deleción" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las deleciones pueden comprender la eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos, hasta el 10% del número total de aminoácidos, o hasta el 20% del número total de aminoácidos que componen la enzima de referencia, conservando la actividad enzimática y/o conservando las propiedades mejoradas de una enzima modificada. Las deleciones pueden dirigirse a las porciones internas y/o a las porciones terminales del polipéptido. En diversas formas de realización, la deleción puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinua.

[0050] "Inserción" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las inserciones pueden ser en las porciones internas del polipéptido, o en el extremo carboxi o amino. Las inserciones utilizadas en el presente documento incluyen proteínas de fusión conocidas en la técnica. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separado por uno o más de los aminoácidos del polipéptido natural.

[0051] Un "fragmento funcional" o un "fragmento biológicamente activo" utilizado indistintamente en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una o varias deleciones aminoterminales y/o carboxiterminales y/o deleciones internas, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia con la que se está comparando (por ejemplo, un GLA de ingeniería de longitud completa de la presente invención) y que conserva sustancialmente toda la actividad del polipéptido de longitud completa.

[0052] "Polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está sustancialmente separado de otros contaminantes que lo acompañan naturalmente, por ejemplo, proteínas, lípidos y polinucleótidos. El término abarca polipéptidos que han sido extraídos o purificados de su entorno natural o sistema de expresión (por ejemplo, célula huésped o síntesis in vitro). Los polipéptidos GLA recombinantes pueden estar presentes dentro de una célula, presentes en el medio celular, o preparados de diversas formas, como lisados o preparaciones aisladas. Como tal, en algunas formas de realización, los polipéptidos GLA recombinantes pueden ser un polipéptido aislado.

[0053] "Polipéptido sustancialmente puro" se refiere a una composición en la que la especie polipeptídica es la especie predominante presente (i.e., en una base molar o de peso es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y generalmente es una composición sustancialmente purificada cuando la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento de las especies macromoleculares presentes por mol o % de peso. Generalmente, una composición de GLA sustancialmente pura comprende aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 95% o más, y aproximadamente 98% o más de todas las especies macromoleculares por mol o % en peso presentes en la composición. En algunas formas de realización, la especie objeto se purifica hasta alcanzar una homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. Las especies de disolventes, las moléculas pequeñas (<500 Daltons) y las especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares. En algunas formas de realización, los polipéptidos GLA recombinantes aislados son composiciones polipeptídicas sustancialmente puras.

[0054] "Propiedad enzimática mejorada" se refiere a un polipéptido GLA modificado que presenta una mejora en cualquier propiedad enzimática en comparación con un polipéptido GLA de referencia y/o como un polipéptido GLA de tipo salvaje u otro polipéptido GLA modificado. Las propiedades mejoradas incluyen, entre otras, las siguientes: mayor expresión de la proteína, mayor termoactividad, mayor termoestabilidad, mayor actividad en pH, mayor estabilidad, mayor actividad enzimática, mayor especificidad o afinidad del sustrato, mayor actividad específica, mayor resistencia a la inhibición del sustrato o del producto final, mayor estabilidad química, mayor quimioselectividad, mayor estabilidad del disolvente, mayor tolerancia al pH ácido o básico, mayor tolerancia a la actividad proteolítica (es decir, menor sensibilidad a la proteólisis) y perfil de temperatura alterado, sensibilidad reducida a la proteólisis), agregación reducida, solubilidad aumentada, inmunogenicidad reducida, modificación postraduccional mejorada (por ejemplo, glicosilación) y perfil de temperatura alterado.

[0055] "Actividad enzimática aumentada" o "actividad catalítica mejorada" se refiere a una propiedad mejorada de los polipéptidos GLA de ingeniería, que puede representarse por un aumento de la actividad específica (p. ej., producto producido/tiempo/peso de proteína) o un aumento del porcentaje de conversión del sustrato en producto (p. ej., porcentaje de conversión de la cantidad inicial de sustrato en producto en un periodo de tiempo especificado utilizando una cantidad especificada de GLA) en comparación con la enzima GLA de referencia. En los Ejemplos se proporcionan métodos ejemplares para determinar la actividad enzimática. Cualquier propiedad relacionada con la actividad enzimática puede verse afectada, incluidas las propiedades enzimáticas clásicas de K^m, V^max o k^cat, cuyos cambios pueden conducir a un aumento de la actividad enzimática. Las mejoras en la actividad enzimática pueden ser desde aproximadamente 1,1 veces la actividad enzimática de la correspondiente enzima de tipo salvaje, hasta tanto como 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces o más actividad enzimática que la GLA natural u otra GLA de ingeniería de la que se derivaron los polipéptidos GLA.

[0056] En algunas formas de realización, los polipéptidos GLA modificados tienen un k^cat de al menos 0,1/s, al menos 0,5/s, al menos 1,0/s, al menos 5,0/s, al menos 10,0/s y En algunas formas de realización preferidas superior a 10,0/s. En algunas formas de realización, la K^m está en el intervalo de aproximadamente 1μM a aproximadamente 5mM; en el intervalo de aproximadamente 5 μM a aproximadamente 2mM; en el intervalo de aproximadamente 10 μM a aproximadamente 2mM; o en el intervalo de aproximadamente 10μM a aproximadamente 1mM. En algunas formas de realización específicas, la enzima GLA modificada presenta una actividad enzimática mejorada tras la exposición a ciertas condiciones en un rango de 1,5 a 10 veces, 1,5 a 25 veces, 1,5 a 50 veces, 1,5 a 100 veces o mayor que la de una enzima GLA de referencia (por ejemplo, una GLA de tipo salvaje o cualquier otra GLA de referencia). La actividad GLA puede medirse por cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, ensayos estándar, como la monitorización de los cambios en las propiedades espectrofotométricas de los reactivos o productos). En algunas formas de realización, la cantidad de productos producidos puede medirse mediante separación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) combinada con absorbancia UV o detección fluorescente directa o posterior a la derivatización con o-ftaldialdehído (OPA). Las comparaciones de las actividades enzimáticas se realizan utilizando una preparación definida de enzima, un ensayo definido en unas condiciones establecidas y uno o más sustratos definidos, como se describe con más detalle en el presente documento. Generalmente, cuando se comparan lisados, se determina el número de células y la cantidad de proteína ensayada, así como el uso de sistemas de expresión idénticos y células huésped idénticas para minimizar las variaciones en la cantidad de enzima producida por las células huésped y presente en los lisados.

[0057] El término "tolerancia mejorada al pH ácido" significa que una GLA recombinante según la invención tendrá una mayor estabilidad (mayor actividad retenida a aproximadamente pH 4,8 tras la exposición a pH ácido durante un periodo de tiempo especificado (1 hora, hasta 24 horas)) en comparación con una GLA de referencia u otra enzima.

[0058] Por "pH fisiológico", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende el intervalo de pH que se encuentra generalmente en la sangre de un sujeto (por ejemplo, un ser humano).

[0059] El término "pH básico" (p. ej., utilizado con referencia a la estabilidad mejorada a condiciones de pH básico o tolerancia aumentada a pH básico) significa un intervalo de pH de aproximadamente 7 a 11.

[0060] El término "pH ácido" (p. ej., utilizado con referencia a la estabilidad mejorada a condiciones de pH ácido o tolerancia aumentada a pH ácido) significa un intervalo de pH de aproximadamente 1,5 a 4,5.

[0061] "Conversión" se refiere a la conversión enzimática (o biotransformación) de un sustrato(s) al producto(s) correspondiente(s). "Porcentaje de conversión" se refiere al porcentaje del sustrato que se convierte en el producto dentro de un período de tiempo en condiciones especificadas. Así, la "actividad enzimática" o "actividad" de un polipéptido GLA puede expresarse como "porcentaje de conversión" del sustrato en el producto en un periodo de tiempo específico.

[0062] "Astringencia de hibridación" se refiere a las condiciones de hibridación, como las condiciones de lavado, en la hibridación de ácidos nucleicos. Generalmente, las reacciones de hibridación se realizan en condiciones de baja astringencia, seguidas de lavados de rigurosidad variable pero más alta. El término "hibridación moderadamente astringente" se refiere a condiciones que permiten que el ADN diana se una a un ácido nucleico complementario que tiene aproximadamente un 60% de identidad, preferiblemente aproximadamente un 75% de identidad, aproximadamente un 85% de identidad con el ADN diana, con más de aproximadamente un 90% de identidad con el polinucleótido diana. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes son las condiciones equivalentes a la hibridación en formamida al 50%, solución de Denhart 5x, 5xSSPE, 0,2% SDS a 42°C, seguida de lavado en 02xSSPE, 0,2% SDS, a 42°C. "Hibridación de alta astringencia" se refiere generalmente a condiciones que están a unos 10°C o menos de la temperatura de fusión térmica T^m determinada bajo la condición de solución para una secuencia polinucleotídica definida. En algunas formas de realización, una condición de alta astringencia se refiere a condiciones que permiten la hibridación de sólo aquellas secuencias de ácido nucleico que forman híbridos estables en NaCl 0,018M a 65°C (es decir, si un híbrido no es estable en NaCl 0,018M a 65°C, no será estable en condiciones de alta astringencia, como se contempla en el presente documento). Se pueden proporcionar condiciones de alta astringencia, por ejemplo, hibridando en condiciones equivalentes a 50% de formamida, 5x solución de Denhart, 5xSSPE, 0,2% SDS a 42°C, seguido de lavado en 0,1xSSPE y 0,1% SDS a 65°C. Otra condición de alta astringencia es la hibridación en condiciones equivalentes a la hibridación en 5X SSC conteniendo 0,1% (p:v) SDS a 65°C y lavado en 0,1x SSC conteniendo 0,1% SDS a 65°C. En las referencias citadas anteriormente se describen otras condiciones de hibridación de alta astringencia, así como condiciones moderadamente astringentes.

[0063] "Optimizado a codón" se refiere a cambios en los codones del polinucleótido que codifica una proteína a aquellos preferentemente utilizados en un organismo particular, de tal manera que la proteína codificada se exprese más eficientemente en el organismo de interés. Aunque el código genético es degenerado en el sentido de que la mayoría de los aminoácidos están representados por varios codones, denominados "sinónimos", es bien sabido que el uso de codones por determinados organismos no es aleatorio y está sesgado hacia determinados tripletes de codones. Este sesgo en el uso de codones puede ser mayor en referencia a un gen determinado, genes de función común u origen ancestral, proteínas altamente expresadas frente a proteínas de bajo número de copias y las regiones de codificación de proteínas agregadas del genoma de un organismo. En algunas formas de realización, los polinucleótidos que codifican las enzimas GLA pueden estar optimizados en codones para una producción óptima a partir del organismo huésped seleccionado para la expresión.

