ES2937307T3 - Inhibición selectiva del bromodominio del BDF1 fúngico - Google Patents

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nhalk
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Charles E Mckenna
Carlo Petosa
Jerome Govin
Boris A Kashemirov
Elena Ferri
Flore Mietton
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Grenoble Alpes
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
University of Southern California USC
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Grenoble Alpes
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
University of Southern California USC
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Abstract

La invención proporciona compuestos antifúngicos, composiciones antifúngicas e intermedios para la preparación de compuestos antifúngicos y composiciones antifúngicas. La invención también proporciona métodos para inhibir hongos y métodos para tratar infecciones fúngicas, por ejemplo, con un compuesto o composición descritos en el presente documento. Las composiciones antifúngicas pueden incluir adyuvantes antifúngicos tales como aceites esenciales o extractos de aceites esenciales, adyuvantes que mejoran aún más la actividad antifúngica de las composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibición selectiva del bromodominio del BDF1 fúngico
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones fúngicas oportunistas son una causa importante de morbilidad y mortalidad en individuos inmunocomprometidos, incluyendo los receptores de trasplantes de células madre y órganos, individuos con neoplasias hematológicas y pacientes con S iDa , con más de 800.000 muertes al año en todo el mundo causadas por candidemia, meningitis criptocócica, aspergilosis invasiva y neumonía por pneumocystis colectivamente. Las especies de Candida son los principales patógenos nosocomiales, con una tasa de mortalidad del 30-40%. Candida albicans y Candida glabrata ocupan el primer y segundo lugar en frecuencia de aislamiento, respectivamente, y colectivamente son responsables del 70% de todas las candidiasis sistémicas. Actualmente, las infecciones fúngicas invasivas se tratan centrándose en uno de los siguientes objetivos: integridad de la membrana celular (fármacos polienos); inhibición de la síntesis de ergosterol (azoles); inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos (flucitosina); inhibición de la síntesis de la pared celular (equinocandinas).
La aparición de cepas resistentes a los fármacos y la toxicidad, el alto coste y el estrecho espectro de actividad del limitado repertorio de fármacos disponibles plantean una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos. Las proteínas bromodominio (BD) y extra-terminal (BET) son factores asociados a la cromatina que regulan la transcripción de genes y la remodelación de la cromatina. Las proteínas BET reconocen la cromatina a través de sus dos bromodominios (BD1 y BD2), pequeños dominios helicoidales que reconocen específicamente péptidos cortos acetilados en residuos de lisina. En concreto, las proteínas BET se asocian a través de sus bromodominios (BD) con las colas N-terminales acetiladas de las histonas H3 y H4. En los últimos años se han desarrollado varios inhibidores BET BD humanos, que se han utilizado como agentes terapéuticos contra el cáncer y otras enfermedades humanas no infecciosas. Además, los expertos en la técnica reconocerán que los fármacos disponibles para tratar las infecciones fúngicas presentan desventajas y se basan en mecanismos que no implican a las proteínas BET fúngicas. El documento WO 2015 129 927 proporciona compuestos de fórmula I y composiciones que contienen los compuestos. Los compuestos y composiciones son útiles en los métodos de inhibición de la acción de ERK5, una proteína de la familia BET o ambas. En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones son útiles en la prevención, mejora o tratamiento de una enfermedad mediada por ERK5, una enfermedad mediada por la proteína BET o ambas.
SUMARIO
El factor 1 de Bromodominio de proteína BET fúngica (Bdfl) es una proteína BET fúngica que regula la transcripción de más de 500 genes. Se ha descubierto que Bdfl es un gen esencial en C. albicans, un patógeno fúngico muy extendido, y que la funcionalidad de los bromodominios (BD) dentro de Bdfl es crítica para el crecimiento de este organismo. Esto establece una justificación convincente para idear inhibidores selectivos de Bdfl BD para tratar las infecciones fúngicas oportunistas. Como se describe en el presente documento, se han descubierto y evaluado inhibidores selectivos de la BD fúngica por su actividad antifúngica.
En consecuencia, se proporciona una composición que comprende un compuesto, un segundo fármaco antifúngico y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable; en la que el compuesto es:
Figure imgf000002_0001
Figure imgf000003_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
También se proporciona el compuesto recitado en la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento de una infección fúngica en un sujeto que lo necesite.
Opcionalmente, el segundo compuesto antifúngico es un compuesto de Fórmula II.
Se divulga un compuesto de Fórmula II o III:
Figure imgf000003_0002
en la que:
X es NH, NHC(O), O o S;
El anillo A y el anillo B son cada uno independientemente un arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, fenilo) o un heteroarilo sustituido o no sustituido;
Ri, R2, R3y R4 son cada uno independientemente Alk, OH, NH2, NHAlk, OAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2 , S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es un alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((cH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4;
Raes H, Alquilo, OH,NH2 , NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2, C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2, S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xcH 3 donde n es 2-4 y x es 1-4, o R10 donde R10 es piperidin-1-il, morfolino u otro sustituyente heterocíclico que contenga nitrógeno; y
R6 es H, Alk, OH,NH2, NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2, S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Opcionalmente, X es NH o NHC(O).
Opcionalmente, el anillo A y el anillo B se seleccionan cada uno independientemente entre fenilo sustituido o no sustituido, piridilo sustituido o no sustituido y pirazol sustituido o no sustituido.
Opcionalmente, R1 es OH o Me, opcionalmente en la posición para con respecto a la unión del anillo A al núcleo heterocíclico de Fórmula II o III, en el que el anillo A es un anillo de seis miembros.
Opcionalmente, R3 es metilo. En diversas realizaciones, R4es H u OH. En otras realizaciones, R5 es opcionalmente metilo o piperidina-1 -ilo.
El compuesto de Fórmula II puede ser un compuesto de Fórmula IIA:
Figure imgf000004_0001
en el que:
R1 es H, Alk, OH, NH2, NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2 NH2, S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es un alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4; y
R3 es Alk, NHAlk, OAlk, cicloalquilo, C(O)OAlk, C(O)NHAlk, S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es un alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4 (donde R3 es preferiblemente meta, o más preferiblemente para, al nitrógeno de su anillo fenilo); y
R5 es H, Alquilo, OH, NH2 , NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2 NH2, S(O)2 NHAlk, o NHC(O)Alk, o NHC(O)Alk, donde Alk es alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4, o R10 donde R10 es piperidin-1-il, morfolino u otro sustituyente heterocíclico que contenga nitrógeno;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
El compuesto de Fórmula II puede ser MS51:
Figure imgf000004_0002
El compuesto de Fórmula III puede ser:
Figure imgf000004_0003
Los compuestos pueden tener una mayor actividad de unión al factor 1 de Bromodominio fúngico (Bdfl) en comparación con las proteínas Bromodominio y Extra-Terminal (BET) de humanos u otros animales. Además, los compuestos pueden ser selectivos para un BD1 fúngico frente al BD2, o viceversa.
Se proporciona un compuesto de Fórmula IV:
Figure imgf000005_0001
en la que:
X es CH2, O, NH o S;
R es -(CH2)n-L, donde n es 0-4 y L es H, halo, R1, -COO-R1, -CO-R1, -CON(R1R2), -S(O)r R1, -S(O)r N(R1R2), -N(R i R2), -N(R2)COR1 un arilo sustituido o no sustituido, o un heteroarilo sustituido o no sustituido, donde R1 yR2 son cada uno independiente:
(i) H, halo, un arilo sustituido o no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido;
(ii) un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; o
(iii) un alquilo C1-C8, un alquenilo C2-C8 o un alquinilo C2-C8, cada uno de los cuales comprende 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N; o un cicloalquilo C3-C12 sustituido o no sustituido o un cicloalquenilo C3-C12 sustituido o no sustituido; y
R3 es (i) H, halo, un arilo sustituido o no sustituido, o un heteroarilo sustituido o no sustituido; (ii) un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; (iii) un alquilo C1-C8, un alquenilo C2-C8 o un alquino C2-C8, cada uno que comprende 0, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N; o un cicloalquilo C3-C12 sustituido o no sustituido o un cicloalquenilo C3-C12 sustituido o no sustituido; o (iv) OH, o una amina, éter, amida o éster sustituidos o no sustituidos;
Z es un radical divalente de 1 átomo de carbono o nitrógeno, o una cadena lineal de 2 a 40 átomos, en la que la cadena lineal comprende al menos un átomo de carbono o nitrógeno, y en la que la cadena comprende de 0 a 8 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N, cadena que está opcionalmente interrumpida por 1 o 2 grupos cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo;
El anillo A es un arilo sustituido o no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido;
R11 y R12 son cada uno independientemente H, Alk, OH, NH2, NHAlk, OAlk, halógeno, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2, C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2, o S(O)2NHAlk, donde Alk es un alquilo C 1-C4 sustituido o no sustituido;
R15 es H, Alk, OH, NH2, NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2, C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2, o S(O)2NHAlk, donde Alk es un alquiloC1-C4 sustituido o no sustituido o RZ, donde RZ es piperidin-1-il, morfolino u otro sustituyente heterocíclico que contenga nitrógeno; y
R16 es H, Alk, OH, NH2, NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2, C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2, o S(O)2NHAlk, donde Alk es un alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Ejemplos específicos de compuestos de fórmula IV son los compuestos (A1) y (B1), que son los únicos que se considerarán parte de la presente invención:
Figure imgf000005_0002
Los compuestos descritos en el presente documento son eficaces para el tratamiento de infecciones fúngicas estándar, además de infecciones fúngicas que son resistentes a fármacos antifúngicos que no son compuestos de ninguna de las fórmulas I-IV. Así, la invención proporciona un compuesto (por ejemplo, un compuesto descrito anteriormente) que es eficaz contra una cepa de una especie de Candida que es resistente a otros fármacos antifúngicos. La invención proporciona además una composición que comprende un compuesto descrito en el presente documento (por ejemplo, un compuesto de una cualquiera de las fórmulas descritas anteriormente), un segundo fármaco antifúngico y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden incluir un adyuvante antifúngico. El coadyuvante antifúngico puede ser un aceite esencial o un extracto de aceite esencial, tal como naranja dulce, Mentha arvensis, menta piperita, madera de cedro, limón, Eucalyptus globulus, Litsea cubeba, clavo, menta verde, nuez moscada, canela, albahaca, laurel o una combinación de los mismos. En una realización específica, el extracto de aceite esencial es eugenol.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia o para diagnóstico.
La invención divulga además un método ex vivo para reducir o perjudicar el crecimiento de un cultivo fúngico que comprende exponer el cultivo a un compuesto que inhibe una o ambas proteínas bromodominio fúngicas, en el que el compuesto es un compuesto de cualquiera de las fórmulas I-IV, y el crecimiento del cultivo fúngico se reduce o perjudica de este modo.
También se proporciona un compuesto recitado en la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento de una infección fúngica en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso la administración al sujeto de una cantidad antifúngica eficaz del compuesto que inhibe una o ambas proteínas bromodominio fúngicas, en el que la infección fúngica se trata de este modo.
El compuesto puede tener una mayor actividad de unión a Bdfl en comparación con las proteínas BET humanas o de otros animales. El compuesto también puede ser eficaz contra una cepa de una especie de Candida resistente a otros fármacos antifúngicos.
El compuesto puede administrarse, concurrente o secuencialmente, en combinación con un segundo fármaco antifúngico. Opcionalmente, el segundo fármaco antifúngico es anfotericina, anidulafungina, caspofungina, clotrimazol, fluconazol, flucitosina, itraconazol, ketoconazol, micafungina, miconazol, posaconazol, voriconazol, o una combinación de los mismos. La invención por lo tanto divulga el uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las fórmulas I-IV para el tratamiento de una infección fúngica.
Así, se divulga un método ex vivo para reducir o impedir el crecimiento de un cultivo fúngico. El método incluye exponer el cultivo a al menos un compuesto que inhiba uno o ambos bromodominios de la proteína Bdfl. En el método, el compuesto puede tener una mayor actividad de unión a Bdfl en comparación con las proteínas BET humanas o de otros animales.
Se divulga un uso de los compuestos recitados en un método de tratar una infección fungicida en un tema en la necesidad del mismo. El método incluye administrar al sujeto al menos un compuesto o una composición que inhiba uno o ambos bromodominios de la proteína Bdfl. En el método, el compuesto puede tener una mayor actividad de unión a Bdfl en comparación con las proteínas BET humanas o de otros animales. Opcionalmente, el compuesto es eficaz contra una especie de Candida resistente a otros antifúngicos tal como el fluconazol. Opcionalmente, el compuesto puede administrarse con otro fármaco antifúngico tal como anfotericina, anidulafungina, caspofungina, clotrimazol, fluconazol, flucitosina, itraconazol, ketoconazol, micafungina, miconazol, posaconazol o voriconazol.
En el método ex vivo de reducción o impedimento del crecimiento de un cultivo fúngico, o el uso de los compuestos y composiciones recitados en un método de tratamiento de una infección fúngica, el al menos un compuesto puede inhibir selectivamente BD1 o BD2, o ambos BD1 y BD2, de la proteína Bdfl fúngica. El compuesto puede proporcionarse como una composición farmacéutica que comprende un diluyente, excipiente o portador fisiológica o farmacéuticamente aceptable.
La invención divulga así compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento, intermedios para la síntesis de compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento, así como métodos de preparación de compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento. La invención también divulga compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento que son útiles como intermedios para la síntesis de otros compuestos útiles. La invención divulga para el uso de compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento para la fabricación de medicamentos útiles para el tratamiento de infecciones fungicidas en un mamífero, tal como un humano. La invención divulga así el uso de las composiciones descritas en el presente documento para el uso en terapia médica. La terapia médica puede consistir en tratar una infección fúngica o sus síntomas. El medicamento puede incluir un diluyente, excipiente, portador, adyuvante o combinación de los mismos farmacéuticamente aceptable.
El alcance de la invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende un compuesto, un segundo fármaco antifúngico y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable; en la que el compuesto es:
Figure imgf000007_0001
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de Fórmula IV que se selecciona de
Figure imgf000008_0001
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los siguientes dibujos forman parte de la memoria descriptiva y se incluyen para demostrar ciertas realizaciones o diversos aspectos de la invención. En algunos casos, las realizaciones de la invención pueden comprenderse mejor haciendo referencia a los dibujos adjuntos en combinación con la descripción detallada que se presenta en el presente documento. La descripción y los dibujos que la acompañan pueden destacar un ejemplo concreto o un aspecto determinado de la invención. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que partes del ejemplo o aspecto pueden utilizarse en combinación con otros ejemplos o aspectos de la invención. Para una comprensión más completa de la presente invención, se hace referencia ahora a las siguientes descripciones tomadas conjuntamente con los dibujos adjuntos.
Figura 1. (Sólo referencia) Las mutaciones que inactivan los dos bromodominios Bdfi(CaBdfl) de C. albicans alteran la viabilidad y el crecimiento celular, lo que demuestra que el bloqueo de estos dominios debería tener un efecto similar y aumentar la susceptibilidad a los fármacos antifúngicos.
Figura 2. (Sólo referencia) Las estructuras cristalinas de resolución atómica de las Bdfl BDfúngicas revelan características estructurales fundamentales para el diseño de inhibidores potentes y selectivos. Las diferencias estructurales entre los bromodominios humanos y fúngicos permiten la inhibición selectiva de estos últimos.
