ES2930808T3 - Nanofibras híbridas de miel - Google Patents

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Aleman María Del Mar Romero
Rodriguez José Enrique Hernandez
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Abstract

La presente invención proporciona nanofibras híbridas que comprenden una mezcla de componentes de una miel y un polímero sintético. La invención proporciona además un método para producir las nanofibras híbridas. Las nanofibras híbridas de la invención se pueden utilizar en prótesis tubulares para la reconexión de nervios tras axotomía de nervios periféricos, en mallas quirúrgicas, apósitos y suturas, para mejorar la reinervación, y por tanto la recuperación funcional de lesiones en órganos diversos como la piel (pe quemaduras , úlceras, incisiones quirúrgicas, fístulas, etc.). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanofibras híbridas de miel
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de ingeniería tisular. En particular se refiere a la aplicación de nanofibras híbridas de miel para la regeneración nerviosa.
Antecedentes de la invención
El tejido nervioso controla la homeostasis de todos los órganos y sistemas del cuerpo. La correcta regeneración del tejido nervioso contribuye a la regeneración funcional de otros tejidos que forman diferentes órganos. Tras lesiones traumáticas, el éxito del recrecimiento axonal tanto en el Sistema Nervioso Central (SNC) como en amplios espacios entre cabos nerviosos periféricos, y la reinervación funcional en los tejidos diana consecuencia de lesiones del SNC, nervios periféricos o heridas locales (ej. heridas cutáneas) es actualmente un desafío en el campo de la biomedicina regenerativa. Los nervios periféricos presentan una capacidad de recrecimiento espontánea siempre que se restablezca el contacto entre los cabos nerviosos pues las células de Schwann del cabo nervioso distal ofrecen un microambiente favorable. Sin embargo, la estructura y función de los nervios regenerados difiere de las condiciones normales de salud. Además, la reinervación de los órganos diana suele ser clínicamente decepcionante con importantes y persistentes déficits funcionales.
Hasta ahora el procedimiento estrella para la regeneración de los nervios periféricos consiste en la sustitución de la zona dañada con tejidos autótrofos y heterótrofos. Sin embargo, éstos presentan importantes limitaciones como la reducida disponibilidad de los primeros y posibilidad de rechazo inmunológico de los últimos. Como alternativa, se ha propuesto el uso de materiales naturales y sintéticos que reproduzcan la organización micrométrica y nanométrica natural de la matriz extracelular de los tejidos sanos y que provean de un microambiente óptimo para la adhesión, crecimiento, proliferación y diferenciación celular.
En la literatura se reconoce la utilidad de polímeros sintéticos tales como poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) y ácido poli-L-láctico (PLLA) en el recrecimiento axonal [PLLA (Corey et al., J. Biomed. Mater Res. A 2007, 83(3)636-645; Wang et al., J. Neural Eng. 2009, 6(1), 016001), PHBV (Masaeli et al., 2013, PLoS One 8(2) e57157), Prabhakaran et al., 2013, Biotechnol. Bioeng.110(10)2775-84)]. Además, I Uslu et al (Hacettepe J. Biol. & Chem., 2010, 38(1)) divulga el uso de nanofibras híbridas de aloe vera con polímeros sintéticos de alcohol polivinilico/polivinilpirrolidona/polietilenglicol para vendaje de heridas. Gupta et al. (J. Biomater. Tissue Eng., 2013, 3(5) 503-11) divulgan nanofibras híbridas de aloe vera, alcohol polivinilo, óxido de polietileno y carboximetil celulosa. Jithendra et al. (ACS Appl. Matter. Interfaces, 2013, 5, 7291-8) divulgan nanofibras de aloe vera, colágeno y quitosano para ingeniería tisular. Shanmugavel et al. (J.Biomatter. Appl., 2013, 29(1) 46-58) divulgan nanofibras de aloe vera, fibroina de seda y caprolactona para ingeniería de tejido de huesos. Sungaya et al, 2014 divulgan nanofibras de aloe vera, fibroina de seda e hidroxiapatito para osteogéneis. Suganya et al. (Int. J. Bioi. Macromol. 68 (7), 135-143 (2014)) divulga estructuras nanofibrosas hechas por electrohilado de una dissolución que contiene PLACL, fibroína de seda y polvo de Aloe vera. Además, W02015/157485A describe un dispositivo para promover curación en un sitio de conexión entre estructuras biológicas tubulares comprende una construcción porosa de nanofibras hiladas a partir de un material biocompatible (policaprolactona, polilactida o poliglicólido) en una hoja. Además, Wang y Ji-Huan divulgan la producción de nanofibras híbridas de miel y alcohol polivinílico (PVA) (Thermal Science 2013, 17:1549-1550). Maleki et al. proponen el uso de nanofibras híbridas de miel y de PVA como vendaje para heridas (J. Appl. Polym. Sci 2013, 127:4086-4092). Arslán et al. describen la producción de nanofibras híbridas de miel y polietileno tereftalato (PET) y el uso potencial de las mismas como un apósito para heridas (J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2014, 25(10) :999-1012). Sarhan et al. publican la producción de nanofibras híbridas de miel, PVA y chitosan para su uso en ingeniería de tejidos y como apósito para heridas (Material Science and Engineering C 2016, 67:276-284; Materiales e interfaces aplicadas 2016 8:6379-6390). Ninguno de estos documentos menciona estructuras que sean eficientes en el crecimiento y regeneración de los tejidos nerviosos
Por tanto, existe la necesidad en el estado de la técnica de conseguir nuevas estructuras que sean más eficientes en la regeneración nerviosa, en particular en la reinervación funcional en los tejidos diana, nervios periféricos o heridas locales.