[0064] "Secuencia de control" se refiere aquí para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido de la presente solicitud. Cada secuencia de control puede ser nativa o ajena a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Dichas secuencias de control incluyen, entre otras, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptidos, una secuencia promotora, una secuencia de péptidos señal, una secuencia de iniciación y una secuencia de terminación de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traslacional. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido.

[0065] "Operablemente enlazado" se define aquí como una configuración en la que una secuencia de control está colocada apropiadamente (i.e., en una relación funcional) en una posición relativa a un polinucleótido de interés de tal manera que la secuencia de control dirige o regula la expresión del polinucleótido y/o polipéptido de interés.

[0066] "Secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido de interés, como una secuencia codificante. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional, que median la expresión de un polinucleótido de interés. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped elegida, incluidos promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifiquen polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.

[0067] "Condiciones de reacción adecuadas" se refiere a aquellas condiciones en la solución de reacción de conversión enzimática (p. ej., intervalos de carga de enzima, carga de sustrato, temperatura, pH, tampones, co-solventes, etc.) en las que un polipéptido GLA de la presente solicitud es capaz de convertir un sustrato en el compuesto de producto deseado. "Carga", como en "carga de compuestos" o "carga de enzimas" se refiere a la concentración o cantidad de un componente en una mezcla de reacción al inicio de la reacción. "Sustrato" en el contexto de un proceso de reacción de conversión enzimática se refiere al compuesto o molécula sobre el que actúa el polipéptido GLA. "Producto" en el contexto de un proceso de conversión enzimática se refiere al compuesto o molécula resultante de la acción del polipéptido GLA sobre un sustrato.

[0068] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "cultivo" se refiere al crecimiento de una población de células microbianas en cualquier condición adecuada (por ejemplo, utilizando un medio líquido, gelatinoso o sólido).

[0069] Los polipéptidos recombinantes pueden producirse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los genes que codifican el polipéptido de tipo salvaje de interés pueden clonarse en vectores, como plásmidos, y expresarse en huéspedes deseados, como E. coli, S. cerevisiae, etc. Las variantes de polipéptidos recombinantes pueden generarse por diversos métodos conocidos en la técnica. De hecho, existe una amplia variedad de técnicas de mutagénesis bien conocidas por los expertos en la técnica. Además, muchos proveedores comerciales de biología molecular ofrecen kits de mutagénesis. Existen métodos para realizar sustituciones específicas en aminoácidos definidos (site-directed), mutaciones específicas o aleatorias en una región localizada del gen (regio-specific), o mutagénesis aleatoria en todo el gen (por ejemplo, mutagénesis de saturación). Los expertos en la técnica conocen numerosos métodos adecuados para generar variantes enzimáticas, que incluyen, entre otros, la mutagénesis dirigida al sitio de ADN monocatenario o bicatenario mediante PCR, la mutagénesis en casete, la síntesis de genes, la PCR propensa a errores, el barajado y la mutagénesis por saturación química, o cualquier otro método adecuado conocido en la técnica. En las siguientes patentes se ofrecen ejemplos no limitativos de métodos utilizados para la ingeniería de ADN y proteínas: Pat. de EE.UU. n26.117.679; Pat. de EE.UU. n26.420.175; Pat. de EE.UU. n26.376.246; Pat. de EE.UU. n26.586.182; Pat. de EE.UU. n27.747.391; Pat. de EE.UU. n27.747.393; Pat. de EE.UU. n27.783.428; y Pat. de EE.UU. N28.383.346. Una vez producidas las variantes, se puede comprobar si tienen las propiedades deseadas (por ejemplo, actividad alta o aumentada, o actividad baja o reducida, actividad térmica aumentada, estabilidad térmica aumentada y/o estabilidad a pH ácido, etc.). En algunas formas de realización, se utilizan "polipéptidos GLA recombinantes" (también denominados en el presente documento "polipéptidos GLA de ingeniería", "enzimas GLA variantes" y "variantes GLA").

[0070] Tal como se utiliza en el presente documento, un "vector" es una construcción de ADN para introducir una secuencia de ADN en una célula. En algunas formas de realización, el vector es un vector de expresión que está enlazado operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión en un huésped adecuado del polipéptido codificado en la secuencia de ADN. En algunas formas de realización, un "vector de expresión" tiene una secuencia promotora unida de forma operativa a la secuencia de ADN (por ejemplo, el transgén) para impulsar la expresión en una célula huésped y, en algunas formas de realización, también comprende una secuencia terminadora de la transcripción.

[0071] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido, incluyendo, entre otros, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción y la modificación postraduccional. En algunas formas de realización, el término también abarca la secreción del polipéptido a partir de una célula.

[0072] Como se usa aquí, el término "produce" se refiere a la producción de proteínas y/u otros compuestos por las células. Se pretende que el término abarque cualquier paso implicado en la producción de polipéptidos, incluyendo, pero sin limitarse a, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción y la modificación postraduccional. En algunas formas de realización, el término también abarca la secreción del polipéptido a partir de una célula.

[0073] Tal como se utiliza en el presente documento, una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos (por ej., una secuencia promotora, un péptido señal, una secuencia terminadora, etc.) es "heteróloga" con respecto a otra secuencia con la que está vinculada de forma operable si las dos secuencias no están asociadas en la naturaleza.

[0074] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "célula huésped" y "cepa huésped" se refieren a hospedadores adecuados para los vectores de expresión que comprenden el ADN proporcionado en el presente documento (p. ej., los polinucleótidos que codifican las variantes de GLA). En algunas formas de realización, las células huésped son células procariotas o eucariotas que han sido transformadas o transfectadas con vectores construidos mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica.

[0075] El término "análogo" significa un polipéptido que tiene más del 70% de identidad de secuencia, pero menos del 100% de identidad de secuencia (por ejemplo, más del 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia) con un polipéptido de referencia. En algunas formas de realización, por análogos se entiende polipéptidos que contienen uno o más residuos de aminoácidos no naturales, incluidos, entre otros, homoarginina, ornitina y norvalina, así como aminoácidos naturales. En algunas formas de realización, los análogos también incluyen uno o más residuos de aminoácidos D y enlaces no peptídicos entre dos o más residuos de aminoácidos.

[0076] El término "terapéutico" se refiere a un compuesto administrado a un sujeto que muestra signos o síntomas de patología que tiene efectos médicos beneficiosos o deseables.

[0077] El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto mamífero (p. ej., humano) que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un polipéptido GLA modificado incluido en la invención y un portador aceptable.

[0078] El término "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para producir el resultado deseado. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad efectiva mediante experimentación rutinaria.

[0079] Los términos "aislado" y "purificado" se utilizan para referirse a una molécula (por ejemplo, un ácido nucleico aislado, un polipéptido, etc.) u otro componente que se separa de al menos otro componente con el que está asociado de forma natural. El término "purificado" no exige una pureza absoluta, sino una definición relativa.

[0080] El término "sujeto" abarca mamíferos como los seres humanos, los primates no humanos, el ganado, los animales de compañía y los animales de laboratorio (por ejemplo, roedores y lagamorfos). Se pretende que el término englobe tanto a mujeres como a hombres.

[0081] Como se usa aquí, el término "paciente" significa cualquier sujeto que está siendo evaluado, tratado o que está experimentando una enfermedad.

[0082] El término "lactante" se refiere a un niño en el período comprendido entre el primer mes después del nacimiento y aproximadamente un (1) año de edad. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "recién nacido" se refiere al niño en el periodo comprendido entre el nacimiento y el 28° día de vida. El término "lactante prematuro" se refiere a un lactante nacido después de la vigésima semana completa de gestación, pero antes de llegar a término, y que generalmente pesa entre ~500 y ~2499 gramos al nacer. Un "lactante de muy bajo peso al nacer" es un lactante que pesa menos de 1500 g al nacer.

[0083] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "niño" se refiere a una persona que no ha alcanzado la edad legal para consentir tratamientos o procedimientos de investigación. En algunas formas de realización, el término se refiere a una persona entre el momento del nacimiento y la adolescencia.

[0084] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "adulto" se refiere a una persona que ha alcanzado la edad legal para la jurisdicción pertinente (por ejemplo, 18 años de edad en los Estados Unidos). En algunas formas de realización, el término se refiere a cualquier organismo maduro completamente desarrollado. En algunas formas de realización, el término "adulto joven" se refiere a una persona menor de 18 años, pero que ha alcanzado la madurez sexual.

[0085] Tal como se utilizan en el presente documento, "composición" y "formulación" engloban productos que comprenden al menos un GLA modificado de la presente invención, destinados a cualquier uso adecuado (por ejemplo, composiciones farmacéuticas, suplementos dietéticos/nutricionales, piensos, etc.).

[0086] Los términos "administración" y "administrar" una composición significan proporcionar una composición de la presente invención a un sujeto (por ejemplo, a una persona que sufre los efectos de la enfermedad de Fabry).

[0087] El término "portador" cuando se usa en referencia a una composición farmacéutica significa cualquiera de los portadores, tampones y excipientes farmacéuticos estándar, como estabilizadores, conservantes y adyuvantes.

[0088] El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que puede administrarse a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera deletérea con cualquiera de los componentes que lo contienen y que posee la actividad biológica deseada.

[0089] Como se usa aquí, el término "excipiente" se refiere a cualquier aditivo, portador, diluyente, adyuvante u otro ingrediente farmacéuticamente aceptable, que no sea el ingrediente farmacéutico activo (API; por ejemplo, los polipéptidos GLA diseñados de la presente invención). Los excipientes suelen incluirse con fines de formulación y/o administración.

[0090] El término "cantidad terapéuticamente eficaz" cuando se usa en referencia a síntomas de enfermedad/condición se refiere a la cantidad y/o concentración de un compuesto (por ejemplo, polipéptidos GLA diseñados) que mejora, atenúa o elimina uno o más síntomas de una enfermedad/condición o previene o retrasa la aparición de síntoma(s).

[0091] El término "cantidad terapéuticamente eficaz" cuando se usa en referencia a una enfermedad/condición se refiere a la cantidad y/o concentración de una composición (por ejemplo, polipéptidos GLA manipulados) que mejora, atenúa o elimina la enfermedad/condición. En algunas formas de realización, el término se utiliza en referencia a la cantidad de una composición que provoca la respuesta biológica (por ejemplo, médica) de un tejido, sistema o animal que busca el investigador, médico, veterinario u otro clínico.

[0092] Se pretende que los términos "en tratamiento", "tratar" y "tratamiento" abarquen el tratamiento preventivo (por ejemplo, profiláctico), así como el paliativo.

