ES2928425T3

ES2928425T3 - Compuestos lipopeptídicos para el tratamiento de trastornos del dolor

Info

Publication number: ES2928425T3
Application number: ES18719204T
Authority: ES
Inventors: Nicolas Cenac; Justine Bertrand-Michel; Teresa Perez-Berezo; Thierry Durand; Jean-Marie Galano; Julien Pujo; Eric Oswald; Patricia Martin; Faouder Pauline Le; Alexandre Guy
Original assignee: Ecole Nat Veterinaire De Toulouse; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM; Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse; Universite de Montpellier; Universite Toulouse III Paul Sabatier; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Current assignee: Ecole Nat Veterinaire De Toulouse; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM; Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse; Universite de Montpellier; Universite Toulouse III Paul Sabatier; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2022-11-17
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: EP3615511B1; US11912645B2; WO2018197666A1; US20200048187A1; EP3615511A1; DK3615511T3

Abstract

La invención se basa en el descubrimiento de un nuevo compuesto bacteriano con propiedades analgésicas que podría utilizarse como una nueva herramienta para el tratamiento de trastornos del dolor como el dolor visceral. Estudiando los mecanismos implicados en las propiedades analgésicas de la cepa probiótica de Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), los inventores caracterizaron los aminoácidos grasos producidos por EcN, que muestran las propiedades analgésicas de Ecn. Uno de estos compuestos inhibe la hipersensibilidad a la distensión colorrectal inducida por la capsaicina, que es un compuesto nociceptivo muy potente y actúa a través del receptor GABA B. Además, los inventores demuestran que este compuesto es capaz de atravesar la barrera epitelial celular (como el epitelio intestinal). Así, la invención se refiere a un compuesto lipopeptídico, derivado del ácido gamma-aminobutírico. La invención también se refiere a un compuesto lipopeptídico según la invención para el tratamiento de trastornos del dolor, como el dolor somático y el dolor visceral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos lipopeptídicos para el tratamiento de trastornos del dolor

Sector de la técnica

La invención se refiere a un compuesto lipopeptídico como se define en las reivindicaciones que es adecuado para el tratamiento de trastornos del dolor.

Estado de la técnica

El dolor es una sensación desagradable a menudo causada por estímulos intensos o dañinos. La definición ampliamente utilizada de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor establece: "El dolor es una experiencia sensorial y emocional desagradable asociada con un daño tisular real o potencial, o descrita en términos de dicho daño". Por ejemplo, el dolor crónico es un problema común que constituye un gran desafío para los proveedores de atención médica debido a su compleja historia natural, etiología poco clara y mala respuesta al tratamiento. El dolor crónico es una afección pobremente definida. La mayoría de los autores consideran el dolor continuo que dura más de 6 meses como diagnóstico, mientras que otros han utilizado 3 meses como criterio mínimo. En el dolor crónico, el parámetro de duración se usa arbitrariamente. Algunos autores sugieren que cualquier dolor que persista más tiempo que el tiempo de curación esperado razonable para los tejidos afectados debe considerarse dolor crónico. La fisiopatología del dolor crónico es multifactorial y compleja y aún no se comprende bien. Varios trastornos neuromusculares, reproductivos, gastrointestinales y urológicos pueden causar o contribuir al dolor crónico.

El síndrome del intestino irritable (SII) es un trastorno gastrointestinal (GI) funcional caracterizado por episodios recurrentes de dolor/malestar abdominal y cambios en el hábito intestinal (por ejemplo, estreñimiento, diarrea)1. Con una prevalencia mundial de ~11 %1, el SII constituye una de las afecciones más comunes que llevan a la derivación gastroenterológica y resulta en una carga de enfermedad considerable. Si bien la fisiopatología del SII no se comprende completamente, se ha propuesto la hipersensibilidad visceral (HV; mayor sensibilidad de la pared intestinal a los estímulos locales) como un mecanismo clave subyacente al dolor abdominal, uno de los síntomas más debilitantes y problemáticos de este trastorno2-4. Los tratamientos actuales para el SII están principalmente orientados a los síntomas; sin embargo, la eficacia general es baja y no hay medicamentos específicamente aprobados para el dolor abdominal5. Por lo tanto, las herramientas farmacológicas selectivas dirigidas a la HV pueden considerarse un enfoque terapéutico adecuado para el tratamiento del dolor visceral y el desarrollo de nuevas terapias para el SII.

Los datos de la investigación clínica sugieren que ciertas cepas bacterianas probióticas tienen el potencial de modular el dolor abdominal en el SII6-9. Sin embargo, estos datos difieren considerablemente entre los estudios debido a las cepas bacterianas probióticas utilizadas para el tratamiento y la heterogeneidad de los grupos de SII incluidos. Asimismo, los mecanismos de acción responsables de los efectos terapéuticos declarados difieren de una cepa a otra.

El documento WO2010/109284 desvela lipopéptidos ultracortos que demuestran actividad antimicrobiana. Sin embargo, no son adecuados para el tratamiento del dolor.

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) es el componente activo de Mutaflor® (Ardeypharm GmbH, Herdecke, Alemania), un fármaco probiótico autorizado en varios países para el tratamiento de múltiples trastornos intestinales10. Los ensayos clínicos han demostrado que la EcN es eficaz para el tratamiento del dolor abdominal en pacientes con SII1112 pero se sabe muy poco sobre los mecanismos específicos a través de los cuales EcN ejerce los efectos analgésicos atribuidos. Se sabe que EcN alberga una isla genómica, denominada pks, que lleva un grupo de genes que permite la síntesis de policétidos peptídicos híbridos y especialmente una genotoxina llamada colibactina (fig. S1)13. La colibactina es una PK-NRP estructuralmente no caracterizada que se cree que surge de un profármaco llamado precolibactina, que tampoco se ha dilucidado completamente estructuralmente14,15. Esta toxina es producida por una maquinaria biosintética compleja que involucra la acción secuencial de las proteínas ClbA a ClbS16. La maquinaria central consta de tres policétido sintasas, tres péptido sintetasas no ribosomales y dos híbridos PKS-NRPS16. La maquinaria también emplea proteínas de maduración adicionales y bomba(s) de expulsión. ClbA una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) esencial para la activación de las enzimas n Rp S y PKS16. ClbA es obligatoria para la biosíntesis de colibactina13 pero también participa en la biosíntesis de otros metabolitos bioactivos como los sideróforos enterobactina, salmoquelina y yersiniabactina17. Después de la activación por ClbA, el NRPS ClbN iniciador usa Asn como sustrato para generar una N-miristoil-D-Asn. La línea de ensamblaje de NRPS-PKS continúa la síntesis de compuestos de precolibactina utilizando malonil-coA y diferentes aminoácidos18'20 como sustratos. Luego, la precolibactina es escindida por la peptidasa ClbP para liberar colibactina y N-miristoil-D-Asn (C14-Asn, fig. S1 )182122.

Sorprendentemente, aunque se demostró que la colibactina es un factor de virulencia de buena fe y un agente cancerígeno putativo13, esta genotoxina también es producida por EcN. Aparentemente, la actividad probiótica de EcN no puede disociarse de su actividad genotóxica, ya que la inactivación de clbA requerida para la activación de las enzimas NRPS y PKS que conducen a la producción de colibactina también atenúa la actividad probiótica de EcN en la colitis experimental23. Una posible explicación para el papel dual de la colibactina en EcN puede ser que el código de la isla pks para compuestos bioactivos adicionales distintos de la colibactina e involucrados en la actividad probiótica1624 Esta hipótesis se ha visto reforzada recientemente por la caracterización estructural de varias moléculas pequeñas dependientes de la ruta de la colibactina14,15,22 Por ende, la identificación y caracterización funcional de nuevas moléculas derivadas de los grupos de genes biosintéticos híbridos PKS-NRPS que codifican colibactina pueden ayudar a descifrar algunos de los mecanismos que respaldan la capacidad de EcN para modular el dolor abdominal y, por lo tanto, permitiendo el diseño de nuevos agentes analgésicos desprovistos de propiedades genotóxicas. En este caso, se describe un trabajo interdisciplinario que ha llevado al aislamiento y elucidación estructural de un nuevo metabolito codificado por la isla pks que muestra potentes propiedades anti-nociceptivas in vitro y en vivo. Si bien se ha descrito un mayor número de moléculas pequeñas derivadas de los grupos de genes biosintéticos híbridos PKS-NRPS que codifican colibactina181922, este es el primer estudio que caracteriza un metabolito bioactivo no genotóxico in vivo. Este compuesto analgésico producido por bacterias probióticas puede representar un agente terapéutico prometedor en el dolor somático y el dolor visceral.

Objeto de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de un nuevo compuesto bacteriano con propiedades analgésicas que podría utilizarse como una nueva herramienta para el tratamiento de trastornos del dolor como el dolor visceral (es decir, el SII). El estudio de los mecanismos implicados en las propiedades analgésicas del probiótico Escherichia coli cepa Nissle 1917 (EcN) ha permitido a los inventores caracterizar, por cromatografía acoplada con espectrometría de masas de alta resolución y estudios genéticos, un aminoácido graso con propiedades analgésicas potenciales. Este compuesto es capaz de inhibir la hipersensibilidad a la distensión colorrectal inducida por la capsaicina, que es un potente compuesto nociceptivo y actúa a través del receptor GABA B.

Por otra parte, los inventores han demostrado que este compuesto es capaz de atravesar una monocapa de células epiteliales intestinales humanas in vitro y colon de ratón in vivo. En cambio, el GABA solo no pudo atravesar el epitelio. En ratones no tratados anteriormente, este compuesto se cuantifica en todos los compartimentos analizados (sistema nervioso central, sangre y periférico). En función de su capacidad para atravesar las barreras epiteliales y hematoencefálicas, los inventores consideran que este compuesto podría ser utilizado para el dolor somático con una aplicación directa sobre la piel.

Por lo tanto, la invención se refiere a un compuesto lipopeptídico derivado del ácido gamma-aminobutírico de fórmula I (véase más adelante).

La invención se refiere también a un compuesto lipopeptídico según la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno de dolor, tal como el dolor somático y el dolor visceral.

Otro objeto de la invención se refiere a una composición terapéutica que comprende un compuesto lipopeptídico, como se ha definido anteriormente.

Para finalizar, también se describe un método para sintetizar el compuesto lipopeptídico.