Descripción de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar estructuras que permitan la reconexión nerviosa tras axotomía de nervios periféricos para mejorar la recuperación sensitiva de lesiones en órganos sensoriales como la piel (ej. quemaduras, úlceras, incisiones quirúrgicas, etc.) entre otros. Las nanofibras híbridas proporcionadas en la presente invención promueven la regeneración nerviosa sirviendo adicionalmente como soporte estructural para el crecimiento del tejido nervioso. Además, la naturaleza biocompatible de las nanofibras híbridas de la invención evita el rechazo en el organismo.
En un primer aspecto la invención se refiere a nanofibras híbridas que comprenden
una mezcla de miel y un polímero sintético, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida-co-glicolida (PLGA), polihidroxialcanoatos (PHA), carbonato de polipropileno (PPC), y mezclas derivadas,
en donde las nanofibras híbridas comprenden
- entre 5 y 10% en peso de una miel; y
-10% en peso del polímero sintético.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de las nanofibras híbridas de arriba, en donde el procedimiento comprende:
a) preparar una solución de una miel en un disolvente seleccionado de hexafluoruro-2-propanol, polivinilalcohol (PVA), 1% ácido acético, o ácido trifluoroacético (TFA),
b) mezclar la solución de miel de la etapa a), con un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida-co-glicolida (PLGA), polihidroxialcanoatos (PHA), carbonato de polipropileno (PPC), y mezclas derivadas, para la formación de una solución polimérica híbrida, e
c) inyectar la mezcla de la etapa b) en un equipo de electrohilado para la fabricación de las nanofibras híbridas de miel por electrohilado.
En un aspecto, la invención se refiere a las nanofibras híbridas que comprenden una mezcla de miel y un polímero sintético, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida-co-glicolida (PLGA), polihidroxialcanoatos (PHA), carbonato de polipropileno (PPC), y mezclas derivadas, en donde las nanofibras híbridas comprenden entre 5 y 10% en peso de una miel y 10% en peso del polímero sintético para su uso como medicamento.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de las nanofibras hibridas que comprenden una mezcla de miel y un polímero sintético, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida-co-glicolida (PLGA), polihidroxialcanoatos (PHA), carbonato de polipropileno (PPC), y mezclas derivadas, en donde las nanofibras híbridas comprenden entre 5 y 10% en peso de una miel y 10% en peso del polímero sintético para uso en la regeneración del tejido nervioso; preferiblemente donde la regeneración del tejido nervioso ocurre mediante la promoción de crecimiento, proliferación o diferenciación de cualquier tipo de célula ubicada en cualquier tejido, órgano o sistema de órganos donde el tejido nervioso está presente. En particular, la regeneración o el crecimiento del tejido nervioso en presencia de las nanofíbras híbridas de la invención ocurre sin requerir la presencia de otros aditivos o factores de crecimiento que favorecen el crecimiento del tejido nervioso.
Además, la invención se también refiere al uso de las nanofibras hibridas que comprenden una mezcla de miel y un polímero sintético, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida-co-glicolida (PLGA), polihidroxialcanoatos (PHA), carbonato de polipropileno (PPC), y mezclas derivadas, en donde las nanofibras híbridas comprenden entre 5 y 10% en peso de una miel y 10% en peso del polímero sintético, para aplicaciones de ingeniería tisular.