Expresión y Actividad de GLA Mediante Ingeniería:

[0093] Se utilizaron dos estrategias para la expresión de GLA secretado, utilizando el péptido señal MFa de levadura (MF-SP) o una secuencia líder más larga de 83 aminoácidos (MF-líder) para impulsar la secreción de un GLA humano maduro optimizado en codones de levadura. Los clones se expresaron a partir de un vector pYT-72 en la cepa INVSc 1 de S. cerevisiae. Ambos enfoques proporcionaron sobrenadantes con actividad medible en el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil a-D-galactopiranósido (4-MuGal). Sin embargo, la construcción con el péptido señal MFa de levadura proporcionó actividades 3 veces superiores y se utilizó como secuencia de partida para la evolución dirigida.

[0094] Para identificar la diversidad mutacional, se construyeron una biblioteca combinatoria "homóloga" conservada de 13 posiciones y una biblioteca de mutagénesis de saturación de sitios de 192 posiciones. Se analizaron volúmenes equivalentes de sobrenadante en una condición sin exposición (sin incubación, pH 4,8) o tras una incubación de una hora en un entorno de pH bajo (3,9-4,2) o alto (7,1- 8,2). Las variantes de GLA con mayor actividad debida a una mayor expresión de GLA o a una actividad específica de GLA se identificaron en función de su mejora en pliegues con respecto al GLA parental. Las variantes de GLA con mayor estabilidad se identificaron dividiendo la mejora de pliegues observada en condiciones de exposición por la mejora de pliegues observada en condiciones sin exposición. Este enfoque reduce el sesgo hacia la selección de variantes basadas en una mayor expresión, pero sin cambios en la actividad específica a pH extremos. Las puntuaciones compuestas de actividad (el producto de las mejoras de pliegues para las tres condiciones) y estabilidad (el producto de las puntuaciones de estabilidad) se utilizaron para clasificar las mutaciones en variantes mejoradas para su inclusión en bibliotecas GLA posteriores.

GLA de Ingeniería:

[0095] En algunas formas de realización, el polipéptido GLA diseñado es un polipéptido listado en la Tabla 2.2, 2.4, 2.5, o Tabla 7.1, donde el polipéptido GLA se selecciona de cualquiera de las SEQ ID N°: 10, 13, 18, 21, 24, 40, 42, 44, 46, 119-121,236-431,433-435, 437-442, 444-453, 455-478, 480-498, 500-510, 512-550, 552-649, 651-687, 689-733.

[0096] En algunas formas de realización, el polipéptido GLA modificado es un polipéptido enumerado en la Tabla 2.3.

[0097] En algunas formas de realización, el polipéptido GLA modificado se selecciona de SEQ ID N°:15, 13, 10 y 18.

[0098] En algunas formas de realización, el polipéptido GLA modificado comprende un fragmento funcional de un polipéptido GLA modificado comprendido en la invención. Los fragmentos funcionales pueden tener al menos el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad del polipéptido GLA modificado del que deriva (es decir, el GLA modificado original). Un fragmento funcional comprende al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e incluso el 99% de la secuencia original del GLA modificado. En algunas formas de realización, el fragmento funcional está truncado en menos de 5, menos de 10, menos de 15, menos de 10, menos de 25, menos de 30 o menos de 35aminoácidos.

Polinucleótidos que Codifican Polipéptidos de Ingeniería, Vectores de Expresión y Células Huésped:

[0099] La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos GLA modificados descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, los polinucleótidos están unidos operativamente a una o más secuencias reguladoras heterólogas que controlan la expresión génica para crear un polinucleótido recombinante capaz de expresar el polipéptido. Las construcciones de expresión que contienen un polinucleótido heterólogo que codifica los polipéptidos GLA modificados pueden introducirse en células huésped apropiadas para expresar el polipéptido GLA correspondiente.

[0100] Como será evidente para el artesano experto, la disponibilidad de una secuencia proteica y el conocimiento de los codones correspondientes a los diversos aminoácidos proporcionan una descripción de todos los polinucleótidos capaces de codificar los polipéptidos en cuestión. La degeneración del código genético, en el que los mismos aminoácidos están codificados por codones alternativos o sinónimos, permite fabricar un número extremadamente grande de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican el polipéptido GLA diseñado. Así, conociendo una secuencia de aminoácidos concreta, los expertos en la técnica podrían fabricar cualquier número de ácidos nucleicos diferentes simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de forma que no cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína. A este respecto, la presente invención contempla específicamente todas y cada una de las posibles variaciones de polinucleótidos que podrían realizarse codificando los polipéptidos descritos en el presente documento mediante la selección de combinaciones basadas en las posibles elecciones de codones, y todas estas variaciones deben considerarse específicamente divulgadas para cualquier polipéptido descrito en el presente documento, incluidas las variantes proporcionadas en las Tablas 2.2, 2.3, 2.4 y 2.5, en las que la variante tiene una secuencia polipeptídica seleccionada de cualquiera de las SEQ ID N°: 10, 13, 18, 21, 24, 119-121 y 236-400.

[0101] En varias formas de realización, los codones se seleccionan preferentemente para adaptarse a la célula huésped en la que se produce la proteína. Por ejemplo, los codones preferidos utilizados en bacterias se utilizan para la expresión en bacterias. En consecuencia, los polinucleótidos de codones optimizados que codifican los polipéptidos GLA diseñados contienen codones preferidos en aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más del 90% de las posiciones de codones de la región codificante de longitud completa.

[0102] En algunas formas de realización, el polinucleótido que codifica los polipéptidos GLA modificados comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de una secuencia polinucleotídica que codifica SEQ ID N°:10, 13, 15, 18, 21, y 24. En algunas formas de realización, el polinucleótido que codifica los polipéptidos GLA modificados comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de SEQ ID N°: 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 19, 20, 22, y 23.

[0103] En algunas formas de realización, un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de los polipéptidos GLA de ingeniería proporcionados en el presente documento se manipula de diversas maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. En algunas formas de realización, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos se proporcionan como vectores de expresión en los que están presentes una o más secuencias de control para regular la expresión de los polinucleótidos y/o polipéptidos. La manipulación del polinucleótido aislado antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos y secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

[0104] En algunas formas de realización, las secuencias de control incluyen, entre otras secuencias, promotores, secuencias líderes, secuencias de poliadenilación, secuencias de propéptidos, secuencias de péptidos señal y terminadores de transcripción. Como se sabe en la técnica, los promotores adecuados pueden seleccionarse en función de las células huésped utilizadas. Entre los promotores ejemplares para células huéspedes de hongos filamentosos, se incluyen promotores obtenidos a partir de los genes de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Aspergillus niger alfa-amilasa neutra, Aspergillus niger alfa-amilasa estable al ácido, Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamilasa (glaA), Rhizomucor miehei lipasa, Aspergillus oryzae proteasa alcalina, Aspergillus oryzae triosa fosfato isomerasa, Aspergillus nidulans acetamidasa y Fusarium oxysporum proteasa similar a la tripsina (Véase, por ejemplo.g., WO 96/00787 ), así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes de la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae ), y sus promotores mutantes, truncados e híbridos. Los promotores ejemplares de células de levadura pueden ser de los genes de Saccharomyces cerevisiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactoquinasa (GAL1), Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH₂/GAP), y Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato quinasa. En la técnica se conocen otros promotores útiles para las células huésped de levadura (véase, por ejemplo, Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]). Los promotores ejemplares para su uso en células de mamíferos incluyen, entre otros, los del citomegalovirus (CMV), del virus vacuolador simio 40 (SV40), de la fosforglicerato quinasa de Homo sapiens, de la beta actina, del factor de elongación-1 a o de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, o de la p-actina de Gallus gallus.

[0105] En algunas formas de realización, la secuencia de control es una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operablemente unida al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped elegida puede utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, pueden obtenerse terminadores de transcripción ejemplares para células huéspedes fúngicas filamentosas a partir de los genes de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nidulans antranilato sintasa, Aspergillus niger alfa-glucosidasa y Fusarium oxysporum proteasa similar a la tripsina. Pueden obtenerse terminadores ejemplares para células huésped de levadura a partir de los genes de la enolasa de Sac charomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. En la técnica se conocen otros terminadores útiles para células huésped de levadura (véase, por ejemplo, Romanos et al., supra). Los terminadores ejemplares para células de mamíferos incluyen, entre otros, los del citomegalovirus (CMV), del virus vacuolador simio 40 (SV40) o de la hormona del crecimiento de Homo sapiens.

[0106] En algunas formas de realización, la secuencia de control es una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operablemente unida al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Puede utilizarse cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped elegida. Se obtienen líderes ejemplares para células huésped de hongos filamentosos a partir de los genes de Aspergillus oryzae TAKA amilasa y Aspergillus nidulans triosa fosfato isomerasa. Los líderes adecuados para las células huésped de levadura incluyen, entre otros, los obtenidos a partir de los genes de Saccharomyces cere visiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfogliceratoquinasa, Saccharomyces cerevisiae alfa-factor y Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH₂/GAP).

[0107] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operablemente unida al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. En la presente invención puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped elegida. Las secuencias de poliadenilación ejemplares para células huéspedes de hongos filamentosos incluyen, entre otras, las de los genes de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nidulans antranilato sintasa, Fusarium oxysporum tripsinaproteasa y Aspergillus niger alfa-glucosidasa. También se conocen en la técnica secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura (véase, por ejemplo, Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]).

[0108] En algunas formas de realización, la secuencia de control es una región codificante de péptido señal que codifica una secuencia de aminoácidos unida al amino terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico puede contener inherentemente una región codificante de péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal ajeno a la secuencia codificante. Cualquier región codificante de péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de una célula huésped de elección encuentra uso para la expresión de los polipéptidos GLA de ingeniería aquí proporcionados. Las regiones codificantes de péptidos señal eficaces para células huéspedes fúngicas filamentosas incluyen, entre otras, las regiones codificantes de péptidos señal obtenidas a partir de los genes de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger amilasa neutra, Aspergillus niger glucoamilasa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Humicola insolens celulasa y Humicola lanuginosa lipasa. Los péptidos señal útiles para las células huésped de levadura incluyen, entre otros, los de los genes del factor alfa de Saccharomyces cere visiae y de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Los péptidos señal útiles para las células huésped de mamíferos incluyen, entre otros, los de los genes de la inmunoglobulina gamma (IgG).

[0109] En algunas formas de realización, la secuencia de control es una región codificante de un propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos situada en el extremo amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se denomina "proenzima", "propolipéptido" o "zimógeno" en algunos casos). Un propolipéptido puede convertirse en un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido.

