ES2910449T3 - Procedimiento de mantenimiento de una columna de punta de pipeta en un estado húmedo y columna de punta de pipeta - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de mantenimiento de una columna de punta de pipeta en un estado húmedo, que comprende las etapas que consisten en: a) proporcionar una columna de punta de pipeta, donde la columna comprende un lecho rellenado de perlas de resina de gel, y donde al menos el 99 % del espacio intersticial está ocupado por un disolvente miscible en agua con un punto de ebullición superior a 100 °C; donde la punta de pipeta comprende: i) un cuerpo de columna de punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; ii) una frita inferior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo; iii) una frita superior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna definen una cámara de medio; iv) el lecho rellenado de perlas de resina de gel colocado en el interior de la cámara de medio, b) almacenar la columna de modo que esté abierta a la temperatura ambiente, a la presión de aire y a la humedad.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de mantenimiento de una columna de punta de pipeta en un estado húmedo y columna de punta de pipeta

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al campo de la extracción de analitos de una solución de muestra. Los analitos pueden incluir biomoléculas, particularmente macromoléculas biológicas, tales como proteínas y péptidos. El dispositivo y procedimiento de esta invención son particularmente útiles en proteómica para la preparación y análisis de muestras con tecnologías analíticas que emplean biochips, espectrometría de masas y otra instrumentación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La extracción en fase sólida es una tecnología poderosa para purificar y concentrar analitos, incluyendo las biomoléculas. Por ejemplo, es una de las principales herramientas utilizadas para preparar muestras de proteínas antes del análisis mediante una variedad de técnicas analíticas, incluyendo la espectrometría de masas, la resonancia de plasmones superficiales, la resonancia magnética nuclear, la cristalografía de rayos X y similares. Con estas técnicas, normalmente solo se requiere un pequeño volumen de muestra. Sin embargo, a menudo es fundamental que los contaminantes que interfieren se eliminen de la muestra y que el analito de interés esté presente en una concentración mínima. Por tanto, se necesitan procedimientos de preparación de muestras que permitan la purificación y concentración de muestras de pequeño volumen con una pérdida mínima de muestras.

Erdjument-Bromage H y col. ("Examination of micro-tip reversed phase liquid chromatographic extraction of peptide pools for mass spectrometric analysis", Journal of Chromatography A, ELSEVIER, Ámsterdam, NL, vol. 826, n.° 2, 27 de noviembre de 1998 (1998-11-27), págs. 167-181, XP004150465, ISSN: 0021-9673, DOI: 10, 1016/S0021-9673(98)00705-5) se refiere a la extracción por cromatografía líquida en fase inversa. Más específicamente, se trata de un estudio de los aspectos cuantitativos y cualitativos de la extracción de polipéptidos utilizando micropuntas identificadas como perlas POROS 50 R2 que son partículas de poliestireno divinilbenceno.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un procedimiento de mantenimiento de una columna de punta de pipeta en un estado húmedo, que comprende las etapas que consisten en:

a) proporcionar una columna de punta de pipeta, donde la columna comprende un lecho rellenado de perlas de resina de gel, y donde al menos el 99 % del espacio intersticial está ocupado por un disolvente miscible en agua con un punto de ebullición superior a 100 °C;

donde la punta de pipeta comprende:

i) un cuerpo de columna de punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna;

ii) una frita inferior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo;

iii) una frita superior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna definen una cámara de medio;

iv) el lecho rellenado de perlas de resina de gel colocado en el interior de la cámara de medio,

b) almacenar la columna de modo que esté abierta a la temperatura ambiente, a la presión de aire y a la humedad.

Además, la invención también proporciona una columna de punta de pipeta que comprende:

un lecho rellenado de perlas de resina de gel, donde al menos el 99 % del espacio intersticial está ocupado por un disolvente miscible en agua con un punto de ebullición superior a 100 °C;

donde la columna de punta de pipeta comprende:

i) un cuerpo de columna de punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna;

ii) una frita inferior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo;

iii) una frita superior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna definen una cámara de medio;

iv) el lecho rellenado de perlas de resina de gel colocado en el interior de la cámara de medio, y donde la columna está abierta a la temperatura ambiente, a la presión de aire y a la humedad.

En determinadas realizaciones preferidas de la invención, la columna de punta de pipeta comprende un lecho rellenado compuesto por perlas de resina de gel de agarosa o sefarosa.

En determinadas realizaciones de la invención, el lecho de perlas de resina de gel tiene un volumen de entre aproximadamente 0,1 pl y 100 pl, entre aproximadamente 0,1 pl y 20 pl, entre aproximadamente 0,1 pl y 10 pl, entre aproximadamente 1 pl y 100 pl, entre aproximadamente 1 pl y 20 pl, entre aproximadamente 1 pl y 10 pl, o entre aproximadamente 3 pl y 10 pl.

En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior tiene/tienen un bajo volumen de poro.

En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior tiene/tienen menos de 200 micrómetros de espesor.

En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior tiene/tienen un volumen de poro igual a 10 % o inferior al volumen intersticial del lecho de medio de extracción.

En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior tiene/tienen un volumen de poro de 0,5 microlitros o menos.

En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior es/son un tamiz de membrana, por ejemplo, una membrana tejida de nailon o poliéster.

En determinadas realizaciones de la invención, las perlas de resina de gel tienen un grupo de unión por afinidad que tiene afinidad por una molécula biológica de interés, por ejemplo, Proteína A, Proteína G y un metal inmovilizado fijado a las perlas.

En determinadas realizaciones de la invención, el cuerpo de columna de punta de pipeta comprende un material de policarbonato, polipropileno o polietileno.

En determinadas realizaciones de la invención, el cuerpo de columna de punta de pipeta comprende un adaptador luer, una jeringa o una punta de pipeta.

En determinadas realizaciones de la invención, el extremo superior del cuerpo de columna de punta de pipeta está fijado a una bomba para aspirar fluido a través del extremo inferior del cuerpo de columna de punta de pipeta, por ejemplo, una pipeta, una jeringa, una bomba peristáltica, una bomba electrocinética, o una bomba fluídica basada en inducción.

En determinadas realizaciones de la invención, la columna de punta de pipeta comprende un miembro tubular inferior que comprende: el extremo inferior del cuerpo de columna, un primer extremo de acoplamiento y un canal abierto inferior entre el extremo inferior del cuerpo de columna y el primer extremo de acoplamiento; y un miembro tubular superior que comprende el extremo superior del cuerpo de columna, un segundo extremo de acoplamiento y un canal abierto superior entre el extremo superior del cuerpo de columna y el segundo extremo de acoplamiento, el tamiz de membrana superior de la columna de extracción unido al canal abierto superior y que se extiende a través del mismo en el segundo extremo de acoplamiento; donde el primer extremo de acoplamiento se acopla con el segundo extremo de acoplamiento para formar un acoplamiento de sellado. En algunas de estas realizaciones, el primer extremo de acoplamiento tiene un diámetro interno que coincide con el diámetro externo del segundo extremo de acoplamiento, y donde el primer extremo de acoplamiento recibe el segundo extremo de acoplamiento en una relación telescópica. El primer extremo de acoplamiento tiene opcionalmente un orificio ahusado que coincide con una superficie externa ahusada del segundo extremo de acoplamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 representa una columna de punta de pipeta según la invención, que está construida a partir de una punta de pipeta ahusada.

La Fig. 2 es una vista ampliada de la columna de extracción de la Fig. 1.

La Fig. 3 representa una realización de la invención donde la columna de punta de pipeta está construida a partir de dos miembros cilindricos.

La Fig. 4 representa una realización de bomba de jeringa de la invención con un lecho cilindrico de perlas de resina de gel en la punta.

La Fig. 5 es una vista ampliada del elemento de columna de punta de pipeta de la realización de bomba de jeringa de la Fig. 4.

Las Figs. 6-10 muestran etapas sucesivas en la construcción de la realización representada en las Figs. 1 y 2. La Fig. 11 representa una realización de la invención con una configuración de conexión recta como se describe en el Ejemplo 8.

La Fig. 12 representa una realización de la invención con una tapa de extremo y una configuración de anillo de retención como se describe en el Ejemplo 9.

La Fig. 13 representa un ejemplo de un aparato de extracción multiplexado.

La Fig. 14 es un gel SDS-PAGE al que se hace referencia en el Ejemplo 11.

La Fig. 15 representa una columna de punta de pipeta fijada a una pipeta y señala el espacio de cabeza.

La Fig. 16 representa gráficamente la presión de descarga de una columna de punta de pipeta, el volumen de cámara de una jeringa fijada a la columna de punta de pipeta y el volumen de líquido en la columna, todo en función del tiempo, durante un procedimiento de extracción típico.

La Fig. 17 representa la columna de punta de pipeta de la invención.

La Fig. 18 representa una realización preferida de la invención de la realización general representada en la Fig. 17. La Fig. 19 representa una columna de punta de pipeta fijada a un aparato para determinar la contrapresión de la columna.

Las Figs. 20 y 21 representan un procedimiento de determinación de la contrapresión de una frita de membrana como se describe en el Ejemplo 12.

La Fig. 22 representa una frita porosa, cuya contrapresión se determinará como se describe en el Ejemplo 12. La Fig. 23 representa una columna de punta de pipeta a almacenar en un estado húmedo según la invención. Las Figs. 24 a 27 representan un procedimiento de colocación de columnas de punta de pipeta en un procedimiento de extracción multiplexado.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a un procedimiento de mantenimiento de una columna de punta de pipeta en un estado húmedo; y a una columna de punta de pipeta. El dispositivo y procedimiento de esta invención son particularmente útiles en relación con la proteómica para la preparación y análisis de muestras con tecnologías analíticas que emplean biochips, espectrometría de masas y otra instrumentación.

Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un polímero que lleva un carbonilo protegido incluiría un polímero que lleva dos o más carbonilos protegidos y similares.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entienden normalmente los expertos en la materia a la que pertenece la invención.

Definiciones

En la presente descripción, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.

La expresión "volumen de lecho", como se usa en esta invención, se define como el volumen de un lecho de medio de extracción en una columna de extracción. Dependiendo de la densidad de relleno del lecho, el volumen del medio de extracción en el lecho de columna suele ser de un tercio a dos tercios del volumen total del lecho; los lechos bien rellenos tienen menos espacio entre las perlas y, por ende, generalmente tienen volúmenes intersticiales más bajos.

La expresión "volumen intersticial" del lecho se refiere al volumen del lecho de medio de extracción que es accesible al disolvente, por ejemplo, soluciones acuosas de muestra, soluciones de lavado y disolventes de desorción. Por ejemplo, en el caso de que el medio de extracción sea una perla de cromatografía (por ejemplo, agarosa o sefarosa), el volumen intersticial del lecho constituye el volumen accesible del disolvente entre las perlas, así como cualquier región interna accesible del disolvente de la perla, por ejemplo, poros accesibles del disolvente. El volumen intersticial del lecho representa el volumen mínimo de líquido requerido para saturar el lecho de columna.

La expresión "volumen muerto", como se usa en esta invención con respecto a una columna, se define como el volumen intersticial del lecho de extracción, los tubos, la membrana o fritas y los conductos en una columna. Algunas realizaciones preferidas de la invención implican columnas de bajo volumen muerto, como se describe con más detalle en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 10/622.155.

La expresión "volumen de elución", como se usa en esta invención, se define como el volumen de líquido de desorción o elución en el que se desorben y recogen los analitos. Las expresiones "disolvente de desorción", "líquido de elución" y similares se usan en esta invención de forma intercambiable.

La expresión "factor de enriquecimiento", como se usa en esta invención, se define como la relación del volumen de muestra dividido por el volumen de elución, asumiendo que no hay contribución de líquido proveniente del volumen muerto. En la medida en que el volumen muerto diluya los analitos o impida la adsorción completa, se reduce el factor de enriquecimiento.

Las expresiones "columna de extracción" y "punta de extracción", como se usan en esta invención, se definen como un dispositivo de columna usado en combinación con una bomba, conteniendo el dispositivo de columna un lecho de material de extracción en fase sólida, es decir, medio de extracción.

El término "frita", como se usa en esta invención, se define como material poroso para mantener el medio de extracción en su lugar en una columna. Una cámara de medio está definida por fritas superior e inferior colocadas en una columna. En realizaciones preferidas de la invención, la frita es un filtro delgado de bajo volumen de poro, por ejemplo, una tamiz de membrana.

La expresión "cuerpo de columna inferior", como se usa en esta invención, se define como el lecho de columna y el tamiz de membrana inferior de una columna.

La expresión "tamiz de membrana", como se usa en esta invención, se define como una tela o tamiz tejido o no tejido para mantener el relleno de la columna en su lugar en el lecho de columna, teniendo las membranas un volumen muerto bajo. Las membranas tienen una resistencia suficiente para resistir el relleno y el uso del lecho de columna y una porosidad suficiente para permitir el paso de líquidos a través del lecho de columna. La membrana es lo suficientemente delgada para que se pueda sellar alrededor del perímetro o la circunferencia del tamiz de membrana de modo que los líquidos fluyan a través del tamiz.

La expresión "volumen de muestra", como se usa en esta invención, se define como el volumen del líquido de la solución de muestra original a partir de la cual se separan o purifican los analitos.

La expresión "cuerpo de columna superior", como se usa en esta invención, se define como la cámara y el tamiz de membrana superior de una columna.

El término "biomolécula", como se usa en esta invención, se refiere a una biomolécula derivada de un sistema biológico. El término incluye macromoléculas biológicas, tales como proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.

La expresión "chip de proteína" se define como una pequeña placa o superficie sobre la que se va a depositar o se ha depositado una matriz de muestras de proteínas separadas, discretas. Estas muestras de proteínas suelen ser pequeñas y, a veces, se denominan "manchas". En general, un chip que lleva una matriz de proteínas discretas está diseñado para ponerse en contacto con una muestra que tiene una o más biomoléculas que pueden o no tener la capacidad de unirse a la superficie de una o más de las manchas, y la aparición o ausencia de dicha unión en cada mancha se determina posteriormente. Una referencia que describe los tipos y funciones generales de los chips de proteínas es Gavin MacBeath, Nature Genetics Supplement, 32:526 (2002).

Columnas

En la presente descripción, se pueden emplear técnicas químicas, biológicas y analíticas convencionales dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Chromatography, 5' edición, PARTE A: FUNDAMENTALS An D TECHNIQUES, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York (1992); ADVANCED CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROMIGRATION METHODS IN BIOSCIENCES, editor: Z. Deyl, Elsevier Science BV, Ámsterdam, Países Bajos, (1998); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole y Salwa K. Poole, y Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, (1991).

En algunas realizaciones de la invención objeto, el lecho rellenado de perlas de resina de gel está contenido en una columna de punta de pipeta de bajo volumen muerto.

Cuerpo de columna

El cuerpo de columna es un tubo que tiene dos extremos abiertos conectados por un canal abierto, a veces denominado conducto pasante. El tubo puede tener cualquier forma, incluyendo, aunque de forma no limitada, cilíndrica o troncocónica, y cualquier dimensión acorde con la función de la columna como se describe en esta invención. De acuerdo con la invención, el cuerpo de columna adopta la forma de una punta de pipeta. En la punta de pipeta, el extremo de la punta donde se sitúa el lecho de perlas de resina de gel puede adoptar cualquier número de geometrías, por ejemplo, puede ser ahusado o cilíndrico. En algunos casos, un canal cilíndrico de radio relativamente constante puede ser preferible a una punta ahusada, por una variedad de razones, por ejemplo, la solución fluye a través del lecho a una velocidad uniforme, en lugar de variar en función de un diámetro de canal variable.

En algunas realizaciones, uno de los extremos abiertos de la columna, a veces denominado en esta invención extremo superior abierto de la columna, está adaptado para su fijación a una bomba, ya sea directa o indirectamente. En algunas realizaciones de la invención, el extremo abierto superior está fijado operativamente a una bomba, por lo que la bomba se puede usar para aspirar (es decir, extraer) un fluido en la columna de extracción a través del extremo inferior abierto de la columna y, opcionalmente, para descargar (es decir, expulsar) fluido a través del extremo inferior abierto de la columna.

El cuerpo de columna puede estar compuesto por cualquier material que sea lo suficientemente no poroso como para que pueda retener fluido y que sea compatible con las soluciones, medio, bombas y analitos utilizados. Debe emplearse un material que no reaccione sustancialmente con las sustancias con las que entrará en contacto durante el uso de la columna de extracción, por ejemplo, las soluciones de muestra, el analito de interés, el medio de extracción y el disolvente de desorción. Un amplio intervalo de materiales adecuados están disponibles y son conocidos por los expertos en la materia, y la elección es una cuestión de diseño. Diversos plásticos son materiales ideales para el cuerpo de columna, pero en algunas realizaciones de la invención, se podrían utilizar otros materiales tales como vidrio, cerámica o metales. Algunos ejemplos de materiales preferidos incluyen polisulfona, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, poliétersulfona, politetrafluoroetileno, acetato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, copolímero de acrilonitrilo y PVC, poliestireno, copolímero de poliestireno/acrilonitrilo, fluoruro de polivinilideno, vidrio, metal, sílice y combinaciones de los materiales enumerados anteriormente.

Se proporcionan algunos ejemplos específicos de cuerpos de columna adecuados.

Medio de extracción

El medio de extracción utilizado en la columna es perlas de resina de gel (por ejemplo, una perla porosa o no porosa) que tiene afinidad por un analito de interés. Normalmente, el analito de interés es una proteína, un péptido o un ácido nucleico. Los procedimientos de extracción pueden ser de afinidad, exclusión por tamaños, fase inversa, fase normal, intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba o agentes de cromatografía de interacción hidrófila. Por tanto, las expresiones "columna de separación" y "columna de extracción" se pueden usar indistintamente. El término "analito" puede referirse a cualquier compuesto de interés, por ejemplo, que va a ser analizado o simplemente retirado de una solución.

El volumen de lecho del medio de extracción usado en las columnas de la invención está normalmente en el intervalo de 0,1 pl-25 ml, preferiblemente en el intervalo de 0,1 jil-10 ml, por ejemplo, en un intervalo que tiene un límite inferior de 0,1 |jl, 0,5 |jl, 1 |jl, 1,5 |jl, 2 jil, 2,5 jil, 3 jil, 5 |jl o 10 jil; y un límite superior de 5 jil, 10 jil, 15 jil, 20 jil, 30 jil, 40 jil, 50 jil, 60 jil, 70 jil, 80 jil, 90 jil, 100 jil, 150 jil, 200 jil, 300 jil, 400 jil, 500 jil, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml o 25 ml. Los bajos volúmenes de lecho empleados en determinadas realizaciones contribuyen a un bajo volumen intersticial del lecho, reduciendo el volumen muerto de la columna.

Los bajos volúmenes de lecho empleados en determinadas realizaciones permiten el uso de cantidades relativamente pequeñas de perlas de resina de gel. Por ejemplo, algunas realizaciones de la invención emplean un lecho que tiene un peso seco inferior a 1 gramo (por ejemplo, en el intervalo de 0,001-1 g, 0,005-1 g, 0,01-1 g o 0,02-1 g), inferior a 100 mg (por ejemplo, en el intervalo de 0,1-100 mg, 0,5-100 mg, 1-100 mg, 2-100 mg o 10-100 mg), inferior a 10 mg (por ejemplo, en el intervalo de 0,1-10 mg, 0,5-10 mg, 1-10 mg o 2-10 mg), inferior a 2 mg (por ejemplo, en el intervalo de 0,1-2 mg, 0,5-2 mg o 1-2 mg), o inferior a 1 mg (por ejemplo, en el intervalo de 0,1-1 mg o 0,5-1 mg).

En determinadas realizaciones, se usan volúmenes de lecho más grandes que requieren cantidades más grandes de perlas de resina de gel. En estas realizaciones, el lecho de medio de extracción puede tener un peso seco de hasta 50 gramos, por ejemplo, en un intervalo que tiene un límite superior de 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 g.