Descripción detallada de la invención:

Compuesto lipopeptídico

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que tiene la siguiente estructura de fórmula (I):

RC(O)-Xaa-Xbb-Y (I),

en donde

- R es una cadena hidrocarbonada C5-C19 (grasa),

- Xaa es una asparagina o un aminoácido polar y no cargado equivalente seleccionado entre la lista que consiste en resto serina, treonina o glutamina,

- Xbb es un resto de ácido gamma-aminobutírico,

- Y es -OH o NH2,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Estructuralmente, las membranas celulares constituyen un conjunto complejo de lípidos, proteínas y azúcares (u osas) organizados sobre la base de una doble hoja de fosfolípidos. Por lo tanto, las membranas celulares actúan como verdaderas barreras fisicoquímicas a través de la regulación del intercambio de materia celular. Por ejemplo, el GABA solo no puede atravesar la membrana celular. La capacidad del compuesto de la invención para atravesar la barrera epitelial celular está ligada a la cadena hidrocarbonada (grasa) del compuesto que debe contener al menos 5 carbonos para atravesar la membrana celular.

La expresión "cadena hidrocarbonada C5-C19 (grasa)" significa una cadena hidrocarbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada, que comprende de 5 a 19 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, un alquilo, alquenilo o alquinilo, etc.

En una realización, R se selecciona entre la lista que consiste en alquilo, alquenilo o alquinilo.

En una realización específica, R es un alquilo C5-C19. En una realización más específica, R es un alquilo C11.

Grupo "alquilo C5-C19" significa una cadena hidrocarbonada saturada, lineal o ramificada, que comprende de 1 a 19 átomos de carbono.

En una realización específica, el alquilo C5-C19 del compuesto según la presente invención tiene la siguiente estructura:

CH3-CyHx-, donde y = 4 a 18, x = 2y. En realizaciones específicas, y = 8 a 14. Por ejemplo, y = 10.

El término ácido gamma-aminobutírico (ácido Y-aminobutírico) (también llamado GABA) significa el principal neurotransmisor inhibitorio en el sistema nervioso central de los mamíferos. Desempeña el papel principal en la reducción de la excitabilidad neuronal en todo el sistema nervioso (véase Watanabe M, et al (2002). "GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs". Int. Rev. Cytol. 213. pág. 1-47). Aunque en términos químicos es un aminoácido (ya que tiene un grupo funcional tanto de amina primaria como de ácido carboxílico), El GABA rara vez se menciona como tal en la comunidad científica o médica. Por convención, el término "aminoácido", cuando se usa sin un calificador, se refiere específicamente a un aminoácido alfa. El GABA no es un alfa aminoácido, lo que significa que el grupo amino no está unido al carbono alfa, por lo que no se incorpora a las proteínas.

La fórmula del ácido gamma-aminobutírico es

El resto GABA está preferiblemente unido a asparagina (o aminoácido polar y no cargado equivalente de asparagina) a través de su grupo funcional amina.

En una realización específica, Y es OH-.

En una realización, Xaa es asparagina.

En otra realización, Xaa es un aminoácido polar equivalente y sin carga de asparagina seleccionado entre el grupo que consiste en serina, treonina y glutamina.

En la realización preferente, para el compuesto de fórmula (I), el grupo RC(O) está en el lado N terminal del lipopéptido y el resto GABA es un lado C terminal del lipopéptido.

Como se utiliza en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales o no naturales en sus estereoisómeros D y L para aminoácidos quirales. Se entiende que se refiere tanto a los aminoácidos como a los residuos de aminoácidos correspondientes, tal como están presentes, por ejemplo, en la estructura peptidílica. Los aminoácidos naturales y no naturales son bien conocidos en la técnica. Los aminoácidos naturales comunes incluyen, sin limitación, alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), Lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val). Los aminoácidos poco comunes y no naturales incluyen, sin limitación, alil glicina (AllylGly), norleucina, norvalina (Avl), bifenilalanina (Bip), citrulina (Cit), 4-guanidinofenilalanina (Phe(Gu)), homoarginina (hArg), homolisina (hLys), 2-naftilalanina (2-Nal), ornitina (Orn) y pentafluorofenilalanina.

Los aminoácidos se clasifican típicamente en una o más categorías, incluyendo polares, hidrófobos, ácidos, básicos y aromáticos, según sus cadenas laterales. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen aquellos que tienen grupos funcionales de cadena lateral tales como hidroxilo, sulfhidrilo y amida, así como los aminoácidos ácidos y básicos. Los aminoácidos polares incluyen, sin limitación, asparagina, cisteína, glutamina, la histidina, selenocisteina, serina, treonina, triptófano y tirosina. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos o no polares incluyen aquellos restos que tienen cadenas laterales alifáticas no polares, tal como, sin limitación, leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, prolina, metionina y fenilalanina. Los ejemplos de restos de aminoácidos básicos incluyen aquellos que tienen una cadena lateral básica, tal como un grupo amino o guanidino. Los restos aminoácidos básico incluyen, sin limitación, arginina, homolisina y lisina. Los ejemplos de restos aminoácidos ácidos incluyen aquellos que tienen un grupo funcional de cadena lateral ácida, tal como un grupo carboxilo. Los restos aminoácidos ácidos incluyen, sin limitación, ácido aspártico y ácido glutámico. Los aminoácidos aromáticos incluyen aquellos que tienen un grupo de cadena lateral aromática. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, sin limitación, bifenilalananina, la histidina, 2-naftilalananina, pentafluorofenilalanina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Se observa que algunos aminoácidos se clasifican en más de un grupo, por ejemplo, la histidina, el triptófano y la tirosina se clasifican como aminoácidos polares y aromáticos. Los aminoácidos pueden clasificarse además como aminoácidos no cargados o cargados (positiva o negativamente). Los ejemplos de aminoácidos cargados positivamente incluyen, entre otros, lisina, arginina e histidina. Los ejemplos de aminoácidos cargados negativamente incluyen, sin limitación, ácido glutámico y ácido aspártico. Los aminoácidos adicionales que se clasifican en cada uno de los grupos anteriores son conocidos por los expertos en la materia.

"Aminoácido equivalente" significa un aminoácido que puede sustituirse por otro aminoácido en los compuestos peptídicos según la invención sin ninguna pérdida apreciable de función. Los aminoácidos equivalentes serán reconocidos por los expertos en la materia. La sustitución de aminoácidos similares se realiza sobre la base de la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral, por ejemplo, con respecto al tamaño, la carga, la hidrofilicidad y la hidrofobicidad como se describe en el presente documento. La expresión "o un aminoácido equivalente del mismo" cuando se usa después de una lista de aminoácidos individuales significa un equivalente de uno o más de los aminoácidos individuales incluidos en la lista.

En una realización particular, el compuesto de la invención consiste en ácido C11 C(O)-Asn-gamma-aminobutírico

El compuesto de la invención puede obtenerse por purificación directa a partir de cualquier bacteria que contenga la isla pks, preferentemente de Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), o por cualquiera de los métodos químicos sintéticos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, los compuestos lipopeptídicos de interés pueden recuperarse del medio de cultivo o de los lisados de células bacterianas. Habitualmente, los compuestos lipopeptídicos de la invención se aíslan de Escherichia coli. Por ejemplo, el compuesto lipopeptídico de la invención se puede aislar de Escherichia coli Nissle 1917 (EcN). Las bacterias empleadas en la producción de los lipopéptidos de interés pueden alterarse por varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación y descongelación, sonicación, disrupción mecánica o agentes de lisis celular.

Puede preferirse la purificación del lipopéptido de interés a partir de bacterias. Los procedimientos descritos en el Ejemplo son ejemplos de procedimientos adecuados para la purificación de compuestos lipopeptídicos del sobrenadante de Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) (o cualquier bacteria que contenga paquetes isla o que contiene al menos enzimas codificantes por clbA, ClbN y ClbB)).

Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados del compuesto lipopeptídico: incluyen: fraccionamiento de lipopéptidos con espectrometría acoplada en línea a una cromatografía líquida (como se usa en el ejemplo); HPLC en fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación en sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, columnas Sephadex G-75; de Proteína A Sepharose para eliminar contaminantes; y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopos del lipopéptido de interés.

La o las etapas de purificación seleccionadas dependerán de la naturaleza del proceso de producción usado y del compuesto lipopeptídico particular producido.

El protocolo para la producción del compuesto lipopeptídico, mediante cultivo de bacterias también se describe en "Screening concepts, characterization and structural analysis of microbial-derived bioactive lipopeptides: a review." Crit Rev Biotechnol. mayo de 2017; 37 (3): 393-410. doi: 10.3109/07388551.2016.1163324.

En determinadas realizaciones, el compuesto lipopeptídico de la invención puede sintetizarse mediante técnicas convencionales de síntesis química.

Método para tratar el trastorno del dolor

Por consiguiente, un primer objeto de la presente invención se refiere a los compuestos que se reivindican para su uso en un método para tratar el dolor en un sujeto de los mismos, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención.

El tratamiento puede ser para cualquier propósito, incluyendo el tratamiento terapéutico de sujetos que sufren dolor, así como el tratamiento profiláctico de sujetos que no sufren dolor (por ejemplo, sujetos identificados como de alto riesgo de dolor). Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar", y "tratar" se refieren a revertir, aliviar, inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno como se describe en el presente documento (es decir, dolor), o retrasar, eliminar o reducir la incidencia o aparición de un trastorno o enfermedad como se describe en el presente documento, en comparación con la que se produciría en ausencia de la medida tomada. Los términos y expresiones "profilaxis" o "uso profiláctico" y "tratamiento profiláctico" como se usan en el presente documento, hacen referencia a cualquier procedimiento médico o de salud pública cuyo propósito sea prevenir la enfermedad aquí divulgada (es decir, el dolor). Como se utiliza en el presente documento, los términos "prevenir", "prevención" y "prevenir" se refieren a la reducción del riesgo de adquirir o desarrollar una determinada condición (es decir, dolor), o la reducción o inhibición de la recurrencia o dicha condición (es decir, dolor) en un sujeto que no está enfermo, pero que ha estado o puede estar cerca de un sujeto con la afección (es decir, dolor).

Los compuestos de la presente invención son adecuados para el tratamiento de una amplia gama de trastornos del dolor, particularmente, dolor agudo, dolor crónico, dolor neuropático, dolor inflamatorio, dolor yatrogénico, incluido el dolor por cáncer, dolor infeccioso, incluido el dolor herpético dolor visceral, dolor central, trastornos de la disfunción del dolor, incluida la fibromialgia, dolor nociceptivo, incluido el dolor posquirúrgico y dolores de tipo mixto que afectan a las vísceras, el tracto gastrointestinal, las estructuras craneales, el sistema musculoesquelético, la columna vertebral, el sistema urogenital, el sistema cardiovascular y el SNC, incluyendo el dolor del cáncer, el dolor de espalda y orofacial.

