ES2932648T3 - Procedimiento para el desgomado enzimático - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para desgomar un aceite vegetal, que comprende a. poner en contacto una mezcla de aceite y agua que comprende un aceite vegetal crudo que comprende fosfolípidos con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa, donde la mezcla de aceite y agua comprende una solución acuosa que tiene una fuerza iónica molal de entre 0,001 y 0,5 mol/kg; b. separar una mezcla de agua y aceite en una composición de aceite y una composición acuosa; y C. lavar la composición de aceite con un ácido, en el que se produce un vegetal desgomado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para el desgomado enzimático

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. No. 62/489.700, presentada el 25 de abril de 2017, y de la Solicitud Europea No. 17169851.7, presentada el 8 de mayo de 2017.

Campo

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un aceite vegetal desgomado.

Antecedentes

Los aceites vegetales crudos obtenidos por prensado o por métodos de extracción con disolventes son una mezcla compleja de triacilgliceroles, fosfolípidos, esteroles, tocoferoles, ácidos grasos libres, metales traza y otros compuestos menores. Es deseable eliminar los fosfolípidos, los ácidos grasos libres y los metales traza para producir un aceite comestible de calidad.

En el procesamiento de aceite de soja, la semilla de soja se puede conformar en escamas primero antes de la extracción con hexano para obtener un aceite en forma de escamas. En otro procedimiento comúnmente conocido, la semilla se trata primero con un expansor antes de la extracción, lo que da como resultado un aceite expansor. Este último generalmente conduce a un mayor rendimiento de aceite, pero también a un mayor contenido de fosfolípidos. Otros aceites, como el aceite de canola o de colza se prensan primero para obtener la fracción de aceite prensado. La torta de prensa se puede tratar adicionalmente con un disolvente para producir una fracción de aceite extraído y las dos fracciones combinadas se conocen como aceite crudo de canola, colza o girasol.

La eliminación de fosfolípidos genera la mayoría de pérdidas asociadas al desgomado de aceites vegetales. Dado que la mayoría de las moléculas de fosfolípidos poseen un grupo funcional hidrófilo y un resto lipófilo, que consisten en un glicerol con dos cadenas de ácidos grasos, tienden a ser excelentes emulsionantes naturales. Los principales fosfolípidos de los aceites vegetales son la fosfatidilcolina (PC), la fosfatidiletanolamina (PE), el fosfatidilinositol (PI) y el ácido fosfatídico (PA). La eliminación de fosfolípidos se conoce como desgomado de aceites vegetales.

Se conocen varios procedimientos para el desgomado enzimático de aceites vegetales que utilizan enzimas con actividad fosfolipasa, tales como fosfolipasa A1, fosfolipasa A2, fosfolipasa C, o actividad fosfatidilinositol fosfolipasa C.

El documento WO 2011046812 describe el uso de una PI-PLC en un procedimiento de desgomado enzimático. El aceite vegetal se trata primero con un ácido y luego se neutraliza con un álcali, después de lo cual se lleva a cabo el desgomado enzimático. El aceite tratado enzimáticamente se centrifuga para separar el aceite de la fase acuosa. El documento US 7.713.727 B2 describe un procedimiento para reducir el ensuciamiento del equipo de procesamiento de aceite en el que el aceite vegetal comestible se trata con una enzima fosfolipasa, en el que después de la reacción enzimática el aceite se trata con un ácido orgánico.

El documento US 8.460.905 B2 describe un procedimiento para el desgomado enzimático de un aceite de semilla, tal como el aceite de soja, en el que una fosfolipasa C y una fosfolipasa A se ponen en contacto con el aceite en condiciones neutras o ácidas.

El documento WO 2014/090161 describe un procedimiento para el desgomado enzimático de un aceite de semilla, tal como el aceite de soja, utilizando una fosfolipasa C, en el que el aceite se trata previamente con un ácido y una base. El documento EP 0622446 A2 describe un procedimiento para el desgomado enzimático de aceite utilizando una fosfolipasa A2, en el que la enzima se añade con un ácido.

El documento US 2015/017708 A1 describe un procedimiento para el desgomado enzimático de aceite utilizando fosfolipasas, en el que el aceite se trata previamente con un ácido y una base.

Existe la necesidad de un procedimiento mejorado para el desgomado enzimático de un aceite vegetal.

Sumario

La presente invención se refiere a un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a) Mezclar un álcali en solución acuosa con un aceite vegetal crudo para obtener una mezcla A-1 de aceite y agua que comprende una solución acuosa que tiene una fuerza iónica molal entre 0,001 y 0,5 mol/kg, b) Poner en contacto la mezcla A-1 de agua y aceite con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa para obtener una mezcla B1 de agua y aceite,

c) Separar la mezcla B-1 de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa; y, d) Lavar la composición oleosa con un ácido.

Sorprendentemente, se encontró que el tratamiento final del aceite con un ácido redujo el contenido de fósforo en el aceite vegetal desgomado. En una realización, cuando se pone en contacto la mezcla de aceite y agua con una enzima fosfolipasa una fuerza iónica entre 0,001 y 0,5 mol/kg da como resultado una mayor separación de las gomas durante el procesamiento, lo que da como resultado una reducción del contenido de gomas en el aceite vegetal desgomado.

