EA025705B1

EA025705B1 - Терпимое и минимально инвазивное устройство электропорации кожи

Info

Publication number: EA025705B1
Application number: EA201201203A
Authority: EA
Inventors: Кейт Бродерик; Джей Маккой; Стефен В Кеммеррер; Фэн Линь; Руне Хьекен
Original assignee: Иновио Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2017-01-30
Also published as: PT2542300T; EP2542300A4; MX2012009986A; BR112012021805A2; AU2011223753B2; US20130066296A1; JP5706451B2; EP2542300B1; EA201201203A1; JP2013521058A; ES2594498T3; AU2011223753A1; US20230145532A1; HK1181339A1; WO2011109406A1; PL2542300T3; DK2542300T3; CN102905755A; KR101872408B1; US11565107B2

Abstract

Новое устройство электропорации для доставки вакцин, которое является одновременно эффективным в создании защитного иммунного ответа и терпимым при доставке к субъекту (или почти безболезненным); а также способы практически безболезненного использования этого устройства для вакцинации субъекта против различных инфекционных заболеваний и типов рака.

Description

Изобретение относится, среди прочего, к устройствам электропорации и их использованию для содействия внедрению биомолекул в клетки тканей кожи у млекопитающих.

Уровень техники

Величина иммунного ответа на ДНК-вакцины зачастую зависит от трех основных критериев - оптимизированного дизайна вектора, использования подходящей адъювантной и успешной доставки и последующей экспрессии плазмиды в ткани-мишени. Ιη νίνο электропорация оказалась особенно эффективной в эффективной доставке ДНК иммуногенов в мышцы и кожу, и даже несколько устройств прошли клинические испытания на человеке.

Доставка лекарств в кожные ткани (внутрикожно, ГО) представляет собой привлекательный способ в клинической практике по ряду причин. Кожа является самым большим органом человеческого тела, наиболее доступна, наиболее легко контролируемая, а также высоко иммунокомпетентна. Тем не менее, непроницаемость, барьерная функция кожи является одним из основных препятствий на пути эффективной трансдермальной доставки лекарств.

Кожа человека простирается примерно на 2 м² площади и составляет около 2,5 мм по толщине в среднем, делая ее самым большим органом человеческого тела. Обычно кожа имеет два основных типа ткани - эпидермис и дерму. Эпидермис - постоянно ороговевающий многослойный эпителий. Самый внешний слой кожи - роговой слой (8С) - выступает в качестве основной барьерной функции для кожи. 8С является 15-30-клеточным толстым слоем нежизнеспособных, но биохимически активных корнеоцитов. Остальные три слоя эпидермиса (8. дгапи1о8ит, 8. кршокит, 8. Ъа§а1е) содержат кетатиноциты на разных стадиях дифференцировки, а также иммунные клетки Лангерганса и кожные дендридные клетки.

Физические и химические способы для трансдермальной доставки лекарств и доставки генов были детализированы группами по всему миру. Примерами являются ионофорез, липидная доставка и генная пушка. Еще одним физическим способом временного увеличения проницаемости кожи является электропорация. Электропорация предусматривает применение кратких электрических импульсов, которые приводят к созданию водного пути в липидньгх двухслойных мембранах клеток млекопитающих. Это делает возможным прохождение больших молекул, в том числе ДНК, через клеточную мембрану, которая иначе была бы менее проницаемой. Таким образом, электропорация увеличивает поглощение, а также степень, в которой лекарства и ДНК поступают в их ткани-мишени. Для электропорации причиной образования пор является пороговая энергия, которая должна быть достигнута, а движение производится по электрофоретическому эффекту, зависящему от электрического поля и длительности импульса.

В случае ДНК-вакцин электропорация показала количественно повышение иммунного ответа, увеличение широты этих иммунных реакций, а также повышение эффективности дозы. Доставка в кожу имеет много преимуществ и привлекательна, в первую очередь, в связи с наличием различных релевантных иммунных клеток, легкой клинической доступностью как органа-мишени иммунизации и минимальной глубиной доставки (минимально инвазивна), однако остается один вопрос по поводу возможности достижения высокого уровня трансфекции, а затем надежного иммунного ответа.

Доставка голой ДНК через стандартную внутримышечную (ΙΜ) инъекцию, как известно, неэффективна вне моделей грызунов. Это привело к неспособности обеспечить надежный иммунный ответ на крупных млекопитающих и людях. Некоторые стратегии были разработаны для повышения экспрессии ДНК-вакцин, такие как кодон-оптимизация, оптимизация РНК, добавление лидер-последовательности и развитие оптимизированной консенсус-последовательности.

