ES2930470T3 - Método y dispositivo para la preparación de muestras - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona columnas de extracción para la purificación de un analito (p. ej., una macromolécula biológica, como un péptido, proteína o ácido nucleico) a partir de una solución de muestra, así como métodos para fabricar y usar tales columnas. Las columnas normalmente incluyen un lecho de medios de extracción colocados en la columna entre dos fritas. En algunas realizaciones, la invención proporciona columnas que tienen volúmenes de lecho bajos. En algunas realizaciones, la invención proporciona columnas caracterizadas por una contrapresión baja. En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos caracterizados por la elución del analito en un pequeño volumen de líquido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método y dispositivo para la preparación de muestras
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un método de extracción de un analito de una solución. Los analitos pueden incluir biomoléculas, particularmente macromoléculas biológicas, tales como proteínas y péptidos. La invención es particularmente útil en proteómica, para el análisis con tecnologías analíticas que emplean biochips, espectrometría de masas y otra instrumentación.
Antecedentes de la invención
La extracción en fase sólida es una tecnología poderosa para purificar y concentrar analitos, incluyendo las biomoléculas. Por ejemplo, es una de las principales herramientas utilizadas para preparar muestras de proteínas antes del análisis mediante una variedad de técnicas analíticas, incluyendo la espectrometría de masas, la resonancia de plasmones superficiales, la resonancia magnética nuclear, la cristalografía de rayos X y similares. Con estas técnicas, normalmente solo se requiere un pequeño volumen de muestra. Sin embargo, a menudo es fundamental que los contaminantes que interfieren se eliminen de la muestra y que el analito de interés esté presente en una concentración mínima. Por tanto, se necesitan métodos de preparación de muestras que permitan la purificación y concentración de muestras de pequeño volumen con una pérdida mínima de muestras.
La invención del asunto se refiere a un método para extraer un analito de una solución de muestra usando un lecho relleno de medios de extracción, por ejemplo, un lecho de perlas tipo gel derivatizadas con un grupo que tiene afinidad por un analito de interés. Estos métodos, y los dispositivos y reactivos relacionados, serán de particular interés para los científicos de la vida, ya que proporcionan una poderosa tecnología para purificar, concentrar y analizar biomoléculas y otros analitos de interés. Sin embargo, los métodos, dispositivos y reactivos no se limitan al uso en las ciencias biológicas y pueden encontrar una amplia aplicación en una variedad de contextos preparativos y analíticos.
Resumen de la invención
La presente invención es un método para extraer un analito de una solución que comprende las etapas de
a. Proporcionar una columna de extracción (2) que comprende un cuerpo de columna que comprende una punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre el extremo superior e inferior del cuerpo de la columna; una frita inferior (14) unida al cuerpo de la columna y que se extiende a través del canal abierto; una frita superior (10) unida a la columna y que se extiende a través del canal abierto entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de la columna (6), donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de la columna definen una cámara de medios de extracción (16); y un lecho de medios de extracción colocado dentro de la cámara de medios de extracción (16), en donde los medios de extracción comprenden perlas de resina de gel de agarosa, sefarosa o celulosa,
b. Hacer pasar una muestra que contiene un analito a través de la columna de extracción y
c. Eluir el analito pasando un solvente de desorción a través de la columna de extracción,
caracterizado por que el lecho de medios de extracción en la columna de extracción tiene un volumen en el rango entre 0,1 y 100 pL;
por que dicha columna, que proporciona una relación aproximadamente lineal entre la contrapresión y el caudal, se ha adaptado para proporcionar una contrapresión en el rango de aproximadamente 3,45 kPa (0,5 psi) a 13,79 kPa (2 psi) cuando se hace pasar una solución acuosa a través de la columna a un caudal de 1 mL/min; y
por que la solución de muestra en la etapa b. se hace pasar hacia atrás y hacia delante a través del lecho de medios de extracción más de una vez.
La invención usa columnas de separación, muchas de las cuales usan lechos relativamente pequeños de medios de extracción.
La presente invención utiliza una columna de procesamiento de muestras que comprende un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior, unida y que se extiende a través del extremo inferior abierto; y un lecho de medios de extracción, colocado dentro del canal abierto y en contacto con la frita inferior. La columna comprende perlas de resina de gel de agarosa, sefarosa o celulosa.
El lecho de medios de extracción tiene un volumen de entre aproximadamente 0,1 pL y 100 pL.
En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior tiene/tienen un volumen de poro igual a 10 % o inferior al volumen intersticial del lecho de medios de extracción.
En determinadas realizaciones de la invención, la frita inferior y/o la frita superior es/son un tamiz de membrana, por ejemplo, una membrana tejida de nailon o poliéster.
En ciertas realizaciones del método, el solvente de desorción se hace pasar, aspira y descarga de la columna más de una vez, es decir, se emplea una pluralidad de ciclos de entrada/salida para hacer pasar el solvente hacia atrás y hacia delante a través del lecho más de una vez.
En ciertas realizaciones del método, el analito es una proteína.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa un cuerpo de columna de extracción construido a partir de una punta de pipeta cónica. La figura 2 es una vista ampliada de la columna de extracción de la figura 1.
La figura 3 representa un ejemplo de un aparato de extracción multiplexada.
La figura 4 es un gel de SDS-PAGE al que se hace referencia en el Ejemplo 2.
La figura 5 representa una columna de puntas de pipeta fijada a un pipeteador y señala el espacio libre superior. La figura 6 representa gráficamente la presión de descarga de una columna de puntas de pipeta, el volumen de cámara de una jeringa fijada a la columna de puntas de pipeta y el volumen de líquido en la columna, todo en función del tiempo, durante un proceso de extracción típico.
La figura 7 representa la columna de extracción que adopta la forma de una punta de pipeta.
La figura 8 representa una realización preferida de la invención de la realización general representada en la figura 7.
La figura 9 representa una columna de puntas de pipeta fijada a un aparato para determinar la contrapresión de la columna.
La figura 10 representa un método de determinación de la contrapresión de una frita de membrana como se describe en el Ejemplo 3.
La figura 11 representa una frita porosa, cuya contrapresión se determinará como se describe en el Ejemplo 3. Las figuras 12 a 15 representan un método de colocación de columnas de puntas de pipeta en un proceso de extracción multiplexada.
La figura 16 representa un método que no está de acuerdo con la invención, para desalinizar una muestra que contiene un analito proteico de interés.
Descripción de realizaciones específicas de la invención
Esta invención se refiere al campo de la extracción de analitos de una solución de muestra. Los analitos pueden incluir biomoléculas, particularmente macromoléculas biológicas, tales como proteínas y péptidos, polinucleótidos, lípidos y polisacáridos. El método de esta invención es particularmente útil en proteómica, para la preparación y análisis de muestras con tecnologías analíticas que emplean biochips, espectrometría de masas y otra instrumentación. El proceso de extracción resulta, en general, en el enriquecimiento, concentración, y/o purificación de un analito o analitos de interés.
En la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 10/620,155, se describen métodos y dispositivos para realizar extracciones de baja columna muerta. La presente memoria descriptiva, entre otras cosas, amplía los conceptos descritos en esa solicitud.
El documento US 6008040 A describe un método para extraer un analito usando un cuerpo de columna que comprende una punta de pipeta.
Antes de describir con más detalle, la presente invención se debe entender que esta invención no está limitada a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. Se debe entender también que la terminología utilizada en el presente documento con el propósito de describir únicamente realizaciones particulares no pretende ser limitativa. Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a una columna de extracción que contiene una frita de membrana incluiría una columna de extracción que contiene dos o más fritas de membrana.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entienden normalmente los expertos en la materia a la que pertenece la invención. En el presente documento se describen ejemplos específicos de materiales y métodos apropiados. El alcance de la invención se encuentra definido en las reivindicaciones adjuntas.
Definiciones
Para describir y reivindicar la presente invención se utilizará la siguiente terminología, de acuerdo con las definiciones que se indican a continuación.
La expresión "volumen de lecho", como se usa en esta invención, se define como el volumen de un lecho de medios de extracción en una columna de extracción. Dependiendo de la densidad de relleno del lecho, el volumen de los medios de extracción en el lecho de columna suele ser de un tercio a dos tercios del volumen total del lecho; los lechos bien rellenos tienen menos espacio entre las perlas y, por ende, en general, tienen volúmenes intersticiales más bajos.
La expresión "volumen intersticial" del lecho se refiere al volumen del lecho de medios de extracción que es accesible para el solvente, por ejemplo, soluciones acuosas de muestra, soluciones de lavado y solventes de desorción. Por ejemplo, en el caso de que los medios de extracción sea una perla de cromatografía (por ejemplo, agarosa o sefarosa), el volumen intersticial del lecho constituye el volumen accesible para el solvente entre las perlas, así como cualquier región interna accesible para el solvente de la perla, por ejemplo, poros accesibles para el solvente. El volumen intersticial del lecho representa el volumen mínimo de líquido requerido para saturar el lecho de la columna.
La expresión "volumen muerto", como se usa en esta invención con respecto a una columna, se define como el volumen intersticial del lecho de extracción, los tubos, la membrana o las fritas y los conductos en una columna. Algunas realizaciones preferidas de la invención implican columnas de bajo volumen muerto, como se describe con más detalle en la Solicitud de patente de EE.UU. No. 10/620,155.
La expresión "volumen de elución", como se usa en esta invención, se define como el volumen de líquido de desorción o elución en el que se desorben y recogen los analitos. Las expresiones "solvente de desorción", "líquido de elución" y similares se usan en esta invención de forma intercambiable.
La expresión "factor de enriquecimiento", como se usa en esta invención, se define como la relación del volumen de muestra dividido por el volumen de elución, asumiendo que no hay contribución de líquido proveniente del volumen muerto. En la medida en que el volumen muerto diluya los analitos o impida la adsorción completa, se reduce el factor de enriquecimiento.
Las expresiones "columna de extracción" y "punta de extracción", como se usan en esta invención, se definen como un dispositivo de columna usado en combinación con una bomba, conteniendo el dispositivo de columna un lecho de material de extracción en fase sólida, es decir, medios de extracción.
El término "frita", como se usa en esta invención, se define como material poroso para mantener los medios de extracción en su lugar en una columna. Una cámara de medios está definida normalmente por fritas superior e inferior colocadas en una columna de extracción. En realizaciones preferidas de la invención, la frita es un filtro delgado de bajo volumen de poro, por ejemplo, un tamiz de membrana.
La expresión "cuerpo de columna inferior", como se usa en esta invención, se define como el lecho de columna y el tamiz de membrana inferior de una columna.
La expresión "tamiz de membrana", como se usa en esta invención, se define como una tela o tamiz tejido o no tejido para mantener el relleno de la columna en su lugar en el lecho de columna, teniendo las membranas un bajo volumen muerto. Las membranas tienen una resistencia suficiente para resistir el relleno y el uso del lecho de la columna y una porosidad suficiente para permitir el paso de líquidos a través del lecho de la columna. La membrana es lo suficientemente delgada para que se pueda sellar alrededor del perímetro o de la circunferencia del tamiz de membrana de modo que los líquidos fluyan a través del tamiz.
La expresión "volumen de muestra", como se usa en esta invención, se define como el volumen del líquido de la solución de muestra original a partir de la cual se separan o purifican los analitos.
La expresión "cuerpo de columna superior", como se usa en esta invención, se define como la cámara y el tamiz de membrana superior de una columna.
El término "biomolécula", como se usa en esta invención, se refiere a una biomolécula derivada de un sistema biológico. El término incluye macromoléculas biológicas, tales como proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.
Columnas de extracción
En la presente invención, se pueden emplear técnicas químicas, biológicas y analíticas convencionales dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Chromatography, 5a edición, PARTE A: FUNDAMENTALS AND TECHNIQUES, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York (1992); ADVANCED CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROMIGRATION METHODS IN BIOSCIENCES, editor: Z. Deyl, Elsevier Science BV, Ámsterdam, Países Bajos, (1998); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole y Salwa K. Poole, y Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, (1991).
En la presente invención, el lecho relleno de medios de extracción está contenido en una columna, por ejemplo, una columna de bajo volumen muerto. En el presente documento se presentan ejemplos no limitativos de columnas adecuadas, particularmente columnas de bajo volumen muerto. Debe entenderse que la presente invención no debe ser interpretada como limitada al uso de lechos de extracción en columnas de bajo volumen muerto.
Cuerpo de columna
El cuerpo de columna es un tubo que tiene dos extremos abiertos conectados por un canal abierto, a veces denominado conducto pasante. De acuerdo con la invención, el cuerpo de columna adopta la forma de una punta de pipeta. El extremo de la punta en donde está colocado el lecho de medios de extracción puede adoptar cualquier número de geometrías, por ejemplo, puede ser cónico o cilíndrico. En algunos casos, un canal cilíndrico de radio relativamente constante puede ser preferible a una punta cónica, por una variedad de razones, por ejemplo, la solución fluye a través del lecho a una velocidad uniforme, en lugar de variar en función de un diámetro de canal variable.
En algunas realizaciones, uno de los extremos abiertos de la columna, a veces denominado en esta invención extremo superior abierto de la columna, está adaptado para su fijación a una bomba, ya sea directa o indirectamente. En algunas realizaciones de la invención, el extremo abierto superior está fijado operativamente a una bomba, por lo que la bomba se puede usar para aspirar (es decir, extraer) un fluido en la columna de extracción a través del extremo inferior abierto de la columna y, opcionalmente, para descargar (es decir, expulsar) fluido a través del extremo inferior abierto de la columna. Por lo tanto, es una característica de ciertas realizaciones de la presente invención que el fluido entre y salga de la columna de extracción a través del mismo extremo abierto de la columna, normalmente el extremo inferior abierto. Esto está en contradicción con el funcionamiento de algunas columnas de extracción, en las que el fluido entra en la columna por un extremo abierto y sale por el otro después de atravesar medios de extracción, es decir, similar a la cromatografía en columna convencional. El fluido puede ser un líquido, tal como una solución de muestra, una solución de lavado o un solvente de desorción. El fluido también puede ser un gas, por ejemplo, aire, utilizado para expulsar líquido de la columna de extracción.
En otras realizaciones de la presente invención, el fluido entra en la columna por un extremo y sale por el otro. En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos de extracción que se refieren a un enfoque híbrido; es decir, uno o más fluidos entran en la columna por un extremo y salen por el otro, y uno o más fluidos entran y salen de la columna por el mismo extremo abierto de la columna, por ejemplo, el extremo inferior. Así, por ejemplo, en algunos métodos la solución de muestra y/o la solución de lavado son introducidas por la parte superior de la columna y salen por el extremo inferior, mientras que la solución de desorción entra y sale por la abertura inferior de la columna. La aspiración y descarga de la solución a través del mismo extremo de la columna puede resultar particularmente ventajosa en los procedimientos diseñados para minimizar la pérdida de muestras, especialmente cuando se utilizan pequeños volúmenes de líquido. Un buen ejemplo sería un procedimiento que emplea un volumen muy pequeño de solvente de desorción, por ejemplo, un procedimiento que implique un alto factor de enriquecimiento.
El cuerpo de columna puede estar compuesto por cualquier material que sea lo suficientemente no poroso como para que pueda retener fluido y que sea compatible con las soluciones, medios, bombas y analitos utilizados. Debe emplearse un material que no reaccione sustancialmente con las sustancias con las que entrará en contacto durante el uso de la columna de extracción, por ejemplo, las soluciones de muestra, el analito de interés, los medios de extracción y el solvente de desorción. Un amplio rango de materiales adecuados está disponible y es conocido por los expertos en la materia, y la elección es una cuestión de diseño. Diversos plásticos son materiales ideales para el cuerpo de columna, pero en algunas realizaciones de la invención, se podrían utilizar otros materiales tales como vidrio, cerámica o metales. Algunos ejemplos de materiales preferidos incluyen polisulfona, polipropileno, polietileno, tereftalato de polietileno, poliétersulfona, politetrafluoroetileno, acetato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, copolímero de acrilonitrilo y PVC, poliestireno, copolímero de poliestireno/acrilonitrilo, fluoruro de polivinilideno, vidrio, metal, sílice y combinaciones de los materiales enumerados anteriormente.
En los Ejemplos, se proporcionan algunos ejemplos específicos de cuerpos de columna adecuados.
Medios de extracción
Los medios de extracción utilizados en la columna son preferiblemente una forma de partículas insolubles en agua (por ejemplo, una perla porosa o no porosa) que tiene una afinidad por un analito de interés. Normalmente, el analito de interés es una proteína, un péptido o un ácido nucleico. Los procesos de extracción pueden ser de afinidad, exclusión por tamaños, fase inversa, fase normal, intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba o agentes de cromatografía de interacción hidrófila. En general, el término "medios de extracción" se usa en un sentido amplio para abarcar cualquier medio capaz de efectuar la separación, ya sea parcial o completa, de un analito de otro. Por tanto, las expresiones "columna de separación" y "columna de extracción" se pueden usar indistintamente. El término "analito" puede referirse a cualquier compuesto de interés, por ejemplo, que va a ser analizado o simplemente retirado de una solución.
El volumen del lecho de los medios de extracción usados en las columnas de extracción de la invención está en el rango de 0,1-100 pL. El bajo volumen del lecho contribuye a un bajo volumen intersticial del lecho, reduciendo el volumen muerto de la columna, facilitando así la recuperación del analito en un pequeño volumen de solvente de desorción.
Los bajos volúmenes de lecho empleados en determinadas realizaciones permiten el uso de cantidades relativamente pequeñas de medios de extracción, por ejemplo, perlas de tipo gel. Por ejemplo, algunas realizaciones de la invención emplean un lecho de medios de extracción que tienen un peso seco inferior a 1 gramo (por ejemplo, en el rango de 0,001-1 g, 0,005-1 g, 0,01-1 g o 0,02-1 g), inferior a 100 mg (por ejemplo, en el rango de 0,1-100 mg, 0,5-100 mg, 1-100 mg, 2-100 mg o 10-100 mg), inferior a 10 mg (por ejemplo, en el rango de 0,1-10 mg, 0,5-10 mg, 1-10 mg o 2-10 mg), inferior a 2 mg (por ejemplo, en el rango de 0,1-2 mg, 0,5-2 mg o 1-2 mg), o inferior a 1 mg (por ejemplo, en el rango de 0,1-1 mg o 0,5-1 mg).
Muchos de los tipos de medios de extracción adecuados para usar en la invención se seleccionan de una variedad de clases de medios de cromatografía. Se ha encontrado que muchos de estos tipos de medios de cromatografía y las químicas asociadas son adecuados para usar como medios de extracción en fase sólida en los dispositivos y métodos de esta invención.
Los medios de extracción incluyen perlas de resina que son resinas de gel.
La expresión "resina de gel" se refiere a una resina que comprende materiales de perlas de baja reticulación que pueden hincharse en un solvente, por ejemplo, tras hidratación. Reticulación se refiere al enlace físico de las cadenas poliméricas que forman las perlas. El enlace físico normalmente se logra a través de un monómero de reticulación que contiene funcionalidad de bipolimerización de modo que durante el proceso de polimerización, la molécula puede incorporarse en dos cadenas poliméricas diferentes. El grado de reticulación de un material particular puede variar de 0,1 a 30 %, utilizándose normalmente de 0,5 a 10 %. Lo más habitual es una reticulación del 1 al 5 %. Un menor grado de reticulación hace que la perla sea más permeable al solvente, lo que hace que los sitios funcionales dentro de la perla sean más accesibles al analito. Sin embargo, una perla poco reticulada puede deformarse fácilmente y solo debe usarse si el flujo de eluyente a través del lecho es lo suficientemente lento o suave para impedir el cierre de los espacios intersticiales entre las perlas, lo que podría provocar a continuación un colapso catastrófico del lecho. Los materiales de mayor reticulación se hinchan menos y pueden impedir el acceso de los analitos y materiales de desorción a los grupos funcionales interiores dentro de la perla. En general, es deseable usar un nivel de reticulación tan bajo como sea posible, siempre que sea suficiente para resistir el colapso del lecho. Esto significa que, en las columnas rellenas de gel convencionales, puede ser necesario utilizar caudales lentos. En la presente invención, la contrapresión es muy baja y se pueden usar caudales de líquido elevados sin aplastar el lecho. Sorprendentemente, el uso de estas altas velocidades de solvente no parece reducir la capacidad o la utilidad de los materiales de las perlas. Las resinas de gel son agarosa, sefarosa o celulosa. Las resinas de gel pueden ser perlas no porosas o microporosas.
La baja contrapresión asociada con la invención da como resultado, en algunos casos, que las columnas muestren características que normalmente no se asocian con las columnas rellenas convencionales. Por ejemplo, en algunos casos se ha observado que por debajo de un determinado umbral de presión, el solvente no fluye a través de la columna. Este umbral de presión se puede considerar como un "punto de burbujeo". En las columnas convencionales, el caudal a través de la columna, en general, aumenta desde cero como una función uniforme de la presión a la que se empuja el solvente a través de la columna. Con muchas de las columnas de la invención, un aumento progresivo de la presión no dará como resultado ningún flujo a través de la columna hasta que se alcance el umbral de presión. Una vez que se alcanza el umbral de presión, el flujo comenzará a una velocidad significativamente mayor que cero, es decir, no hay un aumento suave en el caudal con la presión, sino un salto repentino de cero a un caudal relativamente grande. Una vez que se ha excedido el umbral de presión, comienza el flujo, el caudal aumenta, en general, con relativa suavidad, con el aumento de la presión, como sería el caso de las columnas convencionales.
Ejemplos de perlas de resina incluyen perlas de proteína G (p. ej., para la purificación de proteínas IgG), perlas de fase de afinidad (p. ej., para purificación de proteínas), perlas de fase de intercambio iónico (p. ej., para purificación de proteínas), perlas de interacción hidrófoba (p. ej., para purificación de proteínas), perlas de fase inversa (p. ej., para la purificación de ácidos nucleicos o proteínas), y perlas que tienen afinidad por las moléculas analizadas mediante detección sin etiquetas.
Se ha descubierto que las perlas a base de agarosa y sefarosa funcionan sorprendentemente bien en el método de esta invención. En la cromatografía convencional, caudales elevados pueden dar lugar a la compresión de las perlas, lo que provoca un aumento de la contrapresión y afecta negativamente a la capacidad de utilizar estos geles con caudales más elevados. En la presente invención se utilizan volúmenes de lecho relativamente pequeños, y parece que esto permite el uso de caudales elevados con una cantidad mínima de compresión de las perlas y el problema que conlleva dicha compresión.
Los diámetros promedio de partícula de las perlas de la invención están normalmente en el rango de aproximadamente 1 pm a varios milímetros, por ejemplo, diámetros en rangos que tienen límites inferiores de 1 pm, 5 pm, 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm. pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 150 pm, 200 pm, 30o pm o 500 pm, y límites superiores de 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 150 pm, 200 pm, 300 pm, 500 pm, 750 pm, 1 mm, 2 mm o 3 mm.
El tamaño de perla que se puede usar depende en cierta medida del volumen de lecho y del área de la sección transversal de la columna. Una columna de menor volumen de lecho tolerará un tamaño de perla más pequeño sin generar las altas contrapresiones que podrían romper una frita de membrana delgada. Por ejemplo, un volumen de lecho de 0,1 a 1 pl puede tolerar partículas de 5 a 10 pm. Los lechos más grandes (hasta aproximadamente 50 pl) normalmente tienen tamaños de perlas de 30-150 pm o más. El rango superior de tamaño de partícula depende del diámetro del lecho de columna. El tamaño del diámetro de la perla no debe ser superior al 50 % del diámetro del lecho, y preferiblemente inferior al 10 % del diámetro del lecho.