La expresión "resina de gel" se refiere a una resina que comprende materiales de perlas de baja reticulación que pueden hincharse en un disolvente, por ejemplo, tras la hidratación. Reticulación se refiere al enlace físico de las cadenas poliméricas que forman las perlas. El enlace físico normalmente se logra a través de un monómero de reticulación que contiene funcionalidad de bipolimerización de modo que durante el procedimiento de polimerización, la molécula puede incorporarse en dos cadenas poliméricas diferentes. El grado de reticulación de un material particular puede variar de 0,1 a 30 %, utilizándose normalmente de 0,5 a 10 %. Lo más habitual es una reticulación del 1 al 5 %. Un menor grado de reticulación hace que la perla sea más permeable al disolvente, lo que hace que los sitios funcionales dentro de la perla sean más accesibles al analito. Sin embargo, una perla poco reticulada puede deformarse fácilmente y solo debe usarse si el flujo de eluyente a través del lecho es lo suficientemente lento o suave para impedir el cierre de los espacios intersticiales entre las perlas, lo que podría provocar a continuación un colapso catastrófico del lecho. Los materiales altamente reticulados se hinchan menos y pueden impedir el acceso de los analitos y materiales de desorción a los grupos funcionales interiores dentro de la perla. Generalmente, es deseable usar un nivel de reticulación tan bajo como sea posible, siempre que sea suficiente para resistir el colapso del lecho. Esto significa que, en las columnas rellenadas de gel convencionales, puede ser necesario utilizar caudales lentos. Las resinas de gel comunes incluyen agarosa, sefarosa, poliestireno, poliacrilato, celulosa y otros sustratos. Las resinas de gel pueden ser perlas no porosas o microporosas.

Se ha descubierto que las perlas de resina de gel blandas, tales como las perlas basadas en agarosa y sefarosa, funcionan sorprendentemente bien en columnas y procedimientos de esta invención. En la cromatografía convencional, los caudales rápidos pueden dar lugar a la compresión de las perlas, lo que provoca un aumento de la contrapresión y afecta negativamente a la capacidad de utilizar estos geles con caudales más rápidos. En la presente invención se utilizan volúmenes de lecho relativamente pequeños, y parece que esto permite el uso de caudales elevados con una cantidad mínima de compresión de perlas y el problema que conlleva dicha compresión.

Los diámetros promedio de partícula de las perlas de la invención están normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 |jm a varios milímetros, por ejemplo, diámetros en intervalos que tienen límites inferiores de 1 |jm, 5 jm , 10 jm , 20 jm , 30 jm , 40 jm , 50 jm , 60 jm , 70 jm , 80 jm , 90 jm , 100 jm , 150 jm , 200 jm , 300 jm o 500 jm , y límites superiores de 10 jm , 20 jm , 30 jm , 40 jm , 50 jm , 60 jm , 70 jm , 80 jm , 90 jm , 100 jm , 150 jm , 200 jm , 300 jm , 500 jm , 750 jm , 1 mm, 2 mm o 3 mm.

El tamaño de perla que se puede usar depende en cierta medida del volumen de lecho y del área de sección transversal de la columna. Una columna de menor volumen de lecho tolerará un tamaño de perla más pequeño sin generar las altas contrapresiones que podrían romper una frita de membrana delgada. Por ejemplo, un volumen de lecho de 0,1 a 1 j l puede tolerar partículas de 5 a 10 jm . Los lechos más grandes (hasta aproximadamente 50 j l ) normalmente tienen tamaños de perlas de 30-150 jm o más. El intervalo superior de tamaño de partícula depende del diámetro del lecho de columna. El tamaño de diámetro de perla no debe ser superior al 50 % del diámetro de lecho, y preferiblemente inferior al 10 % del diámetro de lecho.

La química de extracción empleada con la columna de punta de pipeta descrita en esta invención puede adoptar cualquiera de una amplia variedad de formas. Por ejemplo, el medio de extracción se puede seleccionar de entre, o basarse en, cualquiera de las químicas de extracción utilizadas en la extracción y/o cromatografía en fase sólida, por ejemplo, en fase inversa, en fase normal, de interacción hidrófoba, de interacción hidrófila, de intercambio iónico, de separación tiófila, de inducción de carga hidrófoba o de unión por afinidad.

Las extracciones por afinidad, que no están contempladas como tales por la presente invención, utilizan una técnica en la que se prepara un adsorbente bioespecífico acoplando un ligando específico (tal como una enzima, antígeno u hormona) para el analito (por ejemplo, macromolécula) de interés a un soporte sólido. Este ligando inmovilizado interactuará selectivamente con moléculas que puedan unirse a él. Las moléculas que no se unen eluyen sin ser retenidas. La interacción es selectiva y reversible. Las referencias enumeradas a continuación muestran ejemplos de los tipos de grupos de afinidad que pueden emplearse en la práctica de esta invención. Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, Edition AB, 18-1037-46 (2002); Protein Purification Handbook, Amersham Biosciences, Edition AC, 18-1132-29 (2001); Affinity Chromatography Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AC, 18-1022-29 (2001); The Recombinant Protein Handbook, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AB, 18­ 1142-75 (2002); y Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Jan-Christen Janson (Editor), Lars G. Ryden (Editor), Wiley, John & Sons, Incorporated (1989).

Los ejemplos de agentes de unión por afinidad adecuados se resumen en la Tabla I, donde los agentes de afinidad pertenecen a una o más de las siguientes categorías de interacción:

1. Interacción metal quelante-ligando

2. Interacción proteína-proteína

3. Interacción molécula o fracción orgánica-proteína

4. Interacción azúcar-proteína

5. Interacción ácido nucleico-proteína

6. Interacción ácido nucleico-ácido nucleico

TABLA I

En un aspecto de la invención, se utilizan perlas de resina de gel que contienen una funcionalidad de superficie que tiene afinidad por una etiqueta de fusión de proteína utilizada para la purificación de proteínas recombinantes. Hay disponible una amplia variedad de etiquetas de fusión y grupos de afinidad correspondientes.

La solicitud de patente de EE. UU. N.° 10/622.155 describe en detalle el uso de reactivos de unión por afinidad específicos en la extracción en fase sólida. Los ejemplos de agentes de unión por afinidad específicos incluyen proteínas que tienen afinidad por anticuerpos, regiones Fc y/o regiones Fab tales como Proteína G, Proteína A, Proteína A/G, y Proteína L; metales quelados tales como quelato de metal-NTA (por ejemplo, níquel-NTA, cobre-NTA, hierro-NTA, cobalto-NTA, zinc-NTA), quelato de metal-IDA (por ejemplo, níquel-IDA, cobre-IDA, hierro-IDA, cobalto-IDA) y quelato de metal-CMA (aspartato carboximetilado) (por ejemplo, níquel-CMA, cobre-CMA, hierro-CMA, cobalto-CMA, zinc-CMA); superficies de glutatión-nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos y sus análogos (por ejemplo, ATP); superficie de lectina-superficie de heparina-superficie de avidina o estreptavidina, un péptido o análogo de péptido (por ejemplo, que se une a una proteasa o a otra enzima que actúa sobre los polipéptidos).

El reactivo de unión por afinidad puede ser uno que reconozca uno o más de los muchos grupos de afinidad utilizados como etiquetas de afinidad en las proteínas de fusión recombinantes. Los ejemplos de dichas etiquetas incluyen etiquetas de polihistidina (por ejemplo, la etiqueta 6X-His), que se pueden extraer usando un metal quelado tal como secuencias peptídicas de Ni-NTA (tales como el epítopo FLAg ) que son reconocidas por un anticuerpo inmovilizado; biotina, que se puede extraer utilizando avidina o estreptavidina inmovilizada; "péptido de unión a calmodulina" (o, CBP), que se reconoce por calmodulina cargada con proteína calcio-glutatión S-transferasa (GST), reconocida por glutatión inmovilizado; proteína de unión a maltosa (MBP), reconocida por amilosa; la etiqueta del dominio de unión a celulosa, reconocida por celulosa inmovilizada; un péptido con afinidad específica por la proteína S (derivado de la ribonucleasa A); y la etiqueta de secuencia peptídica CCxxCC (donde xx es cualquier aminoácido, tal como RE), que se une al agente de unión por afinidad bis-arsenical fluoresceína (tinción FIAsH).

Los anticuerpos se pueden extraer utilizando, por ejemplo, proteínas tales como la proteína A, la proteína G, la proteína L, híbridos de estas, o mediante otros anticuerpos (por ejemplo, un anti-IgE para purificar IgE).

Los metales quelados no solo son útiles para purificar proteínas etiquetadas con poli-His, sino también otras proteínas no etiquetadas que tienen una afinidad intrínseca por el metal quelado, por ejemplo, fosfopéptidos y fosfoproteínas.

Los anticuerpos también pueden ser útiles para purificar proteínas no etiquetadas por las que tienen afinidad, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos con afinidad por un sitio de fosforilación específico o aminoácidos fosforilados.

Se pueden emplear superficies de extracción que son generalmente menos específicas que los agentes de unión por afinidad discutidos anteriormente. Estas químicas de extracción siguen siendo a menudo bastante útiles. Los ejemplos incluyen superficies de extracción o de cromatografía de intercambio iónico, fase inversa, fase normal, interacción hidrófoba e interacción hidrófila. En general, estas químicas de extracción, procedimientos de uso, disolventes apropiados, etc., son bien conocidos en la técnica y, en particular, se describen con más detalle en las solicitudes de patente de EE.UU. N.° 10/434.713 y 10/622.155, y las referencias citadas en las mismas, por ejemplo, Chromatography, 5a edición, PARTE A: FUNDAMENTALS AND TECHNIQUES, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, pág. A25 (1992); ADVANCED CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROMIGRATION METHo Ds IN BIOSCIENCES, editor: Z. Deyl, Elsevier Science BV, Ámsterdam, Países Bajos, pág. 528 (1998); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole y Salwa K. Poole, y Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, pág. 394 (1991); y ORGANIC SYNTHESIS ON SOLID PHASE, F. Dorwald Wiley VCH Verlag Gmbh, Weinheim 2002.

Fritas

De acuerdo con la invención, las fritas se utilizan para contener el lecho de perlas de resina de gel en una columna de punta de pipeta. Las fritas pueden adoptar una variedad de formas y pueden construirse a partir de una variedad de materiales, por ejemplo, vidrio, cerámica, metal, fibra. Algunas realizaciones de la invención emplean fritas que tienen un volumen de poro bajo, lo que contribuye a reducir el volumen muerto. Las fritas de la invención son porosas, ya que es necesario que el fluido pueda pasar por la frita. La frita debe tener suficiente resistencia estructural para que la integridad de la frita pueda contener las perlas de resina de gel en la columna. Es deseable que la frita tenga poca o ninguna afinidad por los productos químicos con los que entrará en contacto durante el procedimiento de extracción, en particular el analito de interés. El analito de interés puede ser una biomolécula, particularmente una macromolécula biológica. Por tanto, en muchas realizaciones de la invención, es deseable utilizar una frita que tenga una tendencia mínima a unirse o interactuar de otro modo con macromoléculas biológicas, particularmente proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.

Pueden usarse fritas de varios tamaños de poros y densidades de poro siempre que sea posible el flujo libre de líquido y las perlas se mantengan en su lugar dentro del lecho rellenado de perlas de resina de gel.

Una frita (una frita inferior) está unida al canal abierto y se extiende a través del mismo del cuerpo de columna. Una segunda frita se une al canal abierto y se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna.

De acuerdo con la invención, la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna (es decir, la superficie interior del canal) definen una cámara de medio donde se coloca un lecho de perlas de resina de gel. Las fritas deben fijarse firmemente al cuerpo de columna y extenderse a lo largo de la abertura y/o extremo abierto para ocluir completamente el canal, confinando así sustancialmente el lecho de perlas de resina de gel en el interior de la cámara de medio. En realizaciones preferidas de la invención, el lecho de perlas de resina de gel ocupa al menos el 60 % del volumen de la cámara de medio, más preferiblemente 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o sustancialmente el 100 % del volumen. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el espacio entre el lecho y las fritas superior e inferior es insignificante, es decir, las fritas están en contacto sustancial con las superficies superior e inferior del lecho, manteniendo un lecho bien rellenado de perlas de resina de gel de forma segura en su lugar.

De acuerdo con la invención, la frita inferior está ubicada en el extremo inferior abierto del cuerpo de columna. Esta configuración se muestra en las figuras y se ejemplifica en los Ejemplos, pero no es necesaria, es decir, en algunas realizaciones, la frita inferior se ubica a cierta distancia del cuerpo de columna del extremo inferior abierto. Sin embargo, en vista de la ventaja que viene con la minimización del volumen muerto en la columna, es deseable que la frita inferior y la cámara de medio estén ubicadas en el extremo inferior o cerca del mismo. En algunos casos, esto puede significar que la frita inferior está fijada a la cara del extremo inferior abierto, como se muestra en las Figs. 1-10. Sin embargo, en algunos casos puede haber alguna porción del extremo inferior que se extienda más allá de la frita inferior, como se ejemplifica por la realización representada en la Fig. 11. Para los fines de esta invención, siempre y cuando la longitud de esta extensión sea tal que no introduzca sustancialmente un volumen muerto en la columna o tenga un impacto adverso en la función de la columna, se considera que la frita inferior está ubicada en el extremo inferior del cuerpo de columna. En algunas realizaciones de la invención, el volumen definido por la frita inferior, la superficie de canal y la cara del extremo inferior abierto (es decir, el volumen del canal debajo de la frita inferior) es inferior al volumen de la cámara de medio, o inferior al 10 % del volumen de la cámara de medio, o inferior al 1 % del volumen de la cámara de medio.

En algunas realizaciones de la invención, la cámara de medio está colocada cerca de un extremo de la columna, que a efectos explicativos se describirá como el extremo inferior de la columna. El área del canal de cuerpo de columna por encima de la cámara de medio puede ser bastante grande en relación con el tamaño de la cámara de medio. Por ejemplo, en algunas realizaciones el volumen de la cámara es igual a menos de 50 %, menos de 20, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 2 %, menos de 1 % o menos de 0,5 % del volumen interno total del cuerpo de columna. En funcionamiento, el disolvente puede fluir a través del extremo inferior abierto de la columna, a través del lecho de perlas de resina de gel y fuera de la cámara de medio en la sección del canal por encima de la cámara. Dado que el cuerpo de columna es una punta de pipeta, el extremo superior abierto se puede insertar en una pipeta y una solución extraída a través de las perlas de resina de gel y en la parte superior del canal.

En determinadas realizaciones de la invención, las fritas utilizadas en la invención se caracterizan por tener un bajo volumen de poro. Algunas realizaciones de la invención emplean fritas que tienen volúmenes de poro inferiores a 1 microlitro (por ejemplo, en el intervalo de 0,015-1 microlitros, 0,03-1 microlitros, 0,1-1 microlitros o 0,5-1 microlitros), preferiblemente inferior a 0,5 microlitros (por ejemplo, en el intervalo de 0,015-0,5 microlitros, 0,03-0,5 microlitros o 0,1-0,5 microlitros), inferior a 0,1 microlitros (por ejemplo, en el intervalo de 0,015-0,1 microlitros o 0,03-0,1 microlitros) o inferior a 0,03 microlitros (por ejemplo, en el intervalo de 0,015-0,03 microlitros). En otras realizaciones de la invención, las fritas tienen un mayor volumen de poro, por ejemplo, teniendo un límite superior de 1,25, 1,5, 2, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5 o 20 microlitros.

Las fritas de la invención preferiblemente tienen aberturas de poro o aberturas de malla de un tamaño en el intervalo de aproximadamente 5-200 pm, más preferiblemente 10-100 pm y aún más preferiblemente 15-50 pm, por ejemplo, aproximadamente 43 pm. El rendimiento de la columna normalmente se mejora mediante el uso de fritas que tienen poros o aberturas de malla lo suficientemente grandes como para minimizar la resistencia al flujo. El uso de tamices de membrana como se describe en esta invención proporciona típicamente esta baja resistencia al flujo y, por ende, mejores caudales, contrapresión reducida y distorsión mínima del lecho de medio de extracción. Por supuesto, las aberturas de poro o malla no deben ser tan grandes que no puedan contener adecuadamente las perlas de resina de gel en la cámara.

Algunas fritas utilizadas en la práctica de la invención se caracterizan por tener un volumen de poro bajo en relación con el volumen intersticial del lecho de medio de extracción contenido en la frita. Por tanto, en realizaciones preferidas de la invención, el volumen de poro de la frita es igual al 25 % o menos del volumen intersticial del lecho de medio de extracción (por ejemplo, en el intervalo de 0,1-10 %, 0,25-10 %, 1-10 % o 5-10 % del volumen intersticial), más preferiblemente 5 % o menos del volumen intersticial del lecho de medio de extracción (por ejemplo, en el intervalo de 0,1-5 %, 0,25-5 % o 1-5 % del volumen intersticial), y aún más preferiblemente 1 % o menos del volumen intersticial del lecho de medio de extracción (porejemplo, en el intervalo de 0,01-1 %, 0,05-1 % o 0,1-1 % del volumen intersticial).

La densidad de poro permitirá el flujo del líquido a través de la membrana y es preferiblemente del 10 % y superior para aumentar el caudal que sea posible y reducir el tiempo necesario para procesar la muestra.

Determinadas realizaciones de la invención emplean una frita que tiene menos de 1500 pm de espesor (por ejemplo, en el intervalo de 20-350 pm, 40-350 pm o 50-350 pm), más preferiblemente menos de 200 pm de espesor (por ejemplo, en el intervalo de 20-200 pm, 40-200 pm o 50-200 pm), más preferiblemente menos de 100 pm de espesor (por ejemplo, en el intervalo de 10-100 pm, 40-100 pm, o 50-100 pm), y lo más preferiblemente menos de 75 pm de espesor (por ejemplo, en el intervalo de 20-75 pm, 40-75 pm o 50-75 pm). Los límites superiores para el espesor de la frita son 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250 o 1500 pm.

Algunas realizaciones preferidas de la invención emplean un tamiz de membrana como frita. El tamiz de membrana debe ser lo suficientemente resistente para no solo contener las perlas de resina de gel en el lecho de columna, sino también para evitar que se desprenda o perfore durante el relleno actual de las perlas de resina de gel en el lecho de columna. Las membranas pueden ser frágiles y, en algunas realizaciones, deben estar contenidas en un armazón para mantener su integridad durante el uso. Sin embargo, es deseable usar una membrana de suficiente resistencia de manera que pueda usarse sin depender de dicho armazón. El tamiz de membrana también debe ser flexible para que pueda adaptarse al lecho de columna. Esta flexibilidad es ventajosa en el procedimiento de relleno, ya que permite que el tamiz de membrana se adapte al lecho del medio de extracción, lo que resulta en una reducción del volumen muerto.

La membrana puede ser una malla tejida o no tejida de fibras que puede ser un tejido de malla, una estera de fibras orientadas al azar, es decir, un "papel polimérico", una malla unida por hilado, un papel o membrana grabada o "con poros perforados" tal como membrana grabada con huella nuclear o malla electrolítica (véase, por ejemplo,el documento 5.556.598). La membrana puede ser, por ejemplo, de polímero, vidrio o metal, siempre que la membrana tenga un volumen muerto bajo, permita el movimiento de las diversas muestras y los líquidos de procesamiento a través del lecho de columna, se pueda unir al cuerpo de columna y sea lo suficientemente resistente para soportar el procedimiento de relleno de lecho, sea lo suficientemente resistente como para sostener el lecho de columna de perlas y no interfiera con el procedimiento de extracción, es decir, no adsorba ni desnaturalice las moléculas de muestra.

La frita se puede fijar al cuerpo de columna por cualquier medio que dé como resultado una fijación estable. Por ejemplo, el tamiz se puede unir al cuerpo de columna mediante soldadura o encolado. El encolado se puede realizar con cualquier pegamento adecuado, por ejemplo, silicona, pegamento de cianoacrilato, pegamento epoxi y similares. El pegamento o la junta soldada deben tener la resistencia requerida para resistir el procedimiento de relleno del lecho de medio de extracción y para contener el medio de extracción con la cámara. Para las juntas con pegamento, se debe seleccionar un pegamento empleado que no adsorba ni desnaturalice las moléculas de muestra.

Por ejemplo, se puede usar pegamento para fijar una membrana a la punta de la columna de punta de pipeta. Se aplica un pegamento adecuado al extremo de la punta. En algunos casos, se puede insertar una varilla en la punta para evitar que el pegamento se extienda más allá de la cara del cuerpo. Después de aplicar el pegamento, la punta se pone en contacto con la frita de la membrana, fijando así la membrana a la punta. Después de la fijación, la punta y la membrana pueden disponerse contra una superficie dura y plana y frotarse con un movimiento circular para garantizar la fijación completa de la membrana al cuerpo de columna. Después del secado, el exceso de membrana se puede recortar de la columna con una hoja de afeitar.

