ES2915023T3

ES2915023T3 - HER2 como un factor predictivo de respuesta al bloqueo dual de HER2 en ausencia de terapia citotóxica

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Publication number: ES2915023T3
Application number: ES16809752T
Authority: ES
Inventors: Aparicio Aleix Prat; Castan Javier Cortes; Cussac Antonio Llombart
Original assignee: Fund Solti; Fundacion Solti; Hospital Clinic de Barcelona; Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron VHIO; Fundacion para el Fomento de la Investigacion Sanitaria y Biomedica de la Comunitat Valenciana FISABIO
Current assignee: Fund Solti; Fundacion Solti; Hospital Clinic de Barcelona; Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron VHIO; Fundacion para el Fomento de la Investigacion Sanitaria y Biomedica de la Comunitat Valenciana FISABIO
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2022-06-20
Anticipated expiration: 2036-12-07
Also published as: US11851709B2; JP2020500543A; EP3551761A1; EP3551761B1; JP7377713B2; WO2018103834A1; US20190338368A1

Abstract

Un método in vitro para determinar la eficacia de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+ que comprende: (a) la cuantificación de un producto de expresión génica de HER2 en una muestra biológica aislada del paciente: (a.i) antes de comenzar la terapia anti-HER2, y (a.ii) a un día del 5º al 20º día después del inicio de la terapia anti-HER2, en el que, si existe una reducción entre el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) en comparación con (a.i), es indicativo de la eficacia de la terapia anti-HER2.

Description

DESCRIPCIÓN

HER2 como un factor predictivo de respuesta al bloqueo dual de HER2 en ausencia de terapia citotóxica

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular al cáncer de mama, específicamente a un nuevo método para predecir la respuesta a la terapia contra HER2 en los pacientes con cáncer de mama HER2+ que no están recibiendo quimioterapia. El método tiene posibles aplicaciones potenciales en el tratamiento y el seguimiento clínicos de dichos pacientes con cáncer de mama HER2+.

Estado de la técnica

El cáncer de mama HER2+, que se define por IHC/FISH (definición convencional)1, representa el ~20 % de todos los tumores de mama. Establecido inicialmente como un biomarcador de pronóstico, su mayor valor hoy en día es como factor predictivo del beneficio del trastuzumab, así como de otros agentes que se dirigen a la vía HER2. La introducción de la terapia con trastuzumab mejoró notablemente el mal pronóstico asociado a HER2+2 La posterior identificación de mecanismos de resistencia y la incorporación de nuevos fármacos con un bloqueo mejor o diferente de HER2 han mejorado los resultados de supervivencia en el escenario mestastásico34. En etapas tempranas, la incorporación de nuevos agentes anti-HER2 ha proporcionado resultados discordantes. Por un lado, los tumores localmente avanzados y operables grandes mostraron un aumento espectacular de las tasas anatomopatológicas completas (pCR, del inglés pathological complete rates) con la incorporación de lapatinib o pertuzumab al trastuzumab neoadyuvante convencional y la quimioterapia de combinación. Con la pCR validada como criterio de valoración indirecto para la supervivencia libre de enfermedad (DFS, del inglés disease-free survival) en pacientes con enfermedad HER2+5, el pertuzumab tiene la aprobación concedida por la Agencia Europea del Medicamento (EMA, del inglés European Medicines Agency) y la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA, del inglés Food and Drug Administraron) para esta población. Por otro lado, la adición de lapatinib al trastuzumab adyuvante convencional y la quimioterapia de combinación, proporcionaron un beneficio absoluto estadísticamente no significativo en el intervalo del 2 % en 4,5-año en DFS6. Se esperan los resultados de un segundo estudio a gran escala que incorporaba pertuzumab al trastuzumab en el mismo escenario. Sin embargo, una restricción a los logros clínicamente relevantes en esta población es el riesgo bajo-moderado que sigue a la alta eficacia del trastuzumab y la quimioterapia. De hecho, un estudio de tratamiento con un solo grupo en pacientes con cáncer de mama HER2+ predominantemente en estadio I (es decir, T1 y negativo en ganglios o N1mic) que explora el paclitaxel semanal de baja intensidad adyuvante durante 12 semanas con 1 año de trastuzumab, obtuvo una DFS del 98,7 % a los 3 años.

Se necesitan nuevas estrategias en el cáncer de mama HER2+ temprano para optimizar y reducir la intensidad de los tratamientos. En la enfermedad negativa para HER2/HR+, se han incorporado ensayos basados en la expresión de genes para personalizar el riesgo y, lo más importante, para establecer los beneficios y las necesidades de la quimioterapia adyuvante. La falta de cualquier herramienta predictiva en el panorama de HER2+ es una pregunta que se hace desde hace años que está penalizando los estudios de adyuvantes.

Tres estudios de neoadyuvante anteriores han demostrado que la expresión del ARNm de ERBB2 solo se asocia a una mayor probabilidad de pCR después de la quimioterapia y la terapia anti-HER2 en pacientes con enfermedad HER2+8-10. En el estudio NeoALTTO11, se evaluó la secuenciación de ARN de 254 muestras basales (de 455 pacientes incluidos)8. El NeoALTTO asignó aleatoriamente 455 mujeres con cáncer de mama HER2+ en estadio temprano al trastuzumab, el lapatinib o la combinación, durante 6 semanas, seguido de la adición de paclitaxel semanalmente durante 12 semanas. Después del tratamiento sistémico, las pacientes se sometieron a cirugía11. Los resultados revelaron que la alta expresión de ARNm de ERBB2 se asoció a pCR en todos los grupos de tratamiento8. En otro estudio retrospectivo a partir del ensayo NeoALTTO, también se descubrió que la expresión solamente de proteína HER2 se asocia también a una mayor probabilidad de ^pCR12. En el segundo ensayo clínico, el CALGB40601, se asignaron aleatoriamente pacientes con cáncer de mama HER2+ en estadio II a III a la quimioterapia (es decir, paclitaxel) más trastuzumab solo o con la adición de lapatinib durante 16 semanas antes de la cirugía9. El análisis retrospectivo reveló que la alta expresión de ERBB2 por ARNm se asociaba a pCR en toda la población9. Por último, en el estudio de fase II abierto Tryphaena, los pacientes con cáncer de mama HER2+ localmente avanzado o inflamatorio, operable, se aleatorizaron 1:1:1 para recibir 6 ciclos de neoadyuvante de 3 regímenes diferentes de quimioterapia con múltiples agentes en combinación con trastuzumab y pertuzumab10. De los diferentes biomarcadores moleculares analizados, los niveles de HER2 (proteína y ARNm) mostraron una asociación con las tasas de pCR cuando se combinaron datos de todos los grupos.

Las asociaciones previas entre el ARNm de ERBB2 basal, o la proteína, con la pCR después de la terapia anti-HER2, necesitan una consideración especial. De hecho, los 3 ensayos clínicos (es decir NeoALTTO, CALGB40601 y Tryphaena) incluyen la quimioterapia de base en todos sus grupos de tratamiento. Por tanto, no puede discriminarse el efecto predictivo de la expresión de ERBB2 sobre la quimioterapia. De hecho, un estudio grande anterior en el escenario adyuvante observó una interacción significativa entre la positividad para HER2 (como criterios convencionales definidos utilizando IHC y/o FISH) y el beneficio del paclitaxel13. En este estudio, 1.500 mujeres con cáncer de mama positivo para ganglios que se habían asignados aleatoriamente para recibir doxorrubicina (60, 75 o 90 mg por metro cuadrado de área superficial corporal) y ciclofosfamida (600 mg por metro cuadrado) durante cuatro ciclos, seguido de cuatro ciclos de paclitaxel (175 mg por metro cuadrado) u observación. Había disponibles bloques de tejido de 1322 de estas 1500 mujeres13. Se realizaron análisis inmunohistoquímicos de estas muestras de ensayo tisulares para determinar el HER2 con el anticuerpo monoclonal CB11 frente a HER2 o con un kit de ensayo policlonalanticuerpo e hibridación in situ por fluorescencia para la amplificación de HER2. La interacción entre la positividad a HER2 y la adición de paclitaxel al tratamiento se asoció a una relación de riesgo para la recurrencia de 0,59 (p = 0,01)13 Las pacientes con un cáncer de mama HER2+ se beneficiaron del paclitaxel, independientemente del estado del receptor de estrógeno, pero el paclitaxel no benefició a las pacientes con cánceres negativos para HER2-, cánceres positivos para receptor de estrógeno. Por tanto, no puede excluirse la posibilidad de que los niveles basales de ERBB2 altos también sean predictivos del beneficio de la quimioterapia o predictivos de un efecto de sinergia entre los dos tratamientos (es decir, quimioterapia y anti-HER2, simple o doble), algo que NeoALTTO, CALGB40601 y Tryphaena no pueden descartar porque no incluyeron pacientes sin quimioterapia. En otros estudios HER2 estatus ha sido utilizado para identificar pacientes para tratamiento, por ejemplo, con trastuzumab o lapatinib17 o con quimioterapia18. Además, ninguno de estos estudios ha evaluado el valor predictivo de los cambios en la expresión de ARNm de ERBB2 después de 2 semanas de tratamiento.

