ES2923106T3 - Composición que comprende compuestos de tiosulfinato y/o tiosulfonato para su uso en la prevención de infecciones bacterianas en animales acuáticos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una composición que comprende al menos un compuesto de fórmula I R-SOa-SR' (I), en la que a es igual a 1 ó 2 y R y R' son, independientemente entre sí, un C1 lineal o ramificado. -Grupo alquilo C5, para uso en la prevención de infecciones parasitarias de animales acuáticos, representando dicho al menos uno de los compuestos antes mencionados un 0,003% en peso con respecto al peso total de la composición. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende compuestos de tiosulfinato y/o tiosulfonato para su uso en la prevención de infecciones bacterianas en animales acuáticos

La invención se refiere a una composición alimenticia y sus usos, en particular en el campo de la acuicultura.

El término “acuicultura” se usa para referirse a la cría de organismos acuáticos (peces, algas, crustáceos, moluscos, etc.) en un ambiente cerrado (estanques, ríos, lagos, jaulas). Practicado durante varios millones de años en Asia, este sistema de “domesticación” de los recursos acuáticos ha experimentado un aumento considerable a escala mundial y se ha convertido en una importante actividad económica en varios países.

Hoy en día, el mayor desafío en esta industria es optimizar el rendimiento de la producción para satisfacer la demanda cada vez mayor de los consumidores. Las principales áreas de desarrollo para lograr este objetivo implican una mayor intensificación y diversificación de las especies acuícolas. En las unidades de producción a gran escala, donde los animales acuáticos se exponen a condiciones de estrés, los problemas vinculados a enfermedades y deterioro de las condiciones ambientales son cada vez más frecuentes y dan como resultado importantes pérdidas económicas.

La prevención y el control de infecciones implica principalmente el uso de productos veterinarios. Hasta ahora, los problemas bacterianos se han controlado mediante el uso de antibióticos. Su uso generalizado ha promovido la aparición de cepas resistentes de bacterias. Esta resistencia puede transferirse fácilmente a otras cepas, ya sea después de modificaciones en el genoma que ya está presente, o mediante la transferencia de material genético entre células por medio de plásmidos o bacteriófagos. Se ha encontrado resistencia debida a la transferencia de plásmidos en numerosos patógenos bacterianos, incluidos los géneros Aeromonas spp, Edwardsiella spp, Photobacterium spp, Streptococcus spp, Tenacibaculum spp, Vibrio spp, Yersinia spp... Para limitar los problemas de resistencia vinculada con los antibióticos, es necesario desarrollar tratamientos que realmente se adapten a cada especie y métodos alternativos para mantener un ambiente microbiano saludable para los animales.

Las alternativas que actualmente parecen prometedoras incluyen la vacunación, la inmunoestimulación y los probióticos.

La vacunación es una herramienta importante en la prevención de enfermedades infecciosas en seres humanos y animales, y se usa ampliamente para los peces. El término “vacuna” sólo puede aplicarse estrictamente cuando se pretende obtener una protección duradera mediante la activación de la memoria inmunológica, ya que se dirige a la respuesta inmunitaria específica. La vacunación requiere una estimulación primaria con un antígeno y depende de los linfocitos para ser implementada. Además, la mayoría de las vacunas comerciales suelen aumentar la resistencia solo a uno o dos patógenos específicos y solo proporcionan resistencia temporal a la enfermedad, lo que resta beneficios a esta alternativa.

Los inmunoestimulantes pueden fortalecer la inmunidad a una amplia variedad de agentes patógenos; por lo tanto, no son específicos. La inmunoestimulación puede obtenerse en un sentido más general, por ejemplo, dirigiéndose a la activación del complemento, la activación de macrófagos, la fagocitosis acumulada por neutrófilos y monocitos y la secreción de citocinas, sin requerir una respuesta específica a un antígeno definido. Los inmunoestimulantes se han estudiado en profundidad en peces y crustáceos, tanto a escala animal como a escala celular. Se usan como agentes profilácticos para combatir enfermedades infecciosas en animales y también actúan como moléculas de alarma, que activan el sistema inmunitario no específico. Sin embargo, el uso de varios inmunoestimulantes por periodos prolongados no parece proporcionar ventajas adicionales en comparación con una sola dosis; una sobredosis puede incluso inhibir las respuestas inmunitarias y, por tanto, reducir el crecimiento de los animales. Por último, usualmente tienen un efecto durante un período corto y, frecuentemente, son ineficaces una vez que la enfermedad está presente. Por lo tanto, esta alternativa también tiene limitaciones.

Por último, desde hace varios años, los probióticos han tenido una gran importancia en la acuicultura. Los probióticos se definen como microorganismos vivos que tienen un efecto beneficioso sobre el huésped al regular su flora microbiana intestinal de manera positiva, al optimizar su uso de los alimentos ingeridos, al estimular su respuesta inmunitaria a los patógenos y al mejorar la calidad de su ambiente circundante. El uso de probióticos y productos comerciales que contienen probióticos en la acuicultura (frecuentemente en la camaronicultura) ha dado resultados que muestran resistencias a enfermedades que son similares a las obtenidas con los antibióticos que se usan actualmente. Son, por tanto, una alternativa interesante para solucionar el problema de la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, por definición, los probióticos se usan como agentes profilácticos. Pueden prevenir la aparición de una enfermedad, pero no constituyen una estrategia curativa eficaz, ya que actúan sobre el huésped en lugar del patógeno. Además, como microorganismos vivos, cuando se aplican, no puede usarse ningún otro tratamiento químico destinado a combatir microorganismos tales como organismos fúngicos o parásitos, ya que dichos tratamientos alteran la eficacia de los probióticos. Dichos probióticos también pueden ser fácilmente destruidos por compuestos químicos o fármacos que interfieren con su eficacia y sus beneficios a largo plazo.

Estos métodos alternativos, aunque han demostrado su eficacia, están limitados por el hecho de que son esencialmente preventivos, frecuentemente son específicos para uno o varios patógenos más, y son poco eficaces en el tratamiento curativo a largo plazo de una enfermedad. Dichos métodos también dependen de la fisiología del animal huésped y varios factores tales como la genética de la especie, la etapa del ciclo de vida y el entorno de cría interactúan con el tipo y la dosificación de estos productos, lo que puede reducir su eficacia.

El desarrollo de ingredientes activos naturales con propiedades antimicrobianas proporciona una eficacia menos dependiente del entorno y de la fisiología del huésped, y proporciona un espectro antimicrobiano más amplio ya que estos ingredientes activos se dirigen directamente al patógeno, lo que permite dos tipos de aplicación: aplicación profiláctica en el huésped y aplicación terapéutica en el huésped y el entorno de cría.

También se conocen del estado de la técnica el tiosulfinato de propilo (PTS) y el tiosulfonato de propilo (PTSO), que son derivados naturales de Alliaceae, tal como compuestos antibacterianos y antimicrobianos de amplio espectro que afectan por igual a microorganismos unicelulares tales como bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas y virus u otros patógenos tales como parásitos multicelulares.

Por ejemplo, la solicitud EP 2552432 A2 propone usar compuestos de tiosulfinato de propilo (PTS) de fórmula R— SOa-S—R, donde R es un grupo n-propilo (—CH2—CH2—CH3), y compuestos de tiosulfonato de propilo (PTSO) de fórmula R—SOa-S—R, donde R es un grupo n-propilo (—CH2—CH2—CH3), para reducir el número de patógenos apicomplexa en un animal. Para ser precisos, un apicomplexa se define como un organismo unicelular que es parásito de vertebrados e invertebrados. El término “apicomplexa” cubre los géneros Babesia, Cryptosporidium, Eimeria, Gregarina, Monospora, Neospora, Plasmodium, Theileri y Toxoplasma. La composición descrita en este documento se usa esencialmente en el contexto de la cría de aves, cerdos o rumiantes, pero no incluye especies acuáticas.

La solicitud internacional WO 2015049587 A2 propone usar los mismos compuestos para reducir parásitos patógenos en animales acuáticos. En concreto, los parásitos estudiados abarcan parásitos pertenecientes a diferentes grupos zoológicos, tales como ectoparásitos dinoflagelados, ciliados, zooflagelados, helmintos tales como monógenos, trematodos, cestodos, nematodos, ectoparásitos parásitos tales como moluscos, crustáceos y piojos de mar. Sin embargo, este documento no se ocupa de la contaminación bacteriana y viral de los estanques acuícolas. El documento Journal of Food Agriculture and Environment; Vol. 11(1); 2013; pp. 696-699 describe el uso de la alicina en el tratamiento de las infecciones parasitarias de los peces en estructuras acuícolas.