La química de extracción empleada en la presente invención puede adoptar cualquiera de una amplia variedad de formas. Por ejemplo, los medios de extracción se pueden seleccionar de entre, o basarse en, cualquiera de las químicas de extracción utilizadas en la extracción y/o cromatografía en fase sólida, por ejemplo, en fase inversa, en fase normal, de interacción hidrófoba, de interacción hidrófila, de intercambio iónico, de separación tiófila, de inducción de carga hidrófoba o de unión por afinidad. Debido a que la invención es particularmente adecuada para la purificación y/o la concentración de biomoléculas, las superficies de extracción capaces de adsorber tales moléculas son particularmente relevantes. Véase, por ejemplo, SEPARATION AND SCIENCE TECHNOLOGY Vol. 2.: HANDBOOK OF BIOSEPARATIONS, editado por Satinder Ahuja, Academic Press (2000).
Las extracciones por afinidad, que no están contempladas como tales por la presente invención, utilizan una técnica en la que se prepara un adsorbente bioespecífico acoplando un ligando específico (tal como una enzima, un antígeno o una hormona) para el analito (por ejemplo, macromolécula) de interés, a un soporte sólido. Este ligando inmovilizado interactuará selectivamente con moléculas que puedan unirse a él. Las moléculas que no se unen se eluyen sin ser retenidas. La interacción es selectiva y reversible Las referencias enumeradas a continuación muestran ejemplos de los tipos de grupos de afinidad que pueden emplearse en la práctica de esta invención y que están incorporados por ello por referencia en el presente documento en su totalidad. Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, Edition AB, 18-1037-46 (2002); Protein Purification Handbook, Amersham Biosciences, Edition AC, 18-1132-29 (2001); Affinity Chromatography Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AC, 18-1022-29 (2001); The Recombinant Protein Handbook, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AB, 18-1142-75 (2002); y Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Jan-Christen Janson (Editor), Lars G. Ryden (Editor), Wiley, John & Sons, Incorporated (1989).
En un aspecto de la invención, se utilizan medios de extracción que contienen una funcionalidad superficial que tiene afinidad por una etiqueta de fusión de proteína utilizada para la purificación de proteínas recombinantes. Hay disponible una amplia variedad de etiquetas de fusión y grupos de afinidad correspondientes.
La Solicitud de Patente de EE. UU. No. 10/620,155 describe en detalle el uso de reactivos de unión por afinidad específicos en la extracción en fase sólida. Ejemplos de agentes de unión por afinidad específicos incluyen proteínas que tienen afinidad por anticuerpos, regiones Fc y/o regiones Fab tales como Proteína G, Proteína A, Proteína A/G, y Proteína L; metales quelados tales como quelato de metal-NTA (por ejemplo, níquel-NTA, cobre-NTA, hierro-NTA, cobalto-NTA, zinc-NTA), quelato de metal-IDA (por ejemplo, níquel-IDA, cobre-IDA, hierro-IDA, cobalto-IDA) y quelato de metal-CMA (aspartato carboximetilado) (por ejemplo, níquel-CMA, cobre-CMA, hierro-CMA, cobalto-CMA, zinc-CMA); superficies de glutatión-nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos y sus análogos (por ejemplo, ATP); superficie de lectina-superficie de heparina-superficie de avidina o estreptavidina, un péptido o análogo de péptido (por ejemplo, que se une a una proteasa o a otra enzima que actúa sobre los polipéptidos).
El reactivo de unión por afinidad puede ser uno que reconozca uno o más de los muchos grupos de afinidad utilizados como etiquetas de afinidad en las proteínas de fusión recombinantes. Ejemplos de dichas etiquetas incluyen etiquetas de polihistidina (por ejemplo, la etiqueta 6X-His), que se pueden extraer usando un metal quelado tal como secuencias peptídicas de Ni-NTA (tales como el epítopo FLAG) que son reconocidas por un anticuerpo inmovilizado; biotina, que se puede extraer utilizando avidina o estreptavidina inmovilizada; "péptido de unión a calmodulina" (o, CBP), que se reconoce por calmodulina cargada con proteína calcio-glutatión S-transferasa (GST), reconocida por glutatión inmovilizado; proteína de unión a maltosa (MBP), reconocida por amilosa; la etiqueta del dominio de unión a celulosa, reconocida por celulosa inmovilizada; un péptido con afinidad específica por la proteína S (derivado de la ribonucleasa A); y la etiqueta de secuencia peptídica CCxxCC (donde xx es cualquier aminoácido, tal como RE), que se une al agente de unión por afinidad bisarsenical fluoresceína (tinción FIAsH).
Los anticuerpos se pueden extraer utilizando, por ejemplo, proteínas tales como la proteína A, la proteína G, la proteína L, híbridos de estas, o mediante otros anticuerpos (por ejemplo, un anti-IgE para purificar IgE).
Los metales quelados no solo son útiles para purificar proteínas etiquetadas con poli-His, sino también otras proteínas no etiquetadas que tienen una afinidad intrínseca por el metal quelado, por ejemplo, fosfopéptidos y fosfoproteínas.
Los anticuerpos también pueden ser útiles para purificar proteínas no etiquetadas por las que tienen afinidad, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos con afinidad por un sitio de fosforilación específico o aminoácidos fosforilados.
En otras realizaciones de la invención se emplean superficies de extracción que son, en general, menos específicas que los agentes de unión por afinidad explicados anteriormente. Estas químicas de extracción siguen siendo a menudo bastante útiles. Los ejemplos incluyen superficies de extracción o de cromatografía de intercambio iónico, fase inversa, fase normal, interacción hidrófoba e interacción hidrófila. En general, estas químicas de extracción, métodos de uso, solventes apropiados, etc., son bien conocidos en la técnica y, en particular, se describen con más detalle en las Solicitudes de Patente de EE.UU. No. 10/434,713 y 10/620,155, y las referencias citadas en las mismas, por ejemplo, Chromatography, 5a edición, PARTE A: FUNDAMENTALS AND TECHNIQUES, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, pág. A25 (1992); ADVANCED CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROMIGRATION METHODS IN BIOSCIENCES, editor: Z. Deyl, Elsevier Science BV, Ámsterdam, Países Bajos, pág. 528 (1998); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole y Salwa K. Poole, y Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, pág. 394 (1991); y ORGANIC SYNTHESIS ON SOLID PHASE, F. Dorwald Wiley VCH Verlag Gmbh, Weinheim 2002.
Fritas
Según la invención, se utilizan una frita superior y una frita inferior para contener el lecho de medios de extracción en la columna. Las fritas pueden adoptar una variedad de formas y pueden construirse a partir de una variedad de materiales, por ejemplo, vidrio, cerámica, metal, fibra. Algunas realizaciones de la invención emplean fritas que tienen un volumen de poro bajo, lo que contribuye a reducir el volumen muerto. Las fritas de la invención son porosas, ya que es necesario que el fluido pueda pasar por la frita. La frita debe tener suficiente resistencia estructural para que la integridad de la frita pueda contener los medios de extracción en la columna. Es deseable que la frita tenga poca o ninguna afinidad por los productos químicos con los que entrará en contacto durante el proceso de extracción, en particular el analito de interés. El analito de interés puede ser una biomolécula, particularmente una macromolécula biológica. Por tanto, en muchas realizaciones de la invención, es deseable utilizar una frita que tenga una tendencia mínima a unirse o interactuar de otro modo con macromoléculas biológicas, particularmente proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.
Se pueden usar fritas de diversos tamaños de poros y densidades de poros siempre que sea posible el flujo libre de líquido y las perlas se mantengan en su lugar dentro de los medios de extracción. De acuerdo con la invención, las fritas superior e inferior se unen y se extienden a través del canal abierto del cuerpo de la columna. Preferiblemente, la frita inferior se une en o cerca del extremo inferior abierto de la columna, por ejemplo, se une y se extiende a través del extremo inferior abierto. Se coloca un lecho de medios de extracción dentro del canal abierto y en contacto con la frita inferior.
La frita superior, la frita inferior y el cuerpo de columna (es decir, la superficie interior del canal) definen una cámara de medios donde está colocado un lecho de medios de extracción. Las fritas deben fijarse firmemente al cuerpo de la columna y extenderse a lo largo de la abertura y/o el extremo abierto para ocluir completamente el canal, confinando así sustancialmente el lecho de medios de extracción en el interior de la cámara de medios. En realizaciones preferidas de la invención, el lecho de medios de extracción ocupa al menos el 80 % del volumen de la cámara de medios de extracción, más preferiblemente el 90 %, el 95 %, el 99 %, o sustancialmente el 100 % del volumen. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el espacio entre el lecho de medios de extracción y las fritas superior e inferior es despreciable, es decir, las fritas están en contacto sustancial con las superficies superior e inferior del lecho de medios de extracción, manteniendo un lecho bien relleno de medios de extracción de manera segura en su lugar.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la frita inferior está posicionada en el extremo inferior abierto del cuerpo de la columna. Esta configuración se muestra en las figuras y se ejemplifica en los ejemplos, pero no es necesaria, es decir, en algunas realizaciones, la frita inferior está posicionada a cierta distancia del cuerpo de la columna del extremo inferior abierto. Sin embargo, en vista de la ventaja que viene con la minimización del volumen muerto en la columna, es deseable que la frita inferior y la cámara de medios de extracción estén posicionadas en el extremo inferior o cerca del mismo. En algunos casos, esto puede significar que la frita inferior está fijada a la cara del extremo inferior abierto, como se muestra en las figuras 3, 5 y 7-9.
Sin embargo, en algunos casos puede haber alguna porción del extremo inferior que se extienda más allá de la frita inferior. Para los fines de esta invención, siempre y cuando la longitud de esta extensión sea tal que no introduzca sustancialmente un volumen muerto en la columna de extracción o tenga un impacto adverso en la función de la columna, se considera que la frita inferior está posicionada en el extremo inferior del cuerpo de la columna. En algunas realizaciones de la invención, el volumen definido por la frita inferior, la superficie de canal y la cara del extremo inferior abierto (es decir, el volumen del canal debajo de la frita inferior) es inferior al volumen de la cámara de medios, o inferior al 10 % del volumen de la cámara de medios, o inferior al 1 % del volumen de la cámara de medios.
En algunas realizaciones de la invención, la cámara de medios de extracción está colocada cerca de un extremo de la columna que, a efectos explicativos, se describirá como el extremo inferior de la columna. El área del canal del cuerpo de la columna por encima de la cámara de medios de extracción puede ser bastante grande en relación con el tamaño de la cámara de medios de extracción. Por ejemplo, en algunas realizaciones el volumen de la cámara de extracción es igual a menos del 50 %, menos del 20, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 2 %, menos del 1 % o menos del 0,5 % del volumen interno total del cuerpo de la columna. En funcionamiento, el solvente puede fluir a través del extremo inferior abierto de la columna, a través del lecho de medios de extracción y fuera de la cámara de medios de extracción en la sección del canal por encima de la cámara. El cuerpo de la columna, que es una punta de pipeta, comprende un extremo superior abierto que se puede ajustar a un pipeteador y una solución extraída a través de los medios de extracción y en la parte superior del canal.
Las fritas utilizadas en la invención se caracterizan por tener un bajo volumen de poro. Algunas realizaciones preferidas de la invención emplean fritas que tienen volúmenes de poro inferiores a 1 microlitro (por ejemplo, en el rango de 0,015-1 microlitros, 0,03-1 microlitros, 0,1-1 microlitros o 0,5-1 microlitros), preferiblemente inferior a 0,5 microlitros (por ejemplo, en el rango de 0,015-0,5 microlitros, 0,03-0,5 microlitros o 0,1-0,5 microlitros), inferior a 0,1 microlitros (por ejemplo, en el rango de 0,015-0,1 microlitros o 0,03-0,1 microlitros) o inferior a 0,03 microlitros (por ejemplo, en el rango de 0,015-0,03 microlitros).
Las fritas de la invención preferiblemente tienen aberturas de poro o aberturas de malla de un tamaño en el rango de aproximadamente 5-100 pm, más preferiblemente 10-100 pm y aún más preferiblemente 15-50 pm, por ejemplo, aproximadamente 43 pm. El rendimiento de la columna normalmente se mejora mediante el uso de fritas que tienen poros o aberturas de malla lo suficientemente grandes como para minimizar la resistencia al flujo. El uso de tamices de membrana como se describe en el presente documento proporciona esta normalmente baja resistencia al flujo y, por ende, mejores caudales, menor contrapresión y distorsión mínima del lecho de medios de extracción. Por supuesto, las aberturas de poro o malla no deben ser tan grandes que no puedan contener adecuadamente los medios de extracción en la cámara.
Algunas fritas utilizadas en la práctica de la invención se caracterizan por tener un volumen de poro bajo en relación con el volumen intersticial del lecho de medios de extracción contenido por la frita. Por tanto, en realizaciones preferidas de la invención, el volumen de poro de la frita es igual al 10 % o menos del volumen intersticial del lecho de medios de extracción (por ejemplo, en el rango de 0,1-10 %, 0,25-10 %, 1-10 % o 5-10 % del volumen intersticial), más preferiblemente 5 % o menos del volumen intersticial del lecho de medios de extracción (por ejemplo, en el rango de 0,1-5 %, 0,25-5 % o 1-5 % del volumen intersticial), y aún más preferiblemente 1 % o menos del volumen intersticial del lecho de medios de extracción (por ejemplo, en el rango de 0,01-1 %, 0,05-1 % o 0,1-1 % del volumen intersticial).
La densidad de poro permitirá el flujo del líquido a través de la membrana y es preferiblemente del 10 % y superior para aumentar el caudal que sea posible y reducir el tiempo necesario para procesar la muestra.
Determinadas realizaciones de la invención emplean una frita delgada que tiene, preferiblemente, menos de 350 |jm de grosor (por ejemplo, en el rango de 20-350 jm , 40-350 jm o 50-350 jm ), más preferiblemente menos de 200 jm de grosor (por ejemplo, en el rango de 20-200 pm, 40-200 pm o 50-200 pm), más preferiblemente menos de 100 pm de grosor (por ejemplo, en el rango de 20-100 pm, 40-100 pm, o 50-100 pm), y lo más preferiblemente menos de 75 pm de grosor (por ejemplo, en el rango de 20-75 pm, 40-75 pm o 50-75 pm).
Algunas realizaciones preferidas de la invención emplean un tamiz de membrana como frita. El tamiz de membrana debe ser lo suficientemente resistente para no solo contener los medios de extracción en el lecho de la columna, sino también para evitar que se desprenda o perfore durante el relleno real de las perlas de medios en el lecho de la columna. Las membranas pueden ser frágiles y, en algunas realizaciones, deben estar contenidas en un armazón para mantener su integridad durante el uso. Sin embargo, es deseable usar una membrana de suficiente resistencia, de tal manera que pueda usarse sin depender de dicho armazón. El tamiz de membrana también debe ser flexible para que pueda adaptarse al lecho de columna. Esta flexibilidad es ventajosa en el proceso de relleno, ya que permite que el tamiz de membrana se adapte al lecho de los medios de extracción, lo que resulta en una reducción del volumen muerto.
La membrana puede ser una malla tejida o no tejida de fibras que puede ser un tejido de malla, una estera de fibras orientadas al azar, es decir, un "papel polimérico", una malla unida por hilado, un papel o membrana grabada o "con poros perforados" tal como una membrana grabada con huella nuclear o una malla electrolítica (véase, por ejemplo, el documento US 5,556,598). La membrana puede ser, por ejemplo, de polímero, vidrio o metal, siempre que la membrana tenga un bajo volumen muerto, permita el movimiento de las diversas muestras y los líquidos de procesamiento a través del lecho de columna, se pueda unir al cuerpo de columna y sea lo suficientemente resistente para soportar el proceso de relleno del lecho, sea lo suficientemente resistente como para sostener el lecho de columna de perlas y no interfiera con el proceso de extracción, es decir, no adsorba ni desnaturalice las moléculas de la muestra.
La frita se puede fijar al cuerpo de columna por cualquier medio que dé como resultado una fijación estable. Por ejemplo, el tamiz se puede unir al cuerpo de la columna mediante soldadura o encolado. El encolado se puede realizar con cualquier pegamento adecuado, por ejemplo, silicona, pegamento de cianoacrilato, pegamento epoxi y similares. El pegamento o la junta soldada deben tener la resistencia requerida para resistir el proceso de relleno del lecho de medios de extracción y para contener los medios de extracción con la cámara. Para las juntas con pegamento, se debe seleccionar un pegamento empleado que no adsorba ni desnaturalice las moléculas de la muestra.
Por ejemplo, se puede usar pegamento para unir una membrana a la punta de una columna de extracción basada en puntas de pipeta, es decir, una columna en la que el cuerpo de la columna es una punta de pipeta. Se aplica un pegamento adecuado al extremo de la punta. En algunos casos, se puede insertar una varilla en la punta para evitar que el pegamento se extienda más allá de la cara del cuerpo. Después de aplicar el pegamento, la punta se pone en contacto con la frita de la membrana, fijando así la membrana a la punta. Después de la fijación, la punta y la membrana pueden disponerse contra una superficie dura y plana y frotarse con un movimiento circular para garantizar la fijación completa de la membrana al cuerpo de columna. Después del secado, el exceso de membrana se puede recortar de la columna con una cuchilla de afeitar.
Alternativamente, el cuerpo de columna se puede soldar a la membrana fundiendo el cuerpo en la membrana, o fundiendo la membrana en el cuerpo, o ambos. En un método, se elige una membrana de tal manera que su temperatura de fusión es superior a la temperatura de fusión del cuerpo. La membrana se sitúa sobre una superficie y el cuerpo se baja hasta la membrana y se calienta, por lo que la cara del cuerpo se fundirá y soldará la membrana al cuerpo. El cuerpo puede calentarse por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, con una superficie plana caliente, aire caliente o ultrasónicamente. Inmediatamente después de soldar, la soldadura puede ser enfriada con aire u otro gas para mejorar la probabilidad de que la soldadura no se rompa.
Alternativamente, se puede fijar una frita por medio de un tubo anular, como se describe en la Patente de EE.
UU. 5,833,927. Este modo de fijación es particularmente adecuado para realizaciones donde la frita es un tamiz de membrana.
Las fritas de la invención, por ejemplo, un tamiz de membrana, se pueden fabricar de cualquier material que tenga las propiedades físicas requeridas como se describe en el presente documento. Ejemplos de materiales adecuados incluyen nailon, poliéster, poliamida, policarbonato, celulosa, polietileno, nitrocelulosa, acetato de celulosa, difluoruro de polivinilideno, politetrafluoroetileno (PTFE), polipropileno, polisulfona, metal y vidrio. Un ejemplo específico de un tamiz de membrana es el material de malla de poliéster de tamaño de poro de 43 pm de Spectra/Mesh® comercializado por la firma Spectrum Labs (Ranch Dominguez, CA, PN 145837).
Las características del tamaño de poro de los filtros de membrana se pueden determinar, por ejemplo, mediante el uso del método no. F316-30, publicado por ASTM International, titulado "Standard Test Methods for Pore Size Characteristics of Membrane Filters by Bubble Point and Mean Flow Pore T est".
La polaridad del tamiz de membrana puede ser importante. Un tamiz hidrófilo favorecerá el contacto con el lecho y favorecerá la interfase aire-líquido estableciendo una tensión superficial. Un tamiz hidrófobo no favorecería esta tensión superficial y por lo tanto las presiones umbral para fluir serían diferentes. Se prefiere un tamiz hidrófilo en determinadas realizaciones de la invención.
Sin embargo, según el contexto en el que se use el dispositivo, puede ser preferible usar una membrana hidrófila, tal como poliéster, o una membrana hidrófoba, tal como nailon, o una combinación de membranas hidrófobas e hidrófilas, por ejemplo, una membrana hidrófila en la parte superior y una membrana hidrófila en la parte inferior. Por ejemplo, el uso de una membrana hidrófoba como parte superior y/o la frita inferior puede mejorar las características de flujo de la columna, particularmente en implementaciones automatizadas de la invención, tal como por medio de un sistema robótico de manejo de líquidos. Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular de funcionamiento, parece probable que el uso de una membrana hidrófoba junto con soluciones acuosas generará una tensión superficial menor, lo que dará como resultado un menor punto de burbujeo y, por lo tanto, una menor contrapresión. Los ejemplos de membranas hidrófobas e hidrófilas incluirían, por ejemplo, membranas que comprenden nailon y poliéster, respectivamente.
En ciertas realizaciones de la invención, se incluye un taco de material fibroso en el dispositivo, que se extiende a través del canal abierto entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de la columna, en el que el taco de material fibroso, la frita inferior y el canal abierto definen una cámara de medios, en la que el lecho de medios de extracción está colocado en el interior de la cámara de medios. En algunos ejemplos que no forman parte de la invención, el taco de material fibroso se usa en lugar de una frita superior, es decir, hay una sola frita inferior y un taco de material fibroso definiendo la cámara de medios. En otras realizaciones, se utilizan tanto una frita superior como un taco de material fibroso. Por ejemplo, el material fibroso puede estar colocado en el interior del canal abierto y en contacto con la frita superior, por ejemplo, el taco de material fibroso puede estar colocado entre la frita superior y el extremo superior abierto, o entre las fritas inferior y superior, es decir, dentro de la cámara de medios.
El taco de material fibroso puede tener cualquiera de una variedad de dimensiones o tamaños. Por ejemplo, el volumen del taco en determinados dispositivos está entre el 1 % y el 1000 % del volumen de la cámara de medios, preferiblemente entre el 5 % y el 500 %, o el 10 % y el 100 %, del volumen de la cámara de medios. En algunas realizaciones, el taco de material fibroso comprende fibra de poliéster o polietileno.
Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que el taco de material fibroso puede facilitar el movimiento de la solución a través del lecho de material de extracción actuando como un agente de efecto de mecha. Este es particularmente el caso cuando un gas tal como el aire está presente en el lecho de medios de extracción o junto a él, lo que puede aumentar la contrapresión del líquido en movimiento a través de la columna, particularmente cuando el gas es una burbuja en contacto con un tamiz de membrana. Un tamiz de membrana, particularmente uno que sea hidrófilo, puede resultar en un punto de burbujeo relativamente alto que provoca un aumento en la contrapresión; el uso de un agente de efecto de mecha alivia este problema.
Montaje de columna de extracción
Las columnas de extracción de la invención se pueden construir mediante una variedad de métodos utilizando las explicaciones proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones preferidas, la columna de extracción se puede construir mediante el acoplamiento (es decir, la fijación) de elementos tubulares superior e inferior (es decir, cuerpos de columna) que se combinan para formar la columna de extracción. Ejemplos de este modo de construcción de columnas, y otros, se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. 10/620,155.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, una columna de extracción se construye acoplando los cuerpos de columna exterior e interior, donde cada cuerpo de columna tiene dos extremos abiertos (por ejemplo, un extremo superior abierto y un extremo inferior abierto) y un canal abierto que conecta los dos extremos abiertos (por ejemplo, un cuerpo tubular, tal como una punta de pipeta). El cuerpo de columna exterior tiene una primera frita (preferiblemente, una frita de membrana) unida al extremo inferior abierto y que se extiende a través del mismo, ya sea en la punta misma del extremo abierto o cerca del extremo abierto. La sección del canal abierto entre el extremo superior abierto y la primera frita define un cuerpo de columna exterior. El cuerpo de columna interior también tiene una frita (preferiblemente, una frita de membrana) unida a su extremo inferior abierto y que se extiende a través del mismo.