Alternativamente, el cuerpo de columna se puede soldar a la membrana fundiendo el cuerpo en la membrana, o fundiendo la membrana en el cuerpo, o ambos. En un procedimiento, se elige una membrana de modo que su temperatura de fusión sea superior a la temperatura de fusión del cuerpo. La membrana se sitúa sobre una superficie y el cuerpo se baja hasta la membrana y se calienta, por lo que la cara del cuerpo se fundirá y soldará la membrana al cuerpo. El cuerpo puede calentarse por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, con una superficie plana caliente, aire caliente o ultrasónicamente. Inmediatamente después de soldar, la soldadura puede enfriarse con aire u otro gas para mejorar la probabilidad de que la soldadura no se rompa.

Alternativamente, se puede fijar una frita por medio de un tubo anular, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.833.927. Este modo de fijación es particularmente adecuado para realizaciones donde la frita es un tamiz de membrana.

Las fritas de la invención, por ejemplo, un tamiz de membrana, se pueden fabricar de cualquier material que tenga las propiedades físicas requeridas como se describe en esta invención. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen nailon, poliéster, poliamida, policarbonato, celulosa, polietileno, nitrocelulosa, acetato de celulosa, difluoruro de polivinilideno, politetrafluoroetileno (PTFE), polipropileno, polisulfona, metal y vidrio. Un ejemplo específico de un tamiz de membrana es el material de malla de poliéster de tamaño de poro de 43 pm de Spectra/Mesh® que está disponible en Spectrum Labs (Ranch Dominguez, CA, PN 145837).

Las características del tamaño de poro de los filtros de membrana se pueden determinar, por ejemplo, mediante el uso del procedimiento n.° F316-30, publicado por ASTM International, titulado "Standard Test Methods for Pore Size Characteristics of Membrane Filters by Bubble Point and Mean Flow Pore Test".

La polaridad del tamiz de membrana puede ser importante. Un tamiz hidrófilo promoverá el contacto con el lecho y promoverá la interfase aire-líquido estableciendo una tensión superficial. Un tamiz hidrófobo no promovería esta tensión superficial y por lo tanto las presiones umbral para fluir serían diferentes. Se prefiere un tamiz hidrófilo en determinadas realizaciones de la invención.

Conjunto de columna

Las columnas de la invención se pueden construir mediante una variedad de procedimientos utilizando las enseñanzas proporcionadas en esta invención. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la columna se puede construir mediante el acoplamiento (es decir, fijación) de miembros tubulares superior e inferior (es decir, cuerpos de columna) que se combinan para formar la columna. Los ejemplos de este modo de construcción de columna se describen en los Ejemplos y se representan en las figuras.

En algunas realizaciones preferidas de la invención, una columna se construye acoplando los cuerpos de columna interior y exterior, donde cada cuerpo de columna tiene dos extremos abiertos (por ejemplo, un extremo superior abierto y un extremo inferior abierto) y un canal abierto que conecta los dos extremos abiertos (por ejemplo, un cuerpo tubular, tal como una punta de pipeta). El cuerpo de columna exterior tiene una primera frita (preferiblemente una frita de membrana) unida al extremo inferior abierto y que se extiende a través del mismo, ya sea en la punta misma del extremo abierto o cerca del extremo abierto. La sección del canal abierto entre el extremo superior abierto y la primera frita define un cuerpo de columna exterior. El cuerpo de columna interior también tiene una frita (preferiblemente una frita de membrana) unida a su extremo inferior abierto y que se extiende a través del mismo.

Para construir una columna según esta realización, las perlas de resina de gel se disponen dentro del cuerpo de columna inferior, por ejemplo, orientando el cuerpo de columna inferior de manera que el extremo inferior abierto quede hacia abajo y llenando o parcialmente llenando el canal abierto con las perlas de resina de gel, por ejemplo, en forma de suspensión. El cuerpo de columna interior, o al menos alguna porción del cuerpo de columna interior, se inserta a continuación en el cuerpo de columna exterior de manera que el extremo inferior abierto del cuerpo interior (donde se fija la segunda frita) entre primero en el cuerpo de columna exterior. El cuerpo de columna interior se coloca de forma sellada dentro del canal abierto del cuerpo de columna exterior, es decir, la superficie exterior del cuerpo de columna interior forma un sello con la superficie de la abertura. La sección del canal abierto entre las fritas primera y segunda contiene las perlas de resina de gel, y este espacio define una cámara de medio. En general, resulta ventajoso que el volumen de la cámara de medio (y el volumen del lecho de perlas de resina de gel colocado con dicha cámara de medio) sea inferior al del cuerpo de columna exterior, ya que esta diferencia de volumen facilita la introducción de perlas de resina de gel en el cuerpo de columna exterior y, por ende, simplifica el procedimiento de producción. Esto es particularmente ventajoso en realizaciones de la invención donde las columnas de extracción se producen en masa.

El cuerpo de la columna interior puede fijarse de forma estable al cuerpo de columna exterior mediante acoplamiento por fricción con la superficie del canal abierto.

Uno o ambos de los cuerpos de columna pueden ser puntas de pipeta, secciones de puntas de pipeta o formas modificadas de puntas de pipeta. Por ejemplo, una realización de la invención donde los dos miembros tubulares son secciones de puntas de pipeta se representa en la Fig. 1 (la Fig. 2 es una vista ampliada del extremo inferior abierto y la cámara de medio de extracción de la columna). Esta realización está construida a partir de un miembro tubular superior troncocónico 2 y un miembro tubular inferior troncocónico 3 acoplado con el mismo. El extremo de acoplamiento 6 del miembro tubular inferior tiene un orificio ahusado que coincide con la superficie externa ahusada del extremo de acoplamiento 4 del miembro tubular superior, recibiendo el extremo de acoplamiento del miembro tubular inferior el extremo de acoplamiento del miembro tubular superior en una relación telescópica. El orificio ahusado se acopla perfectamente con la superficie exterior ahusada para formar un buen sello en la columna ensamblada.

Un tamiz de membrana 10 está unido a la punta del extremo de acoplamiento y se extiende a través de la misma del miembro tubular superior y constituye la frita superior de la columna. Otro tamiz de membrana 14 está unido a la punta del miembro tubular inferior y se extiende a través de la misma y constituye la frita inferior de la columna. La cámara de medio 16 está definida por los tamices de membrana 10 y 14 y la superficie de canal 18, y está rellenada con perlas de resina de gel.

El volumen de poro de los tamices de membrana 10 y 14 es bajo para minimizar el volumen muerto de la columna. La muestra y la solución de desorción pueden pasar directamente del vial o depósito en el lecho de medio de extracción. El bajo volumen muerto permite la desorción del analito en el volumen de desorción más pequeño posible, maximizando así la concentración del analito.

El volumen de la cámara de medio 16 es variable y puede ajustarse cambiando la profundidad a la que se extiende el extremo de acoplamiento del miembro tubular superior en el miembro tubular inferior, según lo determinado por las dimensiones relativas del orificio ahusado y la superficie exterior ahusada.

El sellado del miembro tubular superior al tubular inferior en esta realización se logra mediante la fricción de un ajuste a presión, pero podría lograrse alternativamente mediante soldadura, encolado o procedimientos de sellado similares.

Tenga en cuenta que en esta y otras realizaciones similares, una porción del cuerpo de columna interior, es decir, la mayor parte de la punta de pipeta 2 no está dispuesta dentro del primer canal, sino que se extiende fuera del cuerpo de columna exterior. En este caso, el extremo superior abierto del cuerpo de columna interior está adaptado para fijarse de forma operativa a una bomba, por ejemplo, una pipeta.

La Fig. 3 representa un dispositivo que comprende un miembro tubular superior e inferior acoplado en una relación telescópica que no se basa en un ajuste ahusado. En su lugar, los extremos de acoplamiento 34 y 35 son cilíndricos, con el diámetro exterior de 34 coincidente con el diámetro interior de 35, de manera que el extremo de acoplamiento concéntrico forma un ajuste sin holgura. Los extremos de acoplamiento se sellan mediante ajuste a presión, soldadura, encolado o procedimientos de sellado similares. El volumen del lecho de perlas de resina de gel se puede variar cambiando cuánto se extiende la longitud del extremo de acoplamiento 34 en el extremo de acoplamiento 35. Tenga en cuenta que el diámetro del miembro tubular superior 30 es variable, en este caso es más ancho en el extremo superior abierto 31 y se estrecha hacia el extremo de acoplamiento más estrecho 34. Este diseño permite un volumen mayor en el canal de columna por encima de las perlas de resina de gel, lo que facilita de esta manera el procesamiento de volúmenes de muestra y volúmenes de lavado más grandes. El tamaño y la forma del extremo superior abierto pueden adaptarse para amoldarse a una bomba utilizada en conexión con la columna. Por ejemplo, el extremo abierto superior 31 se puede estrechar hacia fuera para formar un mejor ajuste por fricción con una bomba tal como una pipeta o una jeringa.

Un tamiz de membrana 40 está unido a la punta 38 y se extiende a través de la misma del extremo de acoplamiento 34 y constituye la frita superior de la columna de extracción. Otro tamiz de membrana 44 está unido a la punta 42 y se extiende a través de la misma del miembro tubular inferior 36 y constituye la frita inferior de la columna. La cámara de medio 46 está definida por los tamices de membrana 40 y 44 y el canal interior abierto del miembro tubular inferior 36, y está rellenada con perlas de resina de gel.

La Fig. 4 es una realización de la bomba de jeringa de la invención con un lecho cilindrico de perlas de resina de gel en la punta, y la Fig. 5 es una ampliación de la parte superior de la realización de la bomba de jeringa de la Fig. 4. Estas figuras muestran una columna con bajo volumen muerto en función del uso de una jeringa desechable y un cuerpo de columna. En lugar de una pipeta, se utiliza una jeringa desechable para bombear y contener la muestra.

La porción superior de esta realización constituye una bomba de jeringa con un cilindro 50 en el que se coloca un émbolo 52 para su movimiento a lo largo del eje central del cilindro. Una lengüeta de accionador manual 54 está asegurada a la parte superior del émbolo 52. Un anillo de sellado concéntrico 56 está asegurado al extremo inferior del émbolo 52. La superficie exterior 58 del anillo de sellado concéntrico 56 forma un acoplamiento de sellado con la superficie interior 60 del cilindro 50 de modo que el movimiento del émbolo 52 y el anillo de sellado 56 hacia arriba o hacia abajo en el cilindro mueve el líquido hacia arriba o hacia abajo del cilindro.

El extremo inferior del cilindro 50 está conectado a un cilindro interno 62 que tiene una proyección 64 para acoplar un adaptador Luer. El borde inferior 66 del cilindro interior 62 tiene un tamiz de membrana 68 asegurado al mismo. El cilindro interior 62 se desliza en un manguito exterior 70 con un adaptador Luer convencional 72 en su extremo superior. El segmento inferior 74 del manguito exterior 70 tiene un diámetro menor que la porción superior 76, formando el manguito exterior 70 un reborde 78 colocado para hacer tope con el extremo inferior 66 y el tamiz de membrana 68. Un tamiz de membrana 80 está asegurado al extremo inferior 82 del segmento inferior 74. La cámara de medio de extracción 84 está definida por los tamices de membrana superior e inferior 68 y 80 y la superficie del canal interior del segmento inferior 74. Las perlas de extracción se colocan en la cámara de medio de extracción 84. El volumen de la cámara de medio de extracción 84 se puede ajustar cambiando la longitud del segmento inferior 74.

En la fabricación de columnas en general, todo el cuerpo de columna interior se puede disponer dentro del primer canal abierto. El primer extremo superior abierto está normalmente adaptado para una fijación operable a una bomba, es decir, el cuerpo de columna exterior es una punta de pipeta y la bomba es una pipeta. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el diámetro exterior del cuerpo de columna interior se estrecha hacia su extremo inferior abierto, y el canal abierto del cuerpo de columna exterior se estrecha en la región donde el cuerpo de columna interior se acopla por fricción con el canal abierto, siendo los ahusamientos del cuerpo de columna interior y canal abierto complementarios entre sí. Esta complementariedad de ahusamiento permite que los dos cuerpos se ajusten sin holgura y formen una fijación de sellado, de manera que la columna resultante comprenda un único canal abierto que contiene el lecho de perlas de resina de gel unido por las dos fritas.

La Fig. 17 ilustra la construcción de un ejemplo de esta realización de las columnas de punta de pipeta de la invención. Este ejemplo incluye un cuerpo de columna exterior 160 que tiene un eje longitudinal 161, un conducto pasante central 162 (es decir, un canal abierto), un extremo inferior abierto 164 para la absorción y/o expulsión de fluido, y un extremo superior abierto 166 para fijación operable a una bomba, por ejemplo, el extremo superior abierto está en comunicación con una pipeta o pipeta multicanal. La comunicación puede ser directa o indirecta, por ejemplo, a través de uno o más accesorios, acoplamientos o similares, siempre que el funcionamiento de la bomba afecte a la presión en el conducto pasante central (denominado en otra parte de esta invención como "espacio de cabeza"). El cuerpo de columna exterior incluye una sección troncocónica 168 del conducto pasante 162, que es adyacente al extremo inferior abierto 164. El diámetro interior de la sección troncocónica disminuye desde un primer diámetro interior 170, en una posición en la sección troncocónica distal al extremo inferior abierto, hasta un segundo diámetro interior 172 en el extremo inferior abierto. Una frita inferior 174, preferiblemente un tamiz de membrana, se une al extremo inferior abierto 164 y se extiende a través del mismo. En una realización preferida de la invención, se puede unir una frita de membrana al cuerpo de columna exterior mediante los procedimientos descritos en esta invención, tal como mediante encolado o soldadura. Esta realización incluye además un anillo 176 que tiene un diámetro exterior 178 que es inferior al primer diámetro interior 170 y superior al segundo diámetro interior 174. Una frita superior 180, preferiblemente un tamiz de membrana, está unido al anillo y se extiende a través del mismos.

Para construir la columna, se introduce una cantidad deseada de medio de extracción 182, preferiblemente en forma de suspensión, en el conducto pasante a través del extremo superior abierto y se coloca en la sección troncocónica adyacente al extremo inferior abierto. El medio de extracción forma preferiblemente un lecho compacto en contacto con la frita inferior 174. A continuación, el anillo 176 se introduce en el conducto a través del extremo superior abierto y se coloca en un punto en la sección troncocónica donde el diámetro interior de la sección troncocónica coincide con el diámetro exterior 178 del anillo, de modo que el anillo hace contacto con un sello y forma el mismo con la superficie del conducto pasante. La frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto pasante delimitado por las fritas superior e inferior definen una cámara de medio de extracción 184. La cantidad de medio de extracción introducido en la columna normalmente se selecciona de manera que el lecho rellenado resultante llene sustancialmente la cámara de medio de extracción, preferiblemente haciendo contacto con las fritas superior e inferior.

Tenga en cuenta que el anillo puede adoptar cualquiera de una serie de geometrías distintas del anillo simple representado en la Fig. 17, siempre que el anillo tenga la forma para ajustarse a la geometría interna de la sección troncocónica e incluya un conducto pasante a través del cual la solución puede pasar. Por ejemplo, la Fig. 18 representa una realización preferida de la invención donde el anillo adopta la forma de un miembro troncocónico 190 que tiene un conducto pasante central 192 que conecta un extremo superior abierto 194 y un extremo inferior abierto 195. El diámetro exterior del miembro troncocónico disminuye desde un primer diámetro exterior 196 en el extremo superior abierto a un segundo diámetro exterior 197 en el extremo inferior abierto. El segundo diámetro exterior 197 es superior al segundo diámetro interior 172 e inferior al primer diámetro interior 170. El primer diámetro exterior 196 es inferior o sustancialmente igual al primer diámetro interior 170. Una frita superior 198 está unida al extremo inferior abierto 195 y se extiende a través del mismo. El miembro troncocónico 190 se introduce en el conducto pasante de un cuerpo de columna exterior que contiene un lecho de medio de extracción colocado en la frita inferior 174. La superficie exterior ahusada del miembro troncocónico coincide con el ahusamiento de la sección troncocónica del conducto abierto, y las dos superficies hacen un contacto de sellado. La configuración troncocónica extendida de esta realización del anillo facilita la alineación y el asentamiento apropiados del anillo en el conducto exterior.

Debido al ajuste por fricción del anillo a la superficie del conducto pasante central, normalmente no es necesario utilizar medios adicionales para unir la frita superior a la columna. Si se desea, se pueden utilizar medios de fijación adicionales, por ejemplo, mediante unión, encolado, soldadura, etc. En algunas realizaciones, la superficie interior de la sección troncocónica y/o el anillo se modifica para mejorar la conexión entre los dos elementos, por ejemplo, al incluir ranuras, mecanismos de bloqueo, etc.

En las realizaciones anteriores, las secciones transversales anular y latitudinal de la sección troncocónica se ilustran como geometría circular. Alternativamente, podrían emplearse otras geometrías, por ejemplo, ovaladas, poligonales o de otro tipo. Cualesquiera que sean las geometrías, las formas anular y troncocónica deben coincidir en la medida requerida para lograr un acoplamiento de sellado adecuado. Las fritas se colocan preferiblemente, aunque no necesariamente, en una orientación paralela entre sí y perpendicular al eje longitudinal.

En los ejemplos también se describen otras realizaciones de la invención que ejemplifican diferentes procedimientos de construcción.

Bomba

En algunos modos de las columnas de extracción descritas en esta invención, se fija una bomba al extremo abierto superior de la columna y se usa para aspirar y descargar la muestra de la columna. La bomba puede adoptar cualquiera de una variedad de formas, siempre que sea capaz de generar una presión de columna interna negativa para aspirar un fluido en el canal de columna a través del extremo inferior abierto. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la bomba también es capaz de generar una presión de columna interna positiva para descargar fluido del extremo inferior abierto. Alternativamente, se pueden usar otros procedimientos para descargar la solución de la columna, por ejemplo, centrifugación.

La bomba debe ser capaz de bombear líquido o gas, y debe ser lo suficientemente resistente como para poder extraer una solución de muestra deseada, solución de lavado y/o disolvente de desorción a través del lecho de medio de extracción. Con el fin de evacuar líquidos del lecho rellenado e introducir un gas tal como aire, es deseable que la bomba pueda soplar o extraer aire a través de la columna. Una bomba capaz de generar una fuerte presión podrá soplar gas de manera más efectiva a través de la columna, expulsando el líquido del volumen intersticial y contribuyendo a un analito más altamente purificado y concentrado.

La bomba puede ser capaz de controlar el volumen de fluido aspirado y/o descargado de la columna, por ejemplo, una pipeta. Esto permite la entrada y salida dosificada de disolventes, lo que facilita volúmenes de elución más precisos para maximizar la recuperación y concentración de la muestra.

Los ejemplos de bombas adecuadas incluyen una pipeta, una jeringa, una bomba peristáltica, un recipiente presurizado, una bomba centrífuga, una bomba electrocinética o una bomba fluídica basada en inducción. Las bombas preferidas tienen buena precisión, buena exactitud e histéresis mínima, pueden manipular pequeños volúmenes y pueden ser controladas directa o indirectamente por un ordenador u otro medio automatizado, de modo que la bomba pueda usarse para aspirar, infundir y/o manipular un volumen predeterminado de líquido. La exactitud y la precisión necesarias para la manipulación de fluidos variarán dependiendo de la etapa del procedimiento de extracción, del enriquecimiento de la biomolécula deseada y de las dimensiones de la columna de extracción y del volumen del lecho.