Además, persiste el tratamiento de infecciones en las estructuras y el entorno de cría.

El problema que aborda la invención es remediar este inconveniente.

Uno de los problemas que aborda la invención es proporcionar una nueva composición que se adapte al tema de la acuicultura.

Otro problema abordado por la invención es proponer un medio eficaz que se use fácilmente para tratar o prevenir las infecciones parasitarias encontradas en el cultivo acuícola.

La invención se refiere a una composición que contiene al menos un compuesto de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo C1 - C5 alifático o no alifático, lineal o ramificado,

para uso diario o uso más regular, durante al menos ocho días, en la prevención de infecciones parasitarias, y en particular infecciones bacterianas o virales, en animales acuáticos criados en estructuras acuícolas, en particular en estanques acuícolas,

donde dicho al menos un compuesto mencionado anteriormente es el 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición.

Ventajosamente, la invención se refiere a una composición que contiene al menos un compuesto de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo C1 - C5 alifático o no alifático, lineal o ramificado,

y al menos un soporte mineral, dicho al menos un compuesto constituye el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral,

para uso diario o uso más regular, durante al menos ocho días, en la prevención de infecciones parasitarias, y en particular infecciones bacterianas o virales, en animales acuáticos criados en estructuras acuícolas, donde dicho al menos un compuesto mencionado anteriormente es el 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición.

La invención se basa en la observación de los inventores de que una dosis particular de al menos un compuesto de fórmula I, mediante el uso de un modo de administración específico, permite prevenir la infección bacteriana en estructuras acuícolas. Los inventores han demostrado que la dosis del 0,003 % era particularmente adecuada para prevenir infecciones bacterianas.

En la invención, "uso diario o uso más regular" significa el uso una vez al día, o incluso varias veces al día, por ejemplo, por la mañana y por la tarde, o por la mañana, al mediodía y por la noche. Este uso dependería de las prácticas del criador y de las necesidades nutricionales de los animales acuáticos en cuestión. Un experto en la técnica sabría ajustar la frecuencia de acuerdo con la especie.

En la invención, "durante al menos ocho días" significa el uso durante 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días o 31 días, o incluso más. Un experto en la técnica ajustaría el uso de acuerdo con las necesidades profilácticas del cultivo acuícola en cuestión. En cualquier caso, es importante que se use durante al menos 8 días.

En el uso mencionado anteriormente, las bacterias acuáticas a las que se dirige la composición de acuerdo con la invención son las bacterias de los siguientes géneros; Aerococcus, Aeromonas, Allivibrio, Brucella, Campylobacter, Carnobacterium, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Edwardsiella, Elizabethkingia, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Francissella, Hafnia, Halomonas, Lactococcus, Listonella, Moraxella, Moritella, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Pasteurella, Photobacterium, Plesiomonas, Pseudomonas, Renibacterium, Rhodococcus, Salmonella, Serratia, Shewanella, Staphylococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Tenacibaculum, Vagococcus, Vibrio y Yersinia.

Más ventajosamente, la invención se refiere a una composición que contiene al menos dos compuestos de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo C1 - C5 alifático o no alifático, lineal o ramificado, para el uso mencionado anteriormente,

dichos al menos dos compuestos tienen diferentes estructuras químicas.

En otras palabras, la invención se refiere a la composición para el uso mencionado anteriormente, dicha composición contiene al menos dos, en particular dos, compuestos de la fórmula I separada, dichos al menos dos compuestos son el 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición.

Puede ser particularmente ventajoso para los dos compuestos, que tienen estructuras químicas separadas, que el primer compuesto tenga a = 1 y el segundo compuesto tenga a = 2. En cualquier caso, en ningún caso los dos compuestos pueden tener fórmulas químicas idénticas, o sólo diferir entre sí a causa de una forma salina.

Ventajosamente, la invención se refiere a la composición para el uso mencionado anteriormente, en donde dicha composición contiene una mezcla de los siguientes compuestos

CH³-CH²-CH²-SO-S-CH²-CH²-CH³ y CH³-CH²-CH²-SO²-S-CH²-CH²-CH³, donde dicha mezcla es el 0,003 % en peso de dicha composición.

En la invención, la molécula de fórmula CH³-CH²-CH²-SO-S-CH²-CH²-CH³ se denomina tiosulfinato de di(n-propilo) o PTS, y la molécula de fórmula CH³-CH²-CH²-SO²-S-CH²-CH²-CH³ se conoce como tiosulfonato de di(n-propilo) o PTSO.

En una modalidad más ventajosa, la invención se refiere a una composición que contiene una mezcla de PTS y PTSO, para el uso mencionado anteriormente.

También es ventajoso que la composición mencionada anteriormente esté en forma de un polvo que pueda dispersarse, por ejemplo, en el agua de cría, o incluirse en el alimento, o dispersarse sobre o en el alimento.

En particular, es ventajoso que la composición mencionada anteriormente contenga al menos un compuesto, en particular al menos dos compuestos mencionados anteriormente, y un soporte mineral, dicho al menos un compuesto constituye el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral.

Aún más ventajosamente, la composición mencionada anteriormente es tal que contiene:

a. 20 % en peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral, b. del 40 al 61 % en peso basado en el peso total de la composición de uno o más compuestos que permiten la estabilidad e hidrodispersión de la composición, y del 19 al 40% en peso de uno o más compuestos inmunoestimulantes.

Una composición particularmente ventajosa de la invención es aquella que contiene los siguientes ingredientes: 20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice.

Una composición particularmente ventajosa de la invención es aquella que contiene los siguientes ingredientes: 20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

34 % en peso de bentonita,

17 % en peso de sepiolita,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice.

Además, uno de los aspectos particularmente ventajosos de la invención se refiere a una composición constituida por

20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

34 % en peso de bentonita,

17 % en peso de sepiolita,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice,

para uso diario o uso más regular, o uso más frecuente, en un suplemento nutricional durante al menos ocho días, en la prevención de infecciones parasitarias, y en particular infecciones bacterianas, en animales acuáticos criados en estanques acuícolas,

dicha mezcla de PTS/PTSO usada al 0,003% en peso basado en el peso total de la composición.

La composición mencionada anteriormente es tal que hace que el producto sea estable, fácil de usar en acuicultura e hidrodispersable con actividad principalmente antimicrobiana; dicho producto se fortalece con propiedades inmunoestimulantes y protege el sistema celular de los animales acuáticos diana.

En resumen, uno de los aspectos ventajosos es usar una composición mencionada anteriormente a razón del 0,1 % de la composición total (que contiene el ingrediente activo de fórmula I y los otros compuestos). Dado que, ventajosamente, los ingredientes activos de la composición (PTS/PTSO) constituyen el 15 % de una fracción del 20 % en peso basado en el peso total de la composición, se entiende por tanto que el ingrediente activo (mezcla de PTS/PTSO) se usa al 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición original.

En otras palabras, la invención se refiere ventajosamente a una composición que contiene al menos un compuesto de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo Cⁱ - C⁵ alifático o no alifático, lineal o ramificado,

dicha composición se usa en estado diluido, suspendido o disperso al 1/1000, en un disolvente o en un sólido, de uso diario o de uso más regular, durante al menos ocho días, en la prevención de infecciones parasitarias, y en particular infecciones bacterianas o víricas, en animales acuáticos criados en estructuras acuícolas, tal que dicho al menos un compuesto mencionado anteriormente, cuando se usa en un estado diluido, suspendido o disperso al 1/1000, constituye el 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición original sin diluir, sin suspender o sin dispersar.

Aún más ventajosamente, la invención se refiere a la composición para el uso mencionado anteriormente, en donde dichos animales en estanques acuícolas son peces o crustáceos decápodos.

Los ejemplos de peces y crustáceos decápodos, en particular camarones, se dan en los siguientes ejemplos, sin tener un efecto limitante.

Aún más ventajosamente, la invención se refiere a la composición mencionada anteriormente para el uso mencionado anteriormente, en la que dichos al menos dos compuestos están en proporciones relativas en peso que varían de 60/40 a 40/60.

En la invención se entiende una mezcla de PTS/PTSO, donde PTS constituye el 60 % de la mezcla con PTSO, donde el PTSO sustituye el 40 % de esta mezcla, y viceversa. La invención también cubre una mezcla que contiene el 50 % de cada uno de los dos compuestos.