Несмотря на улучшения в дизайне вектора и использовании молекулярных адъювантов, попрежнему сохраняется необходимость в эффективном способе введения ДНК-вакцин, который приводит к высокому уровню экспрессии плазмиды в необходимом типе клетки желаемой ткани, чаще всего, мышц, опухоли или кожи. Кроме того, сохраняется необходимость в устройстве электропорации и способе доставки вакцин, который является одновременно эффективным в генерировании защитного иммунного ответа и терпимым (или почти безболезненным).

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал в слои ткани эпидермиса между роговым и базальным слоями, что приводит к электропорации клеток в названной ткани, которые включают генератор напряжения, а также массив, имеющий множество электродов, в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов расположен отдельно от соседних электродов на расстоянии от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 до примерно 50 В в эпидермальной ткани; а электроды имеют кончик на дистальном конце, такой, что тупой с острия электрод позволяет проникать в слои ткани эпидермиса между роговым и базальным слоями и обеспечивает электрический потенциал от генератора напряжения к эпидермальной ткани.

В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации

- 1 025705 клеток названной эпидермальной ткани, которые состоят из генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов расположен отдельно от соседних электродов на расстояниии от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 до примерно 50 В в эпидермальной ткани, а электроды приспособлены для проникновения в ткань эпидермиса на глубину 0,1 мм или менее.

В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации клеток названной ткани, которые состоят из генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до около 50 В; при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани являются безболезненными при измерении по визуальной аналоговой шкале.

В другом аспекте изобретения представлены три устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации клеток названной ткани, которые состоят из генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до около 50 В, при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани выступают в качестве доказательства минимального повреждения тканей в указанных клетках.

В другом аспекте изобретения представлены допустимые способы доставки биомолекул в клетки эпидермальной ткани субъекта путем электропорации с помощью устройств электропорации, описанных здесь, которые включают введение биомолекулы в клетки; контакт электродов с эпидермальной тканью таким образом, что электроды проникают через роговой слой и находятся в слоях выше базальных слоев; а также доставку допустимого электрического потенциала от генератора напряжения к клеткам эпидермального слоя с помощью электродов.

Краткое описание чертежей

Многочисленные цели и преимущества настоящего изобретения могут быть лучше поняты специалистами в данной области техники со ссылкой на сопроводительные чертежи, на которых фиг. 1 показывает инженерные фигуры одного из вариантов сборки минимально инвазивного устройства ЕР (ΜΙΕΌ);

фиг. 2 - трехмерные фигуры компонентов одного из вариантов воплощения ΜΙΕΌ. а показывает одноразовый стерильный корпус массива, Ъ показывает прочный корпус и с показывает корпусный электрод с одноразовым массивом (2а);

фиг. 3 - трехмерные фигуры одного из вариантов воплощения ΜΙΕΌ, т.е. батареи с портативным питанием со съемным массивом (для стерилизации), а показывает внешний вид, Ъ показывает внутренний вид (включая батареи);

фиг. 4 - фотографии варианта воплощения ΜΙΕΌ;

фиг. 5 - флуоресцентные изображения тканей кожи морской свинки для обнаружения СЕР экспрессии после введенной электропорационным способом доставки СЕР экспрессии, построенной на использовании ΜΙΕΌ;

фиг. 6 - флуоресцентные изображения ткани из кожи различных животных для обнаружения СЕР экспрессии после введенной электропорационным способом доставки СЕР экспрессии, построенной на использовании ΜΙΕΌ;

фиг. 7 - фигуры, показывающие результаты иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у мышей;

фиг. 8 - фигуры, показывающие результаты иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у морских свинок;

фиг. 9 - фигуры, показывающие результаты иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у нечеловеческих приматов.

Подробное описание изобретения

Следующим аббревиатурам или сокращениям даны определения, чтобы способствовать пониманию предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения. Сокращенные определения, приведенные здесь, не являются исчерпывающими и они не противоречат определениям, определениям, принятым в данной области техники или представленным в словаре. Сокращенные определения приведены здесь, чтобы дополнить и более четко обозначить определения, известные в данной области техники.

