ES2902988T3 - Electrodo y procedimiento de electropermeabilización sin contacto - Google Patents

Abstract

Un procedimiento no invasivo para habilitar la administración de sustancias terapéuticas en el tejido de un mamífero mediante el uso de un dispositivo de electropermeabilización de chispas para administrar un potencial de tensión eléctrica de electropermeabilización a la superficie de un tejido de mamífero, que comprende: generar un potencial de tensión suficiente para hacer saltar un espacio de distancia predeterminada; y el suministro de dicho potencial de tensión generado en forma de una chispa que pueda saltar dicho espacio a la superficie del tejido de mamífero sin causar daño macroscópico a la integridad de la superficie del tejido de mamífero caracterizado porque dicha tensión generada está configurada para hacer reversiblemente porosas las células de dicho tejido para habilitar la administración de dichas sustancias terapéuticas a dichas células.

Description

DESCRIPCIÓN

Electrodo y procedimiento de electropermeabilización sin contacto

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a la administración de sustancias terapéuticas que incluyen macromoléculas, como polinucleótidos y polipéptidos, en células de mamíferos, particularmente en células adyacentes o cercanas a superficies de los tejidos, utilizando un novedoso sistema de electropermeabilización.

Antecedentes

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente divulgación. No implica la admisión de que dicha información sea el estado de la técnica, ni que sea relevante, para las invenciones actualmente reivindicadas, ni que cualquier publicación a la que se haga referencia específica o implícitamente sea el estado de la técnica.

La electropermeabilización de células de mamíferos es una técnica que se ha utilizado para la administración de sustancias terapéuticas, incluyendo pequeñas moléculas, como los agentes anticancerígenos bleomicina y cisplatino, y macromoléculas como ácidos nucleicos y proteínas. Típicamente, el suministro de dichas sustancias en las células se realiza inyectando la sustancia en los tejidos que contienen las células, inyección que simplemente coloca dicha sustancia en los espacios intersticiales entre las células, seguida de un contacto físico de los tejidos con un electrodo metálico de una u otra configuración y la aplicación de un potencial eléctrico a través de los electrodos. Por lo general, el electrodo se manifiesta en forma de al menos dos varillas o tubos de perforación tisular en forma de agujas opuestas que comprenden un ánodo y un cátodo. Otras formas de electrodos que entran en contacto con los tejidos son los electrodos no penetrantes, como las almohadillas planas que se encuentran en los dispositivos de electrodos "calibradores", como los que se divulgan en Patente US no. 5.439.440 y los electrodos en forma de meandro, como los divulgados en la Patente US no. 6.009.345. Otros tipos de electrodos han incluido electrodos mínimamente invasivos, como los divulgados en Patente US no. 6.603.998.

Con respecto a los electrodos mencionados anteriormente, todos operan dentro de un paradigma bien entendido en las técnicas eléctricas para requerir un contacto expreso y directo entre el electrodo y el tejido sometido a electropermeabilización. Además, el potencial eléctrico colocado a través de los polos positivo y negativo, a menudo expresado como "intensidad de campo" en voltios/centímetro, ha estado en la vecindad de decenas a cientos de voltios por centímetro, es decir, el potencial de tensión entre los polos positivo y negativo espaciados en, o sobre, el tejido una distancia determinada. Normalmente, las distancias entre los electrodos son de décimas de centímetro a centímetros completos de longitud. En la mayoría de las divulgaciones relativas a la electropermeabilización, las tensiones requeridas para proporcionar una fuerza de campo suficiente para la formación de poros celulares en los tejidos van desde un voltio para los tejidos de la piel hasta más de quinientos o seiscientos voltios para las células que yacen en los tejidos corporales más profundos. Los distintos niveles de tensión aplicados suelen depender de la separación de los electrodos positivos y negativos y de la resistencia eléctrica del tejido que se está tratando.

Ha habido muchos avances recientes en la técnica de la electropermeabilización en los que se han aplicado potenciales de baja tensión a los tejidos de la piel. En muchos de estos casos, la baja tensión aplicada ha estado ligada a periodos de tiempo muy largos para aplicar la energía eléctrica. En algunos casos, la energía eléctrica se ha aplicado en forma de corriente continua entendida en las técnicas como proporcionando un efecto de electroforesis o iontoforesis en el que las sustancias se mueven a través del tejido lentamente. En tales condiciones, y particularmente con moléculas pequeñas, los pulsos eléctricos sólo permiten que las moléculas se muevan a través del espacio intersticial del tejido, no dentro de las células del mismo. Incluso cuando una baja tensión se ha aplicado durante cortos períodos de tiempo, los electrodos comprenden la típica y compleja disposición matricial de dos polos, es decir, por ejemplo, al menos uno de cada uno de los cátodos y ánodos cargables independientemente colocados en contacto con los tejidos. Otras divulgaciones recientes explican el uso de tensiones muy altas, en el rango de 10.000 voltios o más, durante períodos de tiempo muy cortos para lograr la administración de sustancias en las células, pero sin embargo requieren el contacto de los electrodos con el tejido.

Tanto si se utilizan tensiones bajas como altas, los sistemas de electrodos que entran en contacto con los tejidos están sujetos a limitaciones prácticas, principalmente en lo que respecta a la seguridad y la comodidad, o la falta de ella, para el mamífero que recibe el tratamiento. También está la practicidad o impracticabilidad de fabricar complejos conjuntos miniaturizados que contengan ánodos y cátodos a menudo organizados para ser pulsados independientemente unos de otros en varias secuencias y direcciones de pulsación. El uso de altas tensiones con electrodos que perforan el tejido y tocan la superficie puede ser peligroso por el potencial electroshock severo si las condiciones incluyen un alto amperaje durante un tiempo superior a 10 milisegundos. El uso de tensiones bajas durante un período prolongado, aunque no suele ser peligroso, tiene el potencial de ser incómodo para el mamífero paciente o requiere procesos de fabricación complejos. Además, existe la preocupación de que los sistemas facilitados por la tensión o los procedimientos de administración den lugar a bajos niveles de eficacia.

Existen otras cuestiones que preocupan en el suministro de sustancias a las células de la superficie de la piel o de los tejidos. Por ejemplo, algunos sistemas divulgan procedimientos de administración de la sustancia a través de la superficie de la piel, es decir, el estrato córneo, seguido del suministro del potencial eléctrico con los típicos electrodos penetrantes en el tejido o de contacto con la superficie. En lo que respecta a la administración de dicha sustancia, en lugar de la inyección directa, algunos sistemas intentan extraer la sustancia directamente a través del estrato córneo mediante iontoforesis y/o electroforesis, aplicando diversos medios para abladir primero el estrato córneo antes de proporcionar la sustancia y el potencial eléctrico. Por ejemplo, un sistema utiliza un rayo láser para hacer agujeros en el estrato córneo (Patente US no. 6.527.716). Otro utiliza unas chispas de ablación de tejidos de alta intensidad, no muy diferente de un instrumento quirúrgico cauterizador (Patente US no. 6.611.706). En cada uno de estos sistemas, la metodología se basa en la alteración física del estrato córneo para suministrar la sustancia y ayudar a la transmisión de la energía eléctrica desde los electrodos que entran en contacto con el tejido.

Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de avanzar en la administración de sustancias en las células utilizando la electropermeabilización de una manera que evite los riesgos eléctricos, la incomodidad para el paciente tratado, el daño a los tejidos y la fabricación compleja. Un procedimiento y un dispositivo según el preámbulo de las reivindicaciones 1 y 5 son conocidos por el documento US2002010414.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones 1 y 5. En el presente documento se presenta una metodología novedosa y un dispositivo de electropermeabilización (o electroformación de poros) que proporciona un potencial eléctrico con una intensidad de campo suficiente para provocar la permeabilidad celular (o la formación de poros reversible) en células basadas en la piel o en la superficie de los tejidos sin causar condiciones eléctricas potencialmente peligrosas, daños físicos a la superficie de los tejidos o molestias perceptibles. Además, el electrodo novedoso es capaz de suministrar el potencial eléctrico necesario sin ser invasivo, es decir, sin penetrar en la piel.

