ES2920198B2 - Aspergillus tubingensis strain and its use for the isolation of nematicidal compounds - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Cepa de aspergillus tubingensis y su uso para el aislamiento de compuestos nematicidas Aspergillus tubingensis strain and its use for the isolation of nematicidal compounds
Campo de la invenciónfield of invention
La presente invención pertenece al campo técnico de los compuestos para el control de plagas en cultivos, más específicamente compuestos nematicidas.The present invention belongs to the technical field of compounds for controlling pests in crops, more specifically nematicidal compounds.
Se describe el aislamiento de compuestos de una nueva cepa de la especie Aspergillus tubingensis, a la que también se refiere la presente invención.The isolation of compounds from a new strain of the species Aspergillus tubingensis , to which the present invention also relates, is described.
Otros aspectos de la invención son composiciones que comprenden los compuestos nematicidas aislados de la nueva cepa de la especie Aspergillus tubingensis, y el procedimiento para el control de nematodos en cultivos.Other aspects of the invention are compositions that comprise nematicidal compounds isolated from the new strain of the species Aspergillus tubingensis, and the procedure for controlling nematodes in crops.
Antecedentes de la invenciónBackground of the invention
Es conocido el daño que causan los nematodos a los principales cultivos, tanto en invernaderos y plantaciones agrícolas en campo abierto, como en jardines.The damage that nematodes cause to the main crops is known, both in greenhouses and agricultural plantations in open fields, as well as in gardens.
Con el fin de controlar la enfermedad producida por nematodos se puede utilizar un control químico sobre ellos. El control químico de nematodos se realiza mediante el tratamiento con agentes químicos como carbamatos, organofosforados y similares. Aunque los nematicidas químicos, principalmente organofosforados o carbamatos, consiguen un alto control de los nematodos fitopatógenos, son altamente tóxicos cuando permanecen en el suelo, se acumulan en las plantas de cultivo y perjudican la salud humana y animal. También son causantes de contaminación ambiental debido a las acciones negativas que ejercen contra los microorganismos del suelo, que son beneficiosos para el crecimiento de los cultivos, y gradualmente hacen que el suelo se vuelva estéril.In order to control the disease caused by nematodes, chemical control can be used on them. Chemical control of nematodes is carried out through treatment with chemical agents such as carbamates, organophosphates and similar agents. Although chemical nematicides, mainly organophosphates or carbamates, achieve high control of phytopathogenic nematodes, they are highly toxic when they remain in the soil, accumulate in crop plants and harm human and animal health. They also cause environmental pollution due to the negative actions they exert against soil microorganisms, which are beneficial for the growth of crops, and gradually cause the soil to become sterile.
Por tanto, se ha evitado el uso de plaguicidas químicos debido a los problemas como la contaminación ambiental, la destrucción del ecosistema, la intoxicación por pesticidas de humanos y animales, y además ha aumentado paralelamente la demanda de productos que respeten el medio ambiente. Therefore, the use of chemical pesticides has been avoided due to problems such as environmental pollution, destruction of the ecosystem, pesticide poisoning of humans and animals, and the demand for products that respect the environment has also increased in parallel.
En esta línea, existe una creciente demanda de desarrollo de nematicidas que sean más seguros para el medio ambiente y que puedan reemplazar a los pesticidas químicos mencionados anteriormente.Along these lines, there is a growing demand for the development of nematicides that are safer for the environment and that can replace the chemical pesticides mentioned above.
En los últimos años, entre los métodos para el control de nematodos respetuosos con el medio ambiente, son cada vez más numerosos los métodos que utilizan microorganismos.In recent years, among environmentally friendly methods for controlling nematodes, methods that use microorganisms have become increasingly numerous.
Los estudios han demostrado que los microorganismos son capaces de producir diversos metabolitos que actúan directamente sobre los patógenos, disminuyendo sus efectos negativos sobre los cultivos.Studies have shown that microorganisms are capable of producing various metabolites that act directly on pathogens, reducing their negative effects on crops.
La patente europea EP3282007, se refiere a la cepa de Aspergillus niger F22 y su actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas y en concreto contra Meloidogyne spp. Este documento no describe ninguno de los compuestos activos producidos por la cepa F22.European patent EP3282007 refers to the strain of Aspergillus niger F22 and its nematicidal activity against plant parasitic nematodes and specifically against Meloidogyne spp. This document does not describe any of the active compounds produced by strain F22.
La presente invención describe una nueva cepa de Aspergillus tubingensis, su caldo de cultivo y su extracto crudo, e identifica los compuestos con actividad nematicida producidos por la misma.The present invention describes a new strain of Aspergillus tubingensis, its culture broth and its crude extract, and identifies the compounds with nematicidal activity produced by it.
Descripción de la invenciónDescription of the invention
La presente invención se refiere al aislamiento de compuestos nematicidas de una nueva cepa de Aspergillus tubingensis. The present invention relates to the isolation of nematicidal compounds from a new strain of Aspergillus tubingensis.
La nueva cepa de Aspergillus tubingensis es un microorganismo endófito. El primer aspecto de la invención es la nueva cepa de la especie Aspergillus tubingensis, (cepa de la invención o cepa de Aspergillus tubingensis de la invención referenciada como cepa BP3 en los ejemplos), que fue depositada el 15 de diciembre de 2020 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Burjassot, Valencia, España) y a la cual se le asignó el número de acceso CECT 21186.The new strain of Aspergillus tubingensis is an endophytic microorganism. The first aspect of the invention is the new strain of the species Aspergillus tubingensis, (strain of the invention or strain of Aspergillus tubingensis of the invention referenced as strain BP3 in the examples), which was deposited on December 15, 2020 in the Collection Spanish Type Crops (CECT) (Burjassot, Valencia, Spain) and to which the accession number CECT 21186 was assigned.
Otros aspectos de la invención son el caldo de fermentación y el extracto crudo extraído de la cepa de la invención.Other aspects of the invention are the fermentation broth and the crude extract extracted from the strain of the invention.
El caldo de fermentación de la cepa de la invención se obtiene a partir de un cultivo de la cepa de la invención mediante un procedimiento que comprende: The fermentation broth of the strain of the invention is obtained from a culture of the strain of the invention by a procedure that comprises:
a) cultivar la cepa de Aspergillus tubingensis de la invención, hasta que se desarrolle el micelio;a) cultivate the strain of Aspergillus tubingensis of the invention, until the mycelium develops;
b) fermentar el micelio desarrollado en a) en medio líquido;b) ferment the mycelium developed in a) in a liquid medium;
c) separar el micelio para obtener el caldo de fermentación.c) separate the mycelium to obtain the fermentation broth.
El extracto crudo de la cepa de la invención se obtiene cuando tras las etapas a)- c) arriba descritas se realiza una extracción a partir del caldo de fermentación.The crude extract of the strain of the invention is obtained when, after steps a)-c) described above, an extraction is carried out from the fermentation broth.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el procedimiento de obtención del extracto crudo que comprende las etapas de:Therefore, another aspect of the invention is the procedure for obtaining the crude extract that includes the steps of:
a) cultivar la cepa de Aspergillus tubingensis de la invención, hasta que se desarrolle el micelio;a) cultivate the strain of Aspergillus tubingensis of the invention, until the mycelium develops;
b) fermentar el micelio desarrollado en a) en medio líquido;b) ferment the mycelium developed in a) in a liquid medium;
c) separar el micelio para obtener el caldo de fermentación;c) separate the mycelium to obtain the fermentation broth;
d) realizar una extracción a partir del caldo de fermentación obtenido en c) para obtener el extracto crudo.d) perform an extraction from the fermentation broth obtained in c) to obtain the crude extract.
Esta cepa tiene actividad nematicida, por lo que otro aspecto de la invención se refiere a un agente nematicida que incluye el caldo de fermentación y/o un extracto crudo de la cepa de la invención.This strain has nematicidal activity, so another aspect of the invention refers to a nematicidal agent that includes the fermentation broth and/or a crude extract of the strain of the invention.
