ES2942214T3 - Inhibidores de la función plaquetaria y procedimientos de utilización de los mismos - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen inhibidores de molécula pequeña de la función plaquetaria, y métodos para usar las moléculas pequeñas para tratar enfermedades, tales como hemostasia y trombosis plaquetaria. En particular, en el presente documento se describen compuestos de fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos: en los que los sustituyentes son como se describe. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la función plaquetaria y procedimientos de utilización de los mismos

REFERENCIA CRUZADA A LA APLICACIÓN RELACIONADA

[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. N.° 62/659,024, presentada el 17 de abril de 2018.

DECLARACIÓN DE INTERÉS DEL GOBIERNO

[0002] Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo GM105671 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

ANTECEDENTES

Campo técnico

[0003] La presente descripción se refiere a inhibidores de la función plaquetaria y métodos de uso de los inhibidores para tratar enfermedades, tales como hemostasia plaquetaria y trombosis.

Descripción de la tecnología relacionada

[0004] La activación plaquetaria juega un papel crítico en las complicaciones trombóticas asociadas con eventos isquémicos cardiovasculares que amenazan la vida, tales como infarto de miocardio y apoplejía. La inhibición de la activación plaquetaria en individuos con riesgo de eventos trombóticos mediante el uso de aspirina y antagonistas del receptor P2Y i2 ha disminuido significativamente la morbilidad y la mortalidad asociadas con estas condiciones debilitantes (Chen et al., Lancet 366:1607-1621,2005; Palacio et al., Stroke 43:2157-2162, 2012).

[0005] Los ácidos grasos poliinsaturados ("PUFA") como complemento dietético se han utilizado tradicionalmente por sus efectos cardioprotectores potenciales, incluidos sus efectos antiplaquetarios. Se ha demostrado que el ácido dihomo-^-linolénico ("DGLA"), un AGPI 0-6, inhibe la agregación plaquetaria ex vivo (Farrow y Willis, Br J Pharmacol 55:316P-317P, 1975; Kernoff et al., Br Med J 2:1441-1444, 1977, Willis y col., Prostaglandins 8:509-519, 1974). Además, las plaquetas aisladas de humanos, así como de babuinos, conejos y ratas que recibieron dosis orales diarias de DGLA tuvieron una reducción significativa en la agregación ex vivo. Se piensa principalmente que los PUFA ejercen sus efectos reguladores sobre la función plaquetaria a través de su conversión en lípidos bioactivos (oxilipinas) por oxigenasas (Wada et al., J Biol Chem 282:22254-22266, 2007). En plaquetas, DGLA puede ser oxidado por ciclooxigenasa-1 ("COX-1") o plaquetas 12-lipoxigenasa ("12-LOX") (Falardeau et al., Biochim Biophys Acta 441: 193-200, 1976) después de su liberación de la bicapa de fosfolípidos predominantemente a través de las acciones de la fosfolipasa A 2 citoplásmica (Borsch-Haubold et al., The Journal of Biological chemistry 270:25885-25892, 1995; Lands and Samuelsson, Biochim Biophys Acta 164:426-429, 1968). Si bien tanto la COX-1 como la 12-LOX pueden oxidar DGLA a sus respectivos metabolitos, las contribuciones relativas de estos productos oxilipídicos a los efectos inhibidores de DGLA sobre la función plaquetaria siguen sin estar claras. Históricamente, los efectos antiplaquetarios de DGLA se han atribuido únicamente a los metabolitos derivados de COX-1 que han demostrado inhibir la activación plaquetaria (Farrow and Willis, supra; Kernoff et al., supra; Srivastava, Z Ernahrungswiss 17:248-261, 1978; Willis y col., supra). Sin embargo, los productos derivados de DGLA de la COX-1 (TXA 1 y PGE 1) son lábiles y se producen en bajas cantidades en las plaquetas (Bunting et al., Prostaglandins 12:897-913, 1976a; Bunting et al., Br J Pharmacol 56:344P-345P, 1976b; Moncada y col., Nature 263:663-665, 1976; Needleman y col., Prostaglandins 19:165-181, 1980). Recientemente, se descubrió que el ácido 12(S)-hidroxieicosatetrienoico ("12-HETrE"), la oxilipina de DGLA derivada de 12-LOX, exhibe un efecto antiplaquetario potencial ex vivo. Posteriormente se encontró que w-6 PUFA, DGLA, inhibía la formación de trombos plaquetarios in vivo después de una lesión en la pared del vaso. Curiosamente, DGLA no pudo inhibir la formación de trombos en ratones 12-LOX-/-, lo que sugiere que los efectos antitrombóticos de DGLA estaban mediados por 12-LOX. La oxilipina de DGLA derivada de 12-LOX, 12-HETrE, deterioró poderosamente la formación de trombos después de una lesión vascular independientemente de la expresión de 12-LOX. Además, se demostró que el efecto antiplaquetario de 12-HETrE inhibe la función plaquetaria a través de la activación de la vía de señalización de G a s que conduce a la formación de cAMP y la activación de PKA en la plaqueta. El documento WO 2017/223447 A1 divulga compuestos de ácido 12(S)-hidroxieicosatrienoico y profármacos de los mismos, así como su uso como agentes terapéuticos.

[0006] Los avances en la terapia antiplaquetaria han disminuido significativamente el riesgo de morbilidad y mortalidad debido a la trombosis. Sin embargo, incluso con las actuales terapias antiplaquetarias estándar de atención disponibles, el infarto de miocardio y el accidente cerebrovascular debido a eventos trombóticos oclusivos siguen siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. El hecho de que la tasa de eventos isquémicos siga siendo alta en individuos que toman agentes antiplaquetarios (ver Diener et al., Lancet 364:331-337, 2004) enfatiza la necesidad clínica no satisfecha de terapias alternativas que reduzcan los eventos trombóticos oclusivos sin promover un mayor riesgo de sangrado Además, si bien la terapia antiplaquetaria tradicional ha sido útil para limitar la activación de las plaquetas, su utilidad en los trastornos relacionados con la activación inmunitaria de los receptores inmunitarios en las plaquetas, como la trombocitopenia ("TPI"), se ha limitado debido a su propensión a causar hemorragia y capacidad limitada para prevenir o inhibir la eliminación de plaquetas. Por estas razones, los trastornos trombóticos que conducen a la eliminación de plaquetas, la trombosis y el sangrado siguen siendo un desafío para tratar terapéuticamente.

RESUMEN

[0007] En un aspecto, en el presente documento se proporcionan compuestos de Fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:

donde: (a) cada uno de R1 y R2 independientemente es arilo C6-10 opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de alquilo C1-6, halo y arilo; o (b) R1 es HET y R2 es alquilo C1-6; HET es un grupo heteroarilo que contiene 1,2 o 3 átomos de nitrógeno y 5 o 6 átomos en el anillo en total y opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de alquilo C1-6, halo y arilo; L es -(CO2)s-(CH2)m-(Cy)r-(CH2)n-; Cy es cicloalquileno C3-8; m es 1 o 2; n es 1, 2, 3, 4 o 5; y r y s son cada uno independientemente 0 o 1.

[0008] En algunas formas de realización, R1 es HET y R2 es alquilo C1-6. En diversas formas de realización, HET comprende pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo o triazinilo. En algunos casos, HET comprende pirazinilo. En varios casos, h Et se sustituye con uno o dos sustituyentes. En algunas formas de realización, HET se sustituye con un sustituyente. En varias formas de realización, HET se sustituye con dos sustituyentes. En algunos casos, HET se sustituye por uno o dos grupos arilo. En varios casos, el arilo comprende fenilo. En diversas formas de realización, R2 es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, s-butilo, t-butilo, isobutilo, pentilo o hexilo. En algunos casos, R2 es metilo, etilo, propilo o isopropilo. En diversas formas de realización, R2 es isopropilo. En algunas formas de realización, HET es

y R2 es isopropilo.

[0009] En algunas formas de realización, cada uno de R1 y R2 independientemente es arilo C6-10. En diversas formas de realización, cada uno de R1 y R2 comprende fenilo. En algunos casos, cada fenilo no está sustituido. En varios casos, al menos un fenilo se sustituye por halo. En algunos casos, halo es Cl o F. En varios casos, halo es Cl. En algunas formas de realización, uno de R1 y R2 es fenilo y el otro de R1 y R2 es 4-clorofenilo.