Para construir una columna según esta realización, medios de extracción de interés se disponen dentro del cuerpo de columna inferior, por ejemplo, orientando el cuerpo de columna inferior de tal manera que el extremo inferior abierto queda hacia abajo, y llenando, o llenando parcialmente, el canal abierto con la resina, por ejemplo, en forma de suspensión. El cuerpo de columna interior, o al menos alguna porción del cuerpo de columna interior, se inserta a continuación en el cuerpo de columna exterior de tal manera que el extremo inferior abierto del cuerpo interior (donde está fijada la segunda frita) entra primero en el cuerpo de columna exterior. El cuerpo de columna interior se coloca de manera estanca dentro del canal abierto del cuerpo de columna exterior, es decir, la superficie exterior del cuerpo de columna interior forma una junta estanca con la superficie de la abertura. La sección del canal abierto entre las fritas primera y segunda contiene los medios de extracción, y este espacio define una cámara de medios. En general, resulta ventajoso que el volumen de la cámara de medios (y el volumen del lecho de medios de extracción colocado con dicha cámara de medios) sea inferior al del cuerpo de columna exterior, ya que esta diferencia de volumen facilita la introducción de medios de extracción en el cuerpo de columna exterior y, por ende, simplifica el proceso de fabricación. Esto es particularmente ventajoso en realizaciones de la invención en las que las columnas de extracción se fabrican en serie.
En ciertas realizaciones del proceso de fabricación anterior, el cuerpo de columna interior puede fijarse de forma estable al cuerpo de columna exterior mediante acoplamiento por fricción con la superficie del canal abierto.
En algunas realizaciones, uno o ambos de los cuerpos de columna pueden ser puntas de pipeta, secciones de puntas de pipeta o formas modificadas de puntas de pipeta. Por ejemplo, una realización de la invención en la que los dos elementos tubulares son secciones de puntas de pipeta, está representada en la figura 1 (la figura 2 es una vista ampliada del extremo inferior abierto y de la cámara de medios de extracción de la columna). Esta realización está construida a partir de un elemento tubular superior troncocónico 2 y un elemento tubular inferior troncocónico 3 acoplado con el mismo. El extremo de acoplamiento 6 del elemento tubular inferior tiene un orificio cónico que coincide con la superficie externa cónica del extremo de acoplamiento 4 del elemento tubular superior, recibiendo el extremo de acoplamiento del elemento tubular inferior el extremo de acoplamiento del elemento tubular superior en una relación telescópica. El orificio cónico se acopla perfectamente con la superficie exterior cónica para formar una buena junta de estanqueidad en la columna ensamblada.
Un tamiz de membrana 10 está unido a la punta del extremo de acoplamiento, y se extiende a través de la misma, del elemento tubular superior, y constituye la frita superior de la columna de extracción. Otro tamiz de membrana 14 está unido a la punta del elemento tubular inferior, y se extiende a través de la misma, y constituye la frita inferior de la columna de extracción. La cámara de medios de extracción 16 está definida por los tamices de membrana 10 y 14 y la superficie de canal 18, y está rellena con medios de extracción.
El volumen de poro de los tamices de membrana 10 y 14 es bajo, para minimizar el volumen muerto de la columna. La muestra y la solución de desorción pueden pasar directamente del vial o depósito al lecho de medios de extracción. El bajo volumen muerto permite la desorción del analito en el volumen de desorción más pequeño posible, maximizando así la concentración del analito.
El volumen de la cámara de medios de extracción 16 es variable, y puede ser ajustado cambiando la profundidad hasta la que se extiende el extremo de acoplamiento del elemento tubular superior en el elemento tubular inferior, según lo determinado por las dimensiones relativas del orificio cónico y de la superficie exterior cónica.
El sellado del elemento tubular superior al tubular inferior en esta realización se logra mediante la fricción de un ajuste a presión, pero podría lograrse alternativamente mediante soldadura, encolado o métodos de sellado similares.
Cabe señalar que en esta y en otras realizaciones similares, una porción del cuerpo de columna interior (en este caso, la mayor parte de la punta de pipeta 2) no está dispuesta dentro del primer canal, sino que, por el contrario, se extiende fuera del cuerpo de columna exterior. En este caso, el extremo superior abierto del cuerpo de columna interior está adaptado para ser fijado de manera operativa a una bomba, por ejemplo, un pipeteador.
En otras realizaciones de este método general de fabricación de columnas, todo el cuerpo de columna interior se puede disponer dentro del primer canal abierto. En estas realizaciones, el primer extremo superior abierto está normalmente adaptado para una fijación operable a una bomba, es decir, el cuerpo de columna exterior es una punta de pipeta y la bomba es un pipeteador. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el diámetro exterior del cuerpo de columna interior se estrecha hacia su extremo inferior abierto, y el canal abierto del cuerpo de columna exterior se estrecha en la región en la que el cuerpo de columna interior se acopla por fricción con el canal abierto, siendo las conicidades del cuerpo de columna interior y del canal abierto complementarias entre sí. Esta complementariedad de conicidad permite que los dos cuerpos se ajusten perfectamente y formen una unión estanca, de tal manera que la columna resultante comprende un solo canal abierto que contiene el lecho de medios de extracción unido por las dos fritas.
La figura 7 ilustra la construcción de un ejemplo de esta realización de las columnas de extracción de la invención. Este ejemplo incluye un cuerpo de columna exterior 160 que tiene un eje longitudinal 161, un conducto pasante central 162 (es decir, un canal abierto), un extremo inferior abierto 164 para la absorción y/o la expulsión de fluido, y un extremo superior abierto 166 para fijación operable a una bomba, por ejemplo, el extremo superior abierto está en comunicación con un pipeteador o un pipeteador multicanal. La comunicación puede ser directa o indirecta, por ejemplo, a través de uno o más accesorios, acoplamientos o similares, siempre que el funcionamiento de la bomba afecte a la presión en el conducto pasante central (denominado en otra parte de esta invención como "espacio libre superior"). El cuerpo de columna exterior incluye una sección troncocónica 168 del conducto pasante 162, que es adyacente al extremo inferior abierto 164. El diámetro interior de la sección troncocónica disminuye desde un primer diámetro interior 170, en una posición en la sección troncocónica distal al extremo inferior abierto, hasta un segundo diámetro interior 172 en el extremo inferior abierto. Una frita inferior 174, preferiblemente un tamiz de membrana, se une al extremo inferior abierto 164 y se extiende a través del mismo. En una realización preferida de la invención, se puede unir una frita de membrana al cuerpo de columna exterior mediante los métodos descritos en esta invención, tal como mediante encolado o soldadura. Esta realización incluye además un anillo 176 que tiene un diámetro exterior 178 que es inferior al primer diámetro interior 170 y superior al segundo diámetro interior 174. Una frita superior 180, preferiblemente un tamiz de membrana, está unido al anillo y se extiende a través del mismo.
Para construir la columna, se introduce una cantidad deseada de medios de extracción 182, preferiblemente en forma de suspensión, en el conducto pasante a través del extremo superior abierto y se coloca en la sección troncocónica adyacente al extremo inferior abierto. El medios de extracción forma preferiblemente un lecho relleno en contacto con la frita inferior 174. A continuación, el anillo 176 se introduce en el conducto a través del extremo superior abierto y se coloca en un punto en la sección troncocónica donde el diámetro interior de la sección troncocónica coincide con el diámetro exterior 178 del anillo, de modo que el anillo hace contacto con una junta de estanqueidad y forma el mismo con la superficie del conducto pasante. La frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto pasante delimitado por las fritas superior e inferior definen una cámara de medios de extracción 184. La cantidad de medios de extracción introducidos en la columna normalmente se selecciona de tal manera que el lecho relleno resultante llena sustancialmente la cámara de medios de extracción, preferiblemente haciendo contacto con las fritas superior e inferior.
Cabe señalar que el anillo puede adoptar cualquiera de una serie de geometrías distintas del anillo simple representado en la figura 7, siempre que el anillo tenga la forma para ajustarse a la geometría interna de la sección troncocónica e incluya un conducto pasante a través del cual la solución puede pasar. Por ejemplo, la figura 8 representa una realización preferida en la que el anillo adopta la forma de un elemento troncocónico 190 que tiene un conducto pasante central 192 que conecta un extremo superior abierto 194 y un extremo inferior abierto 195. El diámetro exterior del elemento troncocónico disminuye desde un primer diámetro exterior 196 en el extremo superior abierto hasta un segundo diámetro exterior 197 en el extremo inferior abierto. El segundo diámetro exterior 197 es superior al segundo diámetro interior 172 e inferior al primer diámetro interior 170. El primer diámetro exterior 196 es inferior o sustancialmente igual al primer diámetro interior 170. Una frita superior 198 está unida al extremo inferior abierto 195 y se extiende a través del mismo. El elemento troncocónico 190 se introduce en el conducto pasante de un cuerpo de columna exterior que contiene un lecho de medios de extracción colocado en la frita inferior 174. La superficie exterior cónica del elemento troncocónico coincide con el ahusamiento de la sección troncocónica del conducto abierto, y las dos superficies hacen un contacto de sellado. La configuración troncocónica extendida de esta realización del anillo facilita la alineación y el asentamiento apropiados del anillo en el conducto exterior.
Debido al ajuste por fricción del anillo a la superficie del conducto pasante central, normalmente no es necesario utilizar medios adicionales para unir la frita superior a la columna. Si se desea, se pueden utilizar medios de fijación adicionales, por ejemplo, mediante unión, encolado, soldadura, etc. En algunas realizaciones, la superficie interior de la sección troncocónica y/o del anillo se modifica para mejorar la conexión entre los dos elementos, por ejemplo, incluyendo ranuras, mecanismos de bloqueo, etc.
En las realizaciones anteriores, las secciones transversales anular y latitudinal de la sección troncocónica se ilustran como de geometría circular. Alternativamente, podrían emplearse otras geometrías, por ejemplo, ovaladas, poligonales o de otro tipo. Cualesquiera que sean las geometrías, las formas anular y troncocónica deben coincidir en la medida requerida para lograr un acoplamiento de estanqueidad adecuado. Las fritas se colocan preferiblemente, aunque no necesariamente, en una orientación paralela entre sí y perpendicular al eje longitudinal.
En los ejemplos también se describen otras realizaciones de la invención que ejemplifican diferentes métodos de construcción.
Bomba
En algunos modos de utilización de las columnas de extracción de la invención, se fija una bomba al extremo abierto superior de la columna y se usa para aspirar y descargar la muestra de la columna. La bomba puede adoptar cualquiera de una variedad de formas, siempre que sea capaz de generar una presión de columna interna negativa para aspirar un fluido en el canal de columna a través del extremo inferior abierto. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la bomba también es capaz de generar una presión de columna interna positiva para descargar fluido del extremo inferior abierto. Alternativamente, se pueden usar otros métodos para descargar la solución de la columna, por ejemplo, centrifugación.
La bomba debe ser capaz de bombear líquido o gas, y debe ser lo suficientemente resistente como para poder extraer una solución de muestra deseada, una solución de lavado y/o un solvente de desorción a través del lecho de medios de extracción. Con el fin de evacuar líquidos del lecho relleno e introducir un gas tal como aire, es deseable que la bomba pueda soplar o extraer aire a través de la columna. Una bomba capaz de generar una fuerte presión podrá soplar gas de manera más efectiva a través de la columna, expulsando el líquido del volumen intersticial y contribuyendo a un analito más altamente purificado y concentrado.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la bomba es capaz de controlar el volumen de fluido aspirado y/o descargado de la columna, por ejemplo, un pipeteador. Esto permite la entrada y salida dosificada de solventes, lo que facilita volúmenes de elución más precisos para maximizar la recuperación y la concentración de la muestra.
Ejemplos no limitativos de bombas adecuadas incluyen un pipeteador, una jeringa, una bomba peristáltica, un recipiente presurizado, una bomba centrífuga, una bomba electrocinética o una bomba fluídica basada en inducción. Las bombas preferidas tienen buena precisión, buena exactitud y una histéresis mínima, pueden manipular pequeños volúmenes y pueden ser controladas directa o indirectamente por un ordenador u otro medio automatizado, de tal manera que la bomba puede ser utilizada para aspirar, infundir y/o manipular un volumen predeterminado de líquido. La exactitud y la precisión necesarias para la manipulación de fluidos variarán dependiendo de la etapa del proceso de extracción, del enriquecimiento de la biomolécula deseada y de las dimensiones de la columna de extracción y del volumen del lecho.
La solución de muestra entra en la columna por un extremo y pasa a través del lecho de extracción o de alguna porción de la longitud total del lecho de extracción, y finalmente sale del canal por el mismo extremo de la columna o por el otro extremo. La introducción de la solución de muestra en la columna se puede lograr mediante cualquiera de varias técnicas para expulsar o extraer líquido a través de un canal. Los ejemplos incluirían el uso de la gravedad de una bomba (como se ha descrito anteriormente), fuerza centrífuga, acción capilar o presión de gas para mover el fluido a través de la columna. La solución de muestra preferiblemente es movida a través del lecho de extracción a un caudal que permita un tiempo de contacto adecuado entre la muestra y la superficie de extracción. La solución de muestra se hace pasar a través del lecho más de una vez, ya sea haciendo circular la solución a través de la columna en la misma dirección dos o más veces, o haciendo pasar la muestra hacia atrás y hacia delante a través de la columna dos o más veces (por ejemplo, haciendo oscilar un tapón o una serie de tapones de solución de desorción a través del lecho). Es importante que la bomba pueda bombear aire, permitiendo de este modo que el líquido sea expulsado del lecho. Las bombas preferidas tienen buena precisión, buena exactitud y una histéresis mínima, pueden manipular pequeños volúmenes y pueden ser controladas directa o indirectamente por un ordenador u otro medio automatizado, de tal manera que la bomba puede ser utilizada para aspirar, infundir y/o manipular un volumen predeterminado de líquido. La exactitud y la precisión necesarias para la manipulación de fluidos en la columna variarán dependiendo de la etapa del proceso de extracción, del enriquecimiento de la biomolécula deseada y de las dimensiones de la columna.
Solventes
Las extracciones de la invención implican normalmente la carga del analito en una solución de muestra, un lavado opcional con una solución de enjuague y la elución del analito en una solución de desorción. La naturaleza de estas soluciones se describirá ahora con mayor detalle.
Con respecto a la solución de muestra, generalmente consiste en el analito disuelto en un solvente en el cual el analito es soluble, y en el cual el analito se unirá a la superficie de extracción. Preferiblemente, la unión es fuerte, dando como resultado la unión de una porción sustancial del analito y, de manera óptima, sustancialmente todo el analito se unirá bajo el protocolo de carga usado en el procedimiento. El solvente también debe ser suave, de modo que la estructura y función nativas del analito se conserven tras la desorción de la superficie de extracción. Por lo general, en el caso de que el analito sea una biomolécula, el solvente es una solución acuosa, que generalmente contiene un tampón, sal, y/o tensioactivos para solubilizar y estabilizar la biomolécula. Ejemplos de soluciones de muestra incluyen lisados de células, medio de crecimiento de hibridomas, mezclas de reacción de traducción o transcripción sin células, extractos de tejidos, órganos o muestras biológicas y extractos derivados de fluidos biológicos.
Es importante que el solvente de la muestra no solo solubilice el analito, sino que también sea compatible con la unión a la fase de extracción. Por ejemplo, cuando la fase de extracción se basa en el intercambio de iones, la fuerza iónica de la solución de muestra debe tamponarse a un pH apropiado de modo que la carga del analito sea opuesta a la del ion inmovilizado, y la fuerza iónica debe ser relativamente baja para favorecer la interacción iónica. En el caso de una extracción en fase normal, el solvente de carga de la muestra debe ser no polar, por ejemplo, hexano, tolueno o similar. Según la naturaleza de la muestra y el proceso de extracción, otros constituyentes pueden ser beneficiosos, por ejemplo, agentes reductores, detergentes, estabilizadores, desnaturalizantes, quelantes, metales, etc.
Se debe seleccionar una solución de lavado, si se usa, de tal manera que se eliminan los contaminantes no deseados con una pérdida o daño mínimo del analito unido. Las propiedades de la solución de lavado suelen ser intermedias entre las de las soluciones de muestra y de desorción.
El solvente de desorción se puede introducir como una corriente o un tapón de solvente. Si se usa un tapón de solvente, un tapón tampón de solvente puede seguir al tapón de desorción de modo que cuando la muestra se deposite en la diana, también se deposite un tampón para dar a la muestra depositada un pH adecuado. Un ejemplo de esto es la desorción de una superficie de proteína G de un anticuerpo IgG que se ha extraído de una solución de hibridoma. En este ejemplo, se usa un tapón de ácido fosfórico 10 mM a pH 2,5 para desorber la IgG del tubo. Un tapón tampón de fosfato 100 mM a pH 7,5 sigue al tapón de solvente de desorción para llevar la solución depositada a un pH neutro. A continuación, el material depositado puede analizarse, por ejemplo, mediante depósito en un chip SPR.
El solvente de desorción debe ser lo suficientemente resistente como para desorber cuantitativamente el analito y dejar atrás los materiales de interferencia fuertemente unidos. Los solventes se eligen para que sean compatibles con el analito y con el último método de detección. En general, los solventes utilizados son solventes convencionales conocidos. Los solventes típicos entre los que se puede seleccionar un solvente adecuado incluyen cloruro de metileno, acetonitrilo (con o sin pequeñas cantidades de modificadores básicos o ácidos), metanol (que contiene una mayor cantidad de modificador, por ejemplo, ácido acético o trietilamina, o mezclas de agua con metanol o acetonitrilo), acetato de etilo, cloroformo, hexano, isopropanol, acetona, tampón alcalino, tampón de alta fuerza iónica, tampón ácido, ácidos fuertes, bases fuertes, mezclas orgánicas con ácidos/bases, metanol ácido o básico, tetrahidrofurano y agua. El solvente de desorción puede tener una miscibilidad diferente a la del solvente de sorción.
En el caso de que la extracción implique la unión del analito a una molécula de ligando afín específica, por ejemplo, un metal inmovilizado, el solvente de desorción puede contener una molécula que interferirá con dicha unión, por ejemplo, imidazol o un quelante de metal en el caso del metal inmovilizado.
En las Tablas A y B se muestran ejemplos de fases adecuadas para la extracción en fase sólida y solventes de desorción.
Tabla A
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Tabla B
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II. Métodos de uso de las columnas de extracción
En general, la primera etapa en un proceso de extracción de esta invención implicará la introducción de una solución de muestra que contiene un analito de interés en un lecho relleno de medios de extracción, normalmente en forma de columna, tal como se ha descrito anteriormente. La muestra se puede introducir convenientemente en el lecho de separación bombeando la solución a través de la columna. Cabe señalar que el volumen de la solución de muestra puede ser mucho mayor que el volumen del lecho. La solución de muestra se puede hacer pasar opcionalmente a través de la columna más de una vez, por ejemplo, bombeándola hacia atrás y hacia delante a través del lecho. Esto puede mejorar la adsorción del analito, lo que puede suceder particularmente en los casos en que el analito es poco abundante y, por ende, se desea una máxima recuperación de la muestra.
Ciertas realizaciones de la invención son particularmente adecuadas para el procesamiento de muestras biológicas, donde el analito de interés es una biomolécula. De particular relevancia son las macromoléculas biológicas tales como polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos, o grandes complejos que contienen uno o más de estos restos.
La solución de muestra puede ser cualquier solución que contenga un analito de interés. La presente descripción es particularmente útil para la extracción y purificación de moléculas biológicas, por lo que la solución de muestra suele ser de origen biológico, por ejemplo, un lisado celular. En una realización de la invención, la solución de muestra es un sobrenadante de cultivo de células de hibridoma.
Una ventaja de usar las columnas de bajo volumen de lecho descritas anteriormente es que permiten una alta velocidad lineal del flujo de líquido a través de la columna (es decir, caudal lineal) sin la pérdida de rendimiento asociada y/o desarrollo de contrapresión observados con columnas más convencionales. Las altas velocidades lineales reducen el tiempo de carga. Debido a las altas velocidades lineales empleadas, es probable que la mayoría de las interacciones de carga estén en la superficie del material de extracción.
El caudal lineal a través de una columna en (cm/min) puede determinarse dividiendo el flujo volumétrico (en mL/min o cm3/min) por el área de la sección transversal (en cm2). Este cálculo implica que la columna está actuando como un tubo abierto, en el sentido de que el flujo de tampón/eluyentes está penetrando adecuadamente en los medios. Por tanto, por ejemplo, el caudal lineal de una separación que tiene un caudal volumétrico de 1 mL/min a través de una columna con un área de la sección transversal de 1 cm2 sería (1 mL/min)/(1 cm2) = 1 cm/min.
Una columna de puntas de pipeta a modo de ejemplo de la presente invención podría tener un volumen de lecho de 20 j l colocado en un tronco de ángulo recto (es decir, un cono invertido con la punta cortada, donde el diámetro inferior es de 1,2 mm y el diámetro superior es de 2,5 mm, y la altura aproximada del lecho es de 8 mm). El diámetro medio es de aproximadamente 1,8 mm, por lo que el área de la sección transversal media del lecho es de aproximadamente 0,025 cm2. A un caudal de 1 mL/min, el caudal lineal es (1 mL/min)/(0,025 cm2) = 40 cm/min. El área de la sección transversal media del lecho en la punta es de aproximadamente 0,011 cm2 y el caudal lineal en la punta es (1 mL/min)/(0,011 cm2) = 88 cm/min. Se trata de una característica de determinadas columnas de extracción de la invención que pueden ser efectivas en métodos que emplean un alto caudal lineal que supera los caudales utilizados anteriormente en los métodos de extracción convencionales. Por ejemplo, la invención proporciona métodos (y las columnas de extracción adecuadas) emplean caudales lineales superiores a 10 cm/min, 20 cm/min, 30 cm/min, 40 cm/min, 50 cm/min, 60 cm/min, 70 cm/min, 80 cm/min, 90 cm/min, 100 cm/min, 120 cm/min, 150 cm/min, 200 cm/min, 300 cm/min, o superiores. En diversas realizaciones de la invención se proporcionan métodos y columnas que emplean rangos de caudales lineales que tienen límites inferiores de 10 cm/min, 20 cm/min, 30 cm/min, 40 cm/min, 50 cm/min, 60 cm/min, 70 cm/min, 80 cm/min, 90 cm/min, 100 cm/min, 120 cm/min, 150 cm/min, o 200 cm/min; y límites superiores de 50 cm/min, 60 cm/min, 70 cm/min, 80 cm/min, 90 cm/min, 100 cm/min, 120 cm/min, 150 cm/min, 200 cm/min, 300 cm/min, o superiores.
Las columnas de la invención pueden adaptarse a una variedad de caudales, y la invención proporciona métodos que emplean un amplio rango de caudales, que a menudo varían en diferentes etapas del método. En diversas realizaciones, el caudal del líquido que pasa a través del lecho de medios cae dentro de un rango que tiene un límite inferior de 0,01 mL/min, 0,05 mL/min, 0,1 mL/min, 0,5 mL/min, 1 mL/min, 2 mL/min, o 4 mL/min y un límite superior de 0,1 mL/min, 0,5 mL/min, 1 mL/min, 2 mL/min, 4 mL/min, 6 mL/min, 10 mL/min o superior. Por ejemplo, algunas realizaciones de la invención implican hacer pasar un líquido a través de un lecho relleno de medios que tiene un volumen inferior a 100 j l a un caudal de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 4 mL/min, o entre aproximadamente 0,5 y 2 mL/min, por ejemplo, un pequeño lecho relleno de medios de extracción como se describe en otra parte de esta invención. En otro ejemplo, otras realizaciones de la invención implican hacer pasar un líquido a través de un lecho relleno de medios que tiene un volumen inferior a 25 j l a un caudal de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 4 mL/min, o entre aproximadamente 0,5 y 2 mL/min.