[0110] En otro aspecto, la presente invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido GLA manipulado, y una o más regiones reguladoras de la expresión tales como un promotor y un terminador, un origen de replicación, etc., dependiendo del tipo de hospedador en el que se introduzcan, En algunas formas de realización, las diversas secuencias de ácido nucleico y de control descritas anteriormente se unen para producir un vector de expresión recombinante que incluye uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido GLA en dichos sitios. Alternativamente, la(s) secuencia(s) polinucleotídica(s) de la presente invención se expresan insertando la secuencia polinucleotídica o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia polinucleotídica en un vector apropiado para su expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté enlazada operablemente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0111] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (porej., un plásmido o virus), que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda dar lugar a la expresión de la secuencia polinucleotídica GLA variante. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

[0112] En algunas formas de realización, el vector de expresión es un vector de replicación autónoma (i.e., un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, como un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial). El vector puede contener cualquier medio que garantice la autorreplicación. En algunas formas de realización alternativas, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

[0113] En algunas formas de realización, el vector de expresión contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables, que permiten una fácil selección de las células transformadas. Un "marcador seleccionable" es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofia frente a auxótrofos y similares. Los marcadores adecuados para las células huésped de levadura incluyen, entre otros, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, entre otros, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasas), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como sus equivalentes. En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido GLA modificado de la presente solicitud, estando el polinucleótido unido operativamente a una o más secuencias de control para la expresión de la(s) enzima(s) GLA modificada(s) en la célula huésped. Las células huésped para expresar los polipéptidos codificados por los vectores de expresión de la presente invención son bien conocidas en la técnica e incluyen, entre otras, células fúngicas, como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris [por ejemplo, ATCC Accession No. 201178]); células de insecto (por ejemplo, células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9), células vegetales, células animales (por ejemplo, CHO, COS y BHK) y células humanas (por ejemplo, HEK₂93T, fibroblastos humanos, líneas celulares de melanoma THP-1, Jurkat y Bowes).

[0114] Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir los polipéptidos GLA modificados por ingeniería, donde los métodos comprenden cultivar una célula huésped capaz de expresar un polinucleótido que codifica el polipéptido GLA modificado por ingeniería en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además los pasos de aislar y/o purificar los polipéptidos GLA, como se describe en el presente documento.

[0115] Los medios de cultivo y las condiciones de crecimiento apropiados para las células huésped descritas anteriormente son bien conocidos en la técnica. Los polinucleótidos para la expresión de los polipéptidos GLA pueden introducirse en las células por diversos métodos conocidos en la técnica. Las técnicas incluyen, entre otras, la electroporación, el bombardeo biolístico de partículas, la transfección mediada por liposomas, la transfección por cloruro cálcico y la fusión de protoplastos.

[0116] El GLA modificado con las propiedades aquí descritas puede obtenerse sometiendo el polinucleótido que codifica el polipéptido GLA natural o modificado a métodos de mutagénesis y/o evolución dirigida conocidos en la técnica, y como se describe aquí. Una técnica ejemplar de evolución dirigida es la mutagénesis y/o la mezcla de ADN (véase, por ejemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 y Patente de EE. UU. 6,537,746 Otros procedimientos de evolución dirigida que pueden utilizarse son, entre otros, el proceso de extensión escalonada (StEP), la recombinación in vitro (véase, por ejemplo, Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]), la PCR mutagénica (véase, por ejemplo, Caldwell et al., ^pC^r Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]) y la mutagénesis en casete (véase, por ejemplo, Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]).

[0117] Por ejemplo, los métodos de mutagénesis y evolución dirigida pueden aplicarse fácilmente a polinucleótidos para generar bibliotecas de variantes que puedan expresarse, examinarse y ensayarse. Los métodos de mutagénesis y evolución dirigida son bien conocidos en la técnica (véanse, por ej., las patentes de EE.UU. N°. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 5,837,458, 5,928,905, 6,096,548, 6,117,679, 6,132,970, 6,165,793, 6,180,406, 6,251,674, 6,277,638, 6,287,861, 6,287,862, 6,291,242, 6,297,053, 6,303,344, 6,309,883, 6,319,713, 6,319,714, 6,323,030, 6,326,204, 6,335,160, 6,335,198, 6,344,356, 6,352,859, 6,355,484, 6,358,740, 6,358,742, 6,365,377, 6,365,408, 6,368,861, 6,372,497, 6,376,246, 6,379,964, 6,387,702, 6,391,552, 6,391,640, 6,395,547, 6,406,855, 6,406,910, 6,413,745, 6,413,774, 6,420,175, 6,423,542, 6,426,224, 6,436,675, 6,444,468, 6,455,253, 6,479,652, 6,482,647, 6,489,146, 6,506,602, 6,506,603, 6,519,065, 6,521,453, 6,528,311, 6,537,746, 6,573,098, 6,576,467, 6,579,678, 6,586,182, 6,602,986, 6,613,514, 6,653,072, 6,716,631, 6,946,296, 6,961,664, 6,995,017, 7,024,312, 7,058,515, 7,105,297, 7,148,054, 7,288,375, 7,421,347, 7,430,477, 7,534,564, 7,620,500, 7,620,502, 7,629,170, 7,702,464, 7,747,391, 7,747,393, 7,751,986, 7,776,598, 7,783,428, 7,795,030, 7,853,410, 7.868.138, 7.873.499, 7.904.249, 7.957.912, 8.383.346, 8.504.498, 8.849.575, 8.876.066, 8.768.871, y todos sus homólogos no estadounidenses; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; Pat. de EE.UU. Publ. Solic. N₂.2008/0220990, US2009/0312196, US2014/0005057, US2014/0214391, US2014/0221216; US2015/0050658, US2015/0133307, US2015/0134315 y todos sus homólogos no estadounidenses; WO 95/22625, WO 97/0078, WO 97/35966, WO 98/27230, WO 00/42651, WO 01/75767, y WO 2009/152336).

[0118] En algunas formas de realización, las variantes enzimáticas obtenidas tras el tratamiento de mutagénesis se examinan sometiendo las variantes enzimáticas a una temperatura definida (u otras condiciones de ensayo) y midiendo la cantidad de actividad enzimática restante tras los tratamientos térmicos u otras condiciones de ensayo. El ADN que contiene el polinucleótido que codifica el polipéptido GLA se aísla entonces de la célula huésped, se secuencia para identificar los cambios en la secuencia de nucleótidos (si los hay) y se utiliza para expresar la enzima en una célula huésped diferente o en la misma. La medición de la actividad enzimática a partir de las bibliotecas de expresión puede realizarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, técnicas bioquímicas estándar, como el análisis por HPLC).

[0119] Para polipéptidos de ingeniería de secuencia conocida, los polinucleótidos que codifican la enzima pueden prepararse por métodos estándar en fase sólida, según métodos sintéticos conocidos. En algunas formas de realización, pueden sintetizarse individualmente fragmentos de hasta unas 100 bases, y luego unirse (por ejemplo, mediante métodos de litigación enzimática o química, o métodos mediados por polimerasa) para formar cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos y oligonucleótidos aquí divulgados pueden prepararse mediante síntesis química utilizando el método clásico de la fosforamidita (Véase, por ejemplo, Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859-69 [1981]; y Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]), tal y como se practica habitualmente en los métodos sintéticos automatizados. Según el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan (por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN), se purifican, se recuecen, se ligan y se clonan en vectores apropiados.

[0120] Por consiguiente, En algunas formas de realización, un método para preparar el polipéptido GLA diseñado puede comprender: (a) sintetizar un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos de cualquier variante proporcionada en las Tablas 2.2, 2.3, 2.4, y/o 2.5, donde la variante en las Tablas 2.2, 2.3, 2.4 y 2.5 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID N₂: 10, 13, 18, 21, 24, 119-121 y 236-400, así como SEQ ID N₂:10, 13, 15, 18, 21, y/o 24, y (b) expresar el polipéptido GLA codificado por el polinucleótido. La secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido puede tener opcionalmente una o varias (por ejemplo, hasta 3, 4, 5 o hasta 10) deleciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede tener opcionalmente 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1­ 15, 1 -20, 1-21, 1 -22, 1 -23, 1 -24, 1 -25, 1 -30, o 1 -35 deleciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos tiene opcionalmente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30 o 35 deleciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos tiene opcionalmente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21,22, 23, 24, o 25 deleciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. En algunas formas de realización, las sustituciones pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.

[0121] El polipéptido GLA modificado expresado puede evaluarse para cualquier propiedad mejorada deseada (p. ej., actividad, selectividad, estabilidad, tolerancia a los ácidos, sensibilidad a las proteasas, etc.), utilizando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a los ensayos y condiciones descritos en el presente documento.

[0122] En algunas formas de realización, cualquiera de los polipéptidos GLA modificados expresados en una célula huésped se recupera de las células y/o del medio de cultivo utilizando una o más de las técnicas bien conocidas para la purificación de proteínas, incluyendo, entre otras, el tratamiento con lisozima, la sonicación, la filtración, la eliminación de sales, la ultracentrifugación y la cromatografía.

[0123] Las técnicas cromatográficas para el aislamiento de los polipéptidos GLA incluyen, entre otras, cromatografía de fase inversa cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel y cromatografía de afinidad. Las condiciones para purificar una enzima concreta dependen, en parte, de factores como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilia, el peso molecular, la forma molecular, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. En algunas formas de realización, pueden utilizarse técnicas de afinidad para aislar las variantes mejoradas de las enzimas GLA. En algunas formas de realización que utilizan la purificación por cromatografía de afinidad, se puede utilizar cualquier anticuerpo que se una específicamente a la variante del polipéptido GLA. En algunas formas de realización que utilizan la purificación por cromatografía de afinidad, se utilizan proteínas que se unen a los glicanos unidos covalentemente a GLA. En otras formas de realización que utilizan purificaciones por cromatografía de afinidad, se puede utilizar cualquier molécula pequeña que se una al sitio activo de GLA. Para la producción de anticuerpos, se inmunizan diversos animales huéspedes, incluidos, entre otros, conejos, ratones, ratas, etc., mediante inyección con un polipéptido GLA (por ejemplo, una variante de GLA), o un fragmento del mismo. En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento GLA se une a un portador adecuado, como BSA, mediante un grupo funcional de cadena lateral o enlazadores unidos a un grupo funcional de cadena lateral.

[0124] En algunas formas de realización, el polipéptido GLA modificado se produce en una célula huésped mediante un método que comprende el cultivo de una célula huésped (por ejemplo, S. cerevisiae, Daucus carota, Nicotiana tabacum, H. sapiens (por ejemplo, HEK₂93T), o Cricetulus griseus (por ejemplo, CHO)) que comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido GLA modificado según se describe en el presente documento en condiciones propicias para la producción del polipéptido GLA modificado y la recuperación del polipéptido GLA modificado a partir de las células y/o el medio de cultivo.

[0125] En algunas formas de realización, una vez que los polipéptidos GLA modificados se recuperan de las células huésped recombinantes o del medio de cultivo celular, se purifican adicionalmente mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas formas de realización adicionales, los polipéptidos GLA purificados se combinan con otros ingredientes y compuestos para proporcionar composiciones y formulaciones que comprenden el polipéptido GLA diseñado, según sea apropiado para diferentes aplicaciones y usos (por ejemplo, composiciones farmacéuticas). En algunas formas de realización adicionales, los polipéptidos GLA purificados o los polipéptidos GLA formulados se liofilizan.