Figura 3. (Sólo referencia) Los bromodominios Bdfl de C. albicans son específicos para colas de histonas H4 multiacetiladas. (a) Filogenia y organización de dominios de los ortólogos fúngicos Bdfl y BET humanos. (b) Unión de los bromodominios CaBdfl de tipo silvestre y mutante a un conjunto de 384 péptidos histónicos. El conjunto comprendía péptidos de control (fondo gris) o péptidos N-terminales derivados de las histonas H3, H4, H2A y H2B (fondo magenta, cian, rosa y verde, respectivamente) con entre 0 y 4 modificaciones postraduccionales, incluyendo marcas de metilo, citrulina, fosforilo y acetilo. Las señales correspondientes a los controles de fondo y de unión positiva (verde), a los péptidos H4 (magenta) y H4ac4 (azul) están recuadradas y se muestran a mayor aumento debajo del conjunto. El ensayo se realizó por duplicado. (c). Resumen de los datos de unión de los péptidos H4 acetilados. Los péptidos H4 (rectángulos cian) que abarcan los residuos 1-19 u 11-30 presentan entre 0 y 4 marcas de acetilo en los residuos K5, K8, K12, K16 o K20 (recuadros negros). La intensidad de la unión se normaliza con respecto a la intensidad del control positivo. Ambas BD se unieron a péptidos multiacetilados con más fuerza que a péptidos monoacetilados y no acetilados, mientras que la unión se suprimió cuando los residuos Tyr conservados implicados en el reconocimiento del ligando se mutaron a Phe. (d) Ensayo desplegable. Los péptidos N-terminales de la histona H4 en su forma no modificada (H4) o tetraacetilada (H4ac4) se inmovilizaron e incubaron con bromodominios CaBdf1 marcados con GST de tipo silvestre o con los constructos correspondientes que llevaban la sustitución inactivadora de Tyr por Phe. Tras el lavado, las proteínas unidas se eludieron y se visualizaron en una transferencia Western utilizando un anticuerpo ant-GST.
Figura 4. (Solo de referencia) Conservación de bromodominios BET y desarrollo de anticuerpos ant-CaBdf1.
(a) Porcentaje de identidad de los bromodominios BET entre las proteínas b Et humanas y fúngicas. (b) Localización de las mutaciones puntuales YF utilizadas en este estudio. (c) Desarrollo de un anticuerpo específico de Bdfl de C. albicans. Tras la inmunización del conejo se detecta específicamente una banda del peso molecular esperado. (d) Validación de la especificidad de los anticuerpos. El anticuerpo detectó una banda desplazada cuando Bdfl estaba marcado con TAP, mientras que la señal se perdía cuando Bdfl no se expresaba.
Figura 5. (Sólo referencia) Los bromodominios Bdfl son esenciales para la viabilidad de C. albicans. (a) Esquema del constructo Tet-OFF de un paso utilizado en este estudio. El constructo contiene un marcador auxotrófico (ARG4), el gen que codifica el activador Tet de fusión (TetR-VP16) y siete repeticiones en tándem del operador TetO corriente arriba de la BDF1 ORF . Dox inhibe la unión de TetR-VP16 a TetO, impidiendo la transcripción de BDF1. Recientemente se ha publicado un sistema similar con un método de selección diferente37. (b) Análisis de los niveles de expresión de Bdfl en diferentes cepas. Las intensidades de banda se cuantificaron utilizando triplicados biológicos. (c) Ensayo de crecimiento sólido de cepas en las que la expresión de Bdfl está controlada por Dox. (d) Las cepas mostradas en (c) se inyectaron en un modelo de ratón de candidiasis diseminada. (*valor p < 0,05 en una prueba T pareada de dos caras utilizando >5 réplicas biológicas). (e) Ensayo de crecimiento sólido que evalúa la importancia de las Bdfl BD para el crecimiento de C. albicans. Las mutaciones dobles de las Bdfl BD afectan gravemente al crecimiento. (f) Ensayo de crecimiento líquido realizado con las cepas mostradas en (e). Se sembró una carga fúngica igual para cada cepa y se monitorizó el crecimiento mediante densidad óptica a 600 nm.
Figura 6. (Sólo referencia) Los bromodominios Bdfl son esenciales en C. albicans. (a). Ensayo de crecimiento sólido de cepas en las que la expresión de Bdfl está controlada por doxiciclina (izquierda) o por un promotor sensible a la metionina (pMET, derecha). La viabilidad de C. albicans se pierde cuando Bdfl está ausente o cuando ambas Bdfl BD están mutadas. (b) Ensayo de crecimiento líquido con las cepas presentadas en (a) (lado derecho, con el promotor pMET). Izquierda, OD no normalizado. La represión del promotor pMET requiere la adición de altas concentraciones de metionina y cisteína, lo que afecta al crecimiento de C. albicans (WT, comparar barras negras y rojas). Derecha, los datos se normalizaron con respecto al crecimiento de la cepa WT (tanto las barras negras como las rojas son iguales al 100% en la cepa WT).
Figura 7. (Sólo referencia) Ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF). a. Configuración del ensayo. Un péptido de histona tetraacetilado biotinilado se une a perlas de estreptavidina que se acoplan a un fluoróforo donante con base en terbio, criptato lumi-Tb. El bromodominio marcado con GST está unido por un anticuerpo anti-GST acoplado al fluoróforo aceptor, una molécula orgánica denominada D2. La unión del péptido por el bromodominio sitúa al donante y al aceptor a una distancia FRET. En esta situación, la excitación del donante a 337 nm provoca la transferencia de energía al donante, cuya fluorescencia emitida se controla a 665 nm de forma resuelta en el tiempo para eliminar la fluorescencia de fondo transitoria. b-d. Unión del péptido H4 tetraacetilado biotinilado (H4ac4) por los bromodominios BD1 de Brd4 humana (b), Bdfl de S. cerevisiae (c) y Bdfl de C. albicans (d) medida por un aumento de la señal HTRF con el aumento de la concentración del péptido.
Figura 8. (Sólo referencia) Las CaBdfl BD son insensibles a los inhibidores BET humanos. (a) Ensayos de inhibición HTRF realizados en BD1 y BD2 de CaBdfl y Brd4 humana para evaluar los efectos de cuatro inhibidores BET humanos. Las curvas de inhibición se muestran como círculos cerrados (BD1) y abiertos (BD2) en verde (Brd4) y magenta (Bdfl). Los valores IC50 se resumen debajo de cada gráfico. (b) Estabilidad térmica de las BET BD indicadas en presencia y ausencia de inhibidores BET determinada por fluorimetría diferencial de barrido. Se indica el desplazamiento térmico (ATm) de cada inhibidor. Se representan las curvas obtenidas en presencia (líneas gruesas) o ausencia (líneas finas) para CaBDF1 BD1 (magenta sólido), CaBDFI BD2 (magenta discontinuo) y Brd4 humana (verde). (c) Experimento ITC que mide la unión de JQ1 a CaBDFI BD (magenta) y a Brd4 BD1 humana (verde). (d ) iBET-151 y la bromosporina no afectan al crecimiento de C. albicans , incluso cuando se suprimen los bromodominios Bdfl. Los experimentos se han realizado en presencia de doxiciclina, que reprime el alelo pTetO-BDF1.
Figura 9. (Sólo referencia) Estructuras cristalinas de BD BET fúngicos. (a) Alineación estructural de CaBdfl BD1 (arriba) y BD2 (abajo) con las correspondientes Brd4 BD humanas. Para mayor claridad, en las estructuras de BD1 se han omitido los 20 residuos N-terminales que preceden a la hélice Z. (b) Diagramas del potencial electrostático de superficie de las estructuras BD1 (arriba) y BD2 (abajo) de Brd4 humana, C. albicans y S. cerevisiae. Las regiones de potencial negativo y positivo se muestran en rojo y azul, respectivamente. (c) Análisis comparativo de las bolsas de unión al ligando de las BET BD fúngica y humana. Los paneles muestran la alineación estructural de la BD fúngica indicada con las BD correspondientes de las cuatro proteínas BET humanas (Brd2, Brd3, Brd4 y Brdt). Los residuos exclusivos de la BD fúngica se muestran en magenta, y los residuos humanos correspondientes en gris. Los residuos en naranja se conservan entre los BD fúngicos y humanos, pero están desplazados en la estructura fúngica.
Figura 10. Identificación de un inhibidor selectivo de Bdfl BD1 de C. albicans. (a) Estrategia de cribado químico empleada. (b) Estructura química del compuesto de dibenzotiazepinona MS4. (c) Ensayos HTRF que muestran la inhibición selectiva de CaBdfl BDIpor MS4. (d) Experimento ITC que muestra la unión selectiva de MS4 a CaBdfl BD1. (e-f) Detalles del reconocimiento de MS4 y base estructural de la selectividad.
Figura 11. (Sólo referencia) Compuestos de dibenzotiazepinona que muestran selectividad por CaBdfl BD1 sobre Brd4-BD1 humana.
Figura 12. Detalles del reconocimiento de MS4 por CaBdf1-BD1. (a) Alineación estructural de los cuatro complejos BD1-MS4 en la unidad asimétrica cristalográfica. (b) Entorno de residuos de MS4 dentro del sitio activo.
Figura 13. Identificación de un inhibidor de CaBdf1-BD1 que fenocopia la inactivación de BD1. (a) Estructura química del compuesto de dibenzotiazepinona MS5. (b) Ensayo HTRF que muestra que MS5 inhibe CaBdfl-BD1 preferentemente sobre CaBdf1-BD2 y con una selectividad débil en comparación con hBrd4-BD1. (c) Experimento ITC que muestra la unión de MS5 hacia la BD indicada. (d) Efecto de MS5 sobre el crecimiento de C. albicans. El primer alelo se indica debajo del gráfico, el segundo es pMET-BDF1 (arriba) o pTetO-BDF1 (abajo). Las cepas se cultivaron en presencia de doxiciclina o metionina/cisteína, respectivamente, para reprimir la expresión del segundo alelo. MS5 compromete el crecimiento cuando CaBdf1-BD2 se inactiva por deleción o mutación puntual. La prueba estadística es una prueba t pareada de dos caras realizada en >5 réplicas biológicas (*p = 0,01 a 0,05; **p = 0,001 a 0,01; ***p < 0,001). (e) Experimento dosis-respuesta que muestra el efecto de MS5 en cepas mutantes Bdfl.
Figura 14. Reconocimiento de MS5 por CaBdf1-BD1. Se muestran tres vistas ortogonales del complejo. Los recuadros muestran el entorno de residuos de M5 dentro del sitio activo.
Figura 15. (Sólo referencia) Identificación de un inhibidor selectivo de Bdfl BD2 de C. albicans . (a) Estructura química del compuesto MS51. (b) Ensayos HTRF que muestran la inhibición selectiva de BD2 CaBdfl por MS51. (c) Experimento ITC que muestra la unión de MS51 a BD1 CaBdf1. (d) Base estructural del reconocimiento de MS51.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente solicitud describe pequeñas moléculas que inhiben selectivamente las BD Bdfl (BD1 o BD2, o BD1 y BD2). Varias de las pequeñas moléculas se han identificado mediante ensayos y experimentos in vitro con base en la comparación del patrón de campo tridimensional de una biblioteca de pequeñas moléculas con el de un patrón de referencia. Este patrón de campo de referencia se determina utilizando la estructura cristalina de uno de los inhibidores descritos en el presente documento en complejo con CaBdf1BD1.
Se divulgan pequeñas moléculas para reducir o impedir el crecimiento de cultivos fúngicos mediante la inhibición de las Bdfl BD.
Se divulgan pequeñas moléculas para reducir o curar una infección fúngica mediante la unión selectiva a las BD Bdfl. La infección fúngica puede ser una infección localizada, tal como la candidiasis, o una infección sistémica, tal como la candidemia.
Se divulga una composición farmacéutica que contiene uno o más de los compuestos divulgados anteriormente que inhiben Bdfl BD, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Opcionalmente, uno de los compuestos de la composición puede ser un compuesto antifúngico diferente, que puede ser un fármaco antifúngico aprobado por la FDA, tal como el fluconazol, y similares. Opcionalmente, los compuestos inhibidores de Bdf1 pueden utilizarse para tratar infecciones fúngicas resistentes a otros agentes/fármacos antifúngicos. Opcionalmente, un compuesto inhibidor de Bdfl puede inhibir selectivamente BD1 o BD2 de la proteína Bdfl fúngica, o ambas BD1 y BD2 de una proteína Bdfl fúngica. En el presente documento también se divulgan combinaciones que comprenden un compuesto que inhibe BD1 y otro compuesto que inhibe BD2. La composición farmacéutica puede utilizarse contra levaduras patógenas tales como C. albicans y C. glabrata.
En referencia a las figuras, la Fig. 1 muestra cómo la funcionalidad del bromodominio Bdfl es necesaria para el crecimiento y la aptitud de C. albicans. La Fig. 1a muestra que Bdfl es esencial en C. albicans. Se suprimió un alelo y el otro se colocó bajo control pMET. La expresión de Bdfl se reprime en medios SC que contienen metionina y cisteína o en medios ricos (YPD). El rescate de la cepa suprimida confirma que el fenotipo observado se debe a la ausencia de Bdfl. La Fig. 1b muestra que la deleción del bromodominio Bdfl compromete el crecimiento. Se suprimieron uno o ambos bromodominios de un alelo Bdfl, mientras que el otro alelo estaba bajo control pMET. La supresión de ambos bromodominios casi fenocopia la supresión completa de BDF1. La temperatura de 42 °C, que imita un choque térmico, agrava los fenotipos observados a 30 °C. La Fig. 1c muestra la inactivación del bromodominio por mutación puntual. Se construyeron mutantes puntuales simples y dobles sustituyendo los residuos Tyr225 o Asn268 en BD1 y Tyr402 o Asn445 en BD2 por fenilalanina y alanina, respectivamente. En los bromodominios BET humanos, estos residuos forman un enlace de hidrógeno directo (Asn) o mediado por agua (Tyr) con el péptido histónico acetilado.
La Fig. 2 muestra las estructuras cristalinas de resolución atómica de las Bdfl BD de S. cerevisiae y C. albicans . Al igual que las bromodominios canónicas, las estructuras fúngicas comprenden un haz zurdo de cuatro hélices (aZ, aA, aB y aC) con los bucles ZA y BC definiendo la bolsa de unión del ligando. Las estructuras se asemejan a las de los bromodominios BET humanos, con la mayoría de los residuos dentro de la bolsa de unión al ligando, incluyendo cuatro moléculas de agua estructuradas importantes para el reconocimiento del ligando, conservadas entre los ortólogos humanos y fúngicos. Sin embargo, varios residuos difieren en identidad o ubicación espacial, lo que da lugar a diferencias pequeñas pero significativas en las propiedades estereoquímicas de la bolsa de unión del ligando.
Las fórmulas I-IV proporcionan estructuras químicas que resumen las características estructurales 2D mostradas por clases de moléculas que incluyen compuestos que muestran alta actividad para uno de los bromodominios de Bdfl de C. albicans y que son selectivos para los dominios fúngicos sobre los bromodominios humanos Brd4. Un andamiaje principal es una azepinona, que opcionalmente se convierte en una tia, oxa o diazepinona. Fusionados al andamiaje de azepinona hay dos anillos aromáticos (arilo o heteroarilo), opcionalmente sustituidos. Además, el átomo de nitrógeno del andamio de azepinona está opcionalmente sustituido, tal como con sustituyentes arilo o alquilo, que a su vez pueden estar opcionalmente sustituidos.