Descripción de las figuras
Las figuras incluidas en la descripción ilustran realizaciones particulares de la presente invención. Además, en combinación con el texto de la descripción sirven para explicar los principios en los que se basa la invención.
La figura 1 enseña una tabla recogiendo las particulares condiciones de formación por electrohilado de nanofibras de polímero sintético, y de nanofibras híbridas de aloe vera (no según la invención).
La figura 2 enseña la micrografía obtenida por un microscopio electrónico de barrido, de polímeros electrohilados: A. PLLA, B. PLLA aloe vera, C. PDS, D. PDS aloe vera; E. Ph BV; F. PHBV aloe vera. Escalas (A-F): 60 pm. Escalas en el recuadro (A-F): 6 pm.
La figura 3 en seña imágenes de inmunofluorescencia de neuronas de explantes del ganglio de raíz dorsal (GRD) de rata cultivadas en presencia de nanofibras alineadas de polímero sintético PHBV (figure 3A), y en presencia de las nanofibras alineadas híbridas de PHBV y aloe vera (figure 3B) (no según la invención). La figura 3C es un esquema representativo de las figuras 3A y 3B, que muestra los cuerpos neuronales (estructuras esféricas) y sus prolongaciones nerviosas siguiendo el recorrido de las nanofibras alineadas. Las flechas en las figuras 3A, 3B y 3C indican la ubicación de los conos de crecimiento. Escala (3A y 3B): 200 pm.
La Figura 4 muestra la micrografía de microscopía electrónica de barrido de nanofibras no alineadas orientadas en diferentes direcciones una con respecto a otra: A. Miel PHVB; B. Aloe vera PHBV,y C. PHBV. Escala (Figuras 4A, 4B y 4C): 20 p.
La Figura 5A muestra una imagen de inmunofluorescencia (microscopio confocal) de neuronas de explantes del ganglio de raíz dorsal (GRD) de rata cultivadas en presencia de nanofibras no alineadas de la Figura 4A. Figura 5B es un diagrama representativo de la Figura 5A que muestra los cuerpos neuronales (estructura central esférica) y el crecimiento de sus neuritas siguiendo el recorrido de las nanofibras no alineadas.
Exposición detallada de la invención
Nanofibras híbridas de miel y polímero sintético
Las nanofibras híbridas comprenden una mezcla de una miel de abejas y un polímero sintético, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (p Hb v ), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), alcohol polivinilo (PVA), polilactida co-glicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC) y mezclas derivadas. En una realización particular, las nanofibras híbridas de miel pueden comprender una mezcla de los componentes de miel y poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico tales como Z3A1 o Z9A1 (Biomer Technology LTD), DegraPol® (poliéster uretano formado por dos poliéster dioles unidos por un grupo isocianato) o Desmopan® 9370A (éter de 4 átomos de carbono) de Bayer.
En una realización preferida, las nanofibras híbridas de miel y polímero sintético comprenden una mezcla de los componentes de una miel de abejas y un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS) y mezclas derivadas.
La miel es producida por las abejas a partir del néctar de las flores o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores de plantas. La miel de abejas se extrae directamente del panal de abejas y es conservada en un recipiente estéril a 8°C antes de la formación de las nanofibras híbridas.
Para la preparación de las nanofibras híbridas de miel, la miel utilizada puede ser cualquier tipo de miel. En particular, la miel utilizada puede ser miel de flores tal como miel monofloral, multifloral, de sierra, de montaña o del desierto. La miel de las nanofibras híbridas también puede ser miel de mielada, rocío de miel, miel de rocío o miel de bosque.
En general, la composición de la miel conocida en el estado de la técnica comprende los siguientes componentes:
- 14-22% en peso de agua,
- 28-44% en peso de fructosa,
- 22-40% en peso de glucosa,
- 0,2-7% en peso de sacarosa,
- 2-16% en peso de maltosa,
- 0,1-8% en peso de otros azúcares,
- 0,2-2% en peso de proteínas y aminoácidos,
- 0,5-1% en peso de vitaminas, enzimas, hormonas y ácidos orgánicos,
- 0,5-1% en peso de minerales, y
- 0,2-1% en peso de cenizas.
En una realización particular la composición de la miel comprende:
- 18% en peso de agua,
- 38% en peso de fructosa,
- 31% en peso de glucosa,
- 1% en peso de sacarosa,
- 7,5% en peso de maltosa, y
- 5% en peso de otros azúcares.