Composiciones:

[0126] La presente invención proporciona varias composiciones y formatos, incluyendo pero no limitándose a los descritos a continuación. En algunas formas de realización, la presente invención proporciona polipéptidos GLA manipulados adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas y de otro tipo, como suplementos dietéticos/nutricionales.

[0127] Dependiendo del modo de administración, estas composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un GLA modificado según la invención se presentan en forma sólida, semisólida o líquida. En algunas formas de realización, las composiciones incluyen otros componentes farmacéuticamente aceptables como diluyentes, tampones, excipientes, sales, emulsionantes, conservantes, estabilizantes, cargas y otros ingredientes. Los detalles sobre las técnicas de formulación y administración son bien conocidos en la técnica y se describen en la bibliografía.

[0128] En algunas formas de realización, los polipéptidos GLA manipulados se formulan para su uso en composiciones farmacéuticas. Cualquier formato adecuado para la administración de los polipéptidos GLA modificados puede usarse en la presente invención, incluyendo, entre otros, píldoras, comprimidos, comprimidos de gel, cápsulas, pastillas para chupar, grageas, polvos, geles blandos, sol-geles, geles, emulsiones, implantes, parches, aerosoles, pomadas, linimentos, cremas, pastas, gelatinas, pinturas, aerosoles, gomas de mascar, demulcentes, barritas, soluciones, suspensiones (incluidas, entre otras, las suspensiones a base de aceite, las emulsiones de aceite en agua, etc.), suspensiones, jarabes, formulaciones de liberación controlada, supositorios, etc. En algunas formas de realización, los polipéptidos GLA modificados se suministran en un formato adecuado para inyección o infusión (es decir, en una formulación inyectable). En algunas formas de realización, los polipéptidos GLA manipulados se proporcionan en matrices biocompatibles como solgeles, incluidos solgeles a base de sílice (por ejemplo, oxisilano). En algunas formas de realización, los polipéptidos GLA manipulados están encapsulados. En algunas formas de realización alternativas, los polipéptidos GLA manipulados se encapsulan en nanoestructuras (por ejemplo, nanotubos, nanotúbulos, nanocápsulas o microcápsulas, microesferas, liposomas, etc.). De hecho, no se pretende que la presente invención se limite a ninguna formulación de administración y/o medio de administración en particular. Se pretende que los polipéptidos GLA modificados se administren por cualquier medio adecuado conocido en la técnica, incluidos, entre otros, parenteral, oral, tópico, transdérmico, intranasal, intraocular, intratecal, mediante implantes, etc.

[0129] Los polipéptidos GLA manipulados pueden modificarse químicamente mediante glicosilación, reactivos químicos de reticulación, pegilación (i.e., modificados con polietilenglicol [PEG] o PEG activado, etc.) u otros compuestos (véase, p. ej., Ikeda, Amino Acids 29:283-287 [2005]; Pat. de EE.UU. N₂. 7.531.341, 7.534.595, 7.560.263 y 7.53.653; Pat. de EE.UU. Publ. N° N°. 2013/0039898, 2012/0177722, etc.). De hecho, no se pretende que la presente invención se limite a ningún método y/o mecanismo de administración en particular.

[0130] En algunas formas de realización adicionales, los polipéptidos GLA manipulados se proporcionan en formulaciones que comprenden cristales enzimáticos estabilizados en matriz. En algunas formas de realización, la formulación comprende una enzima GLA de ingeniería cristalina reticulada y un polímero con una fracción reactiva que se adhiere a los cristales de la enzima. La presente invención también proporciona polipéptidos GLA de ingeniería en polímeros.

[0131] En algunas formas de realización, las composiciones que comprenden los polipéptidos GLA modificados de la presente invención incluyen uno o más compuestos portadores comúnmente usados, incluyendo pero no limitados a azúcares (p. ej., lactosa, sacarosa, manitol y/o sorbitol), almidones (p. ej., maíz, trigo, arroz, patata u otro almidón vegetal), celulosa (p. ej., metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica), gomas (p. ej., arábiga, tragacanto, guar, etc.) y/o proteínas (p. ej., gelatina, colágeno, etc.).

[0132] En algunas formas de realización, la presente invención proporciona polipéptidos GLA de ingeniería adecuados para su uso en la disminución de la concentración de glicolípidos en fluidos tales como sangre, líquido cefalorraquídeo, etc. La dosis de polipéptido(s) GLA modificado(s) administrado(s) depende de la afección o enfermedad, del estado general del sujeto y de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. En algunas formas de realización, las composiciones están destinadas a administraciones únicas o múltiples. En algunas formas de realización, se contempla que la concentración de polipéptido(s) GLA modificado(s) en la(s) composición(es) administrada(s) a un humano con enfermedad de Fabry es suficiente para tratar y/o mejorar eficazmente la enfermedad (por ejemplo, la enfermedad de Fabry). Los polipéptidos GLA modificados pueden administrarse en combinación con otras composiciones farmacéuticas y/o dietéticas.

EXPERIMENTAL

[0133] Los siguientes Ejemplos, incluidos los experimentos y resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos de la presente invención.

[0134] En la divulgación experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: ppm (partes por millón); M (molar); mM (milimolar), uM y gM (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); gm y g (gramo); mg (miligramos); ug y gg (microgramos); L y l (litro); ml y mL (mililitro); cm (centímetros); mm (milímetros); um y gm (micrómetros); seg. (segundos); min(s) (minuto(s)); h(s) y hr(s) (hora(s)); U (unidades); MW (peso molecular); rpm (rotaciones por minuto); °C (grados centígrados); CDS (secuencia codificante); ADN (ácido desoxirribonucleico); ARN (ácido ribonucleico); E. coli W3110 (cepa de E. col i utilizada habitualmente en laboratorio, disponible en la página web de la Comisión Europea). coli, disponible en el Coli Genetic Stock Center [CGSC], New Haven, CT); HPLC (cromatografía líquida de alta presión); MWCO (corte de peso molecular); SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico); PES (polietersulfona); CFSE (carboxifluoresceína succinimidiléster); IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido); PMBS (sulfato de polimixina B); NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato); GIDH (glutamato deshidrogenasa); FIOPC (mejoras en pliegues con respecto al control positivo); PBMC (células mononucleares de sangre periférica); LB (caldo Luria); MeOH (metanol); Athens Research (Athens Research Technology, Athens, GA); ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Ram Scientific (Ram Scientific, Inc, Yonkers, NY); Pall Corp. (Pall, Corp., Pt. Washington, NY); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Dispositivos Moleculares (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basilea, Suiza); Axygen (Axygen, Inc., Union City, CA); Toronto Research Chemicals (Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, Ontario, Canadá); Cambridge Isotope Laboratories, (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, parte de Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (parte de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Irlanda); Enzo (Enzo Life Sciences, Inc, Farmingdale, NY); GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ); Pierce (Pierce Biotechnology (ahora parte de Thermo Fisher Scientific), Rockford, IL); LI-COR (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE); Amicus (Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ); Phenomenex (Phenomenex, Inc., Torrance, CA); Optimal (Optimal Biotech Group, Belmont, CA); y Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

[0135] Las siguientes secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas se utilizan en el presente documento. En algunos casos (como se muestra a continuación), la secuencia polinucleotídica va seguida del polipéptido codificado.

Secuencia polinucleotídica del ADNc de GLA humano completo (SEQ ID N°. 1):

Secuencia polipeptídica del GLA humano completo:

Secuencia polinucleotídica del GLA humano maduro (yCDS nativo):

Q Secuencia polipeptídica del GLA humano maduro (SEQ ID Nº.5):

Secuencia de polinucleótidos del vector de expresión pCK1 10900i E. coli:

Secuencia de polinucleótidos del vector de expresión de levaduras secretoras pYT-72Bgl:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 73 yCDS:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 73:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 73:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 218 yCDS:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 218 hCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 218:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 326 yCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 326:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 206 yCDS:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 206 hCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 206:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 205 yCDS:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 205 hCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 205:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 76 yCDS:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 76 hCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 76:

Secuencia polinucleotídica del péptido señal de Mfalpha:

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCT (SEQ ID N°:25) Secuencia polipeptídica del péptido señal de Mfalpha:

MRFPSIFTAVLFAASSALA (SEQ ID N°:26)

Secuencia polinucleotídica de MMO435: ttaactatatcgtaatacacaggatccaccATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG (SEQ ID N°:27)

Secuencia polinucleotídica de MMO439:

AGTAGGTGTACGGGCTAACCCGTTATCCAAAGCTAATGCGGAGGATGC (SEQ ID N°:28) Secuencia polinucleotídica de MMO514:

TTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTTTGGATAACGGGTTAGCCCG (SEQ ID N°:29) Secuencia polinucleotídica de MMO₄81:

Secuencia polinucleotídica del péptido señal sintético de mamífero:

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCC (SEQ ID N°:31) Secuencia de polinucleótidos de LAKE Fw:

CGATCGAAGCTTCGCCACCA (SEQ ID N°.32)

Secuencia polinucleotídica de Br reverso:

CTTGCCAATCCATTGTCCAGGGAGTGGACACCAGTCGTTA (SEQ ID N°:33)

Secuencia polinucleotídica de Br Fw:

Secuencia polinucleotídica de hGLA Rv:

CGATCGGCGGCCGCTCAAAGTAAGTCTTTTAATGACA (SEQ ID N°:35)

Secuencia de polinucleótidos de SP-GLA (yCDS):

Secuencia polinucleotídica de MFleader-GLA (yCDS):

Secuencia polipeptídica de MFleader:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 395 yCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 395:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 402 yCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 402:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 625 yCDS:

^{<SEQ IÜ N Ü} 4^Í) Secuencia polipeptídica de la variante n° 625:

Secuencia de polinucleótidos de la variante n° 648 yCDS:

Secuencia polipeptídica de la variante n° 648:

EJEMPLO 1

Adquisición del Gen GLA y Construcción de Vectores de Expresión

[0136] Se diseñó un gen sintético que codifica un GLA humano WT para la expresión génica optimizada en Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID N°:3), se ensambló y se subclonó en el vector de expresión de E. coli pCK100900i (SEQ ID N°:6).