[0010] En algunos casos, r y s son cada uno 1. En varios casos, Cy comprende ciclobutileno, ciclopentileno o ciclohexileno. En algunas formas de realización, Cy comprende ciclopentileno o ciclohexileno. En varias formas de realización, Cy comprende ciclohexileno. En algunos casos, m es 1. En varios casos, n es 1 o 2. En algunas formas de realización, n es 1. En varias formas de realización, n es 2.

[0011] En algunos casos, r y s son cada uno 0. En varios casos, n+m es 3, 4, 5 o 6. En algunas formas de realización, n+m es 3. En varias formas de realización, n+m es 4 En algunos casos, n+m es 5. En varios casos, n+m es 6.

[0012] Los compuestos contemplados específicamente de la divulgación incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

, y

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, la divulgación proporciona el compuesto A1, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables:

En varios casos, la divulgación proporciona el compuesto A2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables:

En algunas formas de realización, la divulgación proporciona el compuesto A3, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables:

[0013] En este documento también se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto o una sal del mismo descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0014] Otro aspecto de la descripción se refiere a un compuesto o composición para usar en un método para tratar un trastorno trombótico en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, el trastorno trombótico se selecciona de trombosis arterial, trombosis venosa profunda ("TVP"), embolia pulmonar ("EP"), accidente cerebrovascular isquémico, trombocitopenia inmune ("TPI"), trombocitopenia inducida por heparina ("TIH"), y trombocitopenia y trombosis inducidas por heparina ("TTIH").

[0015] Los aspectos y ventajas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la revisión de la siguiente descripción detallada, tomada junto con los dibujos. La siguiente descripción incluye formas de realización específicas con el entendimiento de que la descripción es ilustrativa y no pretende limitar la invención a las formas de realización específicas descritas en este documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0016]

FIG. 1 representa la concentración del compuesto A3 administrado por vía oral o IV (30 mg/kg) en el plasma de ratones (n=3), monitoreado en 3 puntos de tiempo (2 h, 4 □ y 7 h), como se describe más detalladamente en la sección de Ejemplos.

FIG. 2 representa el porcentaje de agregación de plaquetas inducida por colágeno para los compuestos A1, A2 y A3 a 1 j ⁱ M, 5 j ⁱ M, 10 |jM y 20 j ⁱ M, como se describe con más detalle en la sección de Ejemplos.

FIG. 3 representa el porcentaje de agregación de plaquetas inducida por trombina para los compuestos A1, A2 y A3 a 1 ^jiM, 5 ^jiM, 10 ^jiM y 20 ^jiM, como se describe adicionalmente en la sección de Ejemplos.

FIG. 4 representa el total y fosfo-VASP (serina 157) con el compuesto A3, cuantificado por Transferencia Western utilizando un sistema de formación de imágenes Odyssey (Ll-CoR).

FIG. 5A-5E representa el efecto del compuesto ^a 3 sobre el cambio de pliegue a diferentes concentraciones durante la fosforilación de VASP.

FIG. 6 muestra imágenes representativas de la acumulación de plaquetas (verde) y la formación de fibrina (roja) en trombos en crecimiento en arteriolas cremáster en un animal de control de tipo salvaje ("WT") tratado con polietilenglicol ("PEG"; control, superior), tratado con WT con el compuesto CCG26368 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días; medio), y WT tratado con el compuesto A3 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días; inferior), como se describe con más detalle en la sección de Ejemplos.

FIG. 7 representa la intensidad de fluorescencia media ("MFI") de la acumulación de plaquetas en el sitio de la lesión que se registró a lo largo del tiempo en ratones de control y ratones tratados con el compuesto A3 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días), como se describe adicionalmente en la sección de Ejemplos. Los datos representan la media de ± SEM; AN OVA bidireccional.

FIG. 8 representa la intensidad de fluorescencia media ("MFI") de la acumulación de fibrina en el sitio de la lesión registrada a lo largo del tiempo en ratones de control y ratones tratados con el compuesto A3 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días), como se describe adicionalmente en la sección de Ejemplos. Los datos representan la media de ± SEM; AN OVA bidireccional.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0017] En el presente documento se describen compuestos que tienen una estructura de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos:

que tienen actividad antiplaquetaria y son útiles para tratar trastornos trombóticos, por ejemplo, al prevenir o inhibir la trombosis, la trombocitopenia y/o la isquemia, sin alterar la hemostasia. Los compuestos y métodos de la presente divulgación impiden la formación de trombos in vivo, proporcionando efectos cardioprotectores a través de la atenuación de la función plaquetaria. A diferencia de otros agentes antiplaquetarios que causan sangrado excesivo (Ahrens and Peter, Nat Biotechnol 26:62-63, 2008; Capodanno et al., J Am Coll Cardiol 66:1639-1640, 2015; Lee et al., Br J Pharmacol 166: 2188-2197, 2012), los compuestos y métodos de la presente divulgación no alteran significativamente la hemostasia y, en cambio, ejercen un efecto antitrombótico, mientras que al mismo tiempo mantienen la hemostasia primaria.

[0018] Los compuestos descritos en el presente documento son superiores al ácido 12(Sj-hidroxieicosatrienoico ("12(Sj-HETrE"), que también tiene actividad antiplaquetaria, ya que pueden inhibir la función plaquetaria en el rango nanomolar único, pueden inhibir completamente agregación inducida por agonistas, y puede inducir la fosforilación de fosfoproteína estimulada por vasodilatadores ("fosforilación de VASP") después de la adición de los compuestos a plaquetas humanas en concentraciones tan bajas como 10 nM. Además, los compuestos descritos en el presente documento no inducen sangrado, se pueden administrar por vía oral o intravenosa y son estables en la sangre.

Definiciones

[0019] Como se utiliza en este documento, el término "alquilo" se refiere a grupos hidrocarbonados saturados de cadena lineal y ramificados que contienen de uno a treinta átomos de carbono, por ejemplo, de uno a veinte átomos de carbono, o de uno a diez átomos de carbono. El término Cn significa que el grupo alquilo tiene "n" átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C4 se refiere a un grupo alquilo que tiene 4 átomos de carbono. Alquilo C1-7Q se refiere a un grupo alquilo que tiene un número de átomos de carbono que abarca el rango completo (p. ej., 1 a 7 átomos de carbono), así como todos los subgrupos (p. ej., 1-6, 2-7, 1-5, 3-6, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 átomos de carbono). Los ejemplos no limitantes de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo (2-metilpropilo), í-butilo (1,1-dimetiletilo), 3,3-dimetilpentilo y 2-etilhexilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo alquilo puede ser un grupo alquilo no sustituido o un grupo alquilo sustituido.

[0020] Como se usa aquí, el término "cicloalquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo cíclico alifático monovalente que contiene de tres a ocho átomos de carbono (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono). El término Cn significa que el grupo cicloalquilo tiene "n" átomos de carbono. Por ejemplo, cicloalquilo C5 se refiere a un grupo cicloalquilo que tiene 5 átomos de carbono en el anillo. Cicloalquilo C5-8Q se refiere a grupos cicloalquilo que tienen un número de átomos de carbono que abarca todo el rango (p. ej., 5 a 8 átomos de carbono), así como todos los subgrupos (p. ej., 5-6, 6-8, 7-8, 5­ 7, 5, 6, 7 y 8 átomos de carbono). Ejemplos no limitantes de grupos cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo cicloalquilo puede ser un grupo cicloalquilo no sustituido o un grupo cicloalquilo sustituido. Los grupos cicloalquilo descritos en el presente documento se pueden aislar o fusionar con otro grupo cicloalquilo, un grupo heterocicloalquilo, un grupo arilo y/o un grupo heteroarilo. Cuando un grupo cicloalquilo se fusiona con otro grupo cicloalquilo, cada uno de los grupos cicloalquilo puede contener de tres a ocho átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con uno a tres grupos, alquilo, alquileno-OH, C(O)NH2, NH2, oxo (=O), arilo, haloalquilo, halo y OH seleccionados independientemente.

[0021] Como se usa en el presente documento, el término "cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo bivalente. Por ejemplo, el término "cicloalquileno-arilo" se refiere a un grupo cicloalquileno sustituido con un grupo arilo. El término Cn significa que el grupo cicloalquileno tiene "n" átomos de carbono. Por ejemplo, cicloalquileno C3-6Q se refiere a un grupo cicloalquileno que tiene un número de átomos de carbono que abarca el intervalo completo, así como todos los subgrupos, como se describió previamente para los grupos "cicloalquilo".