En algunos casos, es deseable realizar una o más etapas de un proceso de purificación a un caudal relativamente lento, por ejemplo, la carga y/o etapas de lavado, para maximizar la unión de un analito de interés a un medio de extracción. Para facilitar tales métodos, en ciertas realizaciones, la invención proporciona una pipeta que comprende un cuerpo; un microprocesador; un accionador accionado eléctricamente dispuesto dentro del cuerpo, el accionador en comunicación con el microprocesador y controlado por el mismo; un conjunto de desplazamiento que incluye un pistón de desplazamiento móvil dentro de un extremo de un cilindro de desplazamiento que tiene una cámara de desplazamiento y que tiene otro extremo con una abertura, donde dicho pistón de desplazamiento está conectado al accionador y controlado por dicho accionador; y una punta de pipeta en comunicación con dicha abertura, donde el microprocesador es programable para provocar el movimiento del pistón en el cilindro a una velocidad que resulta en la extracción de un líquido en la punta de la pipeta con un flujo deseado cuando la punta está en comunicación con el líquido. El caudal puede ser relativamente lento, tal como los caudales lentos descritos anteriormente, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 y 4 mL/min.
La punta de pipeta es una columna de puntas de pipeta de la invención, por ejemplo, una punta de pipeta que comprende un cuerpo de punta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de la punta; una frita inferior unida y que se extiende a través del canal abierto; una frita superior unida y que se extiende a través del canal abierto entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de la punta, donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de la columna definen una cámara de medios; y un lecho de medios colocado dentro de la cámara de medios.
En algunas realizaciones, el microprocesador es externo al cuerpo del pipeteador, por ejemplo, un PC externo programado para controlar un procedimiento de procesamiento de muestras. En algunas realizaciones, el pistón es accionado por un motor, por ejemplo, un motor paso a paso.
La invención proporciona un pipeteador (tal como un pipeteador multicanal) adecuado para actuar como bomba en métodos tales como los descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el pipeteador comprende un accionador accionado eléctricamente. El accionador accionado eléctricamente puede ser controlado por un microprocesador, por ejemplo, un microprocesador programable. En diversas realizaciones, el microprocesador puede ser interno o externo al cuerpo del pipeteador. En ciertas realizaciones, el microprocesador está programado para hacer pasar un volumen preseleccionado de solución a través del lecho de medios a un caudal preseleccionado.
La contrapresión de una columna dependerá del tamaño promedio de perla, de la distribución del tamaño de perla, de la longitud promedio del lecho, del área de la sección transversal promedio del lecho, de la contrapresión debida a la frita y de la viscosidad del caudal del líquido que pasa a través del lecho. Para un lecho de 10 ul descrito en esta solicitud, la contrapresión a un caudal de 2 mL/min varió de 0,5 a 2 psi (1 psi = 6,8948 kPa).
Otras dimensiones de las columnas darán como resultado contrapresiones que varían de, por ejemplo, 0,1 psi a 30 psi dependiendo de los parámetros descritos anteriormente. El caudal promedio varía de 0,05 mL/min a 10 mL/min, pero comúnmente estará en un rango de 0,1 a 2 mL/min con un caudal de 0,2-1 mL/min siendo el más común para las columnas de lecho de 10 ul.
En algunas realizaciones, la invención proporciona columnas caracterizadas por volúmenes de lecho pequeños, áreas de sección transversal promedio pequeñas, y/o bajas contrapresiones. Esto contrasta con las columnas previamente notificadas que tienen volúmenes de lecho pequeños pero tienen contrapresiones más altas, por ejemplo, para uso en HPLC. Los ejemplos incluyen contrapresiones en condiciones normales de funcionamiento (p. ej., 2 mL/min en una columna con lecho de 10 j L) menos de 2 psi. Una ventaja de las contrapresiones bajas es que las resinas blandas, por ejemplo, perlas a base de agarosa o sefarosa de baja reticulación, tienen una tendencia mucho menor a aplastarse. Debido a las bajas contrapresiones, muchas de estas columnas pueden funcionar usando solo la gravedad para impulsar la solución a través de la columna. Otras tecnologías que tienen contrapresiones más altas necesitan una presión más alta para impulsar la solución, por ejemplo, centrifugación a una velocidad relativamente alta. Esto limita el uso de este tipo de columnas a perlas de resina que pueden soportar esta presión sin aplastarse.
La expresión "área de la sección transversal" se refiere al área de una sección transversal del lecho de medios de extracción, es decir, una sección plana del lecho generalmente perpendicular al flujo de solución a través del lecho y paralela a las fritas. En el caso de un lecho cilíndrico o troncocónico, la sección transversal es, en general, circular, y el área de la sección transversal es simplemente el área del círculo (área = pi x r2). En las realizaciones de la invención donde el área de la sección transversal varía a lo largo del lecho, tal como en el caso de muchas de las realizaciones preferidas de la invención descritas en esta invención que tienen una forma troncocónica cónica, el área de la sección transversal promedio es un promedio de las áreas de sección transversal del lecho. Como buena aproximación, el área de la sección transversal media de un lecho troncocónico es la media de las secciones transversales circulares en cada extremo del lecho. El área de la sección transversal media del lecho de medios de extracción puede ser bastante pequeña en algunas de las columnas de la invención, particularmente en las columnas de baja contrapresión. Los ejemplos incluyen áreas de sección transversal inferiores a aproximadamente 100 mm2, inferiores a aproximadamente 50 mm2, inferiores a aproximadamente 20 mm2, inferiores a aproximadamente 10 mm2, inferiores a aproximadamente 5 mm2, o inferiores a aproximadamente 1 mm2. Por tanto, algunas realizaciones de la invención involucran rangos de contrapresiones que se extienden de un límite inferior de 0,1, 0,5, 1,2, 3, 5, 10 o 20 mm2 a un límite superior de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mm2.
Después de introducir la solución de muestra en el lecho y permitir que el analito se adsorba, la solución de muestra se evacua sustancialmente del lecho, dejando el analito unido. No es necesario que toda la solución de muestra sea evacuada del lecho, pero la diligencia en la eliminación de la solución puede mejorar la pureza del producto final. Una etapa de lavado opcional entre las etapas de adsorción y de desorción también puede mejorar la pureza del producto final. Por lo general, se usa agua o un tampón para la solución de lavado. La solución de lavado es preferiblemente una que, con una desorción mínima del analito de interés, eliminará el exceso de materiales de matriz, materiales ligeramente adsorbidos o no específicamente adsorbidos, para que no se desprendan en el ciclo de elución como contaminantes. El ciclo de lavado puede incluir solvente o solventes que tengan un pH específico, o que contengan componentes que promuevan la eliminación de materiales que interactúan ligeramente con la fase de extracción. En algunos casos, se pueden utilizar varios solventes de lavado en sucesión para eliminar material específico, por ejemplo, PBS seguido de agua. Estos ciclos se pueden repetir tantas veces como sea necesario. En otros casos, donde se puede tolerar una ligera contaminación, se puede omitir un ciclo de lavado.
En algunas realizaciones, antes de la desorción del analito de los medios de extracción, se hace pasar gas a través del lecho de extracción como un medio para desplazar el líquido del volumen intersticial del lecho. El gas puede comprender nitrógeno, por ejemplo, aire o nitrógeno puro. Este líquido normalmente se compone de una solución de muestra residual y/o una solución de lavado. Minimizando la presencia de esta solución no deseada del lecho antes de la introducción del solvente de desorción, es posible obtener una purificación y una concentración superiores a las que se podrían conseguir de otro modo. En algunas realizaciones de la invención, esta introducción de gas da como resultado que la mayor parte del volumen intersticial esté ocupado por gas (es decir, sin líquido). En algunas realizaciones, más del 70 %, el 80 %, el 90 % o incluso el 95 % por ciento del volumen intersticial está ocupado por gas. Si bien a menudo es deseable soplar la mayor cantidad posible de líquido libre del lecho, también es importante en muchos casos preservar la hidratación de las perlas, por ejemplo, en el caso de perlas de gel, tal como la agarosa. En algunos casos, la conservación de la hidratación de las perlas puede mejorar la estabilidad de los analitos unidos, en particular las biomoléculas. En estos casos se debe tener cuidado para evitar un secado excesivo del lecho durante la introducción del gas. La naturaleza del gas no suele ser crítica y, normalmente, el uso de aire es la forma más conveniente y económica de lograr la eliminación deseada de líquido del lecho.
La introducción de aire puede coincidir con la evacuación de la solución de muestra y/o la evacuación de la solución de lavado del lecho. Así, después de hacer pasar la solución por el lecho, la solución es expulsada con aire. Para lograr esto de la manera más efectiva, se debe usar una bomba que pueda bombear líquido con precisión y que también pueda soplar (o extraer) aire a través del lecho.
El volumen de solvente de desorción utilizado puede ser muy pequeño, aproximándose al volumen intersticial del lecho de medios de extracción. En realizaciones preferidas de la invención, la cantidad de solvente de desorción utilizada es menos de 10 veces mayor que el volumen intersticial del lecho de medios de extracción, más preferiblemente menos de 5 veces mayor que el volumen intersticial del lecho de medios de extracción, aún más preferiblemente menos de 3 veces mayor que el volumen intersticial del lecho de medios de extracción, aún más preferiblemente menos de 2 veces mayor que el volumen intersticial del lecho de medios de extracción, y lo más preferiblemente es igual o menor que el volumen intersticial volumen del lecho de medios de extracción. Por ejemplo, los rangos de volúmenes de solvente de desorción apropiados para usar con la invención pueden tener un límite inferior de 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 % o 300 % del volumen intersticial, y un límite superior de 50 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, o 1000 % del volumen intersticial, por ejemplo, 10 a 200 % del volumen intersticial, 20 a 100 % del volumen intersticial, 10 a 50 %, 100 % a 500 %, 200 a 1000 %, etc., del volumen intersticial.
Alternativamente, el volumen de solvente de desorción utilizado se puede cuantificar en términos de porcentaje del volumen del lecho (es decir, el volumen total de medios más el espacio intersticial) en lugar del porcentaje del volumen intersticial. Por ejemplo, los rangos de volúmenes de solvente de desorción apropiados para usar con la invención pueden tener un límite inferior de 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 % o 300 % del volumen de lecho, y un límite superior de 50 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, o 1000 % del volumen de lecho, por ejemplo, 10 a 200 % del volumen de lecho, 20 a 100 % del volumen de lecho, 10 a 50 %, 100 % a 500 %, 200 a 1000 %, etc., del volumen del lecho.
En algunas realizaciones de la invención, la cantidad de solvente de desorción que se introduce en la columna es inferior a 100 pl, inferior a 20 pl, inferior a 15 pl, inferior a 10 pl, inferior a 5 pl o inferior a 1 ul. Por ejemplo, los rangos de volúmenes de solvente de desorción apropiados para usar con la invención pueden tener un límite inferior de 0,1 pL, 0,2 pL, 0,3 pL, 0,5 pL, 1 pL, 2 pL, 3 pL, 5 pL o 10 pL, y un límite superior de 2 pL, 3 |jL, 5 pL, 10 pL, 15 pL, 20 pL, 30 pL, 50 pL o 100 pL, p. ej., entre 1 y 15 pL, 0,1 y 10 pL o 0,1 y 2 pL.
El uso de pequeños volúmenes de solución de desorción permite lograr altos factores de enriquecimiento en los métodos descritos. La expresión "factor de enriquecimiento", como se usa en el presente documento, se define como la relación del volumen de muestra dividido por el volumen de elución, suponiendo que no hay contribución de líquido proveniente del volumen muerto. En la medida en que el volumen muerto diluya los analitos o impida la adsorción completa, se reduce el factor de enriquecimiento. Por ejemplo, si se cargan 1000 pL de solución de muestra en la columna y el analito combinado se eluye en 10 pL de solución de desorción, el factor de enriquecimiento calculado es 100. cabe señalar que el factor de enriquecimiento calculado es el enriquecimiento máximo que se puede lograr con la captura y liberación completa del analito. Los enriquecimientos reales logrados normalmente disminuirán debido a la naturaleza incompleta de la mayoría de las etapas de unión y liberación. Diversas realizaciones de la invención pueden lograr rangos de factores de enriquecimiento que tienen un límite inferior de 1, 10, 100 o 1.000 y un límite superior de 10, 100, 1.000, 10.000 o 100.000.
A veces, para mejorar la recuperación, es deseable hacer pasar el solvente de desorción a través del lecho de extracción varias veces, por ejemplo, aspirando y descargando repetidamente el solvente de desorción a través del lecho de extracción y del extremo inferior de la columna. Se pueden realizar eluciones por etapas para eliminar materiales de interés de manera secuencial. Puede introducirse aire en el lecho en este momento (o en cualquier otro momento del procedimiento), pero debido a la necesidad de controlar el movimiento del líquido a través del lecho, no se prefiere.
El solvente de desorción variará según la naturaleza del analito y los medios de extracción. Por ejemplo, cuando el analito es una proteína marcada con his y los medios de extracción son una resina IMAC, la solución de desorción contendrá imidazol o similar para liberar la proteína de la resina. En algunos casos, la desorción se logra mediante un cambio en el pH o en la fuerza iónica, por ejemplo, usando una solución de desorción de bajo pH o alta fuerza iónica. Se puede llegar a una solución de desorción adecuada utilizando los conocimientos disponibles por parte de un experto en la técnica.
Las columnas y los dispositivos de extracción de la invención deben almacenarse en condiciones que preserven la integridad de los medios de extracción. Por ejemplo, las columnas que contienen medios de extracción a base de agarosa o sefarosa deben almacenarse en condiciones frías (por ejemplo, 4 grados Celsius) y en presencia de azida sódica al 0,01 por ciento o etanol al 20 por ciento. Antes de la extracción, se puede emplear una etapa de acondicionamiento. Esta etapa es para asegurarse de que la punta esté en una situación lista y uniforme, y puede implicar el tratamiento con un solvente y/o eliminación del exceso de líquido del lecho. Si se utilizan materiales de gel de agarosa o similares, el lecho debe mantenerse completamente hidratado antes de su uso.
A menudo es deseable automatizar el método de la invención. Para ello, la presente invención proporciona un dispositivo para realizar el método que comprende una columna que contiene un lecho relleno de medios de extracción, una bomba unida a un extremo de dicha columna y un medio automatizado para accionar la bomba.
Los medios automatizados para accionar la bomba pueden ser controlados mediante software. Este software controla la bomba y se puede programar para introducir los líquidos deseados en una columna, así como para evacuar el líquido mediante la introducción positiva de gas en la columna si así se desea.
Multiplexación
El método de la invención se puede ejecutar de manera paralela, por ejemplo, multiplexada. Esto permite el procesamiento paralelo y simultáneo de múltiples muestras. Se proporciona una descripción de la multiplexación de capilares de extracción en EE. UU.
Las Solicitudes de Patente de EE. UU. No. 10/434,713 y 10/733,534, y el mismo planteamiento general se pueden aplicar a las columnas y dispositivos de la invención del asunto.
La multiplexación se puede lograr, por ejemplo, disponiendo las columnas en paralelo de modo que el fluido pueda pasar a través de ellas al mismo tiempo. Cuando se utiliza una bomba para manipular fluidos a través de la columna, cada columna de la matriz e multiplexación puede tener su propia bomba, por ejemplo, bombas de jeringa activadas por un accionador común. Alternativamente, las columnas se pueden conectar a una bomba común, un dispositivo de vacío común o similar. En otro ejemplo de una disposición de multiplexación, la pluralidad de columnas está dispuesta de tal manera que se pueden centrifugar, siendo el fluido impulsado a través de las columnas por la fuerza centrífuga.
En una realización, la muestra se puede disponer desde una columna de extracción hasta una pluralidad de ubicaciones predeterminadas, por ejemplo, ubicaciones en un chip o en micropocillos en una placa de múltiples pocillos. Se puede utilizar un sistema de procesamiento de líquidos preciso para distribuir el volumen deseado de eluyente en cada ubicación. Por ejemplo, una columna de extracción que contiene analito unido absorbe 50 |jl de solvente de desorción, y las gotas de 1 j l se depositan en micropocillos utilizando un sistema robótico tal como los comercializados por las firmas Zymark (por ejemplo, el manipulador de muestras SciClone), Tecan (por ejemplo, el Genesis NPS, Aquarius o TeMo) o Distribución cartesiana (por ejemplo, el sistema de sobremesa Honeybee), Packard (por ejemplo, MiniTrak5, Evolution, Platetrack o Apricot), Beckman (por ejemplo, FX-96) y Matrix (por ejemplo, Plate Mate 2 o SerialMate). Esto se puede utilizar para ensayos de alto rendimiento, cristalizaciones, etc.
La figura 3 representa un ejemplo de un sistema de extracción multiplexada. El sistema incluye un soporte de jeringas 12 para sostener una serie de jeringas 14 (por ejemplo, jeringas de vidrio de 1 mL) y un soporte de émbolos 16 para acoplar los émbolos 18 con una bomba de jeringa 20. La bomba de jeringa incluye un tornillo 34 para mover el soporte del émbolo y una base estacionaria 36. La bomba de jeringa puede mover el soporte del émbolo hacia arriba y hacia abajo mientras el soporte de jeringa permanece estacionario, accionando por tanto simultáneamente todos los émbolos de jeringa fijados al soporte. Cada jeringa incluye un accesorio de fijación 21 para la fijación de una columna de extracción. Fijada a cada jeringa a través del accesorio hay una columna de extracción 22. La columna representada en esta realización emplea una punta de pipeta modificada para el cuerpo de columna, los filtros de membrana sirven como fritas superior e inferior 23 y 25, y el lecho de medios de extracción 24 es un lecho relleno de un medio de gel. El sistema también incluye una gradilla de muestras 26 con múltiples posiciones para contener viales de recogida de muestras 28, que pueden ser tubos eppendorf. La gradilla de muestras está montada de manera deslizable sobre dos varillas verticales, y la altura de la gradilla se puede ajustar deslizándola hacia arriba o hacia abajo de las varillas y bloqueando la gradilla en la ubicación deseada. La posición de la gradilla se puede ajustar para que el extremo inferior (la punta) de la columna entre en contacto con la solución en un tubo en la gradilla de eppendorf. El sistema también incluye un controlador 30 para controlar la bomba de jeringa. El controlador está conectado a un ordenador 32, que puede programarse para controlar el movimiento de la bomba a través del controlador. El controlador permite controlar cuándo y a qué velocidad se mueve la gradilla de émbolos, que a su vez se utiliza para controlar el flujo de solución a través de las columnas, la extracción y la infusión. El control de los émbolos puede ser manual o automatizado, mediante un archivo de comandos que puede crear un usuario. El software permite el control del caudal a través de las columnas, y un protocolo de extracción puede incluir múltiples ciclos de extracción e infusión, junto con retrasos opcionales entre ciclos.
En un ejemplo de un procedimiento de multiplexación, se sitúan 10 tubos eppendorf que contienen una muestra, por ejemplo, 50o pl de un lisado celular clarificado que contiene una proteína recombinante etiquetada con his, en la gradilla de muestras. Las jeringas de un mL se fijan en el soporte de jeringas y los émbolos se acoplan con el soporte de émbolos. Las columnas de extracción, por ejemplo, columnas de lecho relleno de bajo volumen muerto como en otras partes en esta invención, se fijan a los accesorios de fijación de jeringa. La punta se acondiciona expulsando la mayor parte de la solución de almacenamiento de la columna y reemplazándola con aire. La gradilla de muestras se eleva para que los extremos de las puntas de extracción entren en la muestra. La solución de muestra se extrae en las columnas mediante la acción de la bomba de jeringa, que eleva el soporte de émbolos y los émbolos. La bomba es preferiblemente capaz de aspirar con precisión un volumen deseado de solución a un caudal deseado, y de depositar y extraer solución a través de la columna. Un ejemplo de una bomba de jeringa adecuada es ME-100 (disponible en PhyNexus, Inc., San Jose, CA). El control del solvente líquido en la columna es opcionalmente bidireccional. En este caso, y cuando se usa una jeringa para controlar el líquido, la cabeza del émbolo de jeringa y el cuerpo de jeringa deben sujetarse firmemente dentro de la bomba de jeringa. Cuando se invierte la dirección del émbolo de la jeringa, puede haber un retraso o un efecto de histéresis antes de que la jeringa pueda comenzar a mover el líquido en el sentido opuesto. Este efecto es más importante a medida que se reduce el volumen de solvente. En el instrumento m E-100, la jeringa y el émbolo de jeringa están fijados de modo que no se pueda realizar ningún movimiento perceptible contra la gradilla de soportes.
Si el volumen de la muestra es mayor que el volumen intersticial del lecho, la muestra se introduce a través del lecho y en el cuerpo de columna por encima de la frita superior. A continuación, la solución de muestra se expulsa nuevamente en el recipiente de muestra. En algunas realizaciones no contempladas por la invención reivindicada, el proceso de extracción de la muestra a través del lecho y de nuevo al recipiente de muestras se realiza dos o más veces, cada una de las cuales da como resultado el paso de la muestra a través del lecho dos veces. Como se explicó en otra parte del presente documento, la adsorción de analitos se puede mejorar en algunos casos usando un caudal más lento y/o aumentando el número de pasos de la muestra a través de los medios de extracción.
A continuación se retira el recipiente de muestras y se reemplaza con un recipiente similar que contiene solución de lavado (por ejemplo, en el caso de una extracción de metal inmovilizado, imidazol 5 mM en PBS), y la solución de lavado se bombea hacia atrás y hacia delante a través del lecho de extracción (como fue el caso de la muestra). La etapa de lavado se puede repetir una o más veces con volúmenes adicionales de solución de lavado. Se puede emplear opcionalmente una serie de dos o más soluciones de lavado diferentes, por ejemplo, PBS seguido de agua.
Después de la etapa de lavado, el lecho de extracción se puede purgar opcionalmente con gas para eliminar la solución a granel del espacio intersticial. Opcionalmente, la jeringa se puede cambiar antes de la elución. Por ejemplo, las jeringas desechables de 1 mL utilizadas para la muestra y la solución de lavado se pueden reemplazar con jeringas Estancas al gas de 50 pl para la elución. A continuación, se llena la gradilla de muestras original (o una bandeja de recogida de muestras diferente) con viales de recogida de muestras (por ejemplos, tubos Eppendorf de 0,5 mL) y se ajusta la altura de los tubos de modo que los extremos inferiores de las columnas queden justo por encima de la parte inferior de los tubos de muestras individuales. Se sitúa una alícuota de solvente de desorción en el fondo de cada tubo (por ejemplo, 15 pl de imidazol 200 mM serían típicos para la elución de proteína de una columna de metal inmovilizado que tiene un volumen de lecho de aproximadamente 20 pl). La solución de elución se puede manipular hacia atrás y hacia delante a través del lecho varias veces mediante ciclos repetidos de aspiración y expulsión de la solución a través de la columna. El ciclo de elución se completa expulsando la solución de desorción de nuevo al vial de muestra. El proceso de elución puede repetirse, lo que en algunos casos permite una mejor recuperación de la muestra.