Teniendo en cuenta que el bloqueo dual de HER2 mejora la eficacia de la terapia contra HER2 con un agente único, una pregunta clínica que surge es si el bloqueo dual puede eliminar la necesidad de quimioterapia en un subgrupo de pacientes. El bloqueo dual de HER2 exclusivo ha demostrado una alta actividad en un grupo de pacientes con cáncer de mama HER2+ metastásico y primario14-16. En el cáncer de mama metastásico HER2+ tratado previamente con trastuzumab, la adición de pertuzumab o lapatinib al trastuzumab consigue un mayor beneficio clínico que ya sea el pertuzumab o el lapatinib solos16. En el cáncer de mama HER2+ primario las combinaciones de trastuzumab-lapatinib trastuzumab-pertuzumab neoadyuvantes sin quimioterapia consiguieron tasas de ^pCR en la mama del 17-27 %1415. En general, los resultados indican que un subconjunto de pacientes con cánceres de mama HER2+ es altamente sensible al bloqueo doble anti HER2 y podrían tratarse potencialmente sin terapia citotóxica.

Un reto importante es descubrir biomarcadores que identificarán los pacientes más sensibles al bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia. Hasta la fecha, la positividad al receptor hormonal por inmunohistoquímica (IHC, del inglés immunohistochemistry) es el único biomarcador molecular para predecir la respuesta dual al bloqueo de HER2 sin quimioterapia. En el ensayo TBCRC006, la tasa de pCR en la enfermedad positiva para el receptor de estrógeno fue del 21 % frente al 36% en la enfermedad negativa para los ER tras 12 semanas de tratamiento con lapatinib y trastuzumab (y terapia hormonal si el tumor era ER+)15. En el ensayo NeoSphere, la tasa de pCR en la enfermedad positiva para el receptor de estrógeno (ER) o positiva para el receptor de progesterona (PR) positivo era del 5,9 % frente al 27,3 % en la enfermedad ER-negativa o PR-negativa después de 12 semanas de tratamiento con pertuzumab y trastuzumab (Grupo C)14. Sin embargo, este biomarcador no es suficiente para identificar a aquellos pacientes que obtendrán el mayor beneficio del bloqueo dual del HER2 sin quimioterapia. Actualmente, el 30 % de los pacientes con cáncer de mama positivo para HER2 (HER2+) se benefician sustancialmente del bloqueo dual de1HER2 sin quimioterapia. Sin embargo, existe una necesidad de identificar estos pacientes antes y durante el tratamiento.

Hoy en día, la combinación de dobletes anti-HER2 (lapatinib trastuzumab o pertuzumab trastuzumab) con regímenes de quimioterapia de múltiples agentes óptimos está ofreciendo tasas de pCR en el intervalo del ~60 %10, y el pertuzumab ha sido específicamente aprobado por la FDA y la EMA para los pacientes con cáncer de mama HER2+ temprano con tumores primarios >2°cm o con enfermedad positiva para ganglios. Por otra parte, para los pacientes con enfermedad HER2+ estadio I, el paclitaxel semanal durante 12 dosis más un anti-HER2 individual (es decir, trastuzumab) se considera un régimen aceptable7. Esta estrategia de tratamiento ofrece tasas de pCR que van del 29 % al 46 %11.

Hoy en día, con el fin de seleccionar la terapia más adecuada para el tratamiento del cáncer de mama está el ensayo del estado de receptores hormonales, un examen que determina si las células de cáncer de mama tienen o no receptores para las hormonas estrógeno y progesterona. Un cáncer se denomina positivo para el receptor de estrógeno (o ER+) si más del 1 % de las células tumorales expresan el ER mediante IHC. Esto indica que las células cancerosas, como las células mamarias normales, pueden recibir señales del estrógeno que podrían promover su crecimiento. El cáncer es positivo para receptores de progesterona (PR+) si más del 1 % de las células tumorales expresan el ER mediante IHC. El ensayo del estado de receptores hormonales mediante IHC, sin embargo, fracasa en proporcionar una información exacta del receptor, en algunos casos particulares de los casos de mama, que, por desgracia, pueden provocar que un médico tome una decisión equivocada en la decisión del protocolo terapéutico más apropiado.

A pesar de los esfuerzos realizados, existe la necesidad de marcadores biológicos que proporcionen información predictiva exacta del éxito de una terapia en particular antes de su administración al paciente diagnosticado de cáncer de mama.

Resumen de la invención

Los inventores han descubierto que la expresión del producto del gen ERBB2, en particular, los niveles de ARNm, cuando se cuantifican en un paciente ya diagnosticado de cáncer de mama HER2+ y antes de recibir cualquier terapia, puede proporcionar información útil acerca de la respuesta positiva o negativa a la administración de la terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia (véase la Figura 5).

A partir de los datos que se proporcionan a continuación, es notable el hecho de que utilizando ERBB2 como biomarcador, la información proporcionada acerca de la respuesta anatomopatológica completa ("^pCR") es sustancialmente más exacta en comparación con el protocolo aceptado actualmente por los médicos, que se basa en la determinación del estado de los receptores hormonales (véase la Tabla 4 a continuación).

Es notable que la información proporcionada por el biomarcador ERBB2, de acuerdo con la presente invención, es para una población de pacientes con enfermedad HER2+ que podrían ser candidatos para recibir terapia anti-HER2 y evitar la quimioterapia. Esto es de gran importancia porque, como se ha señalado anteriormente, el ERBB2 puede afectar a la eficacia de la quimioterapia y los estudios anteriores no han discriminado el efecto del biomarcador ERBB2 con quimioterapia frente a la terapia anti-HER2.

Por tanto, la invención significa un gran avance en la predicción de forma exacta, antes de comenzar la terapia, de cómo un paciente ya diagnosticado de cáncer de mama HER2+ podría responder positivamente a la terapia anti-HER2 sin quimioterapia. Esto puede ser de gran valor para el médico con el fin de decidir la mejor estrategia terapéutica para superar satisfactoriamente la enfermedad.

El primer aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para determinar la eficacia de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+ que comprende la cuantificación de un producto de expresión del gen de HER2 en una muestra de ensayo aislada del paciente, (a.i.) antes de comenzar la terapia anti-HER2 y (a.ii) a un día del 5° al 20° día después del inicio de la terapia anti-HER2, en el que, si existe una reducción entre el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) en comparación con (a.i), es indicativo de la eficacia de la terapia anti-HER2.

Además de lo anterior, los presentes inventores también han descubierto que la determinación de la relación de la expresión génica del producto ERBB2 antes de comenzar una terapia anti-HER2 y después de un tiempo de haber comenzado la terapia, también puede ayudar a predecir la eficacia del tratamiento anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente ya diagnosticado con cáncer de mama HER2+.

Como se muestra a continuación, los niveles de ERBB2 determinados antes y después de 15 días de comenzar la terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia, predicen la eficacia del tratamiento en comparación con el estado del receptor hormonal (véase la Tabla 6 a continuación). Además de esto, la determinación de los niveles de expresión del producto del gen ERBB2 entre estos dos puntos temporales (es decir, antes y después de 15 días) durante la terapia anti-HER2, proporciona información valiosa para decidir si debe retirarse el tratamiento anti-HER2.

Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para determinar la eficacia de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia de un paciente con cáncer de mama HER2+ que comprende:

(a) la cuantificación de un producto de expresión génica de HER2 en una muestra biológica aislada del paciente: (a.i) antes de comenzar la terapia anti-HER2 y

(a.ii) a un día del 5° al 20° día después del inicio de la terapia anti-HER2, en el que, si existe una reducción entre el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) en comparación con (a.i), es indicativo de la eficacia de la terapia anti-HER2.

Los resultados proporcionados en el presente documento abren la puerta a nuevos estudios en el cáncer de mama HER2+ que evalúen los resultados de supervivencia a largo plazo del bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia después de la selección de pacientes sobre la base de los niveles de expresión de ARNm de ERBB2.

Con el método del segundo aspecto de la invención, se observaron tasas de pCR del 64,9 %-75,0 % en el grupo de pacientes tratados con bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia con una expresión basal de ERBB2 alta o una relación de expresión de ERBB2 alta entre la semana 2 y los puntos temporales basales, lo que indica que la quimioterapia podría evitarse en un subconjunto de pacientes, que representa aproximadamente el ~25 % (es decir, un cuartil) de todos los pacientes HER2+. Estas tasas de pCR se consiguen, en la actualidad, con quimioterapia de múltiples agentes en combinación con el bloqueo dual de HER2 si no se tiene en cuenta ninguna selección de pacientes.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para decidir o recomendar a un paciente con cáncer de mama HER2+ si ha de iniciar un régimen médico alternativo a una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia, que comprende:

(a) la cuantificación de un producto de expresión génica de HER2 en una muestra biológica aislada del paciente: (ai) antes de comenzar una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia y (a.ii) a un día del 5° al 20° día después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia, en el que si el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) es mayor que en (a.i), es indicativo de que se necesita el régimen médico alternativo. Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso de un ratio de un producto de expresión génica de HER2 antes y después de comenzar una terapia anti-HER2 como un marcador in vitro para determinar la eficacia de la terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+ o, como alternativa, como un marcador in vitro para decidir o recomendar la posibilidad de iniciar un régimen médico alternativo a la terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso de medios para determinar la presencia o para cuantificar el producto de expresión génica de HER2 en los métodos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1, esquema de ensayo PAMELA.

La figura 2 muestra el diagrama que resume la información de los pacientes del ensayo PAMELA.

La figura 3 describe los análisis de exactitud equilibrada que utilizan un número variable de genes (medidos en el momento basal) y los diferentes métodos de clasificación y selección de variables. adld, análisis discriminante lineal diagonal; adl, análisis discriminante lineal; adc, análisis discriminante cuadrático; ba, bosques aleatorios; erc, eliminación características recursivas; ensayo t, preuba t de Student; ensayo.welch, prueba t de Welch.

La figura 4 muestra los análisis de validación cruzada de área bajo la curva (ABC) utilizando muestras basales solo después de la selección de 1,2, 3, 4, 5 y 10 genes.

La figura 5 describe la asociación de la expresión de ERBB2 con la pCR en todo el conjunto de datos de muestras basales (n = 151). A, análisis de validación cruzada del área bajo la curva (ABC); B; gráfica de frecuencias acumuladas de la expresión de ERBB2 en pacientes que consiguieron una pCR en comparación con los que no (no-pCR).

La figura 6 muestra el análisis del ABC de la expresión de ERBB2 (medida al inicio del estudio, relación de la semana 2/línea basal o semana 2) para la predicción de la pCR en todo el conjunto de datos de muestras pareadas (n = 144). La figura 7 análisis de la exactitud equilibrada en el uso de un número variable de genes (relación de la semana 2/línea basal) y diferentes métodos de clasificación y selección de variables. adld, análisis discriminante lineal diagonal; adl, análisis discriminante lineal; adc, análisis discriminante cuadrático; ba, bosques aleatorios; erc, eliminación de características recursivas; ensayo t, prueba t de Student; ensayo welch, prueba t de Welch.

La figura 8 muestra el análisis del ABC utilizando la relación de la semana 2/línea basal después de la selección de 1, 2, 3, 4, 5 y 10 genes.

Descripción detallada de la invención

El cáncer de mama HER2 (positivo para HER2) es un cáncer de mama que da positivo para una proteína denominada receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2, por sus sigla en inglés). Las técnicas utilizadas por la práctica clínica para determinar la expresión de HER2 son bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo mediante la detección de la proteína mediante inmunohistoquímica o detectando el número de copias mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH, por sus siglas en inglés), ensayo SPOT-Light HER2 CISH (hibridación in situ cromogénica de tecnología de sonda de sustracción) o mediante el ensayo de ISH Dual para HER2 Informa (Hibridación dual in situ Inform).

El gen "HER2" ("ERBB2", homólogo del oncogén viral de leucemia eritroblástica aviar 2v-erb-b2) (GeneID: 64) codifica un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) de los receptores tirosina cinasas. La amplificación y/o sobreexpresión de este gen se ha reportado en numerosos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama y los tumores de ovario. Son sinónimos génicos los siguientes CD340; HER-2; HER-2/neu; HER2; MLN 19; NEU; LGN; y TKR1.

SEQ ID NO: 1 (ERBB2) (NM_001005862.1, fecha de 19-ENE-2014) se corresponde con el ADN complementario (ADNc) que codifica el ARNm de la variante 2 de Homo sapiens. El corte y empalme alternativo da como resultado varias variantes de la transcripción adicionales, codificando algunas diferentes isotermas. Se han reportado variaciones alélicas en las posiciones de aminoácidos.

La ID de la proteína HER2 es la siguiente: "NP_001005862.1" (SEQ ID NO: 2).

La secuencia diana de ERBB2 para la cuantificación en una realización preferida es la SEQ ID NO: 3 (ACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTC CCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGG).

En la presente invención, la cuantificación de un producto de expresión génica de HER2 se ha realizado en pacientes con cáncer de mama HER2+ antes y durante las terapias anti-HER2, en ausencia de quimioterapia.

Por tanto, en una realización preferida de los métodos de la invención, el paciente además no ha recibido ninguna quimioterapia antes de la cuantificación del producto de expresión génica de HER2.

En una realización del primer aspecto de la invención, cuando se sobreexpresa el producto de expresión génica de HER2 es indicativo de la eficacia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia. La sobreexpresión es en relación con una muestra de referencia, la muestra de referencia es un tejido mamario normal de una persona sana.

En una realización del primer aspecto de la invención, cuando la cantidad de producto de expresión génica de HER2 se expresa altamente (definida, por ejemplo, como la parte superior del percentil 25 % o una puntuación de la expresión génica de ERBB2 de >3,22), es indicativo de una alta eficacia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia.

En la presente invención la expresión "producto de expresión génica" se refiere al ácido ribonucleico mensajero (ARN mensajero o ARNm) o a la proteína.

En una realización, el producto de expresión génica es ARNm. "ARNm" abarca tanto la secuencia completa de ARNm así como los fragmentos de la misma.

En otra realización, la expresión "producto de expresión génica" se refiere a la proteína HER2. "Proteína HER2" abarca tanto la proteína HER2 completa de secuencia SEQ ID NO: 2, así como fragmentos funcionales de la misma (tales como fragmentos inmunológicos de la misma) o una proteína con una secuencia que tenga un porcentaje de identidad de al menos el 70, el 71, el 72, el 73, el 74, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente de 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

En la presente invención el término "identidad" se refiere al porcentaje de restos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias están alineadas de forma óptima. Si, en la alineación óptima, una posición en una primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las secuencias presentan identidad con respecto a esa posición. El nivel de identidad entre dos secuencias (o "porcentaje de identidad de secuencia") se mide como una relación del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias con respecto al tamaño de las secuencias (es decir, identidad de secuencia porcentual = [número de posiciones idénticas/número total de posiciones] x 100).

Se conocen varios algoritmos matemáticos para obtener rápidamente la alineación óptima y calcular la identidad entre dos o más secuencias y se incorporan en una serie de programas de software disponibles. Los ejemplos de dichos programas incluyen los programas MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA y ROBUST para el análisis de secuencias de aminoácidos, entre otros. Los programas de análisis de software preferidos incluyen los programas ALIGN, CLUSTAL W y BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ y versiones posteriores de los mismos).