[0022] Como se usa en el presente documento, el término "arilo" se refiere a un grupo aromático cíclico, como un grupo aromático monocíclico, por ejemplo, fenilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo arilo puede estar sustituido o no sustituido con uno o más, y en particular de uno a cuatro grupos seleccionados independientemente de, por ejemplo, halo, alquilo, alquenilo, OCF3, NO2, CN, NC, OH, alcoxi, amino, CO2H, CO2alquilo, arilo y heteroarilo. Los grupos arilo pueden aislarse (p. ej., fenilo) o fusionarse con otro grupo arilo (p. ej., naftilo, antracenilo), un grupo cicloalquilo (p. ej., tetrahidronaftilo), un grupo heterocicloalquilo y/o un grupo heteroarilo. Los grupos arilo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, clorofenilo, metilfenilo, metoxifenilo, trifluorometilfenilo, nitrofenilo, 2,4-metoxiclorofenilo y similares.

[0023] Como se usa en el presente documento, el término "heteroarilo" se refiere a un anillo aromático cíclico que tiene de cinco a doce átomos en el anillo en total (p. ej., un anillo aromático monocíclico con 5 a 6 átomos en el anillo en total), y que contiene de uno a tres heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y átomo de azufre en el anillo aromático. A menos que se indique lo contrario, un grupo heteroarilo puede estar sustituido o no sustituido con uno o más, y en particular de uno a cuatro, sustituyentes seleccionados de, por ejemplo, halo, alquilo, alquenilo, OCF3, NO2, CN, NC, OH, alcoxi, amino, CO2H, CO2alquilo, arilo y heteroarilo. En algunos casos, el grupo heteroarilo está sustituido con uno o más grupos alquilo y alcoxi. Los grupos heteroarilo se pueden aislar (p. ej., piridilo) o fusionarse con otro grupo heteroarilo (p. ej., purinilo), un grupo cicloalquilo (p. ej., tetrahidroquinolinilo), un grupo heterocicloalquilo (p. ej., dihidronaftiridinilo) y/o un grupo arilo (p. ej., benzotiazolilo). y quinolilo). Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, entre otros, tienilo, furilo, piridilo, pirrolilo, oxazolilo, quinolilo, tiofenilo, isoquinolilo, indolilo, triazinilo, triazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, benzotiazolilo, pirazinilo, pirimidinilo, tiazolilo y tiadiazolilo. Cuando un grupo heteroarilo se fusiona con otro grupo heteroarilo, cada anillo puede contener cinco o seis átomos de anillo en total y de uno a tres heteroátomos en su anillo aromático.

[0024] Como se usa en el presente documento, el término "halo" se refiere a un grupo fluoro, cloro, bromo o yodo.

[0025] El término "sustituido" utilizado aquí, cuando se utiliza para modificar un grupo funcional químico, se refiere al reemplazo de al menos un radical de hidrógeno en el grupo funcional con un sustituyente. Los sustituyentes pueden incluir, entre otros, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, heterocicloalquilo, tioéter, politioéter, arilo, heteroarilo, hidroxilo, oxi, alcoxi, heteroalcoxi, ariloxi, heteroariloxi, éster, tioéster, carboxi, ciano, nitro, amino, amido, acetamida y halo (p. ej., flúor, cloro, bromo o yodo). Cuando un grupo funcional químico incluye más de un sustituyente, los sustituyentes pueden estar unidos al mismo átomo de carbono o a dos o más átomos de carbono diferentes. Un grupo funcional químico sustituido puede incluir uno o más sustituyentes.

[0026] Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un compuesto o combinación de compuestos terapéuticamente activos que mejora, atenúa o elimina uno o más síntomas de una enfermedad o afección en particular, o previene o retrasa la aparición de uno o más síntomas de una enfermedad o condición en particular.

[0027] Como se usa en este documento, los términos "paciente" y "sujeto" pueden usarse indistintamente y significar animales, como perros, gatos, vacas, caballos y ovejas (por ejemplo, animales no humanos) y humanos. Los pacientes o sujetos particulares son mamíferos (p. ej., seres humanos). Los términos paciente y sujeto incluyen hombres y mujeres.

[0028] Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratado" o "tratamiento" y similares incluyen tratamiento preventivo (p. ej., profiláctico) y paliativo. En algunos casos, el tratamiento se refiere al tratamiento de un síntoma de un trastorno o enfermedad como se describe en el presente documento.

Compuestos

[0029] En el presente documento se proporcionan compuestos de Fórmula (I), o sus sales farmacéuticamente aceptables:

donde:

(a) cada uno de R1 y R2 independientemente es arilo Ca-io opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de alquilo Ci-a, halo y arilo; o

(b) R1 es HET y R2 es alquilo Ci-a;

HET es un grupo heteroarilo que contiene 1, 2 o 3 átomos de nitrógeno y 5 o 6 átomos en el anillo en total y opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de alquilo C1-a, halo y arilo;

L es -(CO2)s-(CH2)m-(Cy)r-(CH2)n-;

Cy es cicloalquileno C3-8;

m es 1 o 2 ;

n es 1, 2, 3, 4 o 5; y

cada uno de r y s independientemente es 0 o 1.

[0030] En algunas formas de realización, R1 es HET y R2 es alquilo C1-a. En diversas formas de realización, HET comprende pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo o triazinilo. En algunos casos, HET comprende pirazinilo. En varios casos, h Et se sustituye con uno o dos sustituyentes. En algunas formas de realización, HET se sustituye con un sustituyente. En varias formas de realización, HET se sustituye con dos sustituyentes. En algunos casos, HET se sustituye por uno o dos grupos arilo. En varios casos, el arilo comprende fenilo. En diversas formas de realización, R2 es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, s-butilo, t-butilo, isobutilo, pentilo o hexilo. En algunos casos, R2 es metilo, etilo, propilo o isopropilo. En diversas formas de realización, R2 es isopropilo. En algunas formas de realización, HET es

y R2 es isopropilo.

[0031] En algunas formas de realización, cada uno de R1 y R2 independientemente es arilo Ca-10. En diversas formas de realización, cada uno de R1 y R2 comprende fenilo. En algunos casos, cada fenilo no está sustituido. En varios casos, al menos un fenilo se sustituye por halo. En algunos casos, halo es Cl o F. En varios casos, halo es Cl. En algunas formas de realización, uno de R1 y R2 es fenilo y el otro de R1 y R2 es 4-clorofenilo.

[0032] En algunos casos, r y s son cada uno 1. En varios casos, Cy comprende ciclobutileno, ciclopentileno o ciclohexileno. En algunas formas de realización, Cy comprende ciclopentileno o ciclohexileno. En varias formas de realización, Cy comprende ciclohexileno. En algunos casos, m es 1. En varios casos, n es 1 o 2. En algunas formas de realización, n es 1. En varias formas de realización, n es 2.

[0033] En algunos casos, r y s son cada uno 0. En varios casos, n+m es 3, 4, 5 o a. En algunas formas de realización, n+m es 3. En varias formas de realización, n+m es 4 En algunos casos, n+m es 5. En varios casos, n+m es a.

[0034] Los compuestos contemplados específicamente de la divulgación incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

y

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, la descripción proporciona el compuesto A1 (CCG-263451) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables:

En varios casos, la descripción proporciona el compuesto A2 (CCG-264085) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables:

En algunas formas de realización, la divulgación proporciona el compuesto A3 (CCG-263720), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

Síntesis de compuestos

[0035] El presente documento se pueden sintetizar usando técnicas convencionales y materiales de partida fácilmente disponibles conocidos por los expertos en la técnica. En general, los compuestos proporcionados en este documento se obtienen convenientemente a través de métodos de síntesis de química orgánica estándar.

[0036] Por ejemplo, el ácido fenilborónico o el yodobenceno se pueden hacer reaccionar con 4-cloroanilina para formar 4-cloro-W-fenilanilina. El grupo amino se puede hacer reaccionar con trifosgeno para formar un grupo de ácido carbónico, que se puede hacer reaccionar con un grupo (ciclohexano-14,-diil)dimetanol apropiado para formar el 4-(hidroximetil)ciclohexil)metilo (4-clorofenil)(4) deseado. compuesto de fenil)carbamato. El compuesto de carbamato se puede proteger con alcohol y hacer reaccionar con 5-mercapto-2,4-dihidro-3H- 1,2,4 -triazol-3-ona para formar el compuesto deseado. Alternativamente, el compuesto de carbamato se puede oxidar para formar un aldehído y permitir que experimente una reacción de Wittig para formar el alqueno. El alqueno se puede hacer reaccionar con un reactivo de boro para formar un alcohol, que se puede proteger y hacer reaccionar con 5-mercapto-2,4-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona para formar el compuesto deseado.