La miel utilizada por los inventores procede de un apicultor local de las Palmas de Gran Canaria inscrito en el Registro General Sanitario de Empresas Alimentarias y Alimentos (RGSEAA): María del Rosario Cazorla López, N° RGSEAA: 23.03229/GC.
Las nanofibras híbridas de miel que comprenden una mezcla de los componentes de una miel y un polímero sintético, contienen entre 5 y 10% en peso de los componentes de una miel y 10% en peso de un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), , policaprolactona (PCL), alcohol polivinilo (PVA), polilactida co-glicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC) y poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico tales como Z3A1 o Z9A1 (Biomer Technology LTD), DegraPol® (poliéster uretano formado por dos poliéster dioles unidos por un grupo isocianato), Desmopan® 9370A (éter de 4 átomos de carbono) de Bayer o mezclas derivadas. Preferiblemente, las nanofibras híbridas contienen entre 6 y 8% en peso de una miel y 10% en peso de un polímero sintético.
En una realización particular la relación en peso de los componentes de miel y polímero sintético en las nanofibras híbridas de la invención está comprendida entre 33:67 y 50:50. Preferiblemente, la relación en peso de los componentes de miel y polímero sintético está comprendida entre 35:65 y 48:52, preferiblemente entre 37: 62 y 46:54, más preferiblemente entre 40:60 y 45:55. En una realización preferida, la relación en peso miel/ polímero sintético está comprendida entre 42:58 y 44:56.
En una realización particular, las nanofibras híbridas de miel y polímero sintético de la invención presentan un diámetro aproximado de entre 0,3 y 1,5 micras, preferiblemente entre 0,5 y 1,3, más preferiblemente entre 0,7 y 1,2. En otra realización, las nanofibras híbridas de miel y polímero sintético de la invención presentan un diámetro aproximado de entre 0,8 y 1,1 micras, preferiblemente entre 0,9 y 1 micra. Las nanofibras híbridas de miel, al igual que las nanofibras híbridas de aloe vera, sirven como soporte para la adherencia y guía de las células nerviosas en el crecimiento axonal en un proceso regenerativo y de cicatrización de cualquier tejido u órgano que presente estructuras nerviosas. En particular, las nanofibras híbridas de miel de la presente invención sirven como soporte para la regeneración axonal en el sistema nervioso periférico (SNP) y sistema nervioso central (SNC).
En otra realización, las nanofibras híbridas de miel de la invención pueden estar alineadas, es decir orientadas en una misma dirección, o bien desordenadas, es decir orientadas en distinta dirección unas respecto a otras. Preferiblemente, las nanofibras híbridas de miel de la invención están alineadas.
En una realización particular, las nanofibras híbridas de miel que comprenden una mezcla de componentes de una miel, y poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), presentan un diámetro promedio entre 0,8 y 1,5 micras y están alineadas en una determinada dirección unas respecto a otras.
En otra realización particular, las nanofibras híbridas de miel que comprenden una mezcla de componentes de una miel, y ácido poli-L-láctico (PLLA), presentan un diámetro promedio entre 0,8 y 1,5 micras y están alineadas en una determinada dirección u orientadas en distinta dirección unas respecto a otras.
En otra realización particular, las nanofibras híbridas de miel que comprenden una mezcla de componentes de una miel, y polidioxanona (PDS), presentan un diámetro promedio entre 0,8 y 1,5 micras y están alineadas en una determinada dirección u orientadas en distinta dirección unas respecto a otras.
Procedimiento de fabricación de las nanofibras híbridas de miel y polímero sintético
Las nanofibras híbridas de miel y polímero sintético de la invención pueden ser obtenidas por un procedimiento de fabricación similar al utilizado para la fabricación de las fibras híbridas de aloe vera y polímero sintético. El procedimiento para la fabricación de las nanofibras híbridas de miel comprende:
a) preparar una solución de una miel en un disolvente seleccionado de hexafluoruro-2-propanol, polivinilalcohol (PVA), ácido acético 1% y ácido trifluoroacético (TFA).
b) mezclar la solución de miel de la etapa a), con un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida coglicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico y mezclas derivadas, para la formación de una solución polimérica híbrida, e
c) inyectar la mezcla de la etapa b) en un equipo de electrohilado para la fabricación de las nanofibras híbridas de miel por electrohilado.
Según el procedimiento más arriba descrito, en la etapa a) se prepara una solución de miel, en hexafluoruro-2-propanol (HFIP), polivinilalcohol (PVA), ácido acético 1% y ácido trifluoroacético (TFA). Dicha solución suele presentar una concentración de 50 a 100 mg/ml de miel.
