ES2922533T3 - Un derivado de oxopiridina sustituido - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al 5-({6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2/7)-il]-3-metilhcxanoil}amino)pirazol[1,5-c/]piridinca-3-carboxamida, a procesos para su preparación, a su uso para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades y a su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades, en particular trastornos cardiovasculares, preferiblemente trastornos trombóticos o tromboembólicos, y edemas, y también trastornos oftálmicos, y su uso para inhibir la actividad perturbadora de la calicreína plasmática para la realización de procedimientos extracorpóreos y ensayos analíticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un derivado de oxopiridina sustituido

La invención se refiere a 5-({6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoil}amino)pirazol[1,5-a]piridin-3-carboxamida, a los procesos para su preparación, a su uso para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, y a su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, en particular, trastornos cardiovasculares, preferentemente trastornos trombóticos o tromboembólicos, y edemas , y también trastornos oftálmicos, y a su uso para inhibir la actividad perturbadora de la calicreína plasmática para la realización de procedimientos extracorpóreos y pruebas analíticas.

La coagulación sanguínea es un mecanismo de protección del organismo que ayuda a “sellar” los defectos en la pared de los vasos sanguíneos de forma rápida y fiable. Por tanto, la pérdida de sangre se puede evitar o reducir al mínimo. La hemostasia después de la lesión de los vasos sanguíneos se efectúa principalmente por el sistema de coagulación en el que se desencadena una cascada enzimática de reacciones complejas de las proteínas plasmáticas. Numerosos factores de coagulación sanguínea están involucrados en este proceso, cada uno de los cuales convierte, al activarse, el siguiente precursor inactivo respectivamente en su forma activa. Al final de la cascada, llega la conversión de fibrinógeno soluble en fibrina insoluble, lo que resulta en la formación de un coágulo de sangre.

Es relevante que el sistema de coagulación se pueda activar particularmente en superficies cargadas negativamente, que incluyen no solo estructuras superficiales de células extrañas (por ejemplo, bacterias), sino también superficies artificiales como prótesis vasculares, stents y circulación extracorpórea. En la superficie, inicialmente el factor XII (FXII) se activa al factor XIIa que posteriormente activa el factor XI al factor Xla. Además, el factor XIIa también activa la precalicreína plasmática (PCP) a calicreína plasmática (CP) que, en un bucle de potenciación, conduce en primer lugar a una activación adicional del factor XII, lo que en general da como resultado la amplificación del inicio de la cascada de coagulación. Además, la CP es una proteasa liberadora de bradicinina, lo que, entre otras cosas, conduce a un aumento de la permeabilidad endotelial. Otros sustratos que se han descrito son la prorrenina y la prourocinasa, cuya activación puede influir en los procesos reguladores del sistema renina-angiotensina y la fibrinólisis. La activación de la CP es, por tanto, un vínculo importante entre los procesos de coagulación, y los procesos inflamatorios.

La activación incontrolada del sistema de coagulación o la inhibición defectuosa de los procesos de activación, pueden conducir a la formación de trombosis o embolias locales en vasos (arterias, venas, vasos linfáticos) o cavidades cardíacas. Además, la hipercoagulabilidad sistémica puede conducir a la formación de trombos en todo el sistema y, finalmente, a la coagulopatía por consumo en el contexto de una coagulación intravascular diseminada. Las complicaciones tromboembólicas también pueden ocurrir en sistemas circulatorios extracorpóreos, como durante la hemodiálisis, y también en prótesis vasculares o válvulas cardíacas protésicas, y stents.

La calicreína plasmática (CP) se asocia a otros trastornos, que se asocian a un aumento de la permeabilidad vascular o trastornos inflamatorios crónicos como es el caso de la retinopatía diabética, el edema macular y el angioedema hereditario, o los trastornos intestinales inflamatorios crónicos. La retinopatía diabética es causada principalmente por una deficiencia microvascular, que conduce a un engrosamiento de la membrana basal de los vasos y a la pérdida de pericitos vascularizados seguido de oclusión vascular e isquemia retiniana que, debido a la hipoxia retiniana así causada, puede conducir a una mayoritario permeabilidad de los vasos con la formación subsiguiente de un edema macular y, debido a todos los procesos presentes, el paciente queda ciego. En el angioedema hereditario (AEH), la formación reducida del inhibidor fisiológico de la calicreína Cl-esterasa causa una activación descontrolada de la calicreína plasmática que conduce a inflamaciones con formación de edema fulminante y dolores fuertes. A partir de modelos animales experimentales, existen indicaciones de que la inhibición de la calicreína plasmática inhibe el aumento de la permeabilidad vascular y, por lo tanto, puede prevenir la formación de un edema macular, o retinopatía diabética, o puede mejorar los síntomas agudos del AEH. Los inhibidores de la calicreína plasmática oral también podrían utilizarse para la profilaxis del AEH.

Las cininas generadas por medio de la calicreína plasmática tienen especialmente un papel causal en la progresión de los trastornos intestinales inflamatorios crónicos (EIC). Su efecto proinflamatorio a través de la activación de los receptores de bradicinina induce y potencia la progresión de la enfermedad. Los estudios en pacientes con enfermedad de Crohn muestran una correlación entre la concentración de calicreína en el epitelio intestinal y el grado de inflamación intestinal. La activación del sistema calicreína-cinina también se observó en estudios experimentales con animales. Por consiguiente, la inhibición de la síntesis de bradicinina por inhibidores de calicreína podría usarse también para la profilaxis, o terapia de trastornos intestinales inflamatorios crónicos.

Para muchos trastornos, la combinación de principios antitrombóticos y antiinflamatorios también puede ser particularmente atractiva para prevenir la mejora mutua de la coagulación y la inflamación.

El documento WO 2006/030032 describe, entre otras cosas, las piridinonas sustituidas como moduladores alostéricos del receptor mGluR2, y el documento WO 2008/079787 describe piridin-2-onas sustituidas y su uso como activadores de glucocinasa. Los documentos WO2005/123680, WO 2014/154794, WO 2014/160592, WO 2015/011087, WO 2015/063093, WO 2015/120777, WO 2016/046156, WO 2016/046157, WO 2016/046158, WO 2016/046159, WO 2016/046164, WO 2016/046166, WO 2016/146606, WO 2017/005725, WO 2017/037051 y WO 2018/041122 describen la piridin-2-ona sustituida, y su uso como inhibidor del factor Xla, o inhibidores de calicreína.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo compuesto para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, en particular de trastornos trombóticos o tromboembólicos, en seres humanos y animales, y para el uso en precalicreína plasmática (PCP) o calicreína plasmática (CP), que contienen muestras biológicas para evitar los efectos perturbadores causados por el recambio de sustratos fisiológicos y artificiales por parte de la CP.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que cierto derivado de oxopiridina sustituida representa un inhibidor de la calicreína plasmática altamente potente y selectivo.

La invención proporciona el compuesto 5-({6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoil}amino)pirazol[1,5-a]piridin-3-carboxamida, que corresponde al compuesto de fórmula (I):

y las sales del mismo, los solvatos del mismo y los solvatos de las sales del mismo.

Además, la invención proporciona el compuesto trifluoroacetato de 5-({6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoil}amino)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamida, que corresponde al compuesto de fórmula (Ia):

Se da preferencia al compuesto 5-({(2S)-6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoil}amino)pirazol[1,5-a]piridin-3-carboxamida, que corresponde al compuesto de fórmula (Ib):

y las sales del mismo, los solvatos del mismo y los solvatos de las sales del mismo.

Además, se da preferencia al compuesto trifluoroacetato de 5-({(2S)-6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoil}amino)pirazol[1,5-a]piridin-3-carboxamida, que corresponde al compuesto de fórmula (Ic):

Los compuestos de la invención pueden, dependiendo de su estructura, existir en diferentes formas estereoisoméricas, es decir, en forma de isómeros configuracionales o también, si es apropiado, como isómeros conformacionales (enantiómeros, o diastereómeros, incluidos los atropisómeros). Por tanto, la presente invención engloba los enantiómeros y diastereómeros, y sus respectivas mezclas. Los constituyentes estereoisoméricamente uniformes pueden aislarse de tales mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros de una manera conocida; para ello, se utilizan preferentemente procesos de cromatografía, especialmente cromatografía HPLC en fase quiral o aquiral.

Si los compuestos de acuerdo con la invención, pueden presentarse en formas tautoméricas, la presente invención abarca todas las formas tautoméricas.

En el contexto de la presente invención, la expresión “enantioméricamente puro” debe entenderse que significa que el compuesto en cuestión con respecto a la configuración absoluta del centro quiral, está presente en un exceso enantiomérico de más del 95 %, preferentemente, más del 97 %. El exceso enantiomérico, ee, se calcula, en el presente documento, evaluando el cromatograma de HPLC correspondiente en una fase quiral, utilizando la siguiente fórmula:

Ee = [EA (% de área) - EB (% de área)] x 100 %/[EA (% de área) EB (% de área)]

(EA: enantiómero mayoritario; EB: enantiómero minoritario)

La presente invención también abarca todas las variantes isotópicas adecuadas de los compuestos de la invención. Se entiende, en el presente documento, por variante isotópica de un compuesto de la invención, un compuesto en el que al menos un átomo de dentro del compuesto de la invención ha sido intercambiado por otro átomo del mismo número atómico, pero con una masa atómica diferente a la masa atómica que se da normal o predominantemente en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse a un compuesto de la invención son los de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor, cloro, bromo y yodo, tales como 2H (deuterio), 3H (tritio), 13C, 14C, 15N, 17O, 18O y 36Cl. Las variantes isotópicas particulares de un compuesto de la invención, especialmente aquellas en las que se han incorporado uno o más isótopos radiactivos, pueden ser beneficiosas, por ejemplo, para el examen del mecanismo de acción o de la distribución del principio activo en el organismo; debido a la comparativamente fácil preparación y detectabilidad, especialmente los compuestos marcados con los isótopos 3H o 14C son adecuados para este fin. Además, la incorporación de isótopos, por ejemplo, de deuterio, puede conducir a beneficios terapéuticos particulares como consecuencia de una mayoritario estabilidad metabólica del compuesto, por ejemplo, una extensión de la semivida en el organismo o una reducción de la dosis activa requerida; tales modificaciones de los compuestos de la invención pueden, por tanto, en algunos casos, también constituir una realización preferida de la presente invención. Las variantes isotópicas de los compuestos de la invención se pueden preparar mediante los procesos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante los métodos descritos más adelante, y los procedimientos descritos en los ejemplos de trabajo, utilizando las correspondientes modificaciones isotópicas de los respectivos reactivos y/o compuestos de partida.