[0037] Como otro ejemplo, una cetona apropiada (p. ej., propanona) se puede hacer reaccionar con 4-aminobutanol para formar un 4-(amino)butan-1-ol deseado, que se puede hacer reaccionar con 5-bromo-2,3- difenilpirazina para formar un compuesto de 4-((5,6-difenilpirazin-2-il)amino)butan-1-ol deseado. A continuación, el grupo cloro se puede hacer reaccionar con 5-mercapto-2,4-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona para formar el compuesto deseado.

[0038] Los procedimientos sintéticos adicionales para preparar los inhibidores descritos en el presente documento se pueden encontrar en la sección de Ejemplos.

Métodos de uso

[0039] Se requiere reactividad plaquetaria adecuada para mantener la hemostasia. Sin embargo, la reactividad plaquetaria excesiva también puede conducir a la formación de trombos oclusivos. Se ha encontrado que los compuestos descritos en este documento (p. ej., los compuestos de fórmula (I), los compuestos A1, A2 y A3 y las sales farmacéuticamente aceptables de los anteriores) pueden inhibir la agregación plaquetaria, lo que tiene implicaciones para la trombosis y la hemostasia.

[0040] Los compuestos descritos en el presente documento pueden inhibir la agregación plaquetaria al afectar la señalización intracelular, específicamente al inhibir la activación de Rap1, un efector de señalización común requerido para la activación de la integrina anbp3. Sin pretender limitarse a la teoría, se cree que los efectos antiplaquetarios de los compuestos descritos en el presente documento están mediados por la activación de la vía de señalización de G^s que conduce a la formación de cAMP y la activación de PKA en la plaqueta.

[0041] También se proporciona en el presente documento un compuesto descrito en el presente documento (p. ej., un compuesto de fórmula (I), compuesto A l, A2 o A3, o sales farmacéuticamente aceptables de los anteriores) para sujetos que lo necesiten. para su uso en un método de tratamiento de un trastorno trombótico en un sujeto. Los trastornos trombóticos particularmente contemplados que pueden tratarse o prevenirse mediante la administración de un compuesto descrito en el presente documento incluyen trombosis arterial, trombosis venosa profunda ("TVP"), embolia pulmonar ("EP"), accidente cerebrovascular isquémico, trombocitopenia inmunitaria ("TPI"), heparina trombocitopenia inducida ("TIH"), y trombocitopenia y trombosis inducidas por heparina ("TTIH").

[0042] En la sección de ejemplos, a continuación, se puede encontrar orientación adicional para el uso de los compuestos descritos en el presente documento que tienen actividad antiplaquetaria, como un compuesto de fórmula (I), los compuestos A1, A2 o A3, o las sales farmacéuticamente aceptables de los anteriores.

Formulaciones farmacéuticas, dosificación y vías de administración

[0043] El uso de composiciones farmacéuticas, que incluyen uno o más de los compuestos proporcionados en este documento. También se incluyen las propias composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas normalmente incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, en la presente se proporcionan formulaciones farmacéuticas que incluyen un compuesto descrito en la presente (p. ej., un compuesto de Fórmula (I), compuesto A1, A2 o A3, o una sal farmacéuticamente aceptable de los anteriores), como se describió anteriormente en la presente, y uno o vehículos más farmacéuticamente aceptables.

[0044] La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea aquí para referirse a aquellos ligandos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para usar en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

[0045] La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación. Como se usa aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye tampón, agua estéril para inyección, disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1 ) azúcares, como lactosa, glucosa y sacarosa; (2 ) almidones, tales como almidón de maíz, almidón de patata y pciclodextrina sustituida o no sustituida; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) polvo de tragacanto; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, como propilenglicol; (11 ) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12 ) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tampón de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento no son pirogénicas, es decir, no inducen elevaciones de temperatura significativas cuando se administran a un paciente.

[0046] El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a las sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos relativamente no tóxicas de un compuesto proporcionado en el presente documento. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y la purificación de un compuesto proporcionado aquí, o haciendo reaccionar por separado el compuesto en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislando la sal así formada. Las sales representativas incluyen bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, sales de laurilsulfonato, y sales de aminoácidos, y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19.)

[0047] En algunas formas de realización, un compuesto proporcionado en el presente documento puede contener uno o más grupos funcionales ácidos y, por lo tanto, es capaz de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de bases inorgánicas y orgánicas relativamente no tóxicas de un compuesto proporcionado en el presente documento. Estas sales también se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y la purificación del compuesto, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoníaco, o con una amina primaria, secundaria o terciaria orgánica farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares (véase, por ejemplo, Berge et al., supra).

[0048] Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.

[0049] Las composiciones preparadas como se describe en el presente documento se pueden administrar de varias formas, dependiendo del trastorno a tratar y la edad, condición y peso corporal del paciente, como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, cuando las composiciones se van a administrar por vía oral, se pueden formular como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos o jarabes; o para administración parenteral, pueden formularse como inyecciones (intravenosas, intramusculares o subcutáneas), preparaciones para infusión en gotas o supositorios. Para la aplicación por vía de la membrana mucosa oftálmica, pueden formularse como colirios o pomadas oftálmicas. Estas formulaciones se pueden preparar por medios convencionales junto con los métodos descritos en este documento y, si se desea, el ingrediente activo se puede mezclar con cualquier aditivo o excipiente convencional, como un aglutinante, un agente disgregante, un lubricante, un corrector, un agente solubilizante, un auxiliar de suspensión, un agente emulsionante o un agente de revestimiento.

[0050] Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden variar para obtener una "cantidad terapéuticamente eficaz", que es una cantidad del ingrediente activo eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente.

[0051] La concentración de un compuesto proporcionado en el presente documento en una mezcla farmacéuticamente aceptable variará dependiendo de varios factores, incluida la dosis del compuesto que se va a administrar, las características farmacocinéticas de los compuestos empleados y la vía de administración. En algunas formas de realización, las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden proporcionar en una solución acuosa que contiene aproximadamente 0,1-10 % p/v de un compuesto descrito en el presente documento, entre otras sustancias, para administración parenteral. Los intervalos de dosis típicos pueden incluir desde alrededor de 0,01 hasta alrededor de 50 mg/kg de peso corporal por día, administrados en 1-4 dosis divididas. Cada dosis dividida puede contener compuestos iguales o diferentes. La dosificación será una cantidad terapéuticamente eficaz dependiendo de varios factores que incluyen la salud general de un paciente y la formulación y vía de administración de los compuestos seleccionados.

[0052] Se pueden preparar formas de dosificación o composiciones que contienen un compuesto como se describe en el presente documento en el intervalo de 0,005 % a 100 %, estando el resto formado por un vehículo no tóxico. Los métodos para la preparación de estas composiciones son conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones contempladas pueden contener 0,001 %-100 % de ingrediente activo, en una forma de realización 0,1-95 %, en otra forma de realización 75-85 %. Aunque la posología variará en función de los síntomas, la edad y el peso corporal del paciente, la naturaleza y gravedad del trastorno a tratar o prevenir, la vía de administración y la forma del fármaco, en general, se recomienda una posología diaria de 0,01 a 2000 mg del compuesto para un paciente humano adulto, y esto puede administrarse en una sola dosis o en dosis divididas. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación generalmente será la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico.

[0053] En las jurisdicciones que prohíben patentar métodos que se practican en el cuerpo humano, el significado de "administrar" una composición a un sujeto humano se limitará a prescribir una sustancia controlada que un sujeto humano se autoadministrará por cualquier medio. técnica (por ejemplo, por vía oral, inhalación, aplicación tópica, inyección, inserción, etc.). Se pretende la interpretación razonable más amplia que sea consistente con las leyes o reglamentos que definen la materia patentable. En jurisdicciones que no prohíben patentar métodos que se practican en el cuerpo humano, la "administración" de composiciones incluye tanto los métodos practicados en el cuerpo humano como las actividades anteriores.