La solución de muestra entra en la columna por un extremo y pasa a través del lecho de extracción o de alguna porción de la longitud total del lecho de extracción, y finalmente sale del canal por el mismo extremo de la columna o por el otro extremo. La introducción de la solución de muestra en la columna se puede lograr mediante cualquiera de varias técnicas para expulsar o extraer líquido a través de un canal. Los ejemplos incluirían el uso de una bomba (como se describe anteriormente), gravedad, fuerza centrífuga, acción capilar o presión de gas para mover el fluido a través de la columna. La solución de muestra preferiblemente se mueve a través del lecho de extracción a un caudal que permita un tiempo de contacto adecuado entre la muestra y la superficie de extracción. La solución de muestra se puede pasar a través del lecho más de una vez, ya sea haciendo circular la solución a través de la columna en la misma dirección dos o más veces, o pasando la muestra de un lado a otro a través de la columna dos o más veces (por ejemplo, haciendo oscilar un tapón o una serie de tapones de solución de desorción a través del lecho). Es importante que la bomba pueda bombear aire, lo que permite que el líquido sea expulsado del lecho. Las bombas preferidas tienen buena precisión, buena exactitud e histéresis mínima, pueden manipular pequeños volúmenes y pueden ser controladas directa o indirectamente por un ordenador u otro medio automatizado, de modo que la bomba pueda usarse para aspirar, infundir y/o manipular un volumen predeterminado de líquido. La exactitud y la precisión necesarias para la manipulación de fluidos en la columna variarán dependiendo de la etapa del procedimiento de extracción, del enriquecimiento de la biomolécula deseada y de las dimensiones de la columna.

Disolventes

Las extracciones que se describen en esta invención y que no están contempladas por la invención reivindicada normalmente implican la carga del analito en una solución de muestra, un lavado opcional con una solución de enjuague y la elución del analito en una solución de desorción. La naturaleza de estas soluciones se describirá ahora con mayor detalle.

Con respecto a la solución de muestra, generalmente consiste en el analito disuelto en un disolvente en el cual el analito es soluble, y en el cual el analito se unirá a la superficie de extracción. Preferiblemente, la unión es fuerte, dando como resultado la unión de una porción sustancial del analito y, de manera óptima, sustancialmente todo el analito se unirá bajo el protocolo de carga usado en el procedimiento. El disolvente también debe ser suave, de modo que la estructura y función nativas del analito se conserven tras la desorción de la superficie de extracción. Por lo general, en el caso de que el analito sea una biomolécula, el disolvente es una solución acuosa, que generalmente contiene un amortiguador, sal, y/o tensioactivos para solubilizar y estabilizar la biomolécula. Los ejemplos de soluciones de muestra incluyen lisados de células, medio de crecimiento de hibridomas, mezclas de reacción de traducción o transcripción sin células, extractos de tejidos, órganos o muestras biológicas y extractos derivados de fluidos biológicos.

Es importante que el disolvente de la muestra no solo solubilice el analito, sino que también sea compatible con la unión a la fase de extracción. Por ejemplo, cuando la fase de extracción se basa en el intercambio de iones, la fuerza iónica de la solución de muestra debe tamponarse a un pH apropiado de modo que la carga del analito sea opuesta a la del ion inmovilizado, y la fuerza iónica debe ser relativamente baja para promover la interacción iónica. En el caso de una extracción en fase normal, el disolvente de carga de la muestra debe ser no polar, por ejemplo, hexano, tolueno o similar. Según la naturaleza de la muestra y el procedimiento de extracción, otros constituyentes pueden ser beneficiosos, por ejemplo, agentes reductores, detergentes, estabilizadores, desnaturalizantes, quelantes, metales, etc.

Se debe seleccionar una solución de lavado, si se usa, de modo que elimine los contaminantes no deseados con una pérdida o daño mínimo del analito unido. Las propiedades de la solución de lavado suelen ser intermedias entre las de las soluciones de muestra y de desorción.

El disolvente de desorción se puede introducir como una corriente o un tapón de disolvente. Si se usa un tapón de disolvente, un tapón amortiguador de disolvente puede seguir al tapón de desorción de modo que cuando la muestra se deposite en la diana, también se deposite un amortiguador para dar a la muestra depositada un pH adecuado. Un ejemplo de esto es la desorción de una superficie de proteína G de un anticuerpo IgG que se ha extraído de una solución de hibridoma. En este ejemplo, se usa un tapón de ácido fosfórico 10 mM a pH 2,5 para desorber la IgG del tubo. Un tapón amortiguador de fosfato 100 mM a pH 7,5 sigue al tapón de disolvente de desorción para llevar la solución depositada a un pH neutro. A continuación, el material depositado puede analizarse, por ejemplo, mediante deposición en un chip SPR.

El disolvente de desorción debe ser lo suficientemente resistente como para desorber cuantitativamente el analito y dejar atrás los materiales de interferencia fuertemente unidos. Los disolventes se eligen para que sean compatibles con el analito y el último procedimiento de detección. Generalmente, los disolventes utilizados son disolventes convencionales conocidos. Los disolventes típicos entre los que se puede seleccionar un disolvente adecuado incluyen cloruro de metileno, acetonitrilo (con o sin pequeñas cantidades de modificadores básicos o ácidos), metanol (que contiene una mayor cantidad de modificador, por ejemplo, ácido acético o trietilamina, o mezclas de agua con metanol o acetonitrilo), acetato de etilo, cloroformo, hexano, isopropanol, acetona, amortiguador alcalino, amortiguador de alta fuerza iónica, amortiguador ácido, ácidos fuertes, bases fuertes, mezclas orgánicas con ácidos/bases, metanol ácido o básico, tetrahidrofurano y agua. El disolvente de desorción puede tener una miscibilidad diferente a la del disolvente de sorción.

En el caso de que la extracción implique la unión del analito a una molécula de ligando afín específica, por ejemplo, un metal inmovilizado, el disolvente de desorción puede contener una molécula que interferirá con dicha unión, por ejemplo, imidazol o un quelante de metal en el caso del metal inmovilizado.

En las Tablas A y B se muestran ejemplos de fases adecuadas para la extracción en fase sólida y disolventes de desorción.

TABLA A

TABLA B

II. Procedimientos de uso de las columnas de extracción

Generalmente, la primera etapa en un procedimiento de extracción de esta descripción y no contemplada por la invención reivindicada implicará la introducción de una solución de muestra que contiene un analito de interés en un lecho rellenado de medio de extracción, típicamente en forma de columna como se describe anteriormente. La muestra se puede introducir convenientemente en el lecho de separación bombeando la solución a través de la columna. Tenga en cuenta que el volumen de la solución de muestra puede ser mucho mayor que el volumen del lecho. La solución de muestra se puede pasar opcionalmente a través de la columna más de una vez, por ejemplo, bombeándola de un lado a otro a través del lecho. Esto puede mejorar la adsorción del analito, lo que puede suceder particularmente en los casos en que el analito es poco abundante y, por ende, se desea una máxima recuperación de la muestra.

La solución de muestra puede ser cualquier solución que contenga un analito de interés. La presente descripción es particularmente útil para la extracción y purificación de moléculas biológicas, por lo que la solución de muestra suele ser de origen biológico, por ejemplo, un lisado celular. La solución de muestra puede ser un sobrenadante de cultivo de células de hibridoma.

Una ventaja de usar las columnas de bajo volumen de lecho descritas anteriormente es que permiten una alta velocidad lineal del flujo de líquido a través de la columna (es decir, caudal lineal) sin la pérdida de rendimiento asociada y/o desarrollo de contrapresión observados con columnas más convencionales. Las altas velocidades lineales reducen el tiempo de carga. Debido a las altas velocidades lineales empleadas, es probable que la mayoría de las interacciones de carga estén en la superficie del material de extracción.

El caudal lineal a través de una columna en (cm/min) puede determinarse dividiendo el flujo volumétrico (en ml/min o cm3/min) por el área de sección transversal (en cm2). Este cálculo implica que la columna está actuando como un tubo abierto, en el sentido de que el medio está siendo penetrado adecuadamente por el flujo de amortiguador/eluyentes. Por tanto, por ejemplo, el caudal lineal de una separación que tiene un caudal volumétrico de 1 ml/min a través de una columna con un área de sección transversal de 1 cm2 sería (1 ml/min)/(1 cm2) = 1 cm/min.

Una columna de punta de pipeta ejemplar de la presente invención podría tener un volumen de lecho de 20 pl colocado en un tronco de ángulo recto (es decir, un cono invertido con la punta cortada, donde el diámetro inferior es de 1,2 mm y el diámetro superior es de 2,5 mm, y la altura aproximada del lecho es de 8 mm). El diámetro medio es de aproximadamente 1,8 mm, por lo que el área de sección transversal media del lecho es de aproximadamente 0,025 cm2. A un caudal de 1 ml/min, el caudal lineal es (1 ml/min)/(0,025 cm2) = 40 cm/min. El área de sección transversal media del lecho en la punta es de aproximadamente 0,011 cm2 y el caudal lineal en la punta es (1 ml/min)/(0,011 cm2) = 88 cm/min. Se trata de una característica de determinadas columnas de la invención que pueden ser efectivas en procedimientos que emplean un alto caudal lineal que supera los caudales utilizados anteriormente en los procedimientos de extracción convencionales. Por ejemplo, los procedimientos (y las columnas de extracción adecuadas) pueden emplear caudales lineales superiores a 10 cm/min, 20 cm/min, 30 cm/min, 40 cm/min, 50 cm/min, 60 cm/min, 70 cm/min, 80 cm/min, 90 cm/min, 100 cm/min, 120 cm/min, 150 cm/min, 200 cm/min, 300 cm/min, o superiores. Los procedimientos y columnas de esta descripción emplean intervalos de caudales lineales que tienen límites inferiores de 10 cm/min, 20 cm/min, 30 cm/min, 40 cm/min, 50 cm/min, 60 cm/min, 70 cm/min, 80 cm/min, 90 cm/min, 100 cm/min, 120 cm/min, 150 cm/min, o 200 cm/min; y límites superiores de 50 cm/min, 60 cm/min, 70 cm/min, 80 cm/min, 90 cm/min, 100 cm/min, 120 cm/min, 150 cm/min, 200 cm/min, 300 cm/min, o superiores.

Las columnas descritas en esta invención pueden adaptarse a una variedad de caudales, y la invención proporciona procedimientos que emplean un amplio intervalo de caudales, que a menudo varían en diferentes etapas del procedimiento. El caudal del líquido que pasa a través del lecho de medio cae dentro de un intervalo que tiene un límite inferior de 0,01 ml/min, 0,05 ml/min, 0,1 ml/min, 0,5 ml/min, 1 ml/min, 2 ml/min, o 4 ml/min y un límite superior de 0,1 ml/min, 0,5 ml/min, 1 ml/min, 2 ml/min, 4 ml/min, 6 ml/min, 10 ml/min o superior. Por ejemplo, se puede pasar un líquido a través de un lecho rellenado de medio que tenga un volumen inferior a 100 pl a un caudal de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 4 ml/min, o entre aproximadamente 0,5 y 2 ml/min, por ejemplo, un pequeño lecho rellenado de medio de extracción como se describe en otra parte de esta invención. Alternativamente, se puede pasar un líquido a través de un lecho rellenado de medio que tenga un volumen inferior a 25 pl a un caudal de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 4 ml/min, o entre aproximadamente 0,5 y 2 ml/min.

En algunos casos, es deseable realizar una o más etapas de un procedimiento de purificación a un caudal relativamente lento, por ejemplo, la carga y/o etapas de lavado, para maximizar la unión de un analito de interés a un medio de extracción. Para facilitar tales procedimientos, se describe en esta invención una pipeta que comprende un cuerpo; un microprocesador; un accionador accionado eléctricamente dispuesto dentro del cuerpo, el accionador en comunicación con el microprocesador y controlado por el mismo; un conjunto de desplazamiento que incluye un pistón de desplazamiento móvil dentro de un extremo de un cilindro de desplazamiento que tiene una cámara de desplazamiento y que tiene otro extremo con una abertura, donde dicho pistón de desplazamiento está conectado al accionador y controlado por dicho accionador; y una punta de pipeta en comunicación con dicha abertura, donde el microprocesador es programable para provocar el movimiento del pistón en el cilindro a una velocidad que resulta en la extracción de un líquido en la punta de la pipeta con un flujo deseado cuando la punta está en comunicación con el líquido. El caudal puede ser relativamente lento, tal como los caudales lentos descritos anteriormente, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 y 4 ml/min.

La contrapresión de una columna dependerá del tamaño promedio de perla, de la distribución del tamaño de perla, de la longitud promedio del lecho, del área de sección transversal promedio del lecho, de la contrapresión debida a la frita y de la viscosidad del caudal del líquido que pasa a través del lecho. Para un lecho de 10 ul descrito en esta invención, la contrapresión a un caudal de 2 ml/min varió de 0,5 a 2 psi. Otras dimensiones de las columnas darán como resultado contrapresiones que varían de, por ejemplo, 0,1 psi a 30 psi dependiendo de los parámetros descritos anteriormente. El caudal promedio varía de 0,05 ml/min a 10 ml/min, pero comúnmente estará en un intervalo de 0,1 a 2 ml/min con un caudal de 0,2-1 ml/min siendo el más común para las columnas de lecho de 10 ul.

En algunas realizaciones, la invención proporciona columnas caracterizadas por volúmenes de lecho pequeños, áreas de sección transversal promedio pequeñas, y/o bajas contrapresiones. Esto contrasta con las columnas previamente notificadas que tienen volúmenes de lecho pequeños pero tienen contrapresiones más altas, por ejemplo, para uso en HPLC. Los ejemplos incluyen contrapresiones en condiciones normales de funcionamiento (por ejemplo, 2 ml/min en una columna con lecho de 10 pl) inferiores a 30 psi, inferiores a 10 psi, inferiores a 5 psi, inferiores a 2 psi, inferiores a 1 psi, inferiores a 0,5 psi, inferiores a 0,1 psi, inferiores a 0,05 psi, inferiores a 0,01 psi, inferiores a 0,005 psi o inferiores a 0,001 psi. Por tanto, algunas realizaciones de la presente descripción implican intervalos de contrapresiones que se extienden de un límite inferior de 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 o 20 psi, a un límite superior de 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 psi (1 psi = 6,8948 kPa). Una ventaja de las contrapresiones bajas es que las resinas blandas, por ejemplo, perlas a base de agarosa o sefarosa poco reticuladas, tienen una tendencia mucho menor a colapsar. Debido a las bajas contrapresiones, muchas de estas columnas pueden funcionar usando solo la gravedad para impulsar la solución a través de la columna. Otras tecnologías que tienen contrapresiones más altas necesitan una presión más alta para impulsar la solución, por ejemplo, centrifugación a una velocidad relativamente alta. Esto limita el uso de este tipo de columnas a perlas de resina que pueden soportar esta presión sin colapsar.

La expresión "área de sección transversal" se refiere al área de una sección transversal del lecho de medio de extracción, es decir, una sección plana del lecho generalmente perpendicular al flujo de solución a través del lecho y paralela a las fritas. En el caso de un lecho cilíndrico o troncocónico, la sección transversal es generalmente circular y el área de sección transversal es simplemente el área del círculo (área = pi x r2). En las realizaciones de la invención donde el área de sección transversal varía a lo largo del lecho, tal como en el caso de muchas de las realizaciones preferidas de la invención descritas en esta invención que tienen una forma troncocónica ahusada, el área de sección transversal promedio es un promedio de las áreas de sección transversal del lecho. Como buena aproximación, el área de sección transversal promedio de un lecho troncocónico es el promedio de las secciones transversales circulares en cada extremo del lecho. El área de sección transversal promedio del lecho del medio de extracción puede ser bastante pequeña en algunas de las columnas de punta de pipeta de la invención, particularmente en las columnas de baja contrapresión. Los ejemplos incluyen áreas de sección transversal inferiores a aproximadamente 100 mm2, inferiores a aproximadamente 50 mm2, inferiores a aproximadamente 20 mm2, inferiores a aproximadamente 10 mm2, inferiores a aproximadamente 5 mm2, o inferiores a aproximadamente 1 mm2. Por tanto, algunas realizaciones de esta descripción involucran intervalos de contrapresiones que se extienden de un límite inferior de 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 o 20 mm2 a un límite superior de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mm2.

Después de introducir la solución de muestra en el lecho y permitir que el analito se adsorba, la solución de muestra se evacua sustancialmente del lecho, dejando el analito unido. No es necesario que toda la solución de muestra sea evacuada del lecho, pero la asiduidad en la eliminación de la solución puede mejorar la pureza del producto final. Una etapa de lavado opcional entre las etapas de adsorción y desorción también puede mejorar la pureza del producto final. Por lo general, se usa agua o un amortiguador para la solución de lavado. La solución de lavado es preferiblemente una que, con una desorción mínima del analito de interés, eliminará el exceso de materiales de matriz, materiales ligeramente adsorbidos o adsorbidos no específicamente para que no se desprendan en el ciclo de elución como contaminantes. El ciclo de lavado puede incluir disolvente o disolventes que tengan un pH específico, o que contengan componentes que promuevan la eliminación de materiales que interactúan ligeramente con la fase de extracción. En algunos casos, se pueden utilizar varios disolventes de lavado en sucesión para eliminar material específico, por ejemplo, PBS seguido de agua. Estos ciclos se puede repetir tantas veces como sea necesario. En otros casos, donde se puede tolerar una contaminación liviana, se puede omitir un ciclo de lavado.

Las columnas y los dispositivos de extracción deben almacenarse en condiciones que preserven la integridad del medio de extracción. Por ejemplo, las columnas que contienen medio de extracción a base de agarosa o sefarosa deben almacenarse en condiciones frías (por ejemplo, 4 grados Celsius) y en presencia de azida sódica al 0,01 por ciento o etanol al 20 por ciento. Antes de la extracción, se puede emplear una etapa de acondicionamiento. Esta etapa es para asegurarse de que la punta esté en una condición lista y uniforme, y puede implicar el tratamiento con un disolvente y/o eliminando el exceso de líquido del lecho. Si se utilizan materiales de gel de agarosa o similares, el lecho debe mantenerse completamente hidratado antes de su uso.

En algunos casos donde durante todo el procedimiento la cámara de medio permanece sellada para evitar que el aire entre o salga del espacio de cabeza, la etapa de proporcionar dicha primera columna comprende las etapas que consisten en:

a) proporcionar una primera columna que comprende:

i. un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un primer extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna;

ii. una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo;

iii. una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto definen una cámara de medio;

iv. un primer lecho rellenado de medio colocado en el interior de la cámara de medio, donde el lecho rellenado de medio comprende un espacio intersticial que está sustancialmente lleno de un líquido de almacenamiento, formando dicho líquido de almacenamiento el sello que evita que el aire entre o salga del espacio de cabeza; y

v. un primer espacio de cabeza definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio de cabeza comprende un gas que tiene una primera presión de descarga; y

b) fijar de manera sellada dicha bomba al extremo superior abierto, donde después de la fijación a la bomba el espacio intersticial de dicho lecho de medio permanece sustancialmente lleno de líquido de almacenamiento, manteniendo de esta manera un sello que evita que el aire entre o salga del espacio de cabeza.

En determinadas realizaciones, el líquido de almacenamiento es un disolvente miscible en agua que tiene una viscosidad superior a la del agua. En determinadas realizaciones, el disolvente miscible en agua tiene un punto de ebullición superior a 250 °C. El disolvente miscible en agua puede constituir el 50 % del líquido de almacenamiento. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el disolvente miscible en agua comprende un diol, triol o polietilenglicol de n=2 a n=150, por ejemplo, glicerol.

Multiplexación

En algunas realizaciones no contempladas por la invención reivindicada, se analiza una pluralidad de columnas de forma paralela, por ejemplo, multiplexada. Esto permite el procesamiento paralelo y simultáneo de múltiples muestras. Se proporciona una descripción de la multiplexación de capilares de extracción en las solicitudes de patente de EE. UU. N.° 10/434.713 y 10/733.534, y se puede aplicar la misma estrategia general a las columnas de punta de pipeta de la invención objeto.

La multiplexación se puede lograr, por ejemplo, disponiendo las columnas en paralelo de modo que el fluido pueda pasar a través de ellas al mismo tiempo. Cuando se utiliza una bomba para manipular fluidos a través de la columna, cada columna de la matriz multiplex puede tener su propia bomba, por ejemplo, bombas de jeringa activadas por un accionador común. Alternativamente, las columnas se pueden conectar a una bomba común, un dispositivo de vacío común o similar. En otro ejemplo de una disposición multiplex, la pluralidad de columnas está dispuesta de tal manera que se pueden centrifugar, siendo el fluido impulsado a través de las columnas por la fuerza centrífuga.