[0137] Se generó una construcción quimérica de expresión de GLA que codifica un péptido señal MFalpha de 19 aminoácidos de S. cerevisae fusionado a la forma madura de GLA optimizada para levadura en un vector de expresión de levadura diseñado para expresión secretada, como sigue. Un fragmento que codifica el péptido señal MFalpha (SEQ ID N°:25) se amplificó mediante PCR utilizando los oligonucleótidos MMO₄35 (SEQ ID N°:27) y MMO₄39 (SEQ ID N°:28) a partir de ADN genómico de S288C, y un fragmento que codifica un GLA sintético (SEQ ID N°:3) se amplificó utilizando los cebadores MMO514 (SEQ ID N°:29) y MMO₄81 (SEQ ID N°:30). La secuencia adicional en los extremos 5' de estos oligonucleótidos proporciona homología para la clonación por recombinación en levadura cuando se cotransforman con el plásmido linealizado pYT-72Bgl (SEQ ID N°:7). En el vector resultante, la expresión de la proteína de fusión SP-GLA (SEQ ID N°:36) está dirigida por el promotor ADH₂. Un constructo de fusión que codifica una fusión de un péptido líder MFalpha de 83 aminoácidos (SEQ ID N°:38) fusionado N-terminalmente a g La (SEQ ID N°:37) se clonó utilizando las mismas técnicas. La clonación por recombinación y la expresión génica se realizaron en la cepa INVSc1 de S. cerevisiae. Se utilizaron técnicas de evolución dirigida generalmente conocidas por los expertos en la técnica para generar bibliotecas de variantes genéticas a partir de esta construcción plasmídica (véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. N° 8.383.346 y WO2010/144103).

[0138] Un constructo de expresión de GLA quimérico que codifica un péptido señal sintético fusionado a un gen sintético que codifica la secuencia codificante de GLA humano maduro para expresión secretada en transfecciones transitorias se generó como sigue. Los oligonucleótidos PLEV113Fw (SEQ ID N°:32) y SPGLARv (SEQ ID N°:33) se utilizaron para amplificar un fragmento que codifica un péptido señal sintético (SEQ ID N°:31) mediante PCR. Se amplificó un segundo fragmento que codifica la secuencia codificante humana nativa para la forma madura de GLA (SEQ ID N°:4) utilizando los oligonucleótidos SPGLAFw (SEQ ID N°:34) y GLARv (SEQ ID N°:35). Se utilizó la PCR de empalme por extensión de solapamiento para recombinar estos fragmentos, y el fragmento quimérico resultante se ligó en el vector de expresión de mamíferos linealizado HindIII/Not I μLEV113. Se utilizaron técnicas de evolución dirigida generalmente conocidas por los expertos en la técnica para generar variantes génicas específicas a partir de esta construcción plasmídica.

EJEMPLO 2

Crecimiento y Ensayos de Alto Rendimiento

Crecimiento de Alto Rendimiento (HTP) de GLA y Variantes de GLA

[0139] Las células de levadura (INVSc1) transformadas con vectores que expresan GLA y variantes de GLA mediante el método del acetato de litio se seleccionaron en placas de agar SD-Ura. Después de 72 h de incubación a 30 °C, las colonias se colocaron en los pocillos de placas de pocillos profundos Axygen® de 1,1 ml y 96 pocillos, llenas con 200 μl/pocillo de caldo SD-Ura (2 g/L de SD-Ura, 6,8 g/L de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos [Sigma Aldrich]), 3,06 g/L de dihidrogenofosfato sódico, 0,804 g/L de hidrogenofosfato disódico, pH 6,0 complementado con un 6% de glucosa. Las células se dejaron crecer durante 20-24 horas en un agitador Kuhner (250 rpm, 30 °C y 85% de humedad relativa). Las muestras de cultivo de una noche (20 μl) se transfirieron a placas profundas Corning Costar® de 96 pocillos llenas con 380 μl de caldo SD-ura suplementado con un 2% de glucosa. Las placas se incubaron durante 66-84 h en un agitador Kuhner (250 rpm, 30 °C y 85% de humedad relativa). A continuación, se pelletearon las células (4000 rpm x 20 min) y se aislaron los sobrenadantes, que se almacenaron a 4 °C antes del análisis.

HTP-Análisis de Sobrenadantes

[0140] La actividad de la variante GLA se determinó midiendo la hidrólisis del 4-metilumbeliferil a-D-galactopiranósido (MUGal). Para este ensayo, se mezclaron 5-50 μL de sobrenadante de cultivo de levadura producido como se ha descrito anteriormente, con 0-45 μL de tampón McIlvaine (McIlvaine, J. Biol. Chem., 49:183-186 [1921]), pH 4,8 y 50 μl de MUGal 2 mM en citrato 50 mM, KCl 200 mM, pH 4,6 en una placa de 96 pocillos, negra, de fondo opaco. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 30-180 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex.

355 nm, Em. 448 nm).

Análisis HTP de Sobrenadantes Pretratados con Ácido

[0141] Las variantes GLA fueron expuestas con tampón ácido para simular los pH extremos que las variantes pueden encontrar en los lisosomas. En primer lugar, se añadieron 50 μl de sobrenadante de cultivo de levadura y 50 uL de tampón Mcllvaine (pH 3,3-4,3) a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las placas se sellaron con un sellador térmico de microplacas PlateLoc (Agilent) y se incubaron a 37 °C durante 1-3 h. Para el ensayo, se mezclaron 10-50 μL de muestra expuesta por el pH ácido con 0-40 μL de tampón McIlvaine pH 4,8, 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 30-180 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm).

Análisis HTP de Sobrenadantes Pretratados con Base

[0142] Las variantes de GLA fueron expuestas con tampón básico (neutro) para simular los pH que las variantes encuentran en la sangre después de su administración a un paciente. En primer lugar, se añadieron 50 μl de sobrenadante de cultivo de levadura y 50 uL de tampón Mcllvaine (pH 7,0-8,2) o 200 mM de bicarbonato sódico (pH 9,1-9,7) a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las placas se sellaron y se incubaron a 37 °C durante 1-18 h. Para el ensayo, se mezclaron 10-50 μL de muestra con pH básico expuesto con 0-40 μL de tampón McIlvaine de pH 4,8, 25 μL de tampón citrato 1 M de pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine de pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 30-180 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm).

Análisis HTP de Sobrenadantes Pretratados con Suero Bovino

[0143] Las variantes de GLA fueron desafiadas con suero bovino para simular las condiciones que las variantes encuentran después de la infusión en un paciente. En primer lugar, se añadieron 20 μl de sobrenadante de cultivo de levadura y 80 μl de suero bovino a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las placas se sellaron y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Para el ensayo, se mezclaron 50 μL de muestra de suero con 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 180 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm).

EJEMPLO 3

Caracterización ^{i n v i t r o} de las Variantes de GLA

Producción de GLA en Levadura

[0144] Para producir sobrenadante que contenga GLA, se cultivaron réplicas de cultivos HTP de GLA como se describe en el Ejemplo 2. Los sobrenadantes de los cultivos de réplica (n = 12-36) se combinaron antes de los análisis posteriores.

Producción de GLA en Células HEK₂93T

[0145] La expresión secretada de las variantes GLA en células de mamífero se realizó mediante transfección transitoria de células HEK₂93. Las células se transfectaron con variantes de GLA (SEQ ID N°:3, 4, 9, 12, 17, 20, 23 y 41) fusionadas a un péptido señal sintético N-terminal de mamífero y se subclonaron en el vector de expresión de mamífero μLEV113 como se describe en el Ejemplo 1. Las células HEK₂93 se transfectaron con ADN plasmídico y se cultivaron en suspensión durante 4 días utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a 4 °C.

EJEMPLO 4

Purificación de Variantes de GLA

Purificación de Variantes de GLA a Partir de Sobrenadantes de Células de Mamífero

[0146] Las variantes de GLA se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos de mamíferos esencialmente como se conoce en la técnica (Véase, Yasuda et al., Prot. Exp. Pur,. 37, 499-506 [2004]). La resina de Concanavalina A (Sigma Aldrich) se equilibró con acetato sódico 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCL, CaCl2, y MnCL 1 mM pH 6,0 (tampón de unión de Con A). El sobrenadante se diluyó 1: 1 con tampón de unión y se cargó en la columna. La columna se lavó con 15 volúmenes de tampón de unión a Concanavalina A, y las muestras se eluyeron añadiendo tampón de unión a Concanavalina A que incluía metil-a-D-manopiranósido 0,9 M y metil-a-D-glucopiranósido 0,9 M. La proteína eluida se concentró y se cambió tres veces de tampón utilizando una unidad de filtración Centricon® Plus-20 con un corte de peso molecular de 10 kDa (Millipore) en tampón de unión a ThioGal (25 mM citrato-fosfato, 0,1 M NaCl, pH 4,8). Las muestras intercambiadas en tampón se cargaron en una resina de D-galactosa inmovilizada (Pierce) equilibrada con tampón de unión a ThioGal. La resina se lavó con seis volúmenes de tampón de unión a ThioGal y se eluyó con fosfato citrato 25 mM, NaCl 0,1 M, D-galactosa 0,1 M, pH 5,5. Las muestras eluidas se concentraron utilizando una unidad de filtración Centricon® Plus-20 con un corte de peso molecular de 10 kDa. La purificación dio como resultado entre 2,4 y 10 gg de proteína purificada/ml de sobrenadante de cultivo, según la cuantificación de Bradford.

Análisis SDS-PAGE de las Variantes de GLA

[0147] Las muestras de sobrenadante de cultivo de levadura y sobrenadante de cultivo de células de mamífero y GLA purificado se analizaron por SDS-PAGE. En los sobrenadantes de levadura, los niveles de GLA eran demasiado bajos para ser detectados mediante este método. Tanto en los sobrenadantes de cultivos celulares de mamíferos como en las muestras purificadas de GLA se encontraron bandas correspondientes al peso molecular de ~49 kDa predicho para GLA.

Análisis de Inmunoblot de las variantes de GLA

[0148] Se analizaron muestras de sobrenadante de levadura y sobrenadante de cultivo de células de mamífero mediante inmunoblot. Brevemente, las muestras se separaron mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF utilizando un sistema iBlot dry blot (Life Technologies). La membrana se bloqueó con tampón de bloqueo Odyssey (TBS) (LI-COR) durante 1 h a RT y se sondó con una dilución 1:250 de IgG a-GLA de conejo (Thermo-Fischer) en tampón de bloqueo Odyssey con 0,2% de Tween® 20 durante 14 h a 4 °C. La membrana se lavó 4 x 5 min con solución salina tamponada con Tris 0,1% de Tween® 20 y se sondó con una dilución 1:5000 de IgG a-conejo de burro IRDye800CW (LI-COR) en tampón de bloqueo Odyssey con 0,2% de Tween® 20 y 0,01% de SDS durante 1 h a temperatura ambiente. La membrana se lavó 4 x 5 min con solución salina tamponada con Tris 0,1% de Tween® 20, y se analizó con un Imager Odyssey (LI-COR). Tanto en el cultivo de células de mamífero como en los sobrenadantes de levadura se encontraron bandas correspondientes al peso molecular de ~49 kDa predicho para GLA. En las muestras expresadas en S. cerevisiae, los mutantes que contenían la mutación E367N tenían un MW ligeramente superior. Esta mutación introduce un sitio canónico de glicosilación NXT N-linked (donde X es cualquier aminoácido excepto P) y la posible introducción de un glicano N-linked adicional puede explicar el mayor MW.