Otras formas de realización

[0054] Debe entenderse que, si bien la divulgación se lee junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la divulgación, que está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

EJEMPLOS

[0055] Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Síntesis de ((1r.4r)-4-(((5-oxo-4.5-dihidro-1H-1.2.4-triazol-3-il)tio)metil)ciclohexM)metil (4-clorofenilo) (fenil)carbamato (A1)

[0056]

Esquema 1. Reactivos y condiciones. (i) Cu(OAc)2, DBU, DMSO, 120 °C, durante la noche (35 %), (ii) piridina, DCM, 0 °C~TA. 2 □ (92 %), (iii) piridina, reflujo, durante la noche (57 %); (iv) piridina, DCM, 0 °C~TA, durante la noche (86 %); (v) NaH, DMF, TA, durante la noche (72 %).

[0057] 4-Cloro-N-fenilanilina (1). A una solución de 4-cloroanilina (0,32 g, 2,5 mmol) y ácido fenilborónico (0,46 g, 3,75 mmol) en DMSO seco (5 ml) se añadieron DBU (0,75 ml, 5 mmol) y Cu(OAc)2 (0,91 g, 5mmol). La mezcla azul oscuro resultante se calentó hasta 120°C y se agitó durante la noche. Después de enfriar, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y luego se pasó a través de Celite y luego se enjuagó con EtOAc. El filtrado se lavó tres veces con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna eluyendo con EtOAc al 2-5 %/hxn para producir 0,18 g (35 %) del compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, Acetona-de) 87,54 (s, 1H), 7,25 (dd, J = 15,6, 8,2 Hz, 4H), 7,16 -7,08 (m, 4H), 6,90 (t, J = 7,3 Hz, 1H).

[0058] Cloruro (4-clorofenil)(fenil)carbámico (2). A una solución de 4-cloro-N-fenilanilina 1 (0,2 g, 0,98 mmol) en DCM seco (3 ml) a 0 °C se añadió trifosgeno (0,32 g, 1,08 mmol). Se añadió lentamente a la mezcla de reacción piridina (0,11 ml, 1,38 mmol) previamente disuelta en 1 ml de DCM. La reacción se agitó durante otros 15 min y luego se calentó a TA y se agitó durante 2 h. Se inactivó con enfriamiento mediante la adición lenta de agua (la solución se volvió rosa). La mezcla se extrajo y la capa acuosa se lavó de nuevo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se concentraron para dar 0,24 g (92%) del compuesto del título como un sólido de color melocotón. Esto se usó en el siguiente paso sin más purificación. 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 57,47 - 7,27 (m, 9H).

[0059] ((1r,4r)-4-(Hidroximetil)cidohexil)metil(4-dorofenil)(fenil)carbamato (3). El cloruro carbámico 2 (0,2 g, 0,75 mmol) y (1r,4r)-ciclohexano-1,4-diildimetanol (0,12 g, 0,83 mmol) se disolvieron en piridina (0,81 ml) en un tubo sellado. La mezcla de reacción se calentó durante la noche a reflujo. Después de enfriar, la mezcla se repartió entre HCl 1 M y EtOAc. La capa ac. se extrajo con EtOAc y los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró. El crudo se purificó mediante cromatografía en columna eluyendo con MeOH al 2-5 %/DCM para producir 0,16 g (57 %) del compuesto del título como un sólido de color melocotón claro. 1H RMN (400 MHz, cloroformo d) 57,33 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,30 - 7,26 (m, 2H), 7,24 - 7,14 (m, 5H), 3,97 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 3,43 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 1,78 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 1,67 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 1,36 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 1,23 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 0,93 (q, J = 11,4, 10,5 Hz, 4H).

[0060] 4-metilbencenosulfonato de ((Ir,4r)-4-((((4-dorofenil)(fenil)carbamoil)oxi)metil)ddohexil)metilo (4). A una solución enfriada con hielo de alcohol 3 (0,24 g, 0,64 mmol) en CH2Cl2 seco (1,7 ml) se añadió piridina (0,41 ml, 5,1 mmol) y TsCl (0,40 g, 2,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y luego se lavó con HCl 1 N. La fase ac. se extrajo con DCM y EtOAc. Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron. El crudo se purificó mediante cromatografía eluyendo con EtOAc al 10-20 %/hxn para producir 0,29 g (86 %) del compuesto del título como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 57,77 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,37 -7,30 (m, 4H), 7,28 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 7,25 - 7,13 (m, 5H), 3,95 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 3,80 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), I , 68 (d, J = 22,0 Hz, 4H), 1,54 - 1,43 (brs, 2H), 0,87 (d, J = 11,7 Hz, 4H).

[0061] ((1r,4r)-4-(((5-oxo-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-3-il)tio)metil)ddohexil)metil (4-clorofenilo)(fenil)carbamato (A1). Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60 % en aceite mineral, 21 mg, 0,53 mmol). Después de 15 min, se añadió gota a gota una solución de tosilato 4 (0,14 g, 0,27 mmol) en DMF (3,2 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y luego se inactivó con HCl 1 N con enfriamiento. La suspensión resultante se extrajo con DCM (2x) y EtOAc (2x). Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El crudo se purificó por cromatografía eluyendo con MeOH al 2-4 %/DCM para proporcionar 0,09 g (72 %) del compuesto del título como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 811,60 (brs, 1H), 11,46 (s, 1H), 7,43 -7,32 (m, 4H), 7,30 -7,21 (m, 5H), 3,86 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 2,82 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 1,75 (d, J = 11,8 Hz, 2H), 1,55 (d, J = I I , 7 Hz, 2H), 1,43 (brs, 1H), 1,33 (brs, 1H), 0,85 (dp, J = 24,5, 12,2 Hz, 4H). HREM (ESI): m/z calculado para C23H26ClN4QOaS [M+H]+ 473,1414, encontrado 473,1411.

Síntesis de ((1s,4s)-4-(2-((5-oxo-4,5-dihidro-1H-1,2,4-tnazol-3-N)tio)etN)cidohexM)metMo (4-clorofenirl)(fenil)carbamato (A2)

[0062]

Esquema 1. Los reactivos y condiciones: (a) K2CO3, Cul, glicerol, 100 °C, 16 h; (b) trifosgen, piridina, DCM, 0-23 °C, 16 h; (c) ((1r,4r)-ciclohexano-1,4-diil)dimetanol, piridina, 120 °C, 18 h; (d) DMP, DCM, -78-23 °C, 3 h; (e) KOC(CHa)a, THF, 23 °C, 4 h; (f) THF, 23 °C, 16 h; (g) BH3THF, NaOH, H2O2, H2O, THF, 0,23 °C, 20 h; (h) TsCl, DMAP, DCM, 23 °C, 4 h; (i) 5-mercapto-2,4-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona, NaH, DMF, 0-23 °C, 4 h.

[0063] 4-doro-N-fenilanilina (3). A una mezcla de l-cloro-4-yodobenceno (2,5 g, 10 mmol) y glicerol (54 ml) se le añadió anilina (1,9 ml, 21 mmol), KOH (1,2 g, 21 mmol) y Cul (40 mg, 0,21 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 100 °C durante 16 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con agua. La mezcla se extrajo con EtOAc (x3). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó con cromatografía en columna eluyendo con DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida (950 mg, 44%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 87,36 - 7,19 (m, 4H), 7,11 -6,94 (m, 5H), 5,67 (s, 1H). 13C RMN (101 MHz, cloroformo-d) 8142,64, 141,85, 129,68, 129,51, 129,27, 129,07, 125,48, 121,67, 118,98, 118,66, 118,29, 117,93.

[0064] Cloruro (4-clorofenil)(fenil)carbámico (4). A una solución de trifosgeno (400 mg, 1,35 mmol) y DCM seco (13 ml) en un baño de hielo a 0°C se añadió 4-cloro-N-fenilanilina y piridina (0,65 ml, 8,09 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se inactivó con NH4QCl sat. y se extrajo con DCM (x3). La capa orgánica se lavó con HCl 1N, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó con cromatografía en columna eluyendo con DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida para obtener el compuesto (0,9 g, 83%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 87,44 - 7,26 (m, 9H).