Generalmente, el dolor se clasifica como agudo o crónico. El dolor agudo comienza repentinamente y tiene una corta duración (normalmente de doce semanas o menos). Normalmente se asocia con una causa concreta, tal como una lesión específica y normalmente es agudo y grave. Es el tipo de dolor que puede producirse después de lesiones específicas a consecuencia de una cirugía, trabajos dentales, un esfuerzo o un esguince. El dolor agudo no da normalmente como resultado una respuesta fisiológica persistente. En cambio, el dolor crónico es el dolor a largo plazo, que normalmente persiste durante más de tres meses y provoca problemas fisiológicos y emocionales significativos. Los ejemplos comunes de dolor crónico son el dolor neuropático (por ejemplo, neuropatía diabética dolorosa, neuralgia postherpética), síndrome del túnel carpiano, dolor de espalda, dolor de cabeza, dolor por cáncer, dolor de artritis y dolor crónico post-quirúrgico. El dolor clínico se presenta cuando se produce malestar y una sensibilidad anormal entre los síntomas del paciente. Los pacientes tienden a ser bastante heterogéneos y pueden presentar diversos síntomas de dolor. Dichos síntomas incluyen: 1) dolor espontáneo que puede ser sordo, ardiente o punzante; 2) respuestas de dolor exageradas a estímulos nocivos (hiperalgesia); y 3) dolor producido por estímulos normalmente inocuos. Aunque los pacientes que padecen diversas formas de dolor agudo y crónico pueden tener síntomas similares, los mecanismos subyacentes pueden ser diferentes y pueden, por lo tanto, requerir diferentes estrategias de tratamiento. El dolor también puede dividirse en una serie de diferentes subtipos según las diferentes fisiopatologías, incluidos los dolores nociceptivo, neuropático e inflamatorio.

El dolor nociceptivo se induce por una lesión tisular o por un estímulo intenso con el potencial de causar lesiones. Los aferentes del dolor se activan por la transducción de estímulos por los nociceptores en el sitio de la lesión y activan neuronas en la médula espinal al nivel de su terminación. Después, esto se transmite por los tractos espinales hasta el cerebro, donde se percibe el dolor (Meyer et al., 1994, Textbook of Pain, 13-44). La activación de los nociceptores activa dos tipos de fibras de nervios aferentes. Las fibras A-delta mielinizadas transmiten rápidamente y son responsables de las sensaciones de dolor agudo y punzante, mientras que las fibras C no mielinizadas transmiten a una velocidad más baja y emiten un dolor sordo o molesto. El dolor nociceptivo agudo de moderado a grave es una característica destacada del dolor procedente de un traumatismo del sistema nervioso central, tensiones/esguinces, quemaduras, infarto de miocardio y pancreatitis aguda, dolor postoperatorio (dolor tras cualquier tipo de procedimiento quirúrgico), dolor postraumático, cólico renal, dolor del cáncer y dolor de espalda. El dolor del cáncer puede ser dolor crónico, tal como el dolor relacionado con tumores (por ejemplo, dolor óseo, dolor de cabeza, dolor facial o dolor visceral) o dolor asociado con la terapia del cáncer (por ejemplo, síndrome después de la quimioterapia, síndrome de dolor posquirúrgico crónico o síndrome posterior a la radiación). El dolor del cáncer también puede ocurrir en respuesta a la quimioterapia, inmunoterapia, la terapia hormonal o la radioterapia. El dolor de espalda puede deberse a una hernia o rotura en los discos intervertebrales o a anomalías en las articulaciones facetarias lumbares, las articulaciones sacroilíacas, los músculos paraespinales o el ligamento longitudinal posterior. El dolor de espalda puede resolverse de manera natural, pero en algunos pacientes, donde dura más de 12 semanas, se convierte en una afección que puede ser particularmente incapacitante.

Hay dos tipos de dolor nociceptivo: dolor "somático" y dolor "visceral".

El dolor "somático" es causado por lesiones en piel, músculos, huesos, articulaciones y tejidos conjuntivos. El dolor somático profundo generalmente se describe como sordo o persistente y se localiza en un área. El dolor somático por una lesión en la piel o en los tejidos justo debajo de ella a menudo es más agudo y puede tener una cualidad de quemazón o punzada. En general, el dolor "somático" es un dolor bien localizado que resulta de la activación de los nociceptores periféricos sin lesionar el nervio periférico o el sistema nervioso central.

El dolor somático a menudo implica la inflamación del tejido lesionado. Aunque la inflamación es una respuesta normal del cuerpo a una lesión y es esencial para la curación, la inflamación que no desaparece con el tiempo puede resultar en una enfermedad dolorosa crónica. El dolor articular causado por la artritis reumatoide puede considerarse un ejemplo de este tipo de dolor nociceptivo somático.

El dolor "visceral" se refiere al dolor que se origina a partir de una lesión continua en los órganos internos o los tejidos que los sostienen. Cuando el tejido lesionado es una estructura hueca, como el intestino o la vesícula biliar, el dolor a menudo está mal localizado y es un calambre. Cuando la estructura lesionada no es un órgano hueco, el dolor puede ser similar a una presión, profundo y punzante. El dolor visceral también podría estar asociado con un subtipo de inflamación (véase más adelante)

En la actualidad, el dolor neuropático se define como dolor iniciado o causado por una lesión primaria o por una disfunción en el sistema nervioso. El daño nervioso puede estar causado por traumatismos y enfermedades y por lo tanto, el término "dolor neuropático" abarca muchos trastornos con varias etiologías. Estas incluyen, pero sin limitación, neuropatía periférica, neuropatía diabética, neuralgia postherpética, neuralgia del trigémino, dolor de espalda, neuropatía del cáncer, neuropatía por VIH, dolor del miembro fantasma, síndrome del túnel carpiano, dolor central después de un accidente cerebrovascular y dolor asociado con el alcoholismo crónico, hipotiroidismo, uremia, esclerosis múltiple, lesión de la médula espinal, enfermedad de Parkinson, epilepsia y deficiencia de vitaminas. El dolor neuropático es patológico, ya que no tiene un papel protector. Normalmente, se presenta tiempo después de que la causa original se haya disipado, teniendo normalmente una duración de años, lo que reduce significativamente la calidad de vida de los pacientes (Woolf y Mannion, 1999, Lancet, 353, 1959-1964). Los síntomas de dolor neuropático son difíciles de tratar, ya que estos normalmente son heterogéneos incluso entre pacientes con la misma enfermedad (Woolf y Decosterd, 1999, Pain Supp., 6, S141-S147; Woolf y Mannion, 1999, Lancet, 353, 1959-1964). Éstos incluyen dolor espontáneo, que puede ser continuo y paroxístico o dolor anormal evocado, tal como la hiperalgesia (aumento de la sensibilidad a un estímulo nocivo) y la alodinia (sensibilidad a un estímulo normalmente inocuo).

El proceso inflamatorio es una serie compleja de eventos bioquímicos y celulares, que se activan en respuesta a una lesión tisular o la presencia de sustancias extrañas, lo que se traduce en inflamación y dolor (Levine y Taiwo, 1994, Textbook of Pain, 45-56). El dolor artrítico es el dolor inflamatorio más común. Las enfermedades reumatoides son una de las causas más comunes de afección inflamatoria en los países desarrollados y la artritis reumatoide es una causa común de discapacidad. Se desconoce la etiología exacta de la artritis reumatoide, pero las hipótesis actuales sugieren que pueden ser importantes factores tanto genéticos como microbiológicos (Grennan y Jayson, 1994, Textbook of Pain, 397-407). Se ha estimado que al menos 16 millones de estadounidenses tienen artrosis sintomática (OA) o enfermedad degenerativa de las articulaciones, la mayoría de los cuales tienen más de 60 años y se espera que aumenten hasta los 40 millones a medida que aumente la edad de la población, haciendo de este un problema de salud pública con una magnitud enorme (Houge y Mersfelder, 2002, Ann Pharmacother., .36, 679-686; McCarthy et al., 1994, Textbook of Pain, 387-395). La mayoría de pacientes con artrosis solicitan atención médica debido al dolor asociado. La artritis tiene un impacto significativo en la función psicológica y física y se sabe que es la principal causa de discapacidad en las etapas posteriores de la vida. La espondilitis anquilosante es una enfermedad reumática que provoca artritis de la columna vertebral y las articulaciones sacroilíacas. Varía de episodios intermitentes de dolor de espalda que se producen a lo largo de la vida a una enfermedad crónica grave que ataca a la columna vertebral, las articulaciones periféricas y a otros órganos del cuerpo.

Otro tipo de dolor inflamatorio es el dolor visceral, que incluye el dolor asociado con la enfermedad inflamatoria del intestino (EII). El dolor visceral es dolor asociado con las vísceras, que abarca los órganos de la cavidad abdominal. Estos órganos incluyen los órganos sexuales, el bazo y parte del sistema digestivo. El dolor asociado con las vísceras puede dividirse en dolor visceral digestivo y dolor visceral no digestivo. Los trastornos gastrointestinales (GI) más frecuentes que inducen dolor incluyen trastornos funcionales del intestino (FBD) y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Estos trastornos Gl incluyen una amplia gama de estados patológicos que actualmente solo están moderadamente controlados, incluso con respecto a FBD-, reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable (SII) y síndrome de dolor abdominal funcional (SDAF) y, con respecto a la EII-enfermedad de Crohn, ileítis y colitis ulcerosa, todas las cuales producen regularmente dolor visceral. Otros tipos de dolor visceral incluyen el dolor asociado con dismenorrea, cistitis y pancreatitis y dolor pélvico.

En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención son particularmente adecuados para el tratamiento del dolor visceral resultante de trastornos gastrointestinales, incluidos trastorno intestinal funcional (TIF) y enfermedad inflamatoria intestinal (EII), dispepsia, síndrome del intestino irritable (SII) y síndrome de dolor abdominal funcional (SDAF) y, con respecto a la EII, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa dismenorrea, cistitis y pancreatitis y dolor pélvico.

En una realización específica, el dolor visceral se selecciona entre el grupo que consiste en enfermedades Inflamatorias intestinales (EII) o síndrome del intestino irritable (SII).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "Síndrome del Intestino Irritable (SU)" es un término para una variedad de condiciones patológicas que causan molestias en el tracto gastrointestinal. Es un trastorno intestinal funcional caracterizado por dolor abdominal crónico, malestar, meteorismo y alteración de los hábitos intestinales en ausencia de cualquier causa orgánica. También incluye algunas formas de hipersensibilidad visceral relacionada con los alimentos, tal como la hipersensibilidad al gluten (es decir, enfermedad celíaca).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión " enfermedades inflamatorias intestinales (EN)" es un grupo de enfermedades inflamatorias del colon y el intestino delgado. Los principales tipos de EII son enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y reservoritis.

En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención son adecuados para el tratamiento del dolor somático causado por lesiones en la piel, músculos, huesos, articulaciones y tejidos conjuntivos, como dolor superficial (de la piel o tejido subcutáneo) y dolor profundo (de estructuras más profundas de la pared del cuerpo).