EJEMPLO 5

Caracterización in vitro de las Variantes de GLA

Optimización del Péptido Señal para la Expresión Secretada de GLA por S. cerevisiae

[0149] S. cerevisiae transformado con Mfleader-GLA (SEQ ID N°:7), SP-GLA (SEQ ID N°:36) o un control de vector se cultivaron en HTP como se describe en el Ejemplo 2. Los cultivos se cultivaron durante 48-120 h antes de recoger el sobrenadante y analizarlo (n = 6) como se describe en el Ejemplo 2. La figura 1 muestra la actividad relativa de diferentes construcciones de GLA en S. cerevisiae tras 2-5 días de cultivo. Como se indica en esta Figura, SP-GLA (SEQ ID N°:36) produjo un alto nivel de enzima activa que se saturó después de tres días de crecimiento.

Estabilidad del pH de Variantes de GLA Expresadas en S. cerevisiae

[0150] Las variantes de GLA fueron expuestas con diferentes tampones para evaluar la estabilidad general de la enzima. En primer lugar, se añadieron 50 μl de sobrenadante de un cultivo de levadura variante GLA y 50 uL de tampón Mcllvaine (pH 2,86-9,27) o carbonato sódico 200 mM (pH 9,69) a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar #3798, Corning). Las placas se sellaron y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Para el ensayo, se mezclaron 50 μL del sobrenadante expuesto con 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 60-180 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm). En la Figura 2 se presentan gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA tras la incubación a distintos pH.

Termoestabilidad de Variantes de GLA Expresadas en S. cerevisiae

[0151] Las variantes de GLA fueron desafiadas a varias temperaturas en presencia y ausencia de 1 μM 1-deoxigalactonojirimicina (Migalastat; Toronto Research Chemicals) para evaluar la estabilidad general de la enzima. En primer lugar, se añadieron 50 μl de sobrenadante de un cultivo de levadura variante de GLA y 50 uL de tampón McIlvaine (pH 7,65) /- 2 mM de 1-deoxigalactonojirimicina a los pocillos de una placa PCR de 96 pocillos (Biorad, HSP-9601). Las placas se sellaron y se incubaron a 30-54 °C durante 1 h utilizando el programa de gradiente de un termociclador. Para el ensayo, se mezclaron 50 μL del sobrenadante expuesto con 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 90 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm). En la Figura 3 se presentan gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA tras la incubación a distintas temperaturas.

Estabilidad Sérica de Variantes de GLA Expresadas en S. cerevisiae

[0152] Para evaluar la estabilidad relativa de las variantes en presencia de sangre, las muestras se expusieron a suero. En primer lugar, se añadieron 20 μl de sobrenadante de un cultivo de levadura variante de GLA y 0-80 μl de agua y 0-80 de suero bovino a los pocilios de una placa de fondo redondo de 96 pocilios (Costar #3798, Corning). Las placas se sellaron y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Para el ensayo, se mezclaron 50 μL del sobrenadante expuesto con 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 90 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em.

448 nm). La Figura 4 muestra gráficos de la actividad absoluta (paneles A y B) y relativa (Paneles C y D) de las variantes de GLA tras la exposición a diversos porcentajes de suero.

Actividades Relativas de las Variantes de GLA Expresadas en Células HEK₂93T

[0153] Los sobrenadantes de variantes de GLA expresadas en células HEKT293T se diluyeron 2x en serie con sobrenadante de un cultivo de levadura que no expresaba GLA. Las diluciones (50 μL) se mezclaron con 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8 y 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 en una placa Corning® de 96 pocillos, negra, de fondo opaco. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm). La Figura 5 muestra la actividad relativa de las variantes de GLA expresadas en células HEK₂93T. Los sobrenadantes de células transfectadas con enzimas GLA variantes mostraron actividades hidrolasas notablemente superiores en comparación con las enzimas WT, y mucha más actividad por volumen que la observada en la expresión de S. cerevisiae.

Estabilidad del pH de Variantes de GLA Expresadas en Células HEK₂93T

[0154] Las variantes de GLA fueron desafiadas con diferentes tampones para evaluar su estabilidad general. Los sobrenadantes de cultivos de células de mamíferos se normalizaron a actividades iguales mediante dilución con sobrenadante de un cultivo que no expresaba GLA. Se añadieron sobrenadantes normalizados (50 μl) y 50 uL de tampón McIlvaine (pH 4,06-8,14) a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar n° 3798, Corning). Las placas se sellaron y se incubaron a 37 °C durante 3 h. Para el ensayo, se mezclaron 50 μL del sobrenadante expuesto con 25 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 25 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 3 h, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em.448 nm). La Figura 6 muestra la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA expresadas en células HEK₂93T, normalizadas para la actividad e incubadas a distintos pH.

[0155] Se observó que todas las enzimas eran más estables frente a los desafíos del pH en comparación con la GLA WT expresada en S. cerevisiae (compárese con la Figura 2). Esta diferencia se debe posiblemente a una glicosilación diferencial entre los huéspedes de expresión. Sin embargo, no se pretende que la presente invención se limite a ningún mecanismo o teoría en particular. Las enzimas mutantes presentaban perfiles de estabilidad de pH más amplios en comparación con la enzima WT expresada en HEK₂93T.

Termoestabilidad de Variantes de GLA Expresadas en Células HEK₂93T

[0156] Las variantes de GLA fueron desafiadas a varias temperaturas en presencia y ausencia de 1 μM 1-deoxigalactonojirimicina (Migalastat) para evaluar su estabilidad general. Los sobrenadantes de cultivos de células de mamíferos se normalizaron a actividades aproximadamente iguales mediante dilución con sobrenadante de un cultivo sin expresión de GLA. Los sobrenadantes diluidos se añadieron a los pocillos de una placa PCR de 96 pocillos (Biorad, HSP-9601). Las placas se sellaron y se incubaron a 30-54 °C durante 1 h utilizando el programa de gradiente de un termociclador. Para el ensayo, 20 μL del sobrenadante expuesto se mezclaron con 30 μL de tampón citrato 1 M pH 4,3 y 50 μL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8. Las reacciones se mezclaron brevemente y se incubaron a 37 °C durante 90 minutos, antes de extinguirlas con 100 μl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm). En la Figura 7 se presentan gráficos que muestran la actividad absoluta (Panel A) y relativa (Panel B) de las variantes de GLA expresadas en células HEK₂93T, normalizadas para la actividad, e incubadas a diversas temperaturas. Como se muestra en esta figura, todas las enzimas eran más estables después de las exposiciones de temperatura en comparación con GLA WT expresado en S. cerevisiae (comparar con la figura 2), probablemente debido a la glicosilación diferencial entre los huéspedes de expresión. En las variantes GLA (SEQ ID N°: 10 y 13) la Tm de la enzima aumentó 2 y 4°C respectivamente. La adición de Migalastat aumentó la Tm en 5,5 °C, sin embargo, a una concentración final de 0,2 μM en el ensayo, la actividad en la muestra tratada con Migalastat se redujo en un -60%.

Actividad de GLA WT y Variantes de GLA en un Sustrato Alternativo

[0157] Para confirmar que la actividad mejorada en la hidrólisis de MUGal correspondía a sustratos más nativos, se ensayaron variantes de GLA expresadas en células de mamífero utilizando N-Dodecanoil-NBD-ceramida trihexósido (NBD-GB3) como sustrato. Se añadieron a tubos de microcentrífuga sobrenadante de cultivo HEK₂93T (10 μl), citrato sódico 100 mM pH 4,8 (80 μl) y NBD-GB3 (0,1 mg/ml) en etanol al 10% (10 μl). Se invirtieron las muestras para mezclarlas y se incubaron a 37 °C durante 1 h. La reacción se extinguió añadiendo 50 μl de metanol, se diluyó con 100 μl de cloroformo, se agitó en vórtex y se aisló la capa orgánica para su análisis. La fase orgánica (10 μl) se vertió en una placa de sílice y se analizó mediante cromatografía en capa fina (cloroformo:metanol:agua, 100:42:6), detectando el material de partida y el producto mediante una lámpara UV de 365 nm. Sólo se observó una conversión significativa con SEQ ID N°: 13, lo que confirma que la variante presenta una actividad mejorada, en comparación con la GLA WT.

Actividad Específica de las Variantes de GLA

[0158] Las variantes de GLA purificadas como se describe en el Ejemplo 4, se evaluaron por su actividad específica. Se añadieron entre 0-0,25 ng de enzima purificada a 4 mM de MUGal en tampón McIlvaine de pH 4,8 (pH final de 4,8). Las muestras se incubaron durante 60 min a 37 °C y se extinguirán mediante la adición de 100 gl de carbonato sódico 1 M. La hidrólisis se analizó utilizando un lector de microplacas SpectraMax® M2 que controla la fluorescencia (Ex. 355 nm, Em. 448 nm), y se correlacionaron con cantidades absolutas de 4-metilumbeliferona mediante el uso de una curva estándar.

Estabilidad del pH de las Variantes Purificadas de GLA a lo Largo del Tiempo

[0159] Para confirmar que las variantes purificadas de GLA muestran la estabilidad de pH deseada observada tras la expresión en levadura, se incubaron GLA WT (SEQ ID N°:5) y SEQ ID N°:42 en tampones ácidos o básicos y se analizó la actividad residual. Las variantes de GLA (200 ng) se añadieron al tampón McIlvaine de pH 4,1 o 7,5 y se incubaron durante 0-24 h a 37 °C. Las muestras (50 gL) se añadieron a una mezcla de 25 uL de ácido cítrico 1M pH 4,3 y 25 gL de MUGal 4 mM en tampón McIlvaine pH 4,8, y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Las muestras se extinguirán con 100 gl de carbonato sódico 1 M, se diluyeron 1:4 en carbonato sódico 1 M y se analizaron mediante espectroscopia de fluorescencia (Ex. 355, Em. 448). SEQ ID N°:42 fue considerablemente más estable en condiciones de exposición tanto ácidas como básicas, lo que confirma que los avances en estabilidad desarrollados en levadura se trasladaron a la proteína expresada en células de mamífero (véase la Figura 8 para los gráficos de los resultados).