Definiciones
Las siguientes definiciones se incluyen para proporcionar una comprensión clara y coherente de la especificación y las reivindicaciones. Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos mencionados tienen el siguiente significado. Todos los demás términos y frases utilizados en esta memoria descriptiva tienen su significado ordinario tal y como lo entendería un experto en la técnica. Dichos significados ordinarios pueden obtenerse consultando diccionarios técnicos, tales como Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14.a edición, de R.J. Lewis, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 2001.
Las referencias en la memoria descriptiva a "una realización", "una realización", etc., indican que la realización descrita puede incluir un aspecto, rasgo, estructura, fracción o característica particular, pero no todas las realizaciones incluyen necesariamente ese aspecto, rasgo, estructura, fracción o característica. Además, dichas frases pueden referirse, aunque no necesariamente, a la misma realización a la que se hace referencia en otras partes de la memoria descriptiva. Además, cuando un aspecto, rasgo, estructura, fracción o característica particular se describe en relación con una realización, está dentro del conocimiento de un experto en la técnica afectar o conectar dicho aspecto, rasgo, estructura, fracción o característica con otras realizaciones, estén o no descritas explícitamente.
Las formas singulares "a", "una" y "el/la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a "un compuesto" incluye una pluralidad de tales compuestos, de modo que un compuesto X incluye una pluralidad de compuestos X. Se señala además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base previa para el uso de terminología exclusiva, tal como "únicamente", "sólo" y similares, en relación con cualquier elemento descrito en el presente documento, o la recitación de elementos de reivindicaciones o el uso de limitaciones "negativas".
El término "y/o" significa cualquiera de los elementos, cualquier combinación de los elementos o todos los elementos con los que se asocia este término. Las frases "uno o más" y "al menos uno" son fácilmente comprensibles para un experto en la técnica, especialmente cuando se leen en el contexto de su uso. Por ejemplo, la frase puede significar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez, 100 o cualquier límite superior aproximadamente l0, 100 o 1000 veces superior a un límite inferior recitado. Por ejemplo, uno o más sustituyentes en un anillo de fenilo se refiere de uno a cinco, o de uno a cuatro, por ejemplo, si el anillo de fenilo está disustituido.
Como comprenderá el artesano experto, todos los números, incluyendo los que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, condiciones de reacción, etc., son aproximaciones y se entiende que están modificados opcionalmente en todos los casos por el término "aproximadamente" Estos valores pueden variar en función de las propiedades deseadas que pretendan obtener los expertos en la técnica utilizando las enseñanzas de las descripciones en el presente documento. También se entiende que tales valores contienen intrínsecamente variabilidad resultante necesariamente de las desviaciones estándar encontradas en sus respectivas mediciones de ensayo. Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular sin el modificador "aproximadamente" también forma un aspecto más.
El término "aproximadamente" puede referirse a una variación de ± 5 %, ± 10 %, ± 20 % o ± 25 % del valor especificado. Por ejemplo, "aproximadamente 50" por ciento puede, en algunas realizaciones, conllevar una variación del 45 al 55 por ciento, o como se defina de otro modo en una reivindicación concreta. Para intervalos de enteros, el término "aproximadamente" puede incluir uno o dos enteros mayores y/o menores que un entero recitado en cada extremo del intervalo. A menos que se indique lo contrario, el término "aproximadamente" pretende incluir valores, por ejemplo, porcentajes en peso, próximos al intervalo mencionado que son equivalentes en términos de funcionalidad del ingrediente, composición o realización individual. El término aproximadamente también puede modificar los puntos finales de un intervalo recitado, como se ha comentado anteriormente en este párrafo.
Como comprenderá un experto en la técnica, para todos y cada uno de los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos mencionados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos, así como los valores individuales que componen el intervalo, particularmente los valores enteros. Por lo tanto, se entiende que cada unidad entre dos unidades particulares también se divulga. Por ejemplo, si se divulgan de 10 a 15, entonces también se divulgan 11, 12, 13 y 14, individualmente y como parte de un intervalo. Un intervalo recitado (por ejemplo, porcentajes en peso o grupos de carbono) incluye cada valor específico, entero, decimal o identidad dentro del intervalo. Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como suficientemente descriptivo y permite descomponer el mismo intervalo en mitades, tercios, cuartos, quintos o décimos al menos iguales. A modo de ejemplo no limitativo, cada intervalo descrito en el presente documento puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, un tercio medio, un tercio superior, etc. Como también comprenderá un experto en la técnica, todo el lenguaje tal como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que", "más que", "o más de", y similares, incluye el número recitado y dichos términos se refieren a intervalos que pueden desglosarse posteriormente en subintervalos como se ha comentado anteriormente. Del mismo modo, todas las proporciones en el presente documento mencionadas incluyen también todas las subproporciones incluidas en la proporción más amplia En consecuencia, los valores específicos recitados para radicales, sustituyentes e intervalos son sólo ilustrativos; no excluyen otros valores definidos u otros valores dentro de intervalos definidos para radicales y sustituyentes. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, como independientemente del otro punto final.
Un experto en la técnica también reconocerá fácilmente que cuando los miembros se agrupan de una manera común, tal como en un grupo de Markush, la invención abarca no sólo todo el grupo enumerado en su conjunto, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal. Además, a todos los efectos, la invención abarca no sólo el grupo principal, sino también el grupo principal ausente uno o más de los miembros del grupo. Por lo tanto, la invención prevé la exclusión explícita de uno o más miembros de un grupo mencionado. En consecuencia, pueden aplicarse salvedades a cualquiera de las categorías o realizaciones divulgadas, en virtud de las cuales uno o más de los elementos, especies o realizaciones recitados pueden excluirse de dichas categorías o realizaciones, por ejemplo, para su uso en una limitación negativa explícita.
En algunas realizaciones, los compuestos contienen grupos hidrocarbilo sustituidos (por ejemplo, grupos alquilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo sustituidos). El término "hidrocarbilo sustituido" se refiere a un grupo hidrocarbilo en el que uno o más enlaces a un(os) carbono(s) o hidrógeno(s) se sustituyen por un enlace a átomos que no son hidrógeno ni carbono, tal como un átomo de halógeno en haluros tales como F, Cl, Br e I; un átomo de oxígeno en grupos tales como grupos hidroxilo, grupos alcoxi, grupos ariloxi y grupos éster; un átomo de azufre en grupos tales como grupos tiol, grupos alquilo y aril sulfuro, grupos sulfona, grupos sulfonilo y grupos sulfóxido; un átomo de nitrógeno en grupos tales como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas y enaminas; un átomo de silicio en grupos tales como grupos trialquilosililo, grupos dialquilosililo, grupos alquilosililo y grupos trilosililo; y otros heteroátomos en otros grupos diversos. Los grupos hidrocarbilo sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces a un átomo de carbono(s) o hidrógeno(s) se sustituyen por un enlace a un heteroátomo tal como el oxígeno en grupos carbonilo, carboxilo y éster; o el nitrógeno en grupos tales como iminas, oximas, hidrazonas y nitrilos.
En algunas realizaciones, los compuestos contienen grupos químicos con heteroátomos. Los grupos hidrocarbilo que contienen heteroátomos son fragmentos moleculares en los que uno o más átomos de carbono se sustituyen por un átomo distinto del carbono, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo o silicio. Por ejemplo, el término "heteroalquilo" se refiere a un sustituyente alquilo que contiene heteroátomos, el término "heterocíclico" se refiere a un sustituyente cíclico que contiene heteroátomos, el término "heteroarilo" se refiere a un sustituyente arilo que contiene heteroátomos, y similares.
Los términos "alquilo" y "Alk" se refieren a un grupo alquilo de cadena recta o ramificada que tiene de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono en la cadena. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser un alquilo (C1-C20), un alquilo (C1-C12), alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C6) o alquilo (C1-C4). Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo (Me), etilo (Et), n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terf-butilo(t-Bu), pentilo, isopentilo, tert-pentilo, hexilo, isohexilo, y grupos que a la luz de la habilidad ordinaria en la técnica y las enseñanzas proporcionadas en el presente documento se considerarían equivalentes a uno cualquiera de los ejemplos anteriores. Los grupos alquilo pueden ser opcionalmente sustituidos o no sustituidos, y opcionalmente parcialmente insaturados, siendo un ejemplo de grupo alquilo parcialmente insaturado un grupo alquenilo.
El término "cicloalquilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos de, por ejemplo, de 3 a 10 átomos de carbono que tienen un único anillo cíclico o múltiples anillos condensados. Los grupos cicloalquilo incluyen, a modo de ejemplo, estructuras de anillo simple tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo y similares, o estructuras de anillo múltiple tales como adamantilo, pinenilo y similares. El grupo cicloalquilo puede ser monovalente o divalente, y puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más grupos alquilo. El grupo cicloalquilo puede incluir opcionalmente uno o más citos de insaturación, por ejemplo, el grupo cicloalquilo puede incluir uno o más dobles enlaces carbonocarbono, tal como, por ejemplo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, y similares.
El término "alcoxi" se refiere al grupo alquilo-O-, donde alquilo es como se define en el presente documento. Los grupos alcoxi preferidos incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, tert-butoxi, sec-butoxi, npentoxi, n-hexoxi, 1,2-dimetilbutoxi y similares.
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico, bicíclico o tricíclico que contiene uno, dos o tres anillos aromáticos y que contiene al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático. El heteroarilo puede estar sin sustituir o sustituido, por ejemplo, con uno o más, y en particular de uno a tres, sustituyentes, tal como se describe en la definición de "sustituido". Los grupos heteroarilo típicos contienen de 2 a 20 átomos de carbono en el esqueleto del anillo, además de uno o más heteroátomos.
Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen 2H-pirrolilo, 3H-indolilo, 4H-quinolizinilo, acridinilo, benzo[b]tienilo, benzotiazolilo, p-carbolinilo, carbazolilo, cromenilo, cinolinilo, dibenzo[b,d]furanilo, furazanilo, furilo, imidazolilo, imidizolilo, indazolilo, indolisinilo, indolilo, isobenzofuranoilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, naftiridinilo, oxazolilo, perimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenarsazinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatiinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tiadiazolilo, tiantenilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo, tetrazolilo y xantenilo. En una realización, el término "heteroarilo" denota un anillo aromático monocíclico que contiene cinco o seis átomos de anillo que contienen carbono y 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno no peróxido, azufre y N(Z), donde Z está ausente o es H, O, alquilo, arilo o alquilarilo (C-i.Ca). En algunas realizaciones, heteroarilo denota un heterociclo bicíclico ortofundido de aproximadamente ocho a diez átomos de anillo derivados del mismo, particularmente un derivado bencénico o uno derivado por fusión de un diradical de propileno, trimetileno o tetrametileno.
El heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más alquilo, alquenilo, alcoxi, halo, haloalquilo, hidroxi, hidroxialquilo, arilo, heteroarilo, heterociclo, cicloalquilo, alcanoilo, alcoxicarbonilo, amino, imino, alquilamino, acilamino, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, carboxi, carboxialquilo, ceto, tioxo, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, ciano, acetamido, acetoxi, acetilo, benzamido, bencenosulfinilo, bencenosulfonamido, bencenosulfonilo, bencenosulfonilamino, benzoilo, benzoilamino, benzoiloxi, bencilo, benzoiloxi, benzoiloxicarbonilo, benciltio, carbamoilo, carbamato, isocianato, sulfamoilo, sulfinamoilo, sulfino, sulfo, sulfoamino, tiosulfo, NRxRy o COORxx, donde cada Rx y Ry son independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclo, cicloalquilo o hidroxi. Por ejemplo, el nitrógeno de cualquier anillo de indolilo puede ser N-sustituido para proporcionar un compuesto de indolilo N-alquilo, W-metilo, o N-grupo protector. Un heteroarilo también puede estar sustituido con un sustituyente como se describe en la definición de sustituyentes más adelante.
El término "heterociclo", "heterociclilo" o "heterocicoalquilo" se refiere a un sistema de anillo saturado o parcialmente insaturado, que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo del oxígeno, nitrógeno y azufre, y opcionalmente sustituido con alquilo, o C(=O)ORb, donde Rb es hidrógeno o alquilo. Típicamente, el heterociclo es un grupo monocíclico, bicíclico o tricíclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo oxígeno, nitrógeno y azufre. Un grupo heterociclo también puede contener un grupo oxo (=O) unido al anillo. Ejemplos no limitantes de grupos heterociclo incluyen 1,3-dihidrobenzofurano, 1,3-dioxolano, 1,4-dioxano, 1,4-ditiano, 2H-pirano, 2-pirazolina, 4H-pirano, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, indolinilo, isocromanilo, isoindolinilo, morfolina, piperazinilo, piperidina, piperidilo, pirazolidina, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirrolidina, pirrolina, quinuclidina y tiomorfolina. El heterociclo puede ser opcionalmente un radical divalente, proporcionando así un heterocicleno.
El heterociclo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más alquilo, alquenilo, alcoxi, halo, haloalquilo, hidroxi, hidroxialquilo, arilo, heteroarilo, heterociclo, cicloalquilo, alcanoilo, alcoxicarbonilo, amino, imino, alquilamino, acilamino, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, carboxi, carboxialquilo, ceto, tioxo, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, ciano, acetamido, acetoxi, acetilo, benzamido, bencenosulfinilo, bencenosulfonamido, bencenosulfonilo, bencenosulfonilamino, benzoilo, benzoilamino, benzoiloxi, bencil, benzoiloxi, benzoiloxicarbonilo, benciltio, carbamoilo, carbamato, isocianato, sulfamoilo, sulfinamoilo, sulfino, sulfo, sulfoamino, tiosulfo, NRxRy o COORx, donde cada Rx y Ry son independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclo, cicloalquilo o hidroxi. Un heterociclo también puede sustituirse con un sustituyente como se describe en la definición de sustituyentes más adelante.
Ejemplos de heterociclos y heteroarilos nitrogenados incluyen pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinoleína, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, morfolino, piperidinilo, tetrahidrofuranoilo y similares, así como heterociclos que contengan N-alcoxi-nitrógeno.
Protección de grupos. El término "grupo protector" se refiere a cualquier grupo que, cuando se une a un esp-centro, un hidroxilo, un nitrógeno u otro heteroátomo impide que se produzcan reacciones no deseadas en este grupo y que puede eliminarse mediante pasos químicos o enzimáticos convencionales para restablecer la fracción "no protegida", tal como un grupo alquino, hidroxilo, nitrógeno u otro heteroátomo. El grupo extraíble concreto empleado suele ser intercambiable con otros grupos en diversas rutas sintéticas. Ciertos grupos protectores que se pueden retirar incluyen sustituyentes convencionales tales como, por ejemplo, alilo, bencilo, acetilo, cloroacetilo, tiobencilo, bencilidina, fenacilo, metilmetoxi, grupos protectores de silicio ("éteres de sililo") (por ejemplo, trimetilsililo (TMS), t-butil-difenilsililo (TBDPS), triisopropilsililo (TIPS) o t-butildimetilsililo (TBS)) y cualquier otro grupo que pueda introducirse químicamente en un hidroxilo u otra fracción y eliminarse después selectivamente por métodos químicos o enzimáticos en condiciones suaves compatibles con la naturaleza del producto.
Un gran número de grupos protectores y las correspondientes reacciones químicas de escisión se describen en Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) ("Greene"). Greene describe muchos grupos protectores de nitrógeno, por ejemplo, grupos formadores de amida. En particular, véase Capítulo 1, Protecting Groups: An Overview, páginas 1-20, Capítulo 2, Hydroxyl Protecting Groups, pages 21-94, Capítulo 4, Carboxyl Protecting Groups, páginas 118-154y Capítulo 5, Carbonyl Protecting Groups,páginas 155-184. Véase también Kocienski, Philip J.; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, Nueva York, 1994). A continuación, se comentan algunos grupos protectores específicos que pueden emplearse junto con los métodos de la invención.