En una realización, se divulgan procedimientos de administración de sustancias terapéuticas, que pueden incluir fármacos, pequeñas moléculas y macromoléculas a las células asociadas con las superficies de los tejidos de un mamífero, como la piel. Con respecto a la piel, el procedimiento actual puede utilizarse para suministrar dichas sustancias en las células del tejido epidérmico y dérmico. Según se define en el presente documento, las macromoléculas incluyen grandes compuestos químicos esteroideos, así como polinucleótidos como el ADN, el ARN, el ARNsi y similares, y polipéptidos como las proteínas que comprenden cadenas de aminoácidos de entre 8 y 3000 unidades de aminoácidos. En una realización, los polinucleótidos incluyen partes monocatenarias y bicatenarias, así como secuencias polinucleotídicas lineales y circulares que codifican polipéptidos que comprenden proteínas funcionales completas y fragmentos de las mismas, incluyendo epítopos cortos.

En una realización, se divulgan procedimientos para impartir un pulso de energía eléctrica suficiente (o un potencial de tensión eléctrica de electorpermeabilización) a una superficie de tejido para causar una formación de poros reversible en las células del tejido para la administración celular de una sustancia terapéutica en las células con formación de poros. En otra realización, se dan a conocer procedimientos para suministrar el pulso de energía eléctrica (o suministrar o descargar el potencial de tensión eléctrica) sin necesidad de una penetración en el tejido, y preferiblemente sin contactar el tejido con el electrodo o "sin contacto" Por lo tanto, el electrodo avanza en la técnica de impartir pulsos de energía eléctrica de electroformación de poros a los tejidos con el fin de provocar la electropermeabilización en el sentido de que no es necesario que se produzca ningún traumatismo en el tejido, como la penetración del tejido por un miembro similar a una aguja o, alternativamente, la compresión, el arañado, la quema o la ablación de la superficie de la piel distinta de la colocación subcutánea previa a la electropermeabilización de la sustancia que debe administrarse a las células.

En otra realización adicional, el sistema de electropermeabilización avanza el suministro de energía eléctrica proporcionando una ruta novedosa para la electropermeabilización de las células para la administración directa en las células de las sustancias terapéuticas en que las presentes implementaciones proporcionan una simplificación del circuito de electrodos desde el requisito de la técnica previa de dos electrodos de polaridades opuestas en el sitio de administración en un tejido para en su lugar, el uso de un solo electrodo de una polaridad singular en el lugar de administración que funciona en concierto con (o de otra manera descargando contra) la polaridad del tejido quiescente o conectado a tierra del sujeto que está siendo tratado, ya sea más positivo o más negativo en relación con la polaridad del electrodo de suministro. En otra realización, la energía impartida al tejido depende de una combinación del potencial de tensión descargado y de la distancia o "espacio" entre la punta del electrodo y la superficie del tejido. En una realización relacionada, el espacio, en lugar de existir exclusivamente entre el electrodo sin contacto y la superficie del tejido, puede incluir un elemento "regulador de chispa" situado entre el electrodo sin contacto y el circuito del dispositivo. El regulador de chispas permite descargar el potencial de tensión de forma predeterminada limitando la cantidad de corriente en función del tiempo. Además, en esta realización, el extremo distal del electrodo puede estar en contacto con la superficie del tejido, es decir, puede contactar con la superficie de la piel. En una realización relacionada, la polaridad singular del electrodo sin contacto permite hacer referencia no a la "intensidad de campo", como es común en los sistemas de electroformación de poros anteriores que requieren electrodos de polaridad opuesta, sino a la "energía total" impartida al tejido. En otra realización, el pulso de energía eléctrica proporcionado por el electrodo sin contacto puede tener una carga eléctrica total impartida en el tejido de entre 2,8*10E-8 y 2,5*10E-6 culombios para lograr la electropermeabilización que es equivalente a entre aproximadamente 0,025 mJ y 270 mJ (milijulios) de energía, como se divulga adicionalmente en la Tabla I.

En otra realización, un electrodo alternativo de polaridad única puede comprender una matriz de contacto con el tejido de electrodos no invasivos o alternativamente mínimamente invasivos que comprenden proyecciones en forma de aguja, en cada caso, todas de una polaridad singular. En una realización, el conjunto puede ser construido a partir de un único material eléctricamente conductor. Tal y como se utiliza en el presente documento, un "electrodo de polaridad única" o un "electrodo de polaridad singular" es aquel que está construido de forma que sólo posee un polo, a saber, el ánodo o el cátodo, según sea el caso. Cuando dicho electrodo de polaridad singular comprende una matriz de proyecciones similares a agujas, todos estos electrodos de proyección son pulsados en un polo desde la fuente de generación de energía eléctrica hasta el tejido. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un electrodo no invasivo es un electrodo que comprende una matriz de proyecciones en forma de aguja que no penetran a través de la capa córnea del tejido cutáneo. Tal como se utiliza en el presente documento, un electrodo mínimamente invasivo es una matriz de electrodos que comprende proyecciones en forma de aguja que penetran a través de una capa de estrato córneo hasta una profundidad de tejido subdérmico, es decir, aproximadamente de 1-2 mm. En esta realización alternativa, el electrodo entra en contacto con la superficie del tejido, pero la energía impartida por el electrodo singular deriva de un pulso eléctrico conducido a través de un regulador de chispas, como se divulga en el presente documento.

En algunas realizaciones en las que los electrodos son mínimamente invasivos o entran en contacto con la superficie del tejido, la fuente de energía puede ser una que sea capaz de generar un potencial de tensión eléctrica suficiente durante un período de tiempo inferior a 1 milisegundo, y preferiblemente inferior a 100 microsegundos. En las realizaciones preferentes, la fuente de energía es un cristal piezoeléctrico. En tales realizaciones, sólo es necesario un espacio entre la fuente de energía y el tejido - dicho espacio está entre el extremo distal del electrodo y el tejido. En algunas realizaciones, el electrodo puede tener un regulador de chispas.

En otra realización, se proporcionan procedimientos para suministrar el pulso de electroformación de poros de energía de una manera regulada en la que la descarga total de energía es controlada por un "regulador de chispa". En una realización, el regulador de chispas comprende una carcasa eléctricamente neutra o no conductora, como un plástico transparente, que encierra dos cables eléctricos separados por un "espacio" de una medida predeterminada y de una resistencia eléctrica predeterminada y, opcionalmente, en condiciones de presión atmosférica positiva o negativa, como por ejemplo un vacío o una presión atmosférica. En las realizaciones relacionadas, el regulador de chispas proporciona la capacidad para que el sistema de administración esté equipado con cualquiera de una variedad de reguladores de chispas, cada uno fabricado para preestablecer los umbrales de tensión para su uso en el establecimiento de parámetros de administración predeterminados, incluyendo tales como tensiones mínimas y máximas, rango de corriente, y cargas/energías totales y/o netas (culombios o julios) impartidas en el tejido. Se contempla que cada uno de estos parámetros puede afectar al resultado inmunológico de una enfermedad o trastorno concreto que se esté tratando en el mamífero.