Termoestabilidad de Variantes Purificadas de GLA Expresadas en Células HEK₂93T

[0160] Se determinó la termoestabilidad de GLA WT (SEQ ID N°:5) y SEQ ID N°:42 para evaluar su estabilidad general. La enzima purificada descrita en el Ejemplo 4 se diluyó a 20 gg/ml en 1x PBS con 1x Sypro Orange (Thermo Fischer Scientific), y se añadió a una placa PCR de 96 pocillos (Biorad, HSP-9601). Las placas se calentaron de 30 a 75 °C a 0,5 °C/min en una máquina de RT-PCR y se monitorizó la fluorescencia Sypro Orange. En estas condiciones, GLA WT se fundió a 37 °C, mientras que SEQ ID N°:42 lo hizo a 55 °C.

EJEMPLO 6

Caracterización in ^vivo de las Variantes de GLA

Farmacocinética Sérica de Variantes Purificadas de GLA

[0161] Se evaluó la estabilidad de las variantes purificadas de GLA producidas como se describe en el Ejemplo 4 en el suero de ratas vivas. Se administró GLA WT (SEQ ID N°:5) o SEQ ID N°:42 a 1 mg/ml por vía intravenosa a 1 ml/kg a tres ratas Sprague-Dawley ingenuas canuladas por vena yugular (7-8 semanas de edad) cada una. Antes de la administración y a los 5, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos post-administración, se recogieron 200 gL de sangre de cada rata en un tubo con EDTA y se centrifugaron a 4°C y 6000 rpm para generar >80 gL de suero por muestra. Las muestras se congelaron y almacenaron en hielo seco antes del análisis. Para el análisis, se añadió suero (10 gL) a 40 gL de MUGal 5 mM en tampón McIlvaine pH 4,4, y se incubó a 37 °C durante 1h. Las muestras se enfriaron con 50 gl de carbonato sódico 1 M, diluido al 1:100 en carbonato sódico 1 M y analizado por espectroscopia de fluorescencia (Ex. 355, Em. 448). Cuatro horas después de la administración, SEQ ID N°:42 retuvo el 15,3% de la actividad máxima, mientras que GLA WT retuvo sólo el 0,66% (véase la Figura 9).

EJEMPLO 7

Desinmunización de GLA

[0162] En este Ejemplo, se describen los experimentos realizados para identificar la diversidad que eliminaría los epítopos de células T predichos de GLA.

Identificación de la Diversidad Desinmunizante:

[0163] Para identificar la diversidad mutacional que eliminaría epítopos de células T, se utilizaron métodos computacionales para identificar subsecuencias GLA que se predijo que se unirían eficientemente a receptores HLA representativos. Además, se realizaron búsquedas experimentales de mutaciones de aminoácidos, en particular de mutaciones que no afectan a la actividad GLA (por ejemplo, en los ensayos descritos en el Ejemplo 2). A continuación, se analizaron las secuencias de aminoácidos de las variantes activas para predecir su inmunogenicidad mediante métodos computacionales.

Identificación Computacional de Epítopos Putativos de Células T en un GLA WT:

[0164] Los epítopos putativos de células T en un GLA WT (SEQ ID N°:5) se identificaron utilizando las herramientas de la Base de Datos de Epítopos Inmunes (IEDB; sitio web de Recursos de Análisis y Bases de Datos de Epítopos Inmunes), como se conoce en la técnica y herramientas de análisis estadístico patentadas (Véase, por ejemplo, iedb.org y Vita et al., Nucl. Acids Res., 38(Database issue):D854-62 [2010]. Epub 2009 Nov 11]). El G^lA WT se dividió en todos los marcos de análisis posibles de 15 polímeros, solapándose cada marco con el anterior en 14 aminoácidos. Se evaluó el potencial inmunogénico de los marcos de análisis de 15-meres puntuando sus regiones centrales de 9-meres para predecir la unión a ocho alelos HLA-DR de clase II comunes (DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1 *1101, DRB1*1301, y DRB1*1501) que colectivamente cubren casi el 95% de la población humana (Ver e.g., Southwood et al., J. Immunol., 160:3363-3373 [1998]), utilizando los métodos recomendados en el sitio web de la IEDB. Los posibles grupos de epítopos de células T contenidos en la enzima (es decir, subregiones contenidas en GLA que tienen un potencial inusualmente alto de inmunogenicidad) se identificaron utilizando herramientas de análisis estadístico, como se conoce en la técnica. Los grupos de epítopos de células T identificados se compararon con la base de datos IEDB de epítopos conocidos. Estos cribados identificaron cinco epítopos putativos de células T en la enzima WT. Estos epítopos se denominan a continuación TCE-I, II, III, IV y V.

Diseño de Bibliotecas Desinmunizantes:

[0165] En primer lugar, se evalúan las secuencias de mutantes GLA activos identificadas en el Ejemplo 2 para detectar la presencia de epítopos de células T. Las mutaciones identificadas para reducir potencialmente la unión a los alelos HLA-DR se incorporan a una biblioteca de recombinación. Se preparan bibliotecas adicionales mediante mutagénesis de saturación de cada uno de los aminoácidos de los cinco epítopos de células T. Los resultados de estas bibliotecas se someten a nuevas rondas de mutagénesis de saturación, cribado HTP y recombinación para eliminar todos los epítopos de células T posibles.

Construcción y Cribado de Bibliotecas Desinmunizantes:

[0166] Las bibliotecas de mutagénesis combinatoria y de saturación diseñadas como se ha descrito anteriormente se construyeron mediante métodos conocidos en la técnica, y se probó su actividad en un ensayo no cuestionado como se describe en el Ejemplo 2. Se identificaron y secuenciaron las variantes activas. Sus actividades y mutaciones con respecto a GLA WT figuran en la tabla siguiente.

Identificación de la Diversidad Desinmunizante:

[0167] Las variantes activas fueron analizadas por sus niveles de inmunogenicidad predicha evaluando su unión a los ocho alelos HLA-DR de Clase II comunes como se describió anteriormente. La puntuación total de inmunogenicidad y el recuento de aciertos inmunogénicos se muestran en la Tabla 7.1. La puntuación de inmunogenicidad total (TIS) refleja la inmunogenicidad global prevista de la variante (es decir, una puntuación más alta indica un mayor nivel de inmunogenicidad prevista). El "recuento de aciertos" inmunogénicos (IHC) indica el número de marcos de análisis de 15-mer con un potencial inusualmente alto de inmunogenicidad (es decir, una puntuación más alta indica un mayor potencial de inmunogenicidad). Las mutaciones que dieron lugar a una puntuación de inmunogenicidad total inferior y/o a un número de aciertos inmunogénicos inferior al de la secuencia de referencia se consideraron posibles "mutaciones desinmunizantes". Se recombinó una colección de las mutaciones más desinmunizantes para generar una serie de variantes que eran activas y se predijo que eran significativamente menos inmunogénicas que la GLA WT. En la siguiente tabla se indican la puntuación total de inmunogenicidad (TIS) y el recuento de éxitos inmunogénicos (IHC).

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una alfa galactosidasa A recombinante y/o un fragmento de alfa galactosidasa A recombinante biológicamente activo que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N₂:206, donde dicha alfa galactosidasa A comprende una mutación en la posición 206, donde la posición se numera con referencia a SEQ ID N°:5.

2. La alfa galactosidasa A recombinante de la reivindicación 1, en la que:

a) dicha mutación en la posición 206 es una mutación 206A, 206M, 206Q, 206R, 206T, 206E, 206G o 206S; b) dicha mutación en la posición 206 es una mutación 206A;

c) dicha alfa galactosidasa A comprende las mutaciones 206T/359S; y/o

d) la alfa galactosidasa A se selecciona entre cualquiera de las SEQ iD N°: 10, 13, 18, 21,24, 40, 42, 44, 46, 119-121, 236-435, 437-442, 444-687 y 689-733.

3. Una alfa galactosidasa A recombinante que comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID N°: 15, 13, 10, 18, 40, 42, 44, o 46.

4. La alfa galactosidasa A recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha alfa galactosidasa A recombinante:

a) es más termoestable que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5;

b) es más estable a pH 7,4 que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5, opcionalmente donde dicha alfa galactosidasa A recombinante es:

(i) más estable a pH 4,3 que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5; o

(ii) más estable a la exposición al suero que la alfa galactosidasa A de SEQ ID N°:5;

c) es una alfa galactosidasa A desinmunizada;

d) es una alfa galactosidasa A desinmunizada seleccionada de SEQ ID N°: 10, 13, 18, 21,40, 42, 44, 46, 121, 236,

237, 239-337, 339-368, 370-373, 375, 376, 378-431, 433-435, 437-442, 444-453, 455-478, 480-498, 500-510, 512­

550, 552-649,651-687 y 689-733;

e) es purificada; y/o

f) presenta al menos una propiedad mejorada seleccionada de entre: i) mayor actividad catalítica; ii) mayor tolerancia al pH 7,4; iii) mayor tolerancia al pH 4,3; iv) mayor tolerancia al suero; o v) inmunogenicidad reducida; o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv), o v), en comparación con una secuencia de referencia, opcionalmente en la que dicha secuencia de referencia es s Eq ID N°:5 o SEQ ID N°:10.

5. Una composición que comprende al menos una alfa galactosidasa A recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una secuencia polinucleotídica recombinante que codifica al menos una alfa galactosidasa A recombinante establecida en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, opcionalmente en la que dicha secuencia polinucleotídica está optimizada en codones.

7. Un vector de expresión que comprende la secuencia polinucleotídica recombinante de la reivindicación 6, opcionalmente en el que dicha secuencia polinucleotídica recombinante está operablemente unida a una secuencia de control, por ejemplo en el que dicha secuencia de control es un promotor, opcionalmente en el que dicho promotor es un promotor heterólogo.

8. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7, opcionalmente en la que dicha célula huésped es eucariota.

9. Un método de producción de una variante de alfa galactosidasa A, que comprende cultivar dicha célula huésped de la reivindicación 8, en condiciones en las que se produce dicha alfa galactosidasa A codificada por dicho polinucleótido recombinante.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende además el paso de recuperar dicha alfa galactosidasa A, opcionalmente donde el método comprende además el paso de purificar dicha alfa galactosidasa A.

11. Una composición farmacéutica que comprende la composición enzimática de la reivindicación 5.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que dicha composición:

a) comprende además un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable;

b) es apta para inyección parenteral o infusión a un ser humano; y/o

c) es para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 o 12 para su uso en el tratamiento y/o prevención de los síntomas de la enfermedad de Fabry en un sujeto.

14. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 13, en la que:

a) se mejoran los síntomas de la enfermedad de Fabry;

b) dicho sujeto es capaz de seguir una dieta menos restringida en su contenido graso que las dietas requeridas por los sujetos que presentan los síntomas de la enfermedad de Fabry;

c) dicho sujeto es (i) un lactante o un niño o (ii) un adulto o un adulto joven.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 5, 11 y 12 para su uso como medicamento.

16. Uso no terapéutico de la composición de la reivindicación 5 como suplemento nutricional.