En una realización, la muestra se puede disponer desde una columna de extracción hasta una pluralidad de ubicaciones predeterminadas, por ejemplo, ubicaciones en un chip o micropocillos en una placa multipocillo. Se puede utilizar un sistema de procesamiento de líquidos preciso para distribuir el volumen deseado de eluyente en cada ubicación. Por ejemplo, una columna de extracción que contiene analito unido toma 50 pl de disolvente de desorción, y las gotas de 1 pl se depositan en micropocillos utilizando un sistema robótico como los disponibles comercialmente en Zymark (por ejemplo, el manipulador de muestras SciClone), Tecan (por ejemplo, el Genesis NPS, Aquarius o TeMo) o Distribución cartesiana (por ejemplo, el sistema de sobremesa Honeybee), Packard (por ejemplo, MiniTrak5, Evolution, Platetrack o Apricot), Beckman (por ejemplo, FX-96) y Matrix (por ejemplo, Plate Mate 2 o SerialMate). Esto se puede utilizar para ensayos de alto rendimiento, cristalizaciones, etc.

La figura 13 representa un ejemplo de un sistema de extracción multiplexado. El sistema incluye un soporte de jeringas 12 para sostener una serie de jeringas 14 (por ejemplo, jeringas de vidrio de 1 ml) y un soporte de émbolos 16 para acoplar los émbolos 18 con una bomba de jeringa 20. La bomba de jeringa incluye un tornillo 34 para mover el soporte del émbolo y una base estacionaria 36. La bomba de jeringa puede mover el soporte de émbolos hacia arriba y hacia abajo mientras el soporte de jeringas permanece estacionario, accionando por tanto simultáneamente todos los émbolos de jeringa fijados al soporte. Cada jeringa incluye un accesorio de fijación 21 para la fijación de una columna de extracción. Adjunta a cada jeringa a través del accesorio hay una columna de extracción 22. La columna representada en esta realización emplea una punta de pipeta modificada para el cuerpo de columna, los filtros de membrana sirven como fritas superior e inferior 23 y 25, y el lecho de medio de extracción 24 es un lecho rellenado de un medio de gel. El sistema también incluye una gradilla de muestras 26 con múltiples posiciones para contener viales de recogida de muestras 28, que pueden ser tubos eppendorf. La gradilla de muestras está montada de manera deslizable sobre dos varillas verticales, y la altura de la gradilla se puede ajustar deslizándola hacia arriba o hacia abajo de las varillas y bloqueando la gradilla en la ubicación deseada. La posición de la gradilla se puede ajustar para que el extremo inferior (la punta) de la columna entre en contacto con la solución en un tubo en la gradilla de eppendorf. El sistema también incluye un controlador 30 para controlar la bomba de jeringa. El controlador está conectado a un ordenador 32, que puede programarse para controlar el movimiento de la bomba a través del controlador. El controlador permite controlar cuándo y a qué velocidad se mueve la gradilla de émbolos, que a su vez se utiliza para controlar el flujo de solución a través de las columnas, la extracción y la infusión. El control de los émbolos puede ser manual o automatizado, mediante un archivo de comandos que puede crear un usuario. El software permite el control del caudal a través de las columnas, y un protocolo de extracción puede incluir múltiples ciclos de extracción e infusión, junto con retrasos opcionales entre ciclos.

Cuando se utiliza un sistema de extracción multiplexado, puede ser conveniente programar retrasos en el software que controla el protocolo de extracción. Cuando se operan varias columnas en paralelo, cada columna puede tener una contrapresión ligeramente diferente. Como resultado, el caudal de un líquido a través de cada columna puede variar cuando se aplica vacío o presión a las columnas. Un medio de compensación de los diferentes caudales es la incorporación de retrasos para igualar el vacío o la presión y por tanto igualar la cantidad total de líquido distribuido o aspirado. Las pausas se pueden utilizar en cualquier momento durante el protocolo, por ejemplo, durante la aspiración, la distribución o entre una etapa de aspiración y distribución.

En un ejemplo de un procedimiento de multiplexación, se sitúan 10 tubos eppendorf que contienen una muestra, por ejemplo, 500 |jl de un lisado celular clarificado que contiene una proteína recombinante etiquetada con His, en la gradilla de muestras. Las jeringas de un ml se fijan al soporte de jeringas y los émbolos se acoplan con el soporte de émbolos. Las columnas de extracción, por ejemplo, columnas de lecho rellenado de bajo volumen muerto como en otras partes en esta invención, se fijan a los accesorios de fijación de jeringa. La punta se acondiciona expulsando la mayor parte de la solución de almacenamiento de la columna y reemplazándola con aire. La gradilla de muestras se eleva para que los extremos de las puntas de extracción entren en la muestra. La solución de muestra se extrae en las columnas mediante la acción de la bomba de jeringa, que eleva el soporte de émbolos y los émbolos. La bomba es preferiblemente capaz de aspirar con precisión un volumen deseado de solución a un caudal deseado, y de depositar y extraer solución a través de la columna. Un ejemplo de una bomba de jeringa adecuada es ME-100 (disponible en PhyNexus, Inc., San Jose, CA). El control del disolvente líquido en la columna es opcionalmente bidireccional. En este caso, y cuando se usa una jeringa para controlar el líquido, la cabeza del émbolo de jeringa y el cuerpo de jeringa deben sujetarse firmemente dentro de la bomba de jeringa. Cuando se invierte la dirección del émbolo de jeringa, puede haber un retraso o un efecto de histéresis antes de que la jeringa pueda comenzar a mover el líquido en la dirección opuesta. Este efecto es más importante a medida que se reduce el volumen de disolvente. En el instrumento ME-100, la jeringa y el émbolo de jeringa están asegurados de modo que no se pueda realizar ningún movimiento perceptible contra la gradilla de soportes.

Si el volumen de la muestra es mayor que el volumen intersticial del lecho, la muestra se introduce a través del lecho y en el cuerpo de columna por encima de la frita superior. A continuación, la solución de muestra se expulsa nuevamente en el recipiente de muestra. En algunas realizaciones no contempladas por la invención reivindicada, el procedimiento de extracción de la muestra a través del lecho y de vuelta al recipiente de muestras se realiza dos o más veces, cada una de las cuales da como resultado el paso de la muestra a través del lecho dos veces. Como se discutió en otra parte de esta invención, la adsorción de analitos se puede mejorar en algunos casos usando un caudal más lento y/o aumentando el número de pasos de la muestra a través del medio de extracción.

A continuación se retira el recipiente de muestras y se reemplaza con un recipiente similar que contenga solución de lavado (por ejemplo, en el caso de una extracción de metal inmovilizado, imidazol 5 mM en PBS), y la solución de lavado se bombea de un lado a otro a través del lecho de extracción (como fue el caso de la muestra). La etapa de lavado se puede repetir una o más veces con volúmenes adicionales de solución de lavado. Se puede emplear opcionalmente una serie de dos o más soluciones de lavado diferentes, por ejemplo, PBS seguido de agua.

Después de la etapa de lavado, el lecho de extracción se puede purgar opcionalmente con gas para eliminar la solución a granel del espacio intersticial. Opcionalmente, la jeringa se puede cambiar antes de la elución. Por ejemplo, las jeringas desechables de 1 ml utilizadas para la muestra y la solución de lavado se pueden reemplazar con jeringas GasTight de 50 j l para la elución. A continuación, se llena la gradilla de muestras original (o una bandeja de recogida de muestras diferente) con viales de recogida de muestras (por ejemplos, tubos Eppendorf de 0,5 ml) y se ajusta la altura de los tubos de modo que los extremos inferiores de las columnas queden justo por encima de la parte inferior de los tubos de muestras individuales. Se sitúa una alícuota de disolvente de desorción en el fondo de cada tubo (por ejemplo, 15 j l de imidazol 200 mM serían típicos para la elución de proteína de una columna de metal inmovilizado que tiene un volumen de lecho de aproximadamente 20 jl). La solución de elución se puede manipular de un lado a otro a través del lecho varias veces mediante ciclos repetidos de aspiración y expulsión de la solución a través de la columna. El ciclo de elución se completa expulsando la solución de desorción de nuevo al vial de muestra. El procedimiento de elución puede repetirse, lo que en algunos casos permite una mejor recuperación de la muestra.

El procedimiento de extracción descrito anteriormente se puede automatizar, por ejemplo, usando software para programar el controlador informático para controlar el bombeo, por ejemplo, los volúmenes, caudales, retrasos y número de ciclos.

En algunas realizaciones no contempladas por la presente invención, la presente descripción proporciona un sistema de extracción multiplexado que comprende una pluralidad de columnas de extracción, por ejemplo, columnas de punta de pipeta de bajo volumen muerto que tienen pequeños lechos rellenados de resinas de gel. El sistema puede ser automático o manual. El sistema puede incluir una bomba o una bomba en acoplamiento operativo con las columnas de extracción, útil para bombear fluido a través de las columnas de forma multiplex, es decir, simultáneamente. En algunas realizaciones, cada columna es direccionable. El término "direccionable" se refiere a la capacidad del mecanismo de manipulación de fluidos, por ejemplo, las bombas, para direccionar individualmente cada columna. Una columna direccionable es aquella en la que el flujo de fluido a través de la columna puede controlarse independientemente del flujo a través de cualquier otra columna que pueda funcionar en paralelo. En la práctica, esto significa que los medios de bombeo en al menos una de las etapas de extracción están en contacto y control de cada columna individual independientemente de todas las demás columnas. Por ejemplo, cuando se usan bombas de jeringa, es decir, bombas capaces de manipular fluido dentro de la columna mediante la aplicación de presión positiva o negativa, a continuación se usan jeringas separadas en cada columna, en lugar de un solo vacío fijado a múltiples jeringas. Debido a que las columnas son direccionables, se puede manipular con precisión una cantidad controlada de líquido en cada columna. En un sistema no direccionable, como cuando se aplica una sola bomba a múltiples columnas, el manejo de líquidos puede ser menos preciso. Por ejemplo, si la contrapresión difiere entre columnas multiplexadas, entonces la cantidad de líquido que entra en cada columna y/o el caudal puede variar sustancialmente en un sistema no direccionable.

Tubo de extracción como medio de transferencia de muestras

Una columna de extracción puede funcionar no solo como un dispositivo de separación, sino también como un medio para recoger, transportar, almacenar o distribuir una muestra líquida.

La columna de punta de pipeta según la invención es transportable y puede transportarse fácilmente de un lugar a otro. Tenga en cuenta que este concepto de transportabilidad se refiere a los dispositivos de extracción que pueden transportarse fácilmente, ya sea manualmente o mediante un mecanismo automatizado (por ejemplo, robótica), durante el procedimiento de extracción. Esto debe distinguirse de otros sistemas que emplean una columna de tal manera que está conectada de manera estable a un dispositivo que no es fácil de transportar, por ejemplo, un instrumento de HPLC. Si bien es cierto que se puede mover un instrumento de este tipo, por ejemplo, al instalarlo en un laboratorio, durante el uso la columna permanece fijada de manera estable al instrumento estacionario. Por el contrario, la columna de punta de pipeta de la invención se transporta.

En una realización, la columna de punta de pipeta de la invención es transportable al sitio donde se destina la muestra eluida, por ejemplo, un contenedor de almacenamiento o un instrumento analítico. Por ejemplo, la columna, con el analito unido, se puede transportar a un instrumento analítico, a un chip, a un robot, etc., y se eluye directamente en o sobre la diana prevista. En una realización, la columna de punta de pipeta de la invención se transporta a una cámara de ionización por electrospray y se eluye directamente en la misma. En otra realización, la columna de punta de pipeta de la invención se transporta a un chip o diana MALDI y el analito se aplica directamente sobre la diana.

En algunas realizaciones de la invención, toda la columna de punta de pipeta se transporta, por ejemplo, en el extremo de una jeringa, o solo la columna desnuda o una porción de la misma.

Por tanto, en varias realizaciones, la invención proporciona una columna de punta de pipeta transportable, que incluye la columna y, opcionalmente, otros componentes asociados, por ejemplo, bomba, soporte, etc. El término "transportable" se refiere a la capacidad de un operador de la extracción para transportar la columna, ya sea manualmente o por medios automatizados, durante el procedimiento de extracción, por ejemplo, durante la absorción, lavado o elución de la muestra, o entre cualquiera de estas etapas. Esto debe distinguirse de los dispositivos de extracción no transportables, tales como una columna de extracción conectada a un instrumento estacionario, de manera que la columna no se transporta, ni es conveniente transportar la columna, durante el funcionamiento normal.

Técnicas analíticas

La columna de punta de pipeta y el procedimiento de la invención encuentran una utilidad particular en la preparación de muestras de analito para análisis o detección mediante una variedad de técnicas analíticas. En particular, el procedimiento puede estar relacionado con la purificación de un analito, una clase de analitos, un agregado de analitos, etc., a partir de una muestra biológica, por ejemplo, una biomolécula que se origina en un fluido biológico. Es particularmente útil para usar con técnicas que requieren pequeños volúmenes de analito puro y concentrado. En muchos casos, los resultados de estas formas de análisis mejoran aumentando la concentración del analito. El analito de interés puede ser una proteína y la extracción sirve para purificar y concentrar la proteína antes del análisis. Los procedimientos son particularmente adecuados para su uso con procedimientos de detección sin etiquetas o procedimientos que requieren proteína funcional, nativa (es decir, no desnaturalizada), pero generalmente son útiles para cualquier proteína o ácido nucleico de interés.

Estos procedimientos son particularmente adecuados para su aplicación en estudios proteómicos, el estudio de interacciones proteína-proteína y similares. La explicación de las redes de interacción proteína-proteína, preferiblemente junto con otros tipos de datos, permite la asignación de funciones celulares a nuevas proteínas y la derivación de nuevas rutas biológicas. Véase, por ejemplo, Curr Protein Pept Sci. 20034(3):159-81.

Muchas de las metodologías analíticas y de detección actuales se pueden aplicar a volúmenes de muestra muy pequeños, pero a menudo requieren que el analito se enriquezca y se purifique para lograr resultados aceptables. Las tecnologías convencionales de preparación de muestras suelen funcionar a mayor escala, lo que genera desperdicios porque producen más volumen del necesario. Esto es particularmente un problema cuando la cantidad de muestra inicial es limitada, como es el caso de muchas biomoléculas. Estos procedimientos convencionales generalmente no son adecuados para trabajar con los pequeños volúmenes requeridos por estas nuevas metodologías. Por ejemplo, el uso de técnicas convencionales de cromatografía de lecho rellenado tiende a requerir mayores volúmenes de disolvente y no son adecuadas para trabajar con volúmenes de muestra tan pequeños por varias razones, por ejemplo, debido a la pérdida de muestra en volúmenes muertos, en fritas, etc. Véase la solicitud de patente de EE.Uu . N.° 10/434.713 para una discusión más profunda de los problemas asociados con tecnologías anteriores en relación con el enriquecimiento y la purificación de biomoléculas de baja abundancia.

Ajuste y control de la presión de descarga de columna

La presente invención se refiere a columnas de punta de pipeta de lecho rellenado del siguiente formato, como se ilustra en la Fig. 15. Las columnas emplean una punta de pipeta o una punta de pipeta modificada como cuerpo de columna. El cuerpo de columna tiene un extremo superior abierto 202 para comunicación con una bomba 204 (por ejemplo, una pipeta o un canal de una pipeta multicanal, fijado al extremo superior abierto mediante un accesorio de sellado), un extremo inferior abierto 206 para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna. Una frita inferior 210 está fijada al conducto abierto y se extiende a través del mismo. En la ilustración, la frita inferior se coloca en el propio extremo inferior abierto, es decir, en el extremo inferior del cuerpo de columna. Si bien este posicionamiento se prefiere en muchos casos, en realizaciones alternativas, la frita podría fijarse en una posición que abarque el conducto abierto a cierta distancia del extremo terminal o del extremo inferior abierto. Como resultado del posicionamiento y fijación de la frita, sustancialmente cualquier líquido que entre o salga del conducto abierto a través del extremo inferior abierto pasará a través de la frita.

La columna incluye además una frita superior 212 que se fija al conducto abierto y se extiende a través del mismo entre la frita inferior 210 y el extremo superior abierto 202. La frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto abierto definen una cámara de medio 216 que contiene un lecho rellenado de medio, por ejemplo, un lecho rellenado de medio de extracción que tiene afinidad por un analito de interés. La columna incluye además un espacio de cabeza 208, definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y el accesorio de bomba 214. En una realización típica de la invención, el volumen del espacio de cabeza es sustancialmente superior al volumen de la cámara de medio. El espacio de cabeza está abierto y puede alojar líquido y/o gas que entra por el extremo inferior abierto y la cámara de medio.

El paso de fluido a través del lecho de medio de extracción se controla mediante la bomba 204. La bomba está fijada por sellado a la parte superior abierta 202, es decir, se forma un sello entre el accesorio de bomba 214 y el extremo superior abierto, de modo que la bomba puede bombear gas hacia adentro o hacia afuera del espacio de cabeza, lo que afecta la presión en el espacio de cabeza, es decir, la presión de descarga. En realizaciones alternativas, la fijación del extremo superior abierto a la bomba puede ser directa o indirecta, por ejemplo, la fijación puede ser a través de válvulas, accesorios, mangueras, etc., siempre que la fijación esté operativa y el accionamiento de la bomba afecte a la presión de descarga, lo que hace que el fluido sea extraído o expulsado del lecho de medio.

La combinación de columna y bomba ilustrada en la Fig. 15 se usa para hacer pasar un líquido de un lado a otro a través del lecho rellenado de medio. El extremo inferior abierto se pone en contacto con el líquido y se activa la bomba para extraer el líquido en el extremo inferior abierto y a través del lecho rellenado de medio, es decir, mediante la generación de una presión negativa en el espacio de cabeza en relación con la presión ambiente. En muchas realizaciones, el volumen de líquido es sustancialmente superior al volumen intersticial del lecho de medio de extracción. El líquido pasa a través del lecho y se acumula en el espacio de cabeza. A continuación, se activa la bomba para expulsar la totalidad o parte del líquido a través del lecho de medio y fuera del extremo inferior abierto, es decir, mediante la generación de una presión positiva en el espacio de cabeza con respecto a la presión ambiente, por ejemplo, presión atmosférica. Este procedimiento normalmente se repite varias veces con una pluralidad de líquidos diferentes, por ejemplo, una solución de muestra que contiene un analito de interés, solución(es) de lavado y solución de desorción, en cualquiera de los diversos procedimientos descritos en esta invención.

La expresión "presión ambiente" se refiere a la presión del aire fuera de la columna, normalmente la presión del aire atmosférico, o la presión del líquido en contacto con el extremo inferior abierto a bombear a través del medio. Durante el procedimiento de bombeo de líquido a través del lecho de medio, la presión de descarga a veces diferirá de la presión ambiente. Esto ocurre porque el accesorio de sellado de la bomba en el extremo abierto superior y el lecho de medio de extracción y fritas en el extremo abierto inferior impiden el flujo de gas hacia adentro y hacia afuera del espacio de cabeza. Este es particularmente el caso cuando el espacio intersticial del lecho de medio está lleno de líquido y/o cuando la frita está húmeda.

Por ejemplo, con el fin de extraer un líquido a través de la frita inferior y en el lecho de medios de extracción, la bomba se usa para extraer aire del espacio de cabeza, generando así una presión de descarga negativa relativa. Una vez que la presión de descarga se vuelve lo suficientemente negativa en relación con la presión ambiente, se aspira líquido a través del extremo superior abierto. El flujo de líquido es resistido por la contrapresión de la columna y por los efectos de la tensión superficial dentro de la columna, particularmente en el lecho y en la interfaz del lecho y las fritas. La tensión superficial puede surgir de la interacción del líquido con el lecho rellenado de medio y/o con la frita. Esta tensión superficial da como resultado una resistencia inicial al flujo de líquido a través del lecho de medio de extracción, que se describe en otra parte de esta invención como una forma de "punto de burbuja". Como resultado, se debe generar un cierto umbral mínimo de presión de descarga negativa antes de que el líquido comience a fluir a través del lecho. Además, existe la contrapresión de la columna que debe superarse para que el líquido fluya a través del lecho. Por tanto, en el funcionamiento de la columna debe generarse una presión de descarga suficientemente negativa para superar los efectos de la contrapresión y la tensión superficial antes de que comience el flujo a través del lecho. Como resultado, pueden desarrollarse y mantenerse presiones de descarga negativas significativas; la magnitud de la presión de descarga dependerá en cierta medida de la contrapresión y la tensión superficial, que a su vez depende del tamaño del lecho, de la naturaleza del medio, de la naturaleza de rellenado, de la naturaleza de las fritas y de la interacción de las fritas con el lecho.