En otra realización más, el regulador de chispas puede construirse para proporcionar cualquier número de niveles de energía eléctrica (o potenciales de tensión eléctrica) que puedan descargarse a través del espacio y regular así la descarga del potencial de tensión aplicado al tejido a través del electrodo. En algunos casos, los electrodos incluyen: conjunto de electrodos de polaridad única de contacto, o alternativamente, el electrodo de no contacto.

En otras realizaciones, la fuente de energía para proporcionar un potencial de polaridad única puede comprender cualquiera de entre una batería de 1 a 12 V, un condensador cargado, una bobina de carga, un cristal piezoeléctrico o un generador de Van de Graaff.

En otras realizaciones, se proporcionan procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria en un tejido de mamífero mediante la electropermeabilización de polaridad única.

Otras características y ventajas serán evidentes a partir de los siguientes dibujos, la descripción detallada y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

El sumario anterior, así como la siguiente descripción detallada de las realizaciones ilustrativas, se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar las realizaciones, se muestran en los dibujos construcciones de ejemplo de las realizaciones; sin embargo, las realizaciones no se limitan a los procedimientos e instrumentos específicos divulgados. En los dibujos:

La figura 1 es un dibujo esquemático que representa ejemplos de elementos de un dispositivo de acuerdo con la presente divulgación;

La figura 2 es una representación de cerca del electrodo de polaridad singular sin contacto separado por un "espacio" de la superficie del tejido;

Las figuras 3A, B y C son representaciones esquemáticas de tres formas que pueden utilizarse para el electrodo de polaridad singular sin contacto;

Las figuras 4A y B son dibujos esquemáticos que representan ejemplos de elementos de diseños alternativos del dispositivo de la figura 1;

La figura 5 es una vista tridimensional de un regulador de chispas;

Las figuras 6A, B y C son gráficos que representan las características de los impulsos de las descargas electrostáticas procedentes de diversas fuentes de energía;

Las Figuras 7A a F son dibujos de varios ejemplos de circuitos eléctricos que generalmente presentan los elementos de generación de carga de realizaciones alternativas;

Las figuras 8A y B son gráficos que muestran descargas de pulsos utilizando un generador de Van de Graaff; y La figura 9 es un gráfico que muestra los títulos de los anticuerpos contra la proteína de la gripe (NP) después de la inyección dérmica y de la pulsación mediante el procedimiento del espacio de chispas de la divulgación.

Implementaciones detalladas de la divulgación

Se proporcionan en la presente memoria sistemas y procedimientos novedosos de electropermeabilización (o electroformación de poros) para impartir pulsos eléctricos de energía de electropermeabilización a las superficies de los tejidos utilizando un electrodo sin contacto, en el que el electrodo no entra en contacto con el tejido, o un electrodo de contacto en el que el electrodo sí entra en contacto con el tejido con una penetración mínima de la piel, y preferiblemente sólo un contacto superficial.

La figura 1 es un dibujo esquemático que representa ejemplos de elementos de un dispositivo 10 que descansa sobre una superficie de tejido 15 en la que se ha colocado un bolo de sustancia terapéutica 16. El dispositivo tiene una carcasa 11 que contiene una fuente de energía eléctrica 14, un circuito 13 y un electrodo de polaridad singular sin contacto 12. La carcasa 11 forma un carenado que rodea y se extiende una medida predeterminada mayor que una longitud del electrodo 12.

La figura 2 es una representación de cerca del electrodo de polaridad singular sin contacto 12 separado por un "espacio" 17 de la superficie del tejido 15.

Las figuras 3A, B y C son representaciones esquemáticas de tres formas útiles para el electrodo de polaridad singular sin contacto. En la Fig. 3A, la punta del electrodo es esférica. En la Fig. 3B, la punta es puntiaguda. En la Fig. 3C, la punta es plana.

El término "potencial de tensión suficiente" o "tensión de potencial suficiente" cuando se refiere a la fuente de energía y al potencial de tensión que dicha fuente genera, el término se refiere a una cantidad mínima de potencial de tensión que se requiere para generar una chispas que sea capaz de saltar a través del espacio en el electrodo (es decir, el espacio de separación del regulador de chispas), o el espacio entre el electrodo y la superficie del tejido cuando el regulador de chispas, para administrar una carga deseada al tejido.

El término "distancia predeterminada" o "distancia deseada" cuando se refiere al espacio en el sistema de electropermeabilización, se refiere al espacio de separación del regulador de chispas o al espacio entre el extremo distal del electrodo y la superficie del tejido (cuando no hay regulador de chispas). Sin embargo, si en dicho sistema se proporcionan tanto el espacio de separación como la espacio entre el electrodo y el tejido, ninguno de los dos espacios será mayor que la de la distancia predeterminada. En las realizaciones en las que están presentes ambos espacios, el espacio entre el extremo distal del electrodo y la superficie del tejido será igual o más corto que el espacio de separación del regulador de chispas.

En una primera realización, el dispositivo 10 puede comprender un electrodo 12 que no necesita entrar en contacto con la superficie del tejido 15 para impartir en el tejido un pulso de energía eléctrica suficiente para causar la electropermeabilización de las células en el tejido. Esta capacidad de proporcionar suficiente energía al tejido sin que el electrodo 12 toque el tejido 15 es un concepto novedoso en el campo de las técnicas de electroformación de poros. Además, la energía puede ser suministrada al tejido a través del electrodo 12 sin causar ningún daño discernible, como la quema o ablación de la superficie del tejido 15. En cambio, en lo que respecta a la transmisión de energía al estrato córneo, por ejemplo, la energía se transmite al tejido mientras el estrato córneo permanece intacto macroscópicamente. Específicamente, la energía eléctrica se aplica directamente a la superficie del tejido 15 en un lugar directamente por encima o en las proximidades de un bolo de sustancia terapéutica previamente administrado que se ha inyectado justo debajo de la superficie del tejido 15. En una realización, el bolo se inyecta en un paciente mamífero, como un ser humano, en cualquiera de las localizaciones subepidérmicas, subcutáneas o intradérmicas. La descarga eléctrica puede ser dirigida como un solo, o alternativamente, una pluralidad de pulsos individuales a varias porciones del área de tejido que contiene el bolo. Por macroscópicamente intacto, se entiende que no hay daños o alteraciones histológicas macroscópicas discernibles en el estrato córneo.

En esta primera realización, el electrodo sin contacto 12 funciona como una fuente de descarga puntual en la que la energía eléctrica pulsada al electrodo desde el circuito del sistema se descarga a la superficie del tejido 15 a través de un espacio (aire) 17 de una medida predeterminada. En concreto, el impulso eléctrico se descarga mediante una chispas que salta a través del espacio 17 en el tejido, tras lo cual la energía eléctrica se disipa a través del tejido. Así, el electrodo 12 imparte una descarga estática de polaridad singular en el tejido. Los pulsos de energía pueden comprender de 1 a más de 100 chispas individuales impartidas a la superficie del tejido 15 con la punta del electrodo descansando en cualquier lugar de 0,01 cm a 10 mm por encima de la superficie del tejido. En una realización, la energía total que pasa a los tejidos a través de la chispa es suficiente para causar la electropermeabilización de las células dentro del tejido, pero no es tan grande como para causar cualquier daño discernible al tejido o a la superficie del tejido 15. En general, la energía eléctrica puede describirse como pulsos eléctricos estáticos. Normalmente, para lograr la transferencia del pulso de energía desde el electrodo a través de un espacio de aire 17 a la superficie del tejido 15 se requieren potenciales de tensión que están en el rango de los kilovoltios. Aunque los potenciales de alta tensión sugieren por sí solos la posibilidad de peligro o incomodidad para el mamífero tratado, dado que la generación de altas tensiones es de naturaleza eléctrica estática, y debido a que la descarga a través del espacio de aire 17 ocurre en un marco de tiempo extremadamente corto (nanosegundos), hay poca corriente generada en el tejido para causar daño tisular, a pesar de que los amperajes alcancen valores significativos. De este modo, el sistema permite la descarga de un potencial de alta tensión con poco peligro de lesión para el paciente. En una realización, el potencial de tensión puede oscilar entre 5 kvoltios y más de 100 kvoltios. El tiempo de descarga puede estar entre 5 nanosegundos y 5 microsegundos cuando el espacio 17 entre el electrodo y la superficie del tejido está entre 0,01 cm y 1 cm. Cuando, como en esta realización, el espacio 17 entre el electrodo 12 y la superficie tisular 15 actúa como un regulador de chispas de facto, es decir, no hay un regulador de chispas separado en el circuito anterior, el espacio 17 puede ser de hasta 1 cm sin que el flujo de corriente resultante sea demasiado grande por motivos de seguridad y sensación. Dentro de este rango de separación, en cada caso la transmisión de energía eléctrica es apenas perceptible.