El término "halógeno" se refiere al cloro, flúor, bromo o yodo. El término "halo" se refiere a cloro, fluoro, bromo o yodo.
En cuanto a cualquiera de los grupos o "sustituyentes" descritos en el presente documento (por ejemplo, los grupos R1, R2, R3, R4, R5 , etc., cada uno puede incluir además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6) sustituyentes. Se entiende, por supuesto, que dichos grupos no contienen ninguna sustitución o patrones de sustitución que sean estéricamente impracticables o sintéticamente inviables.
El término "sustituido" significa que un grupo o fracción especificado puede llevar uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6) sustituyentes, tales como uno o más de los siguientes sustituyentes mencionados en este párrafo. El término "no sustituido" significa que el grupo especificado no lleva sustituyentes. El término "opcionalmente sustituido" significa que el grupo especificado está sin sustituir o sustituido por uno o más sustituyentes, y los elementos de las Fórmulas descritas en el presente documento pueden estar opcionalmente sustituidos. Cuando se utiliza el término "sustituido" para describir un sistema estructural, se entiende que la sustitución se produce en cualquier posición de valencia permitida del sistema. En los casos en que no se indique expresamente que una fracción o grupo especificado está opcionalmente sustituido o sustituido con cualquier sustituyente especificado, se entiende que dicha fracción o grupo no está sustituido en algunas realizaciones, pero puede estar sustituido en otras. En otras palabras, variables tales como R1, R2, y R3 (etc.) y sus elementos pueden sustituirse opcionalmente. En diversas realizaciones, los grupos sustituyentes adecuados (por ejemplo, en los grupos R1, R2, yvR3 y sus elementos) incluyen uno o más de alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, halo, haloalquilo, hidroxi, hidroxialquilo, arilo, aroilo, heteroarilo, heterociclo, cicloalquilo, alcanoilo, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trifluorometiltio, difluorometilo, acilamino, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, carboxi, carboxialquilo, ceto, tioxo, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfinilo, heteroarilsulfonilo, heterociclosulfinilo, heterociclosulfonilo, fosfato, sulfato, hidroxilamina, hidroxil(alquil)amina y ciano. Además, los grupos sustituyentes adecuados pueden ser, por ejemplo , -X, -R, -OH, -OR, -SR, -S-, -NR2 , -NR3, =NR, -CX3 , -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2 , =N2 , -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, - C(=O)NRR, -S(=O)2H, -S(=O)2OH, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NHR, -S(=O)R, -C(=O) R, -C(=O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR, o -C(NR)NRR, donde cada X es independientemente un halógeno ("halo"): F, Cl, Br, o I; y cada R es independientemente H, alquilo, arilo, (aril)alquilo (por ejemplo, bencilo), heteroarilo, (heteroarilo)alquilo, heterociclo, heterociclo(alquilo), o un grupo protector. Como comprenderá fácilmente un experto en la técnica, cuando un sustituyente es ceto (=O) o tioxo (=S), o similar, se sustituyen dos átomos de hidrógeno en el átomo sustituido. En ciertas realizaciones, cualquiera de los grupos anteriores puede incluirse o excluirse de una variable (por ejemplo, los grupos R2 y R3) o de un grupo de sustituyentes.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a compuestos iónicos, en los que un compuesto no iónico parental se modifica haciendo sales ácidas o básicas del mismo. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, sales minerales o de ácidos orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales convencionales no tóxicas y sales de amonio cuaternario del compuesto original formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales no tóxicas pueden incluir las derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares. Las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos pueden incluir aquellos tales como acético, 2-acetoxibenzoico, ascórbico, behénico, bencenosulfónico, benzoico, cítrico, etanosulfónico, etano disulfónico, fórmico, fumárico, gentisínico, glucarónico, glucónico, glutámico, glicólico, hidroximaleico, isetionico, isonicotínico, láctico, maleico, málico, mesilato o metanosulfónico, oxálico, pamóico (1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), pantoténico, fenilacético, propiónico, salicílico, sulfanílico, toluenosulfónico, esteárico, succínico, tartárico, bitartárico y similares. Ciertos compuestos pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con diversos aminoácidos. Para una revisión sobre sales farmacéuticamente aceptables, véase, por ejemplo, Berge et al., J. Pharm. Sci. 1977, 66(1), 1-19.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento pueden sintetizarse a partir del compuesto original, que contiene una fracción básica o ácida, mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas ácidas o básicas libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de ambos; en general, se prefieren los medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Encontrará listas de muchas sales adecuadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott, Williams & Wilkins, (2005).
El término "solvato" se refiere a un compuesto sólido que tiene una o más moléculas de disolvente asociadas a su estructura sólida. Los solvatos pueden formarse cuando un compuesto sólido se cristaliza a partir de un disolvente, en el que una o más moléculas de disolvente se convierten en parte integrante de la matriz cristalina sólida. Los compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento pueden ser solvatos, por ejemplo, solvatos de etanol. Otro tipo de disolvente es el hidrato. Un "hidrato" también se refiere a un compuesto sólido que tiene una o más moléculas de agua íntimamente asociadas a su estructura sólida o cristalina a nivel molecular. Un hidrato es un tipo específico de disolvente. Los hidratos pueden formarse cuando un compuesto se solidifica o cristaliza en agua, donde una o más moléculas de agua se convierten en parte integrante de la matriz cristalina sólida. Los compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento pueden ser hidratos.
El término "diluyente" se refiere a una sustancia farmacológicamente inerte, pero apta para el consumo humano, que sirve como excipiente en la forma farmacéutica inventiva. Un diluyente sirve para diluir el API en la forma farmacéutica inventiva, de modo que puedan prepararse comprimidos de un tamaño típico que incorporen una amplia gama de dosis reales del API.
El término "excipiente" se refiere a un ingrediente de la forma de dosificación que no es medicinalmente activo, pero que sirve para diluir el API, ayudar a la dispersión del comprimido en el estómago del paciente, unir el comprimido y cumplir otras funciones como estabilizar el API contra la descomposición.
El término "contacto" se refiere al acto de tocar, entrar en contacto o llevar a una proximidad inmediata o cercana, incluyendo a nivel celular o molecular, por ejemplo, para provocar una reacción fisiológica, una reacción química o un cambio físico, por ejemplo, en una solución, en una mezcla de reacción, in vitro o in vivo.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz para tratar una enfermedad, trastorno o afección, o para producir un efecto mencionado, tal como un efecto antifúngico. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para reducir la progresión o la gravedad de la afección o los síntomas que se están tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está al alcance de los expertos en la técnica. El término "cantidad eficaz" pretende incluir una cantidad de un compuesto descrito en el presente documento, o una cantidad de una combinación de compuestos descritos en el presente documento, por ejemplo, que sea eficaz para tratar una enfermedad o trastorno, o para tratar los síntomas de la enfermedad o trastorno, en un huésped. Por lo tanto, una "cantidad eficaz" generalmente significa una cantidad que proporciona el efecto deseado.
Los términos "que trata", "tratar" y "tratamiento" incluyen (i) inhibir la enfermedad, condición patológica o médica o detener su desarrollo; (ii) aliviar la enfermedad, condición patológica o médica; o (iii) disminuir los síntomas asociados con la enfermedad, condición patológica o médica. Por lo tanto, los términos "que trata", "tratamiento" y "tratar' pueden incluir reducir, detener o revertir la progresión o gravedad de la afección o los síntomas que se están tratando.
Los términos "inhibir", "que inhibe" e "inhibición" se refieren a la ralentización, detención o inversión del crecimiento o progresión de una enfermedad, infección, afección o grupo de células, tal como las células fúngicas. La inhibición puede ser superior a aproximadamente 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99%, por ejemplo, en comparación con el crecimiento o la progresión que se produce en ausencia del tratamiento o del contacto.
Los fármacos antifúngicos incluyen compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento, que pueden utilizarse en combinación con otros fármacos antifúngicos. En la técnica se conocen diversos fármacos antifúngicos, incluyendo imidazoles tales como oxiconazol, clotrimazol, miconazol, sulconazol y ketoconazol; alilaminas tales como naftifina y terbinafina, triazoles tales como fluconazol e itraconazol; inhibidores de la glucano sintasa tales como cilofungina; inhibidores de la quitina sintasa tales como nikkomicina Z; polienos, tales como anfotericina B, nistatina y faeriefungina; griseofulvina; derivados de morfolina, tales como amorolfina; piridonas, piridinas o piridinonas, tales como ciclopirox olamina; triazinas, tales como pirido[3,4-e]-1,2,4-triazinas; pirimidinas, tales como flucitosina; y disruptores de la pared celular fúngica, tales como equinocandina B. En diversas realizaciones, ejemplos específicos de compuestos antifúngicos útiles para la terapia de combinación incluyen amorolfina, anfotericina (por ejemplo, anfotericina B), anidulafungina, caspofungina, ciclopirox, clotrimazol, econazol, fluconazol, flucitosina, itraconazol, ketoconazol, micafungina, miconazol, naftifina, oxiconazol, posaconazol, terbinafina, terconazol, saperconazol y voriconazol.
Opcionalmente, la infección fúngica puede tratarse administrando a un sujeto que necesite un tratamiento antifúngico una cantidad eficaz de un compuesto de una fórmula descrita en el presente documento que inhiba uno de los dos bromodominios (BD1 o BD2). También puede administrarse un segundo compuesto antifúngico que inhiba el otro bromodominio, de forma concurrente o secuencial, para aumentar la eficacia del tratamiento antifúngico. Por ejemplo, los compuestos de Fórmula I (por ejemplo, MS5) pueden ser eficaces para inhibir BD1, y los compuestos de Fórmula II (por ejemplo, MS51) pueden ser eficaces para inhibir BD2, y los compuestos de estas fórmulas pueden administrarse juntos para tratar terapéuticamente una infección bacteriana.
Alternativamente, uno de los compuestos de una fórmula descrita en el presente documento puede administrarse con un fármaco antifúngico conocido, tal como fluconazol u otro fármaco antifúngico recitado en el presente documento, que sea eficaz para inhibir el otro bromodominio con mayor eficacia que el compuesto de una fórmula descrita en el presente documento. Así, los compuestos descritos en el presente documento pueden ser inhibidores de BD1, e inhibidores de BD2. Cuando los compuestos son más eficaces para inhibir un bromodominio que el otro, se puede tratar una infección fúngica administrando el inhibidor de BD1 junto con un compuesto antifúngico que sea inhibidor de BD2, y viceversa. Además, la eficacia de los fármacos antifúngicos cuya eficacia ha disminuido debido a la resistencia desarrollada por una cepa de Candida sp. puede aumentar significativamente si se administran con un inhibidor de BD2.
Métodos sintéticos generales
En general, la preparación de los compuestos y fórmulas descritos en el presente documento, y sus modificaciones, puede realizarse de acuerdo con técnicas de síntesis orgánica conocidas por los expertos en la técnica y de acuerdo con los esquemas sintéticos proporcionados en el presente documento. Cuando se desee, la síntesis de un compuesto sujeto puede comenzar con productos químicos disponibles en el mercado, a partir de compuestos descritos en la literatura química, o a partir de productos de las reacciones y métodos descritos en el presente documento. Los compuestos disponibles comercialmente pueden obtenerse de fuentes comerciales estándar, incluyendo Acros Organics (Pittsburgh, PA), Aldrich Chemical (Milwaukee, WI, incluyendo Sigma Chemical y Fluka), Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak Company (Rochester, NY), Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, PA), ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA), Lancaster Synthesis (Windham, NH), Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, NJ), TCI America (Portland, OR), Combi-Blocks, Inc. (San Diego, CA), Oakwood Products, Inc. (Estill, SC), y Wako Chemicals USA, Inc. (Richmond, VA).
Además, los métodos conocidos por un experto en la técnica pueden identificarse a través de diversos libros de referencia y bases de datos. Entre los libros y tratados de referencia adecuados que detallan la síntesis de reactivos útiles en la preparación de los agentes inhibidores descritos en el presente documento, o que proporcionan referencias a artículos que describen la preparación, se incluyen, por ejemplo, "Synthetic Organic Chemistry", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York; S. R. Sandler et al, "Organic Functional Group Preparations", 2a Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; H. O. House, "Modern Synthetic Reactions", 2a Ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif. 1972; T. L. Gilchrist, "Heterocyclic Chemistry", 2a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992; J. March, "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 4a edición, Wiley-Interscience, Nueva York, 1992y Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Greene, T.W., y Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, New York.
Otros libros de referencia y tratados adecuados que detallan la síntesis de reactivos útiles en la preparación de compuestos descritos en el presente documento, o proporcionan referencias a artículos que describen la preparación, incluyen por ejemplo, Fuhrhop, J. y Penzlin G. "Organic Synthesis: Concepts, Methods, Starting Materials", segunda edición revisada y ampliada (1994) John Wiley & Sons Is Bn : 3-527-29074-5; Hoffman, R. V. "Organic Chemistry, An Intermediate Text" (1996) Oxford University Press, ISBN 0-19-509618-5; Larock, R. C. "Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations" 2a edición (1999) Wiley-VCH, ISBN: 0-471-19031­ 4; March, J. "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure" 4a edición (1992) John Wiley & Sons, ISBN: 0-471-60180-2; Patai, S. "Patai's 1992 Guide to the Chemistry of Functional Groups" (1992) Interscience ISBN: 0-471-93022-9; Solomons, T. W. G. "Organic Chemistry" 7a edición (2000) John Wiley & Sons, ISBN: 0-471­ 19095-0; "Industrial Organic Chemicals: Starting Materials and Intermediates: An Ullmann's Encyclopedia" (1999) John Wiley & Sons, ISBN: 3-527-29645-X, en 8 volúmenes; "Organic Reactions" (1942-2000) John Wiley & Sons, en más de 55 volúmenes; y "Chemistry of Functional Groups" John Wiley & Sons, en 73 volúmenes.
A continuación se proporcionan varios métodos ejemplares para la preparación de los compuestos de la invención. Estos métodos tienen por objeto ilustrar la naturaleza de tales preparaciones y no limitar el alcance de los métodos aplicables. Otras variaciones, tales como la adición de diversos sustituyentes (por ejemplo, como se han definido anteriormente y en el presente documento) en diversos grupos alquilo, arilo o heterociclo, se incluyen en el ámbito de la invención. Los materiales de partida, los sustituyentes y los grupos que contienen sustituyentes pertinentes pueden adquirirse normalmente a los proveedores comerciales citados anteriormente (por ejemplo, a Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI) o pueden prepararse en unos pocos pasos estándar a partir de materiales disponibles en el mercado. Hermanson describe una serie de técnicas útiles para preparar e instalar sustituyentes en el núcleo de una molécula en Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson. Academic Press, San Diego, CA. 1996).
Formulaciones antifúngicas
En algunas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse como composiciones farmacéuticas. La composición farmacéutica contendrá típicamente un portador fisiológicamente aceptable o un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden incluir un segundo fármaco antifúngico, o un adyuvante antifúngico, tal como un aceite esencial o un extracto de aceite esencial. Entre los aceites y extractos adecuados que pueden utilizarse en combinación con los compuestos descritos en el presente documento se incluyen las sustancias terapéuticamente activas descritas en Publicación PCT No. WO 2006/120565 (Remmal), tales como carveol, timol, eugenol, borneol, carvacrol, alfa-ionona, beta-ionona, así como isómeros, derivados y mezclas de los mismos.