En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención son particularmente adecuados para el tratamiento del dolor crónico que resulta de trastornos musculoesqueléticos tales como artrosis/enfermedad degenerativa de las articulaciones/espondilosis, artritis reumatoide, enfermedad de Lyme, síndrome de Reiter, hernia discal/osteoartropatía facetaria, fracturas/fractura por compresión de vértebras lumbares, postura defectuosa o mala, fibromialgia, polimialgia reumática, lumbalgia mecánica, dolor coccígeo crónico, distensiones y esguinces musculares, mialgia del suelo pélvico (espasmo del elevador del ano), síndrome piriforme, distensión del tendón del recto, hernias (por ejemplo, obturador, ciático, inguinal, femoral, spiegeliano, perineal, umbilical), dolor miofascial de la pared abdominal (puntos gatillo), síndromes de uso excesivo crónico (por ejemplo, tendinitis, bursitis); trastornos neurológicos, tales como, lesión por tracción del plexo braquial, radiculopatía cervical, síndrome de la abertura torácica superior, estenosis espinal, síndrome de aracnoiditis, mialgias por deficiencia metabólica, polimiositis, neoplasia de la médula espinal o del nervio sacro, atrapamiento del nervio cutáneo en cicatriz quirúrgica, neuralgia postherpética (culebrilla), neuralgia (por ejemplo, iliohipogástrico, nervios ilioinguinal o genitofemoral), polineuropatías, polirradiculoneuropatía, mononeuritis múltiple, dolores de cabeza crónicos diarios, dolores de cabeza por tensión muscular, dolores de cabeza de tipo migraña, disfunción de la articulación temporomandibular, tendinitis temporal, sinusitis, dolor facial atípico, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, neuralgia del nervio intermedio, neuralgia esfenopalatina, dolor referido dental o de la articulación temporomandibular, epilepsia abdominal, migraña abdominal, trastornos urológicos, neoplasia de vejiga, infección crónica del tracto urinario, cistitis intersticial, cistitis por radiación, cistitis recurrente, uretritis recurrente, urolitiasis, contracciones vesicales desinhibidas (disinergia detrusor-esfínter), divertículo uretral, síndrome uretral crónico, carbunco uretral, prostatitis, estenosis uretral, torsión testicular, enfermedad de Peyronie; trastornos gastrointestinales, tales como el síndrome de dolor visceral crónico, reflujo gastroesofágico, enfermedad de úlcera péptica, pancreatitis, obstrucción intestinal intermitente crónica, colitis, estreñimiento crónico, enfermedad diverticular, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable; trastornos reproductivos (extrauterinos) como endometriosis, adherencias, quistes anexiales, embarazo ectópico crónico, endometritis por clamidia o salpingitis, endosalpingiosis, síndrome de retención ovárica (síndrome de ovario residual), síndrome de ovario remanente, distrofia ovárica o dolor ovulatorio, síndrome de congestión pélvica, quistes peritoneales postoperatorios, ovario accesorio residual, salpingo-ooforitis subaguda, salpingitis tuberculosa; trastornos reproductivos (uterinos) como adenomiosis, endometritis crónica, dismenorrea atípica o dolor ovulatorio, estenosis cervical, pólipos endometriales o cervicales, leiomiomas, relajación pélvica sintomática (prolapso genital), dispositivo anticonceptivo intrauterino; trastornos psicológicos como los trastornos bipolares de la personalidad, depresión, porfiria, alteraciones del sueño; y otras afecciones tales como enfermedad cardiovascular (por ejemplo, angina), enfermedad vascular periférica y quimioterapia, radiación o complicaciones quirúrgicas.

En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención son adecuados para el tratamiento del dolor que resulta de enfermedades autoinmunes que incluyen esclerosis múltiple, trastornos neurodegenerativos, trastornos neurológicos, incluidas la epilepsia y las patologías sensoriomotoras, artrosis, artritis reumatoide, trastornos neuropatológicos, dolor asociado con la dismenorrea, dolor pélvico, cistitis, pancreatitis, migraña, cefaleas en racimo y tensionales, neuropatía diabética, dolor neuropático periférico, ciática, causalgia y condiciones de disfunción del tracto urinario inferior.

En métodos profilácticos, los compuestos reivindicados son particularmente adecuados para sujetos identificados como de alto riesgo de dolor. Normalmente, los sujetos que tienen riesgo de dolor incluyen pacientes que se someterán a una operación quirúrgica.

Dicho compuesto de la presente invención se puede utilizar como fármaco, en particular como analgésico. Los compuestos son útiles, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos de dolor tales como dolor crónico y dolor visceral.

El experto en la materia puede evaluar fácilmente las propiedades analgésicas del compuesto aminolipídico de la invención evaluando la capacidad de dicho compuesto para inhibir la activación neuronal de los nervios sensoriales. a través de el GABA^breceptor mediante estudios de señalización de calcio en neuronas sensoriales. Las propiedades analgésicas también pueden probarse mediante electrofisiología neuronal in vitro, registro axonal ex vivo, usando un modelo animal de dolor (véase N Gregory, AL Harris, CR Robinson, PM Dougherty, PN Fuchs y KA Sluka. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. noviembre de 2013; 14(11)). Habitualmente, las pruebas que pueden usarse para evaluar la actividad analgésica de un compuesto lipopeptídico se describen en los Ejemplos (figura 4 y figura 6). En una segunda etapa, también se puede probar la capacidad de cruzar la barrera epitelial in vitro en un sistema transwell, in vivo por una cuantificación directa del lipolípido en diferentes órganos (ver la prueba descrita en el ejemplo y las figura 5 y 6) o ex-vivo mediante el uso de cámara de uso (véase HJ Galipeau & EF Verdu. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterol Motil (2016) 28, 957-965).

Se entenderá que la dosis diaria de los compuestos y la composición de la presente invención será decidida por el médico responsable dentro del alcance del buen criterio médico. La dosis específico terapéuticamente eficaz para cualquier paciente en particular dependerá de diversos factores, incluyendo el tipo y la gravedad del trastorno que se va a tratar; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo y vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o casuales con el lipopéptido específico empleado y otros factores bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, dentro del conocimiento de la técnica, se recomienda comenzar el tratamiento con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.

El compuesto de la invención puede administrarse por cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, el compuesto según la invención se puede administrar por vía oral (incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica, pulmonar, vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutánea e intravenosa).

En una realización preferida de la invención, la composición terapéutica que contiene el compuesto de la invención se administra por vía intrarrectal, tópica u oral. Una administración rectal tiene lugar preferentemente en forma de supositorio, enema o espuma. La administración intrarrectal está especialmente indicada para enfermedades intestinales que afectan a las secciones intestinales inferiores, por ejemplo el colon.

Composición farmacéutica

Los inhibidores de la presente invención, junto con uno o más adyuvantes, vehículos o diluyentes convencionales pueden colocarse en forma de composiciones farmacéuticas y dosis unitarias.

"Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea adecuado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un sólido no tóxico, relleno semisólido o líquido, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo.

La composición farmacéutica y las formas de dosificación unitaria pueden comprender ingredientes convencionales en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios activos adicionales y las formas de dosificación unitaria pueden contener cualquier cantidad eficaz adecuada de los principios activos proporcionales al intervalo de dosis diaria previsto que se va a emplear. La composición farmacéutica pueden emplearse como sólidos, tales como comprimidos o cápsulas rellenas, semisólidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida o líquidos, tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires o cápsulas rellenas para uso oral; o en forma de supositorios para administración rectal; o en forma de soluciones inyectables estériles para usos parenterales. Las formulaciones que contienen un (1) miligramo de principio activo o, de manera más amplia, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente cien (100) miligramos, por comprimido, son por consiguiente formas de dosificación unitaria representativas.

El compuesto de la presente invención pueden formularse en una amplia variedad de formas de dosificación de administración oral. Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación pueden comprender compuestos de la presente invención o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos como componente activo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, obleas, supositorios y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes disgregantes de comprimidos o un material de encapsulación. En los polvos, el vehículo generalmente es un sólido dividido finamente, que es una mezcla con el componente activo dividido finamente. En los comprimidos, el componente activo generalmente se mezcla con el vehículo que tiene la capacidad aglutinante necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferentemente de aproximadamente un uno (1) a aproximadamente un setenta (70) por ciento de compuesto activo. Los vehículos adecuados incluyen. pero sin limitaciones, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, gelatina de almidón, tragacanto, metilcelulosa carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares.

El término "preparación" pretende incluir la formulación del compuesto activo con un material de encapsulación como vehículo, proporcionando una cápsula en la cual el componente activo, con o sin vehículos, está rodeado por un vehículo, que está en asociación con este. De forma análoga, se incluyen obleas y pastillas para chupar. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, obleas y pastillas para chupar pueden estar en formas sólidas adecuadas para la administración oral.

Otras formas adecuadas para administración oral incluyen preparaciones en forma líquida incluyendo emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas, suspensiones acuosas o preparaciones en forma sólida que están pensadas para convertirse en preparaciones en forma líquida poco antes de su uso. Las emulsiones pueden prepararse en soluciones, por ejemplo, en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, por ejemplo, tal como lecitina, monooleato de sorbitán o goma arábiga. Las soluciones acuosas pueden prepararse disolviendo el componente activo en agua y añadiendo colorantes adecuados, saporíferos, estabilizantes y agentes espesantes. Las suspensiones acuosas pueden prepararse dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y otros agentes de suspensión bien conocidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones y pueden contener, además del componente activo, colorantes, saporíferos, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

El compuesto de la presente invención pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua) y pueden presentarse en dosis unitarias en ampollas, jeringas precargadas para perfusión de pequeño volumen o en envases multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo, soluciones en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de excipientes oleosos o no acuosos, disolventes diluyentes o vehículos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo oleato de etilo) y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes conservantes, hidratantes, emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo, obtenido mediante aislamiento aséptico de un sólido estéril o mediante liofilización a partir de una solución para su constitución antes de su uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril.

Síntesis del lipopéptido de la invención

La presente invención también se refiere a un método para fabricar un compuesto de la invención, caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) se sintetiza utilizando técnicas de síntesis en fase sólida de péptidos o técnica de síntesis en fase líquida.

Las "técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida" significan estrategias de síntesis que son bien conocidas por los expertos en la materia y se pueden encontrar en libros dedicados a la síntesis de péptidos, tales como: Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997 o Houben-Weyl "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Vol E 22a, Vol E 22b, Vol E 22c, Vol E 22d., M. Goodmann Ed., Georg Thieme Verlag, 2002 o en el artículo de revisión Ann M. Thayer "Making Peptides At Large Scale". Chemical & Engineering News 30 de mayo de 2011 Volumen 89, número 22pp. 21-25.

La "técnica de síntesis en fase líquida" son métodos clásicos de síntesis orgánica que son bien conocidos por los expertos en la materia.