Asimismo, se genera una presión de descarga relativamente positiva con el fin de expulsar el líquido de la columna.

La expulsión de líquido de la columna es resistida por los mismos efectos de contrapresión y tensión superficial descritos para la absorción de líquido. Como resultado, se pueden generar y mantener presiones de descarga positivas relativamente grandes mediante el accesorio de sellado en el extremo abierto superior y la resistencia al flujo de gas proporcionada por el lecho y las fritas.

Durante el transcurso de la realización de una purificación usando las columnas de punta de pipeta de la invención, la presión de descarga de cualquier columna dada variará durante el transcurso del procedimiento. Por ejemplo, consideremos una realización donde se utilizan múltiples columnas de punta de pipeta y una pipeta multicanal programable. Las columnas se fijan por fricción a los accesorios de la pipeta, lo que puede generar una presión positiva inicial en el espacio de cabeza. Esta presión positiva es el resultado de la compresión del espacio de cabeza a medida que la columna es empujada aún más hacia el accesorio después de formar un sello entre el extremo superior abierto y el accesorio. Esta presión positiva se puede mantener durante un período de tiempo sustancial, ya que el sello y la contrapresión y la tensión superficial del lecho inhiben la salida de gas del espacio de cabeza.

Con el fin de extraer líquido en el lecho, la bomba se utiliza para extraer gas del espacio de cabeza, generando así una presión de descarga suficientemente negativa para superar los efectos de la contrapresión y la tensión superficial. Esto generará una presión negativa relativamente estable. Para expulsar el líquido, la bomba se usa para forzar el gas en el espacio de cabeza, generando así una presión de descarga suficientemente positiva para superar los efectos de la contrapresión y la tensión superficial. Este procedimiento se repite a lo largo de cada ciclo de extracción y expulsión de líquido de la columna, y el procedimiento va acompañado de un ciclo de presiones de descarga negativas y positivas.

Tenga en cuenta que la presión de descarga al comienzo de cada etapa de bombeo generalmente no es una presión neutra o ambiente, sino una presión negativa o positiva resultante de una etapa de bombeo anterior, o de la fijación de la punta a la pipeta, o similares. Por ejemplo, considere un procedimiento de purificación típico que implica pasar una solución que contiene un analito a través de un lecho de extracción, seguido de una etapa de lavado y, finalmente, de desorción. Al comienzo de la etapa de desorción, generalmente habrá una presión no neutra, por ejemplo, una presión residual positiva de la última etapa de expulsión de la solución de lavado. La magnitud de esta presión de descarga positiva es el resultado acumulativo de todas las etapas anteriores y dependerá en cierta medida de la naturaleza de la columna de punta particular. Por ejemplo, cuanto mayor sea la resistencia al flujo que debe superar la bomba (es decir, la contrapresión y la tensión superficial de la columna en particular), mayor será la presión positiva que debe generarse en el espacio de cabeza para expulsar el líquido de la columna. Con el fin de extraer el líquido de desorción en el lecho, la bomba debe extraer suficiente gas del espacio de cabeza para compensar la presión positiva y crear una presión de descarga negativa suficiente para extraer la cantidad deseada de solución de desorción a través del lecho.

La Fig. 16 representa la relación entre la presión de descarga y la bomba y el movimiento del líquido en un procedimiento de extracción típico. Este gráfico particular representa una expulsión inicial de líquido de la columna y a continuación un ciclo de absorción y expulsión de líquido de la columna. El eje x es el tiempo y el eje y es la presión o el volumen. La línea continua en la parte superior representa la presión de descarga en función del tiempo, la línea discontinua representa el desplazamiento de una pipeta (en este caso, una jeringa) y la línea discontinua en la parte inferior representa el volumen de líquido en una columna de punta de pipeta. Se utiliza una jeringa como bomba; el movimiento del émbolo de jeringa provoca un cambio en el volumen de la cámara de jeringa, que se llena de aire y se conecta de forma sellada al extremo superior abierto de una columna de punta como se representa en la Fig. 15. En el momento cero, el volumen de líquido (por ejemplo, solución acuosa) en la punta es de aproximadamente 60 ul, el volumen de la cámara de jeringa es de aproximadamente 160 ul y la presión de descarga es de aproximadamente 10 pulgadas de agua. A medida que se presiona el émbolo de jeringa, el volumen de la cámara de jeringa disminuye, lo que hace que aumente la presión de descarga positiva. Este aumento en la presión principal hace que el líquido sea expulsado por el extremo inferior abierto de la columna, lo que da como resultado una disminución en el volumen de líquido en la columna. A medida que el volumen de líquido en la punta se acerca a cero, la presión de descarga comienza a fluctuar. En este punto, apenas sale líquido del lecho, pero aún queda algo de líquido en el espacio intersticial del lecho. La interacción de este líquido con el lecho y las fritas da como resultado un efecto de tensión superficial que impide el flujo de aire a través del lecho. A medida que el volumen de la cámara de jeringa continúa disminuyendo, el aumento de la presión de descarga positiva acabará forzando el aire a través del lecho en forma de burbujas de aire. La tensión superficial en el lecho resiste el movimiento de las burbujas de aire a través del lecho, pero las burbujas de aire serán expulsadas una vez que se logre suficiente presión de descarga positiva. El paso de cada burbuja de aire a través del lecho y fuera de la columna dará como resultado una disminución en la presión de descarga. El resultado son grandes fluctuaciones en la presión de descarga a medida que se presiona el émbolo de jeringa en estas condiciones; el volumen de cabeza se acumula a medida que disminuye el volumen de cámara de jeringa, pero con cada burbuja de aire expulsada a través del lecho, la presión de descarga disminuirá. En muchos casos, se observan fluctuaciones dramáticas en la presión de descarga, como se representa en la Fig. 16, entre los tiempos 1 y 2 (1 y 2 minutos). Cada pico representa la presión de descarga a la que se forzó una burbuja de aire fuera de la columna.

En el momento 2, el volumen de la cámara de jeringa es cero y el émbolo ahora está retraído, lo que da como resultado un aumento del volumen de cámara de jeringa con el tiempo. El aumento del volumen de cámara de jeringa se traduce en una disminución de la presión de descarga, lo que finalmente da como resultado una presión de descarga negativa en un tiempo de aproximadamente 2,5. Una vez que la presión de descarga es suficientemente negativa para superar los efectos de la tensión superficial y la contrapresión, el líquido comienza a fluir a través del lecho y regresa al espacio de cabeza. En el momento 4, el émbolo deja de moverse y el volumen de cámara de jeringa ha alcanzado su máximo. El líquido deja de fluir en la punta y las presiones de descarga se estabilizan a una presión constante moderadamente baja.

Comenzando en el tiempo 6, el émbolo se vuelve a presionar, lo que da como resultado un aumento en la presión de descarga hasta una presión lo suficientemente positiva como para que el líquido comience a fluir hacia afuera de la punta. Tenga en cuenta que una parte de la presión de descarga resulta del peso del líquido sobre el lecho en el espacio de cabeza, y esto puede contribuir a la presión que se aplica para expulsar el líquido. Entre los puntos de tiempo 7,5 y 8, todo el volumen del líquido es expulsado de la columna y la presión de descarga aumenta de nuevo drástricamente debido a los efectos de contrapresión y tensión superficial descritos anteriormente, es decir, como en las condiciones entre 1 y 2 minutos.

Puede ser deseable ajustar la presión de descarga antes o durante el transcurso de un procedimiento de purificación, por ejemplo, antes de una etapa de bombeo. El ajuste de la presión de descarga es particularmente importante en procedimientos automatizados, por ejemplo, procedimientos que involucran pipetas automatizadas, programables y/o robóticas, y en procedimientos que emplean una pluralidad de columnas de punta, por ejemplo, procedimientos multiplexados.

En un procedimiento donde se usa una jeringa o una pipeta manual, por ejemplo, la tradicional Gilson Pipetman® manual, la presión de descarga normalmente no es un problema importante porque el usuario puede compensar cualquier presión de descarga en tiempo real durante la operación de la pipeta. Por ejemplo, al absorber la solución de desorción, el usuario controlará visualmente la absorción de fluido e intuitivamente retraerá el émbolo lo suficiente como para superar cualquier presión positiva residual y extraer la cantidad deseada de líquido a través del lecho. Cualquier ajuste de la presión de descarga es tan trivial que es probable que el usuario no sea consciente de ello. Pero esto es una consecuencia de que el usuario puede controlar visualmente la absorción de fluido y ajustar el movimiento del émbolo en consecuencia.

Sin embargo, cuando se utiliza una pipeta programable, tal como una pipeta multicanal automatizada (por ejemplo, el instrumento ME-200, disponible en PhyNexus, Inc., San Jose, CA), la presión de descarga puede convertirse en un problema crítico. Normalmente, la pipeta bombea gas dentro o fuera del espacio de cabeza mediante el movimiento de un pistón de desplazamiento dentro de un cilindro de desplazamiento que tiene una cámara de desplazamiento y que tiene otro extremo con una abertura en comunicación con el espacio de cabeza (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.905.526, 5.187.990 y 6.254.832). La velocidad y alcance del movimiento del pistón (es decir, el desplazamiento del pistón) están controladas por un microprocesador, que es programado por el operador. El operador programará una cantidad de desplazamiento del pistón que alterará la presión de descarga lo suficiente como para extraer o expulsar una cantidad deseada de líquido a través del lecho. La cantidad de desplazamiento de pistón requerida dependerá de la cantidad de líquido que pase a través del lecho, la resistencia al flujo a través del lecho (por ejemplo, contrapresión, tensión superficial) y también debe ser suficiente para compensar cualquier presión de descarga residual presente antes del desplazamiento de la bomba.

Por ejemplo, considere el caso en el que la siguiente etapa en un procedimiento es la absorción de una solución de desorción, y hay una presión de descarga positiva residual como resultado de una etapa anterior de expulsar una solución de lavado. Con el fin de absorber la solución de desorción, el operador debe programar el microprocesador para dirigir un desplazamiento del pistón suficiente para neutralizar la presión de descarga residual y a continuación introducir una presión negativa en el espacio de cabeza suficiente para superar la resistencia al flujo y extraer la cantidad deseada de solución de desorción. El volumen de solución de desorción suele ser pequeño y la absorción precisa de la cantidad correcta es importante con el fin de lograr la recuperación y concentración óptimas del producto final. Es evidente que para programar el desplazamiento correcto del pistón, es imperativo conocer y tener en cuenta la presión de descarga residual, y/o que se ajuste la presión principal. Si no se tiene en cuenta la presión de descarga, el desplazamiento del pistón será incorrecto, al igual que la cantidad de líquido absorbido. Cuanto mayor sea la presión de descarga, o las variaciones en la presión de descarga, en relación con la cantidad de líquido absorbido, mayor será el problema.

Por ejemplo, en la Fig. 16, las presiones de descarga en los tiempos 3 y 7 representan las presiones de descarga capaces de extraer líquido a través del lecho y expulsar líquido a través del lecho, respectivamente. Note que la diferencia en la presión de descarga entre los tiempos 3 y 7 es menos de 10 pulgadas de agua; por tanto, una diferencia en la presión de descarga de menos de 10 es la diferencia entre la absorción y la expulsión de fluidos. Ahora considere la fluctuación en la presión de descarga entre los tiempos 1 y 2; la presión de descarga varía en más de 10 pulgadas de agua. Estos son los cambios en la presión de descarga que se pueden generar a medida que disminuye el espacio de cabeza de jeringa (aumentando la presión de descarga) y las burbujas de aire son forzadas intermitentemente a través del lecho (disminuyendo la presión de descarga). Dependiendo de en qué momento se detenga la presión del émbolo, la presión de descarga puede variar entre 15 y 25 pulgadas de agua en el punto de parada. Esta presión de descarga es la presión de descarga residual que debe tenerse en cuenta al comenzar la etapa de absorción de fluido, es decir, al comenzar a levantar el émbolo en el tiempo 2. La medida en que se debe levantar el émbolo, es decir, el volumen al que la cámara de jeringa debe aumentarse para extraer la cantidad deseada de líquido dependiendo de la presión de descarga residual. Por ejemplo, si la presión de descarga residual es 25, el cambio en el volumen de cámara de jeringa requerido para lograr la presión de descarga negativa necesaria será sustancialmente menor que si la presión de descarga residual es 15. Un cambio en el volumen de cámara de jeringa que sea suficiente para aspirar, por ejemplo, 20 ul de líquido cuando la presión de descarga residual sea 15, en muchos casos será insuficiente para aspirar la misma cantidad de líquido (o posiblemente cualquier líquido) cuando la presión de descarga residual sea igual a 25 Por otro lado, un cambio en el volumen de cámara de jeringa que sea suficiente para aspirar 20 ul de líquido cuando la presión de descarga residual en 25 puede ser excesiva cuando la presión de descarga residual es de solo 15. Un cambio excesivo en el volumen de presión de descarga puede provocar la aspiración de demasiado líquido. O si el líquido se extrae de un recipiente (por ejemplo, un tubo eppendorf) que contiene solo 20 ul de líquido, el cambio excesivo en el volumen de cámara de jeringa provocará la aspiración de aire a través del lecho después de que se hayan aspirado los 20 ul. Esto puede repercutir negativamente en el resultado de un procedimiento de depuración, ya que puede dar lugar a que suban burbujas de aire a través del lecho que pueden romperse y provocar salpicaduras de líquido en el espacio de cabeza. Esto puede dar como resultado que las gotas de líquido se adhieran a las paredes del conducto pasante, en lugar de formar un cuerpo continuo de líquido sobre la parte superior de la membrana superior. Cuando el líquido se bombea posteriormente fuera del lecho, estas gotas pueden quedar atrás. Cuando el líquido es un pequeño volumen de solución de desorción que se utiliza en una etapa de elución de muestra, estas gotas no recuperadas pueden provocar una pérdida sustancial de la muestra, es decir, una baja recuperación de la muestra.

Otro escenario en el que el volumen de cabeza residual puede plantear problemas sustanciales en un procedimiento de purificación automatizado es cuando se utilizan múltiples columnas de punta de pipeta (dos o más), ya sea simultáneamente o en serie. Por ejemplo, considere un procedimiento de extracción desarrollado para su uso con una columna de punta de pipeta particular, y destinado a ser usado para extraer muestras con múltiples columnas de punta de pipeta del mismo tipo, por ejemplo, sustancialmente las mismas dimensiones de columna, espacio de cabeza, tamaño de lecho, etc. Como se describió anteriormente, el procedimiento estará acompañado por variaciones en la presión de descarga, y particularmente con la acumulación de presiones de descarga residuales (ya sean negativas o positivas) que estarán presentes antes de comenzar cada etapa de absorción o expulsión de líquido. En la práctica, lo que se observa a menudo es que la presión de descarga residual presente en cualquier etapa del procedimiento variará de una columna a otra, a menos que se tomen medidas para ajustar la presión de descarga. Esta variación puede ser el resultado de cualquiera de una serie de factores, incluido el tipo de fluctuaciones de presión de descarga observadas entre los tiempos 1 y 2 en la Fig. 16, y también debido a ligeras variaciones de una columna a otra, lo que refleja una diferencia sutil en el relleno del lecho y de la interacción del lecho con las fritas y con el líquido, es decir, efectos diferenciales de tensión superficial y contrapresión. Debido a que las presiones de descarga residuales pueden variar de un análisis a otro y de una columna a otra, el alcance adecuado del movimiento del émbolo de jeringa (equivalente al movimiento del pistón de desplazamiento en una pipeta) también variará.

Este puede ser el caso en el que varias columnas se analizan secuencialmente (en serie) y se desea programar una pipeta automatizada para extraer la cantidad correcta de líquido en cada etapa. Si la presión de descarga residual al comienzo de una etapa dada varía de una columna a otra, entonces el volumen de desplazamiento apropiado para lograr la cantidad deseada de absorción (o expulsión) de la muestra también variará.

Este también puede ser el caso cuando se analizan varias columnas al mismo tiempo y/o en paralelo, por ejemplo, como se logra mediante una pipeta multicanal o un sistema robótico de manipulación de líquidos. Debido a las sutiles diferencias de punta a punta, pueden desarrollarse diferentes presiones de descarga residuales de punta a punta. Si estas presiones de descarga no se ajustan antes de una etapa dada, y se usa el mismo desplazamiento de volumen preprogramado para cada canal del dispositivo multicanal, entonces pueden surgir los tipos de problemas discutidos anteriormente.

Una estrategia para mantener la presión de descarga constante en varias columnas de punta es comenzar con aproximadamente el mismo volumen de líquido en cada punta y a continuación evitar expulsar o extraer aire a través de cualquier lecho durante las diversas etapas en un procedimiento de purificación.

Por ejemplo, un procedimiento para pasar líquido a través de una columna de punta de pipeta de lecho rellenado, cuyo procedimiento no está contemplado por la invención reivindicada, comprende las etapas que consisten en:

(a) proporcionar una primera columna que comprende: un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un primer extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo; una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie de conducto definen una cámara de medio; un primer lecho rellenado de medio colocado en el interior de la cámara de medio; un primer espacio de cabeza definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio de cabeza comprende un gas (típicamente aire) que tiene una primera presión de descarga; y una bomba (por ejemplo, una pipeta o jeringa) fijada de manera sellada al extremo superior abierto, donde el accionamiento de la bomba afecta a la primera presión de descarga, provocando así que el fluido sea extraído o expulsado del lecho de medio;

(b) poner en contacto dicho primer extremo inferior abierto con un primer líquido;

(c) accionar la bomba para extraer el primer líquido en el primer extremo inferior abierto y a través del primer lecho rellenado de medio; y

(d) accionar la bomba para expulsar al menos parte del primer líquido a través del primer lecho rellenado de medio y fuera del primer extremo inferior abierto.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además las siguientes etapas posteriores a la etapa (d):

e) poner en contacto dicho primer extremo inferior abierto con un segundo líquido, que es opcionalmente el mismo que el primer líquido;

f) accionar la bomba para extraer el segundo líquido en el primer extremo inferior abierto y a través del primer lecho rellenado de medio; y

g) accionar la bomba para expulsar al menos parte del segundo líquido a través del primer lecho rellenado de medio y fuera del primer extremo inferior abierto.

La presión de descarga de la primera columna se puede ajustar en uno o más puntos en el procedimiento, por ejemplo, para abordar los problemas de presión de descarga discutidos anteriormente. Por ejemplo, la primera presión de descarga de la primera columna se puede ajustar entre las etapas (d) y (f) para acercar la presión de descarga a una presión de referencia, o igualar o igualar sustancialmente a una presión de descarga de referencia. La presión de descarga de referencia puede ser cualquier presión deseada para lograr la absorción o expulsión deseada de líquido cuando se acciona la bomba. La presión se puede predeterminar, por ejemplo, determinando la presión de descarga en un análisis de referencia donde se calibra el grado de movimiento de un pistón para lograr la expulsión o absorción de una cantidad deseada de líquido. Por ejemplo, la presión de descarga de referencia puede ser la presión de descarga de la primera columna antes de la etapa (c). La presión de descarga de referencia se puede basar en un estándar externo al espacio de cabeza, por ejemplo, la presión del aire ambiente. Por ejemplo, una forma de ajustar la presión de descarga a un valor predeterminado es exponer el espacio de cabeza al ambiente externo (permitiendo que el aire pase hacia o desde el espacio de cabeza), normalizando así la presión de espacio de cabeza a la presión ambiente. Esto se puede lograr, por ejemplo, rompiendo el sello entre el extremo abierto superior y la bomba (por ejemplo, quitando una columna de punta de pipeta de una pipeta y a continuación volviéndola a colocar, disipando así cualquier presión de descarga negativa o positiva y normalizando la presión de descarga a la presión del aire ambiente). Por ejemplo, considere múltiples columnas de punta de pipeta, cada una fijada a un canal de pipeta y cada una teniendo una presión de descarga diferente como resultado de una operación previa de absorción o expulsión de líquido. Se podría desacoplar brevemente cada columna de punta del canal de pipeta, permitiendo que el espacio superior se equilibre con la presión del aire ambiente y, por lo tanto, normalizando las presiones de descarga. La misma técnica también se aplica a una sola columna de punta de pipeta; la normalización de la presión de descarga asegurará presiones de descarga consistentes al comienzo de una etapa dada y volúmenes iguales de líquido absorbido de análisis a análisis.