[0065] ((1s,4s)-4-(hidmximetil)ddohexil)metil(4-domfenil)(fenil)carbamato (5). A una solución de cloruro de (4-clorofenil)(fenil)carbámico (1,1 g, 4,13 mmol) y piridina (4,4 ml, 55,06 mmol) se añadió ((1r,4r)-ciclohexano-1,4-diil)dimetanol (1,19 g, 8,27 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 120 °C a reflujo durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El concentrado se resuspendió en EtO2/EtOAc 1: 1. Los sólidos se filtraron y lavaron con Et2O/EtOAc 1:1. El filtrado se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con MeOH al 1 % en DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida para dar un aceite amarillo. (1,2 g, 78%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 87,44 - 7,32 (m, 4H), 7,32 -7,20 (m, 5H), 4,33 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 3,88 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 3,16 (dd, J = 5,4, 2,5 Hz, 3H), 1,67 (d, J = 10,4 Hz, 2H), 1,55 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 1,23 -1,14 (m, 1H), 0,80 (q, J = 11,8 Hz, 4H). EM (ESI), m/z (%): 374 (M , 100%).

[0066] ((1s,4s)-4-formilciclohexil)metilo (4-dorofenil)(fenil)carbamato (6). A una solución de ((1s,4s)-4-(hidroximetil)ciclohexil)metil (4-clorofenil)(fenil)carbamato (610 mg, 1,63 mmol) y DCM (5 ml) en acetona/hielo seco a -78 °C al baño se le añadió lentamente una solución de DMP (1,04 g, 2,45 mmol) en DCM (20 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se inactivó con 1:1 sat. NaHCO3/Na2S2O3 (100 ml) y se extrajo con DCM (x 3). Los extractos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4Q, se filtraron, se concentraron y se secaron a presión reducida. El compuesto se aisló como residuo blanco (370 mg, 61%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 89,57 (s, 1H), 7,48 -6,97 (m, 9H), 3,98 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 2,08 (ddd, J = 18,4, 11,1, 5,0 Hz, 1H), 2,01 - 1,88 (m, 2H), 1,84 - 1,69 (m, 2H), 1,63 - 1,51 (m, 1H), 1,20 (qd, J = 13,0, 3,6 Hz, 2H), 0,94 (qd, J = 12,9, 3,4 Hz, 2H). 13C RMN (101 MHz, cloroformo-d) 8204,35, 154,53, 142,03, 141,12, 131,39, 129,26, 129,16, 128,81, 128,70, 128,02, 127,58, 127,27, 126,81, 126,30, 70,72, 50,08, 36,60, 28,29, 28,13, 25,33, 25,13. EM (ESI), m/z (%): 372 (M , 100%).

[0067] ((1s,4s)-4-vinilddohexil)metil(4-dorofenil)(fenil)carbamato (8), A la mezcla de yoduro de metiltrifenilfosfonio (750 mg, 1,85 mmol) y THF (5,4 ml) se le añadió potasio terc-butóxido (218 mg, 1,94 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas para obtener el reactivo de Wittig en THF. La mezcla se añadió a una solución de ((1s,4s)-4-formilciclohexil)metil(4-clorofenil)(fenil)carbamato (0,37 g, 0,99 mmol) y THF (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y se inactivó con agua. La mezcla se extrajo con DCM (x3). La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con DCM al 75-100 % en hexano. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida (0,21 g, 56%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 87,42 - 7,09 (m, 9H), 5,75 (ddd, J = 17,1, 10,4, 6,4 Hz, 1H), 5,03 - 4,80 (m, 2H), 3,98 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 1,83 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 1,80 -I , 71 (m, 2H), 1,71 -1,62 (m, 2H), 1,53 - 1,47 (m, 1H), 1,13 -0,91 (m, 4H).

[0068] ((1s,4s)-4-(2-hidmxietil)ddohexil)metilo (4-dorofenil)(fenil)carbamato (9). A una solución de ((1s,4s)-4-vinilciclohexil)metil (4-clorofenil)(fenil)carbamato (227 mg, 0,61 mmol) y THF (2 ml) en un baño de hielo a 0 °C se añadió BH3-THF (0,3 ml, 0,3 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. Se añadieron lentamente agua (0,01 ml, 0,6 mmol), NaOH 3N (0,2 ml, 0,61 mmol) y H2O2 (0,2 ml, 0,61 mmol) a la mezcla en un baño de hielo a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. La mezcla se inactivó con NaHSO3 sat. y se extrajo con DCM (x3). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró y se secó a presión reducida. El compuesto se aisló como un aceite transparente (183 mg, 77%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo) 87,41 - 7,08 (m, 9H), 3,96 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 3,63 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,76 - 1,60 (m, 4H), 1,53 (dtt, J = I I , 4, 7,1, 4,0 Hz, 1H), 1,43 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 1,34 - 1,26 (m, 1H), 0,91 (qd, J = 11,7, 10,0, 2,6 Hz, 4H).

[0069] 4-metilbencenosulfonato de 2-((ls,4s)-4-((((4- clorofenil)(fenil)carbamoil)oxi)metil)ciclohexil)etilo (10). A una solución de ((1s,4s)-4-(2-hidroxietil)ciclohexil)metil(4-clorofenil)(fenil)carbamato (9) (137 mg, 0,35 mmol) y DCM (5 ml) se añadió DMAP (86,3 mg, 0,71 mmol) y cloruro de 4-metilbencenosulfonilo (135 mg, 0,71 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla se inactivó con agua y se extrajo con DCM (x3). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna eluyendo con MeOH al 5 % en DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida. El compuesto se aisló como un aceite incoloro (130 mg, 68%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 87,86 - 7,65 (m, 2H), 7,55 -7,17 (m, 11H), 4,00 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,84 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 2,39 (s, 3H), 1,57 -1,29 (m, 7H), 1,08 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 0,83 -0,63 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, cloroformo-d) 8154,58, 144,70, 142,11, 141,20, 133,07, 131,33, 129,84, 129,78, 129,01, 128.99, 128.93, 128.91, 127,89, 127,85, 127,77, 127,05, 127,26.44., 37,06, 35,85, 33,63, 31,88, 29,07, 21,68.

[0070] ((1s,4s)-4-(2-((5-Oxo-4,5-dihidm-1H-1,2,4-tríazol-3-il)tio)etil)ddohexil)metilo (4-dorofenil)(fenil)carbamato (A2). Se añadió NaH (18 mg, 0,44 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. 2-((1s,4s)-4-((((4-dorofenil)(fenil)carbamoil)oxi)metil)cidohexil)etilo 4-metilbencenosulfonato (0,12 g, 0,22 mmol) se disolvió en DMF (5 ml) y se añadió a la mezcla. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, se inactivó con agua helada y se extrajo con EtOAc (x3). La capa acuosa se neutralizó con HCl 2N hasta que el pH fue de 7 y se extrajo con EtOAc (x2). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó con cromatografía en columna eluyendo con MeOH al 2% en DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida. El compuesto se aisló como un sólido blanco (90 mg, 83%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 811,63 (s, 1H), 11,48 (s, 1H), 7,45 - 7,32 (m, 4H), 7,31 - 7,20 (m, 5H), 3,86 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 3,00 -2,86 (m, 2H), 1,65 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 1,54 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 1,43 (q, J = 7,2 Hz, 3H), 1,20 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 0,91 -0,71 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) 8156,61, 154,27, 142,45, 141,85, 141,84, 129,50, 129,29, 129,01, 128,97, 127,72, 127,00, 70,89, 37,19, 36,96, 36,46, 31,86, 29,12, 29,06. EM (ESI), m/z (%): 487 (M , 100%).

Síntesis de 5-((4-((5.6-d¡fen¡lp¡raz¡n-2-¡l)(¡soprop¡l)am¡no)but¡l)t¡o)-2.4-d¡h¡dro-3H-1.2.4-tr¡azol-3-ona (A3)

[0071]

Esquema 3. Reactivos y condiciones: (a) Óxido de platino(IV), EtOH, temp. ambiente, 7 días; (b) 5-bromo-2,3-^{difenilpirazina, Kl, 140 °C,} 2 ^{días; (c) d}MA^p, ^{cloruro de 4-metilbencenosulfonil, DCM, temp. ambiente, 18 h; (d) 5-}mercapto-2,4-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona, NaH, DMF, temp. ambiente, 2 días.

temperatura ambiente, 7 días; (b) 5-bromo-2,3-difenilpirazina,

[0072] 4-(isopropilamino)butan-1-ol (3). A una solución de 4-aminobutan-1-ol (2,7 ml, 29 mmol) en acetona (3,5 ml, 47 mmol) se añadió óxido de platino (IV) (67 mg, 0,29 mmol). La mezcla se agitó en atmósfera de H2 a temperatura ambiente durante 7 días. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se concentró a presión reducida para proporcionar un aceite incoloro (3,72 g, 97%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 83,43 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 2,67 (hept, J = 6,3 Hz, 1H), 2,50 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 1,49 (ddt, J = 13,2, 7,8, 4,7 Hz, 4H), 0,95 (d, J = 6,5 Hz, 6H). 13C RMN (101 MHz, cloroformo) 862,11, 48,55, 46,92, 32,23, 28,80, 22,52.