Термин постоянный ток используется здесь для определения тока, который получили или испытывают ткани или клетки определенных описанных тканей, в течение срока действия электрического импульса, доставленного в те же ткани. Электрический импульс поступает из устройств электропорации, описанных здесь. Этот ток остается с постоянной силой тока в указанной ткани в течение срока действия

- 2 025705 электрического импульса, так как в устройстве электропорации есть элемент обратной связи, предпочтительно с мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи может измерять сопротивление ткани (или клеток) в течение длительности импульса и вызывать устройство электропорации изменять мощности его электрической энергии (например, увеличения напряжения) так, что ток в той же ткани остается постоянным в течение электрического импульса (порядка мс) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи состоит из контроллера. Текущие значения величины тока, описанные для устройств, представленных здесь, предпочтительно являются значениями величины постоянного тока.

Термин постоянное напряжение используется здесь для определения напряжения или электрического потенциала, который получили или испытывают ткани или клетки определенной описанной ткани, в течение срока действия электрического импульса, доставленного в ту же ткань. Электрический импульс поступает из устройств электропорации, описанных здесь. Это напряжение остается постоянным напряжением в указанной ткани в течение срока действия электрического импульса, так как в устройстве электропорации есть элемент обратной связи, предпочтительно с мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи может измерять сопротивление ткани (или клеток) в течение длительности импульса и привести к изменению мощности электрической энергии устройства электропорации, так, что напряжение в той же ткани остается постоянным в течение электрического импульса (порядка милисекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи состоит из контроллера. Значения напряжения, описанные для устройств, представленных здесь, предпочтительно являются значениями постоянного напряжения.

Термины обратная связь или ток обратной связи используются как синонимы и обозначают активную реакцию кожи при условии использования устройства ЕР, которое включает измерение тока в ткани между электродами и изменение выходной энергии в ЕР устройстве, соответственно, с целью поддержания тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед началом последовательности импульсов или электрическим лечением. Желательно, чтобы обратная связь осуществлялась путем электропорационного компонента, например контроллера прибора ЕР кожи, так как в нем электрическая цепь в состоянии постоянно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать текущий ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно делать изменение выходной энергии с целью поддержания контроля тока на заданных уровнях. В некоторых вариантах воплощения обратная связь происходит мгновенно, когда это аналоговая замкнутая обратная связь.

Термин биомолекула, используемый здесь, относится к последовательности нуклеиновых кислот, белкам, липидам, микропузырькам (например, лекарствосодержащие везикулы), а также к фармацевтическим препаратам. Предпочтительно биомолекула является вакциной, и более предпочтительно биомолекула является ДНК-вакциной и даже более предпочтительно ДНК-плазмидной вакциной.

Термины электропорация, электропермеабилизация или электрокинетическое усиление (ЕР) используются здесь как взаимозаменяемые и относятся к использованию трансмембранного электрического импульса поля, вызывающего появление микроскопических путей(поры) в биомембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, переходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.

Термин децентрализованно текущий используется здесь для определения структуры электрического тока, поступающего из массива различных игольчатых электродов устройств электропорации, описанных здесь, в которых минимизировано, а еще лучше ликвидировано, возникновение электропорационного теплового стресса в любой области ткани во время электропорации.

Термин механизм обратной связи, используемый здесь, относится к процессу выполнения через программное или аппаратное обеспечение (или прошивку), когда в процессе получается и сравнивается сопротивление желаемой ткани (до, во время и/или после подачи импульса энергии) с текущей величиной, желательно тока, и регулирует импульс энергии, поставляемой для достижения заданного значения. Термин сопротивление используется здесь при обсуждении механизма обратной связи и может быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома, что позволяет сравнения с заданным током. В предпочтительном варианте воплощения механизм обратной связи осуществляется аналоговым замкнутым петлевым контуром.

Термин минимально инвазивный, используемый здесь, относится к ограниченному проникновению игл электродов при условии использования устройства электропорации и может включать в себя неинвазивные электроды (или непроникающие иглы). Желательно, чтобы проникновение осуществлялось в такой степени, чтобы проникнуть через роговой слой, и, желательно, войти в наиболее живой слой ткани зернистого слоя, но не проникнуть в базальный слой. Глубина проникновения не должна превышать 0,1 мм, и, желательно, глубины должны быть в диапазоне от около 0,010 до примерно 0,040 мм, чтобы проникнуть через роговой слой. Предпочтительно это достигается с помощью электрода, который имеет на конце форму острого троакара, что позволяет проникнуть через роговой слой, но избежать глубокого проникновения.