Aunque la administración oral es una vía de administración deseada, también se contemplan otros medios de administración tal como la administración nasal, tópica (por ejemplo, administración a la piel o al ojo) o rectal, o por inyección o inhalación. Dependiendo del modo de administración previsto, las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas, tal como, por ejemplo, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, gotas, pomadas, cremas o lociones, preferentemente en forma de dosificación unitaria adecuada para la administración única de una dosificación precisa. Las composiciones pueden incluir una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable y, además, pueden incluir otros agentes farmacéuticos tales como diversos adyuvantes, diluyentes, tampones u otros agentes antivirales, y similares. De este modo, el compuesto puede administrarse en formulaciones de dosificación que contengan portadores, adyuvantes y vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables. La cantidad de compuesto activo administrada dependerá del sujeto tratado, de su peso, de la forma de administración y del criterio del médico prescriptor.
Para las composiciones sólidas, los portadores sólidos no tóxicos convencionales incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables pueden, por ejemplo, prepararse disolviendo, dispersando, etc., un compuesto activo tal como se describe en el presente documento y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un excipiente, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar así una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar puede contener también pequeñas cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo, acetato sódico, mono-laurato de sorbitán, acetato de trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc. Los métodos reales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en la técnica.
Para la administración oral, la composición adoptará generalmente la forma de un comprimido o cápsula, o puede ser una solución acuosa o no acuosa, suspensión o jarabe. Los comprimidos y cápsulas para uso oral incluirán generalmente uno o más portadores de uso común, tales como la lactosa y el almidón de maíz. También suelen añadirse agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Cuando se utilizan suspensiones líquidas, el agente activo puede combinarse con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir aromatizantes, colorantes o edulcorantes. Otros componentes opcionales para incorporar a una formulación oral incluyen conservantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y similares.
En consecuencia, los compuestos descritos en el presente documento pueden utilizarse para preparar composiciones farmacéuticas terapéuticas, por ejemplo, combinando los compuestos con un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Los compuestos pueden añadirse a un portador en forma de sal o solvato. Por ejemplo, en los casos en que los compuestos son suficientemente básicos o ácidos para formar sales estables no tóxicas de ácido o de base, la administración de los compuestos como sales puede ser apropiada. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son las sales de adición de ácidos orgánicos formadas con ácidos que forman un anión fisiológicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartrato, succinato, benzoato, ascorbato, a-cetoglutarato y p-glicerofosfato. También pueden formarse sales inorgánicas adecuadas, incluyendo las sales de clorhidrato, haluro, sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.
Las sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse utilizando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto suficientemente básico, tal como una amina, con un ácido adecuado para proporcionar un compuesto iónico fisiológicamente aceptable. Las sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o alcalinotérreos (por ejemplo, calcio) de ácidos carboxílicos también pueden prepararse por métodos análogos.
Los compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento pueden formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente humano, en una variedad de formas. Las formas pueden adaptarse específicamente a una vía de administración elegida, por ejemplo, administración oral o parenteral, por vía intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea.
Los compuestos descritos pueden administrarse sistémicamente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Para la administración oral, los compuestos pueden encerrarse en cápsulas de gelatina dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente a los alimentos de la dieta del paciente. Los compuestos también pueden combinarse con uno o más excipientes y utilizarse en forma de comprimidos que se pueden ingerir, comprimidos bucales, troques, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones suelen contener al menos 0,1 % de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variar y puede ser convenientemente de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 25 %, o de aproximadamente 2 % a aproximadamente 10 %, del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles puede ser tal que pueda obtenerse un nivel de dosificación eficaz.
Los comprimidos, trozos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener uno o más de los siguientes elementos: aglutinantes tales como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrador tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; y un lubricante tal como estearato de magnesio. Puede añadirse un edulcorante, tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo, o un aromatizante, tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros materiales diversos pueden estar presentes tal como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma farmacéutica unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propil parabenos como conservantes, un colorante y aromatizantes como el sabor a cereza o naranja. Cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo (es decir, un compuesto antifúngico descrito en el presente documento) puede incorporarse a preparados y dispositivos de liberación sostenida.
El compuesto activo puede administrarse por vía intravenosa o intraperitoneal mediante infusión o inyección. Las soluciones del compuesto activo o sus sales pueden prepararse en agua, opcionalmente mezcladas con un tensioactivo no tóxico. Las dispersiones pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina o mezclas de los mismos, o en un aceite farmacéuticamente aceptable. En condiciones normales de almacenamiento y uso, los preparados pueden contener un conservante para evitar la proliferación de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones acuosas estériles, dispersiones o polvos estériles que comprenden el principio activo adaptado para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables o infusibles estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. La forma farmacéutica final debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un disolvente o medio de dispersión líquido que comprenda, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos u otros agentes antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, opcionalmente seguido de esterilización por filtración. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación pueden incluir técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado presente en la solución.
Para la administración tópica, los compuestos pueden aplicarse en forma pura, por ejemplo, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente será deseable administrar el agente activo a la piel como una composición o formulación, por ejemplo, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido, un líquido, un gel o similares. Si se desea, la formulación tópica que contiene el fármaco antifúngico puede incluir una ciclodextrina tal como la hidroxipropil-p-ciclodextrina para mejorar la hidrosolubilidad del fármaco antifúngico.
Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los portadores líquidos útiles incluyen agua, dimetilsulfóxido (DMSO), alcoholes, glicoles o mezclas de agua-alcohol/glicol, en los que un compuesto puede disolverse o dispersarse a niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de tensioactivos no tóxicos. Pueden añadirse coadyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales (tales como aceites esenciales o extractos de aceites esenciales) para optimizar las propiedades para un uso determinado. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse a partir de almohadillas absorbentes, utilizarse para impregnar vendas y otros apósitos, o pulverizarse sobre la zona afectada mediante un pulverizador de bomba o aerosol.
Los espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados también pueden emplearse con portadores líquidos para formar pastas untables, geles, pomadas, jabones y similares, para su aplicación directa sobre la piel del usuario.
Ejemplos de composiciones dermatológicas para administrar agentes activos a la piel son conocidos en la técnica; por ejemplo, véase las Patentes de EE. UU. Nos. 4,992,478 (Geria), 4,820,508 (Wortzman), 4,608,392 (Jacquet et al.), y 4,559,157 (Smith et al.). Dichas composiciones dermatológicas pueden utilizarse en combinaciones con los compuestos descritos en el presente documento, en las que un ingrediente de dichas composiciones puede sustituirse opcionalmente por un compuesto descrito en el presente documento, o puede añadirse a la composición un compuesto descrito en el presente documento.
Las dosis útiles de los compuestos descritos en el presente documento pueden determinarse comparando su actividad in vitro e in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones, y otros animales, a los humanos son conocidos en la técnica; por ejemplo, véase la Patente de EE.UU No. 4,938,949 (Borch et al). La cantidad de un compuesto, o de una sal o derivado activo del mismo, necesaria para su uso en el tratamiento variará no sólo con el compuesto o sal concreto seleccionado, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección tratada y la edad y estado del paciente, y quedará en última instancia a discreción del médico o clínico que lo atienda.
Una dosis adecuada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal al día, tal como 3 a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal del receptor al día, en el intervalo de 6 a 90 mg/kg/día, o en el intervalo de 15 a 60 mg/kg/día.
Un compuesto descrito en el presente documento puede formularse convenientemente en forma de dosificación unitaria; por ejemplo, conteniendo 5 a 1000 mg, de aproximadamente 10 a 750 mg, o de aproximadamente 50 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. En una realización, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto formulado en tal forma de dosificación unitaria. La dosis deseada puede presentarse en una sola dosis o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis al día. La propia subdosis puede dividirse, por ejemplo, en varias administraciones discretas poco espaciadas, tales como múltiples inhalaciones con un insuflador o mediante la aplicación de varias gotas en el ojo.
La invención proporciona compuestos y composiciones para su uso en métodos terapéuticos de tratamiento de una infección fúngica en un mamífero, que implican administrar a un mamífero que tiene una infección fúngica una cantidad eficaz de un compuesto o composición descritos en el presente documento. Un mamífero incluye un primate, humano, roedor, canino, felino, bovino, ovino, equino, porcino, caprino, bovino y similares.
La capacidad de un compuesto de la invención para tratar una infección fúngica puede determinarse mediante ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el diseño de protocolos de tratamiento, la evaluación de la toxicidad, el análisis de datos y la cuantificación de la muerte celular fúngica son bien conocidos en la técnica.
Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar la invención anterior y no deben interpretarse como una limitación de su alcance. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los Ejemplos sugieren muchas otras formas en las que podría practicarse la invención.
Ejemplo 1. Cribado y evaluación de compuestos antifúngicos
Las infecciones fúngicas invasivas son una causa importante de mortalidad y morbilidad entre los individuos inmunodeprimidos. Sin embargo, el número limitado de fármacos antifúngicos y la creciente prevalencia de cepas farmacorresistentes plantean la necesidad urgente de nuevas estrategias terapéuticas. El factor 1 de bromodominio (BDF1) es un factor de transcripción fúngica de la familia de los bromodominios y dominios extraterminales (BET), en Candida albicans, un patógeno nosocomial muy extendido. BDF1 se investigó como se describe en el presente documento. Los resultados de la investigación indican que BDF1 es esencial en C. albicans y que las mutaciones que inactivan los bromodominios de BDF1 conducen a una pérdida de viabilidad in vitro y a una disminución de la patogénesis en un modelo de ratón de candidiasis.
El análisis estructural y la resistencia a los inhibidores BET humanos revelan diferencias pronunciadas entre las bolsas de unión al ligando de los bromodominios Bdf1 y BET humanos. El cribado químico identificó compuestos de moléculas pequeñas que inhiben la actividad de unión a acetilpéptidos de Bdfl C. albicans con una selectividad de hasta unas 100 veces sobre los bromodominios BET humanos, incluyendo compuestos que fenocopian los efectos de las mutaciones inactivadoras de los bromodominios Bdfl. La selectividad se debe a los residuos del sitio activo que en Bdfl tienen cadenas laterales cortas compatibles con la unión del inhibidor y que corresponden a residuos más voluminosos que dificultan estéricamente la unión del inhibidor en las proteínas BET humanas. Estos hallazgos demuestran el potencial de la inhibición epigenética del dominio lector como estrategia antifúngica novedosa e identifican los bromodominios Bdfl como una nueva y prometedora quimioterapéutica objetivo que puede inhibirse selectivamente sin antagonizar la función BET humana.
Las infecciones fúngicas invasoras son un importante problema sanitario mundial, con hasta dos millones de casos estimados anualmente en todo el mundo1. Se estima que la candidemia, la meningitis criptocócica, la aspergilosis invasiva y la neumonía por pneumocystis causan en conjunto más de 800.000 muertes al año [ref 2 y referencias en las mismas]. Las especies de Candida son, con diferencia, los principales patógenos nosocomiales, con una tasa de mortalidad del 30-40 %. Entre las especies de Candida , C. albicans y C. glabrata ocupan el primer y segundo lugar en frecuencia de aislamiento, respectivamente, y juntas son responsables de aproximadamente 70 % de todas las candidiasis sistémicas3. Los elevados costes hospitalarios de los pacientes con candidemia suponen una carga farmacoeconómica considerable4. Las estrategias terapéuticas actuales para combatir las infecciones fúngicas invasivas se dirigen a la integridad de la membrana celular fúngica (fármacos polienos), o inhiben la síntesis de ergosterol (azoles), ácidos nucleicos (flucitosina) o la pared celular fúngica (equinocandinas)5. La aparición de resistencia adquirida a los fármacos por parte de muchas cepas fúngicas, así como la toxicidad, el elevado coste y el estrecho espectro de actividad del limitado repertorio de fármacos disponibles, han conducido a una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos.1, 6, 7, 8, 9
Hasta la fecha, se ha investigado un pequeño número de proteínas de la cromatina como posibles objetivosantifúngicos10. Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC) tienen una actividad antifúngica débil cuando se utilizan solos, pero sinergizan con otros agentes antifúngicos, tal como los azoles y las equinocandinas11-14. Un estudio reciente investigó el dominio KIX de la subunidad Med15 del complejo Mediator, que interactúa con el factor de transcripción de resistencia pleiotrópica a fármacos (Pdr1) en Candida glabrata15. Un inhibidor dirigido a la interfaz dominio KIX-Pdfl resensibilizó las cepas resistentes a los antifúngicos existentes. En el presente estudio, se investigó un dominio lector epigenético, el bromodominio (BD) de la familia BET (bromo- y dominio extra-terminal), como objetivo antifúngico potencialmente novedoso.
Las proteínas BET son factores asociados a la cromatina que regulan la transcripción génica y la remodelación de lacromatina16 Los miembros humanos de esta familia son Brd2, Brd3, Brd4 y Brdt (Fig. 3a). Las proteínas BET se unen a la cromatina a través de sus dos bromodominios (BD1 y BD2), pequeños dominios helicoidales que reconocen específicamente las histonas acetiladas en residuos de lisina. Mientras que los bromodominios canónicos se unen a péptidos de histona monoacetilados, los bromodominios BET poseen una bolsa de unión al ligando más amplio que les permite reconocer péptidos de histona diacetilados1718. Los inhibidores de moléculas pequeñas, tales como JQ1 e I-BET, que se dirigen selectivamente a los bromodominios BET, se han utilizado para validar la inhibición de los bromodominios BET como estrategia terapéutica contra el cáncer y otras afecciones médicas 1619-22.
La proteína fúngica BET Bdfl ha sido caracterizada como un regulador transcripcional global en la levadura en ciernes S. cerevisiae. Bdfl se asocia con las histonas acetiladas H3 y H42324 y con el factor de transcripción general TFIID25, regula la transcripción de más de 500 genes23, es una subunidad del complejo de remodelación de la cromatina SWR1 que media en el mantenimiento de la eucromatina y antisilenciador26 y es importante para la compactación de la cromatina durante laesporulación27 y para la respuesta a la tensión salina28. Además de BDF1, S. cerevisiae posee un segundo gen de la familia BET, BDF2 , que es en parte funcionalmente redundante con BDF125-29-30.
La alteración de BDF1 causa graves defectos morfológicos y de crecimiento, mientras que la deleción tanto de BDF1 como de BDF2 es letal 232431-33. Las mutaciones puntuales que suprimen la unión del ligando por los bromodominios BD1 y BD2 de Bdfl provocan defectos de crecimiento y afectan a la mayoría de los transcritos alterados por la disrupción de todo el gen23. Muchos hongos patógenos, incluyendo C. albicans, carecen de BDF2, lo que plantea la posibilidad de que la inhibición del bromodominio de la única proteína de la familia BET, Bdfl, pueda reducir significativamente la viabilidad y la virulencia.
RESULTADOS.
La funcionalidad de la BD Bdfl es esencial en C. albicans.
Para investigar la función de Bdfl BD en C. albicans, primero se verificó la actividad de unión a ligando de los dominios individuales. Una matriz de péptidos de histonas mostró que tanto BD1 como BD2 reconocen formas multiacetiladas de la histona H4 (Fig. 3b, 3c), mostrando la mayor afinidad por un péptido H4 tetraacetilado en las lisinas 5, 8, 12 y 16 (en lo sucesivo denominado H4ac4). El reconocimiento del péptido H4ac4 por ambas BD se confirmó en un ensayo desplegable (Fig. 3d). Se reemplazó un residuo de tirosina conservado en la bolsa de unión al ligando de cada BD por fenilalanina, una mutación conocida por comprometer la actividad de unión al ligando en otras proteínas BET23. Estas dos mutaciones "YF" (Y248F e Y425F) abolieron la unión a péptidos H4 acetilados (Fig. 3b-d y Fig.