Se pueden utilizar varias fuentes de energía eléctrica para generar los potenciales de tensión para el electrodo sin contacto 12. Por ejemplo, se puede utilizar un aparato de Van de Graaff para generar potenciales eléctricos estáticos en los que una cúpula metálica actúa como condensador para crear una carga de entre 5 kvoltios y 100 kvoltios que se puede canalizar a través de los circuitos 13 hacia el electrodo durante un periodo de descarga de entre 5 nanosegundos y 5 microsegundos. Alternativamente, se puede utilizar un cristal piezoeléctrico en el que un mecanismo de impacto puede crear pulsos de alta tensión de corta duración de 20 a 100 nanosegundos. En otra variante, puede disponerse una bobina Tesla de alta tensión con un transformador y un interruptor en el que una bobina primaria puede utilizarse para inducir una bobina secundaria a un potencial de 5 voltios a 100 kvoltios durante un período de 40 a 100 nanosegundos. En otra variante, se puede utilizar una batería de 1, 3, 9 o 12 voltios, por ejemplo, para cargar un condensador que genere potenciales de tensión de 100 voltios a 1 kilovoltio que puedan descargarse a través de la bobina primaria de un electrodo sin contacto 12 a la superficie del tejido 15 o, alternativamente, a través de un regulador de chispas (véanse las figuras 4A y 5) a un electrodo de contacto con el tejido de polaridad única 12. Por último, se puede utilizar una fuente de corriente alterna en conexión con un transformador para construir el potencial de tensión estática y operar como se divulga en la presente memoria en forma de polaridad singular. Una persona con conocimientos ordinarios de las tecnicas eléctricas comprenderá los detalles de cómo se pueden organizar los circuitos apropiados para utilizar estos y otros generadores de energía eléctrica para crear un potencial de tensión apropiado y suministrar el potencial al electrodo sin contacto 12 directamente o primero a través de un regulador de chispas para un mayor control de la descarga eléctrica.

En algunas realizaciones en las que los electrodos son mínimamente invasivos o entran en contacto con la superficie del tejido, la fuente de energía puede ser una fuente que sea capaz de generar un potencial de tensión eléctrica suficiente durante un período de tiempo inferior a 1 milisegundo, y preferiblemente inferior a 100 microsegundos. En las realizaciones preferentes, la fuente de energía es un cristal piezoeléctrico.

Utilizando cualquiera de las diferentes fuentes de energía eléctrica señaladas en el presente documento, la descarga de la energía eléctrica se producirá de forma natural a través del regulador de chispas, o de otro modo a través del espacio 17 desde el electrodo sin contacto 12 a la superficie del tejido 15, de una manera oscilante, de tal manera que la polaridad del pulso realmente se invierta en tramas de tiempo de nanosegundos. Dicha descarga probablemente modere la intensidad de la potencia del pulso, evitando así que el potencial de tensión en chispas queme, ablada o dañe de otro modo la superficie del tejido 15.

Las Figuras 4A y B son dibujos esquemáticos que representan ejemplos de elementos de diseños alternativos para el dispositivo en el que el electrodo de polaridad singular comprende una matriz de electrodos de polaridad singular en contacto con el tejido 19 que está conectada a un regulador de chispas 18, como se muestra en la Figura 4A, o alternativamente comprenda un electrodo sin contacto 12 conectado a un regulador de chispas 18 como se representa en la Figura 4B.

Con respecto a la regulación de las energías totales impartidas al tejido utilizando el electrodo sin contacto, las energías suficientes para la electropermeabilización pueden adaptarse ajustando la medida del espacio entre la punta del electrodo sin contacto y la superficie del tejido, o alternativamente la medida del espacio de un regulador de chispas, o alternativamente ajustando la combinación de un espacio en el regulador de chispas dentro del circuito y el espacio entre la superficie del tejido y el electrodo sin contacto. Por ejemplo, la electrónica del sistema y el electrodo pueden estar dispuestos de tal manera que el espacio entre el electrodo sin contacto y la superficie del tejido no sea el único lugar para la regulación de la descarga de tensión. Por el contrario, el electrodo sin contacto puede tener un regulador de chispas aguas arriba del electrodo sin contacto, como se representa en la figura 4B, a fin de establecer la regulación de la descarga lejos del electrodo sin contacto/zona de tratamiento. Esto es similar a la disposición alternativa en la que la guía de electrodos de contacto con el tejido de polaridad única está conectada a un regulador de chispas aguas arriba, como se muestra en la Figura 4A.

La regulación de chispas para la electroformación de poros permite la administración de pulsos de tensión extremadamente cortos y de alta intensidad sin peligro para el mamífero tratado y sin afectar macroscópicamente el estrato córneo. La distancia mínima de separación puede calcularse para establecer las tensiones que se utilizarán en la electroformación de poros. Por ejemplo, a 1 atmósfera (760 torr) y a temperatura ambiente (20 grados Celsius), basándose en la Ley de Paschen y en el mecanismo de ruptura de Townsend en los gases, tal y como lo entiende una persona con conocimientos ordinarios de la técnica, en el que N es la densidad del aire, "d" es la medida del espacio, bajo la fórmula Tensión = K(Nd), la tensión de ruptura necesaria para cruzar un espacio de las medidas se revela en la Tabla I.

La figura 5 es una vista tridimensional de un regulador de chispas en el que los cables eléctricos 22 y 23 están separados por un espacio 24 de una medida predeterminada dentro de la carcasa 25. Como se muestra en la figura 5, el regulador de chispas es un dispositivo que comprende una carcasa 25, construida con un material eléctricamente inerte, como el vidrio, el plexiglás o el plástico transparente, que encierra cada uno de los dos hilos, un cable conductor 20 y un cable receptor 21 , colocados de manera que haya un espacio 24 que separe los extremos terminales 22 y 23, respectivamente, de los mismos. La carcasa está construida de manera que pueda haber un espacio de vacío, si se desea, que comprenda el espacio 24. Este aspecto del vacío permite que se produzca cualquier descarga de energía eléctrica entre los extremos terminales 22 y 23 de los cables a través del espacio sin que las moléculas atmosféricas influyan en la resistencia de la transferencia de carga eléctrica a través del espacio. De esta manera, el espacio puede ser construido para tener cualquier medida de longitud práctica para su uso en la carga de chispas del cable conductor al receptor y así controlar específicamente la cantidad de energía que puede descargar a través del espacio. Normalmente, el espacio puede medir entre 0,01 y 4 cm.

Las figuras 6A, B y C son gráficos que representan las características de los pulsos de las descargas electrostáticas de varias fuentes de energía. La Fig. 6A es un gráfico de la descarga de un generador de Van de Graaff, la Fig. 6B es un gráfico de la descarga de un cristal piezoeléctrico, y la Fig. 6C es un gráfico de la descarga de una bobina de chispas. Cada una de las figuras ilustra el tiempo respecto a la tensión.