Las sales preferidas en el contexto de la presente invención son sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de acuerdo con la invención. Sin embargo, la invención también engloba sales que por sí mismas no son adecuadas para aplicaciones farmacéuticas, pero que pueden usarse, por ejemplo, para el aislamiento o la purificación de los compuestos de acuerdo con la invención.

Las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de acuerdo con la invención incluyen sales de adición de ácidos minerales, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico y ácido benzoico.

En el contexto de la invención, se denominan solvatos aquellas formas de los compuestos de acuerdo con la invención que forman un complejo en estado sólido o líquido por coordinación con moléculas de disolvente. Los hidratos son una forma específica de solvatos en los que la coordinación se da con el agua.

Un aspecto de la divulgación engloba profármacos de los compuestos de la invención. El término "profármacos" engloba compuestos que, por su parte, pueden ser biológicamente activos o inactivos, pero que durante su tiempo de permanencia en el organismo, se convierten en compuestos de acuerdo con la invención (por ejemplo, mediante metabolismo o hidrólisis).

En el contexto de la presente invención, el término “tratamiento” o “tratar” incluye inhibición, retardo, control, alivio, atenuación, restricción, reducción, supresión, repelencia o curación de una enfermedad, afección, trastorno, lesión o un de prueba de salud, o el desarrollo, el curso o la progresión de dichos estados y/o los síntomas de tales estados. El término “terapia” se utiliza en el presente documento como sinónimo del término “tratamiento”.

Los términos “prevención”, “profilaxis” y “evitación” se utilizan como sinónimos en el contexto de la presente invención, y se refieren a evitar o reducir el riesgo de contraer, experimentar, padecer o tener una enfermedad, una afección, un trastorno, una lesión, o un de prueba de salud, o un desarrollo o avance de dichos estados y/o los síntomas de dichos estados.

El tratamiento o la prevención de una enfermedad, afección, trastorno, lesión o de prueba de salud puede ser parcial o completo.

La invención proporciona además un proceso para preparar los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ib) y (Ic), o las sales de los mismos, los solvatos de los mismos o los solvatos de las sales de los mismos. Los compuestos se pueden sintetizar como se ilustra en el esquema sintético 1:

Esquema 1

Los compuestos de acuerdo con la invención tienen un espectro de actividad farmacológica útil imprevisible. Son compuestos que influyen en la actividad proteolítica de la calicreína plasmática (CP) de serina proteasa. Los compuestos de acuerdo con la invención inhiben la escisión enzimática de sustratos, catalizados por parte de la CP, que tienen papeles esenciales en la activación de la coagulación sanguínea, en la agregación de plaquetas sanguíneas y en procesos inflamatorios, que implican particularmente un aumento de la permeabilidad vascular.

Por tanto, son adecuados para su uso como medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades en seres humanos y animales.

La presente invención proporciona además el uso de los compuestos de acuerdo con la invención para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos, en particular, trastornos cardiovasculares, preferentemente trastornos trombóticos o tromboembólicos y/o complicaciones trombóticas o tromboembólicas, y/o trastornos oftálmicos, en particular, retinopatía diabética o edema macular, y/o trastornos inflamatorios, en particular, los asociados con un exceso de actividad de la calicreína plasmática, tales como angioedema hereditario (AEH) o trastornos inflamatorios crónicos, particularmente del intestino tales como la enfermedad de Crohn.

El factor XIIa activa la precalicreína plasmática (PCP) a calicreína plasmática (CP) en el contexto de la activación intrínseca que, entre otras cosas, en un bucle de potenciación, conduce a una activación adicional del factor XII, que en general da como resultado la amplificación del inicio de la cascada de coagulación en superficies. Una actividad inhibidora de CP de un compuesto de acuerdo con la invención reduce así la coagulación a través de la activación superficial y, por tanto, tiene un efecto anticoagulante.

Por consiguiente, los compuestos de acuerdo con invención son adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos o complicaciones que pueden surgir de la formación de coágulos.

En el sentido de la presente invención, los “trastornos trombóticos o tromboembólicos” incluyen trastornos que ocurren tanto en la vasculatura arterial como en la venosa, y que pueden tratarse con los compuestos de acuerdo con la invención, en particular, trastornos en las arterias coronarias del corazón, tales como síndrome coronario agudo (SCA), infarto de miocardio con elevación del segmento ST (STEMI) y sin elevación del segmento ST (no STEMI), angina de pecho estable, angina de pecho inestable, reoclusiones y reestenosis después de intervenciones coronarias, tales como angioplastia, implantación de stent o derivación aortocoronaria, pero también trastornos trombóticos o tromboembólicos en otros vasos que conducen a trastornos oclusivos arteriales periféricos, embolias pulmonares, tromboembolias venosas, trombosis venosas, en particular, en venas profundas de piernas y venas renales, ataques isquémicos transitorios y también accidente cerebrovascular trombótico y accidente cerebrovascular tromboembólico. La estimulación del sistema de coagulación puede ocurrir por diversas causas o trastornos asociados. En el contexto de intervenciones quirúrgicas, inmovilidad, confinamiento en cama, infecciones, inflamación, o cáncer, o tratamiento del cáncer, entre otras, el sistema de coagulación puede estar altamente activado y puede haber complicaciones trombóticas, en particular, trombosis venosas. Por lo tanto, los compuestos de acuerdo con la invención son adecuados para la profilaxis de trombosis en el contexto de intervenciones quirúrgicas en pacientes que padecen cáncer. Por tanto, los compuestos de acuerdo con la invención también son adecuados para la profilaxis de trombosis en pacientes que tienen un sistema de coagulación activado, por ejemplo, en las situaciones de estimulación descritas.

Por lo tanto, los compuestos de la invención también son adecuados para la prevención y el tratamiento de tromboembolias cardiogénicas, por ejemplo, isquemias cerebrales, accidentes cerebrovasculares y tromboembolias e isquemias sistémicas, en pacientes con arritmias cardíacas agudas, intermitentes o persistentes, por ejemplo, fibrilación auricular, y en pacientes sometidos a cardioversión, y también en pacientes con trastornos de las válvulas cardíacas o con válvulas cardíacas artificiales.

Adicionalmente, los compuestos de la invención son adecuados para el tratamiento y la prevención de la coagulación intravascular diseminada (CID) que puede ocurrir en relación con la sepsis, entre otras cosas, pero también debido a intervenciones quirúrgicas, trastornos neoplásicos, quemaduras u otras lesiones, que puede provocar daños graves en los órganos a través de microtrombosis.

Además, las complicaciones tromboembólicas ocurren en anemias hemolíticas microangiopáticas, y cuando la sangre entra en contacto con superficies extrañas en el contexto de la circulación extracorpórea, tales como, por ejemplo, hemodiálisis, ECMO (“oxigenación por membrana extracorpórea”), DAVI (“dispositivo de asistencia ventricular izquierda”) y métodos similares, fístulas AV, prótesis valvulares vasculares y cardíacas.

Por otra parte, los compuestos de acuerdo con la invención son adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos que implican la formación de microcoágulos o depósitos de fibrina en vasos sanguíneos cerebrales que pueden conducir a trastornos demenciales tales como demencia vascular o enfermedad de Alzheimer. En el presente documento, el coágulo puede contribuir en el trastorno tanto a través de oclusiones, como al unirse a otros factores relevantes para la enfermedad.

Asimismo, los compuestos de acuerdo con la invención son particularmente adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos en los que, además del componente procoagulante, el componente proinflamatorio también desempeña un papel esencial. La mejora mutua de la coagulación y la inflamación en particular puede evitarse mediante los compuestos de acuerdo con la invención, reduciendo así decisivamente la probabilidad de complicaciones trombóticas. En este caso, tanto el componente inhibidor del factor XIa (mediante la inhibición de la producción de trombina) como el componente inhibidor de CP pueden contribuir al efecto anticoagulante y antiinflamatorio (por ejemplo, a través de la bradicinina). Por lo tanto, el tratamiento y/o la profilaxis en el contexto de trastornos vasculares ateroscleróticos, inflamaciones en el contexto de trastornos reumáticos del aparato locomotor, trastornos inflamatorios del pulmón, tal como fibrosis pulmonar, trastornos inflamatorios del riñón, tales como glomerulonefritis, trastornos inflamatorios del intestino, tales como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa, o los trastornos que pueden estar presentes en el contexto de una enfermedad diabética subyacente, tales como la retinopatía o nefropatía diabética, pueden considerarse, entre otros.

Las cininas generadas por medio de calicreína plasmática, entre otras cosas, tienen un papel causal en la progresión de los trastornos intestinales inflamatorios (TII) crónicos. Su efecto proinflamatorio a través de la activación de los receptores de bradicinina induce y potencia la progresión de la enfermedad. Los estudios en pacientes con enfermedad de Crohn muestran una correlación entre la concentración de calicreína en el epitelio intestinal y el grado de inflamación intestinal. La activación del sistema calicreína-cinina también se observó en estudios experimentales con animales. Por consiguiente, la inhibición de la síntesis de bradicinina por inhibidores de calicreína podría utilizarse también para la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos intestinales inflamatorios crónicos.

Además, los compuestos, de acuerdo con la invención, pueden utilizarse para inhibir el crecimiento tumoral y la formación de metástasis, y también para la profilaxis y/o el tratamiento de complicaciones tromboembólicas tales como, por ejemplo, tromboembolias venosas, para pacientes con tumores, en particular, aquellos que se someten a intervenciones quirúrgicas principales, o quimioterapia o radioterapia.