[0073] 4-((5,6-difenilpirazin-2-il)(isopropil)amino)butan-1-ol (4). A una mezcla de 5-bromo-2,3-difenilpirazina (1 g, 3,21 mmol) y 4-(isopropilamino)butan-1-ol (2,32 g, 17,7 mmol) se añadió yoduro potásico (266 mg, 1,6 mmol). La mezcla se agitó en un recipiente a presión a 140 °C durante 2 días. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con agua. La mezcla se extrajo con EtOAc (x4) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo crudo se purificó con cromatografía en columna eluyendo con 0-2% MeOH en DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida para obtener un aceite marrón (0,82 g, 71%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 88,02 (s, 1H), 7,49 - 7,42 (m, 2H), 7,39 -7,33 (m, 2H), 7,29 - 7,21 (m, 6H), 4,78 (p, J = 6,7 Hz, 1H), 3,68 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,43 (dd, J = 9,2, 6,7 Hz, 2H), 1,76 (qd, J = 7,8, 7,1, 3,9 Hz, 2H), 1,65 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 1,28 (d, J = 6,7 Hz, 6H).

[0074] N-(4-clorobutil)-N-isopropil-5,6-difenilpirazin-2-amina (5). A una solución de 4-((5,6-difenilpirazin-2il)(isopropil)amino)butan-1-ol (200 mg, 0,55 mmol) y DCM seco (8 ml) se añadió cloruro de 4-metilbencenosulfonilo (320 mg, 1,68 mmol) y DMAP (210 mg, 1,72 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con DCM (x3). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó con cromatografía en columna eluyendo con DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida. El compuesto se aisló como un sólido blanco (170 mg, 81%). 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 88,02 (s, 1H), 7,49 - 7,43 (m, 2H), 7,37 (dt, J = 7,6, 1,4 Hz, 2H), 7.29 - 7,22 (m, 6H), 4,75 (p, J = 6,7 Hz, 1H), 3,60 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,45 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,87 (dt, J = 8,5, 3,5 Hz, 4H), 1.29 (d, J = 6,7 Hz, 6H). EM (ESI), m/z (%): 380 (M , 100%).

[0075] 5-((4-((5,6-difenilpirazin-2-il)(isopropil)amino)butil)tio)-2,4-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (A3). Se añadió NaH (55 mg, 1,38 mmol). Se disolvió N-(4-clorobutil)-N-isopropil-5,6-difenilpirazin-2-amina (150 mg, 0,4 mmol) en DMF (9 ml) y se añadió a la mezcla. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción se inactivó con agua helada y se extrajo con EtOAc (x3). El pH de la fase acuosa se ajustó a 7 con HCl 2N, seguido de extracción con EtOAc (x2). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó con cromatografía en columna eluyendo con MeOH al 2 % en DCM. Las fracciones del producto deseado se combinaron, concentraron y secaron a presión reducida para obtener un sólido blanco (109 mg, 60%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 811,67 (s, 1H), 11,52 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,44 -7,04 (m, 10H), 4,86 -4,59 (m, 1H), 3,39 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 3,09 - 2,96 (m, 2H), 1,70 (q, J = 4,0, 3,5 Hz, 4H), 1,20 (d, J = 6,7 Hz, 6H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) 8156,63, 151,57, 151,57, 148,51, 141,79, 139,86, 139,72, 138,55, 138,55, 130,01, 129,73, 129,66, 129,39, 128,57, 128,42, 128,19, 12., 27,19, 20,47, 20,32. EM (ESI), m/z (%): 461 (M , 100%).

Estudio Farmacocinético de los Inhibidores en Plasma Sanguíneo de Ratón

[0076] La concentración en plasma sanguíneo del compuesto A3 en ratones se determinó después de la administración per os, oral del compuesto ("PO") e intravenosa ("IV").

[0077] Especificidad. Los cromatogramas de plasma en blanco y plasma en blanco/enriquecido con estándar interno (CE302) mostraron que el plasma en blanco no tiene una interferencia significativa con la determinación del compuesto A3 y IS.

[0078] Curva de calibración. El rango de concentración se evaluó de 1 a 5000 ng/ml para el compuesto A3. La curva se construyó con regresión lineal con ponderación (1/X2). El análisis de regresión lineal se realizó trazando la relación del área del pico (y) frente a la concentración (x) en ng/mL. La linealidad de la relación entre la relación del área del pico y la concentración se demostró mediante los coeficientes de correlación (R) obtenidos para la regresión lineal.

[0079] Condiciones del instrumento. Las condiciones de espectrometría de masas y CL-EM para los compuestos probados se muestran a continuación.

Condiciones cromatográficas:

Columna: 5 cm x 2,1 mm D.I., empaquetado con 1,7 pm Aquity BEH C18 (Waters) Fase móvil A: Ácido fórmico al 0,1 % en agua desionizada purificada

Fase móvil B: Ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo

Tasa de flu jo: 0,4 mL/min

Volumen de inyección: 5 pL

Tiempo de ejecución: 4,5 min

Programa de gradiente:

Tiempo % A %B

0,01 95 5

0,30 95 5

0,80 1 99

2,50 1 99

2,51 95 5

4,50 95 5

Condiciones de espectrometría de masas:

Comp- Fórmula/ Ion prec- Ion de pro- Estan- Tensión Col.

uesto Masa ursor (m/z) ducto (m/z) cia(s) de cono Energia

A2 452 452,941 136,96 0,01 20 16

A3 492 492,974 136,959 0,01 26 18

A1 418 416,916 281,045 0,01 38 14

CE302 454 455,16 425,2 0,01 76 31

[0080] Resultados. Los datos de concentración-tiempo del compuesto A3 individual y promedio para los grupos dosificados IV y PO se enumeran en la Tabla 1 y se presentan gráficamente en la FIG. 1.

Tabla 1. Concentración del compuesto A3 en plasma de ratón después de la administración PO e IV a las 2, 4 y 7 horas.

Preparación de plaquetas humanas lavadas

[0081] Se centrifugó sangre entera citratada (200 g durante 10 min) para aislar el plasma rico en plaquetas. El plasma rico en plaquetas se trató con citrato ácido dextrosa (citrato de sodio al 2,5 %, ácido cítrico al 1,5 %, D-glucosa al 2,0 %) y apirasa (0,02 U/ml), y luego se centrifugó (2000 g durante 10 minutos) para sedimentar las plaquetas. Las plaquetas se resuspendieron a 3,0 * 10 8 plaquetas/ml en tampón de Tyrode (HE^p ES 10 mM, NaHCO3, 127 mM, NaCl 127 mM, KCI 5 mM, NaH2PO40,5 mM, MgCh 1 mM y glucosa 5 mM) a menos que se indique lo contrario.

Agregación plaquetaria

[0082] Se prepararon plaquetas humanas lavadas a 3 x 108 plaquetas/ml y se midió la agregación en un Lumi-agregómetro de 4 canales (Chonolog Inc, modelo 700D) en condiciones de agitación a 1100 RPM a 37 °C. Las plaquetas se incubaron con concentraciones crecientes de los Compuestos A1, A2 y A3 (1 □ M a 20 □ M) durante 10 minutos y se indujo la agregación plaquetaria mediante una concentración CE80 de trombina o colágeno. Cada condición se repitió con plaquetas de 5 voluntarios independientes (N=5). La inhibición de la agregación se consideró estadísticamente significativa si había una disminución de la agregación en comparación con las condiciones tratadas con HETre. *, P< 0,05; **, P< 0,01; ***, P< 0,001; ****, p<0,0001. Véase la FIG. 2 y la FIG. 3.