Descripción detallada

La invención está definida por las reivindicaciones.

Además, en una realización no cubierta por la invención reivindicada, en la presente memoria se describe un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende

a. Poner en contacto una mezcla A-1 de aceite y agua que comprende un aceite vegetal crudo con una enzima que tiene una actividad de fosfolipasa para obtener una mezcla B-1 de aceite y agua, en donde la mezcla A-1 de aceite y agua comprende una solución acuosa que comprende una fuerza iónica molal entre 0,001 y 0,5 mol/kg, b. Separar la mezcla B-1 de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa; y, c. Lavar la composición oleosa con un ácido para obtener un aceite vegetal desgomado.

En otra realización no cubierta por la invención reivindicada, en la presente memoria se describe un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a. Poner en contacto una mezcla A-1 de aceite y agua que comprende un aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa para obtener un aceite vegetal, en donde la mezcla A-1 de aceite y agua comprende una solución acuosa que tiene una fuerza iónica molal entre 0,001 y 0,5 mol/kg,

b. Tratar el aceite vegetal obtenido en la etapa a) con una solución acuosa que comprende un ácido, un agente quelante de metales y/o un álcali para obtener una mezcla B-1 de aceite y agua,

c. Separar la mezcla B-1 de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa, y, d. Lavar la composición oleosa con un ácido para obtener un aceite vegetal desgomado.

En otra realización, en la presente memoria se describe además un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a. Agregar una solución acuosa de un álcali a un aceite vegetal crudo para obtener una mezcla A-1 de aceite y agua,

b. Poner en contacto la mezcla A-1 de aceite y agua con una enzima que tiene una actividad de fosfolipasa para obtener un aceite vegetal, en donde la mezcla A-1 de aceite y agua comprende una solución acuosa que tiene una fuerza iónica molal entre 0,001 y 0,5 mol/kg,

c. Tratar el aceite vegetal obtenido en la etapa b) con una solución acuosa que comprende un ácido, un agente quelante de metales y/o un álcali para obtener una mezcla C-1 de aceite y agua,

d. Separar la mezcla C-1 de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa; y, e. Lavar la composición oleosa con un ácido para producir un aceite vegetal desgomado.

En una realización no cubierta por la invención reivindicada, en la presente memoria se proporciona un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a. Poner en contacto un aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa;

b. Separar la mezcla de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa; y,

c. Lavar la composición oleosa con un ácido y producir un aceite vegetal desgomado.

En una realización no cubierta por la invención reivindicada, en la presente memoria se proporciona un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a. Poner en contacto un aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa;

b. Tratar el aceite vegetal obtenido en la etapa a) con una solución acuosa que comprende un ácido, un agente quelante de metales y/o un álcali.

c. Separar una mezcla de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa; y,

d. Lavar la composición oleosa con un ácido,

y producir un aceite vegetal desgomado.

En una realización no cubierta por la invención reivindicada, en la presente memoria se proporciona además un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a. Agregar un álcali a un aceite vegetal crudo

b. Poner en contacto el aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa;

c. Tratar el aceite vegetal obtenido en la etapa b) con una solución acuosa que comprende un ácido, un agente quelante de metales y/o un álcali.

d. Separar una mezcla de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa; y,

e. Lavar la composición del aceite con un ácido,

y producir un aceite vegetal desgomado.

Un aceite vegetal crudo también se conoce como aceite prensado, en escamas o extraído de fuentes vegetales como canola, maíz, oliva, palma, palmiste, maní, colza, salvado de arroz, semilla de sésamo, soja o semilla de girasol. Un aceite vegetal crudo comprende fosfolípidos. En una realización, el aceite vegetal crudo comprende un contenido de fosfolípidos que varía de 0,2 a 3% p/p correspondiente a un contenido de fósforo en el rango de 200 a 1200 ppm.

En una realización, poner en contacto un aceite vegetal que comprende fosfolípidos con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa comprende añadir la enzima que tiene actividad de fosfolipasa al aceite vegetal que comprende fosfolípidos. La etapa de poner en contacto el aceite vegetal con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa se puede realizar durante cualquier período de tiempo y temperatura adecuados. En una realización, un periodo de tiempo adecuado está entre 10 minutos y 48 horas, por ejemplo entre 20 minutos y 36 horas, por ejemplo entre 30 minutos y 24 horas. En una realización, la temperatura adecuada para poner en contacto la enzima es de 10 a 90 °C, tal como entre 20 y 80 °C, por ejemplo entre 30 y 70 °C, por ejemplo entre 40 y 60 °C. En una realización, una enzima que tiene actividad de fosfolipasa es una solución acuosa que comprende una enzima que tiene actividad de fosfolipasa. En una realización, poner en contacto el aceite vegetal que comprende fosfolípidos con una fosfolipasa comprende añadir agua al aceite vegetal. La cantidad adecuada de agua que se agrega puede ser la cantidad de 0,2 a 2 veces la cantidad de fosfolípidos en el aceite (en% en peso). Por ejemplo, se añade al aceite una cantidad entre 0,5 y 10% en peso, tal como entre 1 y 8% en peso, o entre 2 y 6% en peso. La adición de la enzima que tiene actividad de fosfolipasa y/o agua puede comprender el cizallamiento del aceite vegetal, por ejemplo, el mezclado del aceite vegetal con alto cizallamiento.