Además, en la invención, “proporciones relativas de 60/40 a 40/60” significa las siguientes proporciones de PTS/PTSO: 60/40, 59/41, 58/42, 57/43, 56/44, 55/45, 54/46, 53/47, 52/48, 51/49, 50/50, 49/51, 48/52, 47/53, 46/54, 45/55, 44/56, 43/57, 42/58, 41/59 y 40/60.

La invención se refiere además a una composición que contiene al menos un compuesto de la siguiente fórmula I R-SOa-S-R'(I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo C¹C⁵ alifático o no alifático, lineal o ramificado,

para uso diario o uso más regular, durante al menos ocho días, en el tratamiento de infecciones parasitarias y, en particular, bacterianas en animales acuáticos criados en estructuras acuícolas, en particular en estanques acuícolas,

dicho al menos un compuesto mencionado anteriormente es del 0,009 al 0,012 % en peso basado en el peso total de la composición.

En la invención, “de 0,009 a 0,012 % en peso” significa proporciones de 0,009 % en peso, 0,0091 % en peso, 0,0092 % en peso, 0,0093 % en peso, 0,0094 % en peso, 0,0095 % en peso, 0,0096 % en peso, 0,0097 % en peso, 0,0098 % en peso, 0,0099 % en peso, 0,01 % en peso, 0,0101 % en peso, 0,0102 % en peso, 0,0103 % en peso, 0,0104 % en peso, 0,0105 % en peso, 0,0106 % en peso, 0,0107 % en peso, 0,0108 % en peso, 0,0109 % en peso, 0,0110 % en peso, 0,0111 % en peso, 0,0112 % en peso, 0,0113 % en peso, 0,0114 % en peso, 0,0115 % en peso, 0,0116 % en peso, 0,0117 % en peso, 0,0118 % en peso, 0,0119 % en peso y 0,012 % en peso.

Ventajosamente, la invención se refiere a la composición para el uso mencionado anteriormente, dicha composición contiene al menos dos, en particular dos, compuestos de fórmula I, dicha composición contiene de 0,009 a 0,012 % en peso de dichos compuestos, en particular dos compuestos, basado en el peso total de la composición, dicha composición contiene en particular una mezcla de los siguientes compuestos:

CH³-CH²-CH²-SO-S-CH²-CH²-CH³ y CH³-CH²-CH²-SO²-S-CH²-CH²-CH³, en particular en proporciones de desde 60:40 a 40:60 en peso entre sí, en particular 50:50.

Ventajosamente, la invención se refiere a una composición constituida por

20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice,

Ventajosamente, la invención se refiere a una composición constituida por

20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

34 % en peso de bentonita,

17 % en peso de sepiolita,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice,

para uso diario o uso más regular o frecuente en un suplemento nutricional durante al menos ocho días, en el tratamiento de infecciones parasitarias, y en particular infecciones bacterianas, en animales acuáticos criados en estanques acuícolas,

dicha mezcla de PTS/PTSO es del 0,009 al 0,012 % en peso basado en el peso total de la composición.

En resumen, uno de los aspectos ventajosos es usar una composición mencionada anteriormente a razón del 0,3 a 0,4 % de la composición total (que contiene el ingrediente activo de fórmula I y los otros compuestos). Dado que, ventajosamente, los compuestos activos de la composición (PTS/PTSO) constituyen el 15 % de una fracción del 20 % en peso basado en el peso total de la composición, se entiende por tanto que el ingrediente activo (mezcla de PTS/PTSO) se usa del 0,009 al 0,012 % en peso basado en el peso total de la composición original.

En otras palabras, la invención se refiere ventajosamente a una composición que contiene al menos un compuesto de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo C¹ - C⁵ alifático o no alifático, lineal o ramificado,

dicha composición se usa en estado diluido, suspendido o disperso de 3/1000 a 4/1000, en un disolvente o en un sólido, de uso diario o uso más regular, durante al menos ocho días, en la prevención de infecciones parasitarias, y en particular infecciones bacterianas o virales, en animales acuáticos criados en estanques acuícolas, tal que dicho al menos un compuesto mencionado anteriormente, cuando se usa en un estado diluido, suspendido o disperso en 3/1000 a 4/1000, constituye del 0,009 al 0,012 % en peso basado en el peso total de la composición original sin diluir, sin suspender o sin dispersar.

Además, la invención se refiere a un producto alimenticio que contiene al menos un nutriente, y la composición como se define anteriormente, para uno de los usos como se define anteriormente.

El producto alimenticio mencionado anteriormente contiene nutrientes que son necesarios para el crecimiento, para mantener el metabolismo básico y para la supervivencia del animal al que está destinado. Estos nutrientes son nutrientes a base de carbohidratos, ya sea en forma de azúcares simples o complejos, lípidos, en particular en forma de ácidos grasos saturados o insaturados, esteroles o prótidos, en particular que contienen todos o algunos de los veinte aminoácidos. Los nutrientes también contienen minerales y vitaminas. Una composición alimenticia de acuerdo con la invención se describe en los ejemplos siguientes.

Además, la invención se refiere a una composición que contiene:

- al menos un compuesto de la siguiente fórmula I:

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo C¹-C⁵ alifático o no alifático, lineal o ramificado, y

- al menos un soporte mineral,

dicho al menos un compuesto constituye el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral.

Aún más ventajosamente, la invención se refiere a una composición que contiene

- al menos dos compuestos de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente uno del otro, un grupo alquilo Ci - C5 alifático o no alifático, lineal o ramificado, para el uso mencionado anteriormente,

dichos al menos dos compuestos constituyen el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral, donde dichos al menos dos compuestos tienen estructuras químicas diferentes,

y

- al menos un soporte mineral.

Ventajosamente, la invención se refiere a la composición mencionada anteriormente, que contiene:

a. 20 % en peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto, o al menos dos compuestos, y dicho al menos un soporte mineral, dicho al menos un compuesto, o al menos dos compuestos, constituyen el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto, o al menos dos compuestos, y dicho al menos un soporte mineral,

b. del 40 al 61 % en peso basado en el peso total de la composición de compuestos que permita la estabilidad e hidrodispersión de la composición, y

c. del 19 al 40 % en peso de compuestos inmunoestimulantes.

Aún más ventajosamente, la invención se refiere a una composición constituida por

20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice.

Ventajosamente, la invención se refiere a la composición mencionada anteriormente, que contiene:

a. 20 % en peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral, b. del 40 al 61 % en peso basado en el peso total de la composición de compuestos que permita la estabilidad e hidrodispersión de la composición, y

c. del 19 al 40 % en peso de compuestos inmunoestimulantes.

Aún más ventajosamente, la invención se refiere a una composición constituida por

20 % en peso de una mezcla constituida por 15 % en peso de una mezcla de PTS/PTSO y 85 % en peso de un soporte de sílice,

34 % en peso de bentonita,

17 % en peso de sepiolita,

10 % en peso de sorbitol,

5 % en peso de dextrosa,

5 % en peso de vitamina E y 5 % en peso de vitamina C, y

4 % en peso de metionina,

los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición, a excepción de los porcentajes en peso de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice, que se expresan en peso basado en el peso total de la mezcla de PTS/PTSO y del soporte de sílice.

Además, la invención se refiere a un producto alimenticio que contiene al menos un nutriente ya la composición definida anteriormente.

El producto alimenticio mencionado anteriormente contiene nutrientes que son necesarios para el crecimiento, para mantener el metabolismo básico y para la supervivencia del animal al que está destinado. Estos nutrientes son nutrientes a base de carbohidratos, ya sea en forma de azúcares simples o complejos, lípidos, en particular en forma de ácidos grasos saturados o insaturados, esteroles o prótidos, en particular que contienen todos o algunos de los veinte aminoácidos. Los nutrientes también contienen minerales y vitaminas. Una composición alimenticia de acuerdo con la invención se describe en los ejemplos siguientes.

La invención se entenderá mejor a la luz de los siguientes ejemplos y figuras:

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra curvas que ilustran la mortalidad acumulada (eje y) observada en % en juveniles de lobina europea Dicentrarchus labrax, 21 días después de la infección con la cepa PP3 de Photobacterium damselae subsp. piscicida, dependiendo de si los peces no se suplementan (curva con rombos negros) con la composición descrita en la invención aplicada al 0,1 % (es decir, PTS/PTSO al 0,003 %; curva con cuadrados grises) durante 28 días antes de la infección experimental.