Fosforilación de fosfoproteína estimulada por vasodilatadores en plaquetas humanas

[0083] Las plaquetas lavadas se trataron con forskolina (0,5 ^j M), 12-HETre (20 ^j M) o compuesto A3 (5 nm, 10 nm, 25 nm, 50 nm, 100 n, 250 nm, 1 ^j M, 5 ^j M, 10 ^j M y 20 ^j M) durante un minuto, luego lisado directamente en tampón de muestra de Laemmeli 5x (Tris-HCl 1,5 M, pH 6,8, glicerol, 5 % de □-mercaptoetanol, 10 % de dodecilsulfato de sodio (SDS) y azul de bromofenol al 1 %. Las muestras se hirvieron durante cinco minutos y luego se corrieron en un gel SDS-PAGE al 10%. Los niveles de fosfo-VASP total y (serina 157) se cuantificaron mediante transferencia Western utilizando un sistema de imágenes Odyssey (LI-CoR). Como era de esperar, las plaquetas tratadas con forskolina también tuvieron un aumento en la fosforilación de VASP. El compuesto A3 indujo la fosforilación de VASP a una concentración tan baja como 10 nm. Véase la FIG. 4 y 5.

Farmacocinética in vivo después de la administración oral en ratones

[0084] Se administró el compuesto A3 por vía oral a ratones (30 mg/kg) y se controló la concentración de fármaco en plasma en ratones (n=3) en 8 puntos temporales (0,25, 0,5, 1,2, 4, 8, 12, y 24 horas) y evaluado por análisis PK como se describe anteriormente.

Pretratamientos compuestos en ratones experimentales para estudios in vivo

[0085] Se compraron ratones de control C57BL/6 silvestres (WT) de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.) y se alojaron en las instalaciones de investigación de la Universidad de Michigan. El compuesto A1 se sintetizó y se formuló específicamente en polietilenglicol 300 (PEG 300) para dosificación por sonda oral en ratones para estudios de trombosis y hemostasia in vivo. Para el modelo de trombosis de la arteriola cremáster inducida por láser, los ratones se trataron con el compuesto A1 (3 mg/kg) o con PEG 300 mediante administración oral 2 veces al día durante 2 días antes de los estudios de microscopía intravital en el tercer día.

Modelo de trom bosis de la arteriola cremáster inducida por láser

[0086] Se anestesiaron ratones adultos (de 10 a 12 semanas de edad) como se describe anteriormente y se prepararon quirúrgicamente como se describe en detalle, y se insertó un tubo traqueal para facilitar la respiración. El músculo cremáster se preparó y perfundió con solución salina tamponada con bicarbonato precalentada durante todo el experimento. El anticuerpo GP1bp de plaquetas anti-ratón de rata conjugado con DyLight 488 (0,1 m g/g; EMFRET Analytics) y antifibrina conjugada con Alexa Fluor 647 (0,3 pg/g) o anti-CD62P de ratón con Alexa Flour 647 (3 pg/g) ratón) se administraron mediante una cánula en la vena yugular antes de la lesión vascular. Se indujeron múltiples trombos independientes en las arteriolas (30-50 mm de diámetro) en cada ratón mediante un sistema de ablación láser (sistema de fotoablación Ablate!; Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO, EE. UU.). Las imágenes de la formación de trombos en el sitio de las arteriolas lesionadas se adquirieron en tiempo real bajo un objetivo de inmersión en agua 63X con un microscopio fluorescente Zeiss Axio Examiner Z1 equipado con un sistema de lanzamiento de láser sólido (LaserStack; Intelligent Imaging Innovations) y una cámara sCMOS de alta velocidad. Todas las imágenes capturadas se analizaron para el cambio de intensidad fluorescente en el curso de la formación de trombos después de restar el fondo fluorescente definido en una sección no lesionada del vaso utilizando el programa Slidebook.

[0087] Imágenes representativas de acumulación de plaquetas (verde) y formación de fibrina (rojo) en trombos en crecimiento en arteriolas cremáster en un animal de control de tipo salvaje (WT) tratado con polietilenglicol (PEG; control, superior), WT tratado con compuesto CCG26368 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días; medio) y WT tratados con el compuesto A3 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días; inferior) se muestran en la FIG. 6, que demuestra que el compuesto A3 perjudica la formación de trombos en modelos de trombosis de arteriola cremáster inducida por láser.

[0088] La intensidad de fluorescencia media (MFI) de la acumulación de plaquetas y fibrina en el sitio de la lesión se registró a lo largo del tiempo en ratones de control y ratones tratados con el compuesto A3 (6 mg/kg, dos veces al día durante 2 días). Los ratones de tipo salvaje tratados con el compuesto A3 pudieron reducir el crecimiento de trombos (acumulación de plaquetas y fibrina) después de la lesión inducida por láser de la arteriola del músculo cremáster. Véase la FIG. 7 y la FIG. 8.

[0089] La descripción anterior se proporciona únicamente para facilitar la comprensión, y no deben entenderse limitaciones innecesarias de la misma, ya que las modificaciones dentro del alcance de la invención pueden ser evidentes para los expertos en la materia.

[0090] A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones como "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un número entero o paso o grupo de números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos.

[0091] A lo largo de la memoria descriptiva, cuando se describe que las composiciones incluyen componentes o materiales, se contempla que las composiciones también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, cualquier combinación de los componentes o materiales enumerados, a menos que se describa lo contrario. Del mismo modo, cuando se describe que los métodos incluyen pasos particulares, se contempla que los métodos también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, cualquier combinación de los pasos citados, a menos que se describa de otro modo. La invención descrita de manera ilustrativa en el presente documento puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o paso que no se describa específicamente en el presente documento.

[0092] La práctica de un método descrito en el presente documento, y los pasos individuales del mismo, se pueden realizar manualmente y/o con la ayuda o la automatización proporcionada por un equipo electrónico. Aunque los procesos se han descrito con referencia a formas de realización particulares, una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará fácilmente que se pueden usar otras formas de realizar los actos asociados con los métodos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

donde:

(a) cada uno de R1 y R2 independientemente es arilo C6-10 opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de alquilo C1-6, halo y arilo; o

(b) R1 es HET y R2 es alquilo C1-6;

HET es un grupo heteroarilo que contiene 1, 2 o 3 átomos de nitrógeno y 5 o 6 átomos en el anillo en total y opcionalmente sustituidos con 1-2 grupos seleccionados de alquilo C1-6, halo y arilo;

L es -(CO2)s-(CH2)m-(Cy)r-(CH2)n-;

Cy es cicloalquileno C3-8;

m es 1 o 2;

n es 1, 2, 3, 4 o 5; y

r y s son cada uno independientemente 0 o 1.

2. El compuesto o sal de la reivindicación 1, donde R1 es HET y R2 es alquilo C1-6, opcionalmente donde HET comprende pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo o triazinilo.

3. El compuesto o sal de la reivindicación 1 o 2, en el que HET está sustituido con uno o dos sustituyentes.

4. El compuesto o sal de la reivindicación 3, donde HET está sustituido con uno o dos grupos arilo, opcionalmente donde arilo comprende fenilo.

5. El compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde R2 es metilo, etilo, propilo o isopropilo.

6. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que cada uno de R1 y R2 independientemente es arilo C6-10, opcionalmente en el que R1 y R2 comprende cada uno fenilo.

7. El compuesto o sal de la reivindicación 6, en el que cada fenilo no está sustituido o en el que al menos un fenilo está sustituido con halo, donde opcionalmente halo es Cl.

8. El compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde r y s son cada uno 1.

9. El compuesto o sal de la reivindicación 8, en el que Cy comprende ciclopentileno o ciclohexileno.

10. El compuesto o sal de la reivindicación 9, en el que m es 1.

11. El compuesto o sal de la reivindicación 9 o 10, en el que n es 1 o 2.

12. El compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde r y s son cada uno 0 y n+m es 3, 4, 5 o 6.

13. El compuesto o sal de la reivindicación 1, que tiene una estructura

opcionalmente en donde el compuesto tiene una estructura

14. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

15. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la composición de la reivindicación 14 para uso en un método de tratamiento de un trastorno trombótico en un sujeto, opcionalmente en el que el trastorno trombótico se selecciona de trombosis arterial, trombosis de vena profunda ("TVP"), embolia pulmonar ("EP"), accidente cerebrovascular isquémico, trombocitopenia inmune ("TPI"), trombocitopenia inducida por heparina ("TIH") y trombocitopenia y trombosis inducidas por heparina ("TTIH").