Adicionalmente, los compuestos de acuerdo con la invención también son adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de la coagulación intravascular diseminada en el contexto de una enfermedad infecciosa y/o síndrome inflamatorio sistémico (SRIS), disfunción de órganos sépticos, insuficiencia de órganos sépticos e insuficiencia multiorgánica, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lesión pulmonar aguda (a L i), shock séptico y/o insuficiencia de órganos sépticos.

En el curso de una infección, puede presentarse una activación generalizada del sistema de coagulación (coagulación intravascular diseminada o coagulopatía de consumo, en lo sucesivo denominada “CID”) con microtrombosis en varios órganos y complicaciones hemorrágicas secundarias. Además, puede existir daño endotelial con aumento de la permeabilidad de los vasos, y difusión de líquido y proteínas hacia el espacio extravasal. A medida que avanza la infección, puede presentarse insuficiencia de un órgano (por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia hepática, insuficiencia respiratoria, deficiencias del sistema nervioso central e insuficiencia cardiovascular), o insuficiencia multiorgánica.

En el caso de la CID, existe una activación masiva del sistema de coagulación en la superficie de las células endoteliales dañadas, las superficies de cuerpos extraños o tejido extravascular reticulado. Como consecuencia, se presenta una coagulación en pequeños vasos de varios órganos con hipoxia y disfunción orgánica subsiguiente. Un efecto secundario es el consumo de factores de coagulación (por ejemplo, factor X, protrombina y fibrinógeno) y plaquetas, lo que reduce la coagulación de la sangre, y puede provocar un sangrado abundante.

Además de la actividad anticoagulante, la calicreína plasmática es una proteasa liberadora de bradicinina, que es importante, entre otras cosas, porque conduce así a una mayoritario permeabilidad endotelial. Por lo tanto, los compuestos pueden utilizarse para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos que implican formaciones de edemas, tales como trastornos oftálmicos, en particular, retinopatía diabética o edema macular o angioedema hereditario.

Los “trastornos oftálmicos”, en el contexto de la presente invención, incluyen en particular trastornos tales como retinopatía diabética, edema macular diabético (EMD), edema macular, edema macular asociado con oclusión de la vena retiniana, degeneración macular relacionada con la edad (DME), neovascularización coroidea (NVC), membranas neovasculares coroideas (MNVC), edema macular cistoide (EMC), membranas epirretinianas (MER) y perforaciones maculares, neovascularización coroidea asociada a miopía, estrías angioides, estrías vasculares, desprendimiento de retina, cambios atróficos del epitelio pigmentario de la retina, cambios hipertróficos en el epitelio pigmentario de la retina, oclusión de la vena retiniana, oclusión de la vena coroidea de la retina, retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, retinopatía del prematuro, glaucoma, trastornos inflamatorios oculares tales como uveítis, escleritis o endoftalmitis, cataratas, anomalías de refracción tales como miopía, hipermetropía o astigmatismo y queratocono, trastornos del ojo anterior tales como la angiogénesis corneal como secuela de, por ejemplo, queratitis, trasplante de córnea o queratoplastia, angiogénesis corneal como secuela de hipoxia (por ejemplo, por uso excesivo de lentes de contacto), pterigión conjuntiva, edema subcorneal y edema intracorneal.

Los compuestos de acuerdo con la invención también son adecuados para la profilaxis primaria de trastornos trombóticos o tromboembólicos, y/o trastornos inflamatorios y/o trastornos con permeabilidad vascular aumentada en pacientes en los que las mutaciones genéticas conducen a una potenciación de la actividad enzimática, o niveles aumentados de zimógenos, y éstos se establecen mediante las pruebas/mediciones pertinentes de la actividad enzimática o concentraciones de zimógeno.

La presente invención proporciona además el uso de los compuestos de acuerdo con la invención para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos, en especial, los trastornos mencionados anteriormente.

La presente invención proporciona además el uso de los compuestos de acuerdo con la invención para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos, en especial, los trastornos mencionados anteriormente.

Un aspecto de la divulgación proporciona un método para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos, en especial, los trastornos mencionados anteriormente, utilizando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención

La presente invención proporciona además los compuestos de acuerdo con la invención para su uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos, en especial, los trastornos mencionados anteriormente, utilizando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención.

En particular, la presente invención proporciona los compuestos de acuerdo con la invención para su uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos trombóticos o tromboembólicos, utilizando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención.

La presente invención proporciona además medicamentos que comprenden un compuesto de acuerdo con la invención y uno o más compuestos activos adicionales.

Adicionalmente, los compuestos de acuerdo con la invención también pueden utilizarse para prevenir la coagulación ex vivo, por ejemplo, para la protección de órganos que se van a trasplantar contra el daño orgánico causado por la formación de coágulos, y para proteger al receptor del órgano contra las tromboembolias del órgano trasplantado, para conservar productos de sangre y plasma, para limpiar/tratar previamente los catéteres y otros dispositivos auxiliares e instrumentos médicos, para recubrir superficies sintéticas de dispositivos auxiliares e instrumentos médicos utilizados in vivo o ex vivo.

Los compuestos de acuerdo con la invención también se pueden usar en muestras biológicas que contienen precalicreína plasmática (PCP) o calicreína plasmática (CP) para evitar los efectos perturbadores causados por el recambio de sustratos fisiológicos y artificiales por parte de la CP.

La presente invención proporciona además un método para prevenir la coagulación de sangre in vitro, en particular, en muestras de sangre almacenadas o biológicas que pueden contener calicreína plasmática, método que se caracteriza porque se añade una cantidad anticoagulante eficaz del compuesto de acuerdo con la invención.

La presente invención proporciona además medicamentos que comprenden un compuesto de acuerdo con la invención y uno o más compuestos activos adicionales, en particular, para el tratamiento y/o la profilaxis de los trastornos mencionados anteriormente.

“Combinaciones”, en el sentido de la invención, significa no solo formas farmacéuticas que contienen todos los componentes (las denominadas combinaciones fijas), y envases combinados que contienen los componentes separados entre sí, sino también componentes que se administran simultánea o secuencialmente, siempre que se utilizan para la profilaxis y/o el tratamiento de la misma enfermedad. Asimismo, es posible combinar dos o más principios activos entre sí, lo que significa que, por lo tanto, cada uno de ellos se encuentra en combinaciones de dos componentes o de varios componentes.

Los compuestos de la invención pueden actuar de forma sistémica y/o local. Para ello, pueden administrarse de forma adecuada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, dérmica, transdérmica, conjuntival u ótica, o como implante o stent.

Los compuestos de la invención se pueden administrar en formas de administración adecuadas para estas vías de administración.

Las formas de administración adecuadas para la administración oral son aquellas que funcionan de acuerdo con la técnica anterior, y administran los compuestos de la invención rápidamente y/o de forma modificada, y que contienen los compuestos de la invención en forma cristalina, y/o amortizada, y/o disuelta, por ejemplo, comprimidos (sin recubrir o comprimidos recubiertos, por ejemplo, con recubrimientos entéricos o recubrimientos insolubles o que se disuelven con retraso, que controlan la liberación del compuesto de acuerdo con la invención), comprimidos que se deshacen rápidamente en la boca, o películas/obleas, películas/liofilizados, cápsulas (por ejemplo, cápsulas de gelatina dura o blanda), comprimidos recubiertos de azúcar, gránulos, microgránulos, polvos, emulsiones, suspensiones, aerosoles o soluciones.

La administración parenteral se puede realizar evitando una etapa de reabsorción (por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intrarraquídea o intralumbar) o con la inclusión de una absorción (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intracutánea, percutánea o intraperitoneal). Las formas de administración adecuadas para la administración parenteral incluyen preparaciones para inyección e infusión en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, liofilizados o polvos estériles.

Son adecuadas para la administración extraocular (tópica) las formas de administración que funcionan de acuerdo con la técnica anterior, que liberan el compuesto activo rápidamente y/o de manera modificada o controlada y que contienen el compuesto activo en forma cristalina y/o amortizada y/o disuelta, tal como, por ejemplo, colirios, aerosoles y lociones (por ejemplo, soluciones, suspensiones, sistemas vesiculares/coloidales, emulsiones, aerosoles), polvos para colirios, aerosoles y lociones (por ejemplo, compuesto activo molido, mezclas, liofilizados, compuesto activo precipitado), preparaciones oculares semisólidas (por ejemplo, hidrogeles, hidrogeles in situ, cremas y pomadas), insertos oculares (preparaciones sólidas y semisólidas, por ejemplo, bioadhesivos, películas/obleas, láminas, lentes de contacto).

La administración intraocular incluye, por ejemplo, la administración intravítrea, subretiniana, subescleral, intracoroidea, subconjuntival, retrobulbar y subtenoniana. Son adecuadas para la administración intraocular las formas de administración que funcionan de acuerdo con la técnica anterior, que liberan el compuesto activo rápidamente y/o de manera modificada o controlada y que contienen el compuesto activo en forma cristalina y/o amorfizada, y/o disuelta, tales como, por ejemplo, preparaciones para inyección y concentrados para preparaciones para inyección (por ejemplo, soluciones, suspensiones, sistemas vesiculares/coloidales, emulsiones), polvos para preparaciones para inyección (por ejemplo, compuesto activo molido, mezclas, liofilizados, compuesto activo precipitado), geles para preparaciones para inyección (preparaciones semisólidas, por ejemplo, hidrogeles, hidrogeles in situ) e implantes (preparaciones sólidas, por ejemplo, implantes biodegradables y no biodegradables, bombas implantables).

Se da preferencia a la administración oral o, en el caso de los trastornos oftalmológicos, a la administración extraocular e intraocular.

Las formas de administración adecuadas para las otras vías de administración son, por ejemplo, formas farmacéuticas para inhalación (incluidos inhaladores de polvo, nebulizadores), gotas nasales, soluciones o aerosoles; comprimidos para administración lingual, sublingual o bucal, películas/obleas o cápsulas, supositorios, preparaciones para los oídos u ojos, cápsulas vaginales, suspensiones acuosas (lociones, mezclas para agitar), suspensiones lipófilas, pomadas, cremas, sistemas terapéuticos transdérmicos (por ejemplo, parches), leche, pastas, espumas, polvos, implantes o stents.