Para el análisis de la secuencia de aminoácidos, se utilizan una matriz de peso, tal como las matrices BLOSUM (por ejemplo, las matrices BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62 y BLOSUM80), las matrices Gonnet o las matrices PAM (por ejemplo, las matrices PAM30, PAM70, PAM120, PAM160, PAM250 y PAM350), en la determinación de identidad. Los programas BLAST proporcionan un análisis de al menos dos secuencias de aminoácidos, ya sea mediante la alineación de una secuencia seleccionada frente a múltiples secuencias en una base de datos (por ejemplo, GenSeq), o, con BL2SEQ, entre dos secuencias seleccionadas. Los programas BLAST se modifican preferentemente mediante programas de filtrado de complejidad baja tales como los programas DUST o SEG, que están integrados preferentemente en las operaciones del programa BLAST. Si se utilizan los costes de existencia de huecos (o puntuaciones de huecos), el coste de existencia de huecos se encuentra preferentemente entre aproximadamente -5 y -15. Pueden utilizarse parámetros de hueco similares con otros programas, según sea propiado. Los programas BLAST y los principios que subyacen en los mismos se describen adicionalmente en, por ejemplo, Altschul et al., "Basic local alignment search tooV, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403-410.

Para el análisis de secuencias múltiples, puede utilizarse el programa CLUSTAL W. El programa CLUSTAL W deseablemente se ejecuta utilizando la configuración "dinámica" (frente a la "rápida"). Las secuencias de aminoácidos se evalúan utilizando un conjunto variable de matrices BLOSUM en función del nivel de identidad entre las secuencias. El programa CLUSTAL W y los principios subyacentes de la operación se describen adicionalmente en, por ejemplo, Higgins et al., "CLUSTAL V: improved software for múltiple sequence alignment', 1992, CABIOS, 8 (2), páginas 189 191.

En una realización del segundo aspecto de la presente invención, si hay una reducción entre el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) en comparación con (a.i), es indicativo de la eficacia de la terapia anti-HER2. En una realización del tercer aspecto de la presente invención, si el ratio de la expresión génica entre el producto cuantificado en la etapa (a.ii) es mayor que en la etapa (a.i), es indicativo que se necesita un régimen médico alternativo.

En una realización de la presente invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o que se proporcionan a continuación, el producto de expresión génica es un ARNm (ARN mensajero) (en una realización preferida es la SEQ ID NO: 1). En otra realización, la secuencia cuantificada es la SEQ ID NO: 3.

En una realización preferida de la presente invención, se cuantifica el producto de expresión de HER2. En una realización más preferida, se cuantifica el ARNm de HER2. En una realización más preferida se cuantifica la SEQ ID NO: 1.

En una realización preferida de la presente invención, el producto de la expresión de HER2 se cuantificó mediante una técnica de amplificación.

En una realización más preferida de la presente invención el ARNm de HER2 se cuantifica utilizando cebadores y/o sondas específicos.

El experto en la materia sabe que puede conseguirse cuantificación mediante la adición de etapas adicionales a las técnicas de detección.

La detección y/o cuantificación puede realizarse mediante cualquier método conocido por el experto, a condición de que dicho método permita la detección o cuantificación del ARNm en una muestra biológica. Se incluyen entre los ejemplos de estos procedimientos la RCP, la RCP cuantitativa en tiempo real (QRCP), la RCP multiplex, NASBA, LCR, RT-RCP, secuenciación de ARN, hibridación en serie o transferencia "Northern" o combinaciones de éstos. En una realización preferida, la determinación del ARNm se realiza mediante la plataforma nCounter (Nanostring Technologies). En la mayoría de los procedimientos, se requiere el uso de cebadores y/o sondas para detectar y/o cuantificar el ARNm de interés. Un experto en la materia obtendría fácilmente y directamente la secuencia de los cebadores y/o sondas que pueden utilizarse a partir de la secuencia del ARNm de HER2.

En la mayoría de los métodos de detección y cuantificación de ARN mencionados anteriormente, antes de realizar este procedimiento es necesario convertir el ARN en ADN complementario (ADNc). Esta conversión se realiza mediante técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como la transcripción inversa, entre otros.

En una realización de cualquiera de los métodos proporcionados por la presente invención, la cuantificación del producto de expresión génica de HER2 después del inicio de una terapia anti-HER2 se realiza en un día del 5° al 20° día (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) después del inicio de la terapia anti-HER2. En otra realización, la cuantificación del producto de expresión génica de ^hER2 después del inicio de una terapia anti-HER2 se realiza en un día del 5° al 19° día, por ejemplo, a un día del 9° al 19° día, más preferentemente del 5° al 16° día. En otra realización, la cuantificación del producto de expresión génica de HER2 después del inicio de una terapia anti-HER2 se realiza en el día 14° después del inicio de la terapia anti-HER2.

En una realización preferida de los métodos de la invención, el producto de expresión génica de HER2 es ARNm y se cuantifica mediante al menos un par de cebadores y/o sondas. En una realización preferida de la presente invención, la sonda detecta la SEQ ID NO: 3, en una realización particular dos sondas detectan la SEQ ID NO: 3.

En la presente invención, la respuesta anatomopatológica completa (pCR) es la ausencia de células neoplásicas invasoras en el examen microscópico del tumor primario en la cirugía después de que se ha completado un tratamiento de cáncer de mama HER2+, preferentemente mediante un bloqueante dual de HER2, más preferentemente con lapatinib y trastuzumab.

En la presente invención la expresión "después del inicio de una terapia anti-HER2" significa que el sujeto ya ha recibido el tratamiento o que está recibiendo dicho tratamiento (tratamiento en curso).

La terapia anti-HER2 en la presente invención no se proporciona en combinación con quimioterapia. Por tanto, la terapia anti-HER2 se administra al paciente en ausencia de quimioterapia (sin quimioterapia).

Las terapias (tratamiento) anti-HER2 conocidas incluyen trastuzumab (Herceptin®), lapatinib (Tykerb ®), neratinib (HKI-272), pertuzumab (Perjeta®) y ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla®). En una realización de los métodos in vitro proporcionados por la presente invención, la terapia anti-HER2 se selecciona entre la lista que consiste en: trastuzumab, lapatinib, neratinib, pertuzumab y/o ado-trastuzumab emtansina o cualquiera de sus combinaciones. Preferentemente es trastuzumab y lapatinib.

Por tanto, en el caso de que el paciente reciba trastuzumab y lapatinib, el método determina que dicho régimen médico es eficaz cuando la expresión del gen de HER2, preferentemente mediante la cuantificación y/o detección del ARNm, después del inicio de dicha terapia, disminuye en comparación con la expresión basal (antes de recibir dicha terapia). Por tanto, el resultado del tratamiento de dicho paciente es bueno. Por el contrario, cuando dicha comparación muestra que no hay ninguna disminución en la expresión génica entonces dicho régimen médico es menos eficaz o ineficaz. Por tanto, el resultado del tratamiento de dicho paciente es malo. En ese caso, el método de la presente invención es útil para decidir o recomendar cambiar dicho régimen médico y, en particular, para iniciar otro tratamiento y por tanto es útil para determinar el mejor régimen terapéutico para un paciente dado con cáncer de mama HER2+.

La quimioterapia (terapia citotóxica) que podría utilizarse como dicho régimen médico sería paclitaxel, docetaxel, carboplatino, doxorrubicina, epirrubicina, nab-paclitaxel, vinorelbina, capecitabina y eribulina.

En la presente invención el término "eficacia" se relaciona con la pCR del cáncer de mama HER2+, por tanto, la ausencia de células neoplásicas invasoras en el examen microscópico del tumor primario en la cirugía es indicativo de que el tratamiento ha sido eficaz.

En una realización preferida de la invención, la eficacia es la pCR.

La eficacia también puede observarse como cualquier disminución en el tamaño del tumor en el que se utilizan técnicas de formación de imágenes.

La expresión "muestra biológica" incluye, sin limitarse a los mismos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método diseñado para ese fin conocido por los expertos en la materia. La muestra biológica comprende el producto de expresión del gen que codifica HER2.

En una realización de los métodos in vitro proporcionados por la presente invención, la muestra es un tejido mamario, sangre, suero o plasma. En una realización preferida es una muestra de biopsia de tejido de cáncer de mama. En la presente invención, la muestra biológica está fresca, congelada, fijada o fijada e incluida en parafina. En una realización preferida, la muestra es un tejido de cáncer de mama fijado e incluido en parafina. La muestra biológica puede recogerse mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia, por ejemplo mediante biopsia con aguja de la mama.