La invención incluye igualmente un método para controlar nematodos que comprende el siguiente paso, poner en contacto una planta, semilla, plantón, o sustrato con la cepa y/o el caldo de fermentación y/o un extracto crudo de la cepa de la invención.The invention also includes a method for controlling nematodes that comprises the following step, contacting a plant, seed, seedling, or substrate with the strain and/or the fermentation broth and/or a crude extract of the strain of the invention.
De esta cepa de la invención se aislaron una serie de compuestos de los que se comprobó su actividad nematicida.From this strain of the invention, a series of compounds were isolated and their nematicidal activity was verified.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso de la cepa de la invención para la obtención del compuesto de fórmula (I), y/o el compuesto de fórmula (II), y/o el compuesto de fórmula (III) y/o el compuesto de fórmula (IV);Therefore, another aspect of the invention is the use of the strain of the invention to obtain the compound of formula (I), and/or the compound of formula (II), and/or the compound of formula (III). and/or the compound of formula (IV);
y las sales y/o solvatos del mismo.and the salts and/or solvates thereof.
Igualmente forma parte de la invención el procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (I) y/o el compuesto de fórmula (II) y/o el compuesto de fórmula (III) y/o el compuesto de fórmula (IV), procedimiento que comprende los pasos de:Also part of the invention is the procedure for obtaining the compound of formula (I) and/or the compound of formula (II) and/or the compound of formula (III) and/or the compound of formula (IV), a procedure that includes the steps of:
a) cultivar la cepa de Aspergillus tubingensis de la invención, hasta que se desarrolle el micelio;a) cultivate the strain of Aspergillus tubingensis of the invention, until the mycelium develops;
b) fermentar el micelio desarrollado en a) en medio líquido;b) ferment the mycelium developed in a) in a liquid medium;
c) separar el micelio para obtener el caldo de fermentación;c) separate the mycelium to obtain the fermentation broth;
d) realizar una extracción, a partir del caldo de fermentación obtenido en c) para obtener el extracto crudo;d) perform an extraction, from the fermentation broth obtained in c) to obtain the crude extract;
e) aislar el compuesto de fórmula (I) y/o el compuesto de fórmula (II) y/o el compuesto de fórmula (III) y/o el compuesto de fórmula (IV).e) isolating the compound of formula (I) and/or the compound of formula (II) and/or the compound of formula (III) and/or the compound of formula (IV).
Los compuestos de fórmula (I), fórmula (II), fórmula (III) y fórmula (IV) tienen actividad nematicida, por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso de dichos compuestos como nematicidas.The compounds of formula (I), formula (II), formula (III) and formula (IV) have nematicidal activity, therefore, another aspect of the invention is the use of said compounds as nematicides.
Con los compuestos de fórmula (I) y/o fórmula (II) y/o fórmula (III) y/o fórmula (IV) se pueden formular composiciones nematicidas y por lo tanto otro aspecto de la invención es una composición para el control de nematodos que comprende como ingrediente activo al menos uno de los compuestos seleccionados entre: compuesto de fórmula (I), compuesto de fórmula (II), compuesto de fórmula (III) y compuesto de fórmula (IV) o una sal o un solvato de estos, aceptables en agricultura.With the compounds of formula (I) and/or formula (II) and/or formula (III) and/or formula (IV) nematicidal compositions can be formulated and therefore another aspect of the invention is a composition for the control of nematodes comprising as active ingredient at least one of the compounds selected from: compound of formula (I), compound of formula (II), compound of formula (III) and compound of formula (IV) or a salt or a solvate of these , acceptable in agriculture.
Por último, es un aspecto de la invención un método para controlar nematodos que comprende el paso de poner en contacto una planta, semilla, plantón, o sustrato con el compuesto de fórmula (I) y/o el compuesto de fórmula (II) y/o el compuesto de fórmula (III) y/o el compuesto de fórmula (IV). Finally, an aspect of the invention is a method for controlling nematodes that comprises the step of contacting a plant, seed, seedling, or substrate with the compound of formula (I) and/or the compound of formula (II) and /or the compound of formula (III) and/or the compound of formula (IV).
Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention
Como se ha dicho, un aspecto de la invención es la cepa de la especie Aspergillus tubingensis de la invención, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Burjassot, Valencia, España) con el número de acceso CECT 21186.As has been said, one aspect of the invention is the strain of the Aspergillus tubingensis species of the invention, deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) (Burjassot, Valencia, Spain) with the accession number CECT 21186.
Como se ha dicho antes, el extracto crudo de la cepa de la invención se obtiene a partir de un cultivo de la cepa de la invención mediante un procedimiento que comprende:As said before, the crude extract of the strain of the invention is obtained from a culture of the strain of the invention by a procedure that comprises:
a) cultivar la cepa de Aspergillus tubingensis de la invención, hasta que se desarrolle el micelio;a) cultivate the strain of Aspergillus tubingensis of the invention, until the mycelium develops;
b) fermentar el micelio desarrollado en a) en medio líquido;b) ferment the mycelium developed in a) in a liquid medium;
c) separar el micelio para obtener el caldo de fermentación;c) separate the mycelium to obtain the fermentation broth;
d) realizar una extracción del caldo de fermentación para obtener un extracto crudo.d) carry out an extraction of the fermentation broth to obtain a crude extract.
El procedimiento de obtención del caldo de fermentación comprende los pasos a) a c).The procedure for obtaining the fermentation broth includes steps a) to c).
En materializaciones de la invención se puede cultivar la cepa en un medio líquido o en un medio sólido. Preferentemente en la etapa a) el cultivo se realiza en medio sólido PDA en la oscuridad.In embodiments of the invention the strain can be grown in a liquid medium or in a solid medium. Preferably in step a) the culture is carried out in solid PDA medium in the dark.
Preferentemente en la etapa b) el medio líquido es un medio de cultivo Czapek-Dox modificado como el que se describe en el ejemplo 1. Preferentemente se fermenta entre 4 y 14 días, más preferentemente entre 5 y 8 días.Preferably in step b) the liquid medium is a modified Czapek-Dox culture medium as described in example 1. Preferably it is fermented between 4 and 14 days, more preferably between 5 and 8 days.
Preferentemente la separación de la etapa c) se realiza por filtración.Preferably, the separation of step c) is carried out by filtration.
En la etapa d) el disolvente se puede seleccionar entre: diclorometano, éter etílico y acetato de etilo. De manera particular el disolvente de la etapa d) es acetato de etilo.In step d) the solvent can be selected from: dichloromethane, ethyl ether and ethyl acetate. In particular, the solvent of step d) is ethyl acetate.
Como se ha dicho el extracto crudo de la cepa y el caldo de cultivo de la invención tienen actividad nematicida. En particular tienen actividad nematicida frente a nematodos, de manera particular del género Meloidogyne y, de manera más particular, Meloidogyne javanica As has been said, the crude extract of the strain and the culture broth of the invention have nematicidal activity. In particular, they have nematicidal activity against nematodes, particularly the genus Meloidogyne and, more particularly, Meloidogyne javanica .
Los nematodos formadores de nódulos del género Meloidogyne son uno de los principales patógenos de especies vegetales y presentan una distribución mundial. Son endoparásitos obligados, de naturaleza polífaga, e infectan más de 3000 especies vegetales cultivadas a las que causan severos daños con las consiguientes pérdidas económicas. La infección se produce cuando el juvenil de segunda edad (J2), móvil e infectivo, es atraído por el sistema radical de la planta huésped. Durante todo su ciclo vital el nematodo permanece en el interior de la raíz y la infección afecta al crecimiento de la planta, causa marchitamiento, aumenta su susceptibilidad a otros patógenos y en determinadas condiciones puede causar su muerte.Nodule-forming nematodes of the genus Meloidogyne are one of the main pathogens of plant species and have a worldwide distribution. They are obligate endoparasites, polyphagous in nature, and infect more than 3000 cultivated plant species, causing severe damage with consequent economic losses. The infection is It occurs when the second-age juvenile (J2), mobile and infective, is attracted by the root system of the host plant. Throughout its life cycle the nematode remains inside the root and the infection affects the growth of the plant, causes wilting, increases its susceptibility to other pathogens and in certain conditions can cause its death.