Cualquier enzima adecuada que tenga actividad de fosfolipasa se puede poner en contacto con un aceite vegetal crudo en un procedimiento como se describe en este documento. Una enzima que tiene actividad de fosfolipasa puede ser una fosfolipasa A (PLA), una fosfolipasa C (PLC) y/o una fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC). Una fosfolipasa A puede ser una fosfolipasa A1 (PLA1) y/o una fosfolipasa A2 (PLA2). Una enzima que tiene actividad de fosfolipasa puede ser una composición que comprende una o más enzimas de fosfolipasa, por ejemplo una composición que comprende una fosfolipasa A, tal como fosfolipasa A1 o una fosfolipasa A2, una fosfolipasa C y/o una fosfatidilinositol fosfolipasa C.

Las fosfolipasas son enzimas que hidrolizan un enlace éster en fosfolípidos y son muy conocidas en la técnica. Una PLA1 libera ácidos grasos del primer grupo de átomos carbonos de un glicerol y pertenece a la clase de clasificación enzimática EC 3.1.1.3.2. Una PLA2 libera ácidos grasos del segundo grupo de átomos de carbono del glicerol y pertenece a la clasificación enzimática EC 3.1.1.4. Una PLC (tal como la del número de clasificación enzimática EC 3.1.4.3) escinde los fosfolípidos entre el grupo fosfato y el glicerol, lo que da como resultado un diglicérido y un compuesto tipo fosfato tal como el fosfato de colina o el fosfato de etanolamina. Una PLC se conoce, por ejemplo, por los documentos WO 2005/086900, WO 2012/062817 o WO 2016/162456. Una PI-PLC tiene preferencia por escindir el fosfatidilinositol y también puede actuar sobre otros fosfolípidos tales como la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina. La PI-PLC bacteriana pertenece a la clasificación enzimática EC 4.6.1.13. Una enzima PI-PLC adecuada se describe, por ejemplo, en el documento WO 2011/046812.

En una realización, la etapa de poner en contacto el aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa se realiza en una mezcla de aceite y agua, en donde la mezcla de aceite y agua comprende una solución acuosa que tiene una fuerza iónica molal entre 0,001 y 0,5 mol/kg, por ejemplo entre 0,005 y 0,4 mol/kg, por ejemplo entre 0,005 y 0,3 mol/kg, por ejemplo entre 0,005 y 0,2 mol/kg, por ejemplo entre 0,005 y 0,1 mol/kg, por ejemplo entre 0,007 y 0,15 mol/kg , por ejemplo entre 0,008 y 0,15 mol/kg, por ejemplo entre 0,008 y 0,125 mol/kg, por ejemplo entre 0,01 y 0,3 mol/kg, o por ejemplo entre 0,05 y 0,2 mol/kg.

En una realización, la fuerza iónica molal de la solución acuosa en la mezcla de aceite y agua que comprende un aceite vegetal crudo, durante el contacto con una enzima que tiene una actividad de fosfolipasa como se usa en la presente memoria, es la fuerza iónica molal de la solución acuosa después de la adición de un álcali o un ácido (la adición de ácido no está cubierta por la invención reivindicada). En una realización, la fuerza iónica molal de la solución acuosa en la mezcla de aceite y agua que comprende un aceite vegetal crudo, durante el contacto con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa como se usa en la presente memoria, es la fuerza iónica molal de la solución acuosa después de la adición de sales. Las sales que se pueden añadir a la mezcla de aceite y agua pueden ser una sal de ácido (realización no cubierta por la invención reivindicada) o una sal de álcali.

La fuerza iónica molar (I en mol/L) se calcula según la fórmula:

en donde:

ci es la concentración molar del ion I (M, mol/L),

zi es el número de cargas de ese ion,

y la suma se toma de todos los iones en la solución.

Para soluciones no ideales, la fuerza iónica se calcula según la fórmula:

en la que bi es la molalidad (mol/kg)

Véase: IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2a ed. (el "Gold Book "). Compilado por A. D. McNaught y A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Versión XML corregida en línea: http://goldbook.iupac.org (2006-) creada por M. Nic, J. Jirat, B. Kosata; actualizaciones compiladas por A. Jenkins.

En una realización, un procedimiento como se describe en este documento puede comprender agregar un álcali a un aceite vegetal crudo antes de poner en contacto el aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa. El álcali que se añade al aceite vegetal crudo puede ser una solución acuosa que comprende un álcali. El álcali se puede añadir al aceite vegetal crudo que comprende fosfolípidos antes o después del mezclado con cizallamiento del aceite vegetal, tal como un mezclado con alto cizallamiento del aceite vegetal. El cizallamiento de un aceite vegetal se puede realizar por cualquier método conocido por un experto en la materia. Antes del cizallamiento se puede agregar agua al aceite vegetal. La mezcla puede comprender cizallamiento y agitación. En una realización, el cizallamiento del aceite vegetal da como resultado una emulsión.