En la presente invención, los términos "paciente", "sujeto" e "individuo" se utilizan indistintamente.

En la presente invención el paciente es un mamífero, tal como un ratón, rata, cobaya, conejo, perro, gato, bovino, caballo, cabra, oveja, primate o ser humano, preferentemente es un ser humano, más preferentemente es una mujer. El paciente puede ser de cualquier edad, sexo o raza.

En otra realización preferida del primero, segundo y tercer métodos in vitro de la presente invención, el paciente es una mujer.

En la presente invención, el paciente no ha recibido ninguna terapia contra el cáncer previa (ni quimioterapia) antes del inicio de la terapia anti-HER2.

En otra realización preferida de los métodos in vitro de la presente invención, el paciente también puede ser un paciente positivo para receptores hormonales (HR+).

En otra realización preferida de los métodos in vitro de la presente invención, la terapia anti-HER2 se combina con terapia endocrina en pacientes positivo para receptores hormonales (HR+).

El paciente también puede ser un paciente negativo para receptores hormonales (HR-).

La terapia endocrina conocida por el experto en la materia es, por ejemplo: moduladores de respuesta selectivos del receptor de estrógeno (SERM, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, tamoxifeno o toremifeno), inhibidores de la aromatasa (por ejemplo anastrozol, exemestano, letrozol), reguladores negativos del receptor de estrógeno (ERD, por sus siglas en inglés) (por ejemplo fulvestrant) y agentes hormonales liberadores de hormona luteinizante (LHRH, por sus siglas en inglés) (por ejemplo goserelina, leuprolida y triptorelina). En una realización preferida de los métodos y usos de la presente invención, el tratamiento endocrino se selecciona entre la lista que consiste en: un modulador de respuesta selectivo del receptor de estrógeno, un inhibidor de la aromatasa, un regulador negativo del receptor de estrógeno (ERD, por sus siglas en inglés) y/o un agente hormonal liberador de la hormona luteinizante o cualquier combinación de los mismos. En una realización más preferida, el tratamiento endocrino se selecciona entre la lista que consiste en: tamoxifeno, toremifeno, anastrozol, exemestano, letrozol, fulvestrant, goserelina, leuprolida y/o triptorelina o cualquiera de sus combinaciones. En una realización más preferida, es letrozol o tamoxifeno.

Por tanto, una realización preferida de los métodos de la invención se refiere a un método en el que la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib. En una realización más preferida, el paciente además no ha recibido quimioterapia. En una realización más preferida, el producto de expresión génica de HER2 es ARNm, en una realización preferida es la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el paciente es un paciente HR-. En otra realización preferida el paciente es un paciente HR+ y la terapia contra HER2 se combina con letrozol o tamoxifeno. En relación con los métodos del segundo y el tercer aspecto de la invención, además, en una realización preferida, la cuantificación del ARNm después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia se realiza el día 14 después del inicio de la terapia anti-HER2.

Por tanto, una realización preferida de los métodos de la invención se refiere a un método en el que la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib; el paciente es un paciente HR-; el producto de expresión génica de HER2 es ARNm y en una realización preferida es la SEQ ID NO: 1. En relación con los métodos del segundo y el tercer aspecto de la invención, además de en una realización preferida, la cuantificación del ARNm después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia se realiza el día 14 después del inicio de la terapia anti-HER2. En una realización preferida, además, el paciente no ha recibido quimioterapia previamente a la detección/cuantificación de HER2. Una realización preferida de los métodos de la invención se refiere a un método en el que la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib; el paciente es un paciente HR+; la terapia contra HER2 se combina con letrozol o tamoxifeno; el producto de expresión génica de HER2 es ARNm y en una realización preferida es la SEQ ID NO: 1. En relación con los métodos del segundo y el tercer aspecto de la invención, además de en una realización preferida, la detección y/o cuantificación del ARNm después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia se realiza el día 14 después del inicio de la terapia anti-HER2. En una realización preferida, además, el paciente no ha recibido quimioterapia previamente a la detección/cuantificación de HER2.

Por tanto, en una realización preferida del tercer aspecto de la invención, la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib; el paciente es un paciente HR-; el producto de expresión génica de HER2 es ARNm y en una realización más preferida es la SEQ ID NO: 1; la cuantificación del ARNm después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia se realiza el día 14 después del inicio de la terapia anti-HER2; y el régimen alternativo es la quimioterapia. En una realización preferida, además, el paciente no ha recibido quimioterapia previamente a la detección/cuantificación de HER2.

En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib; el paciente es un paciente HR+; la terapia contra HER2 se combina con letrozol o tamoxifeno; el producto de expresión génica de HER2 es ARNm, en una realización más preferida es la SEQ ID NO: 1; la cuantificación del ARNm después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia se realiza el día 14 después del inicio de la terapia anti-HER2; y el régimen alternativo es la quimioterapia. En una realización preferida, además, el paciente no ha recibido quimioterapia previamente a la detección/cuantificación de HER2.

En una realización preferida de los métodos in vitro de la presente invención, el método también comprende la formación de imágenes del sujeto para el cáncer de mama, por ejemplo, mediante ultrasonido. La formación de imágenes puede realizarse en cualquier orden en el método de la invención, por tanto, antes de detectar y/o medir el producto de expresión génica de HER2. La reducción del tamaño del cáncer se asocia a la eficacia de la terapia contra HER2.

La presente invención se refiere también a un método para determinar la eficacia y el tratamiento del cáncer de mama HER2+ en un sujeto diagnosticado con la enfermedad, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) obtener una primera muestra que comprende una muestra de biopsia de tejido de cáncer de mama del sujeto antes del comienzo de una terapia anti-HER2;

b) poner en contacto la primera muestra con un primer reactivo, preferentemente una sonda, que se une al ARNm de HER2;

c) medir una cantidad de ARNm de HER2 que está unido al primer reactivo en la primera muestra;

d) comparar la cantidad de ARNm de HER2 unido al primer reactivo en la etapa c) con el ARNm de HER2 obtenido de una segunda muestra que comprende una muestra de biopsia de tejido de cáncer de mama del sujeto después del inicio de una terapia anti-HER2;

e) determinar el resultado del tratamiento para el sujeto y tratar el sujeto,

en las que:

(i) si la cantidad de ARNm de HER2 unido al primer reactivo en la etapa c) es mayor que la del valor de ARNm de HER2 en la segunda muestra, el tratamiento anti-HER2 es más o muy eficaz; y

(ii) si la cantidad de ARNm unido al primer reactivo en la etapa c) es inferior a la del valor de ARNm de HER2 en la segunda muestra, el tratamiento anti-HER2 es menos eficaz o ineficaz y el tratamiento se selecciona entre el grupo que consiste en: la extirpación del cáncer de mama, el seguimiento, la quimioterapia, la radioterapia y combinaciones de los mismos.

En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, el producto de expresión génica de HER2 es ARNm. Más preferentemente en la que el producto de expresión génica es la SEQ ID NO: 1.

Una realización preferida del cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso en el que el producto de expresión génica es la proteína, en una realización preferida es la SEQ ID NO: 2.

Una realización preferida del cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso en el que la terapia anti-HER2 se selecciona entre el grupo que consiste en: trastuzumab, lapatinib, neratinib, pertuzumab, ado-trastuzumab emtansina o una combinación de los mismos, preferentemente es trastuzumab y lapatinib.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la presente invención, el paciente es una mujer, es preferentemente un paciente positivo para receptores hormonales (HR+). El paciente es un paciente HR+ o un paciente negativo para receptores hormonales (HR-). En la que el paciente es un paciente HR+, la terapia anti-HER2 puede combinarse con la terapia endocrina. En una realización más preferida, el tratamiento endocrino se selecciona entre la lista que consiste en: tamoxifeno, toremifeno, anastrozol, exemestano, letrozol, fulvestrant, goserelina, leuprolida y/o triptorelina o cualquiera de sus combinaciones. En una realización más preferida, es letrozol o tamoxifeno.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la presente invención, la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib; el paciente es un paciente HR-; el producto de expresión génica de HER2 es ARNm y en una realización preferida es la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, además, el paciente no ha recibido quimioterapia previamente a la detección/cuantificación de HER2.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la presente invención, la terapia anti-HER2 es trastuzumab y lapatinib; el paciente es un paciente HR+; la terapia contra HER2 se combina con letrozol o tamoxifeno; el producto de expresión génica de HER2 es ARNm y en una realización preferida es la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, además, el paciente no ha recibido quimioterapia previamente a la detección/cuantificación de HER2. En una realización preferida del quinto aspecto de la presente invención el producto de expresión génica es ARNm, preferentemente la SEQ ID NO: 1; o proteína, preferentemente la SEQ ID NO: 2.