El proceso de extracción descrito anteriormente se puede automatizar, por ejemplo, usando software para programar el controlador informático para controlar el bombeo, por ejemplo, los volúmenes, caudales, retrasos y número de ciclos.
Eluciones escalonadas y multidimensionales
En algunas realizaciones de la invención, se realizan gradientes de solventes de desorción, eluciones por etapas y/o eluciones multidimensionales.
El uso de gradientes es bien conocido en la técnica de la cromatografía y se describe en detalle, por ejemplo, en una serie de referencias generales de cromatografía citadas en este documento. Tal como se aplica al método de la invención, el principio básico implica adsorber un analito en los medios de extracción y luego eluirlo con un gradiente de solvente de desorción. El gradiente se refiere al cambio de al menos una característica del solvente, por ejemplo, cambio de pH, fuerza iónica, polaridad, o la concentración de algún agente que influye en la fuerza de la interacción de unión. El gradiente puede ser con respecto a la concentración de una sustancia química, aquella entidad que interfiere o estabiliza una interacción, particularmente una interacción de unión específica. Por ejemplo, cuando el agente de unión por afinidad es un metal inmovilizado, el gradiente puede estar en la concentración de imidazol, EDTA, etc. En algunas realizaciones, el resultado es el fraccionamiento de una muestra, útil en contextos como la proteómica de escopeta sin gel.
Como se usa en el presente documento, el término "dimensión" se refiere a alguna propiedad del solvente de desorción que varía, por ejemplo, pH, fuerza iónica, etc. Un esquema de elución que involucra la variación de dos o más dimensiones, ya sea simultáneamente o secuencialmente, se denomina elución multidimensional.
Los gradientes utilizados en el contexto de la invención pueden ser eluciones por etapas. En una realización, se realizan dos o más etapas de elución utilizando diferentes solventes de desorción (es decir, solventes de elución) que varían en una o más dimensiones. Por ejemplo, los dos o más solventes pueden variar en pH, fuerza iónica, hidrofobicidad o similares. El volumen de la solución de desorción utilizada en cada dimensión puede ser bastante pequeño y puede pasar de atrás a adelante a través del lecho de medios de extracción varias veces, y a una velocidad que conduce a la máxima recuperación del analito deseado. Opcionalmente, la columna se puede purgar con gas antes de las etapas en el gradiente.
En algunas realizaciones de la invención se emplea una extracción en fase sólida por etapas multidimensional. Esto es particularmente útil en el análisis de péptidos etiquetados por afinidad codificados por isótopos (ICAT), como se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. No.10/434,713 y en las referencias citadas en la misma. Una extracción multidimensional implica variar al menos dos dimensiones de la condición de desorción.
En un ejemplo típico, se realiza una elución por etapas en una dimensión, recogiendo fracciones para cada cambio en las condiciones de elución. Por ejemplo, podría emplearse un aumento gradual de la fuerza iónica cuando la fase de extracción se basa en el intercambio iónico. Luego, las fracciones eluídas se introducen en una segunda columna de extracción (ya sea directamente o después de la recogida en un recipiente intermedio) y, en este caso, se separan en otra dimensión, por ejemplo, por fase inversa o por unión a un grupo de unión por afinidad como la avidina o metal inmovilizado.
En algunas realizaciones, una o más dimensiones de una extracción multidimensional se logran por medios distintos a una columna de extracción de la invención. Por ejemplo, la separación de la primera dimensión podría lograrse usando cromatografía convencional, electroforesis o similares, y luego cargando las fracciones en una columna de extracción para la separación en otra dimensión.
Cabe señalar que, en muchos casos, la elución de una proteína no será un simple proceso intermitente. Es decir, algunos tampones de desorción darán como resultado solo una liberación parcial de analito. La composición del tampón de desorción se puede optimizar para obtener el resultado deseado, por ejemplo, elución completa o casi completa. Alternativamente, cuando se emplea la elución por etapas, dos o más etapas sucesivas en la elución pueden dar como resultado una elución incremental de una fracción de un analito. Estas eluciones parciales incrementales pueden ser útiles para caracterizar el analito, por ejemplo, en el análisis de un complejo multiproteico, como se describe a continuación.
Purificación de clases de proteínas
Las columnas de extracción se pueden usar para purificar clases completas de proteínas sobre la base de motivos altamente conservados dentro de su estructura, por lo que se usa un agente de unión por afinidad que se une reversiblemente al motivo conservado. Por ejemplo, es posible inmovilizar nucleótidos particulares en los medios de extracción. Estos nucleótidos incluyen adenosina 5'-trifosfato (ATP), adenosina 5'-difosfato (ADP), adenosina 5'-monofosfato (AMP), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) o nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP). Estos nucleótidos se pueden usar para la purificación de enzimas que dependen de estos nucleótidos, tales como quinasas, fosfatasas, proteínas de choque térmico y deshidrogenasas, por nombrar algunas.
Existen otros grupos de afinidad que se pueden inmovilizar en los medios de extracción para la purificación de clases de proteínas. Se pueden emplear lectinas para la purificación de glicoproteínas. La concanavilina A (Con A) y la lectina de lentejas pueden ser inmovilizadas para la purificación de glicoproteínas y proteínas de membrana, y la lectina de germen de trigo puede usarse para la purificación de glicoproteínas y células (especialmente linfocitos de células T). Aunque no es una lectina, la molécula pequeña de ácido fenilborónico también puede ser inmovilizada y utilizada para la purificación de glicoproteínas.
También es posible inmovilizar heparina, que es útil para la purificación de proteínas de unión al ADN (p. ej., ARN polimerasa I, II y III, ADN polimerasa, ADN ligasa). Además, la heparina inmovilizada se puede utilizar para la purificación de diversas proteínas de la coagulación (p. ej., antitrombina III, factor VII, factor IX, factor XI, factor XII y XIIa, trombina), otras proteínas plasmáticas (p. ej., owndina, BetaIH, fibronectina, lipasas), lipoproteínas (p. ej., VLDL, LDL, apoproteína v Ld L, HOLP, por nombrar algunas) y otras proteínas (factor plaquetario 4, antígeno de superficie de la hepatitis B, hialuronidasa). Estos tipos de proteínas a menudo son transmitidas a través de la sangre y/o el plasma. Puesto que se están realizando muchos esfuerzos para perfilar rápidamente los niveles de estos tipos de proteínas mediante tecnologías tales como los chips de proteínas, el rendimiento de estos chips se mejorará realizando una purificación inicial y un enriquecimiento de las dianas antes del análisis del chip de proteínas.
También es posible unir dominios de interacción de proteínas a medios de extracción para la purificación de aquellas proteínas que están destinadas a interactuar con ese dominio. Un dominio de interacción que se puede inmovilizar en los medios de extracción es el dominio Srchomology 2 (SH2) que se une a motivos peptídicos específicos que contienen fosfotirosina dentro de diversas proteínas. El dominio SH2 se ha inmovilizado previamente en una resina y se ha utilizado como reactivo de afinidad por realizar experimentos de afinidad cromatográfica/espectrometría de masas, para investigar la fosforilación in vitro del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (véase el documento de Christian Lombardo, et al., Biochemistry, 34:16456 (1995)). Además del dominio SH2, se pueden inmovilizar otros dominios de interacción de proteínas, con el fin de purificar aquellas proteínas que poseen sus dominios de reconocimiento. Se han descrito muchos de estos dominios de interacción de proteínas (véase el documento de Tony Pawson, Protein Interaction Domains, Cell Signaling Technology Catalog, 264-279 (2002)) como ejemplos adicionales de estos dominios de interacción de proteínas).
Como otro ligando de afinidad específico de clase, la benzamidina se puede inmovilizar en los medios de extracción para la purificación de proteasas de serina. El ligando colorante Procion Red HE-3B se puede inmovilizar para la purificación de deshidrogenasas, reductasas e interferón, por nombrar algunos.
En otro ejemplo, péptidos sintéticos, análogos de péptidos y/o derivados de péptidos pueden usarse para purificar proteínas, clases de proteínas y otras biomoléculas que reconocen específicamente péptidos. Por ejemplo, ciertas clases de proteasas reconocen secuencias específicas, y las clases de proteasas pueden purificarse basándose en su reconocimiento de un agente de unión por afinidad basado en un péptido particular.
Complejos multiproteicos
En ciertas realizaciones, el método de la invención se usa para extraer y/o procesar complejos multiproteicos. Esto se logra típicamente mediante el empleo de una solución de muestra que no se desnaturaliza lo suficiente como para que no resulte en la interrupción de un complejo proteico o complejos de interés, es decir, el complejo se extrae de una muestra biológica usando una solución de muestra y condiciones de extracción que estabilizan la asociación entre los constituyentes del complejo. Como se usa en el presente documento, el término complejo multiproteico se refiere a un complejo de dos o más proteínas unidas por fuerzas químicas mutuamente atractivas, normalmente interacciones no covalentes. Los enlaces covalentes normalmente serían reversibles, lo que permitiría la recuperación de las proteínas componentes.
En algunas realizaciones, el complejo multiproteico se adsorbe en la superficie de extracción y se desorbe en condiciones tales que la integridad del complejo se mantiene en todo momento. Es decir, el producto de la extracción es el complejo intacto, que luego se puede recoger y almacenar, o analizar directamente (ya sea como un complejo o una mezcla de proteínas), por ejemplo mediante cualquiera de las metodologías analíticas descritas en este documento.
Un ejemplo implica el uso de una proteína "cebo" recombinante que formará complejos con sus compañeros de interacción naturales. Estos complejos multiproteicos luego se purifican a través de una etiqueta de fusión que se adjunta al "cebo". Estas proteínas marcadas como "cebo" se pueden purificar por medio de reactivos de afinidad tales como grupos de quelatos metálicos, anticuerpos, calmodulina o cualquiera de los otros grupos de superficie empleados para la purificación de proteínas recombinantes. A continuación, la identidad de las proteínas afines se puede determinar mediante cualquiera de una variedad de medios, tal como MS.
También es posible purificar complejos de proteínas "nativas" (es decir, no recombinantes) sin tener que purificar a través de una etiqueta de fusión. Por ejemplo, esto se puede lograr usando como reactivo de unión por afinidad un anticuerpo para una de las proteínas dentro del complejo multiproteico. Este proceso a menudo se denomina "inmunoprecipitación conjunta". Los complejos multiproteicos se pueden eluir, por ejemplo, por medio de un tampón de pH bajo.
A continuación, el complejo multiproteico se carga en la columna como un complejo, y el complejo completo o uno o más constituyentes se desorben y eluyen. Alternativamente, primero se adsorben uno o más constituyentes complejos en la superficie de extracción y, posteriormente, se aplican uno o más constituyentes a la superficie de extracción, de tal manera que se produce la formación de complejos en la superficie de extracción.
El método de la invención se puede utilizar como una herramienta para analizar la naturaleza del complejo. Por ejemplo, el complejo proteico se desorbe en la superficie de extracción y luego se controla el estado del complejo en función de la variación del solvente. Puede emplearse un solvente de desorción, o una serie de solventes de desorción, que dan como resultado la interrupción de algunas o todas las interacciones que mantienen unido el complejo, por lo que se libera un subconjunto del complejo mientras que el resto permanece adsorbido. La identidad y el estado (p. ej., modificaciones postranslacionales de las proteínas liberadas pueden determinarse a menudo, utilizando, por ejemplo, MS. Así, de esta manera los constituyentes y/o los subcomplejos de un complejo proteico se pueden eluir y analizar individualmente. La naturaleza del solvente de desorción se puede ajustar para favorecer o desfavorecer las interacciones que mantienen unidos los complejos proteicos, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, fuerzas de van der Waals e interacciones covalentes, por ejemplo, puentes disulfuro. Por ejemplo, al disminuir la polaridad de un solvente de desorción, las interacciones hidrófobas se debilitarán; la inclusión de un agente reductor (como mercaptoetanol o ditiotritol) romperá los puentes disulfuro. Otras variaciones de la solución incluirían alteración del pH, cambio en la fuerza iónica, y/o la inclusión de un constituyente que afecta de manera específica o no específica las interacciones proteína-proteína, o la interacción de una proteína o un complejo proteico con una biomolécula no proteica.
Se pueden usar secuencialmente una serie de dos o más solventes de desorción, y el eluyente se monitoriza para determinar qué constituyentes proteicos se desprenden en un solvente particular. De esta manera es posible evaluar la fuerza y la naturaleza de las interacciones en el complejo. Por ejemplo, si se utilizan una serie de solventes de desorción de fuerza creciente (p. ej., fuerza iónica creciente, polaridad decreciente, cambio de pH, cambio en la composición iónica, etc.), las proteínas o los subcomplejos unidos con menor fuerza se eluirán primero, con complejos unidos más fuertemente eluyéndose solo a medida que aumenta la fuerza del solvente de desorción.
Al menos una de las soluciones de desorción utilizadas puede contener un agente que efectúe interacciones iónicas. El agente puede ser una molécula que participa en una interacción específica entre dos o más constituyentes proteicos de un complejo multiproteico, por ejemplo, el ATP de Mg favorece la interacción y la unión mutua de ciertas proteínas afines. Otros agentes que pueden afectar a las interacciones proteicas son los desnaturalizantes tales como la urea, el cloruro de guanadinio y el isotiocianato, los detergentes como el tritón X-100, los grupos quelantes como el EDTA, etc.
En otros conjuntos de experimentos, la integridad de un complejo proteico puede probarse mediante modificaciones (p. ej., postranslacionales o mutaciones) en una o más de las proteínas. Usando los métodos descritos en este documento, se puede determinar el efecto de la modificación sobre la estabilidad u otras propiedades del complejo.
En algunas realizaciones, la invención se emplea para analizar complejos multiproteicos.
Recuperación de proteínas nativas
Los métodos de la invención pueden usarse para purificar proteínas que son funcionales, activas y/o en su estado nativo, es decir, no desnaturalizados. Esto se logra realizando el proceso de extracción en condiciones no desnaturalizantes. Las condiciones no desnaturalizantes abarcan todo el proceso de extracción de proteínas, incluida la solución de muestra, la solución de lavado (si se usa), la solución de desorción, la fase de extracción y las condiciones en las que se realiza la extracción. Los parámetros generales que influyen en la estabilidad de las proteínas son bien conocidos en la técnica e incluyen la temperatura (por lo general, se prefieren temperaturas más bajas), el pH, la fuerza iónica, el uso de agentes reductores, tensioactivos, eliminación de la actividad de la proteasa, protección contra la rotura o cizalladura física, radiación, etc. Las condiciones particulares más adecuadas para una proteína, clase de proteínas o composición que contiene proteínas en particular varían algo de una proteína a otra.
Un aspecto particular de la tecnología de extracción de la invención que facilita la extracción sin desnaturalización es que el proceso se puede realizar a bajas temperaturas. En particular, debido a que el flujo de la solución a través de la columna se puede realizar sin introducir calor, por ejemplo, sin la introducción de corriente eléctrica o la generación de calor de Joule que normalmente acompaña a los procesos capilares que involucran cromatografía o flujo electroosmótico, el proceso se puede llevar a cabo a temperaturas más bajas. La temperatura más baja podría ser la temperatura ambiental, o incluso más baja, por ejemplo, si el proceso se lleva a cabo en una cámara frigorífica, o si se usa un aparato de enfriamiento para enfriar el capilar. Por ejemplo, las extracciones se pueden realizar a una temperatura tan baja como 0 °C, 2 °C o 4 °C, por ejemplo, en un rango tal como de 0 °C a 30 °C, de 0°C a 20 °C, de 2 °C a 30 °C, de 2 °C a 20 °C, de 4 °C a 30 °C, o de 4 °C a 20 °C.
Otra ventaja de la extracción como se describe en el presente documento que permite la purificación de proteínas nativas es que el proceso de extracción se puede completar rápidamente, lo que permite una rápida separación de una proteína de las proteasas u otros agentes desnaturalizantes presentes en la solución de muestra. La velocidad del proceso permite llevar rápidamente la proteína de la solución de muestra al dispositivo analítico para el que está destinada, o a condiciones de almacenamiento que favorecen la estabilidad de la proteína. Las extracciones de proteínas de la invención se pueden realizar en menos de 1 minuto, menos de 2 minutos, menos de 5 minutos, menos de 10 minutos, menos de 15 minutos, menos de 20 minutos, menos de 60 minutos o menos de 120 minutos.
La proteína extraída a veces es estabilizada manteniéndola hidratada durante el proceso de extracción. Por ejemplo, si se usa una etapa de purga para eliminar líquido a granel (es decir, segmentos de líquido) de la columna antes de la extracción, se debe tener cuidado para garantizar que el gas no pase a través del lecho durante un tiempo excesivo, evitando así que se sequen los medios de extracción y, posiblemente, la desolvatación de la fase de extracción y/o la proteína.
En otra realización, el método de la invención se realiza en condiciones que no desnaturalizan irreversiblemente la proteína. Por lo tanto, incluso si la proteína se eluye en un estado desnaturalizado, la proteína se puede renaturalizar para recuperar la proteína nativa y/o la proteína funcional. La proteína es adsorbida a la superficie de extracción en condiciones que no desnaturalizan irreversiblemente la proteína, y eluyen la proteína en condiciones que no desnaturalizan irreversiblemente la proteína. Las condiciones requeridas para evitar la desnaturalización irreversible son similares a las que no son desnaturalizantes, pero en algunos casos los requisitos no son tan estrictos. Por ejemplo, la presencia de un desnaturalizante tal como la urea, el isotiocianato o el cloruro de guanidinio, puede provocar una desnaturalización reversible. La proteína eluida se desnaturaliza, pero la proteína nativa se puede recuperar utilizando técnicas conocidas en la técnica, tales como la diálisis, para eliminar el desnaturalizante. Asimismo, ciertas condiciones de pH o condiciones iónicas pueden dar como resultado una desnaturalización reversible, que se revierte fácilmente alterando el pH o la composición del tampón de la proteína eluida.
La recuperación de proteína no desnaturalizada, nativa, funcional y/o activa es particularmente útil como etapa preparatoria para su uso en procesos que requieren que la proteína sea desnaturalizada para que el proceso tenga éxito. Ejemplos no limitativos de dichos procesos incluyen métodos analíticos tales como estudios de unión, ensayos de actividad, ensayos enzimáticos, cristalografía de rayos X y RMN.
La invención también puede ser utilizada para estabilizar el ARN. Esto se puede lograr separando el ARN de una parte o, sustancialmente, de toda la actividad de la ARNasa, enzimática o de otro tipo, que podría estar presente en una solución de muestra. En un ejemplo, el propio ARN se extrae y, por lo tanto, se separa de la ARNasa en la muestra. En otro ejemplo, la actividad de la ARNasa se extrae de una solución, fluyendo el ARN estabilizado a través de la columna. La extracción de ARN puede ser específica para una secuencia o no específica para una secuencia. La extracción de actividad de la ARNasa puede ser específica para una ARNasa particular o una clase de ARNasa, o puede ser general, por ejemplo, extracción de proteínas o subconjunto de proteínas.
Técnicas analíticas
El método de la invención encuentra una utilidad particular en la preparación de muestras de analito para análisis o detección mediante una variedad de técnicas analíticas. En particular, los métodos son útiles para la purificación de un analito, de una clase de analitos, de un agregado de analitos, etc., a partir de una muestra biológica, por ejemplo, una biomolécula que se origina en un fluido biológico. Es particularmente útil para usar con técnicas que requieren pequeños volúmenes de analito puro y concentrado. En muchos casos, los resultados de estas formas de análisis mejoran aumentando la concentración del analito. En algunas realizaciones de la invención, el analito de interés es una proteína y la extracción sirve para purificar y concentrar la proteína antes del análisis. Los métodos son particularmente adecuados para su uso con métodos de detección sin etiquetas o métodos que requieren una proteína funcional, nativa (es decir, no desnaturalizada), pero, en general, son útiles para cualquier proteína o ácido nucleico de interés.
Estos métodos son particularmente adecuados para su aplicación en estudios proteómicos, el estudio de interacciones proteína-proteína y similares. La explicación de las redes de interacción proteína-proteína, preferiblemente junto con otros tipos de datos, permite la asignación de funciones celulares a nuevas proteínas y la obtención de nuevas rutas biológicas. Véase, por ejemplo, el documento Curr Protein Pept Sci. 2003 4(3):159-81.
Muchas de las metodologías analíticas y de detección actuales se pueden aplicar a volúmenes de muestra muy pequeños, pero a menudo requieren que el analito sea enriquecido y purificado para lograr resultados aceptables. Las tecnologías convencionales de preparación de muestras suelen funcionar a mayor escala, lo que genera desperdicios porque producen más volumen del necesario. Esto es particularmente un problema cuando la cantidad de muestra inicial es limitada, como es el caso de muchas biomoléculas. Estos métodos convencionales, en general, no son adecuados para trabajar con los pequeños volúmenes requeridos por estas nuevas metodologías. Por ejemplo, el uso de técnicas convencionales de cromatografía de lecho relleno tiende a requerir mayores volúmenes de solvente y no son adecuadas para trabajar con volúmenes de muestra tan pequeños por varias razones, por ejemplo, debido a la pérdida de muestra en volúmenes muertos, en fritas, etc. Véase la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 10/434,713 para una explicación más profunda de los problemas asociados con tecnologías anteriores en relación con el enriquecimiento y la purificación de biomoléculas de baja abundancia.
En ciertas realizaciones, el método de la invención implica el análisis directo del analito eluido de una columna de extracción sin ninguna etapa intermedia de procesamiento de la muestra, por ejemplo, concentración, desalinización o similar, siempre que el método esté diseñado correctamente. Así, por ejemplo, se puede eluir una muestra de una columna y analizarla directamente mediante MS, SPR o similares. Esta es una clara ventaja sobre otros métodos de preparación de muestras que requieren concentración, desalinización u otras etapas de procesamiento antes del análisis. Estas etapas adicionales pueden aumentar el tiempo y la complejidad del experimento, y pueden dar como resultado una pérdida significativa de muestras, lo que plantea un problema importante cuando se trabaja con analitos de baja abundancia y volúmenes pequeños.
Un ejemplo de una técnica analítica de este tipo es la espectroscopia de masas (MS). En la aplicación de la espectrometría de masas para el análisis de biomoléculas, las moléculas se transfieren de las fases líquida o sólida a la fase gaseosa y a la fase de vacío. Puesto que muchas biomoléculas son grandes y frágiles (las proteínas son un buen ejemplo), dos de los métodos más efectivos para su transferencia a la fase de vacío son la ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) o la ionización por electropulverización (ESI). Algunos aspectos del uso de estos métodos y los requisitos de preparación de muestras se analizan con más detalle en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 10/434,713. En general, ESI es más sensible, mientras que MALDI es más rápida. Significativamente, algunos péptidos se ionizan mejor en modo MALDI que en ESI y viceversa (Genome Technology, junio de 220, pág. 52). Los métodos y dispositivos de extracción de la presente invención son particularmente adecuados para preparar muestras para análisis de MS, especialmente muestras de biomoléculas tales como proteínas. Una ventaja importante de la invención es que permite la preparación de una muestra enriquecida que puede ser analizada directamente, sin necesidad de etapas intermedias del proceso, por ejemplo, concentración o desalinización.