Como se ha dicho igualmente forma parte de la invención el procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (I) y/o el compuesto de fórmula (II) y/o el compuesto de fórmula (III) y/o el compuesto de fórmula (IV), procedimiento que comprende los pasos a) a e) previamente descritos y una última etapa f) donde la etapa f) es aislar el compuesto de fórmula (I) y/o el compuesto de fórmula (II) y/o el compuesto de fórmula (III) y/o el compuesto de fórmula (IV).As has been said, the procedure for obtaining the compound of formula (I) and/or the compound of formula (II) and/or the compound of formula (III) and/or the compound of formula (IV) also forms part of the invention. ), procedure comprising steps a) to e) previously described and a last step f) where step f) is to isolate the compound of formula (I) and/or the compound of formula (II) and/or the compound of formula (III) and/or the compound of formula (IV).
Preferentemente el aislamiento se realiza por técnicas de fraccionamiento.Preferably, isolation is carried out by fractionation techniques.
En materializaciones de la invención las técnicas de fraccionamiento se pueden seleccionar entre: cromatografía líquida de vacío, cromatografía en columna, cromatografía en columna empleando diferentes fases solidas (gel de sílice, sephadex LH-20) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), eluyéndose con distintos gradientes de polaridad mediante diferentes combinaciones de disolventes orgánicos.In embodiments of the invention, the fractionation techniques can be selected between: vacuum liquid chromatography, column chromatography, column chromatography using different solid phases (silica gel, sephadex LH-20) and high-performance liquid chromatography (HPLC), eluting with different polarity gradients using different combinations of organic solvents.
Como se ha dicho otro aspecto, de la invención se refiere a una composición para el control de nematodos que comprende como ingrediente activo al menos uno de los compuestos seleccionados entre: compuesto de fórmula (I), compuesto de fórmula (II), compuesto de fórmula (III) y compuesto de fórmula (IV) o una sal o un solvato de estos, aceptables en agricultura.As another aspect has been said, the invention refers to a composition for the control of nematodes that comprises as an active ingredient at least one of the compounds selected from: compound of formula (I), compound of formula (II), compound of formula (III) and compound of formula (IV) or a salt or solvate thereof, acceptable in agriculture.
La composición de la invención adicionalmente puede comprender diversos vehículos y agentes que faciliten su conservación, manejo y aplicación.The composition of the invention may additionally comprise various vehicles and agents that facilitate its conservation, handling and application.
Los vehículos se seleccionan entre: vehículos sólidos, vehículos líquidos, vehículos gaseosos.The vehicles are selected from: solid vehicles, liquid vehicles, gaseous vehicles.
En materializaciones de la invención se puede seleccionar los agentes entre tensioactivos y auxiliares para la formulación de composiciones de la invención.In embodiments of the invention, the agents can be selected from surfactants and auxiliaries for the formulation of compositions of the invention.
Por ejemplo, se puede adicionar a la composición un aditivo para formular formas tales como concentrados, polvos humectables, líquidos fluibles, (ej. suspensión en agua, emulsión en agua, entre otros), polvos, aerosoles. For example, an additive can be added to the composition to formulate forms such as concentrates, wettable powders, flowable liquids (e.g. suspension in water, emulsion in water, among others), powders, aerosols.
Ejemplos de vehículo sólido que se incluyen en el ámbito de la invención son polvos finos o gránulos de arcillas (ej. arcilla de caolín, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, bentonita, arcilla Fubasaml, arcilla ácida), talcos, cerámicas y otros minerales inorgánicos, como, por ejemplo, sericita, cuarzo, azufre, carbono activo, carbonato cálcico, sílice hidratada, fertilizantes comerciales como sulfato amónico, fosfato amónico, nitrato amónico, urea, cloruro amónico.Examples of solid carriers that fall within the scope of the invention are fine powders or granules of clays (e.g. kaolin clay, diatomaceous earth, synthetic hydrated silicon oxide, bentonite, Fubasaml clay, acid clay), talcs, ceramics and other inorganic minerals, such as, for example, sericite, quartz, sulfur, active carbon, calcium carbonate, hydrated silica, commercial fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea, ammonium chloride.
Ejemplos de vehículo líquido que se incluyen en el ámbito de la invención son agua, alcoholes (ej., metanol, etanol), cetonas (ej., acetona, metil etil cetona) , hidrocarburos aromáticos (ej., benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, metilnaftaleno), hidrocarburos alifáticos (ej. hexano, ciclohexano, queroseno, gasoil) , ésteres (ej., acetato de etilo, acetato de butilo), nitrilos (ej., acetonitrilo, isobutironitrilo), éteres (ej., éter diisopropílico, dioxano) , amidas de ácido (ej., N, N-dimetilformamida, N, N-dimetilacetamida), hidrocarburos halogenados (ej., dicloroetano, tricloroetano, tetracloruro de carbono), sulfóxido de dimetilo, aceites vegetales (ej., aceite de soja, aceite de semilla de algodón).Examples of liquid carriers that fall within the scope of the invention are water, alcohols (e.g., methanol, ethanol), ketones (e.g., acetone, methyl ethyl ketone), aromatic hydrocarbons (e.g., benzene, toluene, xylene, ethylbenzene, methylnaphthalene), aliphatic hydrocarbons (e.g. hexane, cyclohexane, kerosene, diesel oil), esters (e.g. ethyl acetate, butyl acetate), nitriles (e.g. acetonitrile, isobutyronitrile), ethers (e.g. diisopropyl ether , dioxane), acid amides (e.g., N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide), halogenated hydrocarbons (e.g., dichloroethane, trichloroethane, carbon tetrachloride), dimethyl sulfoxide, vegetable oils (e.g., oil soybean, cottonseed oil).
Ejemplos de vehículo gaseoso que se incluyen en el ámbito de la invención son agente de pulverizado, incluyendo gas butano, LPG (gas licuado de petróleo), éter dimetílico, gas de dióxido de carbono.Examples of gaseous carrier that fall within the scope of the invention are spray agent, including butane gas, LPG (liquefied petroleum gas), dimethyl ether, carbon dioxide gas.
Ejemplos de agente tensioactivo que se incluyen en el ámbito de la invención son: sulfatos de alquilo, sales de sulfonato de alquilo, alquil aril sulfonatos, ésteres alquil arílicos, compuestos de polioxietileno de los mismos, ésteres polietílen glicólicos, ésteres de alcohol polihidroxílico y derivados de alcohol de azúcar.Examples of surfactants that fall within the scope of the invention are: alkyl sulfates, alkyl sulfonate salts, alkyl aryl sulfonates, alkyl aryl esters, polyoxyethylene compounds thereof, polyethylene glycolic esters, polyhydroxy alcohol esters and derivatives. of sugar alcohol.
Ejemplos de agente auxiliar para la formulación como agente de fijación y agente de dispersión que se incluyen en la invención son caseína, gelatina, polisacáridos (ej., polvo de almidón, goma arábiga, derivado de celulosa, ácido algínico), derivados de lignina, bentonita, azúcares, polímeros hidrosolubles sintéticos (ej., polialcohol vinílico,polipirrolidona de vinilo, poliácidos acrílicos).Examples of auxiliary agent for formulation as fixing agent and dispersing agent that are included in the invention are casein, gelatin, polysaccharides (e.g., starch powder, gum arabic, cellulose derivative, alginic acid), lignin derivatives, bentonite, sugars, synthetic water-soluble polymers (e.g., polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acids).
Ejemplos de estabilizantes que se incluyen en el ámbito de la invención son PAP (fosfato de ácido isopropílico), BHT (2, 6-di-terc-butil-4-metilfenol), BHA (mezcla de 2-terc-butil-4metoxifenol y 3-terc-butil-4-metoxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, agentes tensioactivos, ácidos grasos o ésteres de los mismos. Examples of stabilizers that fall within the scope of the invention are PAP (isopropyl acid phosphate), BHT (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol), BHA (mixture of 2-tert-butyl-4methoxyphenol and 3-tert-butyl-4-methoxyphenol), vegetable oils, mineral oils, surfactants, fatty acids or esters thereof.