En una realización preferida del quinto aspecto de la presente invención, los medios forman parte de un kit.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende los medios específicos para detectar la presencia o ausencia de HER2 o para cuantificar un producto de expresión génica de HER2, preferentemente su ARNm, para su uso en los métodos de la presente invención. En una realización particular, el kit comprende cebadores y/o sondas específicos, anticuerpos o combinaciones de los mismos. En una realización particular, el kit comprende cebadores y/o sondas específicos para la detección y/o cuantificación de la SEQ ID NO: 1, en una realización más particular, para la detección y/o la cuantificación de la SEQ ID NO: 3.

En toda la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y las variaciones de la palabra, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra "comprende" abarca el caso de "que consiste en". Serán evidentes para los expertos en la materia objetos, ventajas y características adicionales de la invención tras el examen de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención. Los signos de referencia relacionados con los dibujos y puestos entre paréntesis en una reivindicación, son únicamente para intentar aumentar la inteligibilidad de la reivindicación y no deberán interpretarse como limitantes del alcance de la reivindicación. Además, la presente invención incluye todas las combinaciones posibles de las realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1: ERBB2 como factor predictivo de la respuesta del bloqueo dual de HER2 en ausencia de terapia citotóxica

Material y métodos:

Diseño del estudio y pacientes:

PAMELA (NCT01973660) es un estudio sin enmascaramiento, prospectivo, multicéntrico, no aleatorizado de fase 2 en mujeres con cáncer de mama HER2+ (Figura 1). Todos los pacientes elegibles tenían HER2 confirmado centralmente, habían realizado centralmente ensayos de receptor de estrógeno y de receptor de progesterona mediante técnicas de inmunohistoquímica, cáncer de mama en estadio I-IIIA con tumores primarios mayores de 1°cm de diámetro, tenía una edad de 18 años o más y no habían recibido ningún tratamiento previo contra el cáncer. Los tumores tenían que tener una inmunohistoquímica de HER2 3+ o 2+ y tenían que ser positivos para la hibridación cromogénica in situ. Ha de destacarse que los ensayos de HER2, ER y PR se realizaron con acreditación ISO15189. Otros criterios de inclusión principales fueron: estado de rendimiento basal del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0-2, fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) basal del 50 % o más, según se mide por ecocardiografía o adquisición sincronizada múltiple (MUGA, por sus siglas en inglés). Los principales criterios de exclusión fueron los tumores multicéntricos, la enfermedad inoperable en estadio III, la enfermedad en estadio IV, el cáncer de mama bilateral, otros tumores malignos, la insuficiencia de la médula ósea o de la función renal, la insuficiencia hepática, la insuficiencia cardíaca, la hipertensión no controlada, el embarazo y la negativa a utilizar un método anticonceptivo.

El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de Buenas Prácticas Clínicas y la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado. Las aprobaciones para el protocolo del estudio se obtuvieron de los comités de ética independientes.

Procedimientos:

Se proporcionó lapatinib por vía oral a una dosis diaria de 1000 mg. Se proporcionó trastuzumab por vía IV cada 3 semanas a una dosis de carga de 8 mg/kg, seguida de 6 mg/kg. Los pacientes con HR+ recibieron letrozol (2,5 mg diariamente) o tamoxifeno (20 mg diariamente) de acuerdo con el estado menopáusico. La duración total del tratamiento fue de 18 semanas. En la semana 2, era imprescindible una biopsia con aguja gruesa. En la semana 6, era imprescindible una evaluación de respuesta temprana mediante ecografía. Cualquier aumento en el tamaño del tumor durante el estudio o en la semana 6 se consideró un fracaso del tratamiento y el paciente se clasificó como no sensible al criterio de valoración principal (es decir pCR con bloqueo dual). Estos pacientes se trataron con trastuzumab y paclitaxel semanal 80 mg/m2 durante 12 dosis y lapatinib 750 mg por vía oral. Se realizó una cirugía entre las semanas 1 y 3 después de la última dosis de bloqueo dual de HER2 o 2 y 3 semanas después de la última dosis de paclitaxel. Se administró quimioterapia adyuvante convencional de acuerdo con el criterio del médico. Análisis de la expresión de genes:

Una sección de tejido mamario fijado en formol e incluido en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés) se examinó en primer lugar con hematoxilina y eosina para confirmar la presencia de células tumorales invasoras (>10%) y determinar el área superficial tumoral mínima (>4°mm2). Los pacientes no podían ser reclutados a menos que se cumpliera con el requisito mínimo de tejido para el análisis de la expresión génica. Para las muestras el día 15, también se caracterizaron los que no tenían células tumorales invasoras. Para la purificación del ARN (kit a de aislamiento Roche® High Pure RNA FFPET), se utilizaron portaobjetos FFPE de >1-510 pm para cada muestra de ensayo tumoral y se realizó una macrodisección, cuando fue necesario, para evitar la contaminación normal. Se usó un mínimo de ~100 ng de ARN total para medir la expresión de los 555 genes seleccionados de cáncer de mama y 5 genes de limpieza (ACTB, MRPL19, PSMC4, RPLP0 y SF3A1) utilizando la plataforma nCounter (Nanostring Technologies, Seattle, WA, EE.UU.). Los datos se transformaron logarítmicamente en base 2. Se obtuvo la media geométrica de los 5 genes de limpieza para cada muestra y se usó como un factor de normalización para cada gen en cada muestra. El diseño del Conjunto de Códigos 560, incluyendo las secuencias diana, puede encontrarse en la tabla 8.

Análisis estadístico:

El criterio de valoración principal fue la pCR en la mama, que se define como la ausencia de células neoplásicas invasoras en el examen microscópico del tumor primario en la cirugía. Se permitieron lesiones in situ restantes. RESULTADOS:

El ensayo clínico PAMELA:

De octubre de 2013 a diciembre de 2015, se reclutaron 151 pacientes a través de 19 sitios en España. De 151 pacientes reclutadas, 137 pacientes completaron el tratamiento según lo planeado y 14 pacientes interrumpieron el tratamiento (Figura 2). La mediana del tamaño tumoral basal mediante el examen clínico de la mama fue de 2,4°cm y la mayoría de los pacientes tenían axila negativa (64,9%) y eran posmenopáusicas (59,6%) (Tabla 1). Entre las pacientes con enfermedad HR+ (n = 77), el 52 % y el 48 % recibieron tamoxifeno y letrozol, respectivamente, de acuerdo con el estado menopáusico. Todas las pacientes que se sometieron a cirugía tuvieron una evaluación correcta de la respuesta patológica.

T l 1. D m r fi i n l ini i l i .

Se observó una pCR en la mama en 46 de 151 mujeres (30,5 %, IC del 95 % 23,4-38,5). En consonancia con los resultados anteriores, se observaron menos pCR en tumores que eran HR+ en comparación con los HR-negativo (18,2% frente a 43,2%; p = 0,001). Entre 14 pacientes que abandonaron el tratamiento, 6 tenían un fracaso del tratamiento (4,0 % de todos los pacientes). El fracaso del tratamiento se produjo en la enfermedad HR+ (n = 2) y HR-negativa (n = 4). Cinco pacientes de 6 con fracaso del tratamiento recibieron paclitaxel, lapatinib y trastuzumab neoadyuvantes según el protocolo y ninguna consiguió una pCR.

Entre las diferentes variables clínico-patológicas evaluados (edad, tamaño del tumor, estadio tumoral, estado menopáusico, estado ganglionar y estado de los receptores hormonales [HR]), solo se encontró una asociación significativa entre el estado de HR y la pCR (Tabla 2).

T l 2. An li i ^ l M l r r i n l í i l r l i l r mi n .

* RP, razón de posibilidades.