Термины терпимый или безболезненный используются здесь как синонимы и, когда речь идет об электропорации, обозначают существенно более низкий уровень боли, связанный с электропорацией,

- 3 025705 чем обычные уровни с доступными устройствами электропорации. В частности, допустимая (или почти безболезненная) электропорация является результатом комбинации использования ΜΙΕΌ, описанных здесь, избегая электропорации мышц, а также доставки низких электрических полей в слои эпидермиса между роговым и базальным слоями. Предпочтительно электрические поля будут состоять из низких уровней напряжения, т.е. например, от 0,01 до 70 В и предпочтительно от 1 до 15 В. При измерении с помощью УЛ§ субъекты при ΜΙΕΌ электропорации в соответствии со способами, изложенными здесь, испытывают уровни боли, которые находятся в пределах 20% (от полной шкалы) от их безболезненности или безболезненного отсчета, например, в пределах 2 очков по шкале от 0 до 10, и, желательно, в пределах 10% от их безболезненного отсчета.

В одном аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в субъект допустимый электрический потенциал в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями, что приводит к электропорации клеток в указанной ткани, которые включают генератор напряжения, а также массив, имеющий множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 до 50 В в эпидермальной ткани; и электроды имеют кончик на дистальном конце, такой, что острие электрода может проникать в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями и обеспечивает электрический потенциал от генератора напряжения к эпидермальной ткани. В векоторых случаях электроды имеют кончик на дистальном конце, который, как правило, тупой, но в данном случае имеет острие или, другими словами, острие под пологими или тупыми углами. Например, электрод может иметь на дистальном конце троакар, у которого кончик заточен под углом 10° от оси, почти перпендикулярно к оси иглы.

В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в объект допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации клеток указанной эпидермальной ткани, которые состоят из генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 до примерно 50 В в эпидермальной ткани; и электроды приспособлены проникать в эпидермальные ткани на глубину 0,1 мм или менее.

В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в объект допустимый электрический потенциал в эпидермальную ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной ткани, которые состоят из генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до около 50 В, при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани обеспечивают отсутствие боли, измеряемое по визуальной аналоговой шкале.

В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в субъект допустимый электрический потенциал в эпидермальную ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной ткани, которые состоят из генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до около 50 В; при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани выступают в качестве доказательства минимального повреждения ткани в указанных клетках.

В некоторых вариантах воплощения устройства имеют электроды, которые адаптированы к проникновению в эпидермальные ткани на глубину 0,1 мм или меньше и, желательно, на глубину примерно от 0,01 до около 0,04 мм. Предпочтительно, чтобы электроды находились на расстоянии около 1,5 мм от соседних электродов. Кроме того, предпочтительно, чтобы генератор напряжения поставлял в эпидермальные ткани электрический потенциал от около 1 до примерно 15 В, а более предпочтительно около 15 В.

В некоторых вариантах воплощения устройства доставки допустимого электрического потенциала дают электрический потенциал продолжительностью в пределах от примерно 5 до около 250 мс, где указанные значения характеризуют длительность диапазонов и время между ними.

В некоторых вариантах воплощения устройства доставки допустимого электрического потенциала создают боль, по оценке указанного субъекта, которая находится рядом с безболезненным уровнем при измерении по визуальной аналоговой шкале. УЛ§ представляет собой горизонтальную линию длиной 100 мм, на которой 0 мм указывает на отсутствие боли, а 100 мм указывает на сильную боль. Безболезненный уровень определяется как оценка с использованием УЛ§-методологии, которая дает средний балл примерно <20 мм (с 95% доверительным интервалом) и, предпочтительно, -<10 мм (в пределах 95% доверительного интервала).

- 4 025705

В некоторых вариантах воплощения устройства доставки допустимого электрического потенциала дают электрический потенциал, который приводит к минимальному повреждению ткани в указанных клетках субъекта и, желательно, без видимого повреждения тканей в гистопатологическом анализе тканей. Гистологический анализ может быть использован для оценки видимых повреждений.

Гистологический анализ показывает трансфекцию в верхних слоях эпидермиса

Гистопатологический анализ был сделан на ткани кожи морских свинок. Каждая панель представляла ткань, которая была электропорирована с помощью МШ. Все слайды были окрашены гематоксилином и эозином, а также изучены под флуоресцентным микроскопом (х 20 объектив) для визуализации СРР-позитивности. Гистопатология ткани кожи после сакрификации животных через 3 дня после лечения показала, что анализ не выявил связанных повреждений тканей после электропорации с минимально инвазивным устройством. Другими словами, гистопатологический анализ показал, что ткань после электропорации похожа на ткань без электропорации.