Los compuestos de la invención pueden convertirse en las formas de administración mencionadas. Esto se puede realizar de una manera conocida en sí, mezclando con excipientes inertes, no tóxicos y farmacéuticamente adecuados. Estos excipientes incluyen vehículos (por ejemplo, celulosa microcristalina, lactosa, manitol), disolventes (por ejemplo, polietilenglicoles líquidos), emulsionantes y agentes dispersantes o humectantes (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, oleato de polioxisorbitano), aglutinantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos y naturales (por ejemplo, albúmina), estabilizantes (por ejemplo, antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico), colorantes (por ejemplo, pigmentos inorgánicos, por ejemplo, óxidos de hierro) y correctores del aroma y/o del olor.

La presente invención proporciona además medicamentos que comprenden al menos un compuesto de la invención, preferentemente, junto con uno o más excipientes inertes no tóxicos farmacéuticamente adecuados, y el uso de los mismos para los fines mencionados anteriormente.

En el caso de la administración parenteral, generalmente se ha encontrado que es ventajoso administrar cantidades de aproximadamente 5 a 250 mg cada 24 horas para lograr resultados eficaces. En el caso de la administración oral, la cantidad es de aproximadamente 5 a 500 mg cada 24 horas.

A pesar de ello, puede ser necesario, si procede, desviarse de las cantidades especificadas, específicamente en función del peso corporal, la vía de administración, el comportamiento individual hacia el principio activo, el tipo de formulación y el momento o intervalo temporal de la administración.

A menos que se indique lo contrario, los porcentajes en las pruebas y los ejemplos que figuran a continuación son porcentajes en peso; las partes son partes en peso. Las proporciones de los disolventes, las relaciones de dilución y los datos de concentración de las soluciones de líquido/líquido se basan, en cada caso, en el volumen. “p/v” significa “peso/volumen”. Por ejemplo, “10 % p/v” significa: 100 ml de solución o suspensión comprenden 10 g de sustancia.

A) Ejemplos

Abreviaturas

ac. acuoso

Boc terc-butiloxicarbonilo

a amplio (en RMN)

bmpr basado en material de partida recuperado

d día(s), doblete (en RMN)

dd doblete de doblete (en RMN)

ddd doblete de doblete de doblete (en RMN)

DMF W,W-dimetilformamida

DMSO dimetilsulfóxido

IEN ionización por electronebulización (en la EM)

h hora(s)

HATU hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazoM-il)-W,W,W'W-tetrametiluronio

HPLC (High Performance Liquid Chromatography; High Pressure Liquid Chromatography)

cromatografía líquida de alta presión y alto rendimiento

AV alto vacío

CL-EM cromatografía líquida con espectrometría de masas acoplada

m multiplete (en RMN)

min minuto(s)

EM espectrometría de masas

RMN resonancia magnética nuclear espectroscópica

Tr tiempo de retención (en HPLC)

s singlete (en RMN)

t triplete (en RMN)

THF tetrahidrofurano

TFA ácido trifluoroacético

T3P 2,4,6-trióxido de 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano

Métodos de CL-EM:

Método 1: Instrumento de EM: Thermo Scientific FT-MS; instrumento de HPLC: Thermo Scientific UltiMate 3000; columna: Waters Acquity UPLC HSS T3, 100 A, 1,8 |jm, 2,1 mm x 75 mm; eluyente A: 1 l de agua ácido fórmico al 0,01 %; eluyente B: 1 l acetonitrilo ácido fórmico al 0,01 %; gradiente: 0,0 min 10 % de B ^ 2,5 min 95 % de B ^ 3,5 min 95 % de B; horno: 50 °C; caudal: 0,90 ml/min; detección UV: 210 nm/ruta de integración óptima 210-300 nm.

Método 2: Instrumento: Sistema Waters ACQUITY SQD UPLC; columna: Waters Acquity UPLC HSS T3, 100 A, 1,8 jm ; 1 mm x 50 mm; eluyente A: 1 l de agua 0,25 ml de ácido fórmico al 99 %, eluyente B: 1 l de acetonitrilo 0,25 ml ácido fórmico al 99 %; gradiente: 0,0 min 90 % de A ^ 1,2 min 5 % de A ^ 2,0 min 5 % de A; horno: 50 °C; caudal: 0,40 ml/min; detección UV: 210 nm.

Cuando los compuestos de acuerdo con la invención se purifican mediante cromatografía en la que los eluyentes contienen aditivos, por ejemplo, ácido trifluoroacético, ácido fórmico o amoníaco, los compuestos de acuerdo con la invención la invención, pueden obtenerse en forma de sal, por ejemplo, como trifluoroacetato, formiato o sal de amonio, si los compuestos de acuerdo con la invención contienen una funcionalidad suficientemente básica o ácida. Dicha sal se puede convertir en la base o ácido libre correspondiente mediante varios métodos conocidos por el experto en la técnica.

En el caso de los productos intermedios de síntesis y los ejemplos de trabajo de la invención descritos a continuación, cualquier compuesto especificado en forma de una sal de la base o ácido correspondiente es generalmente una sal de composición estequiométrica exacta desconocida, obtenida por la preparación y/o proceso de purificación respectivos. A menos que se especifique con más detalle, las adiciones a los nombres y fórmulas estructurales, como “clorhidrato”, “trifluoroacetato”, “sal de sodio”, o “x HCl”, “x CF3COOH”, “x Na+”, por lo tanto, no deben entenderse en un sentido estequiométrico en el caso de dichas sales, sino que tienen un carácter meramente descriptivo con respecto a los componentes formadores de sal presentes en las mismas.

Esto se aplica correspondientemente si se obtuvieron productos intermedios de síntesis o ejemplos de trabajo o sales de los mismos en forma de solvatos, por ejemplo, hidratos, de composición estequiométrica desconocida (si son de un tipo definido) mediante los procesos de preparación o purificación descritos.

Compuestos de partida

Ejemplo 1A

(2E)-But-2-en-1-il[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]acetato

Se calentó una mezcla de 4-cloro-2-(5-metoxi-2-oxo-1,2-dihidropiridin-4-il)benzonitrilo [CAS-RN 1630193-83-7; documento WO2015/063093, pág. 73f., expl. 2.1C] (11,3 g, 43,2 mmol), bromoacetato de (2E)-but-2-en-1-ilo [CAS-RN 93455-19-7; S. M. Weinreb et al., J. Org. Chem. 1984, 49, 5058-5064] (10,0 g, 51,8 mmol) y carbonato de potasio (8,95 g, 64,8 mmol) en DMF (90 ml) hasta 100 °C durante 45 min. Posteriormente, se eliminó el disolvente al vacío. Se añadió agua y la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se desecaron sobre sulfato de sodio. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: gradiente de ciclohexano - acetato de etilo), produciendo 10,8g (92 % de pureza, 62 % de rendimiento) del compuesto del título.

CL-EM (Método 2): Tr = 0,92 min; EM (IEN+): m/z = 373 [M+H]+.

RMN de1H (400 MHz, DMSO-cfe): 8 [ppm] = 8,01-7,97 (m, 1H), 7,75-7,71 (m, 2H), 7,58 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,88-5,78 (m, 1H), 5,65-5,55 (m, 1H), 4,74 (s, 2H), 4,59 (d, 2H), 3,62 (s, 3H), 1,70 (dd, 3H).

Ejemplo 2A

Ácido 2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lpent-4-eno¡co (mezcla racémica de diastereómeros).

Se d¡solv¡ó (2E)-but-2-en-1-¡l[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]acetato (10,8 g, 92% pureza, 26,7 mmol) en THF (150 ml) y se enfr¡ó hasta -78 °C. Se añad¡ó b¡s(tr¡met¡ls¡l¡l)am¡da de l¡t¡o (58 ml, 1,0 M en THF, 58 mmol). La reacc¡ón se ag¡tó durante 30 m¡n a -78 °C. Poster¡ormente, se añad¡ó cloro(tr¡met¡l)s¡lano (7,4 ml, 58 mmol). Se calentó hasta 60 °C y se ag¡tó durante 1 h. Se añad¡ó agua a la mezcla de reacc¡ón y se ac¡d¡f¡có con ác¡do clorhídrico ac. 1 N. Se extrajo tres veces con d¡clorometano. Las capas orgán¡cas comb¡nadas se extrajeron tres veces con soluc¡ón de h¡dróx¡do de sod¡o ac. 1 N. Las capas bás¡cas comb¡nadas se ac¡d¡f¡caron con ác¡do clorhídr¡co ac. 4 N, y se extrajeron c¡nco veces con d¡clorometano. Las fases orgán¡cas comb¡nadas se desecaron sobre sulfato de sod¡o y el d¡solvente se evaporó, produc¡endo 6,95 g (rend¡m¡ento del 70 %) del compuesto del título en forma de una mezcla racém¡ca de d¡astereómeros (proporc¡ón de 38:62).

CL-EM (Método 1): Tr= 1,59 m¡n (¡sómero m¡nor¡tar¡o), 1,62 m¡n (¡sómero mayor¡tar¡o); EM (IEN+): m/z = 373 [M+H]+.

RMN d e 1H (400 MHz, DMSO-cfó): 8 [ppm] = 13,16 (s a, 1H), 7,99 (d, 1H ¡sómero mayor¡tar¡o) y 7,98 (d, 1H ¡sómero m¡nor¡tar¡o), 7,76-7,69 (m, 2H), 7,44 (s, 1H mayor¡tar¡o) y 7,38 (s, 1^h m¡nor¡tar¡o), 6,52 (s, 1H mayor¡tar¡o) y 6,46 (s, 1H m¡nor¡tar¡o), 5,95 (ddd, 1H mayor¡tar¡o) y 5,59 (ddd, 1H m¡nor¡tar¡o), 5,20 (d, 1H mayor¡tar¡o) y 5,02 (d, 1^h m¡nor¡tar¡o), 5,18-5,15 (m, 1H), 5,11 (dd, 1H mayor¡tar¡o) y 4,92 (dd, 1H m¡nor¡tar¡o), 3,65 (s, 3H mayor¡tar¡o) y 3,62 (s, 3H m¡nor¡tar¡o), 3,26-3,11 (m, 1H), 1,18 (d, 3H m¡nor¡tar¡o) y 0,87 (d, 3H mayor¡tar¡o).