Un álcali adecuado puede ser hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, silicato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, amoníaco, citrato de sodio o cualquier combinación adecuada de los mismos. Sorprendentemente, se encontró que la adición de un álcali al aceite vegetal crudo aumentaba la actividad de las enzimas que tenían actividad de fosfolipasa. En una realización, el álcali se añade en una cantidad entre 10 y 500 ppm con respecto al aceite vegetal que comprende fosfolípidos. En una realización, el álcali se añade en una cantidad entre 20 y 400 ppm, o entre 30 y 300 ppm, o entre 50 y 200 ppm con respecto al aceite vegetal.

Un procedimiento para producir un aceite vegetal desgomado como se describe en la presente memoria puede comprender además una etapa de tratar el aceite vegetal obtenido después de ponerlo en contacto con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa con una solución acuosa que comprende un ácido, un agente quelante de metales y/o un álcali. El aceite vegetal se puede tratar con una solución acuosa que comprende una cantidad de 50-2000 ppm de ácido, agente quelante de metales y/o álcali, por ejemplo, una cantidad de 100 a 1000 ppm, por ejemplo, 200 a 500 ppm de ácido, agente quelante de metales, y/o álcali, en relación con la cantidad de aceite. Un ácido adecuado puede ser un ácido orgánico o un ácido inorgánico, por ejemplo, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico y una mezcla de los mismos. Un agente quelante de metales adecuado puede ser EDTA. Un álcali puede ser un álcali como se definió en la presente memoria anteriormente.

En una realización, tratar el aceite vegetal que se ha puesto en contacto con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa comprende incubar el aceite vegetal con un ácido, agente quelante de metales y/o álcali entre 30 segundos y 10 horas, tal como entre 1 minuto y 5 horas, por ejemplo, entre 2 minutos y 2 horas. Una temperatura adecuada para incubar el aceite vegetal es de 50 a 95 °C, por ejemplo entre 60 y 80 °C.

En una realización, el tratamiento de un aceite vegetal con una solución acuosa que comprende un ácido y/o un agente quelante de metales puede comprender además poner en contacto el aceite vegetal con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa A. Dicho contacto puede comprender la incubación del aceite vegetal con una enzima que tenga actividad de fosfolipasa durante el tratamiento del aceite vegetal con una solución acuosa que comprende un ácido, un álcali y/o un agente quelante de metales.

Una mezcla de aceite y agua se produce cuando se agrega agua o una solución acuosa durante cualquier etapa de un procedimiento como se describe en este documento, por ejemplo, durante el contacto de un aceite vegetal crudo con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa o durante el tratamiento del aceite vegetal con un ácido, álcali y/o agente quelante de metales.

Un procedimiento para desgomar aceite vegetal como se describe en este documento comprende además separar una mezcla de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa. La composición acuosa comprende o consiste en gomas. En una realización, la composición acuosa o las gomas comprenden fosfolípidos, lisofosfolípidos y fosfatos, tales como fosfato libre (P), fosfato de colina (CP), fosfato de etanolamina (EP) y fosfato de inositol (iP).

En una realización, la separación de una mezcla de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa puede comprender la adición de agua a la mezcla de aceite y agua antes de la separación. En una realización, la separación se puede realizar por decantación, filtración y/o centrifugación del aceite, lo cual es conocido por un experto en la materia.

Un procedimiento para desgomar aceite vegetal como se describe en este documento comprende además lavar la composición oleosa con un ácido. Sorprendentemente, se encontró que lavar la composición oleosa con un ácido reducía el contenido de fósforo en el aceite vegetal desgomado en comparación con lavar la composición oleosa con agua.

El ácido puede ser una solución acuosa que comprende un ácido. La composición oleosa se puede lavar con una cantidad de 50-2500 ppm de ácido, por ejemplo una cantidad de 100 a 1000 ppm, por ejemplo de 200 a 500 ppm de ácido en relación con la cantidad de composición oleosa.

Un ácido adecuado para lavar una composición oleosa en un procedimiento como el descrito en este documento puede ser un ácido orgánico o inorgánico, por ejemplo, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico y una mezcla de los mismos. En una realización, lavar la composición oleosa con un ácido puede comprender agregar el ácido al aceite.

En una realización, el lavado de la composición oleosa con un ácido se puede realizar entre 30 segundos y 10 horas, tal como entre 1 minuto y 5 horas, por ejemplo, entre 2 minutos y 2 horas. Una temperatura adecuada para lavar el aceite vegetal puede estar entre 40 y 95 °C, por ejemplo entre 50 y 80 °C. En una realización, el lavado de la composición oleosa se puede realizar mezclando el ácido bajo mezclado y/o agitación de alto cizallamiento conocida en la técnica.

En una realización, lavar una composición oleosa durante un procedimiento para producir un aceite vegetal como se describe en el presente documento puede comprender además poner en contacto una enzima que tiene actividad de fosfolipasa A con la composición oleosa. En una realización, el contacto de la fosfolipasa A con la composición oleosa puede realizarse añadiendo la fosfolipasa A a la composición oleosa. En una realización, poner en contacto la fosfolipasa A con la composición oleosa comprende incubar la fosfolipasa A con el aceite.