В некоторых вариантах воплощения способы включают манипулирование электродами для проникновения в эпидермальные ткани на глубину около 0,1 мм или меньше и, желательно, на глубину примерно от 0,01 мм до около 0,04 мм. Массив может быть приложен вручную туда и обратно (или пошевелен) в месте инъекции, чтобы обеспечить хороший контакт, и в результате кончик электродов пробивает роговой слой. Предпочтительно этап доставки включает доставку допустимого электрического потенциала, который создает боль, по оценке указанного субъекта, которая находится рядом с безболезненным уровнем при измерении по визуальной аналоговой шкале. Кроме того, предпочтительно этап доставки включает в себя доставку допустимого электрического потенциала, который приводит к минимальным повреждениям тканей в указанных клетках субъекта. Этап доставки предпочтительно обеспечивает электрический потенциал от около 0,1 вольта до примерно 15 вольт в клетки.

В некоторых вариантах воплощения способы включают в себя этап доставки, который состоит из доставки электрического потенциала длительностью от около 5 до примерно 250 мс и длительностью диапазонов и подходов между ними предпочтительно 100 мс.

Основные устройства электропорации.

Здесь предусмотрены генераторы или контроллеры устройства электропорации, которые могут обеспечить импульс электрической энергии в эпидермальные ткани между роговым и базальным слоями при низких электрических полях и вызывают допустимую электропорацию. Предпочтительно электропорация будет происходить на уровне зернистого слоя, в основном или исключительно. Устройства доставляют импульс энергии посредством ΜΙΕΌ через игольчатые электроды, которые способны проникать через роговой слой.

В некоторых вариантах воплощения предусматривается реагирование настоящего ΜΙΕΌ, которое предпочтительно поддерживает постоянный ток в обработанной ткани, достигаемое с помощью механизма обратной связи в устройстве ЕР кожи, что предотвращает нагрев ткани и уменьшает повреждение ткани, боль и способствует общему успеху технологии электропорации кожи. В некоторых вариантах воплощения ΜΙΕΌ может дополнительно содержать контроллер, генератор сигналов в электронной связи с контроллером, сигнальный журнал в электронной связи с контроллером, а также батареи, электрически соединенные с генератором сигнала. Контроллер может получать вводные данные от пользователя, поручить генератору сигналов доставить энергетический импульс к желаемой ткани, в соответствии с введенными данными, и передать данные с регистратора сигнала в зависимости от импульса энергии, который поставляется; при этом батарея посылает электрический заряд на генератор сигнала, батарея может быть литий-ионной, никель-металл-гидридной, свинцовой или никель-кадмиевой батареей. Предпочтительно ΜΙΕΌ (фиг. 3) является портативным. Портативное устройство может работать через батарею и подходит для массовой терапевтической вакцинадии или целевой вакцинации.

ΜΙΕΌ может быть сочетанием предусмотренного массива электродов и аппликаторов, а также различных компонентов, генерирующих электрическое поле (или генерирующих электрический импульс), или генераторов. В некоторых примерах генераторы можно выбрать из одного из известных устройств электропорации, включая, но не ограничиваясь следующими: устройства электропорации, описанные в патенте США № 7245963 под названием Сборка электродов постоянного тока для электропорации и в патентах США №№ 5273525, 6110161, 6261281, 6958060 6939862 среди прочих. В более предпочтительных примерах генераторы используются с устройством ΟΕΕΕΕΟΤΚΑ® ЕР и устройством Ε1§οη ЕР (оба из Ιηονίο РЬаттасеийсак, Ιηο.. В1ие Ве11, РА). Указанные патентные ссылки здесь приведены в качестве ссылки во всей их полноте.

- 5 025705

Электропорационные иглы.

Различные известные электропорационные иглы, способные доставлять электрический заряд, могут быть включены в ΜΙΕΌ. Электропорационные иглы минимально инвазивны, включая неинвазивные иглы. Желательно, чтобы иглы были остры, например, в некоторых случаях используют заточенный троакар, так, чтобы они могли проникать через роговой слой и достигать зернистого слоя. Троакарный конец может быть основанием, чтобы оставить его острым, что позволяет проникнуть через роговой слой, но избежать глубокого проникновения. В некоторых примерах электроды имеют кончик на дистальном конце, который, как правило, тупой, но в данном случае имеет острие или, другими словами, острие пологое или под тупыми углами, например, электрод может иметь на дистальном конце троакар, у которого кончик заточен под углом 10° от оси, почти перпендикулярно к оси иглы.