Ejemplo 3A

2-[4-(5-Cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡l-W-(prop-2-en-1-¡l)-pent-4-enam¡da (mezcla racém¡ca de d¡astereómeros).

Se d¡solv¡eron ác¡do 2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lpent-4-eno¡co (mezcla racém¡ca de d¡astereómeros) (4,00 g, 10,7 mmol) y prop-2-en-1-am¡na (12 ml, 160 mmol) en p¡r¡d¡na (40 ml) y se calentaron hasta 60 °C. Se añad¡ó una soluc¡ón de T3P en acetato de et¡lo (19 ml, 50 % de pureza, 32 mmol) gota a gota, y la mezcla se ag¡tó más a 60 °C durante 1 h. Se añad¡ó agua y se extrajo tres veces con acetato de et¡lo. Las capas orgán¡cas comb¡nadas se desecaron sobre sulfato de sod¡o y el d¡solvente se el¡m¡nó al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en columna (gel de síl¡ce; eluyente: grad¡ente de c¡clohexano - acetato de et¡lo), produc¡endo 2,56 g (58 % de rend¡m¡ento) del compuesto del título en forma de mezcla racém¡ca de d¡astereómeros.

CL-EM (Método 1): Tr = 1,81 m¡n; EM (IEN+): m/z = 412 [M+H]+.

RMN d e 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 6 [ppm] = 8,84 (t, 1H isómero minoritario) y 8,69 (t, 1H isómero mayoritario), 7,99 (d, 1H mayoritario) y 7,97 (d, 1H minoritario), 7,76-7,68 (m, 2H), 7,64 (s, 1H mayoritario) y 7,62 (s, 1H minoritario), 6,52 (s, 1H mayoritario) y 6,46 (s, 1H minoritario), 5,89-5,43 (m, 3H), 5,22-4,89 (m, 4H), 3,85-3,60 (m, 2H), 3,65 (s, 3H mayoritario) y 3,64 (s, 3H minoritario), 3,13-2,95 (m, 1H), 1,08 (d, 3H minoritario) y 0,83 (d, 3H mayoritario).

Ejemplo 4A

Alil{2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilpent-4-enoil}carbamato ferc-butílico (mezcla racémica de diastereómeros).

Se disolvió 2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metil-N-(prop-2-en-1-il)pent-4-enamida (mezcla racémica de diastereómeros) (2,50 g, 6,07 mmol) en acetonitrilo (120 ml). Se añadieron dicarbonato di-ferc-butílico (2,8 ml, 12 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (297 mg, 2,43 mmol) y la mezcla se calentó hasta 60 °C durante 1 h. Después, la mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó directamente mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: gradiente de ciclohexano - acetato de etilo), produciendo 3,07 g (rendimiento del 99%) del compuesto del título en forma de mezcla racémica de diastereómeros.

CL-EM (Método 1): Tr = 2,41 min; EM (IEN+): m/z = 512 [M+H]+.

RMN de1H (400 MHz, DMSO-cfe): 6 [ppm] = 7,99 (d, 1H isómero mayoritario) y 7,97 (d, 1H isómero minoritario), 7,75­ 7,63 (m, 2h ), 7,42 (s, 1H mayoritario) y 7,39 (s, 1H minoritario), 6,51 (s, 1H mayoritario) y 6,46 (s, 1H minoritario), 6,45 (d a, 1H mayoritario) y 6,36 (d a, 1H minoritario), 5,96-5,58 (m, 2H), 5,22-4,92 (m, 4H), 4,24-4,07 (m, 2H), 3,66 (s, 3H mayoritario) y 3,62 (s, 3H minoritario), 3,35-3,20 (m, 1H), 1,484 (s, 9H minoritario) y 1,478 (s, 9H mayoritario), 1,16 (d, 3H minoritario) y 0,89 (d, 3H mayoritario).

Ejemplo 5A

3-[4-(5-Cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-4-metil-2-oxo-2,3,4,7-tetrahidro-1H-azepin-1-carboxilato ferc-butílico (mezcla racémica de diastereómeros).

Se disolvió alil{2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilpent-4-enoil}carbamato ferc-butílico (mezcla racémica de diastereómeros) (3,00 g, 5,86 mmol) en diclorometano (1,0 l) y la solución se desgasificó (atmósfera de argón). Se añadió benciliden[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)imidazolidin-2-ilideno]dicloridorutenio— triciclohexilfosfano (1/1) [CAS-RN 246047-72-3] (249 mg, 293 |jmol) y la reacción se agitó a 45 °C durante 1,5 h. Posteriormente, se añadió una solución ac. saturada de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se desecaron sobre sulfato de sodio. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: gradiente de ciclohexano - acetato de etilo), produciendo 2,75 g (rendimiento del 97 %) del compuesto del título en forma de mezcla racémica de diastereómeros.

CL-EM (Método 1): Tr = 2,04 (isómero mayoritario) y 2,06 min (isómero minoritario); EM (IEN-): m/z = 482 [M-H]-.

RMN de1H (400 MHz, DMSO-cfe): 6 [ppm] = 8,01 (m, 1H isómero minoritario) y 8,00 (d, 1H isómero mayoritario), 7,78­ 7,71 (m, 2H), 7,47 (s, 1H mayoritario) y 7,31 (s, 1H, minoritario), 6,60 (s, 1H minoritario) y 6,56 (s, 1H mayoritario), 6,34 (d, 1H mayoritario) y 6,18 (d, 1H minoritario), 6,03-5,94 (m, 1H), 5,90-5,83 (m, 1H minoritario) y 5,83-5,77 (m, 1H mayoritario), 4,57 (dd, 1H minoritario) y 4,47 (dd, 1H mayoritario), 4,44-4,33 (m, 1H), 3,684 (s, 3H minoritario) y 3,676 (s, 3H mayoritario), 3,48-3,38 (m, 1H mayoritario), 3,07-2,97 (m, 1H minoritario), 1,46 (s, 9H mayoritario) y 1,45 (s, 9H minoritario), 1,18 (d, 3H minoritario) y 0,91 (d, 3H mayoritario).

Ejemplo 6A

3-[4-(5-Cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-4-metil-2-oxoazepan-1-carboxilato ferc-butílico (mezcla racémica de diastereómeros).

Se disolvió 3-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-4-metil-2-oxo-2,3,4,7-tetrahidro-1H-azepin-1-carboxilato ferc-butílico (mezcla racémica de diastereómeros) (2,70 g, 5,58 mmol) en acetato de etilo (250 ml) y se añadió paladio (10 % en carbón vegetal, 594 mg). La reacción se agitó bajo hidrógeno (presión atmosférica) durante 4 h. La mezcla se filtró a través de tierra de diatomeas y el disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: gradiente de ciclohexano - acetato de etilo), produciendo 0,54 g del isómero mayoritario del material de partida y 1,78 g (66 % de rendimiento, 82 % de rendimiento bmpr) del compuesto del título en forma de mezcla racémica de diastereómeros.

CL-EM (Método 1): Tr = 2,05 min; EM (IEN-): m/z = 484 [M-H]-.

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6): 6 [ppm] = 8,00 (d, 1H) y 7,99 (d, 1H), 7,77-7,71 (m, 2H), 7,42 (s, 1H isómero minoritario) y 7,16 (s, 1H isómero mayoritario), 6,56 (s, 1H mayoritario) y 6,52 (s, 1H minoritario), 5,89 (s, 1H mayoritario) y 5,86-5,66 (m, 1H minoritario), 4,23-4,13 (m, 1H), 3,68 (s, 3H mayoritario) y 3,66 (s, 3H minoritario), 3,65­ 3,55 (m, 1H), 2,64-2,56 (m, 1H) y (2,15-2,03 (m, 1H), 1,97-1,55 (m, 4H), 1,46 (s, 9H), 1,14 (d, 3H mayoritario) y 0,86 (d, 3H minoritario).

Ejemplo 7A

Ácido 6-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoico (mezcla racémica de diastereómeros).

Se disolvió 3-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-4-met¡l-2-oxoazepano-1-carbox¡lato ferc-butíl¡co (mezcla racém¡ca de d¡astereómeros) (1,77 g, 3,64 mmol) en THF (25 ml), y se añad¡ó una soluc¡ón ac. de h¡dróx¡do de l¡t¡o (3,6 ml, 2,0 M, 7,2 mmol). La mezcla se ag¡tó a 30 °C durante 1 h, luego se concentró al vacío y el res¡duo se d¡solv¡ó en agua. Se lavó con acetato de et¡lo. La fase acuosa se ac¡d¡f¡có con ác¡do clorhídr¡co ac. 1 N y se extrajo dos veces con acetato de et¡lo. Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera y se desecaron sobre sulfato de sod¡o, produc¡endo 1,78 g (rend¡m¡ento del 97%) del compuesto del título en forma de mezcla racém¡ca de d¡astereómeros.

CL-EM (Método 1): Tr = 1,80 m¡n (¡sómero m¡nor¡tar¡o) y 1,84 m¡n (¡sómero mayor¡tar¡o); EM (IEN+): m/z = 504 [M+H]+.

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de): 8 [ppm] = 13,13 (s a, 1H), 8,01-7,97 (m, 1H), 7,76-7,71 (m, 2H), 7,38 (s, 1H), 6,80 (t a, 1H ¡sómero mayor¡tar¡o), y 6,70 (t a, 1H ¡sómero m¡nor¡tar¡o), 6,51 (s, 1H), 5,10 (d, 1H m¡nor¡tar¡o) y 5,05 (d, 1H mayor¡tar¡o), 3,64 (s, 3H m¡nor¡tar¡o) y 3,63 (s, 3H mayor¡tar¡o), 3,01-2,71, y 2,49-2,37 (m, en conjunto, 3H), 1,64-1,40 y 1,31-1,13 y 1,02-0,93 (m, en conjunto, 4H), 1,38 (s, 9H mayor¡tar¡o), y 1,34 (s, 9H m¡nor¡tar¡o), 1,05 (d, 3H m¡nor¡tar¡o), y 0,72 (d, 3H mayor¡tar¡o).