La Figura 2 muestra curvas que ilustran la mortalidad observada en los juveniles de tilapia del Nilo Oreochromis niloticus, 21 días después de la infección con Streptococcus agalactiae, dependiendo de si los peces no se suplementan (curva con cuadrados negros) con la composición descrita en la invención aplicada al 0,1 % (es decir, PTS/PTSO al 0,003 %; curva con cruces grises) o si los peces se suplementan con un antibiótico (curva con círculos) durante 28 días antes de la infección experimental.

La Figura 3 muestra curvas que ilustran la mortalidad observada en poslarvas del camarón blanco Penaeus vannamei, 14 días después de la infección con Vibrio parahaemolyticus, dependiendo de si los camarones no están infectados (curva con cuadrados grises) o si están infectados (curva con triángulos negros), o están infectados y suplementados con la composición descrita en la invención aplicada al 0,1 % (curva con cruces negras), o al 0,3 % (curva con cruces grises), o al 0,5 % (curva con círculos grises) durante 20 días antes de la infección experimental.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Preparación de la composición preferida de la invención

La composición descrita en la invención se basa en el potencial antibacteriano de los compuestos R-SOa-S-R. Una de las versiones ventajosas de la composición de la invención contiene compuestos R-SOa-S-R específicos, mezclados con otros siete ingredientes que tienen propiedades estabilizantes e inmunoestimulantes. La composición se forma de tal manera que proporciona un producto que es estable, fácil de usar en acuicultura e hidrodispersable con actividad principalmente antimicrobiana, que se fortalece con propiedades inmunoestimulantes y que protege el sistema celular de los animales acuáticos diana.

La primera etapa en la fabricación de la composición consiste en producir los compuestos R-SOa-S-R. Aunque dichos compuestos pueden proceder de síntesis química, ventajosamente pueden extraerse de plantas pertenecientes a la familia Alliaceae (de acuerdo con la nomenclatura filogenética APG) y en particular del género Allium, que es miembro de esta familia. Las plantas más conocidas pertenecientes al género Allium son puerros (Allium ampeloprasum), cebollas (Allium cepa L.), ajos cultivados (Allium sativum L.), echalotes (Allium ascalonicum), cebolleta (Allium fistulosum L.), y cebollino (Allium schoenoprasum L.).

El PTSO puede obtenerse mediante síntesis o descomposición (u oxidación) de PTS. La obtención de PTS mediante extracción y la obtención de PTSO se describe en particular en la solicitud de patente EP A11721534. Los compuestos R-SOa-S-R también pueden obtenerse de acuerdo con el método descrito en la solicitud de patente FR A2813884.

Una vez obtenidos, los compuestos R-SOa-S-R, en forma de aceite, se mezclan a continuación con sílice de acuerdo con la relación en peso 15:85 (%) para transformar la solución de compuestos en polvo.

A continuación, este polvo que contiene los compuestos R-SOa-S-R se mezcla en forma de polvo con los siete ingredientes siguientes y de acuerdo con la proporción indicada, mediante el uso de un mezclador industrial: bentonita (34 %), polvo que contiene los compuestos R-SOa-S-R (20 %), sepiolita (17 %), sorbitol (10 %), dextrosa (5 %), vitamina E (5 %), vitamina C (5 %) y metionina (4 %), donde los porcentajes se expresan en peso basado en el peso total de la composición.

En este punto, los compuestos R-SOa-S-R constituyen el 3 % en peso del peso de la composición.

Una aplicación de la composición de 8 ingredientes del 0,1 al 0,4 % en peso del alimento significa que los compuestos R-SOa-S-R constituyen del 0,003 al 0,012 % en peso del peso final del alimento.

El alimento descrito en la invención es un alimento destinado a la alimentación de animales, y más concretamente a la alimentación de los animales acuícolas con el fin de aportarles los nutrientes necesarios para su crecimiento, supervivencia y metabolismo básico. Aquí, el término “alimento para acuicultura” tiene el significado que normalmente le atribuye un experto en la técnica. Por ejemplo, los alimentos para acuicultura pueden considerarse alimentos artificiales (es decir, alimentos formulados y fabricados) para suplementar o reemplazar los alimentos naturales en la industria acuícola. Este alimento se produce comúnmente en forma de escamas, gránulos o tabletas. Por lo general, los alimentos para acuicultura se refiere al alimento artificial que es útil para el crecimiento de peces y crustáceos decápodos. Este alimento formulado está compuesto por diferentes ingredientes en proporciones variables, que se complementan entre sí para formar un alimento completo que cumple con los requerimientos nutricionales de las especies acuícolas diana.

Los alimentos para acuicultura están compuestos de micro y macro ingredientes. En general, los ingredientes usados en dosis superiores al 1 % se denominan macroingredientes. Los ingredientes usados en dosis inferiores al 1 % se denominan microingredientes. Cada una de estas categorías de macro y microingredientes se subdivide en componentes que tienen funciones nutricionales o funciones técnicas. Los ingredientes que tienen una función técnica mejoran las cualidades físicas del alimento para acuicultura. Los ingredientes que tienen una función nutricional proporcionan a los animales acuáticos los nutrientes y la energía necesarios para su crecimiento, supervivencia y metabolismo básico. Estos nutrientes son nutrientes a base de carbohidratos, ya sea en forma de azúcares simples o complejos, lípidos, en particular en forma de ácidos grasos saturados o insaturados, esteroles o prótidos, en particular que contienen todos o algunos de los veinte aminoácidos. Los nutrientes también contienen minerales y vitaminas.

La composición puede incluirse en el alimento durante las etapas de crecimiento larval, poslarval o juvenil, o cualquier otra etapa de crecimiento, del animal de acuicultura.

En ausencia de cualquier enfermedad, la composición descrita en la invención se añade de forma preventiva al alimento para acuicultura y durante el proceso de fabricación de este alimento a una dosis del 0,1 %. La composición, que se considera un microingrediente, se integra en el punto al cual se mezclan los ingredientes en la dosis recomendada, antes del proceso de extrusión o compresión.

Una vez reportada una enfermedad, la composición descrita en la invención se añade como medida curativa al alimento para acuicultura directamente a los gránulos extruidos y a una dosis del 0,4 %. La cantidad de la composición en forma de polvo, equivalente al 0,4 % del alimento, se diluye en agua en una relación de polvo:agua del 1:15, y a continuación se pulveriza directamente sobre la superficie del alimento mediante el uso de una barra pulverizadora. Si es necesario, los gránulos se recubren a continuación con aceite animal o vegetal para evitar que la composición se salinice una vez en el agua de cría de las especies acuáticas.

Ejemplo 2 - Efecto in vitro

La actividad antimicrobiana de la composición que constituye la invención se analiza midiendo concentraciones inhibitorias mínimas expresadas en partes por millón (ppm) en relación con 10 patógenos acuáticos bacterianos. Las bacterias de agua blanda están constituidas por Aeromonas salmonada, Edwardsiella tarda y Yersinia ruckeri, mientras que las bacterias de agua de mar o salobre están constituidas por Aeromonas salmonicida salmonada, Photobacterium damsela damsela, Streptococcus iniae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum discolor, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus y Vibrio anguillarum.

La composición (A), constituida por el conjunto de 8 ingredientes descritos en la invención así como también 3 productos naturales reconocidos por su potencial antimicrobiano: (B) citral, que es un constituyente mayoritario del aceite de citronela y aceites de otras plantas del género Cymbopogon, (C) eugenol, componente principal del clavo, y (D) carvacrol, componente principal del aceite de tomillo y del aceite de orégano, se ponen en una solución en agua destilada y se diluyen sucesivamente en agua destilada directamente en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. Se añaden 100 pl de cultivo bacteriano diana en una dosis de 106 unidades formadoras de colonias / ml (UFC/ml) a cada pocillo de la microplaca en el punto de incubación. A continuación, la microplaca se incuba durante 18 horas a 25 °C. A continuación, se calculan las concentraciones inhibitorias mínimas observando los pocillos que muestran y no muestran crecimiento bacteriano en función de la dosis de la composición o producto asociado. Cuanto menor sea la concentración inhibitoria mínima, más eficaz será el producto, ya que se requiere menos producto para inducir la inhibición del patógeno.