En una realización, el procedimiento para desgomar un aceite vegetal como se describe en el presente documento comprende además producir un aceite vegetal desgomado. Usualmente, un procedimiento para desgomar un aceite vegetal como se describe en la presente memoria comprende además separar la composición oleosa después de lavarla en un aceite vegetal desgomado y una fracción acuosa. La fracción acuosa comprende un ácido. La separación de la composición oleosa después del lavado puede comprender la adición de agua antes de dicha separación. La separación puede comprender sedimentar, filtrar y/o centrifugar la composición oleosa conocida por un experto en la materia.

Un aceite vegetal desgomado producido en un procedimiento como el de la presente memoria descrito comprende un contenido de fósforo (P) entre 0 y 30 ppm, tal como entre 0,5 y 20 ppm, tal como entre 1 y 10 ppm, tal como entre 2 y 5 ppm.

En una realización, un procedimiento para desgomar un aceite vegetal como se describe en el presente documento puede comprender además el refinado del aceite vegetal desgomado. En una realización, el refinado comprende el blanqueo, por ejemplo utilizando tierras de blanqueo y/o desodorización del aceite vegetal mediante métodos conocidos por un experto en la materia.

Un aceite vegetal desgomado o producido en un procedimiento como el descrito en este documento puede ser un aceite vegetal que comprende aceite de canola, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de cacahuete, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de sésamo, aceite de soja y/o aceite de semilla de girasol. En una realización, el aceite vegetal desgomado o producido en un procedimiento como el descrito en la presente memoria es un aceite de soja y/o un aceite de canola.

Los siguientes ejemplos presentan ciertas realizaciones ejemplares y se pretende que sean a modo de ilustración y no a modo de limitación. En cada uno de los ejemplos del presente documento, los porcentajes indican el porcentaje en peso de la mezcla total, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo se llevan a cabo los métodos descritos y reivindicados en el presente documento, y pretenden ser puramente ejemplares y no pretenden limitar el alcance de la materia objeto reivindicada. Existen numerosas variaciones y combinaciones de las condiciones de reacción, por ej., concentraciones de componentes, temperaturas, presiones y otros rangos y condiciones de reacción que pueden usarse para optimizar la pureza y el rendimiento del producto obtenido a partir del procedimiento descrito. Solo se requerirá experimentación razonable y rutinaria para optimizar tales condiciones de procedimiento.

Materiales y métodos

Enzimas

Purifine® (91 U/g de fosfolipasa C), Purifine® 2G (59 U/g PLC), Purifine® 3G (59 U/g PLC) se obtuvieron de DSM. Purifine® comprende solo fosfolipasa C.

Purifine® 2G es una mezcla de enzimas que comprende fosfolipasa C y fosfolipasa A2.

Purifine® 3G es una mezcla de enzimas que comprende una fosfolipasa C, fosfatidilinositol fosfolipasa C y una fosfolipasa A2.

Ensayo de actividad de la fosfolipasa C (PLC)

La actividad PLC se determinó utilizando el sustrato cromógeno p-nitrofenil-fosforilcolina (pNP-PC). La solución de sustrato consistía en pNP-PC 10 mM (Sigma N5879, Zwijndrecht, Países Bajos), tampón de acetato 100 mM pH 5,0, Triton X-100 al 1% y ZnSÜ4 1 mM. Se incubó una mezcla de 20 pL de muestra y 180 pL de solución de sustrato a 37 °C durante 60 min. La reacción se detuvo añadiendo 100 pL de mezcla de reacción a 100 pL de reactivo de parada que contenía TRIS 1 M y EDTA 50 mM ajustado a pH 10 con NaOH 2 M. Se hizo un blanco agregando el reactivo de parada antes de la muestra de enzima. La densidad óptica (OD) de muestras y blancos se midió a 405 nm.

La calibración se realizó preparando soluciones de pNP de, respectivamente, 0 - 0,5 - 1,0 - 2,0 - 2,9 - 4,0 mM en el tampón mencionado anteriormente. Se mezclaron 20 pL de cada solución estándar con 180 pL de sustrato y se agregaron 100 pL de la mezcla a 100 pL de reactivo de parada. La OD de cada solución se midió a 405 nm. Usando regresión lineal se calculó la pendiente de la línea de calibración.

La actividad se calculó utilizando la siguiente fórmula:

U/mL = AAbs x Df/(t*pendiente)

AAbs = (Amuestra — Abl anco)

Df = factor de dilución de la muestra

Pendiente = pendiente de la curva de calibración de p-nitrofenol (mL/pmoL)

t = tiempo de incubación del ensayo (60 min)

Una unidad U se define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de p-nitrofenol por minuto en las condiciones del ensayo (pH 5, 37 °C).