Como se representa en la Figura 6A, la descarga de un pulso de un generador de Van de Graaff ocurrió a través de unos 40 nanosegundos de forma sinusoidal, teniendo cada polaridad un pulso de entre unos 2 y 5 nanosegundos. La descarga de un cristal piezoeléctrico proporcionó una descarga sinusoidal similar a la mostrada en la Figura 6B. En este caso, la bipolaridad de la descarga sinusoidal se produjo en poco más de 10 nanosegundos. En otro ejemplo de descarga de fuente de pulsos eléctricos, se muestra en la figura 6Cuna descarga a través de un espacio de aire utilizando una bobina de chispas (transformador elevador por pasos). En este caso, la descarga es aún más corta, del orden de 10 nanosegundos, pero en la presente situación, la descarga es en un solo pico sinusoidal amplio. Así, la descarga generada por la bobina de chispas tiene impulsos singulares inherentemente más largos de cualquier polaridad. Cuanto más largo sea el pulso único, más asociación con el daño a los tejidos se observa. En una realización, el potencial y la descarga generados por Van de Graaff y piezoeléctricos proporcionan resultados superiores al no causar ningún efecto discernible en la superficie del tejido, mientras que la generación a partir de una bobina de chispas tiene el potencial de asociarse con efectos en el tejido si la energía total del potencial es superior a un nivel predefinido. Por lo tanto, las chispas, independientemente de cómo se generen, son las que pueden generarse y descargarse en la superficie del tejido sin causar, ni a propósito ni inadvertidamente, daños a la integridad del estrato córneo.

Las Figuras 7A a F son dibujos de varios circuitos eléctricos que generalmente presentan los elementos de generación de carga de realizaciones alternativas. En la Figura 7A, se representa un sistema generador de Van de Graaff en el que la acumulación de carga se suministra al tejido del paciente directamente con un electrodo de polaridad única sin contacto y una placa de tierra. Este sistema también puede incluir un regulador de chispas si se desea. En la Figura 7B, una fuente de energía de la batería puede estar dispuesta para aumentar la tensión y enviar la carga a través de un regulador de chispas al tejido del paciente. En la Figura 7C, se muestra un circuito más sencillo en el que la carga generada se envía a través de un regulador de chispas al tejido del paciente. En la Figura 7D, se muestra un circuito en el que la carga se genera utilizando un cristal piezoeléctrico. En este caso, la carga puede ser enviada directamente al electrodo sin contacto o puede ser enviada a través de un regulador de chispas antes de ser enviada al tejido del paciente. En la Figura 7E, se muestra un circuito que representa una bobina conmutada por un transistor de efecto de campo (FET) de alta tensión. En la figura 7F, se muestra un circuito que representa una bobina conmutada manualmente.

Un circuito generador de Van de Graaff puede ser relativamente simple, utilizando como componentes básicos un circuito que comprenda un generador de Van de Graaff unido al elemento de electrodo sin contacto, de manera que el potencial de carga generado se regule en su administración al tejido mediante la separación a través del espacio entre el electrodo sin contacto y la superficie del tejido. Alternativamente, el potencial de carga puede enviarse a un regulador de chispas y luego al tejido a través del electrodo sin contacto o del electrodo de matriz polar única en contacto con el tejido. No es necesario que haya ningún contraelectrodo. Más bien, el sistema prevé intrínsecamente la administración de energías que se descargarán a través del tejido corporal en el medio ambiente. Una variante al uso de ningún contraelectrodo puede ser el uso de una placa de tierra o una almohadilla de pie eléctricamente conductora para ayudar a la descarga completa de energía a través del cuerpo. Además, dado que hay una menor carga total neta impartida al tejido a través del pulso generado por Van de Graaff (probablemente asociado con la naturaleza oscilante de la descarga estática, como se muestra en la Figura 6A), hay incluso menos preocupación por la necesidad de un contraelectrodo para disipar el potencial eléctrico impartido.

Las figuras 7B y C representan circuitos que incorporan reguladores de chispas. Estos circuitos son compatibles con el electrodo sin contacto o con el electrodo de contacto tisular de polaridad única. En la figura 7B, las baterías "Bat 1" y "Bat 2" están conectadas a las bobinas primarias de "xfr 1" y "xfr 2" mediante el interruptor SW1, en el que los devanados secundarios de xfr 1 y xfr 2 son mayores que sus respectivos devanados primarios en la misma proporción con respecto a la tensión en los devanados secundarios en comparación con la tensión de Bat 1 y Bat 2. Estos devanados secundarios son rectificados por el diodo D1, y se conectan a las bobinas adicionales L1 y L2 que aumentan aún más la tensión suficiente para saltar el espacio en la unidad "espacio de chispas" que impulsa la bobina primaria del "xfr 3" para inducir la tensión final visto por el electrodo de chispas en el paciente que está conectado a tierra con el medio ambiente. En esta configuración, el espacio de chispas puede ser de tan sólo 0,01 cm. En la figura 7C , el interruptor SW 1 transfiere la tensión de la batería a la bobina primaria de xfrl y a la bobina secundaria de xfr 1, que es más grande que la bobina primaria, y se conecta a un regulador de chispas incrustado dentro de la bobina primaria del transformador de salida, tras lo cual lo lleva al paciente.

La figura 7D es un dibujo que representa un circuito que emplea un cristal piezoeléctrico. Al igual que el generador Van de Graaff, el impulso de carga puede enviarse directamente al electrodo sin contacto o puede enviarse a través de un regulador de chispas a un electrodo de contacto tisular de polaridad única. Además, al igual que con el generador de Van de Graaff, no es necesario que haya un electrodo de retorno, sino que, si se desea, se puede utilizar un medio de conexión a tierra, como una almohadilla conductora, por ejemplo, sobre la que se sitúe el mamífero tratado.

Las figuras 7E y F representan circuitos generadores de potencial de tensión de bobina. En la figura 7E se muestra una bobina conmutada por un transistor de efecto de campo (FET) de alta tensión. En este caso, cuando se aplica un impulso a la base del FET 1, como se indica en el diagrama, cerrando un interruptor, la bobina L1 se conecta a tierra y la corriente comienza a fluir desde la batería (Bat) a través de L1. Cuando el FET 1 se apaga, la corriente intenta continuar a través de la bobina inductiva de L1 pero no puede, y provocará una chispas a través del paciente hasta que la energía almacenada en L1 se disipe. Del mismo modo, la figura 7F muestra una bobina conmutada manualmente en la que se produce el mismo mecanismo cuando se abra el interruptor después de que la bobina haya acumulado carga.

Las figuras 8A y B son gráficos que muestran descargas de pulsos utilizando un generador de Van de Graaff. En la Fig. 8A, se representa el pulso en el que hay 100 nanosegundos por división en el gráfico. Hay unos 500 nanosegundos de pulso decreciente a aproximadamente 1 voltio por división. Esto se traduce en 10 amperios por división o una corriente máxima de 25 amperios. Este ejemplo tiene un pico de impulso inicial que dura unos 30 nanosegundos. En la Fig. 8B, la misma sección del pulso se muestra en incrementos de 10 nanosegundos que muestran la naturaleza de unos 30 nanosegundos del pico inicial del pulso.