Las etapas adicionales pueden ser:

h) proporcionar una segunda columna que comprende: un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un segundo extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo; una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie de conducto definen una cámara de medio; un segundo lecho rellenado de medio colocado en el interior de la cámara de medio; un segundo espacio de cabeza definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio de cabeza comprende un gas que tiene una segunda presión de descarga; y una bomba fijada de manera sellada al segundo extremo superior abierto, donde el accionamiento de la bomba afecta a la segunda presión de descarga, provocando así que el fluido sea extraído o expulsado del segundo lecho rellenado de medio;

i) poner en contacto dicho segundo extremo inferior abierto con un tercer líquido, que es opcionalmente el mismo que el primer líquido;

j) accionar la bomba para extraer el tercer líquido en el segundo extremo inferior abierto y a través del segundo lecho rellenado de medio;

k) accionar la bomba para expulsar al menos parte del tercer líquido a través del segundo lecho rellenado de medio y fuera del segundo extremo inferior abierto.

l) poner en contacto dicho segundo extremo inferior abierto con un cuarto líquido, que es opcionalmente el mismo que el tercer líquido;

m) accionar la bomba para aspirar el cuarto líquido en el segundo extremo inferior abierto y a través del segundo lecho rellenado de medio; y

n) accionar la bomba para expulsar al menos parte del cuarto líquido a través del segundo lecho rellenado de medio y fuera del segundo extremo inferior abierto, donde la presión de descarga de la segunda columna se ajusta entre las etapas (k) y (m) para hacer que la presión de descarga se acerque más a una presión de referencia.

Las etapas (b) a (g) se pueden realizar antes de las etapas (i) a (n). En otras realizaciones, las etapas (b) a (g) se realizan simultáneamente y en paralelo con las etapas (i) a (n). Es decir, las dos columnas se pueden analizar secuencialmente o en paralelo, como en los procedimientos de extracción multiplexados. En algunas realizaciones, la presión de descarga de referencia es la presión de descarga de la primera columna inmediatamente antes del comienzo de la etapa (f).

La presión de descarga se puede ajustar mediante cualquiera de varios procedimientos. Como se describió anteriormente, la presión de descarga se puede ajustar rompiendo el accesorio de sellado entre la bomba y el extremo superior abierto de una columna, exponiendo el espacio de cabeza a la presión ambiente y volviendo a fijar de nuevo la bomba de manera sellada al extremo superior abierto de la columna.

Alternativamente, se puede emplear una columna que incluye una válvula en comunicación con el espacio de cabeza, y la presión de descarga se ajusta abriendo esta válvula, lo que hace que el gas entre o salga del espacio de cabeza. Por ejemplo, se puede conectar una válvula de 3 vías entre un accesorio de bomba y una columna de punta de pipeta. La abertura de la válvula permitirá que el aire externo entre o salga del espacio de cabeza, permitiendo así el equilibrio de la presión de descarga con la presión externa, por ejemplo, la presión ambiente.

En otra alternativa, la presión de descarga se ajusta por medio de la propia bomba. La bomba se puede accionar para bombear aire dentro o fuera del espacio de cabeza, ajustando así la presión del espacio de cabeza a un nivel deseado. En algunas realizaciones, se coloca un sensor de presión en comunicación operativa con un espacio de cabeza y se usa para controlar la presión de descarga y para determinar la cantidad de gas a bombear en o desde el espacio de cabeza para lograr el ajuste de presión deseado. El sensor de presión puede proporcionar información en tiempo real a un sistema de bombeo automatizado (por ejemplo, una pipeta multicanal o robot) durante un procedimiento de purificación y provocar la activación adecuada de la bomba para ajustar el espacio libre a la presión deseada. Por ejemplo, en una realización, una primera columna comprende un primer sensor de presión en comunicación operativa con el primer espacio de cabeza, un segundo sensor de presión en comunicación operativa con el segundo espacio de cabeza, que es opcionalmente el mismo que el primer sensor de presión, donde dichos sensores de presión se usan para controlar las presiones de descarga primera y segunda y para determinar la cantidad de gas bombeado en o desde el segundo espacio de cabeza. El procedimiento se puede aplicar a cualquier número de múltiples columnas que se utilicen en paralelo y/o secuencialmente.

En otra realización, la presión de descarga se ajusta eliminando el líquido a granel del espacio intersticial de un lecho rellenado de medio, por ejemplo, soplando aire a través del lecho. En algunos casos, se necesita una presión de descarga relativamente alta para expulsar el líquido residual del lecho, por ejemplo, bombeando aire rápidamente a través del lecho. A menudo, una vez que el líquido ha sido expulsado y reemplazado por aire, el aire del exterior de la columna puede atravesar más fácilmente el lecho y entrar en el espacio de cabeza, equilibrando así la presión de descarga con la presión del aire ambiente. Esto se debe a que la resistencia al flujo de aire de un "lecho seco" de medio de extracción es típicamente sustancialmente menor que la resistencia del "lecho húmedo" correspondiente. La expresión "lecho seco" se refiere a un lecho donde el espacio intersticial está sustancialmente vacío de líquido, aunque puede haber algo de líquido a granel residual y el propio medio podría estar hidratado. "Lecho húmedo" se refiere a un lecho donde el espacio intersticial está sustancialmente lleno de líquido. La tensión superficial en el lecho húmedo presumiblemente limita el flujo de gas a través del lecho, lo que permite el mantenimiento de diferencias de presión sustanciales entre el espacio libre y el entorno ambiente externo.

Con el fin de expulsar todo el líquido de una columna de punta de pipeta, el émbolo de jeringa o el pistón de desplazamiento debe poder desplazar suficiente volumen de la cámara para lograr la presión de descarga positiva requerida. Considere el caso donde un pistón de desplazamiento comienza en una posición de inicio dada correspondiente a un volumen de cámara inicial. El pistón se retrae, aumentando el volumen de la cámara y dando como resultado la absorción de líquido. A continuación, el pistón se extiende de nuevo a la posición inicial, reduciendo el volumen de la cámara al volumen de la cámara inicial. En algunos casos, debido por ejemplo a la tensión superficial y otros efectos descritos en esta invención, el alcance del pistón de regreso a la posición inicial es insuficiente para expulsar todo el líquido de la punta como se desea. Por tanto, es necesario extender el pistón más allá de la posición inicial para expulsar la cantidad total de líquido. Esto es imposible si la posición inicial del pistón está en la posición completamente extendida, es decir, el punto inicial típico, donde el volumen de cámara está en su mínimo. Por tanto, el pistón (o su equivalente, tal como el émbolo en una jeringa) puede retraerse hasta cierto punto desde la posición completamente extendida antes de comenzar a absorber cualquier líquido, es decir, la posición inicial se desplaza desde la posición completamente extendida, y por ende, el volumen de cámara es superior al mínimo. Esto es ventajoso porque permite que el pistón se extienda más allá del punto inicial durante la expulsión del líquido, lo que permite la creación de una mayor presión de descarga positiva para expulsar todo el líquido de la columna según se desee. Cuanto mayor sea el desplazamiento de la posición inicial desde la posición completamente extendida, mayor será la presión de descarga que se puede crear al final de la etapa de extensión. El grado de desplazamiento debe ser suficiente para compensar las contrapresiones encontradas en el sistema de columna particular en cuestión, y puede determinarse empíricamente o calcularse en función de las propiedades de la columna, el líquido de muestra, el sistema de bombeo, etc.

Por tanto, un procedimiento de purificación de un analito, cuyo procedimiento no está contemplado por la invención reivindicada, comprende las etapas que consisten en: (a) proporcionar una columna que comprende: un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo; una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto definen una cámara de medio; un lecho rellenado de medio colocado en el interior de la cámara de medio; un espacio de cabeza definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio de cabeza comprende un gas que tiene una presión de descarga; y una bomba (por ejemplo, una pipeta o jeringa) fijada de forma sellada al extremo superior abierto, donde la bomba incluye un accionador lineal (que puede ser controlado por un microprocesador accionado eléctricamente) y, conectado a y controlado por el accionador lineal, un conjunto de desplazamiento que incluye un pistón de desplazamiento móvil dentro de un extremo de un cilindro de desplazamiento que tiene una cámara de desplazamiento y que tiene un extremo con una abertura en comunicación con el espacio de cabeza; (b) posicionar el pistón en una posición inicial que se desplaza desde una posición totalmente extendida que corresponde a un volumen de cámara de desplazamiento mínimo, donde la posición inicial está lo suficientemente desplazada desde la posición totalmente extendida de modo que la extensión completa del pistón provocará la expulsión total del líquido de la columna durante una etapa de expulsión en el procedimiento (siendo la expulsión total definida como la expulsión de todo el líquido o parte del líquido en la medida deseada por el operador del procedimiento); (c) colocar el extremo inferior abierto en un líquido (ya sea antes, después o al mismo tiempo que la etapa (b)); retraer el pistón para extraer líquido a través del extremo inferior abierto y en el lecho rellenado de medio; y (d) extender el pistón más allá del punto de partida, expulsando así el líquido a través del lecho rellenado de medio y fuera del extremo inferior abierto.

Tenga en cuenta que el procedimiento descrito anteriormente puede generar una presión de descarga negativa antes de retraer el pistón y aspirar el líquido.

Como se discutió anteriormente, la variabilidad no deseada en la presión de descarga es a menudo el resultado del sello intermitente formado por el lecho de medio de extracción y la cámara de medio. Cuando el espacio intersticial está sustancialmente lleno de líquido, se forma un sello que evita que el aire entre o salga del espacio de cabeza. Si se permite que entre aire en el lecho durante un procedimiento de extracción, puede formar canales de aire en el lecho a través de los cuales puede pasar el aire, es decir, se altera el sello. Por tanto, en una realización de la invención se evitan variaciones no deseadas en la presión de descarga manteniendo el sello durante todo el procedimiento de extracción, por ejemplo, evitando que entre aire en la cámara.

Por ejemplo, en una realización, cada accionamiento de la bomba para extraer líquido en la cámara comprende inducir una presión de descarga negativa que es suficiente para aspirar una cantidad deseada de líquido pero que no es tan grande como para provocar que entre aire en la cámara de medio a través de la frita inferior. En algunas realizaciones, la presión negativa inducida está predeterminada para que sea suficiente para aspirar una cantidad deseada de líquido, pero no tan grande como para provocar que entre aire en la cámara de medio a través de la frita inferior.

Los procedimientos que implican evitar la entrada de aire en la cámara de medio son particularmente relevantes en las realizaciones de la invención que emplean fritas de membrana.

Una vez que el líquido haya sido extraído en la cámara de medio, la superficie exterior de la frita inferior está en contacto con el aire (por ejemplo, todo el líquido en un pocillo ha sido aspirado), pero se evita que el aire entre o atraviese la cámara de medio por una tensión superficial que resiste el paso de gas a través de la frita de membrana y la cámara de medio. Opcionalmente, la magnitud de la presión negativa está predeterminada para que sea suficiente para extraer el líquido en la cámara de medio pero no tanto como para superar la tensión superficial que resiste el paso del gas a través de la frita de membrana y la cámara de medio. En algunos casos, existe una tensión superficial que resiste la entrada inicial del líquido a través del extremo inferior abierto del cuerpo de columna y en la cámara de medio, y la magnitud de la presión negativa está predeterminada para que sea suficiente para superar la tensión superficial que resiste la entrada inicial del líquido a través del extremo inferior abierto del cuerpo de columna y en la cámara de medio.

Un punto en el que existe un peligro particular de que se formen canales de aire en el lecho de medio de extracción es al fijar una columna a una bomba, por ejemplo, fijar una columna de punta de pipeta a una pipeta. La fijación de la punta generalmente causará un aumento en la presión de descarga, y este aumento en la presión de descarga puede expulsar líquido del espacio intersticial del lecho de medio y dar como resultado la formación de canales. Una forma de evitar esto es asegurarse de que haya suficiente líquido en el espacio intersticial antes de fijar la punta a una bomba, de modo que el espacio intersticial permanezca sustancialmente lleno de líquido. A este respecto, puede ser ventajoso utilizar un líquido que sea más viscoso que el agua como líquido de almacenamiento para una columna, por ejemplo, glicerol. En esta invención se describen una variedad de disolventes miscibles en agua, incluido el glicerol, en relación con el almacenamiento de puntas en un estado húmedo. Por tanto, otra ventaja de muchos de estos disolventes es que se retendrán en el lecho mejor que el agua y será menos probable que sean expulsados por la presión de descarga resultante de la fijación de la columna a una bomba.

Mantenimiento de columnas de punta de pipeta y perlas de polímero en un estado húmedo

La invención proporciona procedimientos para almacenar columnas de punta de pipeta en un estado húmedo, es decir, con un "lecho húmedo" de perlas de resina de gel. Esto es útil porque permite preparar las columnas y a continuación almacenarlas durante períodos prolongados antes del uso real sin que se seque el lecho. Por ejemplo, permite la preparación de columnas de punta de pipeta húmedas que se pueden rellenar y transportar al usuario final, y permite que el usuario final almacene las columnas durante un período de tiempo antes de su uso. En muchos casos, si se permitiera que el lecho se secara, esto afectaría negativamente a la función de la columna, o requeriría una etapa adicional de rehidratación de la columna antes de su uso, que requiere mucho tiempo.

El mantenimiento de un estado húmedo puede ser particularmente crítico cuando el volumen del lecho rellenado de perlas de resina de gel es pequeño, por ejemplo, en un intervalo que tiene un límite inferior de 0,1 pl, 1 pl, 5 pl, 10 pl o 20 pl y un límite superior de 5 pl, l0 pl, 2o pl, 50 pl, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 500 pl, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml o 50 ml. Los intervalos típicos incluirían de 0,1 a 100 pl, de 1 a 100 pl, de 5 a pl, de 10 a 100 pl, de 1 a 20 pl, de 1 a 10 pl, de 5 a 20 pl y de 5 a 10 pl.

La punta húmeda resulta de la producción de una punta que tiene un lecho rellenado de perlas de resina de gel donde al menos el 99 % del espacio intersticial está ocupado por un líquido, que es un disolvente miscible en agua. El líquido puede ser cualquier líquido que sea compatible con los medios, es decir, no debe degradar ni dañar de otro modo los medios ni afectar negativamente el relleno. Preferiblemente, es compatible con la depuración y/o procedimientos de extracción destinados a ser implementados con la columna. Por ejemplo, las cantidades traza del líquido o los componentes del líquido no deben interferir con la química de extracción en fase sólida si la columna está diseñada para usarse en una extracción en fase sólida. Los ejemplos de líquidos adecuados incluyen agua, varias soluciones acuosas y amortiguadores, y varios disolventes polares y no polares descritos en esta invención. El líquido puede estar presente en el momento en que se rellena la columna, por ejemplo, un disolvente en el que el medio de extracción se convierte en una suspensión, o puede introducirse en el lecho después del relleno del lecho.

El disolvente miscible en agua y es relativamente no volátil y/o tiene un punto de ebullición a temperatura ambiente en un intervalo que tiene un límite inferior de 100 °C, 110 °C, 120 °C, 130 °C, 140 °C, 150 °C, 160 °C, 170 °C, 180 °C, 190 °C, 200 °C o superior, y un límite superior de 150 °C, 160 °C, 170 °C, 180 °C, 190 °C, 200 °C, 220 °C, 250 °C, 300 ° C, o incluso superior. Los ejemplos ilustrativos incluirían hidrocarburos alcohólicos con un punto de ebullición superior a 100 °C, tales como dioles, trioles y polietilenglicoles (PEG) de n=2 para n=150 (PEG-2 a PEG-150), PEG-2 a PEG-20, 1,3-butanodiol y otros glicoles, particularmente glicerol y etilenglicol. El disolvente miscible en agua típicamente constituye un componente sustancial del líquido total en la columna, donde "un componente sustancial" se refiere a al menos 5 %, y preferiblemente al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o sustancialmente toda la extensión del líquido en la columna.

Una ventaja de estos disolventes no volátiles es que son mucho menos propensos a evaporarse que las soluciones acuosas típicas y los disolventes utilizados en los procedimientos de extracción. Por tanto, mantendrán el lecho en estado húmedo durante mucho más tiempo que los disolventes más volátiles. Por ejemplo, un espacio intersticial lleno de glicerol en muchos casos permanecerá húmedo durante días sin tomar ninguna medida adicional para mantener la humedad, mientras que el mismo espacio lleno de agua pronto se secará. Estos disolventes son particularmente adecuados para el transporte y almacenamiento de columnas de resina de tipo gel que tienen lechos de agarosa o sefarosa. Otras propiedades ventajosas de muchos de estos disolventes es que son viscosos, por lo que no se desplazan fácilmente de la columna debido a las vibraciones y movimientos del transporte, son resistentes a las bacterias, no penetran ni solvatan apreciablemente la agarosa, la sefaraosa y otros tipos de materiales de rellenado y estabilizan las proteínas. El glicerol en particular es un disolvente que presenta estas características. Obsérvese que cualquiera de estos disolventes se puede utilizar solo o en combinación con agua u otro disolvente, por ejemplo, se puede utilizar glicerol puro o una mezcla de glicerol y agua o amortiguador, tal como glicerol al 50 % o glicerol al 75 %.

Una ventaja del glicerol es que su presencia en pequeñas cantidades tiene efectos insignificantes en muchos procedimientos de extracción en fase sólida. Una columna de punta puede almacenarse en glicerol para evitar que se seque y a continuación usarse en un procedimiento de extracción sin necesidad de una etapa adicional para expulsar el glicerol. En cambio, una solución de muestra (típicamente un volumen mucho mayor que el volumen del lecho y, por ende, mucho mayor que el volumen de glicerol) se carga directamente en la columna aspirándola a través del lecho y en el espacio de cabeza como se describe en otra parte de esta invención. El glicerol se diluye con el gran exceso de solución de muestra y a continuación se expulsa de la columna junto con otros contaminantes no deseados durante las etapas de carga y lavado.

Obsérvese que los disolventes no volátiles, relativamente viscosos del tipo descrito anteriormente, particularmente glicerol y similares, son generalmente útiles para almacenar perlas de polímero, especialmente perlas de resina como se describe en esta invención, por ejemplo, perlas de agarosa y sefarosa y similares. Otros ejemplos de perlas adecuadas incluirían microesferas basadas en tecnología xMAP® (Luminex, Inc., Austin, TX). El almacenamiento de perlas de polímero como suspensión en una solución que comprende uno o más de estos disolventes puede ser ventajoso por varias razones, tales como impedir que las perlas se sequen, reducir la tendencia de las perlas a agregarse e inhibir el crecimiento microbiano. La solución puede ser un disolvente puro, por ejemplo, glicerol al 100 %, o una mezcla, tal como una solución acuosa que comprende algún porcentaje de glicerol. La solución también puede mantener la funcionalidad de la perla de resina manteniendo una hidratación adecuada y protegiendo cualquier grupo de unión por afinidad fijado a la perla, particularmente grupos funcionales relativamente frágiles, tales como ciertas biomoléculas, por ejemplo, proteínas.

La suspensión de perlas de gel podría mantenerse en una matriz de polímero o fibrillas. Las fibrillas pueden ser celulosa, polímeros o cualquier material que pueda unirse en un formato similar a una lámina mientras contiene las partículas de gel hinchadas. La tecnología Empore® desarrollada por 3M (St. Paul, Minnesota) es una tecnología de unión de fibrillas donde se utiliza polímero para contener una variedad de resinas y partículas (véanse las patentes de EE. UU. 5.738.790, 5.639.372 y 5.635.060). En esta tecnología aproximadamente el 90 % de la lámina contenida en este formato son partículas y el 10 % son fibrillas. Los geles hinchados con agua se podrían recubrir con un líquido miscible en agua y de alto punto de ebullición para impedir el secado de las partículas de gel hinchadas dentro de la lámina.