Para la producción de péptidos a gran escala (entre 10 gramos y 2 toneladas), podría preferirse utilizar la técnica de síntesis en fase líquida.

En consecuencia, en una realización específica el método para obtener un compuesto de la invención se caracteriza porque el compuesto de fórmula (I) se sintetiza utilizando la técnica de síntesis en fase líquida.

La síntesis de C12-Asn-GABA partiendo de GABA (Ácido Y-Aminobutírico) se realizó siguiendo 7 etapas diferentes que se resumen en el siguiente esquema:

a) Cbz-Cl, NaOH, 0 °C; b) DCC, DMAP, tBuOH, del 36 % al 50 %; c) H2, Pd/C, MeOH; d) HCl, Et2O, del 50 % al 82 %; e) HBTU, HOBt, NMM, CH2Cl2, del 90 % al 97 %; f) Et2NH, CH2Cl2; g) HBTU, HOBt, NMM, ácido láurico CH2Cl2, del 59 % al 70 %; h) TFA, CH2Cl2, Purificación mediante HPLC, del 8 % al 15 %. Abreviaturas:, Cbz-Cl: cloroformiato de bencilo, DCC: diciclohexilcarbodiimida, DMAP: 4-(dimetilamino)piridina, HBTU: Hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronio, HOBt: Hidrato de 1-hidroxibenzotriazol, NMM: 4-metilmorfolina, TFA: Ácido trifluoroacético.

Los detalles de la preparación se describen a continuación.

1) CBz-GABA-OH: Una solución de ácido Y-aminobutírico (5,22 g, 50,6 mmol, 1 eq) en solución de NaOH 2 M (25 ml, 50 mmol, 1 eq) se enfrió a 0 °C y se trató con cloroformiato de bencilo (8,23 ml, 55,6 mmol, 1,15 eq), mientras que el pH se mantiene alrededor de 10 mediante la adición continua de solución de NaOH 3 M. Después de 15 minutos, la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de dos extracciones con Et²Oh, el pH de la solución acuosa se ajustó a 1,5 mediante la adición de una solución de HCl 6 M. Después de haber saturado con NaCl sólido, la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (3x25 ml), se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron al vacío. El residuo oleoso se recogió con Et²O y el disolvente se eliminaron de nuevo para dar un sólido blanco de CBz-GABA-OH (11,3 g) utilizado directamente en la siguiente etapa.

2) CBz-GABA-OtBu: A una solución de CBz-GABA-OH (11,3 g), tBuOH (14,5 ml, 152 mmol, 3 eq) y DMAP (620 mg, 5,1 mmol, 0,1 eq) en CH²Cl², después de enfriar a 0 °C, se añadió diciclohexilcarbodiimida (12,52 g, 60,7 mmol, 1,2 eq). Después de una hora, la reacción se agitó vigorosamente durante una noche a temperatura ambiente. La DCU se filtró y se lavó con EtOAc (2 x 5 ml). El filtrado se lavó con una solución de HCl 1 M (50 ml) y se volvió a filtrar. La capa acuosa se extrajo con CH²Cl²(3x50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml), solución al 5 % de NaHCO3 (50 ml) y salmuera (50 ml) nuevamente. La capa se secó sobre MgSO4 y se evaporó al vacío. El crudo se purificó por cromatografía en columna (pentano/AcOEt 90/10 a 70/30) para obtener CBz-GABA-OtBu (7,39 g, 50 %). MS (ESI+) [M+Na]+: 316,17; [2M+Na]+: 609,00; MS (ESI-) [M]-: 293,33.

3) GABA-OtBu.HCl: Una solución de CBz-GABA-OtBu (2 g, 6,82 mmol, 1 eq) en MeOH (20 ml) se trató con Pd/C (10 %, 200 mg, 10 % p/p). Después de 6 horas, el catalizador se filtró con un lecho de celite®. El disolvente se evaporó cuidadosamente (precaución, el producto final es volátil). Se añadió solución de HCl 1 M (50 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml) y el pH se ajustó a 10 mediante la adición de gránulos de NaOH. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Esta última fase orgánica se lavó con salmuera (2 x 25 ml), se secó sobre MgSO4 y se evaporó cuidadosamente. La mezcla de reacción cruda se disolvió en Et²O (25 ml) y el pH se ajustó a 1 mediante la adición de una solución de HCl 2 M en Et²O. Después de 30 minutos de agitación, se filtraron y secaron 676 mg de GABA-OtBu.HCl (51 % de rendimiento).

4) Fmoc-Asn(Trt)-GABA-OtBu: A una solución de Fmoc-Asn(Trt)-OH (328 mg, 0,55 mmol, 1,1 eq.) y GABA-OtBu.HCl (98 mg, 0,5 mmol, 1 eq.) en CH²cl²(4 ml) se añadió HBTU (176 mg, 0,75 mmol, 1,5 eq), HOBt (7 mg, 0,05 mmol, 0,1 eq) y N-metilmorfolina (176 pl, 1,6 mmol, 3,2 eq). La mezcla se agitó durante una noche. El disolvente se evaporó en presencia de gel de sílice. El producto se purificó por cromatografía en columna (CH²Cl²/MeOH 97,5/2,5) para obtener Fmoc-Asn(Trt)-GABA-OtBu (360 mg, 97 %). MS (ESI+) [M+H]+: 738,17;

[M+Na]+: 760,50; MS (ESI-) [M-Fmoc]': 514,58.

5) Asn(Trt)-GABA-OtBu: A una solución de Fmoc-Asn(Trt)-GABA-OtBu (350 mg, 0,47 mmol, 1 eq) en CH²cl²(1,35 ml) se añadió dietilamina (1,35 ml) y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La solución resultante se concentró al vacío y se usó directamente en la etapa de acoplamiento de amina.

6) C12:0-Asn(Trt)-GABA-OtBu: A una solución de Asn(Trt)-GABA-OtBu (0,47 mmol, 1 eq.) y ácido láurico (143 mg, 0,71 mmol, 1,5 eq.) en CH²Cl²(4 ml) se añadió HBTU (194 mg, 0,83 mmol, 1,75 eq), HOBt (6 mg, 0,04 mmol, 0,1 eq) y N-metilmorfolina (195 pl, 1,77 mmol, 3,75 eq). La mezcla se agitó durante una noche. El disolvente se evaporó en presencia de gel de sílice. El producto se purificó por cromatografía en columna (pentano/AcOEt 75/25 a 60/40) para obtener C12:0-Asn(Trt)-GABA-OtBu (235 mg, 71 %). MS (ESI+) [M+H]+: 698,25; [M+Na]+: 720,50; MS (ESI-) [M]-: 696,75.

7) C12:0-Asn-GABA-OH: A una solución de C12:0-Asn(Trt)-GABA-OtBu (235 mg, 0,33 mmol, 1 eq) en CH²cl²(0,5 ml) se añadió TFA (0,5 ml) y se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La solución resultante se concentró al vacío. Las trazas de TFA se eliminaron por coevaporación con acetonitrilo (5x2 ml). La mezcla de reacción bruta se agitó con éter diisopropílico (10 ml) y se filtró. El sólido blanco resultante (102 mg) se purificó por HPLC para dar 11 mg (8,6 %) de C12:0-Asn-GABA-OH. LC-MS analítica Tr: 1,62 mn; RMN (500 MHz, MeOD): 8 = 4,64 (t, J = 6,9 Hz, 1H); 3,20 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 2,67 (dd, J = 6,0, 15,3 Hz, 1H); 2,58 (dd, J = 7,3, 15,3 Hz, 1H); 2,30 (t, J = 7,4 Hz, 2H); 2,22 (t, J = 7,4 Hz, 2H); 1,76 (quint, J = 7,0 Hz, 2 H); 1,57 (sa, 2H); 1,27 (sa, 16H), 0,93 0,86 (t, J = 6,4 Hz, 3H); HRMS [M+H]+ calc.: 400,2811 encontrado: 400,2804.

Todas las reacciones que requerían condiciones anhidras se llevaron a cabo en cristalería secada a la llama con agitación magnética en una atmósfera de nitrógeno a menos que se indique lo contrario. Se obtuvo CH²Cl²anhidro del sistema de purificación de solventes PS-Micro de Innovative Technology. Se usaron otros disolventes y reactivos obtenidos de los proveedores (Aldrich, Alfa Aesar, Acros) a menos que se indique lo contrario. Las reacciones se controlaron por ^tL^cutilizando placas recubiertas previamente con gel de sílice 60 (Merck). Los componentes de la reacción se visualizaron usando una lámpara UV de 254 nm y tratamiento con una solución básica de KMnO4. La cromatografía en columna se realizó utilizando gel de sílice de 40-63 pm. Los datos de masa ES-MS y de alta resolución se obtuvieron utilizando los espectrómetros de masas Synapt G2-S (Waters) operados por el Laboratoire de Mesures Physiques de la Universidad de Montpellier y se obtuvieron mediante métodos de ionización por electropulverización positiva. Los espectros de RMN 1H se obtuvieron a 300 o 500 MHz en espectrómetros Bruker. Los espectros se registraron en MeOD. Los espectros de RMN 1H se informan de la siguiente manera: desplazamiento químico en ppm [multiplicidad, constante(s) de acoplamiento J en Hz, integral relativa]. Las multiplicidades se definen como sigue: a = ancho, m = multiplete, s = singlete, d = doblete, t = triplete, c = cuadruplete, quint. = quintuplete o combinaciones de los mismos. Los espectros de RMN 13C se registraron en MeOD. Los análisis LCMS se llevaron a cabo en un Waters Micromass con cadena Alliance 2695 con una columna Chromolite HR C18 (25 x 4,6 mm, Merck Inc) monitorizando a 214 nm con modo positivo para detección de masas. Los disolventes para LCMS fueron agua con ácido fórmico al 0,1 % (disolvente A) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 % (disolvente B). Los compuestos se eluyeron a una velocidad de flujo de 3 ml/min mediante un gradiente lineal del 0 % al 100 % de disolvente B durante 2,5 min y, finalmente, al 100 % de disolvente B durante 1 min antes de equilibrar la columna de nuevo al 0 % de disolvente B durante 1 min.

Purificación LC-MS: las muestras se prepararon en DMSO. El sistema de autopurificación LC/MS consistió en una bomba binaria Waters 2525, un inyector/colector de fracciones Waters 2676, acoplado a un espectrómetro Waters Micromass ZQ (modo de ionización por electropulverización, ESI). Las purificaciones se realizaron con un Luna® 5 pm C18 100 A, Columna LC 100 x 21,2 mm, AXIA™ Packed. Se utilizó un caudal de 20 ml/min y un gradiente de 40-60 % B durante 10 minutos. Eluyente A: agua con TFA al 0,1 %; eluyente B: acetonitrilo con TFA al 0,1 %. Los espectros de masas por electropulverización de iones positivos se adquirieron a un caudal de disolvente de 204 pl/min. Se usó nitrógeno tanto para el gas de nebulización como para el de secado. Los datos se obtuvieron en un modo de exploración que va desde 100 a 1000 m/z en intervalos de 0,1 s; se sumaron 10 escaneos para obtener el espectro final. El disparador de control de recolección se establece en un solo ion protonado con un MIT (umbral de intensidad mínima) de 7,105.