Ejemplo 8A

{6-[(3-Carbamo¡lp¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-5-¡l)am¡no]-5-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-4-met¡l-6-oxohex¡l}carbamato ferc-butíl¡co (mezcla racém¡ca de d¡astereómeros).

Se d¡solv¡eron ác¡do 6-[(ferc-butox¡carbon¡l)am¡no]-2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lhexano¡co (mezcla racém¡ca de d¡astereómeros) (1,08 g, 2,14 mmol) y tr¡fluoroacetato de 5-am¡nop¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-3-carboxam¡da [CAS-RN 1891071-11-6; documento WO2016/046158, pág. 53, expl. 1.1c ] (746 mg, 2,57 mmol) en DMF (4,0 ml). Se añad¡eron HATU (1,22 g, 3,21 mmol) en forma de soluc¡ón en DMF (2,0 ml), y poster¡ormente, A/,W-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (370 pl, 2,1 mmol) gota a gota. La reacc¡ón se ag¡tó durante 1,5 horas a temperatura amb¡ente. Además, se añad¡eron tr¡fluoroacetato de 5-am¡nop¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-3-carboxam¡da (187 mg, 643 pmol) y W,A/-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (370 pl, 2,1 mmol). Después de ag¡tar durante la noche, se añad¡eron más HATU (407 mg, 1,07 mmol) y A/,W-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (370 pl, 2,1 mmol), y después de 1 h, la reacc¡ón se concentró al vacío. El res¡duo se cr¡stal¡zó con agua, se recog¡ó med¡ante f¡ltrac¡ón por succ¡ón, se lavó con agua y se desecó al vacío. El compuesto se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: gradiente de diclorometano/metanol), produciendo 1,20 g (rendimiento del 84% ) del compuesto del título en forma de mezcla racémica de diastereómeros.

CL-EM (Método 1): Tr = 1,75 min; EM (IEN+): m/z = 662 [M+H]+.

RMN de1H (400 MHz, DMSO-cfe): 6 [ppm] = 11,14 (s a, 1H isómero mayoritario) y 11,12 (s a, 1H isómero minoritario), 8,73-8,66 (m, 2H), 8,47 (s, 1H mayoritario), y 8,46 (s, 1H minoritario), 8,00 (d, 1H mayoritario), y 7,99 (d, 1H minoritario), 7,77-7,71 (m, 2H), 7,63 (s, 1H), 7,60 (s a, 1H), 7,26 (dd, 1H), 6,98 (s a, 1H), 6,76-6,70 (m, 1H), 6,56 (s, 1H minoritario) and 6,55 (s, 1H mayoritario), 5,57 (d, 1H mayoritario), y 5,56 (d, 1H minoritario), 3,72 (s, 3H mayoritario), y 3,71 (s, 3H minoritario), 2,96-2,76 (m, 2H), 1,64-0,96 (m, 5H), 1,34 (s, 9H mayoritario), y 1,28 (s, 9H minoritario), 1,05 (d, 3H mayoritario) y 0,78 (d, 3H minoritario).

La separación de los cuatro estereoisómeros se puede realizar mediante cromatografía quiral: Columna y fase sólida: 250 mm x 20 mm, Chiralpak IE, 5 pm; eluyente: etanol; caudal: 15,0ml/min. Produce tres máximos (7,0-8,5 min, 11,1 min, 13,9 min). El primer máximo necesita más cromatografía para la separación: columna y fase sólida: 250 mm x 20 mm, Chiralpak IC, 5 pm; eluyente: etanol; caudal: 15,0 ml/min. Produce dos máximos (6,29 min, 7,33 min). HPLC analítico: columna 250 mmx 4,6 mm, Chiralcel OX-H, 5 pm; eluyente: iso-hexano/etanol 1:1; caudal: 1,0 ml/min; temperatura: 40 °C.

Estereoisómero 1: Tr= 10,90 min.

Estereoisómero 2: Tr = 7,50 min.

Estereoisómero 3: Tr = 8,85 min.

Estereoisómero 4: Tr = 9,19 min.

El estereoisómero 1 y 4, así como el estereoisómero 2 y 3, son enantioméricos entre sí.

Estereoisómeros 1 y 4:

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 6 [ppm] = 11,14 (s a, 1H), 8,70-8,67 (m, 2H), 8,47 (s, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,75-7,71 (m, 2H), 7,60 (s a, 1H), 7,62 (s a, 1H), 7,25 (dd, 1H), 6,98 (s a, 1H), 6,76-7,70 (m, 1H), 6,55 (s, 1H), 5,57 (d, 1H), 3,71 (s, 3H), 2,93-2,74 (m, 2H), 1,52-1,29 (m, 3H), 1,34 (s, 9H), 1,26-0,96 (m, 2H), 1,05 (d, 3H).

Estereoisómeros 2 y 3:

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6): 6 [ppm] = 11,12 (s a, 1H), 8,71 (d, 1H), 8,68 (d, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,99 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,73 (dd, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,59 (s a, 1H), 7,25 (dd, 1H), 6,99 (s a, 1H), 6,75 (t a, 1H), 6,56 (s, 1H), 5,56 (d, 1H), 3,70 (s, 3H), 2,95-2,83 (m, 2H), 2,48-2,39 (m, 1H), 1,66-1,53 (m, 1H), 1,51-1,29 (m, 3H), 1,28 (s, 9H), 0,77 (d, 3H).

Ejemplos de Trabajo

Ejemplo 1

Trifluoroacetato de 5-({6-amino-2-[4-(5-cloro-2-cianofenil)-5-metoxi-2-oxopiridin-1(2H)-il]-3-metilhexanoil}amino)pirazol[1,5-a]piridin-3-carboxamida (mezcla racémica de diastereómeros).

Se disolvió {6-[(3-Carbamo¡lp¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-5-¡l)am¡no]-5-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-4-met¡l-6-oxohex¡l}carbamato terc-butíl¡co (mezcla racém¡ca de d¡astereómeros) (1,20 g, 1,81 mmol) en d¡clorometano, y se enfr¡ó con agua helada. Se añad¡ó ác¡do tr¡fluoroacét¡co (2,8 ml, 36 mmol). La mezcla se calentó hasta la temperatura amb¡ente y se ag¡tó durante 1 h. Luego se evaporó la mezcla. Se añad¡ó d¡clorometano y se el¡m¡nó al vacío. Este proced¡m¡ento se rep¡t¡ó una vez. El res¡duo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en columna (gel de síl¡ce; eluyente: grad¡ente de d¡clorometano/metanol), produc¡endo 785 mg (rend¡m¡ento del 64 %) del compuesto del título en forma de mezcla racém¡ca de d¡astereómeros.

CL-EM (Método 2): Tr = 0,64 m¡n (¡sómero mayor¡tar¡o) 0,68 (¡sómero m¡nor¡tar¡o); EM (IEN+): m/z = 562 [M+H]+.

RMN d e 1H (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 11,17 (s, 1H ¡sómero mayor¡tar¡o) y 11,14 (s, 1H ¡sómero m¡nor¡tar¡o), 8,73-8,67 (m, 2H), 8,48 (s, 1H), 8,00 (d, 1H mayor¡tar¡o) y 7,99 (d, 1H m¡nor¡tar¡o), 7,76-7,72 (m, 2H), 7,69 (s a, 4H), 7,65 (s, 1H mayor¡tar¡o) y 7,61 (s, 1H m¡nor¡tar¡o), 7,28-7,25 (m, 1H), 6,98 (s a, 1H), 6,58 (s, 1H m¡nor¡tar¡o) y 6,57 (s, 1H mayor¡tar¡o), 5,61-5,55 (m, 1H), 3,72 (s, 3H mayor¡tar¡o), y 3,70 (s, 3H m¡nor¡tar¡o), 2,87-2,51 (m, 3H), 1,80-1,09 (m, 4H), 1,08 (d, 3H mayor¡tar¡o), y 0,79 (d, 3H m¡nor¡tar¡o).

Ejemplo 2

Tr¡fluoroacetato de 5-({(2S)-6-am¡no-2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lhexano¡l}am¡no)p¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-3-carboxam¡da (estereo¡sómero 3).

S¡gu¡endo el proced¡m¡ento menc¡onado en el Ejemplo 1, el carbamato separado del estereo¡sómero 3 del Ejemplo 8A se desproteg¡ó ¡nd¡v¡dualmente.

Estereo¡sómero 3:

CL-EM (Método 1): Tr = 1,05 m¡n; EM (IEN+): m/z = 562 [M+H]+.

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 11,15 (s, 1H), 8,72 (d, 1H), 8,69 (d, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,76­ 7,72 (m, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,63 (s a, 4H), 7,27 (dd, 1H), 6,98 (s a, 1H), 6,58 (s, 1H), 5,56 (d, 1H), 3,70 (s, 3H), 2,88­ 2,72 (m, 2H), (1H bajo DMSO), 1,81-1,67 (m, 1H), 1,63-1,44 (m, 2H), 1,39-1,28 (m, 1H), 0,79 (d, 3H).

Ejemplo 3

Tr¡fluoroacetato de 5-({(2S)-6-am¡no-2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lhexano¡l}am¡no)p¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-3-carboxam¡da (estereo¡sómero 4).

Siguiendo el procedimiento mencionado en el Ejemplo 1, el carbamato separado del estereoisómero 4 del Ejemplo 8A se desprotegió individualmente.

Estereoisómero 4:

CL-EM (Método 1): Tr = 0,99 min; EM (IEN+): m/z = 562 [M+H]+.

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-da): 8 [ppm] = 11,17 (s, 1H), 8,72-8,67 (m, 2H), 8,48 (s, 1H), 8,03-7,98 (m, 1H), 7,77­ 7,72 (m, 2H), 7,65 (s, 1H), 7,62 (s a, 4H), 7,26 (dd, 1H), 6,98 (s a, 1H), 6,57 (s, 1H), 5,59 (d, 1H), 3,72 (s, 3H), 2,83­ 2,62 (m, 2H), 2,58-2,51 (m, 1H), 1,70-1,44 (m, 2H), 1,08 (d, 3H), 1,26-1,06 (m, 2H).