Este procedimiento de almacenamiento de suspensiones de perlas de polímero es particularmente valioso para almacenar suspensiones de pequeño volumen, por ejemplo, volúmenes que caen dentro de intervalos que tienen límites inferiores de 0,1 pl, 0,5 pl, 1 pl, 5 pl, 10 pl, 20 pl, 50 pl, 100 pl, 250 pl, 500 pl o 1000 pl y límites superiores de 1 pl, 5 pl, 10 pl, 20 pl, 50 pl, 100 pl, 250 pl, 500 pl, 1 ml, 5 ml 10 ml, 20 ml, o 50 ml. Los intervalos ilustrativos típicos incluirían de 0,1 a 100 pl, de 0,5 a 100 pl, de 1 a 100 pl, de 5 a 100 pl, de 0,1 a 50 pl, de 0,5 a 50 pl, de 1 a 50 pl, de 5 a 50 pl, de 0,1 a 20 pl, de 0,5 a 20 pl, de 1 a 20 pl, de 5 a 20 pl, de 0,1 a 10 pl, de 0,5 a 10 pl, de 1 a 10 pl, de 0,1 a 5 pl, de 0,5 a 5 pl, de 1 a 5 pl y de 0,1 a 1 pl.

Los factores que pueden afectar la velocidad a la que se seca una columna incluyen la temperatura ambiente, la presión del aire y la humedad. Normalmente, las columnas se almacenan y transportan a presión atmosférica, por lo que este no suele ser un factor que se pueda ajustar. Sin embargo, es recomendable almacenar las columnas a temperaturas más bajas y con mayor humedad para ralentizar el procedimiento de secado. Normalmente, las columnas se almacenan en condiciones de temperatura ambiente. La temperatura ambiente es normalmente de aproximadamente 25 °C, por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y 30 °C. En algunos casos, es preferible almacenar las columnas de punta de pipeta a una temperatura relativamente baja, por ejemplo, entre 0 °C y 30 °C, entre 0 °C y 25 °C, entre 0 °C y 20 °C, entre 0 °C y 15 °C, entre 0 °C y 10 °C, o entre 0 °C y 4 °C. En muchos casos, las puntas de la invención se pueden almacenar a temperaturas incluso más bajas, particularmente si la punta se rellena con un líquido que tiene un punto de congelación más bajo que el agua, por ejemplo, glicerol.

En una realización, la invención proporciona una columna de punta de pipeta que comprende un lecho de medio, cuyo espacio intersticial ha estado sustancialmente lleno de líquido durante al menos 24 horas, durante al menos 48 horas, durante al menos 5 días, durante al menos 30 días, durante al menos 60 días, durante al menos 90 días, durante al menos 6 meses o durante al menos un año. "Sustancialmente lleno de líquido" se refiere a al menos 25 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o sustancialmente todo el espacio intersticial que está ocupado por un líquido, sin que se añada ningún líquido adicional a la columna durante todo el período de tiempo. Por ejemplo, esto incluiría una columna que ha sido rellenada, transportada y almacenada durante una cantidad de tiempo considerable después de la producción.

En una realización, la columna de punta de pipeta de la invención se ha rellenado en un recipiente que está sustancialmente lleno de líquido, donde el recipiente mantiene el líquido en la punta de pipeta hasta el punto de que menos del 10 % del líquido se pierde (o se perderá) cuando la punta se almacena en estas condiciones durante al menos 24 horas, durante al menos 48 horas, durante al menos 5 días, durante al menos 30 días, durante al menos 60 días, durante al menos 90 días, durante al menos 6 meses, o durante al menos un año.

En otra realización, la invención proporciona una columna de punta de pipeta que comprende un lecho de medio, cuyo espacio intersticial está sustancialmente lleno de líquido, donde el líquido se escapa (por ejemplo, por evaporación o drenaje) a una velocidad tal que menos del 10 % del líquido se perderá cuando la columna se almacene a temperatura ambiente durante 24 horas, 48 horas, 5 días, 30 días, 60 días, 90 días, seis meses o incluso un año.

En muchos casos, las columnas de punta de pipeta húmedas descritas anteriormente (por ejemplo, la columna que ha estado húmeda durante un período de tiempo prolongado y/o la columna que pierde líquido a una velocidad muy lenta) se rellena, por ejemplo, en una gradilla para puntas de pipeta. La gradilla es un medio conveniente para distribuir las columnas de punta de pipeta y también para transportarlas y almacenarlas. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de formatos; las gradillas que contienen 96 puntas son comunes y se pueden usar junto con placas multipocillo, pipetas multicanal y sistemas robóticos de manipulación de líquidos.

En diversas realizaciones, la invención proporciona procedimientos para mantener la humedad de las columnas de punta de pipeta. Un procedimiento se ilustra en la Fig. 23. La columna de punta de pipeta 340 tiene un lecho rellenado de medio 346 colocado entre la frita superior 342 y la frita inferior 344. El lecho rellenado es húmedo, es decir, el espacio intersticial está sustancialmente ocupado por un disolvente, en este caso un amortiguador acuoso. Con el fin de inhibir el secado del lecho, se coloca una cantidad del mismo amortiguador acuoso 350 (denominado líquido de almacenamiento) en el espacio de cabeza 348. La punta se almacena con la frita inferior hacia abajo, por lo que la gravedad mantiene la cantidad de amortiguador en el extremo inferior del espacio de cabeza y en contacto con la frita superior. Normalmente, una pequeña cantidad de amortiguador en el espacio de cabeza tendrá poca tendencia a fluir a través del lecho y fuera de la columna debido a la resistencia al flujo generada por el lecho. El amortiguador en contacto con la frita superior sirve para mantener la humedad del lecho y las fritas.

En algunas realizaciones, no según la invención, la columna de punta de pipeta está tapada en el extremo inferior 344 y/o el extremo superior 352. Este tapado sirve para restringir la evaporación (es decir, desecación) del líquido del lecho y mantener por tanto la columna húmeda. La tapa puede ser cualquier sustrato sólido que cubra el extremo y selle total o parcialmente. Los ejemplos serían tapas formadas para encajar en el extremo, tales como tapas de plástico o goma. La tapa podría ser una película o lámina, tal como una película hecha de metal, plástico, material polimérico o similar. Una película o lámina es particularmente adecuada para tapar múltiples tapas. Por ejemplo, una pluralidad de puntas en una gradilla de puntas puede taparse en sus extremos superiores con una lámina de papel de aluminio o película plástica que se coloca sobre y en contacto con las partes superiores de las puntas. La tapa se puede fijar a la abertura por presión, o por algún adhesivo, o cualquier medio que resulte en un sello total o parcial suficiente para inhibir la evaporación del líquido de la columna. Por ejemplo, se puede pegar una sola lámina de papel de aluminio o plástico a la parte superior de una pluralidad de puntas dispuestas en una gradilla. Preferiblemente, el adhesivo es uno que no se adhiera con demasiada fuerza (es decir, la tapa se adhiere a la columna de manera que se pueda quitar), de modo que las puntas se puedan destapar antes de su uso y que el adhesivo no deje un residuo en la punta que interferiría con un procedimiento de extracción. Alternativamente, se puede mantener una lámina en contacto con los extremos superiores de las puntas mediante presión. Por ejemplo, se puede disponer una lámina de sellado sobre los extremos superiores de las puntas en una gradilla y situar una cubierta dura en la parte superior y en contacto con la lámina, presionando así la lámina contra las partes superiores de las puntas para formar un sello total o parcial.

El tapado de extremo es particularmente efectivo cuando se usa en combinación con un líquido de almacenamiento en el espacio de cabeza, como se describe anteriormente. El tapado de uno o ambos extremos limita la pérdida de líquido de almacenamiento, y el líquido de almacenamiento mantiene la humedad del lecho durante períodos prolongados de tiempo.

Otro procedimiento para mantener la humedad de la columna es rellenar la punta de columna en presencia de un antidesecante. Un "antidesecante" es cualquier material capaz de hidratar o humedecer un ambiente. Un antidesecante útil es la poliacrilamida hidratada. Por ejemplo, se puede usar un recipiente de punta de pipeta cerrado (una gradilla de puntas) para el almacenamiento de puntas, donde el antidesecante se sitúa en el recipiente y proporciona un entorno húmedo que resiste la desecación de las columnas de punta en el recipiente. En algunas realizaciones, la propia tapa comprende un antidesecante. Por ejemplo, en una realización preferida de la invención, se usa como tapa una bolsa porosa que contiene poliacrilamida hidratada. La bolsa tapa las columnas de punta siendo presionada contra los extremos superior o inferior abiertos de las puntas. Por tanto, la bolsa no solo inhibe la pérdida de líquido de la columna al sellar el espacio de cabeza y/o lecho del ambiente externo, también proporciona un ambiente muy húmedo.

Habiendo descrito ahora en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos y preparaciones se proporcionan para permitir que los expertos en la materia entiendan más claramente y pongan en práctica la presente invención.

Ejemplo 1

Preparación de un cuerpo de columna de extracción a partir de puntas de pipeta

Se usaron dos puntas de pipeta de polipropileno de 1000 pl del diseño que se muestra en la Fig. 6 (VWR, Brisbane, CA, PN 53508-987) para construir una columna de extracción. En este ejemplo, se construyeron dos columnas de extracción: un volumen de lecho de 10 pl y un volumen de lecho de 20 pl. Para construir una columna, se fabricaron varios componentes insertando las puntas en varias herramientas de corte de aluminio personalizadas y cortando el exceso de material que sobresalía de la herramienta con una hoja de afeitar para obtener longitudes y diámetros de columna específicos.

Haciendo referencia a la Fig. 7, se hizo el primer corte 92 en la punta de un tubo de pipeta 90 para formar un orificio 94 de 1,25 mm de diámetro interior en el cuerpo de columna inferior, y se hizo un segundo corte 96 para formar un segmento 98 del cuerpo de columna inferior que tiene una longitud de 15,0 mm.

Con referencia a la Fig. 8, se hizo un corte 102 en la punta de pipeta separada 100 para formar el cuerpo de columna superior 104. Para fabricar una columna con un volumen de lecho de 10 pl, el corte 102 se hizo para proporcionar una punta 106 con un diámetro exterior de 2,09 mm, de modo que cuando el cuerpo superior se insertaba en el cuerpo inferior, la altura de la columna del lecho de medio en fase sólida 114 (Fig. 10) fue de 4,5 mm. Para fabricar una columna con un volumen de lecho de 20 pl, el corte 102 se hizo para proporcionar una punta con un diámetro exterior de 2,55 mm, de modo que cuando el cuerpo superior se insertaba en el cuerpo inferior, la altura de la columna del lecho de medio en fase sólida 114 (Fig. 10) fue de 7,0 mm.

Con referencia a la Fig. 9, un material de malla de poliéster con un tamaño de poro de 43 pm de Spectra/Mesh®(Spectrum Labs, Ranch Domínguez, CA, PN 145837) se cortó en discos con una herramienta de corte circular (Pace Punches, Inc., Irvine, CA) y se fijó a los extremos 106 y 108 de los cuerpos de columna superior y columna inferior para formar los tamices de membrana 110 y 112. Los tamices de membrana se fijaron usando pegamento de cianoacrilato PLASTIX® (Loctite, Inc., Avon, OH). El pegamento se aplicó al cuerpo de polipropileno y a continuación se presionó sobre el material de tamiz de membrana. Usando una hoja de afeitar, se eliminó el exceso de material de malla alrededor del perímetro exterior de cada extremo del cuerpo de columna.

Con referencia a la Fig. 10, el cuerpo de columna superior 104 se inserta en la parte superior del segmento de cuerpo de columna inferior 98 y se presiona hacia abajo para compactar el lecho de medio en fase sólida 114 para eliminar el exceso de volumen muerto por encima de la parte superior del lecho.

Ejemplo 2

Preparación de las columnas de extracción de Proteína G de SEPHAROSE™ y MEP HYPERCEL™

Haciendo referencia a la Fig. 9, una suspensión de Proteína G de SEPHAROSE™ 4 Fast Flow, tamaño de partícula de 45-165 pm, (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, PN 17-0618-01) en agua/etanol se preparó y se pipeteó una cantidad apropiada de material 114 en el cuerpo de columna inferior 98.

Haciendo referencia a la Fig. 10, el cuerpo de columna superior 104 se empujó hacia el cuerpo de columna inferior 98 para que no quedara ningún espacio muerto en la parte superior del lecho 114, es decir, en la parte superior del lecho de columna. Se tuvo cuidado de forma que se formara un sello entre los cuerpos de columna superior e inferior 104 y 98 mientras se conservaba la integridad de la unión del tamiz de membrana a los cuerpos de columna.

Se prepararon varias puntas con volúmenes de lecho de 10 pl y 20 pl. Se prepararon varias columnas de extracción MEP (mercapto-etil-piridina) HYPERCEL™ (Ciphergen, Fremont, CA, PN 12035-010) utilizando el mismo procedimiento. La resina MEP HyperCel™ es un sorbente, con un tamaño de partícula de 80-100 pm, diseñado para la captura y purificación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Las columnas de extracción se almacenaron con una solución acuosa de azida sódica al 0,01 % en un refrigerador antes de su uso.

Ejemplo 3

Configuración de conexión recta

Este ejemplo describe una realización donde el cuerpo de columna se construye acoplando miembros tubulares superiores y tamices de membrana en una configuración recta.

Con referencia a la Fig. 11, la columna consiste en un miembro tubular superior 120, un miembro tubular inferior 122, un tamiz de membrana superior 124, un tamiz de membrana inferior 126 y un círculo tubular inferior 134 para mantener el tamiz de membrana inferior en su lugar. El tamiz de membrana superior se mantiene en su lugar mediante los miembros tubulares superior e inferior. El tamiz de membrana superior, el tamiz de membrana inferior y la superficie de canal 130 del miembro tubular inferior definen una cámara de medio de extracción 128, que contiene un lecho de medio de extracción (es decir, material de relleno). Los miembros tubulares representados en la Fig. 11 tienen forma troncocónica, pero en realizaciones relacionadas podrían adoptar otras formas, por ejemplo, cilíndricas.

Para construir una columna, se fabrican varios componentes formando miembros moldeados por inyección de polipropileno o miembros mecanizados de polímero PEEK para dar longitudes y diámetros de columna específicos y extremos que puedan encajar entre sí, es decir, acoplarse entre sí. La configuración de las porciones macho y hembra del cuerpo de columna tiene una forma diferente dependiendo del procedimiento usado para ensamblar las partes y el procedimiento usado para mantener las partes juntas.

Los componentes están pegados o soldados. Alternativamente, se encajan juntos. En el caso de encajar las piezas en conjunto, la porción hembra contiene un labio y la porción macho contiene una arista que sujetará y sellará las piezas una vez ensambladas. El tamiz de membrana se corta automáticamente durante el procedimiento de ensamblaje o se recorta después del ensamblaje.

Ejemplo 4

Configuración de tapa de extremo y anillo de retención

Este ejemplo describe una realización donde se utiliza una configuración de tapa de extremo y anillo de retención para retener los tamices de membrana que contienen un lecho de 20 pl de material de relleno de columna. La realización se representa en la Fig. 12.

Haciendo referencia a la figura, la punta de pipeta 140 (VWR, Brisbane, CA, PN 53508-987) se cortó con una hoja de afeitar para tener un extremo inferior plano y recto 142 con las caras lisas, de modo que a continuación se pueda realizar un ajuste a presión. Se mecanizó una tapa de extremo 144 a partir de un tubo de polímero PEEK para contener el tamiz de membrana inferior 146.

Se cortaron dos tamices de diferentes diámetros de malla de poliéster (Spectrum Labs, Ranch Dominguez, CA, PN 145836) con una herramienta de corte circular (Pace Punches, Inc., Irving, CA), una para el tamiz de membrana superior 148 y la otra para el tamiz de membrana inferior 146. El tamiz de membrana inferior se situó en la tapa de extremo y se presionó sobre el extremo de la punta de pipeta cortada.

Se formó un lecho de perlas con un volumen de 20 pl pipeteando 40 pl de una suspensión al 50 % de resina de proteína G de agarosa en el cuerpo de columna.

Se usaron dos anillos de retención para mantener el tamiz de membrana en su lugar sobre el lecho de perlas. Los anillos de retención se prepararon tomando una tubería de polipropileno de 1/8 de pulgada de diámetro y cortando círculos delgados de la tubería con una hoja de afeitar. Se situó un primer anillo de retención 152 en la columna y se empujó hacia abajo hasta la parte superior del lecho con una varilla de metal de diámetro similar. El tamiz de membrana 148 se situó encima del primer anillo de retención y a continuación se empujó hacia abajo un segundo anillo de retención 154 para "intercalar" el tamiz de membrana mientras que al mismo tiempo empujaba toda la configuración de tamiz hacia la parte superior del lecho y aseguraba que todo el volumen muerto fuese eliminado. Las dos membranas definen la parte superior e inferior de la cámara de medio de extracción 150, donde se coloca el lecho de perlas. La membrana es flexible y se forma naturalmente en la parte superior del lecho.

La columna se conectó a una pipeta de 1000 pl (Gilson, Middleton, WI, P-1000 PipetteMan) y se bombeó agua a través del lecho y se distribuyó desde el lecho. La columna tenía una baja resistencia al flujo para el disolvente de agua.

Ejemplo 5

Producción de una columna de extracción de microlecho

Para fabricar un lecho de 0,1 pl, se suelda una membrana de poliéster en un extremo de un tubo de polipropileno de 300 mm de diámetro interior y 4 mm de largo. El lecho se llena con un material de resina de gel hasta una altura de 0,25 mm. Se empuja un pequeño círculo o taco de material de frita de membrana en el extremo de la columna. A continuación, se inserta un capilar de sílice fundido de 5 cm de largo (320 pm de, 200 pm di) en la parte superior del tubo de polipropileno y se empuja hacia abajo hasta la parte superior del lecho de columna. Se usa un accesorio para fijar una bomba de microjeringa a la columna, lo que permite introducir y extraer la solución del lecho, para su uso en una extracción a microescala del tipo descrito en esta invención.

Se pueden construir columnas con varios volúmenes de lecho pequeños usando diferentes puntas de pipeta como materiales de partida. Por ejemplo, una columna de lecho de 0,5 pl (0,4 mm de diámetro promedio y 0,4 mm de longitud se puede construir usando puntas de pipeta de 10 pl (Finnitip 10 de Thermolab Systems, Cat. N.° 9400300). El tamiz de membrana se puede fijar mediante encolado, soldadura y fijación mecánica. El volumen del lecho se puede controlar más fácilmente pegando el tamiz de membrana. Se fabricaron otras columnas con tamaños de lechos de 1,2, 2,2, 3,2 y 5,0 pl de forma similar a partir de puntas de pipeta P-235 disponibles en Perkin Elmer (Cat. N.° 69000067).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de mantenimiento de una columna de punta de pipeta en un estado húmedo, que comprende las etapas que consisten en:

a) proporcionar una columna de punta de pipeta, donde la columna comprende un lecho rellenado de perlas de resina de gel, y donde al menos el 99 % del espacio intersticial está ocupado por un disolvente miscible en agua con un punto de ebullición superior a 100 °C;

donde la punta de pipeta comprende:

i) un cuerpo de columna de punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna;

ii) una frita inferior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo;

iii) una frita superior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna definen una cámara de medio;

iv) el lecho rellenado de perlas de resina de gel colocado en el interior de la cámara de medio,

b) almacenar la columna de modo que esté abierta a la temperatura ambiente, a la presión de aire y a la humedad.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde dicho disolvente miscible en agua es glicerol o etilenglicol.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde las perlas de resina de gel tienen un grupo de unión por afinidad.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, donde las perlas de gel de resina son perlas de agarosa o sefarosa.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, donde el grupo de unión por afinidad es una proteína.

6. Una columna de punta de pipeta que comprende:

un lecho rellenado de perlas de resina de gel, donde al menos el 99 % del espacio intersticial está ocupado por un disolvente miscible en agua con un punto de ebullición superior a 100 °C;

donde la columna de punta de pipeta comprende:

i) un cuerpo de columna de punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna;

ii) una frita inferior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo;

iii) una frita superior unida al canal abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna definen una cámara de medio;

iv) el lecho rellenado de perlas de resina de gel colocado en el interior de la cámara de medio,

y donde la columna está abierta a la temperatura ambiente, a la presión de aire y a la humedad.

7. La columna de punta de pipeta de la reivindicación 6, donde dicho disolvente miscible en agua es glicerol o etilenglicol.

8. La columna de punta de pipeta de la reivindicación 6, donde las perlas de resina de gel tienen un grupo de unión por afinidad fijado a las perlas.

9. La columna de punta de pipeta de la reivindicación 6, donde las perlas de gel de resina son perlas de agarosa o sefarosa.

10. La columna de punta de pipeta de la reivindicación 8, donde el grupo de unión por afinidad es una proteína.