Descripción de las figuras

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

Figuras:

Figura 1: Caracterización de C14-Asparagina (C14-Asn-OH) mediante LC-HRMS. (A) Cromatograma de iones totales (TIC) de un extracto lipídico de sedimento EcNwt (arriba) y sedimento EcNAclbA (abajo). (B) Espectro de masas de alta resolución obtenido para el pico eluido a los 15,33 minutos tanto en TIC (arriba) como en simulación de espectro de masas con la fórmula (C1sH34N2O4)-H'. Se obtuvo el mismo perfil isotópico y una precisión de masa de 0,6 ppm. (C) Espectro MS/MS de alta energía adquirido a través de HCD del anión carboxilato de electropulverización [MH]- del pico de LC eluido a los 15,33 minutos.

Figura 2: Caracterización de C12-Asparagina-ácido aminobutírico mediante LC-HRMS. (A) Cromatograma de iones extraídos (EIC) de un extracto lipídico de EcNwt (arriba) y sedimento de EcNAclbA (abajo) para m/z = 398,2664. No se detectó señal en la cepa mutada. (B) Espectro de masas de alta resolución obtenido para el pico eluido a los 12,96 minutos en la cepa probiótica EIC (arriba) y simulación de espectro de masas con la fórmula (C20H37N3O5)-H‘. Se obtuvo el mismo perfil isotópico y una precisión de masa de 1,8 ppm. (C) Espectro de MS/MS de alta energía adquirido a través de HCD del anión carboxilato de electropulverización [MH]- del pico de LC eluido a los 12,96 minutos. (D) Panel superior: cromatograma obtenido para los tres patrones sintetizados: C12-Asn-ácido Y-aminobutírico (GABA), C12-Asn-ácido p-aminobutírico (BABA) y C12-Asn-a-ácido aminobutírico (AABA); panel inferior: Cromatograma obtenido para el extracto lipídico del sedimento EcNwt.

Figura 3: Cuantificación de C12-Asparagina-ácido aminobutírico mediante LC-QQQ. (A) Cuantificación de C12-Asn-GABA en gránulos (panel izquierdo) y sobrenadantes (panel derecho) de EcN de tipo salvaje y mutado.

(B) Cuantificación de C12-Asn-BABA en gránulos (panel izquierdo) y sobrenadantes (panel derecho) de bacterias de tipo salvaje y mutadas. Los datos se representan como media ± SEM de 2 experimentos de 6 cultivos bacterianos independientes por grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn posterior.* p<0,05, **p<0,01, *** p< 0,001, significativamente diferente de EcNwt.

Figura 4: C12-Asn-GABA inhibe la activación neuronal a través del receptor GABA B. Amplitud de movilización de calcio intracelular (AF/F; panel derecho) en neuronas sensoriales de ratón y porcentaje de neuronas que respondieron (panel izquierdo) pretratadas con cantidades crecientes de C12-Asn-GABA (círculo negro) o vehículo (HBSS; círculo blanco) y tratado con capsaicina (125 nM; A ) o una mezcla de agonistas de receptores acoplados a proteína G (histamina, serotonina y bradicinina 10 pM cada uno; B). Los datos se representan como la media ± SEM; n=4 experimentos independientes de 3 pocillos por afección y 30-80 neuronas por pocillo. El análisis estadístico se realizó usando el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn posterior. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente de la mezcla de capsaicina o GPCR. Porcentaje de neuronas que respondieron pretratadas con cantidades crecientes de saclofeno (círculo negro) o vehículo (HBSS; círculo blanco) y tratadas con C12-Asn-GABA (10 pM) y capsaicina (125 nM; C) o una mezcla de agonistas de receptores acoplados a proteína G (histamina, serotonina y bradicinina 10 pM cada uno); D). Los datos se representan como la media ± SEM; n=4 experimentos independientes de 3 pocillos por afección y 30-80 neuronas por pocillo. El análisis estadístico se realizó usando el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn posterior. * p<0,05, ** p<0,01 significativamente diferente de la mezcla C12-Asn-GABA/Capsaicina o C12-Asn-GABA/GPCR.

Figura 5: C12-Asn-GABA atraviesa la barrera epitelial sin modificar la fisiología de las células epiteliales.

Se cultivaron células Caco-2 en cámaras Transwell. Después del tratamiento con C12-Asn-GABA (800 ng) en el lado apical, C12-Asn-GABA se cuantificó dentro de las células y en los compartimentos apical y basolateral mediante LC-MS/MS (A); los datos se representan como la media ± SEM, n=3 experimentos de 3 pocillos por afección. Cromatograma de iones extraídos a la masa exacta de GABA (104,0702 m/z) con una precisión de masa de 5 ppm del estándar comercial GABA (GABA (Patrón) y compartimentos apical y basolateral después de cargar o no células Caco-2 con 800 ng de GABA en el sitio apical (B); representación de un pocillo, n=3 experimentos de 3 pocillos por afección. Permeabilidad paracelular evaluada por el paso de FITC-dextrano cargado en el lado apical (C) y secreción de CXCL8 evaluada por ELISA (D) fueron monitorizados después del tratamiento de células Caco-2 en el lado apical con C12-Asn-GABA (10 pM); los datos se representan como la media ± SEM, n=3 experimentos de 3 pocillos por afección. El análisis estadístico se realizó usando el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn posterior.

Figura 6: C12-Asn-GABA inhibe la hipersensibilidad visceral inducida por capsaicina sin alterar la contracción intestinal. Los ratones recibieron administración intracolónica de C12-Asn-GABA (10 pM; símbolos negros) o vehículo (40 % de etanol; símbolos blancos) y 30 minutos o 4 horas más tarde se recogieron colon (A) y sangre (B) para cuantificar C12-Asn-GABA mediante LC-MS/MS. Los datos se presentan como la media ± SEM, n = 8 ratones por grupo. El análisis estadístico se realizó usando el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn posterior. *** p<0,001 significativamente diferente del grupo de vehículos. Los ratones recibieron administración intracolónica de C12-Asn-GABA (10 pM; símbolos negros) o vehículo (40 % de etanol; símbolos blancos) y 30 minutos o 4 horas después una administración intracolónica de capsaicina (100 pg/ratón; cuadrado) o su vehículo (40 % de etanol; círculo). Quince minutos después del tratamiento con capsaicina o vehículo, se realizó la respuesta visceromotora (RVM) a presiones crecientes de distensión colorrectal. Los datos se presentan como la media ± SEM, n = 7-8 ratones por grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianza Anova de dos vías y la prueba post hoc de Bonferroni posterior. *** p<0,001 significativamente diferente del grupo Vehículo/Vehículo. Medición ex-vivo de la frecuencia (B) y la amplitud (C) de la contracción mecánica duodenal en respuesta a la solución de Krebs-Ringer (control; barra blanca), a DMSO al 0,2 % (vehículo; barra gris) o a C12-Asn-GABA (10 pM; barra negra). Los datos se presentan como la media ± SEM, n = 5-6 por grupo. El análisis estadístico se realizó usando el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn posterior.

Figura 7: C14-Asn-GABA inhibe la activación neuronal por capsaicina. Amplitud de movilización de calcio intracelular (□F/F; A) en neuronas sensoriales de ratón y porcentaje de neuronas que responden (B) pretratado con 10 pM de C14-Asn-GABA (barra negra) o vehículo (HBSS; barra blanca) y tratado con capsaicina (125 nM). Los datos se representan como la media ± SEM; n=3 experimentos independientes de 3 pocillos por afección y 35 82 neuronas por pocillo. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba U de Mann-Whitney. ** p<0,01 significativamente diferente de la capsaicina.

Figura 8: El maleato de trimebutina no tiene efecto sobre la hipersensibilidad visceral inducida por capsaicina. Los ratones recibieron un tratamiento oral con vehículo (PEG200, círculo blanco) o con maleato de trimebutina (25 mg/kg, círculo negro) y 4 horas después una administración intracolónica de capsaicina (100 pg/ratón; círculo blanco y negro). Quince minutos después de la capsaicina, se realizó la respuesta visceromotora (RVM) a presiones crecientes de distensión colorrectal. Los datos se presentan como la media ± SEM, n = 7-8 ratones por grupo.

Figura 9: C12-Asn-GABA inhibe la hipersensibilidad visceral inducida por DSS. Los ratones recibieron DSS al 3 % en su agua potable durante 5 días para inducir colitis. El día 5, a los ratones se les administró intracolónicamente C12-Asn-GABA (10 pM; círculos negros) o vehículo (40 % de etanol; círculos blancos). Treinta minutos después de la administración intracolónica, se realizó la respuesta visceromotora (RVM) a presiones crecientes de distensión colorrectal. Los datos se presentan como la media ± SEM, n = 5 ratones por grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianza Anova de dos vías y la prueba post hoc de Bonferroni posterior. *** p<0,001 significativamente diferente del grupo Vehículo/Vehículo.

EJEMPLO 1:

Materiales y métodos

Animales

Se usaron ratones macho C57B16 (6-8 semanas) para producir cultivos primarios de neuronas sensoriales de ganglios de raíz dorsal (DRG) para experimentos de flujo de calcio y para realizar estudios de distensión colorrectal y contracción isotónica intestinal. Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Atención Animal (CEEA 122).

Cepas bacterianas.

E. coli MG1655, MG1655+BAC pks+, E. coli Nissle 1917 (EcN, Mutaflor, DSM 6601, serotipo O6:K5:H1), los mutantes isogénicos EcNAcIbA, EcNAcIbN, EcNAcbB, EcNAcIbC y EcNAcIbP se usaron en este estudio. La inactivación de genes se diseñó utilizando el método de la recombinasa roja lambda29 y las deleciones se confirmaron usando cebadores flanqueantes.