Después de 18 horas de incubación, los resultados (tabla 1 a continuación) indican que la composición de 8 ingredientes descritos en la invención tiene las concentraciones inhibitorias mínimas más bajas, dependiendo de la cepa patógena, de entre 16 y 125 ppm, en comparación con 64 y 1000 ppm para el producto B, en comparación con 64 y 2000 ppm para el producto C, y en comparación con 32 y 250 ppm para el producto D. Estos valores indican que la eficacia de la composición descrita en la invención es la mejor cuando se compara con los demás productos antibacterianos.

Tabla 1. La Tabla 1 muestra las concentraciones inhibitorias mínimas (expresadas en ppm) en relación con 10 cepas patógenas de la composición descrita en la invención en comparación con 3 productos reconocidos como antibacterianos. (A) Composición constituida por el conjunto de 8 ingredientes descritos en la invención, (B) citral,

(C) eugenol y (D) carvacrol.

Ejemplo 3 - Comparación del efecto de PTS/PTSO y de la composición de acuerdo con la invención

La actividad antimicrobiana de la composición que constituye la invención (A) y de la mezcla constituida por los compuestos R-SOa-S-R únicos (B) se compara con la de los antibióticos de referencia usados en acuicultura (enrofloxacino (C), eritromicina (D) y oxitetraciclina (E)). Se analizan midiendo las concentraciones inhibitorias mínimas expresadas en ppm en relación con 5 patógenos acuáticos bacterianos: Aeromonas salmonicida salmonada, Streptococcus iniae, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum, Vibrio parahaemolyticus.

Después de descongelar y subcultivar las cepas patógenas, dichas cepas se cultivan en un medio líquido Caldo Marino en condiciones aeróbicas a 25 °C durante 24 horas. El nivel de concentración bacteriana es variable dependiendo de las cepas y alcanza de 107 a 109 UFC/ml después de 24 horas. Estas cepas patógenas se diluyen a continuación para alcanzar una concentración de 106 UFC/ml para las pruebas de exposición.

La mezcla constituida por los compuestos R-SOa-S-R únicos o la composición constituida por el conjunto de 8 ingredientes descritos en la invención así como también 3 antibióticos diana se ponen en solución en agua destilada y se diluyen sucesivamente en agua destilada directamente en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. Se añaden 100 pl de cultivo bacteriano diana en una dosis de 106 UFC/ml a cada pocillo de la microplaca en el punto de incubación. A continuación, la microplaca se incuba durante 18 horas a 25 °C. A continuación, se calculan las concentraciones inhibidoras mínimas observando los pocillos que muestran y no muestran crecimiento bacteriano en función de la dosis de la composición o del antibiótico asociado. Las pruebas se repiten un mínimo de 3 veces seguidas para obtener un valor promedio robusto.

Después de 18 horas de incubación, los resultados (Tabla 2 a continuación) indican que la composición basada en los compuestos R-SOa-S-R únicos que constituyen el 20 % de la composición de 8 ingredientes descrita en la invención tiene concentraciones inhibitorias mínimas que son similares a la composición de 8 ingredientes. Por lo tanto, los ingredientes de esta composición inducen una sinergia que fortalece el potencial antimicrobiano de la composición basada en compuestos R-SOa-S-R únicos y permite reducir en un factor de 5 la dosis de estos compuestos R-SOa-S-R en la composición global, haciendo económicamente viable la aplicación de dicha composición.

Además, tras 18 horas de incubación, la composición a base de compuestos R-SOa-S-R únicos así como también la composición de 8 ingredientes descrita en la invención tienen concentraciones inhibitorias mínimas de entre 19 y 150 ppm dependiendo de la cepa, que son similares (diferentes en menos de un factor de 10) a los obtenidos con los antibióticos: 3 a 9 ppm para enrofloxacina, 19 a 300 ppm para oxitetraciclina y 25 y 75 ppm para eritromicina.

composición de 8 ingredientes descrita en la invención (A) en comparación con la mezcla constituida por los compuestos R-SOa-S-R únicos (B) y los 3 antibióticos de interés en acuicultura: enrofloxacino (C), eritromicina (D) y oxitetraciclina (E).

Ejemplo 4 - Prueba de la eficacia de la prevención

En primera instancia, la composición descrita en la invención se analiza como un método para prevenir enfermedades bacterianas en la cría acuícola.

Se analiza en condiciones experimentales de cría de lubina (Dicentrarchus labrax), tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) y camarón blanco (Penaeus vannamei), respectivamente infectados con Photobacterium damselae, responsable de la pasteurelosis en la lubina, Streptococcus agalactiae, responsable de la estreptococosis en la tilapia y Vibrio parahaemolyticus, responsable de la necrosis hepatopancreática aguda en camarones.

A- Cría de lubina

Para la lubina (Dicentrarchus labrax), los juveniles, con un peso de 8,7 ± 0,7 g, se distribuyen en recipientes de fibra de vidrio de 200 l a razón de 35 individuos por recipiente. El agua de mar, con una salinidad del 35 % y una temperatura de 20 ± 0,5 °C, circulaba continuamente en el sistema de cría. Se respeta un fotoperiodo de 14 horas en el día / 10 horas de oscuridad manteniendo la oxigenación del agua por encima del 90 %.

Se aplican 2 tratamientos: (A) un alimento específico para lubina que no se suplementa y (B) un alimento específico para lubina suplementado con la composición aplicada como una medida preventiva al 0,1 % del alimento. La dosis del 0,1 % corresponde a la estimación de la dosis eficaz necesaria para observar la eficacia de la composición mencionada en los ejemplos 2 y 3.

Cada uno de los tratamientos se divide en 3 repeticiones. Dado que el sistema usa recirculación, la propagación del patógeno entre los recipientes es concebible y, por lo tanto, no permite implementar un tratamiento sin peces infectados.

Durante todo el período del ensayo (28 días sin infección seguidos de la infección, a continuación 21 días de monitoreo después de la infección), los peces se alimentan ad libitum 3 veces al día (09:00, 14:00 y 17:00) durante la semana y dos veces al día (10:00 y 16:00) los fines de semana.

El alimento específico para la lubina (A y B) está formulado para cubrir las necesidades nutricionales de la especie. Por lo tanto, contiene un 44 % de proteínas y un 17 % de grasas. Cada uno de los alimentos se fabrica de acuerdo con un proceso claramente definido. Los ingredientes sólidos que constituyen el alimento se trituran en un molino de martillos (Hosokawa Micron, SH1, Holanda) para obtener una molienda inferior a 200 pm. Los polvos obtenidos se mezclan con la composición descrita en la invención (en el primer tratamiento) y con los ingredientes líquidos, tales como los aceites, en un mezclador de paletas (Mainca RM90, España). A continuación, la mezcla se humedece con un 25 % de agua. A continuación, el alimento se produce mediante el uso de un proceso de extrusión a una temperatura controlada por medio de una extrusora de doble tornillo (Italplast P55, Italia). El tamaño final de los gránulos de alimentación es de 1,5 mm. Después del proceso de extrusión, el alimento se seca en un horno de convección (OP 750-UF, LTE Scientifics, Reino Unido) a 40 °C durante 6 horas.

La composición descrita en la invención se añade al alimento en el tratamiento (B) durante el proceso de extrusión a una dosis del 0,1 %.

Después de 28 días de cría en las condiciones descritas anteriormente, los peces en cada uno de los recipientes se infectan con la cepa PP3 de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Después de anestesiar a los peces después de la inmersión en 2-fenoxietanol a 200 ppm, se inyecta peritonealmente al patógeno con 50 pl de caldo de soja tríptico que contiene 103 UFC/ml de la cepa PP3. Se lleva a cabo una inyección única.

La mortalidad se controla durante 21 días. Los peces muertos se retiran diariamente de cada uno de los recipientes. Durante este período, los peces continúan siendo alimentados con los mismos tratamientos descritos anteriormente.

Los resultados de mortalidad (Figura 1) indican que, 21 días después de la inyección de la cepa patógena de cepa PP3 de Photobacterium damselae subsp. piscicida, la composición descrita en la invención aplicada al 0,1 % del alimento aumenta significativamente la resistencia de los juveniles de lobina europea al patógeno. Por lo tanto, la mortalidad se reduce en un 18,1 % con respecto al tratamiento que no está provisto de ninguna composición. Esta misma mortalidad también se estabiliza 7 días después de la inyección para el tratamiento que contiene la composición.

B- Cría de tilapias

Para la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), los juveniles, con un peso de 12 0,4 g, se distribuyen en recipientes de plástico de 100 l a razón de 30 individuos por recipiente. El agua, que tiene una salinidad del 0 % y una temperatura de 28,4 ± 0,3 °C, se renueva continuamente a razón de 200 l/h.