B) Evaluación de la eficacia fisiológica

La idoneidad de los compuestos de acuerdo con la invención para el tratamiento de trastornos tromboembólicos puede demostrarse en los siguientes sistemas de la prueba:

a) Descripciones de las pruebas (in vitro)

a.1) Determinación de la actividad de la calicreína plasmática

Para determinar la inhibición de la calicreína plasmática de las sustancias de acuerdo con la invención, se emplea un sistema de prueba bioquímica que utiliza la reacción de un sustrato de calicreína plasmática peptídica para determinar la actividad enzimática de la calicreína plasmática humana. En el presente documento, la calicreína plasmática escinde, del sustrato de calicreína plasmática péptica, la aminometilcumarina C-terminal (AMC), cuya fluorescencia se mide. Las determinaciones se llevan a cabo en placas de microtitulación.

Las sustancias de prueba se disuelven en dimetilsulfóxido y se diluyen en serie en dimetilsulfóxido (de 3000 pM a 0,0078 pM; concentraciones finales resultantes en la prueba: de 50 pM a 0,00013 pM). En cada caso, se coloca 1 pl de las soluciones de sustancia diluida en los pocillos de las placas de microtitulación blancas de Greiner (384 pocillos). A continuación, se añaden sucesivamente 20 pl del tampón de la análisis (Tris/HCl 50 mM pH 7,4; solución de cloruro de sodio 100 mM; solución de cloruro de calcio 5 mM; albúmina de suero bovino al 0,1 %) y 20 pl de calicreína plasmática de Kordia (0,6 nM en el tampón de análisis). Después de 15 min de incubación, se inicia la reacción enzimática mediante la adición de 20 pl del sustrato H-Pro-Phe-Arg-AMC disuelto en el tampón de análisis (10 pM en el tampón de análisis) de Bachem, la mezcla se incuba a temperatura ambiente (22 °C) durante 30 min y luego se mide la fluorescencia (excitación: 360 nm, emisión: 460 nm). Se comparan las emisiones medidas de los lotes de prueba con sustancia de prueba con las de los lotes de control sin sustancia de prueba (solo dimetilsulfóxido en lugar de la sustancia de prueba en dimetilsulfóxido), y los valores de CI50 se calculan a partir de las relaciones de concentración/actividad. Los datos de actividad de esta prueba se enumeran a continuación en la Tabla A (algunos como valores medios de múltiples determinaciones individuales independientes):

Tabla A

a.2) Medición de la inhibición de FXIa

La inhibición del factor Xia de las sustancias de acuerdo con la invención se determina mediante un sistema de prueba bioquímica que utiliza la reacción de un sustrato de factor Xia peptídico para determinar la actividad enzimática del factor Xia humano. En el presente documento, el factor Xia escinde, del sustrato del factor péptico Xia, la aminometilcumarina C-terminal (AMC), cuya fluorescencia se mide. Las determinaciones se realizan en placas de microtitulación.

Las sustancias de prueba se disuelven en dimetilsulfóxido y se diluyen en serie en dimetilsulfóxido (3000 pM a 0,0078 pM; concentraciones finales resultantes en la prueba: 50 pM a 0,00013 pM). En cada caso, se coloca 1 pl de las soluciones de sustancia diluida en los pocillos de las placas de microtitulación blancas de Greiner (384 pocillos). A continuación, se añaden sucesivamente 20 pl del tampón de análisis (50 mM de Tris/HCl pH 7,4; 100 mM de cloruro de sodio; 5 mM de cloruro de calcio; 0,1 % de albúmina de suero bovino) y 20 pl de factor Xia de Kordia (0,45 nM en el tampón de análisis). Después de 15 min de incubación, se inicia la reacción enzimática mediante la adición de 20 pl del sustrato de factor Xia Boc-Glu (Obzl)-Ala-Arg-AMC disuelto en el tampón de análisis (10 pM en el tampón de análisis) de Bachem, la mezcla se incubó a temperatura ambiente (22 °C) durante 30 min y luego se midió la fluorescencia (excitación: 360 nm, emisión: 460 nm). Se comparan las emisiones medidas de los lotes de prueba con sustancia de prueba con las de los lotes de control sin sustancia de prueba (solo dimetilsulfóxido en lugar de la sustancia de prueba en dimetilsulfóxido), y los valores de CI50 se calculan a partir de las relaciones de concentración/actividad. Los datos de actividad de esta prueba se enumeran en la Tabla B a continuación (algunos como valores medios de múltiples determinaciones individuales independientes):

Tabla B

a.3) Determinación de la selectividad

Para demostrar la selectividad de las sustancias con respecto a la inhibición de FXIa, se examinan las sustancias de prueba para determinar su inhibición de otras serina proteasas humanas, tales como el factor Xa, la tripsina y la plasmina. Para determinar la actividad enzimática del factor Xa (1,3 nmol/l de Kordia), tripsina (83 mU/ml de Sigma) y plasmina (0,1 pg/ml de Kordia), estas enzimas se disuelven (50 mmol/l del tampón Tris [C,C,C-tris(hidroximetil)aminometano], 100 mmol/l de NaCl, SAB al 0,1 % [seroalbúmina bovina], 5 mmol/l de cloruro de calcio, pH 7,4) y se incuban durante 15 min con la sustancia de prueba en diversas concentraciones en dimetilsulfóxido y también con dimetilsulfóxido sin sustancia de prueba. La reacción enzimática se inicia luego mediante la adición de los sustratos apropiados (5 pmol/l de Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC de Bachem para el factor Xa y tripsina, 50 pmol/l de MeOSuc-Ala-Phe-Lys- AMC de Bachem para plasmina). Después de un tiempo de incubación de 30 min a 22 °C, se mide la fluorescencia (excitación: 360 nm, emisión: 460 nm). Se comparan emisiones medidas de las mezclas de prueba con la sustancia de prueba con las mezclas de control sin sustancia de prueba (solo dimetilsulfóxido en lugar de la sustancia de prueba en dimetilsulfóxido) y los valores de CI50 se calculan a partir de las relaciones de concentración/actividad.

a.4) Determinación de la actividad anticoagulante

La actividad anticoagulante de las sustancias de prueba se determina in vitro en plasma humano y plasma de rata. Para ello, se extrae sangre en una proporción de mezcla de citrato de sodio/sangre de 1:9 utilizando una solución de citrato de sodio 0,11 molar como receptor. Inmediatamente después de extraer la sangre, se mezcla bien y se centrifuga a unos 4000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se retira con pipeta.

El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) se determina en presencia de concentraciones variables de sustancia de prueba o el disolvente correspondiente usando un kit de prueba comercial (reactivo aPTT de Siemens). Los compuestos de prueba se incuban con el plasma y el reactivo aPTT a 37 °C durante 3 minutos. A continuación, se inicia la coagulación mediante la adición de cloruro cálcico 25 mM y se determina el momento en que se produce la coagulación. Se determina la concentración de sustancia de prueba que produce una extensión del 50 % o una duplicación del TTPA.

a.5) Determinación de la Integridad del Endotelio

La actividad de los compuestos de acuerdo con la invención se caracteriza por medio de una prueba de permeabilidad in vitro sobre "células venosas umbilicales humanas" (HUVEC). Usando el aparato EOS (EC IS: Detección de impedancia de sustrato de célula eléctrica; Applied Biophysics Inc; Troy, NY), es posible medir variaciones continuas en la resistencia eléctrica transendotelial (RETE) a través de una monocapa de células endoteliales recubierta de electrodos de oro. Las HUVEC se siembran en una placa de electrodos de sensor de 96 pocillos (96W1 E, Ibidi GmbH, Martinsried, Alemania). La hiperpermeabilidad de la monocapa de células confluentes formada se induce mediante estimulación con cininógeno, precalicreína y factor XII (100 nM cada uno). Los compuestos, de acuerdo con la invención, se añaden antes de la adición de las sustancias indicadas anteriormente. Las concentraciones habituales de los compuestos son 1 x 10-10 a 1 x 10-6 M.

a. 6) Determinación de la permeabilidad in vitro de células endoteliales

En otro modelo de hiperpermeabilidad, se determina la actividad de las sustancias sobre la modulación de la permeabilidad macromolecular. Las HUVEC se siembran en una membrana de filtro Transwell recubierta de fibronectina (placas de 24 pocillos, inserción de 6,5 mm con membrana de policarbonato de 0,4 pM; Costar n.° 3413). La membrana del filtro separa el espacio de cultivo celular superior del inferior, con la capa de células endoteliales confluentes en el suelo del espacio de cultivo celular superior. Se añaden 250 g/ml de dextrano FITC de 40 kDa (Invitrogen, D1844) al medio de la cámara superior. La hiperpermeabilidad de la monocapa es inducida por estimulación con cininógeno, precalicreína y factor XII (100 nM cada uno). Cada 30 min, se extraen muestras de medio de la cámara inferior y se determina la fluorescencia relativa como parámetro para los cambios en la permeabilidad macromolecular en función del tiempo mediante un fluorímetro. Los compuestos de acuerdo con la invención se añaden antes de la adición de las sustancias indicadas anteriormente. Las concentraciones habituales de los compuestos son 1 x 10-10 a 1 x 10-6 M.

b) Determinación de la actividad antitrombótica (in vivo)

b. 1) Modelo de trombosis arterial (trombosis inducida por cloruro de hierro (II)) junto con el tiempo de hemorragia del oído en conejos

La actividad antitrombótica de los inhibidores de FXIa se prueba en un modelo de trombosis arterial. La formación de trombos se desencadena al causar una lesión química en una región de la arteria carótida en los conejos. Simultáneamente, se determina el tiempo de sangrado del oído.

Conejos macho (Crl: KBL (NZW) BR, Charles River) que reciben una dieta normal y tienen un peso corporal de 2,2 -2,5 kg se anestesian mediante la administración intramuscular de xilazina y cetamina (Rompun, Bayer, 5 mg/kg y Ketavet, GmbH Pharmacia y Upjohn, 40 mg/kg de peso corporal). Además, la anestesia se mantiene mediante la administración intravenosa de las mismas preparaciones (bolo: infusión continua) a través de la vena auricular derecha.