En otras realizaciones relacionadas, como se muestra en el ejemplo de las Figuras 8A y B, la descarga de un generador de Van de Graaff es en realidad una descarga oscilante en la que hay una inversión de la polaridad de las chispas con inversiones del flujo de carga en retrocesos decrecientes hasta que la energía, medida en voltios, cae por debajo de ese valor que permite el salto de la carga a través del espacio. El flujo de carga oscilante a través del espacio puede ocurrir por debajo del valor de corte inicial del espacio debido a que el flujo de carga a través del espacio de aire se convierte en un plasma. La descarga observada continúa entonces en oscilaciones que se extienden hasta aproximadamente 1 milisegundo, aunque el primer pulso inicial se produjo en menos de 40 nanosegundos.

En otras realizaciones, la descarga del potencial eléctrico puede ser enviada al tejido utilizando una variante al electrodo de no contacto, concretamente a través de un electrodo de contacto con el tejido de polaridad singular. En esta realización alternativa, en lugar de una chispas directamente a la superficie del tejido, la energía se dirige a una matriz de polaridad única de proyecciones en forma de aguja después de pasar a través de un regulador de chispas aguas arriba. En una realización, las proyecciones en forma de aguja son de tipo no invasivo o, alternativamente, de tipo mínimamente invasivo. Además, el electrodo de polaridad singular puede fabricarse a partir de un simple bloque de material conductor de la electricidad. En una realización relacionada, la matriz de "patillas" o proyecciones en forma de aguja puede comprender una matriz de varias dimensiones como, por ejemplo, de 1 a 100 patillas dispuestas en una cuadrícula como una matriz de 4 X 4 o alternativamente una de 10 X 10, o cualquier otra configuración o forma, como una cuadrícula cuadrada o una cuadrícula circular.

En cualquiera de las dos realizaciones alternativas del electrodo, es decir, el electrodo de chispas sin contacto de polaridad singular, o la matriz de polaridad singular en contacto con el tejido, como reconocerá un experto en las técnicas eléctricas, existe la necesidad de que el potencial de tensión se descargue a través del tejido y, ostensiblemente, encuentre su camino hacia un potencial cero. Esto puede lograrse colocando una placa de descarga, esencialmente un electrodo de polaridad opuesta, en contacto con el mamífero tratado o, preferiblemente, haciendo que la carga impartida se conecte a tierra en el tejido del propio animal tratado. En contraste con esta necesidad física de que el potencial de tensión se descargue completamente desde el sitio de entrada al tejido, no hay un requisito de que haya un electrodo de potencial opuesto cerca del sitio de suministro de la descarga de polaridad singular que se suministró desde los electrodos. El mamífero tratado debe estar conectado a tierra lo suficiente como para que la carga estática impartida al mamífero alcance el potencial de tierra. Esto puede lograrse mediante la disipación del potencial impartido a través de los tejidos del cuerpo del mamífero o, alternativamente, se puede colocar un material conductor de la electricidad a distancia en contacto con el cuerpo del mamífero, como una almohadilla conductora de la electricidad para los pies.

Para calcular los valores de la Tabla I, la mayor parte de la descarga, ya sea utilizando un generador de Van de Graaff, un cristal piezoeléctrico o una bobina Tesla, se produce en el extremo delantero del pulso (como se muestra en las Figuras 8A y B). Así, tomando los valores obtenidos del pico de pulso frontal, se pueden determinar los amperios, culombios y la energía total que se imparte en el tejido que se produce a partir de una variedad de potenciales de tensión inicial. Por ejemplo, una carga positiva que tenga una corriente de pico de 20 amperios y que dure aproximadamente 40 nanosegundos (amperios x duración del pulso = culombios) equivale aproximadamente a 8,0*10E-7 culombios para un espacio de 10 mm. Cada uno de los valores de la Tabla I se ha calculado de forma similar, como comprenderá una persona con conocimientos ordinarios de la técnica.

Tabla I

Específicamente, la energía eléctrica mínima necesaria para cruzar un espacio de una distancia dada usando un generador de Van de Graaff se revela en la Tabla I. Con ese potencial de tensión mínimo, la longitud mínima del pulso y la corriente mínima pueden calcularse como se indica. Además, se puede calcular la carga total, en culombios, descargada a través del espacio. De este modo, se puede representar gráficamente la descarga real y calcular la energía neta, en julios, impartida en el tejido. A partir de esta Tabla I, se pueden determinar las energías mínimas capaces de ser suministradas a la superficie del tejido para cualquier espacio empleado en el dispositivo, tanto si se utiliza el espacio entre el electrodo y la superficie del tejido y/o el regulador de espacio anterior. Esta regulación de los espacios de chispas es útil para las realizaciones alternativas, por ejemplo, el electrodo sin contacto y la matriz de electrodos de contacto con el tejido. En ambos casos, se puede administrar una descarga de potencial de tensión de polaridad singular con un suministro de energía total conocido bajo demanda. Dado que esa descarga tendrá lugar durante un período de impulso de aproximadamente entre 5 nanosegundos y 5 microsegundos, no hay ningún daño potencial para el mamífero tratado. Este corto período de tiempo de los pulsos permite una corriente de 4 a 70 amperios con energías totales muy bajas, entre unos 0,00001 y 0,5 julios, sin ningún peligro significativo para el mamífero tratado, a pesar de los altos niveles de tensión asociados a la descarga a través del espacio.

Por ejemplo, un generador de Van de Graaff, como por ejemplo uno cargable a entre 75 kvoltios y 100 kvoltios, fue cargado a 100 kvoltios y la carga descargada a través del espacio de chispas fue calculada para ser aproximadamente 10-5 Culombios. Específicamente, como la carga se acumula en la gran cabeza metálica del generador Van de Graaff, que actúa como un condensador a través del dieléctrico del aire sobre un espacio de chispas de aproximadamente 4 cm, se producirá una ruptura sobre este espacio una vez que la tensión sea superior a unos 100 kvoltios. Al producirse la ruptura y la cargo empieza a administrarse a través del espacio, el aire se ioniza entre la cabeza del electrodo y la piel/tejido del sujeto mamífero, y la corriente comienza a fluir hasta que la carga de Van de Graaff se iguala con el potencial estático del tejido. Sin embargo, dado que la corriente que fluye tiene inercia, el punto de igualdad de potencial entre la cabeza de Van de Graaff y el tejido se invertirá, y acumulará una carga relativa opuesta en comparación con el momento en que se inició la descomposición. Habrá varias oscilaciones de inversión de potencial a medida que la corriente fluye de un lado a otro, hasta que la diferencia de potencial cae por debajo de un mínimo para mantener el aire del espacio de chispas ionizado, momento en el que el evento de chispas termina.

De manera similar, los cálculos de las energías impartidas en el tejido pueden hacerse para los potenciales de tensión generados tanto por los cristales piezoeléctricos como por las bobinas Tesla, como se muestra en las Tablas II y III, respectivamente, dadas a continuación. En estas condiciones, los cálculos tabulares fueron 1 atmósfera (760 torr), 20 grados Celsius, basados en la Ley de Paschen, mecanismo de ruptura de Townsend en gases; V=K (Nd), N=densidad del aire, d=espacio; corriente medida con el medidor de corriente Pearson modelo 411, calibrado a 0,1 V/Amp. Q (culombios) = I (amperios) x t (segundos), E (julios) = Q x voltios.

Tabla II*

Tabla III**

Por ejemplo, los cálculos sobre la energía total impartida se llevaron a cabo utilizando un monitor de corriente inductiva Pearson (Modelo 411, Pearson Electronics, Inc., Palo Alto, CA, USA) que desarrolla una relación de corriente de tensión de 0,1 voltios/amperios, y un osciloscopio Tektronix TDS210 (Tektronix, Inc, Beaverton, OR, USA) con un cristal piezoeléctrico capaz de generar una chispas de 1 cm de longitud, dio como resultado la generación de 25 Amperios en un pulso de 20 nanosegundos para suministrar aproximadamente 10-6 Culombios de carga eléctrica. En concreto, I = dQ/dt con 1 culombio = lamp x 1seg resulta en 25 amperios x 20 x 10-9 seg = 0,5 x 10-6 culombios.