En la etapa b) del procedimiento descrito más arriba, la solución de miel de la etapa a) se mezcla con un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), policaprolactona (PCL), polilactida co-glicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico tales como Z3A1 o Z9A1, DegraPol® o Desmopan® 9370A y mezclas derivadas, para la formación de una solución polimérica híbrida.
En una realización particular, la relación en peso de la miel y el polímero sintético en la solución polimérica híbrida se encuentra comprendida entre 33:67 y 50:50 (miel: polímero sintético). Preferiblemente, la relación en peso miel/ polímero sintético en la solución polimérica híbrida está comprendida entre 35:65 y 48:52, preferiblemente entre 37: 62 y 46:54, más preferiblemente entre 40:60 y 45:55. En una realización preferida, la relación en peso miel/ polímero sintético en la solución polimérica híbrida está comprendida entre 42:58 y 44:56.
En la etapa c) del procedimiento de la invención, la mezcla de la etapa b) se inyecta en un equipo de electrohilado para la fabricación de las nanofibras híbridas de miel por electrohilado. En particular, la mezcla se carga en una bomba de jeringas conectada a un electrodo. La solución es propulsada a una velocidad de flujo de entre 2 y 3 ml/h, preferiblemente a una velocidad de flujo entre 2,5 y 3 ml/h, más preferiblemente entre 2,5 y 2,8 ml/h; y aplicando un potencial de 7 a 11 kV, preferiblemente de 8 a 10 kV, más preferiblemente de 8 a 9 kV, desde la jeringa hacia una rueda colectora en rotación. La rueda colectora de rotación puede girar a una velocidad de entre 2000 y 4000 rpm, preferiblemente de 3000 rpm. La rueda colectora de rotación se encuentra situada a una distancia de 8 a 12 cm de la bomba de jeringas, preferiblemente a una distancia de 9 a 11 cm de la bomba de jeringas, más preferiblemente a una distancia de 10 cm de la bomba de jeringas. Las condiciones utilizadas en el electrohilado son condiciones ambientales de 60-70% de humedad y 20-25°C de temperatura.
Las nanofibras híbridas obtenidas por el procedimiento anteriormente descrito comprenden una mezcla de componentes de una miel y un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA) y polidioxanona (PDS), policaprolactona (PCL), poliactida co-glicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico tales como Z3A1 o Z9A1, DegraPol® o Desmopan® 9370A y mezclas derivadas, donde las nanofibras híbridas presentan un diámetro promedio comprendido entre 0,3 y 1,5 micras. En una realización preferida, las nanofibras híbridas obtenidas por el procedimiento anteriormente descrito comprenden una mezcla de miel y un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS) y mezclas derivadas.
Las nanofibras híbridas de miel pueden ser utilizadas para aplicaciones de ingeniería tisular, en particular para la regeneración del tejido nervioso.
En este sentido, las nanofibras híbridas de miel pueden ser utilizadas para la regeneración del tejido nervioso en prótesis de conexión nerviosa, apósitos, suturas en heridas cutáneas y mallas quirúrgicas. Por lo tanto, la invención se refiere a prótesis de conexión nerviosa, apósitos, suturas en heridas cutáneas o mallas quirúrgicas que comprenden las nanofibras híbridas de miel que se han descrito. Asimismo, las fibras híbridas de miel pueden ser utilizadas en vendajes y apósitos para cubrir heridas.
Las nanofibras de miel híbrida también se pueden utilizar para regenerar otros tejidos, como tendones, ligamentos y tejidos de huesos.
La invención se refiere a las nanofibras híbridas de miel de la invención para su uso como medicamento. Asimismo, la invención se refiere a las nanofibras híbridas de miel para su uso en el tratamiento de regeneración del tejido nervioso de cualquier vertebrado, o de crecimiento, proliferación o diferenciación de cualquier tipo celular localizado en cualquier tejido, órgano, o sistema de órganos donde el tejido nervioso esté presente.