El caldo de fermentación, el extracto crudo y las composiciones de la invención se pueden utilizar conjuntamente con al menos otro ingrediente activo adicional. Ejemplos de ingrediente activo adicional son insecticidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, fertilizantes, acondicionadores del suelo y cebos para animales.The fermentation broth, the crude extract and the compositions of the invention can be used together with at least one other additional active ingredient. Examples of additional active ingredient are insecticides, acaricides, fungicides, herbicides, plant growth regulators, fertilizers, soil conditioners and animal baits.
EjemplosExamples
Ejemplo 1: Preparación del cultivoExample 1: Crop preparation
Se comenzó con la realización de un cultivo en medio sólido PDA (Potato, dextrose y agar) de una muestra de la cepa del hongo Aspergillus tubingensis de la invención (denominada BP3 en los ejemplos) conservada a -80°C. La placa sembrada sellada con parafilm se incubó a 25°C en oscuridad en una cámara a cultivo durante 8 días. Posteriormente se prepararon varias réplicas que fueron cultivadas en las mismas condiciones para tener material e iniciar la fermentación en medio líquido.It began with carrying out a culture in solid PDA medium (Potato, dextrose and agar) of a sample of the strain of the fungus Aspergillus tubingensis of the invention (called BP3 in the examples) preserved at -80°C. The seeded plate sealed with parafilm was incubated at 25°C in the dark in a culture chamber for 8 days. Subsequently, several replicas were prepared that were grown under the same conditions to have material and start fermentation in a liquid medium.
Preparación de los pre-inóculos.Preparation of pre-inocula.
Se prepararon matraces Erlenmeyer de 250 mL con un volumen de 50 mL de medio de cultivo Czapek-Dox modificado. [NaNO3 (2 g/L), KH2PO4 (5 g/L), MgSÜ4 (0,5 g/L), FeSO4 (0,01 g/L), ZnSÜ4 (0,003 g/L), extracto de levadura (1 g/L) y glucosa (60 g/L)]. Los matraces fueron esterilizados en autoclave durante 25 minutos a 121°C. Cada uno de ellos fue inoculado bajo condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar con el raspado del micelio de una placa a la que se le ha añadido sobre la superficie de la colonia 10mL de agua estéril. Finalizado el proceso de raspado se procedió a la incubación en una cámara de cultivo a 25°C y agitación continua en un agitador orbital (120 rpm) durante 3 días.250 mL Erlenmeyer flasks were prepared with a volume of 50 mL of modified Czapek-Dox culture medium. [NaNO 3 (2 g/L), KH 2 PO 4 (5 g/L), MgSÜ 4 (0.5 g/L), FeSO 4 (0.01 g/L), ZnSÜ 4 (0.003 g/L ), yeast extract (1 g/L) and glucose (60 g/L)]. The flasks were autoclaved for 25 minutes at 121°C. Each of them was inoculated under sterile conditions under a laminar flow hood by scraping the mycelium from a plate to which 10mL of sterile water had been added to the surface of the colony. Once the scraping process was completed, the incubation was carried out in a culture chamber at 25°C and continuous shaking in an orbital shaker (120 rpm) for 3 days.
Proceso de fermentaciónFermentation process
La fermentación se llevó a cabo en matraces de 500 ml con un volumen de 200 mL de medio de cultivo durante 5, 8 y 12 días en las mismas condiciones descritas de agitación y temperatura. Como inóculo se utilizó un volumen de 10mL del cultivo de los pre-inóculos por matraces.Fermentation was carried out in 500 ml flasks with a volume of 200 mL of culture medium for 5, 8 and 12 days under the same shaking and temperature conditions described. A volume of 10 mL of the pre-inocula culture per flask was used as inoculum.
Obtención del extracto crudoObtaining the crude extract
Los extractos crudos se obtuvieron a partir de cultivos de 5, 8 y 12 días de la cepa BP3, el micelio se separó del medio por filtración a vacío sobre un embudo Büchner. Se registró el valor del pH del medio líquido (pH=4.31) y se realizó una extracción líquido-líquido con acetato de etilo como disolvente orgánico. El proceso se repitió tres veces secando las fases orgánicas sobre Na2SO4. La eliminación del disolvente a presión reducida en un rotavapor condujo a la obtención de los extractos crudos con rendimientos de 1,3, 2,8 y 2,4 g/L, respectivamente.The crude extracts were obtained from 5, 8 and 12 day cultures of strain BP3, the mycelium was separated from the medium by vacuum filtration on a Büchner funnel. The pH value of the liquid medium was recorded (pH=4.31) and a liquid-liquid extraction was performed with acetate. ethyl as organic solvent. The process was repeated three times drying the organic phases over Na 2 SO 4 . Removal of the solvent under reduced pressure in a rotary evaporator led to obtaining the crude extracts with yields of 1.3, 2.8 and 2.4 g/L, respectively.
Ejemplo 2. Ensayo de la actividad biológica del extracto obtenido en el Ejemplo 1Example 2. Test of the biological activity of the extract obtained in Example 1
Ensayo de actividad biológicaBiological activity assay
La especie de nematodo utilizada como especie diana en el ensayo de actividad biológica del extracto fue Meloidogyne javanica. The nematode species used as the target species in the biological activity test of the extract was Meloidogyne javanica.
Actividad nematicida: Ensayos in vitro con juveniles infectivos (J2)Nematicidal activity: In vitro tests with infective juveniles (J2)
Se utilizaron placas estériles para cultivo celular de 96 pocillos con fondo en U. A cada pocillo se añadió 5 μl del extracto a una concentración de 20 μg/ μl y 95 μl de agua con aproximadamente 100 J2. La concentración final del extracto y/o tratamiento a ensayar fue de 1 μg/ μl. Se realizaron 4 repeticiones por tratamiento. Los controles incluyeron 95 μl de agua con nematodos más 5μl de solución acuosa con el mismo disolvente utilizado (DMSO+Tween 0,6%) para los tratamientos. La distribución de las muestras se realizó en grupos de 4 al azar y dejando la fila y la columna externas rellenas de agua para mantener la humedad y evitar el efecto borde. La placa se incubó en oscuridad a 24°C durante 72 horas.Sterile 96-well U-bottom cell culture plates were used. 5 μl of the extract at a concentration of 20 μg/μl and 95 μl of water with approximately 100 J2 were added to each well. The final concentration of the extract and/or treatment to be tested was 1 μg/μl. 4 repetitions were carried out per treatment. The controls included 95 μl of water with nematodes plus 5 μl of aqueous solution with the same solvent used (DMSO+Tween 0.6%) for the treatments. The distribution of the samples was carried out in groups of 4 at random and leaving the outer row and column filled with water to maintain humidity and avoid the edge effect. The plate was incubated in the dark at 24°C for 72 hours.
Pasado el periodo de incubación se realizó el recuento de nematodos muertos y vivos en un microscopio estereoscópico. Los datos de actividad nematicida se presentaron como porcentaje de mortalidad de J2 corregido según la fórmula de Scheider-Orelli.After the incubation period, dead and live nematodes were counted under a stereoscopic microscope. Nematicidal activity data were presented as J2 mortality percentage corrected according to the Scheider-Orelli formula.
Los extractos del Ejemplo 1 fueron activos sobre M. javanica con 100% de mortalidad.The extracts of Example 1 were active on M. javanica with 100% mortality.
Ejemplo 3. Fraccionamiento biodirigido del extracto crudoExample 3. Biodirected fractionation of the crude extract
Técnicas utilizadas para el fraccionamiento y caracterización químicaTechniques used for fractionation and chemical characterization
Cromatografía en columna (CC)Column chromatography (CC)
Para la cromatografía en fase normal se usó sílica gel y un gradiente de hexano-acetato de etilo-metanol de polaridades crecientes (5 cm diámetro, 15 cm h, Si 35-70 um). For normal phase chromatography, silica gel and a hexane-ethyl acetate-methanol gradient of increasing polarities (5 cm diameter, 15 cm h, Si 35-70 um) were used.