4b, 4c), confirmando la especificidad del reconocimiento peptídico. A diferencia de las proteínas BET humanas, en las que las dos BD reconocen diferentes acetilpéptidos de histona, los resultados anteriores revelan que las dos BD de CaBdf1tienen una selectividad de unión a ligando similar, lo que sugiere un cierto grado de redundancia entre estos dos dominios.
A continuación, se preguntó si la función CaBdf1 BD era importante para la viabilidad de C. albicans, un diploide obligado. Se generó un mutante de deleción heterocigótico para BDF1 en la cepa SC5314, pero no se pudo obtener un mutante de deleción homocigótico, lo que indica que BDF1 es un gen esencial (la cepa heterocigótica no mostró ningún fenotipo significativo). Para verificar la esencialidad, se utilizó un promotor condicional para controlar la expresión Bdfl a partir del segundo alelo. Se utilizaron dos enfoques, con un promotor sensible a la metionina o un casete regulado por tetraciclina de nueva ingeniería.
La expresión génica dependiente de tetraciclina en C. albicans requiere la integración de dos fragmentos independientes en el genoma 3435. Se diseño un casete que contenía todos los elementos reguladores necesarios: el efector TetR-VP16, un marcador selectivo ARG4 y un operador Tet, y se insertó corriente arriba del ORF de BDF1 para generar la cepañbdf1/pTetO-BDF1 (Fig. 5a). En ausencia del compuesto de tetraciclina doxiciclina (Dox), este promotor permite la expresión de Bdfl, aunque a un nivel más débil que el promotor endógeno de BDF1 (Fig.5b), como revela la inmunotransferencia con un anticuerpo policlonal desarrollado para permitir la detección específica de CaBdf1 (Fig. 4c, 4d). El crecimiento de la cepañbdf1/pTetO-BDF1 se vio gravemente comprometido cuando se reprimió la expresión de BDF1 mediante la adición de Dox (Fig. 5c). El fenotipo fue rescatado mediante la reintroducción de una copia funcional de BDF1 (cepa BDF1-R/pTetO-BDF1), lo que confirma que Bdfl es esencial en C. albicans.
Utilizando el sistema Tet-APAGADO para la expresión Dox-reprimible de Bdfl, se evaluó a continuación el papel de Bdfl en un modelo de ratón de candidiasis invasiva. Los ratones inyectados con C. albicans WT o con la cepa BDF1- R/pTetO-BDF1 mostraron una elevada carga fúngica (>50.000 UFC/g) en el riñón 7 días después de la infección (Fig.
5d). En ausencia de Dox, la carga fúngica de la cepa bdf1A/pTetO-BDF1 se redujo significativamente (~1000 UFC/g). Esta disminución está probablemente relacionada con el fenotipo de crecimiento lento de esta cepa debido a un nivel reducido de Bdfl. En presencia de Dox, la carga fúngica quedó esencialmente abolida, lo que concuerda con la letalidad in vitro de la deleción de BDF1 . Estos datos confirman que Bdfl es fundamental para la virulencia in vivo.
Para verificar la importancia de la función BD para el crecimiento fúngico, se generaron cepas en las que BD1 y BD2 en el alelo Bdfl Dox-reprimible fueron inactivadas por deleción de dominio o por mutación de residuos conservados Tyr y Asn implicados en la unión del ligando. Las cepas en las que se inactivaron tanto BD1 como BD2 crecieron tan mal como el mutante de deleción condicional, mientras que las cepas en las que sólo se inactivó un único BD mostraron defectos de crecimiento más leves (Fig. 5e). Estos últimos defectos fueron más graves con la inactivación de BD2 que con la de BD1 y se acentuaron con el tratamiento de choque térmico. Otros ensayos para evaluar la resistencia a la tensión (cafeína) o la integridad de la pared celular no revelaron ningún fenotipo evidente. Las tasas de crecimiento medidas para las cepas anteriores en un ensayo líquido recapitularon los fenotipos observados en medios sólidos (Fig.
5f). También se utilizó un promotor reprimido con metionina como enfoque ortogonal para regular la expresión de un alelo de BDF1 (Fig. 6a). Los datos obtenidos in vitro en medios sólidos o en crecimiento líquido confirmaron los resultados obtenidos con el sistema de tetraciclina (Fig. 6b). En conjunto, estos resultados demuestran que la supervivencia de C. albicans in vitro e in vivo depende críticamente de la presencia de Bdfl que tengan al menos una b D funcional. Las Tablas 1 y 2 describen los plásmidos y las cepas utilizados en este estudio.
Tabla 1. Plásmidos utilizados en este estudio.
Nombre Número Padres Descripción
5'BDF1-HIS1- pJG197 pCR2.1 TOPO que contiene el marcador HIS1 3'BDF1 flanqueado por la secuencia BDF1 corriente arriba y corriente abajo.
bdf1-LEU2 pJG214 pCR2.1 TOPO que contiene BDF1 ORF fusionado al marcador LEU2.
bdf1-bd1A pJG224 pCR2.1 TOPO que contiene la secuencia bdf1-bd1A fusionada al marcador LEU2
bdf1-bd2A pJG225 pCR2.1 TOPO que contiene la secuencia bdf1-bd2A fusionada al marcador LEU2
bdf1-bd1A-bd2A pJG226 pCR2.1 TOPO que contiene la secuencia bdf1-bd1A-bd2A fusionada al marcador LEU2
bdf1-bd1Y266F- pJG215 pJG214 pCR2.1 TOPO que contiene la secuencia bdf1-bd1Y266F LEU2 fusionada al marcador LEU2
bdf1-bd2Y425F- pJG216 pJG214 pCR2.1 TOPO que contiene la secuencia bdf1-bd2Y425F LEU2 fusionada al marcador LEU2
bdf1-bd1Y248F- pJG217 pJG215 pCR2.1 TOPO que contiene la secuencia bdfl -bd2Y425F-LEU2 bd1Y248F-bd2Y425F fusionada al marcador LEU2
ARG4-pTetO-bdf1 pJG254 pCR2.1 TOPO con marcador ARG4, tTA-TetR-VP16,
pTet y BDF1
Casete para transformar, primera entrada = PCR; última entrada, digestión con Xhol; todas las demás, digestión con Apal.
_______________________ Tabla 2. Cepas utilizadas en este estudio.
Nombre Número Padres Genotipo
SN152 SN152 SC5314 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, his1D/his1D,
arg4D/arg4D,leu2D/leu2D
bdflA / pTetO- JG105 SN152 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, BDF1:pTetO-BDF1-BDF1 ARG4/bdf1::HIS1,leu2D/leu2D
BDF1-R / pTetO- JG108 yCaJG105 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdf1::pTetO-BDF1-BDF1 ARG4/bdf1::BDF1-R-LEU2,his1D/his1D
bdf1-bd1A / JG120 yCaJG105 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdf1::pTetO-BDF1-pTetO-BDF1 ARG41bdf1::bdf1-bd1A-LEU2,his1D/his1D
bdf1-bd2A / JG123 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdf1::pTetO-BDF1-pTetO-BDF1 yCaJG105 ARG4/bdf1::bdf1-bd2A-LEU2,his1D/his1D
bdf1-bd1A-bd2A/ JG127 yCaJG105 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdf1::pTetO-BDF1-pTetO-BDF1 ARG4/bdf1::bdf1-bd1A-bd2A-LEU2,his1D/his1D
(continuación)________________________________ Nombre Número Padres Genotipo
bdf1- JG111 yCaJG105 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdf1::pTetO-BDF1-bd1Y248F/ ARG4/bdf1::bdf1-bd1Y248F-LEU2,his1D/his1D
pTetO-BDF1
bdf1- JG114 yCaJG105 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdf1::pTetO-BDF1-Bd2Y425F/ ARG4/bdf1::bdf1 -Bd2Y425F-LEU2,his1D/his1D
pTetO-BDF1
bdf1- JG117 yCaJG105 ura3D-iroDimm/URA3-IRO1, bdfl:: pTetO-BDF1-bd1Y248F- ARG4/bdf1::bdf1-bd1Y248F-Bd2Y425F-bd2Y425F/ LEU2,his1D/his1D
pTetO-BDF1
Referencia, primera entrada, PMC549318, todas las demás, este estudio.
La bolsa de unión al ligando de las BET BD humanas y fúngicas son estereoquímicamente distintos.
Una consideración clave para establecer la inhibición de la BET BD fúngica como una estrategia quimioterapéutica factible es si estos dominios pueden ser el objetivo de inhibidores de moléculas pequeñas sin antagonizar la función BET humana. Para comprobar la similitud entre las cavidades de unión del ligando de C. albicans y las BD BET humanas, se hace la pregunta si los inhibidores BET humanos podían inhibir las CaBdfl BD . Se utilizó un ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) (Fig . 7) para evaluar la capacidad de los inhibidores BET JQ1, PFI-1, IBET-151 y bromosporina para inhibir la unión de BD a un péptido H4ac4 (Fig. 8a). Los cuatro inhibidores inhibieron eficazmente la Brd4 BD1 y BD2 humana, con valores de IC50 en el intervalo bajo de nM (3-95 nM), en consonancia con los resultados comunicados anteriormente.
Por el contrario, las CaBdf1 BD fueron significativamente menos sensibles a los cuatro inhibidores, con valores de IC50 que oscilaron entre 0,3 y >10 pM, lo que implica una reducción de 2-3 órdenes de magnitud en relación con la BD correspondiente de Brd4. La inhibición más fuerte (IC50 de ~300 nM) se observó para IBET-151 en BD1 CaBdfl y para el inhibidor pan-BET bromosporina en CaBdfl BD2, que sin embargo corresponde a una reducción de 60 o 20 veces en la sensibilidad relativa a Brd4. Estos resultados se verificaron en mediciones de barrido fluorimétrico diferencial (DSF), que aprovechan el hecho de que la unión del inhibidor aumenta la estabilidad térmica de las bromodominios BET.
Mientras que los cuatro inhibidores aumentaron sustancialmente la temperatura de fusión (Tm) de Brd4 BD1 humana (en 6,7-11,5 °C), los valores de Tm de las BD fúngicas sólo aumentaron ligeramente (en 1,0-3,8 °C), lo que indica una baja afinidad, con la excepción de IBET-151 y bromosporina en CaBdf1 BD1 y BD2, respectivamente (valores de ATm de ~7 °C). Estos resultados se confirmaron en el caso de JQ1 mediante calorimetría de valoración isotérmica (ITC): mientras que JQ1 se unía fuertemente a Brd4 BD1(Kd de 62 ± 16 nM), como era de esperar, no se detectó ninguna unión ni a BD1 ni a BD2 de CaBdf1. Además, ninguno de los inhibidores BET tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento de C. albicans in vitro, incluyendo los dos inhibidores (IBET-151 y bromosporina) con los valoresIC50 más bajos (Fig. 8d). Los resultados anteriores indican que las bolsas de unión al ligando deCaBdfl poseen características estructurales distintas de las de sus homólogos humanos, que podrían ser objeto de inhibidores selectivos de moléculas pequeñas. Para identificar estas características distintivas, determinamos las estructuras cristalinas de BD1 y BD2 de S. cerevisiae y C. albicans Bdfl (ver Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/366.973 para las estadísticas cristalográficas).
S. cerevisiae Bdfl se incluyó en este análisis porque es filogenéticamente más cercano que CaBdf1 a los ortólogos de varios hongos patógenos (por ejemplo, C. glabrata y A. fumigatus. Fig. 3a), y por tanto informa sobre la idoneidad de dirigirse a Bdfl en otras especies fúngicas. Al igual que los bromodominios canónicos, cada una de las cuatro BD fúngicas comprende un haz zurdo de cuatro hélices (aZ, aA, aB y aC) con los bucles ZA y BC definiendo la bolsa de unión del ligando (Fig. 9a). Las estructuras fúngicas se asemejan mucho a las de las correspondientes BD BET humanas, con un valor RMSD medio por pares para los átomos Ca de <1,7 A y <1,2 A en la totalidad de los dominios BD1 y BD2, respectivamente, y de 0,5 y 1,4 A (C. albicans) o 1,0 y 1,8 A (S. cerevisiae ) dentro de los bucles de unión del ligando BD1 y BD2, respectivamente. La mayoría de los residuos de la bolsa de unión al ligando, incluyendo cuatro moléculas de agua estructuradas importantes para el reconocimiento del ligando, se conservan entre los ortólogos humanos y fúngicos. Sin embargo, varios residuos difieren en identidad o localización espacial, dando lugar a diferencias significativas en las propiedades estereoquímicas de la bolsa de unión del ligando (Fig. 9b) (c.f ref36). La superposición de la estructura de Brd4 BD1 unida a JQ1 con las estructuras fúngicas BET BD1 revela por qué estas últimas son insensibles a JQ1. El análisis de la secuencia de las proteínas Bdfl de los hongos patógenos más prevalentes revela que todas difieren de las proteínas ortólogas humanas en posiciones clave dentro de los bucles ZA y BC (véase la Fig. 17 de la Solicitud de Patente Provisional No. 62/3/3.973.2). En conjunto, los datos estructurales y filogenéticos anteriores indican que los bromodominios BET fúngicos pueden ser un objetivo factible con alta selectividad en relación con los bromodominios BET humanos.
Ataque selectivo de las Bdfl BD mediante inhibidores de moléculas pequeñas.
Para establecer una prueba de principio, se propuso identificar un inhibidor de molécula pequeña que se dirigiera selectivamente a las Bdfl BD de C. albicans sin inhibir las BET BD humanas. Se utilizó el ensayo de inhibición HTRF para analizar una biblioteca químicamente diversa de 80.000 compuestos, lo que dio lugar a la identificación de varios cientos de resultados para cada BD (Fig. 10a). Las curvas dosis-respuesta medidas para las CaBdfl y Brd4 BD identificaron aproximadamente 100 y 44 compuestos selectivos para las BD1 y BD2 fúngicas, respectivamente, definidas por una diferencia >20 veces en el valor IC50 en relación con la BD humana. Entre ellos se encontraban varios compuestos de dibenzotiazepinona, que mostraron valores de IC50 entre 0,4 y 7 pM hacia Bdfl BD1, pero no mostraron inhibición alguna o sólo una inhibición débil de Brd4 BD1 a la concentración más alta probada (20 pM) (Fig.
11).
Para determinar la base molecular de la selectividad se determinó la estructura cristalina de Bdfl BD1 de C. albicans unida a uno de estos inhibidores, el compuesto MS4, que además del andamiaje dibenzotiazepinona lleva grupos ciclopropilo, oxadiazol y pirazina (Fig. 10b). Las mediciones ITC mostraron que MS4 se une a CaBdfl BDIcon una Kd de ~5 pM, coherente con el valor IC50 determinado (4,3 pM). En cambio, no se detectó ninguna unión significativa para Brd4-BD1 y sólo se observó una modesta inhibición para CaBdfl BD2 (Fig. 10c, 10d). La estructura de CaBdfl-BD1 unida a MS4 se resolvió con una resolución de 1,7 A y contiene cuatro complejos BD/inhibidor en la unidad asimétrica. Las moléculas dibenzotiazepinona y ciclopropilo se sitúan en la profundidad de la bolsa de unión del ligando y su reconocimiento se conserva en los cuatro complejos (Fig. 10e-f y Fig. 12).