Predicción de la pCR con la expresión génica a partir de muestras basales:

La expresión de 555 genes relacionados con el cáncer de mama y 5 genes constitutivos se realizó satisfactoriamente en todas las muestras basales (n = 151) (véase la tabla 8). Los análisis de validación cruzada (10 veces, repetidos 25 veces) utilizando 4 métodos de selección de variables (prueba-t, prueba-t de Welch, bosques aleatorios [ba] y eliminación recursiva de la característica [erc]), diferente número de genes seleccionados (1,2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 20 y 30) y 3 métodos de clasificación (análisis discriminante lineal diagonal [adld], análisis discriminante lineal [adl] y análisis discriminante cuadrático [adc]), se realizaron para seleccionar el mejor modelo. Como se muestra en la Figura 3 y la Tabla 3, la mejor "exactitud equilibrada", una medida de rendimiento de clasificación, se obtuvo con un solo gen, que fue ERBB2 en todos los análisis realizados.

Tabla 3. Genes seleccionados durante la validación cruzada de 10 veces utilizando diferentes métodos de l ifi i n l i n n .

"Método de clasif.": método de clasificación; N: "número de genes seleccionados"; "Clasif. errónea": Clasificación errónea

Después, se evaluó, utilizando análisis de validación cruzada (10 veces, repetidos 25 veces) y el método adc, el rendimiento de predicción utilizando el análisis de características operativas del receptor (ROC, por sus siglas en inglés) (es decir, el área bajo la curva ROC [abROC]) cuando se seleccionaron 1, 2, 3, 4, 5 y 10 genes. Como se muestra en la Figura 4, 1 gen individual, que fue ERBB2 en todos los casos, mostró los auROC más altos.

Predicción de la pCR con la expresión de ERBB2 a partir de muestras basales:

En general, estos datos indicaron que entre los 555 genes relacionados con el cáncer de mama, ERBB2 era el gen más robusto para predecir la respuesta tras el bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia. Después, se exploró la posibilidad de la expresión de ERBB2 para predecir la pCR en todo el conjunto de datos de 151 pacientes con muestras de tumores basales. En primer lugar, se calculó el rendimiento de ERBB2 para la predicción de la pCR (Figura 5). Los resultados revelaron un ABC de 0,804.

En segundo lugar, se evaluó la expresión de ERBB2 en pacientes que consiguieron una pCR frente a los que no la consiguieron (sin-pCR) (Figura 5). Los resultados revelaron que la mediana de la expresión de ERBB2 en el grupo de pCR fue de 3,24 y la mediana de la expresión de ERBB2 en el grupo sin-pCR fue de 1,83. La diferencia era 1,42, lo que equivale a una diferencia de 2,68 veces. En tercer lugar, se exploraron las tasas de pCR de acuerdo con la expresión de ERBB2. Utilizando terciles (puntos de corte de puntuación de ERBB2 de 2,93 y 1,61), la tasa de pCR en los terciles más altos, intermedios y bajos fue del 58,8 %, del 24 % y del 8 %, respectivamente. Utilizando cuartiles (puntos de corte de puntuación de ERBB2 de 3,21, 2,45 y 0,97), la tasa de pCR en los cuartiles más altos (los cuartiles 2 intermedios combinados en 1 grupo), intermedios y más bajos fue del 64,9%, del 23,7% y del 10,5%, respectivamente.

Capacidad de ERBB2 en el período basal para predecir la pCR en comparación con el estado de RH:

El estado de HR era el único factor predictivo molecular, hasta la fecha, para predecir la pCR después del bloqueo HER2 dual en ausencia de terapia citotóxica. A continuación, se evaluó la capacidad de ERBB2 para predecir la pCR más allá del estado de RH. En un modelo de regresión logística de dos variables que incluye el estado de los HR y la expresión de ERBB2 (Tabla 4), se observó que ERBB2 permanece significativamente asociado a la pCR, mientras que el estado de RH pierde su significación estadística. Estos resultados indican que el ERBB2 proporcionar más información predictiva que el estado de RH.

Tabla 4. Asociación de ERBB2 línea de base y HR con pCR.

Una variable Dos variables

Tasa

de

Distintivos N pCR RP ^95%95 % Valor 95 % Valor en la _inferiorsuperior de p ^RP95 %

inferior superior de p mama

ERBB2

_basal 151 NA 2,62 1,8 3,9 <0,001 2,41 1,6 3,7 <0,001 Estado de

HR

HR+ 77 18,2 % 1 - - - 1 - - -

^HR- 74 43,2 % 3,42 _negativo 1,6 7,2 0,001 1,68 0,7 3,9 0,224 Predicción de la pCR con la expresión de ERBB2 en el período basal, en la semana 2 y relación entre la semana 2 y el período basal:

Un total de 144 muestras emparejadas estaban disponibles en PAMELA de las 151 pacientes reclutadas. Esto representa el 95 % de todas las muestras disponibles. Por tanto, este conjunto de datos emparejados permitieron comparar la capacidad de predicción de la expresión de ERBB2 medida en el período basal, en la semana 2 y la relación de la expresión de ERBB2 entre los 2 puntos temporales. Para comparar los resultados, se compararon las ABC entre los tres biomarcadores (Figura 6). Los resultados revelaron que la relación de la expresión de ERBB2 entre los puntos temporales semana 2 y período basal era el mejor factor predictivo de la pCR (Figura 6) con un ABC de 0,878.

En segundo lugar, se exploraron las tasas de pCR de acuerdo con la relación de la expresión de ERBB2 entre los puntos temporales semana 2 y período basal. Utilizando terciles (puntos de corte de puntuación de ERBB2 de -3,04 y -0,35), la tasa de pCR en los terciles más bajos, intermedios y altos fue del 64,6 %, del 25 % y del 2 %, respectivamente. Utilizando cuartiles (puntos de corte de puntuación de ERBB2 de -3,88, -1,37 y 0,009), la tasa de pCR en los cuartiles más bajos, intermedios (los 2 cuartiles intermedios combinados en 1 grupo) y más altos fue del 75 %, del 22,2 % y del 2,7%, respectivamente.

En general, estos datos indicaron que el mejor factor predictivo de la pCR era la relación de la expresión de ERBB2 entre los puntos temporales semana 2 y período basal. Sin embargo, no estaba claro si esto podía mejorarse mediante la adición de genes. Por tanto, utilizando los 555 genes relacionados con el cáncer de mama, se evaluó la mejor relación de expresión génica para predecir la pCR. Para ello, se calculó la relación de expresión entre los puntos temporales semana 2 y período basal (es decir, semana 2/período basal) para cada gen. Al igual que en el análisis anterior con las muestras del período basal solamente, se realizó un análisis de validación cruzada (10 veces, repetido 25 veces) utilizando 4 métodos de selección de variables (prueba-t, prueba-t de Welch, bosques aleatorios [ba] y eliminación recursiva de la característica [erc]), diferente número de genes seleccionados (1,2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 20 y 30) y 3 métodos de clasificación (análisis discriminante lineal diagonal [adld], análisis discriminante lineal [adl] y análisis discriminante cuadrático [adc]). Como se muestra en la Figura 7 y la Tabla 5, se obtuvieron "exactitudes equilibradas" similares con un número diferente de genes. Ha de destacarse que cuando se utilizan diferentes métodos de clasificación y selección de variables, se descubrió que el ERBB2 era el gen que más se asociaba a la pCR. Estos resultados indicaron que no se gana mucho rendimiento de predicción mediante la adición de nuevos genes más allá de ERBB2.

Tabla 5. Genes seleccionados durante la validación cruzada de 10 veces utilizando diferentes métodos de l ifi i n l i n n .

"Método de clasif.": método de clasificación; "Método de selecc. de variable": Método de selección de variables; "N. de genes selecc": Número de genes seleccionados; "Clasif. errónea": clasificación errónea; "Exact. equilibr.": exactitud equilibrada

Además, se evaluó, utilizando análisis de validación cruzada (10 veces, repetidos 25 veces) y el método adc, el rendimiento de predicción utilizando el análisis de características operativas del receptor (ROC, por sus siglas en inglés) (es decir, el área bajo la curva ROC [abROC]) cuando se seleccionaron 1, 2, 3, 4, 5 y 10 genes. Como se muestra en la Figura 8, 1 gen individual, que era ERBB2 en todos los casos, mostró una de las ABC más altas. En efecto, un modelo de 2 genes, que incluía ERBB2 y GRB7 (es decir, k = 2), aunque mostró un ABC numéricamente más alta, no mejoró significativamente el ABC en comparación con el ERBB2 solo. En general, estos datos indicaron que entre los mama 555 genes relacionados con el cáncer de, la relación de expresión de ERBB2 entre los puntos temporales semana 2 y período basal era la más robusta para predecir la respuesta tras el bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia.