En otro ejemplo, utilizando la fórmula I = delta Q/delta t, que también puede escribirse como dQ = I x dt = V/R x dt, en la que I = corriente, Q = energía en culombios, V = voltios, R = resistencia en ohmios, y t = tiempo, utilizando un cristal piezoeléctrico, se genera una corriente de 10 amperios en un pulso de 100 nanosegundos y una transferencia de carga total de 10-6 culombios. Específicamente, la punta del generador piezoeléctrico, que es conductora, como un metal eléctricamente conductor, y en contacto con un lado del cristal piezoeléctrico, se acerca a aproximadamente 1 cm de la piel/tejido del sujeto mamífero. El otro lado del cristal piezoeléctrico está conectado a otro conducto eléctrico que posteriormente está conectado a tierra con el entorno del mamífero sujeto, en el que el sujeto conectado a tierra está en comunicación eléctrica con este segundo lado del circuito de cristal. Al aplicar un impulso mecánico al cristal, se genera un pulso de alta tensión de entre 15 y 35 kvoltios. Este pulso, dirigido a la cabeza del electrodo, y colocado a aproximadamente 1 cm del tejido estará a un potencial eléctrico con respecto al sujeto conectado a tierra que es suficientemente alto para ionizar el espacio de aire entre el punto más cercano de la superficie del tejido del sujeto de prueba al electrodo. Además, la corriente fluirá hasta que se disipe la corriente creada en el cristal por el impulso mecánico.

Como se ha indicado anteriormente, las figuras 6A, B y C muestran la descarga de tensiones de tres fuentes diferentes de generación de energía. En la Fig. 6A, se muestra la descarga de Van de Graaff en la que la descarga comprende realmente una forma de onda oscilante. Así, la energía total impartida al tejido no sólo se produce en menos de unos 40 nanosegundos, sino que es en realidad una red de polaridades opuestas que oscilan en el tejido. Además, el periodo de impulso para cada polaridad de impulso es extremadamente corto, concretamente de 2 a 5 nanosegundos. Del mismo modo, como se muestra en la Fig. 6B, la descarga de un cristal piezoeléctrico se produce naturalmente de una manera algo oscilante, de nuevo cada polaridad del pulso es muy corto, aproximadamente de 2-5 nanosegundos. Además, como se muestra en la Fig. 6C, la descarga de una bobina de chispas también exhibe una oscilación en la descarga real, pero en este caso, la forma de onda comprende periodos de pulso único y largo en cualquier polo de la oscilación, un fenómeno diferente de la descarga que se produce a partir del Van de Graaff o generadores de cristal piezoeléctrico. La descarga de un generador de bobina de chispas, si el potencial de tensión es demasiado alto, puede causar daños en los tejidos. Así, cuando se utiliza una bobina de chispas como fuente de generación, el sistema se adapta para descargar sólo energías suficientes para la electropermeabilización y no dañar el tejido.

Ejemplos

A. Experimento con electrodos sin contacto

Un dispositivo que comprende un generador de Van de Graaff como fuente de energía y un electrodo sin contacto fue colocado 1 cm por encima de la superficie de un tejido de mamífero (cobaya) fue pulsado con 4 u 8 descargas de chispas a través de un espacio de 1 cm y por encima de un bolo de 50 pl (microlitro) de inyección intradérmica previamente administrada de proteína verde fluorescente (2mg/ml de plásmido de ADN en PBS) que expresa el plásmido (plásmido pgw12-GFP de Aldevron, N. Dakota). El espacio de chispas utilizado con el generador Van de Graaff es de aproximadamente 1 cm, lo que da lugar a una secuencia repetida de 4 u 8 chispas de aproximadamente 30 kvoltios, lo que da lugar al suministro de aproximadamente 25 milijulios de energía durante cada evento de chispas. Si la electropermeabilización ha tenido lugar y el plásmido ha entrado en las células del tejido epidérmico, la proteína codificada por el plásmido se expresará y la proteína verde fluorescente será fluorescente bajo la luz UV.

En este experimento, el electrodo sin contacto se colocó directamente sobre el sitio donde se inyectó intradérmicamente un bolo de 50 pl de GFP (2mg/ml de plásmido de ADN en PBS). La intensidad de la expresión de la GFP es considerable cuando sólo se administran cuatro descargas de chispas. Se obtuvieron resultados similares cuando se administraron ocho descargas de chispas.

B. Matriz de contacto tisular no invasivo de una sola polaridad

Se obtuvo un dispositivo que incluía un generador de Van de Graaff y una matriz de 4 por 4 de contacto tisular de polaridad única no invasiva para suministrar 4 u 8 pulsos al tejido. Se obtuvieron cobayas y se trataron en cuatro experimentos repetidos mediante una inyección intradérmica en bolo de 50 pl de GFP (2mg/ml de plásmido de adn en PBS), seguida de la pulsación de la superficie del tejido utilizando el electrodo de contacto de polaridad única (30 kvoltios, separación de 1 cm, 4 a 8 pulsos de unos 25 milijulios de energía). Los pulsos se enviaron efectivamente a la matriz, en la que cada aguja o patilla recibió una carga equivalente para disiparse en el tejido. La GFP se electroformaron poros con éxito en los tejidos epidérmicos tanto si se administraron 4 pulsos como 8 pulsos.

C. Electrodo de contacto tisular invasivo de polaridad única

Un dispositivo que incluye un generador de Van de Graaff y un electrodo de penetración tisular se probó en cobayas utilizando 280 pl de 0,1 mg/ml de GFP administrada en un solo bolo a través del suministro en el tejido desde el propio electrodo de penetración tisular. La chispa única en un electrodo invasivo proporcionó sitios de electroformación de poros a las células del tejido.

D. Sistema de electropermeabilización mediante cristal piezoeléctrico

Un dispositivo que comprende un cristal piezoeléctrico como fuente de energía y una matriz de electrodos de contacto se coloca a 1 cm por encima de la superficie de un tejido de mamífero y se pulsa con 4 u 8 descargas de chispas a través de un espacio de 1 cm y por encima de un bolo de 50 pl (microlitros) que se administra previamente por inyección intradérmica de plásmido que expresa proteína verde fluorescente (plásmido pgw12-GFP de Aldevron, N. Dakota). Este espacio debe dar lugar a una secuencia repetida de 4 u 8 chispas, lo que resulta en el suministro de aproximadamente 25 milijulios de energía durante cada evento de chispas. Si la electropermeabilización ha tenido lugar y el plásmido ha entrado en las células del tejido epidérmico, la proteína codificada por el plásmido se expresará y la proteína verde fluorescente será fluorescente bajo la luz UV.

La aplicación de los procedimientos y dispositivos de la presente memoria descritos son muy adecuados para la administración celular de moléculas terapéuticas a las células para provocar respuestas inmunes o para otros tratamientos. Esta tecnología es muy adecuada para la administración de vacunas basadas en el ADN y para las terapias basadas en genes. Por ejemplo, una cantidad terapéutica de sustancia que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico o una formulación del polinucleótido y sales biológicas, como bien sabe un experto en la técnica farmacéutica, puede inyectarse en tejidos epidérmicos, dérmicos o subdérmico, seguido de la administración al tejido de una descarga de energía eléctrica desde el dispositivo a través del electrodo sin contacto o, alternativamente, la matriz de contacto con el tejido de polaridad singular, y el polinucleótido inyectado se electroformarán poros en las células de ese tejido. Además, el uso del procedimiento de la vía de chispas permite la electropermeabilización del tejido objetivo, específicamente las capas más altas de los tejidos de la piel. La expresión de GFP sólo se produce en las capas más superficiales de la piel.