Se aplican 3 tratamientos: (A) un alimento específico para la tilapia del Nilo que no se suplementa, (B) un alimento específico para la tilapia del Nilo suplementado con la composición aplicada como una medida preventiva al 0,1 % del alimento y (C) un alimento específico para la tilapia del Nilo que se suplementa con un antibiótico (amoxicilina). Cada uno de los tratamientos se divide en 5 repeticiones. Dado que el sistema usa recirculación, la propagación del patógeno entre los recipientes es concebible y, por lo tanto, no permite implementar un tratamiento sin peces infectados.

Durante todo el período del ensayo (28 días sin infección seguidos de la infección, a continuación 21 días de monitoreo después de la infección), los peces se alimentan ad libitum 3 veces al día (09:00, 14:00 y 17:00) durante la semana y dos veces al día (10:00 y 16:00) los fines de semana.

El alimento específico para la tilapia del Nilo (A, B y C) está formulado para cubrir las necesidades nutricionales de la especie. Por lo tanto, contiene un 30 % de proteínas y un 8 % de grasas. Cada uno de los alimentos se fabrica de acuerdo con un proceso claramente definido. Los ingredientes sólidos que constituyen el alimento se trituran en un molino de martillos (Hosokawa Micron, SH1, Holanda) para obtener una molienda inferior a 200 pm. Los polvos obtenidos se mezclan con la composición descrita en la invención (en el segundo tratamiento) y con los ingredientes líquidos, tales como los aceites, en un mezclador de paletas (Mainca RM90, España). A continuación, la mezcla se humedece con un 25 % de agua. A continuación, el alimento se produce mediante el uso de un proceso de extrusión a una temperatura controlada por medio de una extrusora de doble tornillo (Italplast P55, Italia). El tamaño final de los gránulos de alimentación es de 1,5 mm. Después del proceso de extrusión, el alimento se seca en un horno de convección (OP 750-UF, LTE Scientifics, Reino Unido) a 40 °C durante 6 horas.

La composición descrita en la invención se añade al alimento en el tratamiento (B) durante el proceso de extrusión a una dosis del 0,1 %. El antibiótico, por su parte, se añade al alimento en el tratamiento (C) durante el proceso de extrusión a una dosis de 80 mg/kg de peso corporal del pez.

Después de 28 días de cría en las condiciones descritas anteriormente, los peces de cada uno de los recipientes están infectados con Streptococcus agalactiae.

La infección experimental se lleva a cabo por inmersión directa en los recipientes de cría de los peces. Después de desconectar el sistema de recirculación, se añade a cada recipiente de 100 l un volumen fijo de 50 ml de un cultivo de 24 horas de Streptococcus agalactiae a una concentración de 109 UFC/ml. Los peces permanecen en el circuito cerrado durante 1 hora y a continuación se reinicia la recirculación. La infección progresa naturalmente de pez a pez por simple contacto. El objetivo de la prueba de infección es obtener un mínimo del 30 % de mortalidad durante un período de 3 semanas después de la infección. Un sistema de luz ultravioleta entre cada recipiente permite limitar la difusión de las bacterias patógenas y por lo tanto limitar la contaminación cruzada.

La mortalidad se controla durante 21 días. Los peces muertos se retiran diariamente de cada uno de los recipientes. Durante este período, los peces continúan siendo alimentados con los mismos tratamientos descritos anteriormente. Los resultados de mortalidad (Figura 2) indican que, 21 días después de la inyección de la cepa patógena de Streptococcus agalactiae, la composición descrita en la invención aplicada al 0,1 % del alimento aumenta significativamente la resistencia de los juveniles de tilapia del Nilo al patógeno. Los resultados también indican que la reducción de la mortalidad observada con la composición es cercana a la observada con el antibiótico, aunque un poco menor. La mortalidad se reduce de este modo en un 8,7 ± 4 % con respecto al tratamiento que no está provisto de ninguna composición. Para la amoxicilina, esto reduce la mortalidad en un 15,3 ± 7 % en comparación con el tratamiento que no está provisto de ninguna composición.

C- Cría de camarones

Para el camarón blanco (Penaeus vannamei), las poslarvas tomadas en la etapa 5 (PL5) se distribuyen en acuarios de vidrio de 100 l a razón de 1000 individuos por acuario en cada caso. El agua tiene una salinidad del 25 %, una temperatura de 27 ± 1° C y se reemplaza diariamente a razón del 20 % del volumen total.

Se aplican 5 tratamientos: (A) un alimento específico para camarón blanco que no se suplementa y no provoca una infección, (B) un alimento específico para camarón blanco que no se suplementa y no provoca una infección, (C) un alimento específico para camarón blanco que se suplementa con la composición aplicada como medida preventiva al 0,1 % del alimento y provoca una infección, (D) un alimento específico para camarón blanco que se suplementa con la composición aplicada como una medida preventiva al 0,3 % del alimento y provoca una infección, y (E) un alimento específico para camarón blanco que se suplementa con la composición aplicada como una medida preventiva al 0,5 % del alimento y provoca una infección.

Durante todo el período del ensayo (20 días sin infección seguidos de la infección, a continuación 14 días de monitoreo después de la infección), los camarones poslarvales se alimentan 5 veces al día (07:00, 11:00, 15:00, 19:00 y 23:00).

El alimento específico para camarón blanco (A, B, C, D y E) es un alimento comercial adaptado para la poslarva de camarón blanco en forma de gránulos comprimidos de un tamaño entre 100 pm y 400 pm, dependiendo de la edad de la poslarva.

La composición descrita en la invención se añade al alimento en el tratamiento (C) después del proceso de compresión de los gránulos a la dosis del 0,1 %. La composición descrita en la invención se añade al alimento en el tratamiento (D) después del proceso de compresión a la dosis del 0,3 %. La composición descrita en la invención se añade al alimento en el tratamiento (D) después del proceso de compresión a la dosis del 0,5 %. La cantidad de la composición en forma de polvo, equivalente al 0,1 %, 0,3 % o 0,5 % del alimento, se diluye en agua de acuerdo con las respectivas relaciones de polvo:agua de 1:60, 1:20 y 1:12 y a continuación se pulveriza directamente sobre la superficie del alimento mediante el uso de un brazo pulverizador. Si es necesario, los gránulos se recubren a continuación con aceite animal o vegetal para evitar que la composición se salinice una vez en el agua de cría de los camarones.

Después de 20 días de cría en las condiciones descritas anteriormente, los camarones en cada uno de los recipientes, a excepción de los recipientes que reciben el tratamiento (A), se infectan con Vibrio parahaemolyticus, una bacteria responsable de la necrosis hepatopancreática aguda en los camarones.

La infección experimental se lleva a cabo por inmersión directamente en los recipientes de cría de los camarones. A cada recipiente de 100 l se le añade una solución bacteriana de Vibrio parahaemolyticus a una concentración de 106 UFC/ml. La infección progresa de forma natural de poslarva a poslarva por simple contacto.

La mortalidad se controla durante 14 días. Los camarones muertos se retiran diariamente de cada uno de los recipientes. Durante este período, los camarones continúan siendo alimentados con los mismos tratamientos descritos anteriormente.

Los resultados de mortalidad (Figura 3) indican que, 14 días después de la inyección de la cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus, la composición descrita en la invención aplicada al 0,1 %, 0,3 % o 0,5 % del alimento aumenta significativamente la resistencia de las poslarvas de camarón al patógeno. La mortalidad se reduce de este modo en un 42 %, 54 % y 57 %, respectivamente, en comparación con el tratamiento infectado que no está provisto de ninguna composición. Los resultados de mortalidad en función de la dosis también muestran una respuesta cuadrática, lo que indica que aunque el 0,1 % es una dosis eficaz, el 0,5 % no es mejor que el 0,3 %, por lo que esta última dosis se considera óptima en camarones. Para los camarones no infectados, tienen una mortalidad baja de menos del 10 %, lo que se considera natural en estas condiciones de cría.

Ejemplo 6 - Estudio fisiológico

La composición descrita en la invención se aplica como un método para la prevención de enfermedades bacterianas en la cría acuícola. La profilaxis del producto se debe a la activación de los parámetros antimicrobianos en la sangre de los peces antes de la infección patógena, lo que permite que los peces aumenten su resistencia en el momento en que el patógeno aparece en el entorno sin afectar realmente su hemograma básico.