En contraste, los grupos oxadiazol y pirazina sobresalen de la bolsa en diferentes orientaciones y median interacciones (incluyendo contactos cristalinos) que varían entre las cuatro copias. Los dos anillos bencénicos unidos a la tiazepinona central están orientados casi ortogonalmente entre sí, lo que confiere al andamiaje un aspecto en forma de L. Esta fracción encaja perfectamente en una cavidad en forma de L que contacta con 4 residuos hidrófobos (V215, L220, V222 y F267) por un lado y una prolina (P210) por el otro. El grupo ciclopropilo encaja en una bolsa poco profunda definida por este residuo Pro y por otros tres residuos hidrófobos (C264, 1274, F211). En la base de esta cavidad, los residuos Asn268 y Tyr225 de los bucles BC y ZA forman enlaces de hidrógeno directos y mediados por agua con el grupo carbonilo de la tiazepinona, respectivamente. La estructura unida se parece mucho a la estructura no unida de CaBdf1-BD1, con la notable excepción de que el residuo Ile274 adopta una conformación de cadena lateral diferente para acomodar el grupo ciclopropilo. La superposición de la estructura de hBrd4 muestra que dos residuos de Brd4, Trp81 y Leu94, obstaculizan estéricamente la unión de MS4. Estos residuos corresponden a residuos de CaBdfl con cadenas laterales más pequeñas (V209 y V222) que son compatibles con la unión de MS4, lo que explica la base de la selectividad del inhibidor para la BD fúngica.
A continuación se probó el efecto de los compuestos hit identificados sobre el crecimiento de C. albicans in vitro. Varios compuestos que mostraron una selectividad significativa hacia CaBdfl, incluyendo MS4, tuvieron poco efecto. Por lo tanto, se probaron compuestos que inhibían CaBdf1-BD1 con valores micromolares de IC5 0 , pero que no eran selectivos o sólo eran débilmente selectivos para la BD fúngica. Estos compuestos incluyen MS5, que en comparación con MS4, carece del grupo ciclopropilo y tiene grupos carboxiamidilo y tetrahidrofurano en lugar de los anillos oxadiazol y pirazina más grandes (Fig. 13a). Los ensayos HTRF e ITC muestran que MS5 inhibe CaBdf1-BD1 con baja afinidad micromolar, presenta una selectividad de 3 a 5 veces con respecto a Brd4-BD1 humana y sólo tiene un débil efecto inhibitorio sobre CaBdf1-BD2 (Fig. 13b, 13c). Los ensayos de crecimiento en cultivo líquido muestran que, en comparación con el vehículo (DMSO), MS5 tiene poco efecto sobre el crecimiento de cepas de C. albicans que expresan WT Bdfl o Bdfl mutante inactivado en la primera BD, lo que concuerda con la especificidad de este compuesto para BD1 y con la observación de que una sola copia funcional de BD2 es suficiente para permitir un crecimiento adecuado (Fig. 3e).
En contraste, MS5 comprometió significativamente el crecimiento de cepas inactivadas en BD2 (Fig. 13d). Una curva dosis-respuesta reveló un valor IC50 de 40 pM, que es aproximadamente 8 veces superior a la Kd determinada in vitro (Fig. 13c). Esta discrepancia puede deberse a que el MS5 atraviesa de forma ineficaz la pared celular fúngica o al metabolismo/secreción del compuesto por la célula. La estructura cristalina de CaBdf1-BD1 unida a MS5 se muestra en la Fig. 14. La estructura explica la falta de selectividad hacia hBrd4-BD1.
De manera similar, se identificó un compuesto, MS51, que inhibía CaBdf1-BD2 con alta selectividad relativa a BD1 de CaBdfl o Brd4 humana (Fig. 15a). Los ensayos HTRF e ITC mostraron que MS51 se une a CaBdf1-BD2 con una afinidad de 1-2 pM (Fig. 15b, 15c). La estructura cristalina de alta resolución de CaBdf1-BD2 unida a MS51 revela la base estructural de la selectividad de unión hacia el dominio fúngico.
En conjunto, los datos anteriores demuestran que la función de las BD Bdfl es necesaria para el crecimiento adecuado y la patogénesis de C. albicans, y que estos dominios pueden ser el objetivo de compuestos de moléculas pequeñas de forma selectiva en relación con los BD humanos. Estos hallazgos allanan el camino para el desarrollo de inhibidores de BET BD como una nueva clase de terapéutica antifúngica.
Ejemplo 2. Preparación de diversos compuestos de la divulgación
Materiales y métodos. 1-cloro-2,4-dinitrobenceno, ácido 2-mercaptobenzoico, ácido (R)-tetrahidrofurano-2-carboxílico y ácidoS)-tetrahidrofurano-2-carboxílico se adquirieron en Sigma-Aldrich. 2-bromo-1-(4-hidroxifenil)etan-1-ona, 2­ bromo-1-(4-fluorofenil)etan-1-ona y 3-metilpiridin-2-amina se adquirieron en TCI America. La P-toluidina se adquirió a Alfa Aesar. 2-bromo-1-feniletan-1-ona se adquirió a Oxchem Corp. Todos los demás reactivos se adquirieron en fuentes comerciales y se utilizaron tal como se obtuvieron. Los compuestos se sintetizaron como se describe a continuación. Los espectros de 1H, 19F RMN se obtuvieron en espectrómetros de RMN Varian 400-MR y VNMRS-600. Los desplazamientos químicos son relativos al hexafluorobenceno externo, C6F6 (8 -164,9, 19F RMN). Las multiplicidades se indican como singlete (s), doblete (d), triplete (t), multiplete no resuelto (m), doblete de dobletes (dd), doblete de dobletes de dobletes (ddd), doblete de tripletes (dt) o señal amplia (br). Todos los desplazamientos químicos se indican en la escala 8 en partes por millón (ppm) con respecto a CD2HOD (8 3,34, 1H RMN) interno, CHCla (87,26, 1H RMN). Las constantes de acoplamiento 1H, 19F (valor J) se indican en Hz. La concentración de las muestras de RMN oscilaba entre 4 y 6 mg/ml. La cromatografía en fase normal se realizó con ISCO Combiflash Lumen+. Se utilizaron detectores UV y ELS. La espectrometría de masas (EM) se realizó en un espectrómetro de masas Finnigan LCQ Deca XP Max equipado con una fuente ESI en el modo de iones negativos. Los nombres IUPAC de los compuestos se asignaron utilizando Chemdraw. Todas las RMN se procesaron e interpretaron con MestReNova 9.0.0.
Figure imgf000025_0001
Síntesis de enantiomeros de MS5.
(R)-N-(10-met¡l-11-oxo-10, 11-dihidrodibenzo[b,f][1,4]tiazepin-7-il)tetrahidrofurano-2-carboxamida:
Figure imgf000025_0002
(S)-N-(10-metil-11-oxo-10, 11-d¡h¡drod¡benzo[b,f][1,4]t¡azep¡n-7-¡l)tetrah¡drofurano-2-carboxam¡da:
Figure imgf000026_0001
Se añadieron 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (0,5 g, 2,5 mmol, 1 equiv.) y 0,38 g (2,5 mmol, 1 equiv.) de ácido 2-mercaptobenzoico a una mezcla de 0,68 ml de TEA y 3,7 ml de 2-propanol. La mezcla se calentó a 80 °C con agitación enérgica durante 3 h. El producto se extrajo con EtOAc (5 ml x 3). A continuación, el disolvente se eliminó al vacío para obtener el producto (ácido 2-((2,4-dinitrofenil)tio)benzoico, rendimiento del 90 %) para el siguiente paso. Se añadió 0,5 g (1,6 mmol, 1equiv.) de ácido 2-((2,4-dinitrofenil)tio)benzoico a 8,25 ml de DMF. 0,713 g (1,2 equiv.) HATU y 0,404 g (2 equiv.) A continuación, se añadió DIEA a la solución. 0.0586 g (1,1 equiv.) También se añadió NH2CH3 a la mezcla. La mezcla de reacción se agitó enérgicamente a TA durante 2 h. El producto se extrajo con EtOAc (5 ml x 3) y se secó al vacío (rendimiento del 70%). Se colocaron 0,26 g (1 equiv.) del producto y 0,04 g (2 equiv.) de K2Co 3 en un matraz de fondo redondo de 10 ml con 2 ml de DMF. La mezcla se mantuvo a 120 °C (baño de aceite) con agitación enérgica durante 4 h. Tras eliminar el disolvente al vacío, el compuesto resultante se lavó con agua desionizada y EtOH y se secó para obtener el producto (49% de rendimiento). Se disolvieron 95 mg (1 equiv.) del producto resultante en EtOAc (3 ml) y la mezcla de 1ml de EtOH y 300 ^L (7 equiv.) HCl al 30 % se añadieron a continuación a la solución. Por último, se añadieron 0,262 g (3,5 equiv.) de SnCl2 a la mezcla de reacción. La mezcla se calentó a 80 °C con agitación enérgica durante 2 h. Una vez completada la reacción (controlada por TLC), el pH se ajustó a 11 con NaOH. El precipitado formado se lavó 3 veces con agua y se secó al vacío. Rendimiento 42%. A continuación, se disolvieron 32 mg (1 equiv.) del producto formado y 15,44 mg (1,1 equiv.) de (R)-tetrahidrofurano-2-carboxílico (o ácido (S)-tetrahidrofurano-2-carboxílico) en 1 ml de DMF. 54,75 mg (1,2 equiv.) hAt U y 31,02 mg (2 equiv.) A continuación, se añadió DIEA a la solución. La reacción se agitó enérgicamente a TA durante 2 h. El producto se extrajo con EtOAc (5 ml x 3) y se secó al vacío. El compuesto final (R-MS5 o S-MS5) se obtuvo con un rendimiento del 42% (18,4 mg).
El enantiómero R de MS5. 1H RMN (600 MHz, cloroformo-d) 58,47 (s, 1H), 7,81 (dd, J = 46,3, 2,5 Hz, 1H), 7,75 - 7,69 (m, 1H), 7,59 (ddd, J = 49,7, 8,7, 2,5 Hz, 1H), 7,42 (dt, J = 7,3, 2,1 Hz, 1H), 7,34 - 7,27 (m, 2H), 7.25 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 8,4, 5,9 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 3,94 (q, J = 7,3 Hz, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,35 (dd, J = 13,4, 7.3 Hz, 1H), 2,13 (tt, J = 8,2, 2,9 Hz, 1H), 2,00 - 1,83 (m, 2H). Calculado para C1gH1sN2O3S: 354,10, Masa encontrada: 355.3 (M+H+); 709,0 (2M+H+); 731,1 (2M+Na+).
El enantiómero S de M S5.1HRMN (400 MHz, cloroformo-d) 58,51 (s, 1H), 7,83 (dd, J = 30,2, 2,5 Hz, 1H), 7,77 - 7,68 (m, 1H), 7,60 (ddd, J = 32,9, 8,7, 2,5 Hz, 1H), 7,47 - 7,40 (m, 1H), 7,34 - 7,25 (m, 3H), 4,44 (dd, J = 8,4, 5,9 Hz, 1H), 4,02 (qd, J = 7,1, 1,1 Hz, 1H).44 (dd, J = 8,4, 5,9 Hz, 1H), 4,02 (qd, J = 7,1, 1,1 Hz, 1H), 3,98 - 3,89 (m, 1H), 3,59 (s, 3H), 2,85 (s, 2H), 2,42 - 2,30 (m, 1H), 2,20 - 2,08 (m, 1H), 1,94 (dtt, J = 19,6, 12,6, 6,7 Hz, 2H). Calculado para C19H18N2O3S: Masa encontrada: 355,6 (M+H+); 377,4 (M+Na+); 730,9 (2M+Na+).
Como reconocería fácilmente un experto en la técnica, las dibenzotiazepinonas sustituidas pueden prepararse modificando adecuadamente la ruta y las técnicas descritas en el Esquema 1. Es importante destacar que la molécula de oxadiazol no es determinante para la selectividad, ya que varios resultados de este grupo no fueron selectivos. El compuesto más activo lleva un grupo ciclopropilo en el nitrógeno lactámico del andamiaje de la dibenzotiazepinona (R en el Esquema 2). Varios otros éxitos también tienen un ciclopropilo en la misma posición; sin embargo, en algunos casos la presencia de un grupo metilo da lugar a una mayor potencia.
Figure imgf000027_0001
en la que R y R5 son como se definen en el presente documento, y X es un enlace directo o L como se define en el presente documento (por ejemplo, como para la Fórmula I).
Por ejemplo, el ácido 2-mercaptobenzoico puede hacerse reaccionar con 3-cloro-4-nitrobenzonitrilo y diversas aminas sustituidas para formar el andamiaje dibenzotiazepinona mediante denitrociclización, seguida de la formación de amidoxima por reacción de la fracción nitrilo con hidroxilamina en un disolvente adecuado tal como el etanol (Eloy et al., Chem. Rev. 1962; 62(2): 155-83), y finalmente la formación de la fracción 3,5-disustituida del 1,2,4-oxadiazol por reacción de la amidoxima con diversos ácidos sustituidos en presencia de catalizadores o calor (Augustine et al., J. Org. Chem. 2009;74(15):5640-3).
Los compuestos más potentes de esta subfamilia (Esquema 2) llevan un anillo aromático (-X-R2) en la posición 5 del anillo de oxadiazol que puede modular la selectividad. En esta posición (X en el Esquema 2 ) pueden instalarse distintos anillos aromáticos para conseguir una actividad y selectividad elevadas. La modificación posterior incluye la sustitución en este anillo aromático. Los compuestos de Fórmula IV pueden sintetizarse de acuerdo con el Esquema 2, a partir de reactivos disponibles en el mercado o mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Procedimiento general para la síntesis de compuestos de variación MS51.
Figure imgf000027_0002
R1 = H, MS51H;
R1 = F, MS51F
En un matraz se añadieron 2 mmol (1 equiv.) de la 2-bromoacetofenona correspondiente y 0,235 g (2,2 mmol, 1,1 equiv.) de p-toluidina. Se añadieron 0,1 g de Na2CO3 y la mezcla se trituró durante 2 min a TA hasta que se volvió amarilla. El material crudo se lavó 3 veces con agua y se secó al vacío dando material sólido con rendimientos del 80­ 90 %. A continuación, se disolvió 1 mmol (1 equiv.) del material sólido en 6 ml de alcohol isopropílico y se añadieron gota a gota 0,108 g de 3-metilpiridin-2-amina (1 mmol, 1 equiv.) a la solución. Por último, se añadieron 0,1 g de ZnI2 y 0,5 g de tamices moleculares de 4Á. La mezcla se calentó a 80 °C con agitación enérgica durante 12 h. Una vez completada la reacción (por TLC), el producto se extrajo con EtOAc (5 ml x 3) y se lavó con agua desionizada (5 ml x 3). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó al vacío. El producto resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (0-90% EtOAc/Hexano), dando compuestos objetivo con rendimientos del 18-24 %.
8-Metil-2-fenil-N-(p-tolil)imidazo[1,2-a]piridin-3-amina, MS51-H:
Figure imgf000028_0001
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 57,97 - 7,91 (m, 2H), 7,88 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,41 - 7,35 (m, 2H), 7,34 - 7,30 (m, 1H), 7,23 (dt, J = 6,9, 1,1 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,89 (t, J = 6 , 8 Hz, 1H), 6,48 - 6,36 (m, 2H), 2,65 (s, 3H), 2,20 (s, 3H). Calculado para C21H19N3: 313,16 Masa encontrada: 314,5 (M+H+).