Массивы.

Множество известных массивов, образованных из игл, может быть использовано с текущим ΜΙΕΌ. Эти массивы, образованные из игл, могут включать любое количество электродов, любой геометрический рисунок электродов в общем плоском расположении. Предпочтительно, чтобы электроды при расположении были равномерно распределены по массиву электродов (или на основании, или на подложке, к которой электроды прикреплены). Более предпочтительно, чтобы игольчатые электроды были расположены на площади, подобно тому, как расположены соседние игольчатые электроды, которые разнесены друг от друга примерно на таком же расстоянии (за исключением электродов на краю площади).

В некоторых вариантах воплощения массив состоит по меньшей мере из трех игл, разнесенных на равном расстоянии друг от друга в модели треугольника, по меньшей мере из четырех игл, разнесенных на равном расстоянии друг от друга по кругу, или игл, расположенных в 2x2, 3x3, 4x4, 5x5 или больше квадратном узоре. Кроме того, модель может быть прямоугольной или ромбовидной. Предпочтительно, чтобы иглы электродов были расположены в 4x4 расположении массива игл. Пример 4x4 массива игл показан на фиг. 1. На фиг. 2 показан пример корпуса ΜΙΕΌ, корпуса массива и корпуса электрода. Каждый игольчатый электрод может быть разнесен от соседних игольчатых электродов на расстояние 150 мм или меньше, от 100 до 1 мм, от 50 до 1 мм, от 40 до 1 мм, от 30 до 1 мм, от 20 до 1 мм, от 10 до 1 мм, от 5 до 1 мм, от 5 до 2 мм, от 5 до 2 мм, а предпочтительно 2 мм, более предпочтительно 1,5 мм.

Электрические импульсы (поставляемый электрический потенциал).

Представленные устройства работают при более низких напряжениях и токах, чем обычные способы ЕР для повышения переносимости во время поддерживаемых успешных трансфекций биомолекулы (о чем свидетельствует экспрессия, а затем иммунный ответ). Устройство, как правило, используется с импульсным генератором, призванным обеспечить постоянное напряжение, ток или комбинацию обоих, при необходимости. Электрические импульсы, используемые ΜΙΕΌ для осуществления трансфекций клеток в кожной ткани, являются любыми известными типами импульсов, которые обеспечивают низкую электрическую энергию, необходимую для получения допустимой электропорации. В некоторых вариантах воплощения ΜΙΕΌ обеспечивает электрический импульс к желаемой ткани по уровням напряжения от 0,01 до 70 В, от 0,01 до 50 В, от 0,01 до 40 В, от 0,01 до 30 В, от 0,01 до 20 В, от 0,01 до 15 В, от 0,1 до 70 В, от 0,1 до 50 В, от 0,1 до 40 В, от 0,1 до 30 В, от 0,1 до 20 В, от 0,1 до 15 В и предпочтительно 1-15 В. Более предпочтительные уровни напряжения составляют 15 В, когда соседние электроды ΜΙΕΌ разнесены примерно на 2 мм, а предпочтительно на 1,5 мм.

В некоторых вариантах воплощения ΜΙΕΌ обеспечивает допустимую электрическую энергию, которая характеризуется электрическим импульсом доставки следующего тока в желаемую ткань: от 0,2 до 100 мА, от 0,1 до 100 мА, от 0,5 до 100 мА, от 1 до 100 мА, от 1 до 80 мА, от 1 до 60 мА, от 1 до 50 мА, от 1 до 40 мА, от 1 до 30 мА, но предпочтительно от 1 до 100 мА, а более предпочтительно от 1 до 30 мА, еще более предпочтительно 10 мА.

Для всех допустимых электрических импульсов, связанных с ΜΙΕΌ, будет характерна короткая продолжительность каждого импульса, в том числе длительностью от 5 до 250 мс, импульс от 10 до 250 мс, от 20 до 250 мс, от 40 до 250 мс, от 60 до 250 мс, от 80 до 250 мс, от 100 до 250 мс, от 20 до 200 мс, от 40 до 200 мс, от 60 до 200 мс, от 80 до 200 мс, от 100 до 200 мс, от 20 до 150 мс, от 40 до 150 мс, от 60 до 150 мс, от 80 до 150 мс, от 100 до 150 мс, от 100 до 140 мс, от 100 до 130 мс, от 100 до 120 мс, от 100 до 110 мс, а более предпочтительно 100 мс.