Después de 28 días de prueba, en los que los juveniles de lubina son alimentados bien con (A) un alimento específico para lubinas que no se suplementa o bien (B) un alimento específico para lubinas suplementado con la composición aplicada como una medida preventiva en el 0,1 % del alimento, se seleccionan 4 peces por recipiente y a continuación se anestesian en 1000 ppm de 2-fenoxietanol. A continuación, se toman muestras de sangre. Se homogeneizan dos alícuotas de sangre fresca para medir la actividad antimicrobiana presente en el compartimiento de la sangre, a saber, actividad de lisozima, explosión respiratoria, actividad antimicrobiana y parámetros hematológicos. Se centrifugan otras dos alícuotas a 8000 g durante 10 minutos a 4 °C para obtener el plasma. Inmediatamente después de recolectar la sangre, se tomaron frotis, se secaron y a continuación se colorearon con una tinción de Wright (Hematocolor, Merck) y a continuación se fijaron con formol-etanol (formaldehído al 10 %: etanol absoluto al 37 %).

El perfil sanguíneo tiene los siguientes parámetros: el hematocrito, que corresponde al volumen ocupado por los glóbulos rojos en un volumen total de sangre, expresado en %. El método implica llenar un tubo capilar con sangre, a continuación sellar uno de los extremos del tubo con pequeños trozos de plastilina y a continuación centrifugar el tubo durante 10 minutos a 8000 g. Después de esto, puede calcularse el porcentaje relativo de glóbulos rojos (RBC). La hemoglobina (Hb) se mide mediante un método colorimétrico. A partir de estos dos parámetros (RBC y Hb), se calculan varios otros parámetros. El volumen corpuscular medio (MCV) corresponde a la fórmula de (hematocrito (%) / RBC (106 |jl)) x 10 y la hemoglobina corpuscular media (MCH) corresponde a la fórmula de (hemoglobina (g dl) / RBC (106 jl)) x 10.

Los glóbulos blancos contenidos en la sangre se cuentan por dilución a 1/20 de sangre homogeneizada en solución salina de Hank que contiene heparina (30 unidades/ml). Los glóbulos rojos contenidos en la sangre se cuentan, por su parte, después de la dilución de 1/200 en solución salina de Hank que contiene heparina (30 unidades/ml). A continuación se lleva a cabo el recuento en una cámara de Neubauer. Las concentraciones de glóbulos rojos y blancos se expresan en 104 células/jl y 106 células/jl, respectivamente.

Entre los mecanismos de defensa inmunitaria del huésped se observa la fagocitosis, que es acompañada de una liberación brusca de moléculas reactivas de oxígeno, lo que comúnmente se denomina explosión respiratoria. Se mide sobre los leucocitos en la sangre de los peces tomados al final de los 28 días del ensayo. Se diluyen 4 j l de sangre fresca en 96 j l de solución salina de Hank que contiene heparina (30 unidades/ml) y se colocan en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos con 100 j l de suspensión de luminol (2 mM de luminol en 0,2 M de tampón de borato a pH 9,0, con 2 pg/ml de forbol miristato acetato, Sigma) durante 2 horas a 25 °C. Cada muestra se compara con un blanco, al que no se ha añadido ninguna muestra de sangre. La quimioluminiscencia producida por el luminol se mide cada 3 minutos mediante un lector de luminiscencia (Synergy HT, Biotek) para generar curvas cinéticas. Cada muestra se mide en 3 repeticiones y la luminiscencia relativa se expresa en unidades relativas de luz (RLU).

La lisozima es una molécula implicada en los mecanismos de defensa del huésped. Se mide mediante el uso de un ensayo turbidimétrico. Se prepara una solución de Micrococcus lysodeikticus (0,5 mg/ml en una solución tampón de fosfato 0,05 M a pH 6,2) en una microplaca. Se mezclan 15 j l de plasma y 250 j l de la solución descrita anteriormente para dar un volumen final de 265 jl. La reacción de lisis bacteriana se lleva a cabo a 25 °C, a una absorbancia de 450 nm. Se lee a los 0,5 y 4,5 minutos en un lector de microplacas de Synergy HT Una solución de lisozima de clara de huevo liofilizada (Sigma) se diluye en tampón fosfato 0,05 M a pH 6,2 para establecer una curva estándar. La tasa de lisozima de las muestras de sangre se encuentra después de usar la fórmula extraída de la curva estándar.

La actividad bactericida contenida en la sangre de los peces se mide mediante el uso de la cepa PP3 de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Las bacterias se cultivan durante 48 horas a 25 °C en agar de soja tríptico (TSA; Difco Laboratoires) y a continuación se inoculan en caldo de soja tríptico (TSB; Difco Laboratoires), donde cada uno de los dos medios se suplementa con NaCl a una concentración final del 1 % (p/v). Las bacterias inoculadas en el caldo se cultivan a continuación durante 24 horas a 25 °C bajo agitación constante a 100 tpm. Las bacterias en fase de crecimiento exponencial se cosechan por centrifugación a 3500 g durante 30 minutos y a continuación se resuspenden en solución salina de Hank que contiene heparina (30 unidades/ml). Su concentración se ajusta a 106 UFC/ml. Se añaden 20 j l de plasma a los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. La solución salina de Hank que contiene heparina (30 unidades/ml) se usa como control. Se añaden 20 j l de la cepa PP3 a 106 UFC/ml a cada pocillo y a continuación se incuba a 25 °C durante 2,5 horas. Se añaden 25 j l de bromuro de 3-(4,5 dimetil-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (1 mg/ml, Sigma) a cada pocillo y a continuación se incuba a 25 °C durante 10 minutos para permitir que se forme formazán. A continuación, las microplacas se centrifugan a 2000 g durante 10 minutos y el precipitado se disuelve en 200 j l de dimetilsulfóxido (Sigma). La absorbancia del formazán disuelto se mide a 560 nm. La actividad bactericida se expresa en %, a partir de la diferencia entre las bacterias supervivientes y el número de bacterias del control.

Después de 28 días de alimentación, la mayoría de los parámetros sanguíneos (ver Tabla 4) relacionados con los glóbulos rojos y la hemoglobina permanecen sin cambios, independientemente del régimen de alimentación (A o B). La composición descrita en la invención aplicada al 0,1 % de alimento no modifica significativamente los parámetros fisiológicos básicos. Por el contrario, la composición aumenta los glóbulos blancos inducidos en la inmunidad, aunque este aumento no es estadísticamente significativo. Al mismo tiempo, la explosión respiratoria, la lisozima y la actividad antimicrobiana de los glóbulos blancos son activados significativamente por la composición y los aumentos porcentuales de los mismos en comparación con el control son del 39 %, 25 % y 8 %, respectivamente. Esta amplia activación de la maquinaria inmunitaria innata fortalece a los peces cuando surgen presiones patógenas y permite comprender los mecanismos implicados en la aplicación de la composición.

Tabla 4. La Tabla 4 muestra los parámetros sanguíneos y los parámetros antimicrobianos observados en juveniles de lobina Dicentrarchus labrax, 28 días después de la alimentación y antes de la infección con la cepa PP3 de Photobacterium damselae subsp. piscicida, dependiendo de si los peces no se suplementan (A) con la composición descrita en la invención o si se aplica dicha composición al 0,1 % (B).

Ejemplo 6 - Prueba del efecto curativo

En segundo lugar, la composición descrita en la invención se aplica como un método para el tratamiento de enfermedades bacterianas en la cría acuícola.

Está probado en condiciones de cría naturales para tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) infectada con Streptococcus spp, que es responsable de la estreptococosis.

Los juveniles de tilapia del Nilo de tamaño uniforme y sin ningún signo de enfermedad o deformidad se aclimatan durante 4 semanas con un alimento comercial de 1,5 mm hasta que alcanzan un peso inicial de 10 g por pez en preparación para la prueba comercial. A continuación, estos juveniles se distribuyen homogéneamente, en función de su peso, entre 12 jaulas de 12 m3 (2,5 x 25 x 2,0 m).

Tras la aparición de una enfermedad bacteriana ligada a Streptococcus spp, la composición descrita en la invención se aplica de acuerdo con dos regímenes de dosificación: 8 días o 14 días.

Se aplican 3 tratamientos: (A) un alimento comercial específico para la tilapia del Nilo que no se suplementa, (B) un alimento comercial específico para la tilapia del Nilo suplementado con la composición aplicada como una medida curativa al 0,4 % del alimento durante 8 días después del surgimiento de la enfermedad, y (C) un alimento comercial específico para la tilapia del Nilo que se suplementa con la composición aplicada como una medida curativa al 0,4 % de alimento durante 14 días después del surgimiento de la enfermedad. Cada tratamiento se aplica a 4 jaulas por tratamiento. Cada jaula contiene 300 peces.