Extracción de aminoácidos-ácidos grasos

E. coli se cultivaron rutinariamente en 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) durante 8 h en una incubadora con agitación (250 rpm) a 37 °C. Se obtuvieron sedimentos de células y sobrenadantes de cultivos filtrados para realizar la extracción en fase sólida de aminoácidos-ácidos grasos utilizando placas de 96 pocillos HRX-50 mg (Macherey Nagel, Hoerd, Francia). El disolvente se evaporó en N2 y las muestras se resuspendieron en 10 pl de MeOH para cromatografía líquida/análisis de espectrometría de masas en tándem30

Caracterización de C12-Asn-ácido aminobutírico

La caracterización de C12-Asn-ácido aminobutírico se realizó en un cromatógrafo líquido de alta resolución (U3000, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de alta resolución Exactive (ThermoFisher Scientific). Los análisis de MS se realizaron en el modo FTMS negativo a una resolución de 30 000 (a m/z 400) con los siguientes parámetros de origen: la temperatura del capilar fue de 325 °C, la temperatura del calentador de la fuente era de 300 °C, el caudal del gas envolvente fue de 30, el caudal de gas auxiliar era de 10 y el voltaje de la fuente era de -2,9 kV. Las muestras se inyectaron en una columna ZorBAX SB 120 C18 (2,1 * 100 mm, 2,7 pm) (Agilent Technologies) mantenida a 40 °C. El disolvente A era ácido fórmico al 0,1 % en H²O y el disolvente B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo a un caudal de 350 pl/min. El gradiente lineal fue el siguiente: 30 % de B a 0 min, 85 % de B a 15 min, 100 % de B a 15,1 min, 100 % de B a 16,5 min y 30 % de B a 16,7 min. El muestreador automático se ajustó a 5 °C y el volumen de inyección fue de 5 pl. La identificación se realizó mediante el software XCalibur (Thermo Fisher Scientific).

Cuantificación de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA

La cuantificación de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA se realizó en una cromatografía líquida de alta resolución (Agilent 1290 Infinity) acoplada a un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (G6460 Agilent). Los parámetros cromatográficos fueron los mismos que se utilizaron para la caracterización. El sistema de HPLC se acopló en línea a un MS de triple cuadrupolo Agilent 6460 (Agilent Technologies) equipado con una fuente de ionización por electropulverización. La ionización por electropulverización (ESI) se realizó en modo de iones negativos. Los parámetros de origen utilizados fueron los siguientes: la temperatura de la fuente se fijó en 325 °C, el caudal de gas del nebulizador (nitrógeno) era de 10 l/min, la temperatura del gas envolvente era de 400 °C, el caudal de gas envolvente (nitrógeno) fue de 12 l/min y el voltaje de pulverización se ajustó a -3,5 kV. Los análisis se realizaron en el modo de detección de Monitorización de Reacción Seleccionada (SRM) usando nitrógeno como gas de colisión. La transición específica fue 398/295 correspondiente a [M-H]-/[M-ABA-H]-. La óptica de iones y la energía de colisión se optimizaron para el análisis de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA. La detección de picos, la integración y el análisis cuantitativo se realizaron utilizando el software de análisis cuantitativo Mass Hunter (Agilent Technologies). Para finalizar, la cuantificación de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA se realizó mediante una curva de calibración calculada por el método IS. Se realizaron seis réplicas biológicas para cada cepa.

Experimentos de cultivo celular y absorción/permeabilidad

Las células Caco-2 se cultivaron en Glutamax DMEM (Gibco, Invitrogen life technologies, Paisley, Reino Unido) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (Gibco, Invitrogen life technologies, Paisley, RU), 1 % de aminoácidos no esenciales y 1 % de antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (Gibco, Invitrogen life technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con un 5 % de CO2. Las células se sembraron en insertos Transwell (Costar, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) y se realizaron estudios de absorción de C12-Asn-GABA y GABA 16 días después. Estos compuestos se cuantificaron mediante LC-MS/MS tanto en cámaras apicales y basolaterales como en células. El efecto de C12-Asn-GABA (1-100 ^jM) sobre la permeabilidad paracelular también se midió mediante el flujo de mucosa a serosa de dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de 4 kDa como se describió anteriormente.31. Todos los experimentos se realizaron en medio libre de suero. La concentración de CXCL8 en las cámaras apical y basolateral se determinó 24 horas después de la adición de C12-Asn-GABA utilizando un kit comercial de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (BD biosciences, Erembodegen, Bélgica) siguiendo las recomendaciones del fabricante32.

Resultados

Identificación de aminoácidos grasos producidos por EcN. Con el fin de caracterizar los lípidos potencialmente implicados en las propiedades probióticas de EcN, se realizó un análisis lipidómico comparativo sin a priori por LC-HRMS de lípidos extraídos de la cepa probiótica de tipo salvaje (EcNwt) y un mutante isogénico para clbA que ha perdido su actividad probiótica (EcNAclbA) en un modelo de colitis23. Los cromatogramas de iones totales (TIC) obtenidos se compararon para caracterizar compuestos con una concentración relativa aumentada en EcNwt en comparación con EcNAclbA. Como la abundancia relativa del pico eluido a los 15,33 min representa más del 80 % de la intensidad relativa en EcNwt y solo el 2,5 % en EcNAclbA, los inventores centraron su interés en este pico (fig. 1A). Con la masa exacta obtenida determinamos una composición química de la molécula: [C18H34N2O4]-H-. Posteriormente, el perfil isotópico del espectro de masas experimental obtenido a los 15,33 min se comparó con el espectro de simulación generado a partir de la fórmula. Estos dos perfiles fueron similares y la precisión de la medida fue de 0,6 ppm (fig. 1B) lo que confirma la composición química. Para finalizar, se realizaron análisis MS/MS. El espectro mostró iones a m/z 131, 114 y 96 que son específicos del aminoácido asparagina25 y anión en m/z 226 correspondiente a una cadena lateral de amrisitoilamida26. Por lo tanto, con el patrón de fragmentación identificamos como se esperaba el aminoácido graso C14-asparagina que es el producto de escisión de la precolibactina182122. Sin embargo, el cromatograma de iones extraídos del ion a m/z 131 nos permitió identificar moléculas adicionales con un aminoácido asparagina. Basado en la precisión de masas del espectrómetro de masas y el análisis de espectros de masas de fragmentación, se identificaron varios aminoácidos grasos con diferentes longitudes de cadena de carbono como ya se publicó2122. Luego se realizó la caracterización de otros aminoácidos ligados a la cadena de ácidos grasos mediante el uso del ion [M-H2O]-H-. Se centró el interés en el ion a m/z 398,2664 eluido a los 12,96 min. Los cromatogramas de iones extraídos mostraron que esta molécula está presente en EcNwt pero no en el mutante EcNAclbA (fig. 2A). La precisión de masa obtenida con el análisis LC-HRMS permitió identificar su fórmula química, lo cual fue confirmado por el patrón isotópico del espectro de simulación correspondiente a la fórmula [C20H37N3O5]-H- (fig. 2B). Los fragmentos presentes en el espectro de fragmentación permitieron determinar que un ácido butírico estaba unido a un aminoácido graso C12-Asn (fig. 2C). Aun así, esta caracterización no permitió determinar el isómero del ácido butírico ligado al ácido graso. Para discriminar isómeros de ácido aminobutírico unidos a C12-Asn, se sintetizó C12-Asn-a-aminobutírico (C12-Asn-AABA), C12-Asn-p-aminobutírico (C12-Asn-BABA) y C12-Asn-Y-aminobutírico (C12-Asn-GABA). Los tres isómeros sintetizados se analizaron mediante espectrometría de masas de baja resolución acoplada en línea a una cromatografía líquida. Se desarrolló un método de separación de 15 min para la separación de cada isómero (fig. 2D). El análisis de los sedimentos bacterianos mostró la presencia únicamente de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA (fig. 2D).

La producción de C12-Asn-ácido Y-aminobutírico y C12-Asn-p-ácido aminobutírico por EcN depende de la isla pks. E.coli K-12 MG1655 se transformó con el cromosoma artificial bacteriano (BAC) que alberga toda la isla pks (BAC pks+)13. Solo la cepa MG1655+BAC pks+ se demostró que producía C12-Asn-BABA y C12-Asn-GABA, lo que demuestra el papel de la isla pks en la producción de estos dos compuestos (). Para dilucidar aún más el papel de la isla pks en la síntesis de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA, EcNAclbA y se generaron mutantes isogénicos adicionales de la cepa EcN. Estos mutantes (AclbA, AclbN, AclbB, AclbC y AclbP) ya no eran capaces de producir la genotoxina colibactina y de inducir roturas de doble cadena en células eucariotas en contraste con la cepa EcN parental. Luego se caracterizaron los perfiles de metabolitos lipídicos en EcN y los mutantes, así como en sus sobrenadantes de cultivo. La inactivación de la clbA, el gen que codifica para la PPTasa indujo una disminución drástica tanto de C12-Asn-GABA como de C12-Asn-BABA en bacterias y sobrenadantes de cultivo (fig. 3B y 3C), lo que confirma la relevancia de este gen para la síntesis de estas moléculas. Los genes de clbN, clbB, clbC y clbP codifican enzimas implicadas en las primeras y últimas etapas de la biosíntesis de colibactina, a saber, el alargamiento y la escisión del armazón del profármaco colibactina. La deleción de clbN anuló por completo la producción y secreción de C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA en bacterias y sus sobrenadantes de cultivo, evidenciando el papel esencial de este gen en la producción de estas moléculas. De manera similar, la inactivación de clbB anuló la síntesis y secreción de C12-AsnbAbA y redujo significativamente la síntesis y secreción de C12-Asn-GABA. Por el contrario, la mutación de clbC (un gen que codifica una trans-acil-transferasa que cataliza una ronda adicional de extensión de policétido, después de ClbN y ClbB) no indujo cambios significativos en la concentración de ninguna de las dos moléculas tanto en bacterias como en sobrenadantes. Del mismo modo, la deleción de clbP no modificó el patrón de síntesis y secreción de ninguna de estas moléculas, lo que demuestra que C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA no son productos de escisión. En cambio y como era de esperar, la concentración del producto de escisión, C14-Asn, disminuyó drásticamente a causa de la deleción de clbP. Por lo tanto, C12-Asn-GABA y C12-Asn-BABA son dos nuevas moléculas dependientes de al menos tres genes del grupo de genes biosintéticos clb, confirmando la hipótesis de que la isla pks podría mediar en la formación de compuestos con potencial actividad probiótica23, además de moléculas que inducen daño en el ADN1327. Como entre los isómeros del ácido aminobutírico, el ácido Y-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio en el cerebro de los mamíferos, los inventores plantearon la hipótesis de que C12-Asn-GABA era responsable de las propiedades anti-nociceptivas EcN.