Se expone la arteria carótida derecha y luego se produce la lesión del vaso envolviendo un trozo de papel de filtro (10 mm x 10 mm) en una tira de Parafilm® (25 mm x 12 mm) alrededor de la arteria carótida sin alterar el flujo sanguíneo. El papel de filtro contiene 100 pl de una solución al 13 % de cloruro de hierro (II) (Sigma) en agua. Después de 5 min, se retira el papel de filtro y el recipiente se enjuaga dos veces con una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,9 %. 30 minutos después de la lesión, se extrae quirúrgicamente la región lesionada de la arteria carótida y se extrae y se pesa cualquier material trombótico.

Las sustancias de prueba se administran por vía intravenosa a los animales anestesiados a través de la vena femoral o por vía oral a los animales despiertos mediante sonda, en cada caso 5 min y 2 h, respectivamente, antes de la lesión.

El tiempo de sangrado del oído se determina 2 min después de la lesión de la arteria carótida. Para ello, se afeita la oreja izquierda y se hace una incisión definida de 3 mm de largo (hoja art. Número 10-150-10, Martin, Tuttlingen, Alemania) paralela al eje longitudinal de la oreja. Aquí se tiene cuidado de no dañar los vasos visibles. La sangre que se extravasa se extrae en intervalos de 15 segundos utilizando trozos de papel de filtro pesados con precisión, sin tocar la herida directamente. El tiempo de sangrado se calcula como el tiempo desde que se hace la incisión hasta el momento en que no se puede detectar más sangre en el papel de filtro. El volumen de sangre extravasada se calcula después de pesar los trozos de papel de filtro.

c) Determinación del efecto sobre la formación de extravasación/edema, o neovascularización en el ojo (in vivo)

c. 1) Prueba de eficacia de sustancias en el modelo de neovascularización coroidea inducida por láser

Este estudio sirve para investigar la eficacia de una sustancia de prueba en la reducción de la formación de extravasación/edema, o neovascularización conoidea en el modelo de rata de neovascularización conoidea inducida por láser.

Con este fin, se seleccionan ratas pigmentadas de la cepa Brown-Norway que no muestran ningún signo de trastornos oftálmicos y distribuyen aleatoriamente en grupos de tratamiento. El día 0, los animales se anestesian mediante inyección intraperitoneal (15 mg/kg de xilacina y 80 mg/kg de cetamina). Después de la instilación de una gota de una solución de tropicamida al 0,5 % para dilatar las pupilas, se activa la neovascularización coroidea en seis ubicaciones definidas alrededor del nervio óptico mediante un fotocoagulador de láser de argón de 532 nm (diámetro 50-75 pm, intensidad de 150 mW, duración de 100 ms). La sustancia de prueba y el vehículo apropiado (por ejemplo, PBS, solución salina isotónica) se administran sistémicamente por vía oral o intraperitoneal, o por vía tópica en el ojo mediante administración repetida como gotas para los ojos o inyección intravítrea. El peso corporal de todos los animales se determina antes del inicio del estudio y luego diariamente durante el estudio.

El día 21, se lleva a cabo una angiografía mediante una cámara de fondo de ojo de fluorescencia (por ejemplo, Kowe, HRA). Bajo anestesia y después de otra dilatación de la pupila, se inyecta por vía subcutánea (s.c.) un colorante de fluoresceína sódica al 10%. 2-10 minutos más tarde, se toman fotografías del fondo del ojo. El grado de extravasación/edema, representado por la fuga de fluoresceína, es evaluado por dos o tres observadores con enmascaramiento y clasificado en grados de gravedad de 0 (sin extravasación) a 3 (coloración fuerte que excede la lesión real).

Los animales se sacrifican el día 23, tras lo cual se extirpan los ojos y se fijan en una solución de paraformaldehído al 4 % durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado, la retina se despega cuidadosamente y el complejo esclerótica-coroidea se tiñe con un anticuerpo de isolectina B4 FITC y, a continuación, se aplica plano a un portaobjetos de microscopio. Las preparaciones obtenidas de esta manera se evalúan mediante un microscopio de fluorescencia (Apotom, Zeiss) a una longitud de onda de excitación de 488 nm.

El área o volumen de la neovascularización coroidea (en pm2 y pirP, respectivamente) se calcula mediante análisis morfométrico utilizando el software Axiovision 4,6.

c.2) Prueba de eficacia de sustancias en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno

Se ha demostrado que la retinopatía inducida por oxígeno es un modelo animal útil para el estudio de la angiogénesis retiniana patológica. Este modelo se basa en la observación de que la hiperoxia durante el desarrollo postnatal precoz en la retina provoca la detención o el retraso del crecimiento de los vasos sanguíneos retinianos normales. Cuando, después de una fase de hiperoxia de 7 días, los animales vuelven al aire ambiente normóxico, esto equivale a una hipoxia relativa, ya que a la retina le faltan los vasos normales que se requieren para garantizar un suministro adecuado de tejido neural en condiciones normóxicas. La situación isquémica provocada de esta manera da como resultado una neovascularización anormal que tiene algunas similitudes con la neovascularización patofisiológica en trastornos oculares tales como la DME húmeda. Además, la neovascularización causada es altamente reproducible, cuantificable y un parámetro importante para examinar los mecanismos de la enfermedad y los posibles tratamientos para diversas formas de trastornos de la retina.

El objetivo de este estudio es examinar la eficacia de las dosis administradas sistémicamente diarias del compuesto de prueba sobre el crecimiento de los vasos retinianos en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno. Se exponen ratones C57Bl/6 recién nacidos y sus madres a hiperoxia (70 % de oxígeno) en el día 7 después del nacimiento (DDN7) durante 5 días. Desde el DDN12, los ratones se mantienen en condiciones normóxicas (aire ambiente, 21 % de oxígeno) hasta el DDN17. Desde el día 12 al día 17, los ratones se tratan diariamente con la sustancia de prueba o el vehículo correspondiente. El día 17, todos los ratones se anestesian con isoflurano y luego se sacrifican por fractura cervical. Se extirpan los ojos y se fijan en formalina al 4 %. Después de lavar en solución salina tamponada con fosfato, se escinde la retina, se produce una preparación plana de la misma y se tiñe con anticuerpo de isolectina B4. La cuantificación de la neovascularización se realiza mediante un Zeiss ApoTome.

C) Ejemplos de trabajo de composiciones farmacéuticas

Las sustancias de acuerdo con la invención se pueden convertir en preparados farmacéuticos de la siguiente manera.

Comprimido:

Composición

100 mg del compuesto del ejemplo 1, 50 mg de lactosa (monohidrato), 50 mg de almidón de maíz, 10 mg de polivinilpirrolidona (PVP 25) (de BASF, Alemania) y 2 mg de estearato de magnesio.

Peso del comprimido de 212 mg. Diámetro de 8 mm, radio de curvatura de 12 mm.

Producción

Se granula la mezcla del compuesto del ejemplo 1, lactosa y almidón con una solución al 5 % (m/m) de PVP en agua.

Tras el desecado, los gránulos se mezclan con el estearato de magnesio durante 5 min. Esta mezcla se comprime en una prensa de comprimidos convencional (véase la información sobre el formato del comprimido anterior).

Suspensión Oral

Composición

1000 mg del compuesto del ejemplo 1, 1000 mg de etanol (96 %), 400 mg de Rhodigel (goma xantana) (de FMC, EE. UU.) y 99 g de agua.

10 ml de suspensión oral corresponden a una dosis única de 100 mg del compuesto de la invención.

Producción

El Rhodigel se suspende en etanol y el compuesto del ejemplo 1 se añade a la suspensión. Se añade el agua mientras se agita. La mezcla se agita durante aproximadamente 6 h hasta que se completa el hinchamiento del Rhodigel. Solución o suspensión para administración tópica en el ojo (colirio)

Se puede preparar una preparación farmacéutica estéril para administración tópica en el ojo reconstituyendo un liofilizado del compuesto de la invención en solución salina estéril. Los conservantes adecuados para dicha solución o suspensión son, por ejemplo, cloruro de benzalconio, tiomersal o nitrato de fenilmercurio en un intervalo de concentración del 0,001 al 1 por ciento en peso.

Solución o suspensión para la administración tópica en el ojo (colirio)

Se puede preparar una preparación farmacéutica estéril para administración tópica en el ojo reconstituyendo un liofilizado del compuesto de la invención en solución salina estéril. Los conservantes adecuados para dicha solución o suspensión son, por ejemplo, cloruro de benzalconio, tiomersal o nitrato de fenilmercurio en un intervalo de concentración del 0,001 al 1 por ciento en peso.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. El compuesto 5-({6-am¡no-2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-metilhexanoil}amino)pirazol[1,5-a]piridin-3-carboxamida de formula (I)

o una de las sales del mismo, uno de los solvatos del mismo o uno de los solvatos de las sales del mismo.

2. El compuesto trifluoroacetato de 5-({6-am¡no-2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lhexano¡l}amino)p¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-3-carboxam¡da de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula (la)

3. El compuesto 5-({(2S)-6-am¡no-2-[4-(5-cloro-2-c¡anofen¡l)-5-metox¡-2-oxop¡r¡d¡n-1(2H)-¡l]-3-met¡lhexano¡l}am¡no)p¡razol[1,5-a]p¡r¡d¡n-3-carboxam¡da de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula (Ib)

o una de las sales del m¡smo, uno de los solvatos del m¡smo o uno de los solvatos de las sales del m¡smo.

4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades.

5. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para producir un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades.

6. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para producir un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos trombóticos o tromboembólicos.

7. El medicamento de acuerdo con la reivindicación 5 para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos trombóticos o tromboembólicos.

8. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos trombóticos o tromboembólicos mediante una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención.

9. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en muestras biológicas que contienen precalicreína plasmática (PCP) o calicreína plasmática (CP) para prevenir los efectos perturbadores causados por el recambio de sustratos fisiológicos y artificiales por parte de la CP.