Ejemplos
1. Preparación de fibras híbridas alineadas de aloe vera y polímero sintético (no según la invención)
Inicialmente, se preparó una solución de 25-50 mg/ml de aloe vera (Prod. n° 001, Laboratorios Luciano Reverón e hijos S.L., Tenerife) en Hexafluoro-2-propanol (HFIP). Para obtener la solución híbridas (AV/PHBV) se añadió 10-12% (w/w) de PHBV (Sigma-Aldrich, Prod. n° 403121) a la solución anterior. Para obtener nanofibras alineadas mediante la técnica de electrospining, la solución polimérica híbrida se cargó en una bomba de jeringas (Hardvard Apparatus PhD Ultra) con una aguja (G20, 0.9 mm diámetro) cuya punta se conectó a un electrodo (spinnerette). Se aplicó 12­ 15 Kv con una fuente de alto voltaje (Spellman 60N300) mientras la bomba de jeringas disparaba la solución (velocidad de flujo de 0.9 ml/h) en condiciones ambientales de 60-65% humedad y de 22-25°C de temperatura hacia una rueda diana (90 mm diámetro/12mm grosor) situada a 12 cm del electrodo. En la rueda diana rotando a 3000 rpm se recolectaron los haces de nanofibras alineadas. En la figura 2F se muestran las micrografías SEM de las nanofibras obtenidas.
Además, las fibras híbridas alineadas de la invención consisten en PLLA y Aloe vera, PDS y Aloe vera y PHVB y aloe vera y las fibras poliméricas sintéticas PLLA, PDS y PHBV fueron
preparadas siguiendo el mismo método. Las figuras 2 A-E muestran las micrografías SEM de las fibras alineadas obtenidas por los polímeros sintéticos PLLA (Fig. 2A), PDS (Fig. 2C) y PHBV (Figura 2E); así como de las fibras híbridas de aloe vera de la invención que consisten en PLLA+ Aloe vera( Fig. 2B); PDS Aloe Vera ( Figura 2D) según el mismo método que se ha descrito.
2.- Ensayos comparativos del crecim iento neurítico
Se realizaron ensayos comparativos a partir del cultivo de explantes del ganglio de la raíz dorsal (GRD) de rata neonatal (Sprague Dawley) en a) medio de cultivo standard [DMEM/F12 (1:1)] para establecer las condiciones control y b) DMEM/F12 (1:1) conteniendo la matriz nanométrica híbrida inventada (Av /PHBV) y otras puras de referencia (PHBV y PLLA) como sustrato experimental del crecimiento neurítico. Los explantes de GRD de rata se incubaron en estufa a 37°C y atmósfera con 5% CO2 durante 6 días y renovación del medio de cultivo a los 3 días.
Pasado el periodo de incubación, los explantes de GRD de rata se fijaron con una solución de 4% paraformaldehído en tampón fosfato salino y se inmunomarcaron anticuerpos específicos para la identificación de neuronas. Posteriormente se tomaron imágenes digitales en un microscopio de fluorescencia dotado con sistema de captación de imágenes. Las imágenes fueron procesadas para su análisis estadístico.
Se realizó un análisis estadístico en cada uno de los polímeros resumiendo las relaciones de área positivas por medianas y rangos intercuartiles en cada uno de los grupos de tratamiento. Los análisis estadísticos demostraron que la mayor tasa de crecimiento neurítico se produjo con las nanofibras híbridas alineadas AV/PHBV en comparación con la ausencia de aloe en nanofibras alineadas PHBV puras (p<0.001) y PLLA puras (p=0.049).
3. - Preparación de fibras híbridas orientadas en diferentes direcciones una con respecto a la otra (no según la invención)
Primero, se preparó una solución de 50 mg/ml de Aloe vera (Prod. No. 001, Laboratorios Luciano Reverón e hijos S.L Tenerife) en hexafluoro-2-propanol (HFIP). El Aloe vera de la solución se liofilizó y se filtró una solución de Aloe vera que tenía un tamaño de 22 ps. Para obtener la solución híbrida (AV/PHBV), 10% en peso de PHBV (Sigma-Aldrich, Prod. No. 403121) se añadió a la solución anterior (400 mg de p HbV en 3.600 mg de HFIP+ Aloe vera).
Para obtener las nanofibras mediante la técnica de electrohilado, la solución de polímero híbrido se cargó en una bomba de jeringas (Hardvard Apparatus PhD Ultra) con una aguja (16G) cuya punta se conectó a un electrodo (spinnerette). Se aplicó 9 Kv con una fuente de alto voltaje (Spellman 60N300) mientras la bomba de jeringas disparaba la solución (velocidad de flujo de 2.75 ml/h) en condiciones ambientales de 60-65% humedad y de 25-26°C de temperatura hacia una rueda diana (90 mm diámetro/8 mm grosor) situada a 10 cm del electrodo. En la rueda diana rotando a 200 rpm se recolectaron las nanofibras no alineadas orientadas en diferentes direcciones una con respecto a la otra. En la figura 4B se muestran las micrografías SEM de las nanofibras híbridas de Aloe vera obtenidas.