Допустимые электрические импульсы, связанные с ΜΙΕΌ, будут также характеризоваться низкой повторяемостью импульсов. Импульсы, поставляемые ΜΙΕΌ, повторяются при доставке со следующим числом импульсов для каждой вакцинации: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, а предпочтительно от 1 до 6 импульсов, более предпочтительно 2 импульса.

Ткань для введения вакцины + ЕР.

ΜΙΕΌ предназначен для доставки достаточной для электропорации электрической энергии в клетки кожной ткани, чтобы обеспечить доставку биомолекул в ее клетки и предпочтительно вакцинацию ДНКвакцинами. Предпочтительно, чтобы электроды проникали только в кожную ткань, которая является живым слоем ткани чуть ниже рогового слоя и выше базального слоя, и предпочтительно только в зернистые слои. Биомолекулы, как правило, доставляются в ткани-мишени с помощью Манту-техники.

- 6 025705

Версия с питанием от батареи с электроникой в рукоятке (см. фиг. 3).

ΜΙΕΌ может быть портативным устройством ЕР. Предусмотрено портативное автономное ΜΙΕΩ устройство, которое является ручным устройством, а источником электрической энергии для электрических импульсов является по меньшей мере одна батарея, имеющая потенциал напряжения между 1,5 и 12 В.

Портативное ΜΙΕΌ может включать в себя корпус, в котором содержится указанная батарея, плату, включающую электрическую цепь обратной связи с электрическим питанием от указанной батареи, и по меньшей мере один конденсатор, способный удерживать емкость между 1000 и 100000 мкФ. В связи с этим вариантом воплощения компоненты (например, батареи, цепи и конденсатор), как правило, пространственно размещены в указанном корпусе в линейной последовательности или в компоновке бок о бок, а корпус может иметь прямоугольную или цилиндрическую форму, и его может держать рукой лицо, эксплуатирующее устройство. Например, корпус будет иметь проксимальный конец и дистальный конец, такой как цилиндр, или где длинная сторона указанного прямоугольника лежит между ними и где указанная батарея находится в пределах указанного проксимального конца указанного корпуса и доступна на таком конце с помощью съемной крышки. На дистальном конце указанного корпуса могут быть расположены электрические каналы, которые находятся в электрической связи с этой цепью и служат в качестве разъема для подключения по меньшей мере с одним катодом и по меньшей мере с одним анодом, которые будут использоваться при комплектации цепи, состоящей из электропоративного импульса на базе указанной батареи через конденсатор и указанную цепь. Дистальный конец указанного корпуса может также включать связанный с или как часть указанного корпуса механизм для крепления, полупостоянный или на постоянной основе, и/или отключения; главное устройство самой сборки, включающей любой из резервуаров для содержания жидкого терапевтического агента с отверстием для жидкости в указанном резервуаре, через которое указанная жидкость может быть направлена к телу ткани; источник энергии для перемещения указанной жидкости из резервуара через указанное отверстие; и по меньшей мере один электрод, содержащий по меньшей мере один анод и один катод.

В некоторых вариантах воплощения портативное ΜΙΕΌ способно передавать в ткани кожи млекопитающего электрический импульс, способный электропорировать клетки в указанной ткани, указанный электрический импульс с напряжением, обычно составляющим от 0,1 до 70 В, предпочтительно от 0,1 до 50 В, более предпочтительно от 1 до 15 В. Кроме того, устройство способно доставлять электропоративный импульс указанной напряженности поля на период между 5 и 250 мс, а более типично между 10 и 100 мс, еще чаще между 30 и 70 мс, а более предпочтительно 50 мс. Более того, устройство способно с помощью своего микропроцессора доставлять биполярный импульс или монополярный импульс электропоративной электрической энергии, при этом биполярный или монополярный импульсы могут содержать предопределенный ход нескольких импульсов, и/или формируемых напряжением импульсов, или даже по-прежнему экспоненциально разряжаемых импульсов. Такая разнообразная возможность пульсации обеспечивает потенциал оптимизации процесса электропорации, включая оптимизацию напряжения, формы импульса, длительности и полярности импульсов электропорации.

Примеры

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами. Следует понимать, что эти примеры, показывающие предпочтительные варианты воплощения изобретения, даны только в качестве иллюстрации. Исходя из вышеизложенного и этих примеров, специалист в данной области техники может установить основные характеристики этого изобретения и, не отходя от его сути и объема, может сделать различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны здесь, будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания. Такие изменения также должны находиться в пределах формулы изобретения.