El método de la invención es útil para preparar muestras de proteínas para cristalización, particularmente para su uso en la determinación de la estructura de proteínas basada en cristalografía de rayos X. La invención es particularmente adecuada para la preparación de muestras para su uso en relación con métodos de cristalización de proteínas de alto rendimiento. Otras técnicas analíticas particularmente adecuadas para su uso junto con ciertas realizaciones de la invención incluyen ensayos inmovilizados en superficie, ensayos inmunológicos, diversos desplazamientos de ligandos/ensayos de competencia, pruebas genéticas directas, métodos biofísicos, mediciones de fuerza directa, RMN, microscopía electrónica (incluida la crio-EM), microcalorimetría, espectroscopia de masas, IR y otros métodos tales como los explicados en el contexto de los chips de detección de unión, pero que también pueden ser utilizados en contextos sin chips.
Ajuste y control de la presión de descarga de columna
Diversas realizaciones de la presente invención emplean columnas de puntas de pipeta de lecho relleno del siguiente formato, como se ilustra en la figura 5. Las columnas emplean una punta de pipeta o una punta de pipeta modificada como cuerpo de columna. El cuerpo de columna tiene un extremo superior abierto 202 para comunicación con una bomba 204 (por ejemplo, un pipeteador o un canal de un pipeteador multicanal, fijado al extremo superior abierto mediante un accesorio de sellado), un extremo inferior abierto 206 para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna. Una frita inferior 210 está fijada al conducto abierto y se extiende a través del mismo. En la ilustración, la frita inferior está posicionada en el propio extremo inferior abierto, es decir, en el extremo inferior del cuerpo de columna. Si bien este posicionamiento se prefiere en muchos casos, en realizaciones alternativas, la frita podría fijarse en una posición que abarque el conducto abierto a cierta distancia del extremo terminal o del extremo inferior abierto. Como resultado del posicionamiento y fijación de la frita, sustancialmente cualquier líquido que entre o salga del conducto abierto a través del extremo inferior abierto pasará a través de la frita.
La columna incluye, además, una frita superior 212 que está unida al conducto abierto y se extiende a través del mismo entre la frita inferior 210 y el extremo superior abierto 202. La frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto abierto definen una cámara de medios 216 que contiene un lecho relleno de medios, por ejemplo, un lecho relleno de medios de extracción que tiene afinidad por un analito de interés. La columna incluye además un espacio libre superior 208, definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y el accesorio de bomba 214. En una realización típica de la invención, el volumen del espacio libre superior es sustancialmente superior al volumen de la cámara de medios. El espacio libre superior está abierto y puede alojar líquido y/o gas que entra por el extremo inferior abierto y la cámara de medios.
El paso de fluido a través del lecho de medios de extracción se controla mediante la bomba 204. La bomba está fijada de manera estanca a la parte superior abierta 202, es decir, se forma una junta de estanqueidad entre el accesorio de bomba 214 y el extremo superior abierto, de tal manera que la bomba puede bombear gas hacia adentro o hacia afuera del espacio libre superior, lo que afecta a la presión en el espacio libre superior, es decir, a la presión de descarga. En realizaciones alternativas, la fijación del extremo superior abierto a la bomba puede ser directa o indirecta, por ejemplo, la fijación puede ser a través de válvulas, accesorios, mangueras, etc., siempre que la fijación esté operativa y el accionamiento de la bomba afecte a la presión de descarga, lo que hace que el fluido sea extraído o expulsado del lecho de medios.
En algunas realizaciones de la invención, la combinación de columna y bomba ilustrada en la figura 5 se usa para hacer pasar un líquido hacia atrás y hacia delante a través del lecho relleno de medios. El extremo inferior abierto se pone en contacto con el líquido y se activa la bomba para extraer el líquido en el extremo inferior abierto y a través del lecho relleno de medios, es decir, mediante la generación de una presión negativa en el espacio libre superior con respecto a la presión ambiental. En muchas realizaciones, el volumen de líquido es sustancialmente superior al volumen intersticial del lecho de medios de extracción. El líquido pasa a través del lecho y se acumula en el espacio libre superior. A continuación, se activa la bomba para expulsar la totalidad o parte del líquido a través del lecho de medios y fuera del extremo inferior abierto, es decir, mediante la generación de una presión positiva en el espacio libre superior con respecto a la presión ambiental, por ejemplo, presión atmosférica. Este proceso normalmente se repite varias veces con una pluralidad de líquidos diferentes, por ejemplo, una solución de muestra que contiene un analito de interés, una solución o soluciones de lavado y una solución de desorción, en cualquiera de los diversos procesos descritos en el presente documento.
La expresión "presión ambiental" se refiere a la presión del aire fuera de la columna, normalmente la presión del aire atmosférico, o la presión del líquido en contacto con el extremo inferior abierto a bombear a través del medio. Durante el proceso de bombeo de líquido a través del lecho de medios, la presión de descarga a veces diferirá de la presión ambiental. Esto ocurre porque el accesorio de sellado de la bomba en el extremo abierto superior y el lecho de medios de extracción y fritas en el extremo abierto inferior impiden el flujo de gas hacia adentro y hacia afuera del espacio libre superior. Este es particularmente el caso cuando el espacio intersticial del lecho de medios está lleno de líquido y/o cuando la frita está húmeda.
Por ejemplo, con el fin de extraer un líquido a través de la frita inferior y en el lecho de medios de extracción, la bomba se usa para extraer aire del espacio libre superior, generando así una presión de descarga negativa relativa. Una vez que la presión de descarga se vuelve lo suficientemente negativa con respecto a la presión ambiental, se aspira líquido a través del extremo superior abierto. El flujo de líquido es resistido por la contrapresión de la columna y por los efectos de la tensión superficial dentro de la columna, particularmente en el lecho y en la interfaz del lecho y las fritas. La tensión superficial puede surgir de la interacción del líquido con el lecho relleno de medio y/o con la frita. Esta tensión superficial da como resultado una resistencia inicial al flujo de líquido a través del lecho de medios de extracción, que se describe en otra parte de esta invención como una forma de "punto de burbujeo". Como resultado, se debe generar un cierto umbral mínimo de presión de descarga negativa antes de que el líquido comience a fluir a través del lecho. Además, existe la contrapresión de la columna que debe superarse para que el líquido fluya a través del lecho. Por tanto, en el funcionamiento de la columna debe generarse una presión de descarga suficientemente negativa para superar los efectos de la contrapresión y la tensión superficial antes de que comience el flujo a través del lecho. Como resultado, pueden desarrollarse y mantenerse presiones de descarga negativas significativas; la magnitud de la presión de descarga dependerá en cierta medida de la contrapresión y de la tensión superficial que, a su vez, depende del tamaño del lecho, de la naturaleza de los medios, de la naturaleza del relleno, de la naturaleza de las fritas y de la interacción de las fritas con el lecho.
Asimismo, se genera una presión de descarga relativamente positiva con el fin de expulsar el líquido de la columna. La expulsión de líquido de la columna es resistida por los mismos efectos de contrapresión y tensión superficial descritos para la absorción de líquido. Como resultado, se pueden generar y mantener presiones de descarga positivas relativamente grandes mediante el accesorio de sellado en el extremo abierto superior y la resistencia al flujo de gas proporcionada por el lecho y las fritas.
Durante el transcurso de la realización de una purificación usando las columnas de la invención, la presión de descarga de cualquier columna dada variará durante el transcurso del proceso. Por ejemplo, considérese una realización donde se utilizan múltiples columnas de puntas de pipeta y un pipeteador multicanal programable. Las columnas se fijan por fricción a los accesorios del pipeteador, lo que puede generar una presión positiva inicial en el espacio libre superior. Esta presión positiva es el resultado de la compresión del espacio libre superior a medida que la columna es empujada aún más hacia el accesorio después de formar una junta de estanqueidad entre el extremo superior abierto y el accesorio. Esta presión positiva se puede mantener durante un período de tiempo sustancial, ya que la junta de estanqueidad y la contrapresión y la tensión superficial del lecho inhiben la salida de gas del espacio libre superior.
Con el fin de extraer líquido en el lecho, la bomba se utiliza para extraer gas del espacio libre superior, generando así una presión de descarga suficientemente negativa para superar los efectos de la contrapresión y la tensión superficial. Esto generará una presión negativa relativamente estable. Para expulsar el líquido, la bomba se usa para forzar el gas en el espacio libre superior, generando así una presión de descarga suficientemente positiva para superar los efectos de la contrapresión y la tensión superficial. Este proceso se repite a lo largo de cada ciclo de extracción y expulsión de líquido de la columna, y el proceso va acompañado de un ciclo de presiones de descarga negativas y positivas.
Cabe señalar que la presión de descarga al comienzo de cada etapa de bombeo, en general, no es una presión neutra o ambiental, sino una presión negativa o positiva resultante de una etapa de bombeo anterior, o de la fijación de la punta al pipeteador, o similares. Por ejemplo, considérese un procedimiento de purificación típico que implica hacer pasar una solución que contiene un analito a través de un lecho de extracción, seguido de una etapa de lavado y, finalmente, de desorción. Al comienzo de la etapa de desorción, en general, habrá una presión no neutra, por ejemplo, una presión residual positiva proveniente de la última etapa de expulsión de la solución de lavado. La magnitud de esta presión de descarga positiva es el resultado acumulativo de todas las etapas anteriores y dependerá en cierta medida de la naturaleza de la columna de puntas particular. Por ejemplo, cuanto mayor sea la resistencia al flujo que debe superar la bomba (es decir, la contrapresión y la tensión superficial de la columna en particular), mayor será la presión positiva que debe generarse en el espacio libre superior para expulsar el líquido de la columna. Con el fin de extraer el líquido de desorción en el lecho, la bomba debe extraer suficiente gas del espacio libre superior para compensar la presión positiva y crear una presión de descarga negativa suficiente para extraer la cantidad deseada de solución de desorción a través del lecho.
La figura 6 representa la relación entre la presión de descarga y la bomba y el movimiento del líquido en un proceso de extracción típico. Este gráfico particular representa una expulsión inicial de líquido de la columna y a continuación un ciclo de absorción y expulsión de líquido de la columna. El eje x es el tiempo y el eje y es la presión o el volumen. La línea continua en la parte superior representa la presión de descarga en función del tiempo, la línea discontinua representa el desplazamiento de un pipeteador (en este caso, una jeringa) y la línea discontinua en la parte inferior representa el volumen de líquido en una columna de puntas de pipeta. Se utiliza una jeringa como bomba; el movimiento del émbolo de la jeringa provoca un cambio en el volumen de la cámara de la jeringa, que se llena de aire y se conecta de manera estanca al extremo superior abierto de una columna de puntas, como se representa en la figura 5. En el momento cero, el volumen de líquido (por ejemplo, una solución acuosa) en la punta es de aproximadamente 60 ul, el volumen de la cámara de la jeringa es de aproximadamente 160 ul y la presión de descarga es de aproximadamente 10 pulgadas (254 mm) de agua. A medida que se presiona el émbolo de la jeringa, el volumen de la cámara de la jeringa disminuye, lo que hace que aumente la presión de descarga positiva. Este aumento en la presión principal hace que el líquido sea expulsado por el extremo inferior abierto de la columna, lo que da como resultado una disminución en el volumen de líquido en la columna. A medida que el volumen de líquido en la punta se acerca a cero, la presión de descarga comienza a fluctuar. En este momento, apenas sale líquido del lecho, pero aún queda algo de líquido en el espacio intersticial del lecho. La interacción de este líquido con el lecho y las fritas da como resultado un efecto de tensión superficial que impide el flujo de aire a través del lecho. A medida que el volumen de la cámara de la jeringa continúa disminuyendo, el aumento de la presión de descarga positiva acabará forzando el aire a través del lecho en forma de burbujas de aire. La tensión superficial en el lecho resiste el movimiento de las burbujas de aire a través del lecho, pero las burbujas de aire serán expulsadas una vez que se logre suficiente presión de descarga positiva. El paso de cada burbuja de aire a través del lecho y fuera de la columna dará como resultado una disminución en la presión de descarga. El resultado son grandes fluctuaciones en la presión de descarga a medida que se presiona el émbolo de la jeringa en estas condiciones; el volumen en la parte superior se acumula a medida que disminuye el volumen de la cámara de la jeringa, pero con cada burbuja de aire expulsada a través del lecho, la presión de descarga disminuirá. En muchos casos, se observan fluctuaciones importantes en la presión de descarga, como se representa en la figura 6, entre los momentos 1 y 2 (1 y 2 minutos). Cada pico representa la presión de descarga a la que una burbuja de aire fue forzada a salir de la columna.
En el momento 2, el volumen de la cámara de la jeringa es cero y el émbolo ahora está retraído, lo que da como resultado un aumento del volumen de la cámara de la jeringa con el tiempo. El aumento del volumen de la cámara de la jeringa se traduce en una disminución de la presión de descarga, lo que finalmente da como resultado una presión de descarga negativa en un tiempo de aproximadamente 2,5 Una vez que la presión de descarga es suficientemente negativa para superar los efectos de la tensión superficial y la contrapresión, el líquido comienza a fluir a través del lecho y regresa al espacio libre superior. En el momento 4, el émbolo deja de moverse y el volumen de la cámara de la jeringa ha alcanzado su máximo. El líquido deja de fluir hacia la punta y las presiones de descarga se estabilizan a una presión constante moderadamente baja.
Comenzando en el momento 6, el émbolo se vuelve a presionar, lo que da como resultado un aumento en la presión de descarga hasta una presión lo suficientemente positiva como para que el líquido comience a salir de la punta. Cabe señalar que una parte de la presión de descarga resulta del peso del líquido sobre el lecho en el espacio libre superior, y esto puede contribuir a la presión que se aplica para expulsar el líquido. Entre los momentos del tiempo 7,5 y 8, todo el volumen del líquido es expulsado de la columna y la presión de descarga aumenta de nuevo de manera importante debido a los efectos de la contrapresión y la tensión superficial descritos anteriormente, es decir, como en las condiciones entre 1 y 2 minutos.
Puede ser deseable ajustar la presión de descarga antes o durante el transcurso de un proceso de purificación, por ejemplo, antes de una etapa de bombeo. El ajuste de la presión de descarga es particularmente importante en procesos automatizados, por ejemplo, procesos que involucran pipeteadores automatizados, programables y/o robóticos, y en procesos que emplean una pluralidad de columnas de puntas, por ejemplo, procesos multiplexados.
En un proceso donde se usa una jeringa o un pipeteador manual, por ejemplo, el tradicional Gilson Pipetman® manual, la presión de descarga normalmente no es un problema importante, porque el usuario puede compensar cualquier presión de descarga en tiempo real durante el accionamiento del pipeteador. Por ejemplo, al absorber la solución de desorción, el usuario controlará visualmente la absorción de fluido e intuitivamente retraerá el émbolo lo suficiente como para superar cualquier presión positiva residual y extraer la cantidad deseada de líquido a través del lecho. Cualquier ajuste de la presión de descarga es tan trivial que es probable que el usuario no sea consciente de ello. Pero esto es una consecuencia de que el usuario puede controlar visualmente la absorción de fluido y ajustar el movimiento del émbolo en consecuencia.
Sin embargo, cuando se utiliza un pipeteador programable, tal como un pipeteador multicanal automatizado (por ejemplo, el instrumento ME-200, comercializado por la firma PhyNexus, Inc., San Jose, CA), la presión de descarga puede convertirse en un problema crítico. Normalmente, el pipeteador bombea gas dentro o fuera del espacio libre superior mediante el movimiento de un pistón de desplazamiento dentro de un cilindro de desplazamiento que tiene una cámara de desplazamiento y que tiene otro extremo con una abertura en comunicación con el espacio libre superior (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. No. 4,905,526, 5,187,990 y 6,254,832). La velocidad y alcance del movimiento del pistón (es decir, el desplazamiento del pistón) están controladas por un microprocesador, que es programado por el operador. El operador programará una cantidad de desplazamiento del pistón que alterará la presión de descarga lo suficiente como para extraer o expulsar una cantidad deseada de líquido a través del lecho. La cantidad de desplazamiento de pistón requerida dependerá de la cantidad de líquido que pase a través del lecho, de la resistencia al flujo a través del lecho (por ejemplo, contrapresión, tensión superficial) y también debe ser suficiente para compensar cualquier presión de descarga residual presente antes del desplazamiento de la bomba.
Por ejemplo, considérese el caso en el que la siguiente etapa en un proceso es la absorción de una solución de desorción, y hay una presión de descarga positiva residual como resultado de una etapa anterior de expulsar una solución de lavado. Con el fin de absorber la solución de desorción, el operador debe programar el microprocesador para dirigir un desplazamiento del pistón suficiente para neutralizar la presión de descarga residual y a continuación introducir una presión negativa en el espacio libre superior suficiente para superar la resistencia al flujo y extraer la cantidad deseada de solución de desorción. El volumen de solución de desorción suele ser pequeño y la absorción precisa de la cantidad correcta es importante con el fin de lograr la recuperación y concentración óptimas del producto final. Es evidente que para programar el desplazamiento correcto del pistón, es imperativo conocer y tener en cuenta la presión de descarga residual, y/o que se ajuste la presión principal. Si no se tiene en cuenta la presión de descarga, el desplazamiento del pistón será incorrecto, al igual que la cantidad de líquido absorbido. Cuanto mayor sea la presión de descarga, o las variaciones en la presión de descarga, con respecto a la cantidad de líquido absorbido, mayor será el problema.
Por ejemplo, en la figura 6, las presiones de descarga en los momentos 3 y 7 representan las presiones de descarga capaces de extraer líquido a través del lecho y expulsar líquido a través del lecho, respectivamente. Cabe señalar que la diferencia en la presión de descarga entre los momentos 3 y 7 es menos de 10 pulgadas de agua; por tanto, una diferencia en la presión de descarga de menos de 10 es la diferencia entre la absorción y la expulsión de fluidos. Ahora considérese la fluctuación en la presión de descarga entre los momentos 1 y 2; la presión de descarga varía en más de 10 pulgadas de agua. Estos son los cambios en la presión de descarga que se pueden generar a medida que disminuye el espacio libre superior de jeringa (aumentando la presión de descarga) y las burbujas de aire son forzadas intermitentemente a través del lecho (disminuyendo la presión de descarga). Dependiendo de en qué momento se detenga la presión del émbolo, la presión de descarga puede variar entre 15 y 25 pulgadas de agua en el punto de parada. Esta presión de descarga es la presión de descarga residual que debe tenerse en cuenta al comenzar la etapa de absorción de fluido, es decir, al comenzar a levantar el émbolo en el tiempo 2. La medida en que se debe levantar el émbolo, es decir, el volumen al que la cámara de la jeringa debe aumentarse para extraer la cantidad deseada de líquido dependiendo de la presión de descarga residual. Por ejemplo, si la presión de descarga residual es 25, el cambio en el volumen de la cámara de la jeringa requerido para lograr la presión de descarga negativa necesaria será sustancialmente menor que si la presión de descarga residual es 15. Un cambio en el volumen de la cámara de la jeringa que sea suficiente para aspirar, por ejemplo, 20 ul de líquido cuando la presión de descarga residual sea 15, en muchos casos será insuficiente para aspirar la misma cantidad de líquido (o posiblemente cualquier líquido) cuando la presión de descarga residual sea igual a 25 Por otro lado, un cambio en el volumen de la cámara de la jeringa que sea suficiente para aspirar 20 ul de líquido cuando la presión de descarga residual en 25 puede ser excesiva cuando la presión de descarga residual es de solo 15. Un cambio excesivo en el volumen de presión de descarga puede provocar la aspiración de demasiado líquido. O si el líquido se extrae de un recipiente (por ejemplo, un tubo eppendorf) que contiene solo 20 ul de líquido, el cambio excesivo en el volumen de la cámara de la jeringa provocará la aspiración de aire a través del lecho después de que se hayan aspirado los 20 ul. Esto puede repercutir negativamente en el resultado de un procedimiento de purificación, ya que puede dar lugar a que suban burbujas de aire a través del lecho que pueden romperse y provocar salpicaduras de líquido en el espacio libre superior. Esto puede dar como resultado que las gotas de líquido se adhieran a las paredes del conducto pasante, en lugar de formar un cuerpo continuo de líquido sobre la parte superior de la membrana superior. Cuando el líquido se bombea posteriormente fuera del lecho, estas gotas pueden quedarse atrás. Cuando el líquido es un pequeño volumen de solución de desorción que se utiliza en una etapa de elución de muestra, estas gotas no recuperadas pueden provocar una pérdida sustancial de la muestra, es decir, una baja recuperación de la muestra.
Otro planteamiento en el que el volumen de la parte superior residual puede plantear problemas sustanciales en un proceso de purificación automatizado es cuando se utilizan múltiples columnas de puntas de pipeta (dos o más), ya sea simultáneamente o en serie. Por ejemplo, considérese un proceso de extracción desarrollado para su uso con una columna de puntas de pipeta particular, y destinado a ser usado para extraer muestras con múltiples columnas de puntas de pipeta del mismo tipo, por ejemplo, sustancialmente las mismas dimensiones de columna, espacio libre superior, tamaño de lecho, etc. Como se describió anteriormente, el proceso estará acompañado por variaciones en la presión de descarga, y particularmente con la acumulación de presiones de descarga residuales (ya sean negativas o positivas) que estarán presentes antes de comenzar cada etapa de absorción o expulsión de líquido. En la práctica, lo que se observa a menudo es que la presión de descarga residual presente en cualquier etapa del proceso variará de una columna a otra, a menos que se tomen medidas para ajustar la presión de descarga. Esta variación puede ser el resultado de cualquiera de una serie de factores, incluido el tipo de fluctuaciones de la presión de descarga observadas entre los momentos 1 y 2 en la figura 6, y también debido a ligeras variaciones de una columna a otra, lo que refleja una diferencia sutil en el relleno del lecho y de la interacción del lecho con las fritas y con el líquido, es decir, efectos diferenciales de tensión superficial y contrapresión. Debido a que las presiones de descarga residuales pueden variar de ejecución a ejecución y de columna a columna, el alcance adecuado del movimiento del émbolo de la jeringa (equivalente al movimiento del pistón de desplazamiento en un pipeteador) también variará.
Este puede ser el caso en el que varias columnas se analizan secuencialmente (en serie) y se desea programar un pipeteador automatizado para extraer la cantidad correcta de líquido en cada etapa. Si la presión de descarga residual al comienzo de una etapa dada varía de una columna a otra, entonces el volumen de desplazamiento apropiado para lograr la cantidad deseada de absorción (o expulsión) de la muestra también variará.
Este también puede ser el caso cuando se analizan varias columnas al mismo tiempo y/o en paralelo, por ejemplo, como se logra mediante un pipeteador multicanal o un sistema robótico de manipulación de líquidos. Debido a las sutiles diferencias de punta a punta, pueden desarrollarse diferentes presiones de descarga residuales de punta a punta. Si estas presiones de descarga no se ajustan antes de una etapa dada, y se usa el mismo desplazamiento de volumen preprogramado para cada canal del dispositivo multicanal, entonces pueden surgir los tipos de problemas explicados anteriormente.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona métodos para abordar los problemas asociados con las variaciones en la presión de descarga descritas anteriormente. Estos métodos implican el ajuste de la presión de descarga en diversas etapas antes de y/o durante un procedimiento de purificación de muestra.
Un planteamiento para mantener la presión de descarga constante en varias columnas de puntas es comenzar con aproximadamente el mismo volumen de líquido en cada punta y a continuación evitar expulsar o extraer aire a través de cualquier lecho durante las diversas etapas en un procedimiento de purificación.