Capacidad de la relación de ERBB2 para predecir la pCR en comparación con el estado de HR:

El estado de HR era el único factor predictivo molecular, hasta la fecha, para predecir la pCR después del bloqueo HER2 dual en ausencia de terapia citotóxica. En el presente documento se evaluó la capacidad de ERBB2 para predecir la pCR más allá del estado de RH. En un modelo de regresión logística de dos variables que incluye el estado de los HR y la expresión de ERBB2 (Tabla 6), se observó que la relación de ERBB2 permanece significativamente asociada a la pCR, mientras que el estado de RH pierde su significación estadística. Estos resultados indican que la relación de ERBB2 proporciona más información predictiva que el estado de RH.

Tabla 6. Asociación de la relación de ERBB2 y HR con pCR.

Una variable Dos variables

Tasa

Distintivos N ^{de pCR}RP 95% 95 % Valor Valor _{en la}inferior superior de p ^RP95 % 95 %

inferior superior de p mama

Relación

_{de ERBB2} 151 NA 0,49 0,4 0,6 <0,001 0,51 0,4 0,6 <0,001 Estado de

HR HR+ 77 18,2 % 1 - - - 1 - - - ^HR- 74 43,2 % 3,42 1,6 7,2 0,001 1,76 0,7 4,6 0,244 Capacidad de la relación de ERBB2 para predecir la pCR en comparación con el ERBB2 basal

En el presente documento se comparó la capacidad de la relación de ERBB2 para predecir la pCR en comparación con el ERBB2 basal en las 144 muestras emparejadas. En un modelo de regresión logística de dos variables que incluye el ERBB2 basal y la relación de e Rbb2 (Tabla7), se observó que la relación de ERBB2 permanece significativamente asociada a la pCR, mientras que el ERBB2 basal pierde su significación estadística. Estos resultados indican que la relación de ERBB2 proporciona más información predictiva que el ERBB2 basal, los que es coherente con los resultados de las ABC anteriores.

Tabla 7. Asociación de la relación de ERBB2 y el ERBB2 basal con la pCR.

Una variable Dos variables

Tasa

de

Distintivos N pCR RP ^95%95 % Valor 95 % 95 % Valor en la _inferiorsuperior de p ^RPinferior superior de p mama

ERBB2 151 NA 2,56 _basal 1,7 3,8 <0,001 1,39 0,9 2,2 0,149 Relación

_{de ERBB2} 151 NA 0,49 0,4 0,6 <0,001 0,51 0,4 0,7 <0,001 CONCLUSIONES:

En el presente estudio, se ha demostrado que la expresión de ERBB2 solo es el mejor factor predictivo de la pCR después del bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia. Este biomarcador puede evaluarse ya sea en el período basal, en la semana 2 de tratamiento o ambos. Estos resultados indican que la capacidad de predicción de la expresión de ERBB2 basal es similar a la expresión de ERBB2 en la semana 2; sin embargo, la combinación de los datos de expresión de ERBB2 procedentes de ambos puntos temporales (es decir, la relación de ERBB2) es el mejor factor predictivo de entre los tres. Por tanto, desde una perspectiva clínica, la expresión de ERBB2 podría utilizarse ya sea solamente en el período basal (es decir, antes de iniciar el tratamiento) o en ambos puntos temporales (es decir, la relación de ERBB2) si hay disponible una biopsia en la semana 2. De cualquier manera, ambos factor predictivos pueden identificar el ~25 % (cuartil superior) de los pacientes con enfermedad HER2+ que conseguirán una pCR en el 64,9-75 % de los casos si se trata con el bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia. Es importante destacar que, el ERBB2 basal o la relación de ERBB2, proporcionan más información, e independiente, en comparación con el estado de HR, que es el único factor predictivo molecular hasta la fecha que se encontró que se asociaba sistemáticamente a la pCR en el cáncer de mama HER2+ después del bloqueo dual de HER2 sin quimioterapia.

T l : Di ñ n n i n n r™ r l n

Tabla 8: continuación

Tabla 8: continuación

Tabla 8: continuación

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para determinar la eficacia de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+ que comprende:

(a) la cuantificación de un producto de expresión génica de HER2 en una muestra biológica aislada del paciente:

(a.i) antes de comenzar la terapia anti-HER2, y

(a.ii) a un día del 5° al 20° día después del inicio de la terapia anti-HER2,

en el que, si existe una reducción entre el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) en comparación con (a.i), es indicativo de la eficacia de la terapia anti-HER2.

2. Un método in vitro para decidir o recomendar a un paciente con cáncer de mama HER2+ si iniciar o no un régimen médico alternativo a una terapia anti HER2 en ausencia de quimioterapia, que comprende:

(a.i) antes de comenzar la terapia anti-HER2, y

en el que si el producto de expresión génica cuantificado en la etapa (a.ii) es mayor que en (a.i), es indicativo de que se necesita el régimen médico alternativo.

3. El método in vitro para decidir o recomendar si iniciar o no un régimen médico alternativo de acuerdo con la reivindicación 2 en el que el régimen médico alternativo es quimioterapia, cirugía, radioterapia o cualquier combinación de las mismas.

4. El método in vitro para decidir o recomendar si iniciar o no un régimen médico alternativo de acuerdo con la reivindicación 3 en el que la quimioterapia se selecciona entre el grupo que consiste en: paclitaxel, docetaxel, carboplatino, doxorrubicina, epirrubicina, nab-paclitaxel, vinorelbina, capecitabina y eribulina o cualquier combinación de los mismos.

5. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la cuantificación del producto de expresión génica de HER2 después del inicio de una terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia se realiza los días 9-19 después del inicio de la terapia anti-HER2, más preferentemente el día 14 después del inicio de la terapia anti-HER2.

6. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el producto de expresión génica de HER2 es ARNm; o, alternativamente, es SEQ ID NO:1; o, alternativamente, es SEQ ID NO: 2; o, alternativamente, la secuencia cuantificada es SEQ ID NO: 3.

7. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la terapia anti-HER2 se selecciona entre el grupo que consiste en: trastuzumab, lapatinib, tratuzumab y lapatinib, neratinib, pertuzumab, ado-trastuzumab emtansina o cualquier combinación de los mismos.

8. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el paciente es una mujer.

9. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que el paciente es un paciente positivo para receptores hormonales (H^r+), o es un paciente negativo para receptores hormonales (HR-), o es un paciente positivo para receptores hormonales (HR+) y la terapia anti-HER2 se combina con terapia endocrina.

10. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 9 en el que, cuando el paciente es un paciente positivo para receptores hormonales (HR+) y la terapia anti-HER2 se combina con terapia endocrina, la terapia endocrina se selecciona entre el grupo que consiste en: tamoxifeno, toremifeno, anastrozol, exemestano, letrozol, fulvestrant, goserelina, leuprolida y/o triptorelina o cualquiera de sus combinaciones.

11. Uso de un ratio de un producto de expresión génica de HER2 antes y a un día del 5° al 20° día después de comenzar una terapia anti-HER 2 como marcador in vitro para determinar la eficacia de la terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+, o, como alternativa, como marcador in vitro para decidir o recomendar si iniciar o no un régimen médico alternativo a la terapia anti-HER2 en ausencia de quimioterapia en un paciente con cáncer de mama HER2+.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el régimen médico alternativo es quimioterapia, cirugía, radioterapia o cualquier combinación de las mismas.

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 en el que la terapia anti-HER2 se selecciona entre el grupo que consiste en: trastuzumab, lapatinib, trastuzumab y lapatinib, neratinib, pertuzumab, adotrastuzumab emtansina o cualquier combinación de los mismos.

14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que el paciente es un paciente positivo para receptores hormonales (HR+), o es un paciente negativo para receptores hormonales (HR-), o es un paciente positivo para receptores hormonales (HR+)y la terapia anti-HER2 se combina con terapia endocrina.

15. Uso de medios para determinar la presencia o para cuantificar el producto de expresión génica de HER2 en cualquiera de los métodos como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.