Detección del contenido de fosfolípidos por P31-RMN

Se pesaron con precisión aproximadamente 350 mg de aceite en un vial adecuado y aproximadamente 1000 mg de tampón de extracción (que contenía 25 g.L-1 de ácido desoxicólico, 5,84 g.L-1 de EDTA y 10,9 g.L-1 de TRIS, tamponado con KOH a pH 9,0) . El aceite se extrajo mediante agitación por vórtex a 2000 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de centrifugación a 13000 G a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, se pesan 600 pL de la capa acuosa en un nuevo vial adecuado. Se agregaron 50 pL de una solución estándar interna (que contenía 10 g.L-1 de fosfato de triisopropilo en tampón de extracción).

Los espectros 1D de P31-RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III HD, que operaba a una frecuencia de 31P de 161,97 MHz, equipado con una sonda criogénica enfriada con nitrógeno, a una temperatura de la muestra de 300 K. Se usó un programa de pulsos de compuerta inversa (ZGIG) con desacoplamiento de protones Waltz16, registrando 4 escaneos ficticios y 128 escaneos por espectro, usando un pulso de 90 grados. Se utilizó un tiempo de adquisición de 3,37 s y un retardo de relajación de 11,5 s.

Las concentraciones de analito se calcularon en relación con el fosfato de triisopropilo.

Se aplicó un factor de corrección para corregir la relajación incompleta del fosfato de colina y el fosfato de etanolamina.

Determinación del contenido de P en aceite por ICP

El contenido de fósforo en el aceite se determinó mediante espectrometría de emisión atómica/plasma acoplado inductivo (ICP-AES) de acuerdo con el método Ca 20-99 de la AOCS, en: Official Methods and Recommended Practices of the Ao Cs , 7" ed.).

Determinación del contenido total de DAG en aceite por HPLC

El contenido total de diacilglicéridos en el aceite se determinó mediante HPLC-ELSD para determinar monoglicéridos y diglicéridos según el método oficial Cd 11 d-96 de la AOCS, en: Official Methods and Recommended Practices of the AOCS, 7" edición

Ejemplo 1. Efecto del pretratamiento con álcali de aceites vegetales crudos sobre la actividad de fosfolipasa El contenido de fosfolípidos de tres aceites crudos fabricados industrialmente, aceite de soja en escamas, aceite de soja expansor y aceite de canola crudo (Tabla 1), se determinó usando P31-RMN como se ha descrito anteriormente. Tabla 1. Composición de los diferentes aceites ensayados utilizados para este ejemplo

Antes del tratamiento con álcali, los tres aceites se homogeneizaron en un balde (20 L) utilizando un T50 IKA Ultra Turrax a máxima velocidad durante 20 minutos.

Se añadieron 10, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 ppm (basado en aceite) de NaOH a lotes de 10 gramos de aceite que se precalentaron a 58 °C, mientras se agitaba, usando una solución de NaOH 4N. Después de 15 min. de incubación con NaOH, se añadió fosfolipasa C (1,6 U Purifine® PLC/gramo de aceite) junto con agua suficiente para tener un 3% de agua en base a la cantidad total de aceite. El aceite se mezcló a 6000 rpm durante 20 segundos. Después de 30 minutos de incubación se tomaron muestras para determinar el fosfato de colina y el de etanolamina por análisis de P31-RMN.

Los resultados de las Tablas 2, 3 y 4 muestran que los productos de reacción (EP y CP) se acumulan a mayor velocidad con una cantidad creciente de álcali (NaOH).

Tabla 2. Producción de fosfato de colina (CP) y fosfato de etanolamina (EP) en aceite de canola pretratado con NaOH mediante Purifine® PLC después de 30 min de incubación

Tabla 3. Producción de fosfato de colina (CP) y fosfato de etanolamina (EP) en aceite de soja en escamas pretratado con NaOH mediante Purifine® PLC después de 30 min de incubación

Tabla 4. Producción de fosfato de colina (CP) y fosfato de etanolamina (EP) en aceite de soja expansor pretratado con NaOH mediante Purifine® PLC después de 30 min de incubación

Ejemplo 2. Efecto del pretratamiento con ácido y/o álcali del aceite de soja expansor sobre la producción enzimática de fosfato de colina (CP) y fosfato de etanolamina

Se homogeneizó un aceite de soja expansor (Ejemplo 1, Tabla 1) en un balde (20 L) utilizando un equipo T50 IKA Ultra Turrax a máxima velocidad durante 20 minutos.

Para cada condición de pretratamiento, se transfirieron 10 gramos de aceite a un vial de reacción de 20 mL que se llevó a una temperatura de 58 °C. Se aplicaron las siguientes condiciones de pretratamiento:

1. Sin pretratamiento: Mientras se agitaba (800 rpm, a 58 °C) se añadió agua (3% en peso total).

2. Pretratamiento con ácido: se agregaron 500 ppm de ácido cítrico mientras se agitaba y se exponía a alto cizallamiento usando 6000 rpm usando un control Utra-Turrax® Tube Drive durante 20 segundos antes de incubar la reacción a 70 °C durante 30 minutos. La reacción se enfrió a 58 °C antes de la adición de agua (3% en peso total).