Por ejemplo, la invención proporciona un método para hacer pasar líquido a través de una columna de puntas de pipeta de lecho relleno, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar una primera columna que comprende: un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un primer extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo; una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto definen una cámara de medios; un primer lecho relleno de medios colocado en el interior de la cámara de medios; un primer espacio libre superior definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio libre superior comprende un gas (normalmente aire) que tiene una primera presión de descarga; y una bomba (por ejemplo, un pipeteador o jeringa) fijada de manera estanca al extremo superior abierto, donde el accionamiento de la bomba afecta a la primera presión de descarga, provocando así que el fluido sea extraído o expulsado del lecho de medios;
(b) poner en contacto dicho primer extremo inferior abierto con un primer líquido;
(c) accionar la bomba para extraer el primer líquido en el primer extremo inferior abierto y a través del primer lecho relleno de medios; y
(d) accionar la bomba para expulsar al menos parte del primer líquido a través del primer lecho relleno de medios y fuera del primer extremo inferior abierto.
En algunas realizaciones, el método comprende, además, las siguientes etapas posteriores a la etapa (d):
(e) poner en contacto dicho primer extremo inferior abierto con un segundo líquido, que es opcionalmente el mismo que el primer líquido;
(f) accionar la bomba para extraer el segundo líquido en el primer extremo inferior abierto y a través del primer lecho relleno de medio; y
(g) accionar la bomba para expulsar al menos parte del segundo líquido a través del primer lecho relleno de medios y fuera del primer extremo inferior abierto.
En diversas realizaciones de la invención, la presión de descarga de la primera columna es ajustada en uno o más momentos del proceso, por ejemplo, para abordar los problemas de la presión de descarga explicados anteriormente. Por ejemplo, la primera presión de descarga de la primera columna se puede ajustar entre las etapas (d) y (f), para acercar la presión de descarga a una presión de referencia, o igualarla o igualarla sustancialmente a una presión de descarga de referencia. La presión de descarga de referencia puede ser cualquier presión deseada para lograr la absorción o expulsión deseada de líquido cuando se acciona la bomba. La presión se puede predeterminar, por ejemplo, determinando la presión de descarga en un análisis de referencia donde se calibra el grado de movimiento de un pistón para lograr la expulsión o absorción de una cantidad deseada de líquido. Por ejemplo, la presión de descarga de referencia puede ser la presión de descarga de la primera columna antes de la etapa (c). La presión de descarga de referencia se puede basar en un estándar externo al espacio libre superior, por ejemplo, la presión ambiental del aire. Por ejemplo, una forma de ajustar la presión de descarga a un valor predeterminado es exponer el espacio libre superior al ambiente externo (permitiendo que el aire pase hacia o desde el espacio libre superior), normalizando así la presión de espacio libre superior a la presión ambiental. Esto se puede lograr, por ejemplo, rompiendo la junta de estanqueidad entre el extremo abierto superior y la bomba (por ejemplo, quitando una columna de puntas de pipeta de un pipeteador y a continuación volviéndola a colocar, disipando así cualquier presión de descarga negativa o positiva y normalizando la presión de descarga a la presión ambiental del aire). Por ejemplo, considérese múltiples columnas de puntas de pipeta, cada una fijada a un canal de pipeteador y cada una teniendo una presión de descarga diferente como resultado de una operación previa de absorción o expulsión de líquido. Se podría desacoplar brevemente cada columna de puntas del canal de pipeteador, permitiendo que el espacio libre superior se equilibre con la presión ambiental del aire y, por lo tanto, normalizando las presiones de descarga. La misma técnica también se aplica a una sola columna de puntas de pipeta; la normalización de la presión de descarga garantizará presiones de descarga consistentes al comienzo de una etapa dada y volúmenes iguales de líquido absorbido de ejecución a ejecución.
Algunas realizaciones involucran etapas adicionales de:
(h) proporcionar una segunda columna, que comprende: un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un segundo extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo; una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto definen una cámara de medios; un segundo lecho relleno de medios colocado en el interior de la cámara de medios; un segundo espacio libre superior definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio libre superior comprende un gas que tiene una segunda presión de descarga; y una bomba fijada de manera estanca al segundo extremo superior abierto, donde el accionamiento de la bomba afecta a la segunda presión de descarga, provocando así que el fluido sea extraído o expulsado del segundo lecho relleno de medios;
(i) poner en contacto dicho segundo extremo inferior abierto con un tercer líquido, que es opcionalmente el mismo que el primer líquido;
(j) accionar la bomba para extraer el tercer líquido en el segundo extremo inferior abierto y a través del segundo lecho relleno de medios;
(k) accionar la bomba para expulsar al menos parte del tercer líquido a través del segundo lecho relleno de medio y fuera del segundo extremo inferior abierto.
(l) poner en contacto dicho segundo extremo inferior abierto con un cuarto líquido, que es opcionalmente el mismo que el tercer líquido;
(m) accionar la bomba para aspirar el cuarto líquido en el segundo extremo inferior abierto y a través del segundo lecho relleno de medio; y
(n) accionar la bomba para expulsar al menos parte del cuarto líquido a través del segundo lecho relleno de medios y fuera del segundo extremo inferior abierto, donde la presión de descarga de la segunda columna se ajusta entre las etapas (k) y (m) para hacer que la presión de descarga se acerque más a una presión de referencia.
En algunas realizaciones, las etapas (b) a (g) se realizan antes de las etapas (i) a (n). En otras realizaciones, las etapas (b) a (g) se realizan simultáneamente y en paralelo con las etapas (i) a (n). Es decir, las dos columnas se pueden analizar secuencialmente o en paralelo, como en los procedimientos de extracción multiplexada. En algunas realizaciones, la presión de descarga de referencia es la presión de descarga de la primera columna inmediatamente antes del comienzo de la etapa (f).
La bomba puede ser cualquiera de las bombas descritas a lo largo de esta memoria descriptiva, tal como una bomba de jeringa o un pipeteador. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la bomba es un pipeteador multicanal y la primera columna está unida a un primer canal del pipeteador multicanal y la segunda columna está unida a un segundo canal del pipeteador multicanal.
En algunas realizaciones, entre las etapas (d) y (f) la primera presión de descarga se ajusta para hacer que la primera y la segunda presión de descarga sean más uniformes. En otros métodos, las presiones de descarga se ajustan para que sean más uniformes en cualquier otra etapa del proceso, particularmente antes de cualquier etapa que implique la absorción o expulsión de líquido.
En algunas realizaciones, el método se aplica simultáneamente y en paralelo a múltiples columnas de puntas de pipeta unidas de manera estanca a un pipeteador multicanal (tal como una estación de trabajo robótica), donde cada columna de puntas de pipeta comprende un espacio libre superior que tiene una presión de descarga, y donde las presiones de descarga de las múltiples columnas de puntas de pipeta se ajustan para hacer que las presiones de descarga sean más uniformes. Las múltiples columnas de puntas de pipeta pueden comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 16, al menos 32, al menos 96 o más columnas de puntas de pipeta. En algunas realizaciones, las presiones de descarga de las múltiples columnas de puntas de pipeta se ajustan para hacer que las presiones de descarga sean sustancialmente iguales.
La presión de descarga se puede ajustar mediante cualquiera de varios métodos. Como se describió anteriormente, la presión de descarga se puede ajustar rompiendo el accesorio de sellado entre la bomba y el extremo superior abierto de una columna, exponiendo el espacio libre superior a la presión ambiental y volviendo a fijar de nuevo la bomba de manera estanca al extremo superior abierto de la columna.
Alternativamente, se puede emplear una columna que incluye una válvula en comunicación con el espacio libre superior, y la presión de descarga se ajusta abriendo esta válvula, lo que hace que el gas entre o salga del espacio libre superior. Por ejemplo, se puede conectar una válvula de 3 vías entre un accesorio de bomba y una columna de puntas de pipeta. La abertura de la válvula permitirá que el aire externo entre o salga del espacio libre superior, permitiendo así el equilibrio de la presión de descarga con la presión externa, por ejemplo, la presión ambiental.
En otra alternativa, la presión de descarga se ajusta por medio de la propia bomba. La bomba se puede accionar para bombear aire dentro o fuera del espacio libre superior, ajustando así la presión del espacio libre superior a un nivel deseado. En algunas realizaciones, se coloca un sensor de presión en comunicación operativa con un espacio libre superior y se usa para controlar la presión de descarga y para determinar la cantidad de gas a bombear en o desde el espacio libre superior para lograr el ajuste de presión deseado. El sensor de presión puede proporcionar información en tiempo real a un sistema de bombeo automatizado (por ejemplo, un pipeteador multicanal o robot) durante un proceso de purificación y provocar la activación adecuada de la bomba para ajustar el espacio libre a la presión deseada. Por ejemplo, en una realización, una primera columna comprende un primer sensor de presión en comunicación operativa con el primer espacio libre superior, un segundo sensor de presión en comunicación operativa con el segundo espacio libre superior, que es opcionalmente el mismo que el primer sensor de presión, donde dichos sensores de presión se usan para controlar las presiones de descarga primera y segunda y para determinar la cantidad de gas bombeado en o desde el segundo espacio libre superior. El método se puede aplicar a cualquier número de múltiples columnas que se utilicen en paralelo y/o secuencialmente.
En otra realización, la presión de descarga se ajusta eliminando el líquido a granel del espacio intersticial de un lecho relleno de medios, por ejemplo, soplando aire a través del lecho. En algunos casos, se necesita una presión de descarga relativamente alta para expulsar el líquido residual del lecho, por ejemplo, bombeando aire rápidamente a través del lecho. A menudo, una vez que el líquido ha sido expulsado y reemplazado por aire, el aire del exterior de la columna puede atravesar más fácilmente el lecho y entrar en el espacio libre superior, equilibrando así la presión de descarga con la presión ambiental del aire. Esto se debe a que la resistencia al flujo de aire de un "lecho seco" de medios de extracción es típicamente sustancialmente menor que la resistencia del "lecho húmedo" correspondiente. La expresión "lecho seco" se refiere a un lecho donde el espacio intersticial está sustancialmente vacío de líquido, aunque puede haber algo de líquido a granel residual y el propio medio podría estar hidratado. "Lecho húmedo" se refiere a un lecho donde el espacio intersticial está sustancialmente lleno de líquido. La tensión superficial en el lecho húmedo presumiblemente limita el flujo de gas a través del lecho, lo que permite el mantenimiento de diferencias de presión sustanciales entre el espacio libre y el entorno ambiental externo.
Con el fin de expulsar todo el líquido de una columna de puntas de pipeta, el émbolo de jeringa o el pistón de desplazamiento debe poder desplazar suficiente volumen de la cámara para lograr la presión de descarga positiva requerida. Considérese el caso donde un pistón de desplazamiento comienza en una posición de inicio dada correspondiente a un volumen de cámara inicial. El pistón se retrae, aumentando el volumen de la cámara y dando como resultado la absorción de líquido. A continuación, el pistón se extiende de nuevo a la posición inicial, reduciendo el volumen de la cámara al volumen de la cámara inicial. En algunos casos, debido por ejemplo a la tensión superficial y otros efectos descritos en esta invención, el alcance del pistón de regreso a la posición inicial es insuficiente para expulsar todo el líquido de la punta como se desea. Por tanto, es necesario extender el pistón más allá de la posición inicial para expulsar la cantidad total de líquido. Esto es imposible si la posición inicial del pistón está en la posición completamente extendida, es decir, el punto inicial normal, donde el volumen de la cámara está en su mínimo. Por tanto, el pistón (o su equivalente, tal como el émbolo en una jeringa) puede retraerse hasta cierto punto desde la posición completamente extendida antes de comenzar a absorber cualquier líquido, es decir, la posición inicial se desplaza desde la posición completamente extendida, y por ende, el volumen de cámara es superior al mínimo. Esto es ventajoso porque permite que el pistón se extienda más allá del punto inicial durante la expulsión del líquido, lo que permite la creación de una mayor presión de descarga positiva para expulsar todo el líquido de la columna según se desee. Cuanto mayor sea el desplazamiento de la posición inicial desde la posición completamente extendida, mayor será la presión de descarga que se puede crear al final de la etapa de extensión. El grado de desplazamiento debe ser suficiente para compensar las contrapresiones encontradas en el sistema de columna particular en cuestión, y puede determinarse empíricamente o calcularse en función de las propiedades de la columna, del líquido de muestra, del sistema de bombeo, etc.
Un método de purificación de un analito puede comprender las etapas que consisten en: (a) proporcionar una columna que comprende: un cuerpo de columna que tiene un extremo superior abierto para comunicación con una bomba, un extremo inferior abierto para la absorción y distribución de fluido, y un conducto abierto entre los extremos superior e inferior del cuerpo de columna; una frita inferior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo; una frita superior fijada al conducto abierto y que se extiende a través del mismo entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de columna, donde la frita superior, la frita inferior y la superficie del conducto definen una cámara de medios; un lecho relleno de medios colocado en el interior de la cámara de medios; un espacio libre superior definido como la sección del conducto abierto entre el extremo superior abierto y la frita superior, donde el espacio libre superior comprende un gas que tiene una presión de descarga; y una bomba (por ejemplo, un pipeteador o jeringa) fijada de manera estanca al extremo superior abierto, donde la bomba incluye un accionador lineal (que puede ser controlado por un microprocesador accionado eléctricamente) y, conectado a y controlado por el accionador lineal, un conjunto de desplazamiento que incluye un pistón de desplazamiento móvil dentro de un extremo de un cilindro de desplazamiento que tiene una cámara de desplazamiento y que tiene un extremo con una abertura en comunicación con el espacio libre superior; (b) posicionar el pistón en una posición inicial que se desplaza desde una posición totalmente extendida que corresponde a un volumen de cámara de desplazamiento mínimo, donde la posición inicial está lo suficientemente desplazada desde la posición totalmente extendida de tal manera que la extensión completa del pistón provocará la expulsión total del líquido de la columna durante una etapa de expulsión en el proceso (estando definida la expulsión total como la expulsión de todo el líquido o parte del líquido en la medida deseada por el operador del método); (c) colocar el extremo inferior abierto en un líquido (ya sea antes, después o al mismo tiempo que la etapa (b)); retraer el pistón para extraer líquido a través del extremo inferior abierto y en el lecho relleno de medios; y (d) extender el pistón más allá del punto de partida, expulsando así el líquido a través del lecho relleno de medios y fuera del extremo inferior abierto.
Cabe señalar que el método descrito anteriormente puede generar una presión de descarga negativa antes de retraer el pistón y aspirar el líquido.
Como se explicó anteriormente, la variabilidad no deseada en la presión de descarga es a menudo el resultado del sellado intermitente formado por el lecho de medios de extracción y la cámara de medios. Cuando el espacio intersticial está sustancialmente lleno de líquido, se forma una junta de estanqueidad que evita que el aire entre o salga del espacio libre superior. Si se permite que entre aire en el lecho durante un proceso de extracción, puede formar canales de aire en el lecho a través de los cuales puede pasar el aire, es decir, se altera la estanqueidad. Se evitan variaciones no deseadas en la presión de descarga manteniendo la junta de estanqueidad durante todo el proceso de extracción, por ejemplo, evitando que entre aire en la cámara.
Cada accionamiento de la bomba para enviar líquido hacia la cámara comprende inducir una presión de descarga negativa que es suficiente para aspirar una cantidad deseada de líquido pero que no es tan grande como para provocar que entre aire en la cámara de medios a través de la frita inferior. En algunas realizaciones, la presión negativa inducida está predeterminada para que sea suficiente para aspirar una cantidad deseada de líquido, pero no tan grande como para provocar que entre aire en la cámara de medios a través de la frita inferior.
Los métodos que implican evitar la entrada de aire en la cámara de medios son particularmente relevantes en las realizaciones de la invención que emplean fritas de membrana.
En ciertas realizaciones, una vez que el líquido ha sido extraído en la cámara de medios, la superficie exterior de la frita inferior está en contacto con el aire (por ejemplo, todo el líquido en un pocillo ha sido aspirado), pero se evita que el aire entre o atraviese la cámara de medios mediante una tensión superficial que resiste el paso de gas a través de la frita de membrana y la cámara de medios. Opcionalmente, la magnitud de la presión negativa está predeterminada para que sea suficiente para extraer el líquido en la cámara de medios, pero no tanto como para superar la tensión superficial que resiste el paso del gas a través de la frita de membrana y de la cámara de medios. En algunos casos, existe una tensión superficial que resiste la entrada inicial del líquido a través del extremo inferior abierto del cuerpo de columna y en la cámara de medios, y la magnitud de la presión negativa está predeterminada para que sea suficiente para superar la tensión superficial que resiste la entrada inicial del líquido a través del extremo inferior abierto del cuerpo de columna y en la cámara de medios.
Un momento en el que existe un peligro particular de que se formen canales de aire en el lecho de medios de extracción es al fijar una columna a una bomba, por ejemplo, al fijar una columna de puntas de pipeta a un pipeteador. La fijación de la punta causará, en general, un aumento en la presión de descarga, y este aumento en la presión de descarga puede expulsar líquido del espacio intersticial del lecho de medios y dar como resultado la formación de canales. Una forma de evitar esto es asegurarse de que haya suficiente líquido en el espacio intersticial antes de fijar la punta a una bomba, de modo que el espacio intersticial permanezca sustancialmente lleno de líquido. A este respecto, puede ser ventajoso utilizar un líquido que sea más viscoso que el agua como líquido de almacenamiento para una columna, por ejemplo, glicerol. En esta invención se describen una variedad de solventes miscibles en agua, incluido el glicerol, en relación con el almacenamiento de puntas en un estado húmedo. Por tanto, otra ventaja de muchos de estos solventes es que se retendrán en el lecho mejor que el agua y será menos probable que sean expulsados por la presión de descarga resultante de la fijación de la columna a una bomba.
Puntas de posicionamiento para uso en procesos multiplexados
En algunas realizaciones, los métodos de la invención implican la extracción multiplexada por medio de una pluralidad de columnas de puntas de pipeta y un pipeteador multicanal. Los métodos pueden implicar extraer líquido de un pocillo en una placa de múltiples pocillos. El volumen de líquido puede ser relativamente pequeño, por ejemplo, del orden de 10 pL o menos de solución de desorción, y a menudo es importante que cada una de las puntas absorba sustancialmente todo el volumen de líquido. Para lograr esto, es fundamental que el extremo inferior abierto de cada columna de puntas de pipeta se coloque con precisión en una posición en cada pocillo que esté en contacto con el fluido, y sea sumergido a una profundidad tal que sustancialmente todo el líquido se introduzca en la punta tras la aplicación de suficiente presión negativa en el espacio libre superior. Por lo general, esta posición es cerca del centro de un pocillo circular, a una profundidad cercana al fondo del pocillo (dentro de uno a varios milímetros), pero preferiblemente no en contacto directo con el fondo. Si la punta hace contacto directo con la superficie del pocillo, existe el peligro de que se forme una junta de estanqueidad entre la punta y el pocillo que restrinja el flujo de líquido hacia y/o fuera de la punta. Sin embargo, el contacto entre la punta y el fondo del pocillo no evitará ni restringirá necesariamente el flujo hacia la punta, particularmente si no se forma una junta de estanqueidad entre la punta y el pocilio.
Un problema que puede surgir en un proceso de purificación multiplexada es que puede ser difícil colocar con precisión todas las puntas en un pipeteador multicanal de modo que cada una esté en la posición óptima en su pocillo correspondiente. Por ejemplo, si los extremos inferiores abiertos de cada punta no están posicionados sustancialmente en una línea recta (para una configuración lineal de puntas) o en un plano (para una matriz bidimensional de puntas), y esa línea (o plano) no es sustancialmente paralela a los fondos de la serie correspondiente de pocillos en una placa, entonces será muy difícil colocar simultáneamente cada punta en su ubicación óptima. Esto se ilustra en la figura 12, que representa ocho columnas 360 de punta de pipeta unidas a un pipeteador 362 de ocho canales. Las puntas se colocan en los pocillos de una placa multipocillo 364, encima y cerca del fondo de los pocillos. Debido a que el pipeteador forma un ligero ángulo con respecto a la placa, la punta en el extremo derecho 366 hace contacto con el fondo del pocillo 368, lo que puede restringir el flujo de líquido a través de la punta. Por otro lado, la punta del extremo izquierdo 370 está colocada demasiado alta y no podrá extraer completamente una pequeña parte alícuota de líquido del fondo del pocillo 372.
En la figura 13 se ejemplifica un método para colocar con precisión una pluralidad de columnas de puntas en los pocillos de una placa de micropocillos. En este caso, las puntas de posicionamiento 380 que se extienden ligeramente más largas que las columnas de pipeta se colocan en cualquier extremo de la fila de columnas de puntas de pipeta, en una disposición que recuerda a los "dientes de vampiro". En funcionamiento, las puntas de posicionamiento se colocan de modo que ambas se apoyen contra el fondo de sus correspondientes pocillos 382. Las columnas de puntas de pipeta internas a las dos puntas de posicionamiento se elevan desde el fondo de sus pocillos a una distancia igual a la distancia que las puntas de posicionamiento se extienden más allá de los extremos de las puntas de pipeta. Por tanto, ajustando la longitud de las puntas de posicionamiento es posible colocar las puntas internas 384 a cualquier distancia deseada desde el fondo de sus pocillos correspondientes. Las puntas de posicionamiento simplifican y estabilizan en gran medida el posicionamiento de las puntas de pipeta a una distancia predeterminada y uniforme del fondo de los pocillos.
Cabe señalar que, como se muestra en la figura 13, hay dos puntas de posicionamiento, una en cada extremo de la fila de puntas. En realizaciones alternativas, se podría usar una sola punta de posicionamiento, por ejemplo, en una posición cerca del centro de la fila como la punta 386. En general, el uso de una sola punta de posicionamiento no brindará la estabilidad y precisión de un formato de puntas de posicionamiento múltiples, pero será mejor que no usar ninguna punta de posicionamiento y, en algunos casos, será suficiente.
Alternativamente, se pueden usar más de dos puntas de posicionamiento, aunque normalmente dos son suficientes para una disposición lineal de puntas de pipeta. Sin embargo, si la fila de puntas es significativamente más larga de ocho puntas de longitud, entonces podría darse el caso de que la estabilidad adicional proporcionada por más de dos puntas de posicionamiento sea beneficiosa.
Cabe señalar que ya sea que se usen una o más puntas, no es necesario que las puntas de posicionamiento adopten una posición particular en relación con las columnas de puntas. Por ejemplo, la disposición de la figura 13 podría variarse de modo que las puntas de posicionamiento se coloquen en las posiciones 388, y las posiciones 380 podrían estar ocupadas, en este planteamiento, por columnas de puntas funcionales.
Las puntas de posicionamiento harán contacto con un punto de referencia que se encuentra en una ubicación fija y predeterminada en relación con los fondos de los pocillos correspondientes a las columnas de puntas de pipeta. Por ejemplo, el punto de referencia puede ser el fondo de un pocillo que no se utiliza en un proceso de extracción. Por ejemplo, la figura 14 representa una placa de 96 pocillos. Los cuatro pocillos 390 de esquina no se usan para contener líquido, sino que se usan como puntos de referencia; las puntas de posicionamiento posicionadas en las cuatro esquinas de la matriz bidimensional de columnas de puntas de pipeta en la figura 15 son puestas en contacto con los fondos de los pocillos 390 para colocar correctamente las columnas de puntas de pipeta en los pocillos correspondientes de la placa.