Cromatografía de HPLC preparativaPreparative HPLC Chromatography
Se utilizó una bomba de HPLC (Varian ProStar 210) y una columna Interchrom KR5/25M. El flujo fue de 20 ml/min colectado en tubos de 10 ml a la mitad de su capacidad con un colector Gilson FC203B.An HPLC pump (Varian ProStar 210) and an Interchrom KR5/25M column were used. The flow rate was 20 ml/min collected in 10 ml tubes at half capacity with a Gilson FC203B collector.
Cromatografía de exclusión molecularSize exclusion chromatography
Se utilizó como soporte Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) para la fase estacionaria y como eluyente una mezcla de disolventes n-hexano:CH2Cl2:MeOH en distintas proporciones, dependiendo de la polaridad de la muestra a cromatografiar.Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) was used as a support for the stationary phase and a mixture of solvents n-hexane:CH 2 Cl 2 :MeOH in different proportions, depending on the polarity of the sample to be chromatographed, as eluent.
Cromatografía en Capa Fina (CCF)Thin Layer Chromatography (TLC)
El seguimiento de las columnas cromatográficas se llevó a cabo mediante cromatografía en capa fina, usando cromatofolios comerciales de gel de sílice 60 F254 con base de aluminio (20 x 20 cm, art. 5554) y óxido de aluminio neutro 60 F254 con base de aluminio (20 x 20 cm, art. 5550), adquiridas en la casa comercial Merck. En el sistema de elución se utilizaron los mismos disolventes y polaridades que en las columnas cromatográficas. El revelado de los cromatofolios se realizó utilizando el reactivo óleum/vainillina para detectar los compuestos, mediante pulverización sobre los cromatofolios y calor.The monitoring of the chromatographic columns was carried out by thin layer chromatography, using commercial chromatographs of silica gel 60 F254 with aluminum base (20 x 20 cm, art. 5554) and neutral aluminum oxide 60 F254 with aluminum base (20 x 20 cm, art. 5550), purchased from Merck. The same solvents and polarities were used in the elution system as in the chromatographic columns. The development of the chromatographs was carried out using the oleum/vanillin reagent to detect the compounds, by spraying on the chromatographs and heat.
OLEUM: está compuesto por una mezcla de ácido sulfúrico (4%), ácido acético (80%) y agua destilada (16%). Las placas se pulverizaron con este reactivo y se visualizaron aplicando calor (110°C-130 °C).OLEUM: is composed of a mixture of sulfuric acid (4%), acetic acid (80%) and distilled water (16%). The plates were sprayed with this reagent and visualized by applying heat (110°C-130°C).
VAINILLINA: 0,5 g vainillina, 100 ml ácido sulfúrico/etanol (40:10).VANILLIN: 0.5 g vanillin, 100 ml sulfuric acid/ethanol (40:10).
Cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS)Mass coupled gas chromatography (GC-MS)
Para la determinación cualitativa y cuantitativa de los compuestos presentes en los aceites esenciales y fracciones volátiles se utilizó como metodología la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (GC-MS), se utilizó un equipo Shimadzu GC-2010 acoplado a un detector de masas Shimadzu GCMS-QP2010-Ultra con una fuente ionización por impacto electrónico a 70 eV y utilizando un analizador Quadrupolo Simple. Se utilizó Helio como gas portador. La cromatografía se llevó a cabo con una columna capilar Teknokroma TRB-5 (95%) Dimetil-(5%) diphenylpolisiloxane, 30 m x 0,25 mm ID y 0,25 ^m de espesor de fase. Las condiciones de trabajo utilizadas fueron: inyección en modo Split inyectando 1 ^l de muestra con una relación de división (20:1), temperatura del inyector 300°C, temperatura de la línea de transferencia conectada al espectrómetro de masas 250°C y temperatura de la fuente de ionización 220°C. La temperatura de la columna inicial fue de 70°C, calentando hasta 290°C a 6°C/min y dejando a 290°C durante 15 min. Los espectros de masas y el tiempo de retención fueron utilizados para identificar los compuestos por comparación con los encontrados en la base de datos Wiley (Wiley 275 Mass Spectra Database, 2001), mientras que para la cuantificación se utilizaron los % de área relativos de todos los picos obtenidos en los cromatogramas.For the qualitative and quantitative determination of the compounds present in the essential oils and volatile fractions, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used as a methodology; a Shimadzu GC-2010 equipment coupled to a gas detector was used. Shimadzu GCMS-QP2010-Ultra masses with an electron impact ionization source at 70 eV and using a Simple Quadrupole analyzer. Helium was used as carrier gas. Chromatography was carried out with a Teknokroma TRB-5 (95%) Dimethyl-(5%) diphenylpolysiloxane capillary column, 30 m x 0.25 mm ID and 0.25 ^m phase thickness. The working conditions used were: injection in Split mode injecting 1 ^l of sample with a split ratio (20:1), injector temperature 300°C, temperature of the transfer line connected to the mass spectrometer 250°C and ionization source temperature 220°C. The initial column temperature was 70°C, heating to 290°C at 6°C/min and leaving at 290°C for 15 min. The mass spectra and retention time were used to identify the compounds by comparison with those found in the Wiley database (Wiley 275 Mass Spectra Database, 2001), while the relative area % of all were used for quantification. the peaks obtained in the chromatograms.
De forma general, los espectros RMN (1H y 13C) fueron obtenidos con espectrómetros Bruker Advance-AMX-500 (1H 500 MHz/13C 125 MHz). Para alta resolución MS se utilizó un espectrómetro de masas Micromass LCT Premier. Para los espectros IR se utilizó un espectrómetro Perkin Elmer modelo 1600 FT-IR y las actividades ópticas [a]o se midieron en un polarímetro Perkin Elmer, modelo 343 usando la línea D de una lámpara de sodioIn general, NMR spectra (1H and 13C) were obtained with Bruker Advance-AMX-500 spectrometers (1H 500 MHz/13C 125 MHz). A Micromass LCT Premier mass spectrometer was used for high resolution MS. For the IR spectra, a Perkin Elmer model 1600 FT-IR spectrometer was used and the optical activities [a]o were measured in a Perkin Elmer, model 343 polarimeter using the D line of a sodium lamp.
Fraccionamiento biodirigido del extracto crudoBiodirected fractionation of the crude extract
300 mg del extracto crudo obtenido a los 5 días de cultivo se fraccionaron en una columna Sephadex-LH-20 con una mezcla de n-hexano:DCM:MeOH (2:1:1). Se aisló el compuesto 2 de fórmula (II) (45 mg).300 mg of the crude extract obtained after 5 days of culture were fractionated on a Sephadex-LH-20 column with a mixture of n-hexane:DCM:MeOH (2:1:1). Compound 2 of formula (II) (45 mg) was isolated.
El fraccionamiento del extracto crudo obtenido a los 8 días (400 mg) se realizó en una columna cromatográfica de Sephadex-LH-20 con mezclas crecientes en polaridad de nhexano:DCM:MeOH (3:1:1)-(2:1:1) y permitió identificar a partir de las fracciones activas los compuestos (3) (9 mg) y (4) (11 mg).The fractionation of the crude extract obtained after 8 days (400 mg) was carried out on a Sephadex-LH-20 chromatographic column with increasing mixtures in polarity of nhexane:DCM:MeOH (3:1:1)-(2:1: 1) and allowed the identification of compounds ( 3 ) (9 mg) and ( 4 ) (11 mg) from the active fractions.