C12-Asn-GABA inhibe la activación neuronal. Para determinar si C12-Asn-GABA o C12-Asn-BABA es capaz de enviar señales a los nervios sensoriales, se realizaron estudios de movilización de calcio en cultivos primarios de neuronas de ganglios de la raíz dorsal (GRD) de ratón. Ninguno de los isómeros (10 j M) indujo la movilización de calcio en condiciones basales (sin estimular). Posteriormente, se realizaron los mismos experimentos en neuronas activadas por un agonista del receptor del canal de calcio TRPV1 (capsaicina) o por una mezcla de agonistas (histamina, serotonina y bradicinina) para los receptores acoplados a proteína G (GPCR) implicados en la hipersensibilidad visceral. La exposición de las neuronas a capsaicina (125 nM) o a la mezcla de agonistas de GPCR (histamina, bradiquinina, serotonina, 10 ^jM cada uno) indujo un aumento en el flujo de calcio como se muestra por el mayor % de neuronas que respondieron y la amplitud de la respuesta (AF/F) en comparación con el vehículo (fig. 4A, 4B). El aumento del flujo de calcio inducido por ambos estímulos nociceptivos se evitó mediante el pretratamiento con C12-Asn-GABA de forma dependiente de la dosis (fig. 4A, 4B), mientras que C12-Asn-BABA no tuvo ningún efecto. Por lo tanto, C12-Asn-GABA no induce la movilización de calcio en las neuronas sensoriales pero inhibe la activación neuronal inducida por estímulos pro-nociceptivos. Para investigar si el efecto inhibitorio de C12-Asn-GABA estaba asociado con el residuo de GABa , las neuronas se trataron con saclofeno (10, 50 y 100 j M), un antagonista competitivo del receptor GABAB. El tratamiento con saclofeno anuló el efecto inhibidor de C12-Asn-GABA contra la capsaicina y la mezcla de agonistas de GPCR de forma dosis-dependiente (fig. 4C, 4D). En conjunto, estos resultados demuestran que C12-Asn-GABA es capaz de inhibir la señalización de calcio en aferentes primarios a través del receptor GABA^b.

Para determinar si la adición de 2 carbonos en la cadena de ácidos grasos cambió las propiedades inhibidoras del C12-Asn-GABA, cultivos de neuronas sensoriales se pretrataron con C14-Asn-GABA y 5 minutos después con el agonista del receptor del canal de calcio TRPV1 (capsaicina). El aumento del flujo de calcio inducido por el estímulo con capsaicina se evitó mediante el pretratamiento con C14-Asn-GABA (fig. 7A, 7b ).

C12-Asn-GABA cruza la barrera epitelial. La barrera inicial para la absorción de cualquier fármaco es la pared celular epitelial intestinal. Para evaluar si C12-Asn-GABA es capaz de cruzar la barrera epitelial y luego, estimular los receptores GABA en las neuronas28, las monocapas de células epiteliales humanas (células Caco-2 completamente diferenciadas) se trataron en el lado apical con C12-Asn-GABA. Veinticuatro horas después, la cuantificación por LC-MS/MS de este compuesto se realizó en células y en el lado apical y basolateral de las cámaras transwell. Al final del periodo de incubación, aproximadamente el 50 % del C12-Asn-GABA agregado en la cámara apical (800 ng) se encontró en la cámara basolateral (fig. 5A). Las células epiteliales contenían niveles bajos de C12-Asn-GABA después de 24 horas de incubación. También se evaluó el transporte de GABA solo a través de la monocapa celular. Con este propósito, se añadió GABA comercial en la cámara apical (800 ng) y, después de 24 h, la presencia de esta molécula se cuantificó por LC-HRMS en cámaras basales y apicales (fig. 5B). No se detectó GABA en la cámara basal después del período de incubación, demostrando que esta molécula no atravesó la monocapa epitelial intestinal. En conclusión, el C12-Asn-GABA es capaz de atravesar una monocapa de células epiteliales. Por lo tanto, la adición del C12-Asn por parte de la bacteria al GABA confiere a este neuromediador la capacidad de atravesar la barrera epitelial intestinal.

Para evaluar el efecto de C12-Asn-GABA en la permeabilidad paracelular, se investigó el transporte de FITC de 4 kDa de dextrano a través de una monocapa de células Caco-2. Como se muestra en la figura 5C, el porcentaje de FITC de 4 kDa que atraviesa las monocapas celulares después de 24 h no se modificó con el tratamiento con C12-Asn-GABA (10 ^jM), evidenciando que C12-Asn-GABA no altera la permeabilidad paracelular. En paralelo, la liberación de CXCL8 de las células Caco-2 al medio, de los lados apical y basolateral del transwell, se evaluó mediante ELISA. Ninguna de las dosis ensayadas (1, 10, 100 j M) y tampoco el vehículo modificaron la secreción de CXCL8 por las células Caco2 (fig. 5D). Por lo tanto, la adición del C12-Asn por parte de la bacteria al GABA confiere a este neuromediador la capacidad de atravesar la barrera epitelial intestinal sin alterar la permeabilidad paracelular. Los inventores plantearon la hipótesis de que la administración intracolónica de C12-Asn-GABA podría imitar la producción luminal del aminolípido analgésico por EcN y su difusión a través de la barrera epitelial.

La administración intracolónica de C12-Asn-GABA inhibe la hipersensibilidad visceral inducida por capsaicina sin alterar la contracción intestinal. En un primer conjunto de experimentos, los inventores evaluaron la capacidad del C12-Asn-GABA para cruzar la barrera epitelial, in vivo. La administración intracolónica de C12-Asn-GABA en ratón aumentó la concentración de este compuesto en el tejido colónico y en la sangre (fig. 6A, 6B). Basado en su efecto inhibitorio sobre la movilización de calcio en las neuronas sensoriales y en su capacidad para atravesar la barrera epitelial in vivo, se evaluó la potencia analgésica de este C12-Asn-GABA. El impacto de C12-Asn-GABA en la hipersensibilidad visceral se evaluó midiendo las respuestas visceromotoras (RVM) a la distensión colorrectal (DCR). Los registros de RVM se iniciaron 15 minutos después de la administración intracolónica de capsaicina (100 jg/animal; 100 j l ) o el vehículo (EtOH 40 %). La capsaicina provocó un aumento (p<0,05) en las presiones de RVM a DCR de 15-60 mm Hg en comparación con el vehículo (fig. 6C). Este aumento se evitó significativamente para todas las presiones de distensión en animales pretratados con una inyección intracolónica de 100 |jl de C12-Asn-GABA (10 |^j M), que mostraron valores de RVM similares a los obtenidos en el grupo control (vehículo/vehículo). La administración de C12-Asn-GABA en ausencia de capsaicina no modificó la sensibilidad visceral en respuesta a DCR (fig. 6C). En cambio, el maleato de trimebutina, un fármaco utilizado clásicamente para el tratamiento de pacientes adultos y adolescentes con síndrome del intestino irritable (SII), no tiene efecto sobre la hipersensibilidad inducida por la capsaicina (Figura 9).

Los pacientes con SII se caracterizan por diversas alteraciones del tránsito intestinal: diarrea, estreñimiento o mixto12345678910, por lo tanto, un fármaco que afecte la motilidad intestinal podría limitar su uso putativo en esta patología. Los inventores evaluaron si C12-Asn-GABA era capaz de alterar la motilidad duodenal. Con este propósito, se utilizaron sensores isotónicos para medir ex vivo las contracciones mecánicas. La aplicación de C12-Asn-GABA en preparaciones duodenales ex vivo no alteran ni la frecuencia de las contracciones (fig. 6D) ni la amplitud de las contracciones intestinales (fig. 6E) en comparación con el control y el vehículo.

Las propiedades analgésicas del C12-Asn-GABA se evaluaron en un modelo de colitis de ratón. Se añadió dextrano sulfato de sodio (DSS) al 3% durante 5 días en el agua de bebida para inducir la colitis. El día 5, el aumento de las presiones de RVM a DCR de 15-60 mm Hg inducido por DSS disminuyó significativamente para todas las presiones de distensión en animales tratados con una inyección intracolónica de 100 j l de C12-Asn-GABA (10 ^jM).

Conclusión

Los inventores identificaron por primera vez un aminoácido graso ligado al GABA, el principal transmisor inhibidor del sistema nervioso central, mostrando potentes propiedades analgésicas en el dolor visceral. Sorprendentemente, la síntesis de este C12-Asn-GABA requiere tres enzimas codificadas por una isla genómica, denominada pks, que porta el grupo de genes que permite la síntesis de policétidos peptídicos híbridos y especialmente la genotoxina colibactina, un factor de virulencia de buena fe y un supuesto agente cancerígeno. Los resultados ilustran cómo la vía biosintética de colibactina NRPS-PKS representa claramente una rica fuente de enzimología de línea de montaje inusual que codifica compuestos bioactivos adicionales distintos de la colibactina. Este estudio es el primer paso en la caracterización de una familia más grande de lipopéptidos bioactivos producidos por la microbiota intestinal. La adición del C12-Asn confiere al GABA la capacidad de difundirse a través de la barrera epitelial y posteriormente actuar sobre las neuronas sensoriales. De manera interesante, C12-Asn-GABA no modifica la fisiología del epitelio intestinal ni la motilidad intestinal, lo que conlleva potencialmente menos efectos secundarios que los analgésicos prototípicos como la morfina. Por lo tanto, C12-Asn-GABA puede representar un agente terapéutico muy prometedor para el tratamiento del dolor visceral.

REFERENCIAS:

A lo largo de la presente solicitud, describen el estado de la técnica diversas referencias a la que pertenece esta invención.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la siguiente estructura de fórmula (I):

RC(O)-Xaa-Xbb-Y (I),

en donde

- R es una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada (grasa) C5-C19,

- Xbb es un resto de ácido gamma-aminobutírico,

- Y es -OH o NH2,

y en donde el resto de ácido gamma-aminobutírico está unido a Xaa a través de su grupo funcional amina y donde el grupo RC(O) está en el lado N terminal e Y es un lado C terminal, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R se selecciona entre la lista que consiste en alquilo, alquenilo o alquinilo.

3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde R es un alquilo C5-C19.

4. El compuesto de la reivindicación 3, en donde R es un alquilo C11.

5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde Xaa es asparagina.

6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde Y es -OH.

7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que consiste en:

ácido C11 C(O)-Asn-gamma-aminobutírico

o sus sales farmacéuticamente aceptables.

8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso como fármaco.

9. El compuesto de la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento del trastorno del dolor.

10. El compuesto para su uso de la reivindicación 9, en donde el trastorno del dolor se selecciona entre el grupo que consiste en dolor visceral y dolor somático.

11. El compuesto para el uso de la reivindicación 10, en donde el trastorno de dolor visceral se selecciona entre el grupo que consiste en, síndrome del intestino irritable (SII), Enfermedades inflamatorias intestinales (EII).

12. El compuesto para su uso de la reivindicación 11, en donde el trastorno de dolor visceral es el Síndrome del Intestino Irritable (SII).

13. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. Un método para obtener el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) se sintetiza utilizando técnicas de síntesis en fase sólida de péptidos o técnicas de síntesis en fase líquida.

15. El método de la reivindicación 14 caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) se sintetiza utilizando la técnica de síntesis en fase líquida.