Los diámetros de las nanofibras obtenidas se midieron a partir de las imágenes SEM utilizando el programa informático Image J (NIH, EE. UU.). El diámetro promedio medido de las nanofibras híbridas de Aloe vera obtenidas es de 1.0241 pm, mientras que el diámetro de las nanofibras híbridas no alineadas que se obtuvieron oscilaron entre 0.9854 pm y 1.0628 pm.
El mismo metodo se siguió para fabricar fibras de miel híbridas no alineadas orientadas en diferentes direcciones la una respecto a la otra, pero usando miel de un apicultor local en Gran Canaria que esté inscrito en el Registro General de Sanidad de Empresas de Alimentos y Productos Alimenticios (RGSEAA) : Maria del Rosario Cazorla Lopez, RGSEAA No. : 23.0322 9/GC, en lugar de Aloe vera. La Figura 4A muestra micrografías SEM de miel híbrida y nanofibras de PHBV que se obtuvieron. Los diámetros de las nanofibras obtenidas se midieron a partir de las imágenes SEM utilizando el programa informático Image J (NIH, EE. UU.). El diámetro medio medido de las nanofibras híbridas de miel obtenidas es de 1.2528 pm, el diámetro de las nanofibras híbridas no alineadas que se obtuvieron caen en el rango entre 0.9801 pm y 1.5255 pm.
Se prepararon nanofibras de PHVB no alineadas para comparativa. En este caso, se añadió 12% en peso de PHBV (Sigma-Aldrich, Prod. No. 403121) en hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener un solución con una concentración del 10% en peso de PHBV. La solución de polímero híbrido se cargó en una bomba de jeringas (Hardvard Apparatus PhD Ultra) con una aguja (16G) cuya punta se conectó a un electrodo (spinnerette). Se aplicó 12 Kv con una fuente de alto voltaje (Spellman 60N300) mientras la bomba de jeringas disparaba la solución (velocidad de flujo de 1 ml/h) en condiciones ambientales de 60-65% humedad y de 25-26°C de temperatura hacia una rueda diana (90 mm diámetro/8 mm grosor) situada a 12 cm del electrodo. En la rueda diana rotando a 200 rpm se recolectaron las nanofibras orientadas en diferentes direcciones una con respecto a la otra. La Figura 4C muestra micrografías SEM de las nanofibras que se obtuvieron. Se midieron los diámetros de las nanofibras obtenidas a partir de las imágenes SEM utilizando el programa informático Image J (NIH, EE. UU.). El diámetro promedio medido de las nanofibras de PHVB no alineadas es de 0.9130 pm, el diámetro de las nanofibras de PHVB no alineadas obtenidas siendo en el rango entre 0.7803 pm y 1.0457 pm.
4. Ensayos comparativos de crecim iento neurítico in vitro
Se realizaron ensayos comparativos a partir del cultivo de explantes del ganglio de la raíz dorsal (GRD) de rata neonatal (Sprague Dawley) en medio de cultivo standard [DMEM/F12 (1:1)], la matriz nanométrica que contiene las fibras de miel/PHBV, AV/PHBV, e PHBV del ejemplo 3 como sustrato experimental del crecimiento neurítico. Los explantes de GRD de rata se incubaron en estufa a 37°C y atmósfera con 5% CO2 durante 6 días y renovación del medio de cultivo a los 3 días.
Pasado el periodo de incubación, los explantes de GRD de rata se fijaron con una solución de 4% paraformaldehído en tampón fosfato salino y se inmunomarcaron anticuerpos específicos para la identificación de neuronas, células de Schwann y núcleos celulares. Se tomaron imágenes digitales en un microscopio de fluorescencia dotado con sistema de captación de imágenes. Se observó un mayor crecimiento neurítico en presencia de nanofibras híbridas de miel/PHBV y AV/PHBV que en presencia de nanofibras de PHBV. La Figura 5A muestra la imagen de inmunofluorescencia del crecimiento de muchas neuritas en todas las direcciones desde el explante de DRG de rata (estructura central esférica en la imagen). Las neuritas en crecimiento siguen el recorrido de las nanofibras híbridas no alineadas, como se muestra en el diagrama de la Figura 5B.