El fraccionamiento del extracto crudo de 12 días de cultivo se llevó a cabo en una columna cromatográfica flash de gel de sílice (5 cm diámetro, 15 cm h, Si 35-70 um) con 4 gramos del extracto en 250 gramos de sílica. Se realizó una elución por gradiente con 4 volúmenes de 500 ml para cada polaridad empleando como eluyente mezclas de n-Hexano: AcOEt (20:80); AcOEt (100): AcOEt: MeOH (95:5) y AcOEt: MeOH (50:50) para obtener 8 fracciones. Las fracciones activas BP3 (B) y BP3 (E, F), se purificaron mediante una cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (Varian ProStar 210) con una columna Interchrom KR5/25M y un flujo fue de 20 ml/min lo que permitió identificar el compuesto 1 en la fracción activa BP3 (B)—4 (6,4 mg). Adicionalmente, el compuesto 2 fue identificado en las fracciones activas B2 y B3 con una abundancia relativa de un 40,5% y 28,6 % respectivamente (análisis de GC-MS). Fractionation of the crude extract from 12 days of culture was carried out on a silica gel flash chromatographic column (5 cm diameter, 15 cm h, Si 35-70 um) with 4 grams of the extract in 250 grams of silica. A gradient elution was carried out with 4 volumes of 500 ml for each polarity using mixtures of n-Hexane: AcOEt (20:80) as eluent; AcOEt (100): AcOEt: MeOH (95:5) and AcOEt: MeOH (50:50) to obtain 8 fractions. The active fractions BP3 (B) and BP3 (E, F) were purified by high performance liquid chromatography (HPLC) (Varian ProStar 210) with an Interchrom KR5/25M column and a flow rate was 20 ml/min, which allowed the identification of compound 1 in the active fraction BP3 (B)—4 (6.4 mg). Additionally, compound 2 was identified in the active fractions B2 and B3 with a relative abundance of 40.5% and 28.6% respectively (GC-MS analysis).
Caracterización química del compuesto 1Chemical characterization of compound 1
La caracterización química mediante espectroscopia (1H RMN, 13C RMN) de la fracción activa B4 del cultivo de 12 días permitió la identificación del compuesto 1. Chemical characterization by spectroscopy (1H NMR, 13C NMR) of the active fraction B4 of the 12-day culture allowed the identification of compound 1.
El compuesto 1 se obtuvo en forma de aceite incoloro. Su fórmula molecular se determinó como C 16H28O4 por HRESIMS [M+Na]+, m/z 307.1882, que muestra tres grados de insaturación en su molécula. Su espectro IR mostró dos bandas de absorción a Dmax 3459 cm -1 y 1640 cm -1 debido a grupos hidroxilo y un grupo carbonilo, respectivamente. El espectro de 13C NMR en combinación con los espectros bidimensionales 1H-1H COSY y HSQC presentó señales características de cinco grupos metilos, cinco metinos, dos de ellos unidos a oxígeno a 72.1 (C-11) y 86.9 (C-7) y uno olefínico a 132.8 (C-5), así como las señales de tres grupos metilenos. Además, se observaron carbonos cuaternarios, uno unido a oxígeno a 87.4 (C-10), un olefínico a 133.8 (C-6) y otro de un grupo carbonilo a 181.3 (C-1). El análisis de estos datos espectroscópicos y las correlaciones observadas en los experimentos HMBC y NOESY confirmaron una estructura base de tetrahidrofurano para el compuesto 1 y permitió identificarlo como el ácido aspérico (1) (Varoglu M. et. al. 2000. J Nat Prod. 63, 41-34).Compound 1 was obtained as a colorless oil. Its molecular formula was determined as C 16 H 28 O 4 by HRESIMS [M+Na]+, m/z 307.1882, which shows three degrees of unsaturation in its molecule. Its IR spectrum showed two absorption bands at Dmax 3459 cm -1 and 1640 cm -1 due to hydroxyl groups and a carbonyl group, respectively. The 13 C NMR spectrum in combination with the two-dimensional 1 H- 1 H COZY and HSQC spectra presented characteristic signals of five methyl groups, five methines, two of them attached to oxygen at 72.1 (C-11) and 86.9 (C-7 ) and one olefinic at 132.8 (C-5), as well as the signals of three methylene groups. In addition, quaternary carbons were observed, one attached to oxygen at 87.4 (C-10), an olefinic carbon at 133.8 (C-6), and another from a carbonyl group at 181.3 (C-1). Analysis of these spectroscopic data and the correlations observed in the HMBC and NOESY experiments confirmed a tetrahydrofuran base structure for compound 1 and allowed it to be identified as asperic acid ( 1 ) (Varoglu M. et. al. 2000. J Nat Prod. 63, 41-34).
El compuesto 1 se ha descrito previamente, pero no su actividad nematicida. Este compuesto en la presente invención se ha referenciado como fórmula (I).Compound 1 has been described previously, but its nematicidal activity has not. This compound in the present invention has been referred to as formula (I).
Ácido aspérico (1). [α]D +4.05 (c 0.37, CHCl3); IR (film) Dmax 3459, 2094,1640, 1530, 1423, 1342, 1330,1131 cm-1; RMN 1 H (CDCl3, 500 MHz): 50.94 (3H, d, J = 6.7 Hz,H-14), 1.12 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-12), 1.15 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 1.18 (3H, s, H-16), 1.38 (1H, m, H-3a), 1.56 (1H, ddd, J = 18.9, 7.8, 4.1 Hz, H-9a), 1.62 (3H, d, J = 1.4 Hz, H-15), 1.69 (1H, m, H-3b), 1.88 (2H, m, H-8), 2.20 (1H, td, J = 12.5, 7.7 Hz, H-9b), 2.41 (1H, ddd, J = 9.2, 7.2, 5.7 Hz, H-2), 2.48 (1H, tt, J = 10.0, 3.6 Hz, H-4), 3.78 (1H, m, H-11), 4.33 (1H, dd, J = 10.7, 5.3 Hz, H-7), 5.16 (1H, d, J = 9.7 Hz, H-5.); RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): 5 181.3 (C-1), 133.8 (C-6), 132.8 (C-5), 87.4 (C-10), 86.9 (C-7), 72.1 (C-11), 40.7 (C-3), 37.1 (C-1), 30.7 (C-8), 30.2 (C-9), 29.9 (C-4), 24.5 (C-16), 21.3 (C-14), 17.5 (C-12), 16.7 (C-13), 11.1 (C-15); HR-ESIMS m/z 307.1882 [M Na]+ (calculado para C 1aH28O4Na, 237.1103). Asperic acid (1) . [α] D +4.05 (c 0.37, CHCl3); IR (film) Dmax 3459, 2094,1640, 1530, 1423, 1342, 1330,1131 cm-1; 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz): 50.94 (3H, d, J = 6.7 Hz,H-14), 1.12 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-12), 1.15 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 1.18 (3H, s, H-16), 1.38 (1H, m, H-3a), 1.56 (1H, ddd, J = 18.9, 7.8, 4.1 Hz, H-9a) , 1.62 (3H, d, J = 1.4 Hz, H-15), 1.69 (1H, m, H-3b), 1.88 (2H, m, H-8), 2.20 (1H, td, J = 12.5, 7.7 Hz, H-9b), 2.41 (1H, ddd, J = 9.2, 7.2, 5.7 Hz, H-2), 2.48 (1H, tt, J = 10.0, 3.6 Hz, H-4), 3.78 (1H, m , H-11), 4.33 (1H, dd, J = 10.7, 5.3 Hz, H-7), 5.16 (1H, d, J = 9.7 Hz, H-5.); 13 C NMR (CDCl 3 , 125 MHz): 5 181.3 (C-1), 133.8 (C-6), 132.8 (C-5), 87.4 (C-10), 86.9 (C-7), 72.1 (C -11), 40.7 (C-3), 37.1 (C-1), 30.7 (C-8), 30.2 (C-9), 29.9 (C-4), 24.5 (C-16), 21.3 (C- 14), 17.5 (C-12), 16.7 (C-13), 11.1 (C-15); HR-ESIMS m/z 307.1882 [M Na]+ (calculated for C 1a H 28 O 4 Na, 237.1103).