Experimento inmunológico

En experimentos adicionales, los animales inyectados con antígeno de la gripe (NP) y pulsados con el aparato, fueron estudiados para la expresión de anticuerpos contra el antígeno. En concreto, los animales de prueba (cobayas) recibieron inyecciones intradérmicas del antígeno (bolo de 50 pl que contenía 1 mg/ml de plásmido NP), seguidas de una electropermeabilización mediante el aparato de chispas (cada animal recibió 10 chispas por punto de inyección). Se realizó un seguimiento de los títulos hasta las diez semanas, como se muestra en la Figura 9, que es un gráfico que muestra los títulos de los anticuerpos contra la proteína de la gripe (NP) después de la inyección dérmica y de la pulsación mediante el procedimiento de las chispas. Los datos de los animales con pulsos de chispas se comparan con la respuesta inmunitaria provocada por la administración de antígeno en el músculo con pulsos mediante un sistema sin chispas, y con la inyección dérmica de antígeno sin pulsos como control. Los animales fueron reforzados con una inyección de antígeno en la semana 4. Los títulos alcanzaron niveles significativos en la quinta semana. Estos títulos fueron superiores a los registrados para el antígeno suministrado por el músculo y electroformación de poros.

Aunque las realizaciones pueden tener muchas formas diferentes, en los dibujos se muestran y se describen en detalle varias realizaciones, entendiendo que la presente divulgación debe considerarse ejemplar y no pretende limitar la invención a las realizaciones ilustradas. El alcance de la invención se medirá por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Todas las composiciones y procedimientos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Si bien las composiciones y los procedimientos se han descrito en términos de diversas implementaciones, será evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y los procedimientos y en los pasos o en la secuencia de pasos del procedimiento en la presente memoria descrito. Más específicamente, las realizaciones descritas deben ser consideradas en todos los aspectos sólo como ilustrativas y no restrictivas.

Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones mencionadas en la memoria son indicativas de los niveles de aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención.

Las implementaciones descritas de forma ilustrativa en el presente documento pueden practicarse de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento(s) no divulgado(s) específicamente en el presente documento. Así, por ejemplo, en cada caso del presente documento cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede ser sustituido por cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no existe la intención de que el uso de tales términos y expresiones implique la exclusión de cualquier equivalente de las características mostradas y descritas en su totalidad o en parte, pero se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del ámbito de la invención reivindicada. Por lo tanto, debe entenderse que, aunque la presente invención se ha divulgado específicamente mediante varias implementaciones y características opcionales, los expertos en la materia pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos en la presente memoria divulgados, y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la presente invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento no invasivo para habilitar la administración de sustancias terapéuticas en el tejido de un mamífero mediante el uso de un dispositivo de electropermeabilización de chispas para administrar un potencial de tensión eléctrica de electropermeabilización a la superficie de un tejido de mamífero, que comprende:

generar un potencial de tensión suficiente para hacer saltar un espacio de distancia predeterminada; y el suministro de dicho potencial de tensión generado en forma de una chispa que pueda saltar dicho espacio a la superficie del tejido de mamífero sin causar daño macroscópico a la integridad de la superficie del tejido de mamífero caracterizado porque dicha tensión generada está configurada para hacer reversiblemente porosas las células de dicho tejido para habilitar la administración de dichas sustancias terapéuticas a dichas células.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el paso de administración comprende: suministrar el potencial de tensión a través de un regulador de chispas que tiene un espacio de separación; en el que el espacio de separación es el espacio de una distancia predeterminada.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además: descargar desde el electrodo directamente a la superficie del tejido de mamífero.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además:

proporcionar el regulador de chispas que tiene una carcasa que comprende un material eléctricamente inerte; proporcionar un cable eléctrico de alimentación y un cable eléctrico de recepción que se colocan cada uno dentro de la carcasa y que están aislados eléctricamente el uno del otro;

proporcionar un espacio de separación entre el cable eléctrico de alimentación y el cable eléctrico de recepción dentro de la carcasa; y

ajustar una presión atmosférica en la carcasa a un valor predeterminado.

5. Un dispositivo para suministrar un pulso eléctrico de electorpermeabilización a la superficie de un tejido de mamífero, que comprende:

una fuente de energía capaz de generar un potencial eléctrico para

electropermeabilizar dicho tejido de mamífero;

un electrodo que tiene una longitud, un extremo próximo y un extremo distal, y un espacio de separación entre dichos extremos, en el que el espacio de separación tiene una distancia predeterminada y funciona como un regulador de chispas; y

una carcasa que forma un carenado circundante y que se extiende una medida predeterminada mayor que la longitud del electrodo,

en el que al alcanzar dicho potencial eléctrico, el pulso eléctrico de electorpermeabilización se suministra a la superficie del tejido de mamífero sin causar daño macroscópico a la superficie del tejido de mamífero, caracterizado porque dicha tensión generada es suficiente para hacer reversiblemente porosas a las células de dicho tejido de mamífero, en el que la distancia entre el extremo extendido de dicha cubierta y el extremo distal del electrodo es un espacio de longitud menor que la longitud de dicho espacio de separación de dicho regulador de chispas.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o el dispositivo de la reivindicación 5, en el que la fuente de energía de potencial eléctrico se selecciona entre una de entre una batería de 1, 3, 9 o 12 v, un cristal piezoeléctrico, una bobina de inducción cargada, un generador de van de Graaff y un condensador cargado.

7. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en el que el regulador de chispas comprende además:

una carcasa que comprende un material eléctricamente inerte;

un cable eléctrico de alimentación y un cable eléctrico de recepción colocados cada uno dentro de la carcasa y aislados eléctricamente entre sí; y

un espacio de separación entre el cable eléctrico de alimentación y el cable eléctrico de recepción dentro de la carcasa,

en el que el espacio se separación tiene un tamaño predeterminado para descargar una cantidad predeterminada de potencial eléctrico cuando se aplica una fuente de potencial eléctrico al cable de alimentación, y

en el que la descarga de la cantidad predeterminada de potencial eléctrico aplica una tensión a un electrodo del dispositivo para suministrar el impulso eléctrico de electropermeabilización a la superficie del tejido de mamífero.

8. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el electrodo comprende una matriz de agujas que entra en contacto con la superficie del tejido del mamífero sin penetrar en la superficie del mismo.

9. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que el extremo distal del electrodo tiene una forma conformada, la forma conformada comprende una forma esférica, puntiaguda y plana.

10. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que la carcasa comprende un material eléctricamente inerte.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el potencial de tensión suministrado comprende además una carga eléctrica total de aproximadamente entre 2,8*10E-8 y 2,5*10E-6, o el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que el electrodo porta un potencial de tensión que tiene una carga eléctrica total de aproximadamente entre 2,8*10E-8 y 2,5*10E-6 culombios.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 u 11, o el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que el potencial de tensión suministrado o el electrodo imparte a la superficie del tejido del mamífero una descarga de energía total de aproximadamente entre 0,000025 y 0,27 julios.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 u 11 a 12, o el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que el potencial de tensión suministrado a la descarga de tensión tiene una longitud de pulso de aproximadamente entre 5 nanosegundos y 5 microsegundos.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 u 11 a 13, o el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que el paso de administración o el pulso eléctrico de electropermeabilización se repite una multiplicidad de veces entre 2 y 20 pulsos.

15. El procedimiento de la reivindicación 4 o el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el espacio de separación tiene una medida de aproximadamente entre 0,01 cm y 4 cm.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el potencial de tensión generado es de 0,9 kva 109 k.