5. Ensayos comparativos de cicatrización de heridas cutáneas in vivo
Con la preceptiva autorización del Comité de Ética de Experimentación Animal, se utilizó el modelo murino de reparación (anillo subcutáneo) de heridas (8 mm de diámetro) para simular la cicatrización por segunda intención en humanos (úlceras cutáneas crónicas). Se realizó un estudio comparativo del efecto de la matriz nanométrica que contiene las nanofibras híbridas no alineadas de miel/PHBV, AV/PHBV y PHBV del ejemplo 3 con tratamientos diarios con miel natural y apósito comercial (Mepilex border). Las matrices mencionadas se aplicaron sobre el lecho de la herida sin más cuidado que protegerlo con un adhesivo quirúrgico. Después de 8 días, las muestras se tomaron para cultivos microbiológicos (Staphylococcus aureus y E. coli). Los datos preliminares indican que el cierre de la herida ocurrió antes en los grupos tratados con las matrices híbridas: miel/PHBV (12,5 días en promedio), AV/PHBV (13 días en promedio) y tratamientos diarios con miel natural (13,3 días en promedio). promedio) en comparación con los grupos tratados con matriz PHBV pura (14.3 días en promedio) o el apósito comercial (15 días en promedio). Los análisis bacteriológicos fueron negativos.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Nanofibras híbridas que comprenden una mezcla de una miel y un polímero sintético, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), alcohol polivinilo (PVA), polilactida co-glicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC) y mezclas derivadas; y donde dichas nanofíbras comprenden
- entre 5 y 10% en peso de una miel; y
-10% en peso del polímero sintético.
2. Las nanofibras híbridas según la reivindicación 1, donde el polímero sintético se selecciona de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), y mezclas derivadas.
3. Las nanofibras híbridas según cualquiera de las reivindicaciónes 1 a 2, donde el polímero sintético es poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV).
4. Las nanofibras híbridas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las nanofibras híbridas contienen entre 6 y 8% en peso de una miel y 10% en peso del polímero sintético.
5. Las nanofibras híbridas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la relación en peso de miel y polímero sintético en las nanofibras híbridas está comprendida entre 33:67 y 50:50.
6. Las nanofibras híbridas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el diámetro promedio de las nanofibras híbridas está comprendido entre 0,3 y 1,5 micras.
7. Las nanofibras híbridas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichas nanofibras están alineadas en una dirección específica u orientadas en diferentes direcciones una con respecto a la otra.
8. Las nanofibras híbridas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dichas nanofibras comprenden una mezcla de una miel y un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (p LlA) o polidioxanona (PDS),
donde dichas nanofibras híbridas tienen un diámetro promedio entre 0,8 y 1,5 micras, y donde las nanofibras están alineadas en una dirección específica u orientadas en diferentes direcciones una con respecto a la otra.
9. Un procedimiento para la fabricación de nanofibras híbridas según las reivindicaciones 1 a 8, donde el procedimiento comprende:
a) preparar una solución de una miel en un disolvente seleccionado de hexafluoruro-2-propanol (HFIP), polivinilalcohol (PVA), ácido acético 1%, o ácido trifluoroacético (TFA).
b) mezclar la solución de miel de la etapa a), con un polímero sintético seleccionado de poli-3-hidroxibutiratoco-3-hidroxivalerato (PHBV), ácido poli-L-láctico (PLLA), polidioxanona (PDS), poliuretanos termoplásticos biodegradables de uso médico, policaprolactona (PCL), polilactida co-glicólido (PLGA), polihidroxialkanoatos (PHAs), carbonato de polipropileno (PPC), y mezclas derivadas, para la formación de una solución polimérica híbrida, e
c) inyectar la mezcla de la etapa b) en un equipo de electrohilado para la fabricación de nanofibras híbridas de miel por electrohilado.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, donde en la etapa b) la relación en peso de la miel y el polímero sintético está comprendida entre 33:67 y 50:50.
11. Nanofibras híbridas según la reivindicación 1 para su uso como medicamento.
12. Nanofibras híbridas según la reivindicación 1, para su uso en la regeneración del tejido nervioso.
13. Nanofibras híbridas para su uso según la reivindicación 12, donde la regeneración del tejido nervioso tiene lugar promoviendo el crecimiento, proliferación o diferenciación de cualquier tipo de célula localizada en cualquier tejido, órgano o sistema donde el tejido nervioso esté presente.
14. Nanofibras híbridas según la reivindicación 1 para aplicaciones de ingeniería de tejidos; preferiblemente para aplicaciones de ingeniería de tejidos nerviosos.
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