Caracterización química del compuesto 2Chemical characterization of compound 2
El compuesto mostró una fórmula molecular C11H18O4 establecida a través HR-ESIMS ([M+Na]+, m/z 237.1102. La estructura química fue determinada por comparación de los datos espectroscópicos de RMN 1H y 13C con los publicados previamente para el (+)-ácido hexilitacónico (Isogai, A. et al. 1984, Agr. Biol. Chem., 48, 2607-2609). La rotación óptica positiva (aD 13.09) indicó que se trata del estereoisómero S cuya configuración absoluta fue determinada por dicroísmo circular vibracional (Nakahashi et al. 2009, Bioorg Med Chem Lett. The compound showed a molecular formula C 11 H 18 O 4 established through HR-ESIMS ([M+Na]+, m/z 237.1102. The chemical structure was determined by comparison of the 1H and 13C NMR spectroscopic data with those published previously for (+)-hexylitaconic acid (Isogai, A. et al. 1984 , Agr. Biol. Chem., 48, 2607-2609). The positive optical rotation (aD 13.09) indicated that it is the S stereoisomer whose configuration absolute was determined by vibrational circular dichroism (Nakahashi et al. 2009, Bioorg Med Chem Lett.
19, 3027-3030).19, 3027-3030).
(+)-ácido hexilitacónico-(2). [ [α]D +13.09 (c 0.1, CHCl3); RMN 1 H (CDCl3, 500 MHz): 50.88 (3H, t, J = 6.8 Hz, H-10), 1.29 (4H, m, H-8 y H-9), 1.34 (4H, m, H-6 y H-7), 1.74 (1H, dq, J = 14.3, 7.9, 6.6 Hz, H-5), 1.94 (1H, dq, J = 14.8, 7.7, 7.1 Hz, H-5), 3.41 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 5.83 (1H, s, H-11a), 6.54 (1H, s,H-11b), 10.98 (2H, br s, 2 X COOH); RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): 5 179.8 (C-1), 171.9 (C-4), 137.3 (C-3), 129.7 (C-11), 46.9 (C-2), 31.6 (C-8), 29.8 (C-5), 29.0 (C-7), 27.3 (C-6), 22.6 (C-9), 14.0 (C-10); HR-ESIMS m/z 237.1102 [M Na]+ (calculado para C11H18O4Na, 237.1103). (+)-hexylitaconic acid-(2) . [[α] D +13.09 (c 0.1, CHCl3); 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz): 50.88 (3H, t, J = 6.8 Hz, H-10), 1.29 (4H, m, H-8 and H-9), 1.34 (4H, m, H- 6 and H-7), 1.74 (1H, dq, J = 14.3, 7.9, 6.6 Hz, H-5), 1.94 (1H, dq, J = 14.8, 7.7, 7.1 Hz, H-5), 3.41 (1H , t, J = 7.4 Hz, H-2), 5.83 (1H, s, H-11a), 6.54 (1H, s,H-11b), 10.98 (2H, br s, 2 X COOH); 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): 5 179.8 (C-1), 171.9 (C-4), 137.3 (C-3), 129.7 (C-11), 46.9 (C-2), 31.6 (C- 8), 29.8 (C-5), 29.0 (C-7), 27.3 (C-6), 22.6 (C-9), 14.0 (C-10); HR-ESIMS m/z 237.1102 [M Na]+ (calculated for C11H18O4Na, 237.1103).
Caracterización química del compuesto 3.Chemical characterization of compound 3.
Su fórmula molecular fue determinada como C 12H20O5 por HR-ESIMS ([M+Na]+, m/z.Its molecular formula was determined as C 12 H 20 O 5 by HR-ESIMS ([M+Na]+, m/z.
267.1203). El espectro de RMN 1H y 13C indicó la presencia de una estructura relacionada con la del compuesto (2). La diferencia más significativa es la presencia de las señales correspondientes a un grupo hidroxilo de un alcohol secundario deducido de las señales RMN de 1H y 13C a 3.70 5h (1H, q, J=5.8 Hz) y 68.5 5c , respectivamente, y una señal adicional de un grupo metoxilo en el C-1 (3.66 5h y 52.4 5c ). Estos datos permitieron identificar el compuesto 3 como el 1-metil éster del ácido 9-hidroxi-hexilitacónico (Klembe C. et al 2004, J. Nat. Prod, 67, 1058-1063). 267.1203). The 1 H and 13 C NMR spectrum indicated the presence of a structure related to that of the compound ( 2 ). The most significant difference is the presence of signals corresponding to a hydroxyl group of a secondary alcohol deduced from the 1H and 13C NMR signals at 3.70 5 h (1H, q, J=5.8 Hz) and 68.5 5 c , respectively. , and an additional signal from a methoxyl group at C-1 (3.66 5 h and 52.4 5 c ). These data allowed the identification of compound 3 as the 1-methyl ester of 9-hydroxy-hexylitaconic acid (Klembe C. et al 2004 , J. Nat. Prod, 67, 1058-1063).
La duplicidad de las señales de algunos carbonos en su espectro de 13C NMR indicó que se trata de mezcla de esteroisómeros en el C-2 del 1-metil éster del ácido 9-hidroxihexilitacónico. The duplicity of the signals of some carbons in its 13 C NMR spectrum indicated that it is a mixture of stereoisomers at the C-2 of the 1-methyl ester of 9-hydroxyhexylitaconic acid.
1-metil éster del ácido 9-hidroxi-hexilitacónico- (3). RMN 1 H (CDCl3, 500 MHz): 5 1.14 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-10), 1.36 (6H, m, H-6, H-7 y H-8), 1.69 (1H, m, H-5a), 1.87 (1H, m, H-5b), 3.48 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 3.66 (3H, s, -OCH3), 3.70 (1H, q, J = 5.8 Hz, H-9), 5.73 (1H, s, H-11a), 6.32 (1H, s, H-11b); RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): 5175.8 (-COOCH3), 169.5 (C-1), 140.8 (C-3), 127.1 (C-11), 68.5 (C-9), 52.4 (-OCH3), 48.10 (C-2), 48.05 (C-2), 39.9 (C-8), 32.09 (C-5), 32.07 (C-5), 28.62 (C-6), 28.60 (C-6), 26.6 (C-7), 23.5 (C-10);HR-ESIMS m/z 267.1203 [M Na]+ (calculado para C12H2OO5Na, 267.1208). 9-hydroxy-hexylitaconic acid 1-methyl ester (3) . 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz): 5 1.14 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-10), 1.36 (6H, m, H-6, H-7 and H-8), 1.69 (1H , m, H-5a), 1.87 (1H, m, H-5b), 3.48 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 3.66 (3H, s, -OCH 3 ), 3.70 (1H, q, J = 5.8 Hz, H-9), 5.73 (1H, s, H-11a), 6.32 (1H, s, H-11b); 13 C NMR (CDCl 3 , 125 MHz): 5175.8 (-COOCH 3 ), 169.5 (C-1), 140.8 (C-3), 127.1 (C-11), 68.5 (C-9), 52.4 (-OCH 3 ), 48.10 (C-2), 48.05 (C-2), 39.9 (C-8), 32.09 (C-5), 32.07 (C-5), 28.62 (C-6), 28.60 (C-6 ), 26.6 (C-7), 23.5 (C-10);HR-ESIMS m/z 267.1203 [M Na]+ (calculated for C12H2OO5Na, 267.1208).