3. Pretratamiento ácido/álcali: se agregaron 500 ppm de ácido cítrico mientras se agitaba y se exponía a alto cizallamiento usando 6000 rpm usando un control Ultra-Turrax® Tube Drive durante 20 segundos antes de incubar la reacción a 70 °C durante 30 minutos. La reacción se enfrió a 58 °C antes de añadir agua (3% en total) que incluía 250 ppm de NaOH.

4. Pretratamiento alcalino: mientras se agitaba (800 rpm y a 58 °C) se añadieron 150 ppm de NaOH junto con el agua (3% en peso total).

Cuando las muestras estaban a 58 °C, se añadió enzima (200 ppm Purifine® 3G/Kg aceite). Las mezclas se incubaron durante 30 min., después de lo cual se retiraron muestras para análisis por P31-RMN.

Los resultados (promedio de dos mediciones) en la Tabla 5 muestran que los productos de reacción se acumulan a una velocidad más alta cuando el aceite se trató previamente con álcali.

Tabla 5. Producción de fosfato de colina (CP) y fosfato de etanolamina (EP) mediante Purifine® PLC después de 30 min de incubación en aceite de soja expansor pretratado bajo diferentes condiciones

Ejemplo 3. Efecto de la adición de ácido después del tratamiento enzimático sobre el contenido de fósforo en aceite vegetal

Un aceite de soja expansor fue homogeneizado en un balde (20 L) usando un equipo T50 IKA Ultra Turrax® a toda velocidad durante 20 minutos. Se llevaron 2 kg de aceite a una temperatura entre 55-60 °C. Los aceites se preacondicionaron añadiendo 120 ppm de NaOH usando una solución de NaOH 4 N y agua (3% en peso total, fuerza iónica de 0,10 mol/kg), y los aceites se agitaron a 250 rpm a 55-60 °C. Posteriormente, se añadieron 200 ppm de Purifine® 3G. La reacción se mezcló utilizando un equipo T50 IKA Ultra Turrax en la posición 6 durante 1 minuto. Después de 120 min de incubación, se realizaron las siguientes adiciones químicas:

1. Adición de ácido cítrico (50% p/p): mientras se agitaba (250 rpm a 55-60 °C) se añadieron 2000 ppm de ácido cítrico.

2. Adición de ácido cítrico (50 p/p%) que incluye un tiempo de incubación de 60 minutos: mientras se agitaba (250 rpm a 55-60 °C) se añadieron 2000 ppm de ácido cítrico.

3. Adición de ácido cítrico (50% p/p)/hidróxido de sodio (16% p/p): mientras se agitaba (250 rpm y a 55-60 °C) se añadieron 2000 ppm de ácido cítrico seguidos de 1320 ppm de NaOH.

Después de la adición de productos químicos tras la reacción, las fases de aceite y agua se separaron usando un equipo gyrotester Alfa Laval de tamaño de banco (3950 rpm).

Posteriormente, el aceite resultante después de la primera separación se lavó con agua (3% en peso) por dispersión del agua en el aceite a alta velocidad utilizando el equipo T50 IKA Ultra Turrax durante 1 minuto. Las fracciones de aceite y agua se separaron por segunda vez utilizando un gyrotester de banco Alfa Laval. Se analizó el contenido de fósforo en muestras del aceite usando ICP como se describió anteriormente.

Los resultados de la Tabla 6 muestran que la adición de un ácido y/o un álcali al aceite después de la incubación del aceite con fosfolipasas dio como resultado un contenido de fósforo más bajo.

Tabla 6. Contenido de fósforo (ppm) del aceite tratado con fosfolipasas y posteriormente tratado con un producto químico

Ejemplo 4. Adición de ácido después del tratamiento del aceite a escala semiindustrial

Adición química de preenzimas (estándar)

Se llevó un aceite de soja expansor a una Unidad de Desgomado Semiindustrial (SIDU) provista por Alfa Laval, a un flujo de 1000 kg/h. El aceite se mezcló con ácido cítrico y se dispersó usando un tratamiento de alto cizallamiento (IKA). El aceite se expuso al ácido durante 30 minutos y posteriormente se enfrió a 55-60 °C a través de intercambiadores de calor. Se añadió álcali para neutralizar el aceite, y agua (2,5% en peso) y enzima (200 ppm de Purifine® 3G) antes de la exposición al mezclado de alto cizallamiento (IKA). Posteriormente, el aceite se transfirió a un depósito de reacción de Alva Laval. Después de dos horas de incubación, el aceite se transfirió a una centrífuga de disco Alva Laval de escala industrial para separarlo en una fracción oleosa y agua.

Adición química posterior a la enzima

Se llevó un aceite de soja expansor a una Unidad de Desgomado Semiindustrial (SIDU) provista por Alva Laval, a un flujo de 1000 kg/h. El aceite se enfrió a 55-60 °C, y se añadieron agua (2,5% en peso) y enzima (200 ppm de Purifine® 3G) antes de dispersarse usando un tratamiento de alto cizallamiento (IKA). Posteriormente, el aceite se transfirió a un depósito de reacción de Alva Laval. Después de dos horas de incubación, se añadieron 2000 ppm de ácido cítrico y el aceite se calentó a 85-90 °C. Posteriormente, el aceite se transfirió a una centrífuga de discos Alva Laval de escala industrial para separarlo en una fracción oleosa y agua.