El método también es adecuado para usar con una matriz bidimensional de puntas, tal como en un pipeteador multicanal que tiene más de una fila de columnas de puntas, por ejemplo, un pipeteador de 96 canales que forma parte de un sistema robótico de manejo de fluidos. Por ejemplo, la figura 15 representa una matriz de 8x12, de 96 columnas de puntas de pipeta y puntas de posicionamiento. En este ejemplo particular, las puntas de posicionamiento están en las esquinas de la matriz 392. Como ocurría con las configuraciones lineales de puntas, en matrices bidimensionales hay una variedad de opciones alternativas para el número y ubicación de las puntas de posicionamiento. Por ejemplo, en una realización preferida, se utilizan cuatro puntas de posicionamiento, una en cada esquina del conjunto de puntas. Alternativamente, podrían usarse más o menos de cuatro puntas de posicionamiento, por ejemplo, dos puntas, una en cada una de las dos esquinas opuestas, o una sola punta posicionada en una esquina o posición interna en la matriz.
Ejemplos
Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir que los expertos en la materia entiendan más claramente y pongan en práctica la presente invención. No se debería considerar que limitan el alcance de la invención, sino que simplemente son ilustrativos y representativos de esta.
Ejemplo 1
Fabricación de una columna de extracción de microlecho
Para fabricar un lecho de 0,1 jL , se suelda una membrana de poliéster en un extremo de un tubo de polipropileno de 300 mm de diámetro interior y 4 mm de longitud. El lecho se llena con un material de resina de gel hasta una altura de 0,25 mm. Se empuja un pequeño círculo o taco de material de frita de membrana en el extremo de la columna. A continuación, se inserta un capilar de sílice fundido de 5 cm de longitud (320 jm de, 200 jm di) en la parte superior del tubo de polipropileno y se empuja hacia abajo hasta la parte superior del lecho de columna. Se usa un accesorio para fijar una bomba de microjeringa a la columna, lo que permite introducir y extraer la solución del lecho, para su uso en una extracción a microescala del tipo descrito en el presente documento.
Se pueden construir columnas con varios volúmenes de lecho pequeños usando diferentes puntas de pipeta como materiales de partida. Por ejemplo, una columna de lecho de 0,5 jL (0,4 mm de diámetro promedio y 0,4 mm de longitud se puede construir usando puntas de pipeta de 10 jL (Finnitip 10, comercializado por la firma Thermolab Systems, Cat. No. 9400300). El tamiz de membrana se puede fijar mediante encolado, soldadura y fijación mecánica. El volumen del lecho se puede controlar más fácilmente pegando el tamiz de membrana. Se fabricaron otras columnas con tamaños de lecho de 1,2, 2,2, 3,2 y 5,0 jL de manera similar, a partir de puntas de pipeta P-235 comercializadas por la firma Perkin Elmer (Cat. No. 69000067).
Ejemplo 2
Evaluación de una columna de puntas de pipeta con un volumen de lecho de 10 jL que contiene una resina de proteína A
En este ejemplo, se evaluó el rendimiento de las columnas de puntas de pipeta con un volumen de lecho de 10 jL (fabricadas a partir de puntas de pipeta de 1 mL (VWR)) que contenían una resina de proteína A. Las resinas bajo consideración consisten en proteína A recombinante purificada acoplada covalentemente a través de unión multipunto a través de amidación reductora para 6 % de perlas de agarosa con alta reticulación (RepliGen Corporation, IPA-400HC; PN: 10-2500-02) o para 4 % perlas de sefarosa reticulada (Amersham-Pharmacia). Las muestras analizadas consistieron en 15 jg de mFITC-MAb (Fitzgerald, Inc. Cat # 10-F50, IgG2a de ratón) en 0,5 mL de PBS o PBS que contiene 5 mg de BSA (10 mg/mL o 1 % m/v BSA).
Se utilizó un sistema de extracción de multiplexación ME-100 (Phynexus, Inc.), cuyos elementos principales se ilustran esquemáticamente en la figura 3 y en el texto que acompaña a esa figura. El sistema se programó para expulsar la mayor parte de la solución de almacenamiento de las puntas antes de tomar las muestras. Las muestras de 0,5 mL se proporcionaron en tubos eppendorf de 1,5 mL y se colocaron en la gradilla de muestras, que se elevó de modo que la punta de las columnas hiciera contacto con la muestra. Durante el ciclo de carga, se emplearon 2 o 5 ciclos de entrada/salida (dependiendo de la prueba), el volumen aspirado o expulsado programado en 0,6 mL @ 0,25 mL/min.
Después de la carga, los lechos de extracción se lavaron con 2 ciclos de entrada/salida, volumen programado a 0,6 mL @ 0,5 mL/min (algunos experimentos incluyeron 4 lavados separados, cada uno con 0,5 mL de PBS), o 1 lavado con 1 mL de PBS, volumen programado en 1,0 mL @ 0,5 mL/min seguido de un lavado final con 0,5 mL de H2 O.
El ciclo de elución involucró 4 ciclos de entrada/salida, volumen programado a 0,1 - 0,15 mL @ 1 mL/min (15 jL de tampón de elución, 111 mM NaH2PO4 in 14,8 mM H3 PO4 , pH 3,0).
Para cuantificar la IgG recuperada en el procedimiento y analizar su pureza, se dividió un volumen de elución de 15 j l en dos partes: 13 j l se hicieron reaccionar con 13 j l de 10 mg/mL TCEP (volumen final = 26 j l y [TCEP] = 17,5 mM) a temperatura ambiental durante ~16 horas. Se inyectaron 20 j l de los 26 j l anteriores de IgG2a reducida en una columna de fase inversa (C-18) de poliestireno divinilbenceno no poroso utilizando un sistema de HPLC HP 1050. Se usó un gradiente de 25 % a 75 % entre el solvente A que es 0,1 % TFA en agua y solvente B que es 0,1 % de TFA en ACN, durante 5 minutos. Detección: UV a 214 y 280 nm. Hay dos picos principales de IgG2a que tienen intensidades similares, como se muestra en los datos a continuación, que eluyeron alrededor de 3,17 y 3,3 min. El área bajo estos dos picos se integró desde (3,13 - 3,5) min en cada caso y se registró el mAU correspondiente a 214 nm. Solo se calculó el porcentaje de recuperación de la primera elución (15 jl). Los estándares de IgG2a tratados con TCEP (cantidad inyectada de 1,08, 2,16, 4,32, 6,48 y 8,64 |jg de FITC-MAb, obtenidos de Fitzgerald, Inc) en condiciones de reacción idénticas se cargaron en la columna y se usaron como curva estándar para el cálculo de la recuperación.
Los datos resumidos que se muestran a continuación de estos experimentos indican que la purificación de IgG usando las columnas de extracción de Proteína A fue altamente selectiva. Se puede eliminar cuantitativamente un exceso de BSA de 333 veces en un proceso muy rápido.
Recuperaciones del ensayo de selectividad (determinado por el método HPLC)
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Se analizaron 2 ul de la IgG reducida de cada experimento mediante SDS-PAGE, utilizando un gel Nu-PAGE 4-12 % Bis-Tris con tampón de funcionamiento MES (figura 4). Carril 1: marcador; carril 2: 2 jg de BSA; carril 3: 2 jg de IgG2a; carriles 4 y 5: RepliGen y resina Proteína A Amersham solamente, respectivamente; carriles 6, 7 y 8: 2 j l de cada uno de IgG2a purificada con Proteína A RepliGen de PBS, PBS que contiene 5 mg de BSA (2 y 5 ciclos de carga), respectivamente; carriles 9, 10 y 11: 2 j l de cada uno de IgG2a purificada con Proteína A Amersham de PBS, PBS que contiene 5 mg de BSA (2 y 5 ciclos de carga), respectivamente.
Ejemplo 3
Comparación de contrapresiones de frita
La contrapresión se determinó para varias fritas de tamiz y fritas de polímero poroso utilizando el siguiente método. Haciendo referencia a la figura 9, se fijó una columna de puntas 308 que comprende fritas de membrana 311 y 313 y un lecho relleno de resina 312 al tubo de salida 314.
Inicialmente, se bombea agua desionizada a través del lecho de medios de extracción 312 a un caudal constante, y la contrapresión de referencia se lee en el manómetro una vez que el caudal y la presión se han estabilizado, es decir, alcanzado el equilibrio. La columna de puntas 308 funciona para producir una contrapresión de referencia cuando se bombea agua desionizada a través del sistema. Para medir la contrapresión de una frita de membrana en particular, se suelda una frita de membrana al extremo estrecho de la punta de una pipeta, y el extremo estrecho de la punta se coloca en el extremo abierto ancho de la columna de puntas para formar una junta de estanqueidad de fricción.
Se permite que el flujo y la presión se estabilicen, y se lee en el manómetro el aumento de la contrapresión con respecto a la contrapresión de referencia resultante de la adición de la membrana.
En algunos experimentos, la contrapresión se determinó para dos o más tamices de membrana conectadas en serie. Esto se logró ajustando por fricción dos o más puntas de pipeta con membrana en serie (324, 326 y 328) y fijándolas a la columna de puntas 308 (véase la figura 10).
El aumento de la contrapresión resultante de la pluralidad de membranas se lee luego en el manómetro una vez que se ha alcanzado el equilibrio.
En un experimento de control, se determinó que la fijación de una punta de pipeta sin frita de membrana (o varias puntas de pipeta en serie) en lugar de la punta de pipeta 324 no dio como resultado ningún aumento detectable en la contrapresión. Por lo tanto, cualquier contrapresión detectada en los experimentos se debe solamente a la frita o fritas.
En un conjunto de experimentos, se determinó la contrapresión para una frita de membrana de poliéster con un tamaño de poro de 37 micras de 1,5 mm de diámetro (Spectrum Lab, Cat. No. 146529) a un caudal de 4 mL/min. Se determinaron las contrapresiones para diferentes tamices individuales y se encontró que la adición de estas membranas resultó en un aumento de la contrapresión de 0,25, 0,3 y 0,3 kPa (1 psi = 6,8948 kPa). Se conectaron dos tamices en serie y se encontró que dieron como resultado un aumento total en un aumento de la contrapresión de 0,4 kPa. Se conectaron tres tamices en serie y se encontró que daban como resultado un aumento en la contrapresión de 1,1 kPa. Por lo tanto, se concluyó que a un caudal de 4 mL/min, la contrapresión de una de estas fritas de membrana es de aproximadamente 0,3 kPa.
En un experimento separado, se demostró que la relación entre la contrapresión y el caudal es aproximadamente lineal. Por lo tanto, se puede extrapolar que a un caudal de 1 mL/min (un caudal típico cuando las fritas se utilizan en el contexto de una columna de extracción de puntas de pipeta) la contrapresión de estas fritas de membrana es de aproximadamente 0,3/4, o 0,075 kPa.
En otro conjunto de experimentos, se evaluó la relación entre el tamaño de poro del tamiz, el diámetro del tamiz y la contrapresión. Se ensayaron fritas de membrana de poliéster con tamaños de poro de 15 micras (Spectrum Lab, Cat. No. 145832), 21 micras (Spectrum Lab, Cat. No. 145833) y 37 micras (Spectrum Lab, Cat. No.
146529). Se prepararon dos tamices de diferente diámetro. El diámetro del tamiz pequeño fue de aproximadamente 0,85 mm y el diámetro del tamiz grande fue de 1,4 mm. Debido a que los tamices estaban soldados a la punta, el diámetro efectivo variaba según la cantidad de polipropileno caliente que fluía desde el borde hacia el tamiz. Esto afectó mucho más a la contrapresión en el diámetro del tamiz más pequeño que en el diámetro del tamiz grande. Se prepararon tres puntas cada una para cada tamaño de poro y para cada diámetro. Los resultados fueron los siguientes:
1. Tamiz pequeño, 15 um, 1 mL/min
Contrapresión: 3,3, 2,7, 1,5 kPa
2. Tamiz pequeño, 21 um, 4 mL/min
Contrapresión: 2,5, 6,3, 3,6 kpa (por lo tanto, contrapresión efectiva a 1 mL/min se extrapola para ser 0,63, 1,6, 0,90 kpascales)
3. Tamiz pequeño, 37 um, 4 mL/min, pila de 3 en serie
Contrapresión: 2,2 kPa (por lo tanto, contrapresión efectiva de una frita a 1 mL/min se extrapola para ser 0,18 kpascales)
4. Tamiz grande, 15 um, 1 mL/min, pila de 3
Contrapresión: 6,5 kPa (por lo tanto, contrapresión efectiva a 1 mL/min se extrapola a 2,2 kpascales) 5. Tamiz grande, 21 um, 4 mL/min, pila de 3 en serie
Contrapresión: aprox. 0,1 kPa (por lo tanto, la contrapresión efectiva a 1 mL/min se extrapola para ser 0,0083 kpascales)
6. Tamiz grande, 37 um, 4 mL/min, pila de 3 en serie
Contrapresión: aprox. 0,05 kPa (por lo tanto, la contrapresión efectiva a 0,0042 mL/min se extrapola para ser kpascales)
La contrapresión también se determinó para fritas fabricadas de material polimérico poroso, similares a los tipos de fritas que se usan en la cromatografía en columna. La frita de polímero poroso se ajustó por fricción en puntas de pipeta como se muestra en la figura 11 (330 es la punta de pipeta y 332 es la frita), y la contrapresión se determinó utilizando el mismo dispositivo y metodología descritos anteriormente para usar con fritas de membrana. (Cabe señalar que los diámetros de las fritas indicadas son de tamaño de corte. Cuando la frita se empuja hacia el interior del cuerpo de la punta, el diámetro disminuirá. El diámetro inicial más grande de las fritas tuvo que empujarse con más firmeza en el cuerpo de la pipeta para evitar que se desalojara).
Todas las fritas de polímero poroso probadas fueron de 1/16 pulgada (1,5875 mm) de grosor, y variadas en diámetro y tamaño de poro. Los materiales probados fueron un polímero hidrófilo de poro de 35 micras (3,4 y 4,4 mm de diámetro) obtenido de Scientific Commodities (Lake Havasu City, Az, Cat No. BB2062-35L); un polímero de polipropileno UHMW de poro de 15-45 micras obtenido de Porex (Cat. No. X-4900) y un polímero de polipropileno de 20-25 micras obtenido de GenPore (Reading, PA). Las contrapresiones medidas se presentan en la siguiente tabla. Las contrapresiones son sustancialmente más altas que las observadas con las fritas de membrana.
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 4
Comparación de contrapresiones de columna
La contrapresión de la columna se determinó para varias columnas de puntas de pipeta utilizando el siguiente método. Haciendo referencia a la figura 9, se configuró una bomba HP1050 302 (Hewlett-Packard) de tal manera que la tubería de entrada 304 se sumerge en agua desionizada 306. Para medir la contrapresión de una columna de puntas 308 particular, el extremo estrecho 310 de la columna de puntas (que contiene el lecho relleno 312 entre las fritas de membrana 311 y 313) se ajusta en el extremo abierto del tubo de salida 314 para formar una junta de estanqueidad de fricción. El tubo de salida incluye un accesorio en T 316 unido a un manómetro Marshall Town 318 con un rango de 0-5 psi (0-34 kPa). A continuación, el agua desionizada se bombea a través del lecho relleno 312 a un caudal constante, y la contrapresión se lee en el manómetro una vez que el caudal y la presión se han estabilizado, es decir, alcanzado el equilibrio.
Cuando la bomba se enciende por primera vez, dependiendo de la contrapresión de la columna, puede llevar un tiempo el que se acumule suficiente presión antes de que el agua comience a fluir a través de la columna a un caudal constante. Por lo general, para alcanzar el equilibrio más rápidamente, la bomba se hizo funcionar inicialmente a un caudal más rápido (p. ej., 2 mL/min) y luego se retrocedió a la velocidad deseada (por ejemplo, 1 mL/min) una vez que el flujo a través de la columna hubo alcanzado una velocidad de aproximadamente la velocidad deseada.
Para algunas columnas, la contrapresión se determinó en solo 1 mL/min. Para otras columnas, la contrapresión se determinó para una serie de caudales ascendentes (p. ej., 1,2, 3 y 4 mL/min). Para estos experimentos, se encontró que la relación entre el caudal y la contrapresión era aproximadamente lineal. Para algunas de las columnas más pequeñas, la contrapresión a 1 mL/min era tan baja que no podía ser medida con precisión con el manómetro utilizado. En esos casos, la contrapresión se determinó a un caudal de 5 mL/min, y la contrapresión en 1 mL/min calculado en base a una supuesta relación lineal entre el caudal y la contrapresión (como se demostró para otras columnas). Las contrapresiones medidas se presentan en la siguiente tabla. La punta Zip C18 se obtuvo de Millipore (Billerica, MA). Las otras puntas son columnas de puntas de pipeta con lecho de resina relleno fabricadas como se describe en este documento. Los cuerpos de las columnas se fabricaron modificando puntas de pipeta obtenidas de varios proveedores diferentes, incluidas puntas 200+ suministradas por Packard/Perkin-Elmer (200+ PE), puntas 200+ proporcionadas por Rainin (200+ R) y puntas 200+ diseñadas para ser utilizadas con un instrumento de Zymark (200+ Z). Cada una de las columnas de resina usó una membrana de poliéster de 37 micras de Spectrum Labs para el material de frita, que se soldó al cuerpo de la punta. La resina de agarosa Ni-NTA (Ni-NTA) se obtuvo de Qiagen (Alemania). La resina de sefarosa de Proteína A (ProA) se obtuvo de Repligen. La resina de agarosa de Proteína G (ProG) se obtuvo de Exalpha. La resina de sefarosa de glutatión (Glu) se obtuvo de Amersham. La mayoría de las columnas de puntas tenían volúmenes de lecho de aproximadamente 5 uL, excepto por tres puntas 200+ Z-ProA, que se prepararon con volúmenes de lecho de aproximadamente 1,25 uL, 0,62 uL y 0,25 uL. Las dimensiones específicas del lecho para los lechos de cada tipo de columna son las siguientes: 200+ PE, longitud del lecho 2,4 mm, diámetro del lecho 1,6-1,82 mm, volumen calculado del lecho de 5,5 uL; 200+ R longitud del lecho 2,3 mm, diámetro del lecho 1,5-1,82 mm, volumen calculado del lecho de 5,0 uL; 200+ Z longitud del lecho 2,5 mm, diámetro del lecho 1,43-1,82 mm, volumen calculado del lecho de 5,2 uL. Las puntas de menor volumen de lecho tenían diámetros de lecho de 1,75-1,82 mm, volúmenes de lecho de aproximadamente 1,25 uL, 0,62 uL y 0,25 uL, correspondientes a alturas de lecho de aproximadamente 0,5 mm, 0,4 mm y 0,3 mm, respectivamente.
Cabe señalar que las columnas de Zip Tip tienen contrapresiones sustancialmente más altas que las columnas de puntas que comprenden un lecho relleno de resina y fritas de membrana.
El efecto de variar la estanqueidad del relleno del lecho se evaluó comparando la contrapresión las puntas de lecho de 200+ Z-ProA, 5,2 pL que se rellenaron de manera más estanca que los otros lechos. Cabe señalar que un relleno más apretado del lecho conduce a contrapresiones sustancialmente más altas.
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 5
Purificación IMAC de una proteína etiquetada con 6XHis
Se prepara una columna de extracción de puntas de pipeta como la que se muestra en la figura 8 como se describe en el texto que acompaña a esa figura, donde el cuerpo de la columna exterior es una punta de pipeta de 200 uL, el volumen de la cámara de medios de extracción es de aproximadamente 5 uL, las fritas son membranas de malla de poliéster y los medios de extracción son resina SuperFlow Ni-NTA (Qiagen). El extremo superior abierto se conecta a un pipeteador (Gilson, Middleton, WI, P-1000 PipetteMan) para extraer muestras de la columna de puntas.
La solución de muestra es una solución de 200 pl que contiene una proteína marcada con 6XHis en 10mM NaH2PO4, 5 mM imidazol, 0,3 M NaCl, pH 7,4. El volumen total de la muestra se extrae a través de la cámara de extracción y al cuerpo de la columna accionando el pipeteador, y luego se expulsa de la columna al recipiente que inicialmente contenía la solución de muestra. Opcionalmente, este proceso de entrada y salida de la muestra puede repetirse en uno o más ciclos adicionales. Haciendo pasar la solución de muestra a través del lecho de extracción varias veces, se puede aumentar la cantidad de proteína marcada con 6XHis unida a la resina Ni-NTA, en relación con los procesos que involucran un solo ciclo de entrada-expulsión.
A continuación, los medios de extracción se lavan absorbiendo y expulsando una solución de lavado (50 nM NaH2PO4, 0,1 M imidazol, 1,5 M NaCl, pH 7,4). Un primer lavado se logra mediante dos ciclos de extracción y expulsión de 200 pL de solución de lavado. Luego se logra un segundo lavado mediante dos ciclos más de preparación y expulsión de 200 pL de solución de lavado nueva.
Finalmente, la proteína marcada con 6XHis purificada y enriquecida se eluye extrayendo y expulsando 10 pl de tampón de elución (10 mM NaH2PO4, 0,25 mM imidazol, 0,14 M NaCl, pH 7,4) a través del lecho de los medios de extracción y repitiendo este proceso de absorción y expulsión de los mismos 10 pL de tampón de elución durante dos ciclos más.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para extraer un analito de una solución, que comprende las etapas de
a. Proporcionar una columna de extracción (2), que comprende un cuerpo de columna que comprende una punta de pipeta que tiene un extremo superior abierto, un extremo inferior abierto y un canal abierto entre el extremo superior e inferior del cuerpo de la columna; una frita inferior (14) unida al cuerpo de la columna y que se extiende a través del canal abierto; una frita superior (10) unida a la columna y que se extiende a través del canal abierto entre la frita inferior y el extremo superior abierto del cuerpo de la columna (6), donde la frita superior, la frita inferior y el cuerpo de la columna definen una cámara de medios de extracción (16); y un lecho de medios de extracción colocado dentro de la cámara de medios de extracción (16), en el que los medios de extracción comprenden perlas de resina de gel de agarosa, sefarosa o celulosa,
b. Hacer pasar una muestra que contiene un analito a través de la columna de extracción y
c. Elución del analito haciendo pasar un solvente de desorción a través de la columna de extracción, en donde el lecho de medios de extracción en la columna de extracción tiene un volumen en el rango entre 0,1 y 100 |jL;
caracterizado por que
que dicha columna, que proporciona una relación aproximadamente lineal entre la contrapresión y el caudal, se ha adaptado para proporcionar una contrapresión en el rango de aproximadamente 3,45 kPa (0,5 psi) a 13,79 kPa (2 psi) cuando se hace pasar una solución acuosa a través de la columna a un caudal de 1 mL/min; y
que la solución de muestra en la etapa b. se hace pasar hacia atrás y hacia delante a través del lecho de medios de extracción más de una vez.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el solvente de desorción se hace pasar, se aspira y se descarga de la columna más de una vez.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que entre las etapas b. y c., se bombea una solución de lavado hacia atrás y hacia delante a través del lecho de extracción.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el volumen del solvente de desorción está en el rango de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 300 % del volumen del lecho de medios de extracción.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha frita superior o dicha frita inferior se compone de un material seleccionado del grupo que consiste en nailon o poliéster.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el volumen de poros de dicha frita inferior es inferior o igual al 10 % del volumen intersticial de dicho lecho de medios de extracción.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el analito es una biomolécula.
8. El método de la reivindicación 7, en el que la biomolécula es una proteína.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la frita inferior es un tamiz de membrana y la frita superior es opcionalmente un tamiz de membrana.
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