Caracterización química del compuesto 4Chemical characterization of compound 4
El ion molecular a m/z 267. 1201 [M+Na]+ de acuerdo con una fórmula molecular C12H2OO5 y las señales del espectro de RMN de1H indicaron que el compuesto 4 es un isómero del compuesto 3. La comparación entre los espectros de RMN de 1H y 13C de ambos compuestos mostraba la desaparición señales del grupo metilo (1.14 5h y 23.5 5c ) y la presencia de un nuevo triplete a 3.54 5h (2H, t, J=6.6 Hz) y 68.5 5c debido un grupo hidroximetileno terminal en la cadena alifática. Las correlaciones observadas en los espectros HMBC y COSY confirmaron la posición del nuevo grupo hidroxilo en C-10. Estos datos coinciden con los publicados para el ácido asperitacónico A y permiten identificar el compuesto 4 como el 1-metil éster del ácido 10-hidroxi-hexilitacónico (Ding L. et al. 2018, J Antibiot, 71, 902-904). The molecular ion at m/z 267. 1201 [M+Na]+ according to a molecular formula C12H2OO5 and the 1H NMR spectrum signals indicated that compound 4 is an isomer of compound 3 . The comparison between the 1 H and 13 C NMR spectra of both compounds showed the disappearance of signals from the methyl group (1.14 5 h and 23.5 5 c ) and the presence of a new triplet at 3.54 5 h (2H, t, J= 6.6 Hz) and 68.5 5 c due to a terminal hydroxymethylene group in the aliphatic chain. The correlations observed in the HMBC and COZY spectra confirmed the position of the new hydroxyl group at C-10. These data coincide with those published for asperitaconic acid A and allow the identification of compound 4 as the 1-methyl ester of 10-hydroxy-hexylitaconic acid (Ding L. et al. 2018 , J Antibiot, 71, 902-904) .
1-metil éster del ácido 10-hidroxi-hexilitacónico- (4). [a]ü +2.3 (c 0.30, CHCl3); RMN 1 H (CDCl3, 500 MHz): 5 1.33 (6H, m, H-6,H-7 y H-8), 1.52 (2H, q, J = 7.2 Hz, H-9), 1.69 (1H, m, H-5a), 1.87 (1H, m, H-5b), 3.48 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-2), 3.54 (2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 3.65 (5H, s,-OCH3), 5.75 (1H, s, H-11a), 6.33 (1H, s, H-11b); RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): 5 175.7 (C-1), 169.3 (C-4), 140.6 (C-3), 127.2 (C-11), 62.9 (C-10), 52.4 (-OCH3), 48.0 (C-2), 33.5 (C-9), 32.1 (C-5), 30.2 (C-7), 28.5 (C-6), 26.7 (C-8);HR-ESIMS m/z 267.1201 [M Na]+ (calculado para C12H2OO5Na, 267.1208). 10-hydroxy-hexylitaconic acid 1-methyl ester (4) . [a] ü +2.3 (c 0.30, CHCl3); 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz): 5 1.33 (6H, m, H-6,H-7 and H-8), 1.52 (2H, q, J = 7.2 Hz, H-9), 1.69 (1H , m, H-5a), 1.87 (1H, m, H-5b), 3.48 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-2), 3.54 (2H, t, J = 6.6 Hz, H-10) , 3.65 (5H, s,-OCH 3 ), 5.75 (1H, s, H-11a), 6.33 (1H, s, H-11b); 13 C NMR (CDCl 3 , 125 MHz): 5 175.7 (C-1), 169.3 (C-4), 140.6 (C-3), 127.2 (C-11), 62.9 (C-10), 52.4 (- OCH 3 ), 48.0 (C-2), 33.5 (C-9), 32.1 (C-5), 30.2 (C-7), 28.5 (C-6), 26.7 (C-8);HR-ESIMS m /z 267.1201 [M Na]+ (calculated for C12H2OO5Na, 267.1208).
Tabla 1. Actividad nematicida de los compuestos 1-4 , expresada como media y error estándar (de cuatro repeticiones) de los porcentajes corregidos de mortalidad de J2 de M. javanica. Table 1. Nematicidal activity of compounds 1 - 4 , expressed as mean and standard error (from four repetitions) of the corrected mortality percentages of J2 of M. javanica.
Ejemplo 4. Actividad nematicida in vivo Example 4. Nematicidal activity in vivo
Nematodos:Nematodes:
La población de Meloidogyne javanica se mantuvo en invernadero en plantas de tomate muy susceptible (variedad Marmande), con inoculaciones periódicas. A los 60 días después de una de las inoculaciones se procesaron las raíces infectadas de las plantas de tomate y se aislaron manualmente las masas de huevos de las agallas bajo el microscopio estereoscópico El inóculo de los juveniles infectivos (J2) se obtuvo durante tres días a partir de la incubación de las masas de huevos en agua a 25°C.The population of Meloidogyne javanica was maintained in a greenhouse on highly susceptible tomato plants (Marmande variety), with periodic inoculations. At 60 days after one of the inoculations, the infected roots of the tomato plants were processed and the egg masses were manually isolated from the galls under the stereoscopic microscope. The inoculum of the infective juveniles (J2) was obtained for three days at from the incubation of egg masses in water at 25°C.
Tratamiento:Treatment:
Extracto crudo de BP3 (4-5D). Se preparó una solución tratamiento a 0,5 mg/mL (en agua y etanol 1%). Los controles consistieron en agua destilada y etanol 1%. BP3 crude extract (4-5D). A treatment solution was prepared at 0.5 mg/mL (in water and 1% ethanol). Controls consisted of distilled water and 1% ethanol.
Procedimiento:Procedure:
Se aplicó el tratamiento al sustrato (75 ml por 600 gr de suelo arcillo arenoso) que después de ser homogeneizado se transfirió a macetas (5) de 800 mL y se humedeció con agua a saturación. El control consistió en 5 macetas con suelo no tratado. A continuación, cada maceta se inoculó con 1000 huevos y juveniles de M. javanica y se dejaron en incubación durante 5 días en una cámara de crecimiento vegetal (25 ± 2 °C, 60%RH). Después del periodo de incubación se procedió al trasplante de una plántula de tomate (var. Marmande) de 21 días de edad en cada maceta y se mantuvieron en las mismas condiciones controladas durante 45 días con aplicación de una solución fertilizante cada 10 días.The treatment was applied to the substrate (75 ml per 600 g of sandy clay soil) which, after being homogenized, was transferred to 800 mL pots (5) and moistened with water to saturation. The control consisted of 5 pots with untreated soil. Each pot was then inoculated with 1000 eggs and juveniles of M. javanica and left to incubate for 5 days in a plant growth chamber (25 ± 2 °C, 60%RH). After the incubation period, a 21-day-old tomato seedling (var. Marmande) was transplanted into each pot and kept under the same controlled conditions for 45 days with the application of a fertilizer solution every 10 days.
A los 45 días después de la inoculación se levantaron las plantas. Los sistemas radicales se lavaron y pesaron y se procesaron las raíces enteras para determinar los siguientes parámetros:At 45 days after inoculation, the plants were lifted. The root systems were washed and weighed and the whole roots were processed to determine the following parameters:
Índice de nodulación (IN): las raíces fueron analizadas visualmente para determinar el índice de nodulación sobre una escala de 0 a 5, donde 0 = sin agallas (sanas, sistema de raíces sin infestación), 1 = 25% del sistema radicular con agallas 2 = 26-50% del sistema radicular con agallas), 3 = 51 -75% del sistema radicular con agallas 4 = 76- 90% del sistema de raíces con agallas, 5= >91% del sistema radical con agallas (Hussey y Janssen,2002). Nodulation index (NI) : Roots were visually analyzed for nodulation index on a scale of 0 to 5, where 0 = no galls (healthy, root system without infestation), 1 = 25% of the root system with galls 2 = 26-50% of the root system with galls), 3 = 51 -75% of the root system with galls, 4 = 76-90% of the root system with galls, 5 = >91% of the root system with galls (Hussey and Janssen,2002).
En la Tabla 2 se muestran los resultados del ensayo In planta. Los sistemas radicales de las plantas tratadas presentaron índices muy bajos de nodulación, al contrario que los de las plantas del control infestado.Table 2 shows the results of the In planta test. The root systems of the treated plants presented very low nodulation rates, unlike those of the infested control plants.
Tabla 2 Incidencia de la infección de J2 de M. javanica en las raíces de las plantas de tomate tratadas y control.Table 2 Incidence of M. javanica J2 infection in the roots of treated and control tomato plants.
Así mismo el tratamiento aplicado no tuvo efectos de fitotoxicidad y no se apreciaron diferencias significativas respecto al peso o aspecto de los sistemas radiculares tratados respecto al control. Likewise, the treatment applied had no phytotoxicity effects and no significant differences were observed regarding the weight or appearance of the treated root systems compared to the control.
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