El contenido de fósforo en los aceites de los dos procedimientos se analizó usando los métodos de ICP y HPLC descritos anteriormente. El contenido de fósforo en el aceite que se trató con ácido después de la etapa de desgomado enzimático fue menor que en el aceite que se trató con ácido y álcali antes de la etapa de desgomado enzimático. La eficiencia enzimática en ambos procedimientos se mantuvo igual.

Tabla 7. Contenido de fósforo en aceites obtenidos tras dos procedimientos diferentes de desgomado enzimático a escala piloto semiindustrial.

Ejemplo 5. Efecto del lavado final con ácido sobre el contenido de fósforo en aceite a escala semiindustrial

Lavado con agua después del desgomado (estándar)

El aceite de soja expansor se desgomó enzimáticamente usando 200 ppm de Purifine® 3G en un depósito de reacción Desmet Ballestra de 25 m3.

Después de la centrifugación, el aceite desgomado se llevó a una SIDU a un flujo de 1000 kg/h. El aceite se mezcló con agua (4,3% en peso) y se dispersó mediante un tratamiento de alto cizallamiento (IKA). Después de la incubación durante 60 minutos, el aceite se llevó a una temperatura de 85-90 °C y el aceite se separó en fracciones de aceite y agua usando centrifugación con discos apilados.

Lavado ácido post-desgomado

El aceite de soja expansor se desgomó enzimáticamente usando 200 ppm de Purifine® 3G en un depósito de reacción Desmet Ballestra de 25 m3.

Después de la centrifugación, el aceite desgomado se llevó a una SIDU a un flujo de 1000 kg/h. El aceite se mezcló con 750 ppm de ácido cítrico y se dispersó usando un tratamiento de alto cizallamiento (IKA). Después de una incubación de 60 min, se añadió agua (3% en peso total) y el aceite se llevó a una temperatura de 85-90 °C. Las fracciones de aceite y agua se separaron mediante centrifugación con discos apilados.

Todos los datos se analizaron usando el método de ICP descrito anteriormente.

Los resultados (promedio de cuatro mediciones) en la Tabla 8 muestran que el lavado del aceite con un ácido dio como resultado un contenido de fósforo más bajo que el lavado del aceite con agua.

Tabla 8. Contenido de fósforo (P) del aceite crudo y el aceite vegetal desgomado después del lavado con agua o ácido

Se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones a los compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento. Otros aspectos de los compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento serán evidentes a partir de la consideración de la memoria descriptiva y práctica de los compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren ejemplares.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para desgomar un aceite vegetal, que comprende:

a) Mezclar un álcali en solución acuosa con un aceite vegetal crudo para obtener una mezcla A-1 de aceite y agua que comprende una solución acuosa que tiene una fuerza iónica molal entre 0,001 y 0,5 mol/kg, b) Poner en contacto la mezcla A-1 de aceite y agua con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa para obtener una mezcla B-1 de aceite y agua,

c) Separar la mezcla B-1 de aceite y agua en una composición oleosa y una composición acuosa, y d) Lavar la composición oleosa con un ácido.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que además comprende producir un aceite vegetal desgomado.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la enzima que tiene una actividad de fosfolipasa comprende una fosfolipasa A1, una fosfolipasa A2, una fosfolipasa C y/o una fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el álcali se agrega en una cantidad de 10 a 500 ppm con respecto al aceite vegetal crudo.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el álcali se selecciona de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, silicato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, amoníaco o citrato de sodio, y combinaciones de los mismos.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa d) comprende además poner en contacto la composición oleosa con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa A.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde la mezcla B-1 de aceite y agua obtenida en la etapa b) se trata con una solución acuosa que comprende un ácido, un agente quelante de metales, un álcali, o una combinación de los mismos, para obtener una mezcla C-1 de aceite y agua, y la mezcla C-1 de aceite y agua se separa en una composición oleosa y una composición acuosa.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la solución acuosa comprende un ácido seleccionado de ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico y ácido succínico, o una combinación de los mismos.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la solución acuosa comprende EDTA como agente quelante de metales.

10. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la solución acuosa comprende un álcali seleccionado entre hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, silicato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, amoníaco y citrato de sodio, o una combinación de los mismos.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el tratamiento del aceite vegetal con la solución acuosa se realiza entre 30 segundos y 10 horas.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el procedimiento comprende además separar la composición oleosa después de lavarla en un aceite vegetal desgomado y una fracción acuosa.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ácido en la etapa de lavado es un ácido orgánico, un ácido inorgánico o una combinación de los mismos.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el ácido en la etapa de lavado se selecciona de ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico y ácido succínico, y combinaciones de los mismos.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el aceite vegetal desgomado comprende un contenido de fósforo (P) entre 0 y 30 ppm.

16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la etapa c) comprende además poner en contacto el aceite vegetal con una enzima que tiene actividad de fosfolipasa A.

17. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que además comprende el refinado del aceite vegetal desgomado.

18. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el aceite vegetal comprende aceite de canola, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de cacahuete, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de sésamo, aceite de soja, o aceite de semilla de girasol.