4-(8-metil-3-(p-tolilamino)imidazo[1,2-a]piridin-2-il)fenol, MS51:
Figure imgf000028_0002
1H RMN(400 MHz, metanol-d4) 57,79 (d, J = 8,5 Hz, 3H), 7,11 (d, J = 6 , 8 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,81 - 6,75 (m, 3H), 6,42 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 2,62 (s, 3H), 2,20 (s, 3H). Calculado para C21H19N3O: 329,15 Masa encontrada: 330,4 (M+H+).
2-(4-Fluorofenil)-8-metil-N-(p-tolil)imidazo[1,2-a]piridin-3-amina, también llamada MS51F:
1*34
Figure imgf000028_0003
1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 58,01 (dd, J = 8 ,8 , 5,5 Hz, 2H), 7,69 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,06 - 6,95 (m, 5H), 6,69 (t, J = 6 , 8 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 2,68 (s, 3H), 2,25 (s, 3H). 19F RMN (564 MHz, cloroformo-d) 5 -105,23, -106,62, -114,35. Calculado para C2 i Hi 8f N3: 331,15 Masa encontrada: 332,3 (M+H+).
Citas de los Ejemplos 1 y 2. En el presente documento se mencionan las siguientes publicaciones:
1 Brown, G. D. et al. Hidden killers: human fungal infections. Sci Transl Med 4, 165rv113 (2012).
2 Fungal_Research_Trust. in Fungal Research Trust 20th Anniversary meeting. (Londres, 2011).
3 Arendrup, M. C. Epidemiology of invasive candidiasis. Curr Opin Crit Care 16, 445-452 (2010).
4 Moran, C., Grussemeyer, C. A., Spalding, J. R., Benjamin, D. K., Jr. & Reed, S. D. Candida albicans and non-albicans bloodstream infections in adult and pediatric patients: comparison of mortality and costs. Pediatr Infect Dis J 28, 433-435 (2009).
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Ejemplo 3. Preparación de compuestos de doble cabeza de guerra
Dado que las cepas de C. albicans inactivadas en una sola Bdfl BD conservan cierta viabilidad, una estrategia de monoterapia dirigida a CaBdf1 puede requerir la inhibición de ambas BD para ser altamente eficaz, al menos para C. albicans. Sin embargo, la monoterapia puede ser eficaz para C. glabrata y otras especies. Además, la inhibición de una sola BD, preferiblemente BD2 en el caso de C. albicans, puede ser eficaz en una estrategia de terapia combinada contra, por ejemplo, una cepa de Candida resistente al fluconazol. CaBdfl también puede inhibirse mediante un único compuesto dirigido a ambas BD (por ejemplo, compuestos de Fórmula IV). Dichos inhibidores BET de doble cabeza de guerra que actúan simultáneamente sobre ambas BD dentro de una única proteína BET serán muy eficaces para tratar diversas infecciones fúngicas.
Los fármacos multivalentes de molécula pequeña son una solución innovadora para las proteínas que ofrecen dos sitios de unión proximales y drogables, lo que conduce a una unión global neta excepcionalmente potente del huésped y el anfitrión. Este llamado efecto de avidez puede superar significativamente la suma de sus componentes contribuyentes, dando lugar a órdenes de magnitud de aumento de la unión en relación con la afinidad asociada a las interacciones individuales. La longitud del enlazador del compuesto de Fórmula IV y los puntos de unión pueden optimizarse variando la longitud del enlazador que une las dos moléculas heterocíclicas. Se han diseñado nuevos inhibidores de CaBdf1 de doble cabeza (A1 y b 1) que combinan los farmacóforos dibenzotiazepinona (Fórmula I) e imidazopiridina (Fórmula II) en la relación espacial correcta. Se han acoplado los "inhibidores de Janus" A1 y B1 por separado a las bolsas de unión de CaBdf1 Bd 1 y BD2. Ambos compuestos mostraron excelentes puntuaciones de unión ICM (Molsoft ICM Pro, acoplamiento de ligandos) y encajes ideales en sus respectivas bolsa.
Figure imgf000030_0001
El prototipo de inhibidor de doble cabeza de guerra (B1) puede sintetizarse mediante conjugación de 7-amino-10-metildibenzo/b,/][1,4]tiazepina-11(10H)-ona 6 (Smirnov et al., J. Het. Chem. 2007;44(6): 1247-51) y 4-((2-(4-hidroxifenil)-8-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)amino)benzoicacido 7 (Esquema 3-1).
Figure imgf000031_0001
El compuesto 7 puede sintetizarse a partir de reactivos disponibles comercialmente adaptando los métodos desarrollados por Lakner (Lakner et al., Synthesis-Stuttgart 2009(12): 1987-90) y Han (Han et al., Síntesis-Stuttgart 2016;48(3):351-6), como se representa en el Esquema 3-2. El inhibidor final B1 puede entonces prepararse mediante la formación de enlaces amida mediada por HATU entre 6 y 7 (Esquema 3-1). Alternativamente, si el fenol desprotegido o la amina secundaria presentes en 7 dan lugar a rendimientos insatisfactorios, pueden instalarse grupos protectores estándar al inicio de la síntesis y eliminarse al final (véaseWuts, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. 5a Ed: Wiley; 2014).
Figure imgf000031_0002
La síntesis de A1 puede utilizar la misma ruta para las 3-amino-imidazopiridinas 12. El conocido sinthon 6 (Smirnov et al., J. Het. Chem. 2007;44(6):1247-51) puede reaccionar con la a-bromocetona 9 para formar la a-aminocetona 13 , que puede convertirse en A1 mediante catálisis con yoduro de zinc siguiendo el método descrito en la bibliografía (Esquema 3-3) (Lipinski, Drug Discov. Today Technol. 2004; 1(4):337-41).
Figure imgf000032_0001
Ejemplo 4. Formas de dosificación farmacéutica
Las siguientes formulaciones ilustran formas de dosificación farmacéuticas representativas que pueden utilizarse para la administración terapéutica o profiláctica de un compuesto de una fórmula descrita en el presente documento, un compuesto específicamente divulgado en el presente documento, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo (en lo sucesivo denominado "Compuesto X"):
(i) Comprimido 1 mg/comprimido
'Compuesto X' 100,0
Lactosa 77,5
Povidona 15,0
Croscarmelosa sódica 12,0
Celulosa microcristalina 92,5
Estearato de magnesio 3,0
300,0
(ii) Comprimido 2 mg/comprimido
'Compuesto X' 20,0
Celulosa microcristalina 410,0
Almidón 50,0
Almidón glicolato sódico 15,0
Estearato de magnesio 5,0
500,0
(iii) Cápsula mg/cápsula
'Compuesto X' 10,0
Dióxido de silicio coloidal 1,5
Lactosa 465,5
Almidón pregelatinizado 120,0
Estearato de magnesio 3,0
600,0
(iv) Inyección 1 (1 mg/ml) mg/ml "Compuesto X" (forma ácida libre) 1,0 Fosfato sódico dibásico 12,0 Fosfato sódico monobásico 0,7 Cloruro sódico 4,5 Solución de hidróxido de sodio 1,0 N (ajuste de pH a 7,0-7,5) q.s.
Agua para inyección q.s. ad 1 ml
(v) Inyección 2 (10 mg/ml) mg/ml "Compuesto X" (forma ácida libre) 10,0 Fosfato sódico monobásico 0,3 Fosfato sódico dibásico 1,1 Polietilenglicol 400 200,0 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N (ajuste de pH a 7,0-7,5) q.s.
Agua para inyección q.s. ad 1 ml
(vi) Aerosol mg/can 'Compuesto X' 20
Ácido oleico 10 Tricloromonofluorometano 5.000 Diclorodifluorometano 10.000 Diclorotetrafluoroetano 5.000
(vii) Gel tópico 1 % en peso 'Compuesto X' 5 % Carbómero 934 1,25 % Trietanolamina (ajuste del pH a 5-7) q.s.
Metilparabeno 0,2 %
Agua purificada q.s. a 100g
(viii) Gel tópico 2 % en peso
'Compuesto X' 5 %
Metilcelulosa 2 %
Metilparabeno 0,2 %
Propilparabeno 0,02%
Agua purificada q.s. a 100g
(ix) Pomada tópica % en peso 'Compuesto X' 5 %
Propilenglicol 1 %
Base de pomada anhidra 40 %
Polisorbato 80 2 %
Metilparabeno 0,2 %
Agua purificada q.s. a 100g
(x) Crema tópica 1 % en peso
'Compuesto X' 5 %
Cera blanca de abeja 10 %
Parafina líquida 30 %
Alcohol bencílico 5 %
Agua purificada q.s. a 100g
(xi) Crema tópica 2 % en peso
'Compuesto X' 5 %
Ácido esteárico 10 %
Monoestearato de glicerilo 3 %
Éter estearílico de polioxietileno 3 %
Sorbitol 5 %
Palmitato de isopropilo 2 %
Metilparabeno 0,2 %
Agua purificada q.s. a 100g
Estas formulaciones pueden prepararse mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica farmacéutica Se apreciará que las composiciones farmacéuticas anteriores pueden variarse de acuerdo con técnicas farmacéuticas bien conocidas para acomodar diferentes cantidades y tipos de ingrediente activo "Compuesto X". La formulación en aerosol (vi) puede utilizarse junto con un generador de aerosol estándar de dosis medida. Además, los ingredientes y proporciones específicos son a título ilustrativo. Los ingredientes pueden cambiarse por equivalentes adecuados y las proporciones pueden variar, de acuerdo con las propiedades deseadas de la forma farmacéutica de interés.
Como se describe en el presente documento, la presente solicitud describe las estructuras cristalinas de resolución atómica de Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans Bdfl BD1 y BD2 en su forma apo (es decir, sin un ligando) y Candida albicans Bdfl BD1 y BD2 en complejo con un inhibidor selectivo. Estas estructuras muestran las características de la bolsa y la interacción de un inhibidor selectivo con la bolsa. En consecuencia, estas estructuras proporcionan un método no reivindicado para identificar nuevas moléculas pequeñas y composiciones que pueden utilizarse como agentes para tratar infecciones fúngicas patógenas. Algunos ejemplos de estos hongos son C. albicans y C. glabrata (para este último, S. cerevisiae es un buen organismo modelo). Se puede aplicar un enfoque similar para identificar agentes antifúngicos para otros hongos que contengan Bdfl.
Opcionalmente, se divulga un método no reivindicado de identificación de un compuesto antifúngico. El método incluye: a) comparar patrones de campo tridimensional de miembros de una biblioteca de moléculas pequeñas con un patrón de campo tridimensional de referencia de un inhibidor de una proteína fúngica esencial, en el que el patrón de campo tridimensional de referencia se obtiene a partir de una estructura cristalina del inhibidor complejado con una región de unión a inhibidor de la proteína fúngica esencial; b) identificar uno o más compuestos antifúngicos putativos a partir de los miembros de la biblioteca de moléculas pequeñas basándose en las comparaciones del patrón de campo tridimensional; y c) probar uno o más de los compuestos con actividad antifúngica para identificar uno o más compuestos antifúngicos que tengan actividad antifúngica, incluyendo compuestos que inhiban selectivamente proteínas BET fúngicas frente a proteínas BET humanas, y compuestos que inhiban selectivamente BD1 o BD2 de una proteína BET fúngica, o ambas BD1 y BD2 de una proteína BET fúngica.
Alternativamente, el método no reivindicado incluye crear un ensayo de unión in vitro, tal como un ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF), para el cribado de una biblioteca química utilizando técnicas de Cribado de Alto Rendimiento (HTS) conocidas en el estado de la técnica, que comprende una proteína fúngica esencial para la regulación transcripcional, o un subdominio funcional de la misma, y el sustrato peptídico natural para la proteína fúngica, con una disposición para detectar y cuantificar la inhibición específica por una molécula pequeña conocida de dicha biblioteca química, y una disposición adicional para el contraescaneado a fin de establecer la selectividad para la proteína fúngica en relación con proteínas humanas homólogas o sus correspondientes subdominios funcionales. En algunas realizaciones, el subdominio comprende uno o más de un bromodominio.
En el método, la región de unión al inhibidor puede ser un bromodominio de la proteína Bdfl fúngica, y los compuestos antifúngicos pueden tener una mayor actividad de unión a la Bdfl fúngica en comparación con las proteínas BET humanas o de otros animales.
En cualquiera de los métodos, un compuesto antifúngico putativo, un compuesto antifúngico, o un compuesto que inhibe un bromodominio de la proteína Bdfl fúngica, puede ser un compuesto de una fórmula de una de las realizaciones siguientes, una combinación de los mismos, o una sal fisiológica o farmacéuticamente aceptable de los mismos.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un compuesto, un segundo fármaco antifúngico y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable; en la que el compuesto es:
Figure imgf000036_0001
2. La composición de la reivindicación 1, en la que el segundo compuesto antifúngico es un compuesto de Fórmula It
Figure imgf000036_0002
en la que:
X es NH, NHC(O), O o S;
El anillo A y el anillo B son cada uno independientemente un arilo sustituido o no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido;
Ri, R2 , R3 y R4 son cada uno independientemente H, Alk, OH,NH2 , NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2 , S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es un alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4;
R5 es H, Alk, OH,NH2, NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2 , S(O)2NHAlk, donde Alk es alquilo C1.C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2­ 4 y x es 1-4, o R10 dondeR10 es piperidin-l-il, morfolino u otro sustituyente heterocíclico que contenga nitrógeno; y
Ra es H, Alk, OH,NH2, NHAlk, OAlk, halo, cicloalquilo, C(O)OH, C(O)OAlk, C(O)NH2 , C(O)NHAlk, S(O)2OH, S(O)2NH2 , S(O)2NHAlk, o NHC(O)Alk, donde Alk es alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido o ((CH2)nO)xCH3 donde n es 2-4 y x es 1-4;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo seleccionado de:
Figure imgf000037_0001
4. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 3 o un compuesto que es:
Figure imgf000038_0001
5. La composición de la reivindicación 4, en la que el adyuvante antifúngico es un aceite esencial o un extracto de aceite esencial.
6. La composición de la reivindicación 5, en la que el aceite esencial o el extracto de aceite esencial se selecciona del grupo que consiste en naranja dulce, Mentha arvensis, menta, madera de cedro, limón, Eucalyptus globulus, Litsea cubeba, clavo, menta verde, nuez moscada, canela, albahaca y laurel.
7. La composición de la reivindicación 6, en la que el extracto de aceite esencial es eugenol.
8. Un método ex vivo para reducir o perjudicar el crecimiento de un cultivo fúngico que comprende exponer el cultivo a un compuesto que inhibe una o ambas proteínas bromodominio fúngicas, en el que el compuesto es un compuesto de la reivindicación 3 o un compuesto que es:
Figure imgf000039_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, y el crecimiento del cultivo fúngico se reduce o deteriora de este modo.
9. Un compuesto de la reivindicación 3 o un compuesto que es:
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de una infección fúngica en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso la administración al sujeto de una cantidad antifúngica eficaz del compuesto que inhibe una o ambas proteínas bromodominio fúngicas, en el que la infección fúngica se trata de este modo.
10. El compuesto para su uso de la reivindicación 9, en el que el compuesto se administra, concurrente o secuencialmente, en combinación con un segundo fármaco antifúngico.
11. El compuesto para su uso de la reivindicación 10, en el que el segundo fármaco antifúngico es anfotericina, anidulafungina, caspofungina, clotrimazol, fluconazol, flucitosina, itraconazol, ketoconazol, micafungina, miconazol, posaconazol o voriconazol.
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