De 10 a 200 g de peso corporal, los peces se alimentan adlibitum 3 veces al día (08:00, 12:00 y 17:00). De 200 a 600 g de peso corporal, los peces se alimentan ad libitum dos veces al día (08:00 y 17:00).

El alimento específico para la tilapia del Nilo (A, B y C) es un alimento para acuicultura como se define anteriormente en el ejemplo 1 y está formulado para satisfacer las necesidades nutricionales de la especie durante todo el ciclo de cría.

Una vez reportada una enfermedad, la composición descrita en la invención se añade como medida curativa al alimento de los tratamientos (B y C) directamente a los gránulos extrudidos y a una dosis del 0,4 %. La cantidad de la composición en forma de polvo, equivalente al 0,4 % del alimento, se diluye en agua en una relación de polvo:agua del 1:15, y a continuación se pulveriza directamente sobre la superficie del alimento mediante el uso de una barra pulverizadora. Si es necesario, los gránulos se recubren a continuación con aceite animal o vegetal para evitar que la composición se salinice una vez en el agua de cría de los peces.

Tras el episodio infeccioso relacionado con Streptococcus spp y la aplicación de la composición con dos regímenes de dosificación diferentes, los resultados de mortalidad indican que la aplicación al 0,4 % durante 8 días (B) provoca una reducción de la mortalidad del 20 % en comparación con el control sin composición (A). La reducción de la mortalidad es del 40 % para el tratamiento proporcionado con la composición al 0,4 % durante 14 días (C). También se observa una mejora del crecimiento después de la enfermedad en términos de ganancia de peso e índice de conversión dependiendo de si la composición se aplica durante 8 días (B) o 14 días (C). La biomasa final de los tratamientos B y C se incrementa de este modo en un 55,2 % y un 117 % respectivamente en comparación con A; el índice de conversión de los tratamientos B y C se optimiza en un 32,5 % y un 47,5 % respectivamente en comparación con A.

Los resultados (Tabla 3 a continuación) confirman que la composición descrita en la invención tiene un efecto curativo después de un mínimo de 8 días de aplicación, pero que la eficacia contra el patógeno es óptima después de 14 días de aplicación.

Tabla 3. La Tabla 3 muestra la mortalidad y los parámetros de crecimiento (biomasa final, kg e índice de conversión) observados en los juveniles de tilapia del Nilo Oreochromis niloticus después de la infección con Streptococcus spp, dependiendo de si los peces no se suplementan (A) con la composición descrita en la invención o si dicha composición se aplica al 0,4 % durante 8 días (B) o 14 días (C) después del surgimiento de la enfermedad.

Ejemplo 7 - Ensayos in vitro

La actividad antimicrobiana de la composición que constituye la invención se analiza midiendo concentraciones inhibitorias mínimas expresadas en partes por millón (ppm) en relación con 10 patógenos acuáticos bacterianos. Las bacterias de agua blanda están constituidas por Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda y Yersinia ruckeri, mientras que las bacterias de agua de mar o salobre están constituidas por Aeromonas salmonicida salmonicida, Photobacterium damsela damsela, Streptococcus iniae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum discolor, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus y Vibrio anguillarum.

La composición (A), constituida por el conjunto de 8 ingredientes descritos en la invención así como también 4 productos naturales reconocidos por su potencial antimicrobiano: (B) citral, que es un constituyente mayoritario del aceite de citronela y aceites de otras plantas del género Cymbopogon, (C) eugenol, un componente principal del clavo, (D) carvacrol, un componente principal del aceite de tomillo y aceite de orégano, y (E) alicina pura, un compuesto organosulfurado abundante en las especies de la familia Alliaceae y que tiene una composiciónCH2=CHCH2-SOS-CH2CH=CH2 reconocida como la sustancia activa que es más comparable a los compuestos activos descritos en la composición (A), se ponen en solución en agua destilada y se diluyen sucesivamente en agua destilada directamente en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. Se añaden 100 pl de cultivo bacteriano diana en una dosis de 106 unidades formadoras de colonias / ml (UFC/ml) a cada pocillo en la microplaca en el punto de incubación. A continuación, la microplaca se incuba durante 24 horas a 25 °C. A continuación, se calculan las concentraciones inhibitorias mínimas observando los pocillos que muestran y no muestran crecimiento bacteriano en función de la dosis de la composición o producto asociado. Cuanto menor sea la concentración inhibitoria mínima, más eficaz será el producto, ya que se requiere menos producto para inducir la inhibición del patógeno.

Después de 24 horas de incubación, los resultados (tabla a continuación) indican que la composición de 8 ingredientes descritos en la invención tiene las concentraciones inhibitorias mínimas más bajas, dependiendo de la cepa patógena, de entre 16 y 125 ppm, en comparación con 64 y 1000 ppm para el producto B, en comparación con 64 y 2000 ppm para el producto C, en comparación con 32 y 250 ppm para el producto D, y en comparación con al menos 4000 ppm para el producto E. Estos valores indican que la eficacia antimicrobiana difiere dependiendo de los productos analizados y que la eficacia antimicrobiana de la composición descrita en la invención es la mejor cuando se compara con los otros productos antibacterianos. Además, cuando se compara con un producto similar, tal como alicina, la eficacia antimicrobiana de los compuestos activos descritos en la invención es significativamente superior.

La siguiente tabla muestra las concentraciones inhibitorias mínimas (expresadas en ppm) en relación con 10 cepas patógenas de la composición descrita en la invención en comparación con 4 productos reconocidos como antibacterianos. (A) Composición constituida por el conjunto de 8 ingredientes descritos en la invención, (B) citral, (C) eugenol, (D) carvacrol y (E) alicina pura.

La invención no se limita a las modalidades expuestas aquí, y otras modalidades serán claras para un experto en la técnica.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que contiene al menos un compuesto de la siguiente fórmula I

R-SOa-S-R' (I),

donde a es igual a 1 o 2 y R y R' son, independientemente entre sí, un grupo alquilo C¹-C⁵ lineal o ramificado, para uso diario o uso más regular, durante al menos ocho días, en la prevención de infecciones bacterianas en animales acuáticos criados en estructuras acuícolas,

donde dicho al menos un compuesto mencionado anteriormente es el 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha composición contiene al menos dos, en particular dos, compuestos de la fórmula I separada, donde dichos al menos dos compuestos son el 0,003 % en peso basado en el peso total de la composición.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha composición contiene una mezcla de los siguientes compuestos,

CH³-CH²-CH²-SO-S-CH²-CH²-CH³ y CH³-CH²-CH²-SO²-S-CH²-CH²-CH³,

donde dicha mezcla es el 0,003 % en peso de dicha composición.

4. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichos animales en estanques acuícolas son peces o crustáceos decápodos.

5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dichos al menos dos compuestos están en proporciones relativas en peso que varían de 60/40 a 40/60.

6. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende al menos un compuesto y un soporte mineral, donde dicho al menos un compuesto constituye el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dicho al menos un compuesto y dicho al menos un soporte mineral.

7. Una composición que contiene los siguientes compuestos

CH³-CH²-CH²-SO-S-CH²-CH²-CH³ y CH³-CH^2-CH²-SO²-S-CH²-CH²-CH³,

para uso diario o uso más regular, durante al menos ocho días, en el tratamiento de infecciones bacterianas en animales acuáticos criados en estructuras acuícolas,

donde dichos compuestos mencionados anteriormente son el 0,009 % en peso basado en el peso total de la composición.

8. Un producto alimenticio que contiene al menos un nutriente, y

- la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o

- la composición de acuerdo con la reivindicación 7, para su uso de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una composición que contiene:

- los compuestos de la fórmula:

CH³-CH²-CH²-SO-S-CH²-CH²-CH³ y CH³-CH²-CH²-SO²-S-CH²-CH²-CH³,

y

- al menos un soporte mineral,

donde dichos compuestos constituyen el 15 % en peso basado en el peso de la mezcla de dichos compuestos y dicho al menos un soporte mineral.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, que contiene:

a. 20 % en peso de la mezcla de dichos compuestos y dicho al menos un soporte mineral,

b. del 40 al 61 % en peso basado en el peso total de la composición de compuestos que permiten la estabilidad e hidrodispersión de la composición, y

c. del 19 al 40 % en peso de compuestos inmunoestimulantes.