Испытание может быть проведено с целью оценки переносимости и снижения боли, порожденной устройствами электропорации, описанными здесь. Персональное исследование можно начать с секундомера для каждого пациента во время применения электропорации. Каждый пациент будет выполнять стандартные оценки боли под наблюдением квалифицированного персонала исследования, и они будут записывать эти оценки в дневнике-буклете в моменты через пять, 10, 15, 20, 30 и 45 мин, 1 ч и 1,5 ч после электропорации, через каждый час в течение 12 ч после электропорации и через 16 ч и 24 ч после электропорации. Пациенты измеряли интенсивность боли с использованием категорийной шкалы и УЛ§. Как уже говорилось ранее, категорийная шкала включает в себя четыре категории: 0=нет, 1=легкая, 2=умеренная и 3=тяжелая.

УЛ§ представляет собой горизонтальную линию длиной 100 мм, на которой 0 мм указывает на отсутствие боли, а 100 мм указывает на сильную боль. С помощью этой 100-мм шкалы практически безболезненным показателем был бы показатель, который находится в пределах 20 мм от оценки, которая показывает безболезненность (не чувствовал боли). В некоторых случаях вблизи безболезненного будет показатель 10 мм от безболезненного показателя.

Способы.

Следующие способы используются в каждом из примеров ниже, в случае необходимости в обсуждении.

- 7 025705

Дизайн минимально инвазивного устройства. Массивы электродов, состоящие из 4x4 позолоченных троакарных игл 0,0175 дюймов в диаметре, размещенных на расстоянии 1,5 мм, которые будут использоваться в сочетании либо с ΕΕΟΕΝΙΟΟΟ (Ιηονίο РЬагтасеийсаЕ, 1пс., В1ие Ве11, РА) генератором импульсов, либо с батарейным питанием низкого напряжения холостого хода.

Подготовка плазмиды. СЕР βΧνίζ плазмиды были приобретены у А14е\топ (Еагдо ΝΏ). ΝΡ плазмида кодирует ΝΡ полной длины, полученную из Риейо Кгсо 8 (Η1Ν1) штамма вируса гриппа. М2 плазмида кодирует всю длину М2, полученную из №ν Са1ейоша/99 (Η1Ν1) штамма вируса гриппа. Конструирование было сориентировано на сигналы мутированного ядра и было оптимизировано и синтезировано от СепеАй (Германия). Все плазмиды были разбавлены в 1хРВ§ перед инъекцией. δΥΝΟΟΝ™ (сконструированная синтетическая ДНК) коктейль плазмид вакцины против гриппа (100 мкг/плазмиды), содержащий рСХ2005 (сконструированная вакцина §ΥNСΟN™, которая кодирует консенсус-последовательность Н1НА) и рСХ2009 (сконструированная вакцина δΥΝ^Ν™, которая кодирует консенсуспоследовательность свиного Н1НА) был разбавлен в 1хРВ§ для инъекций.

Животные. Самки морских свинок Най1еу (штамм код 051), самки новозеландских кроликов и самки Ва1Ь С мышей были получены от Сйаг1е8 РЕег ЬаЪогаЩйек. Самки крыс \7й1аг были приобретены у СЬаг1е8 РЕег йаЪогаЮпек Самки йоркширских свиней были приобретены у δ&δ Еагт'к (Катопа, СА). Морские свинки, крысы, кролики, мыши были размещены в ВюОнаШ (§ап О|едо. СА). Самцы (4) и самки (4) макак (Масаса ти1айо) были размещены в индивидуальном ВЮриЛЕ 1пс. (КосЕШе, ΜΌ) со свободным доступом к пище и воде. Макакам была дана возможность акклиматизироваться по меньшей мере в течение 30 дней на карантине до экспериментов. Все животные были размещены и обрабатывались в соответствии со стандартами 1п81йийопа1 Атта1 Саге апй Ике СоттШее (1АСИС).

Подготовка животных. Наблюдаемые результаты СЕР ответа на морских свинках Нагйеу после удаления волос такие же, как наблюдаемые результаты на голых морских свинках 1АЕ в предыдущих экспериментах. Удаление волос, по всей видимости, не влияет на результат трансфекции и из-за соображений стоимости мы решили провести остальные исследования на животных Най1еу. Морские свинки Най1еу были побриты, а щетина удалялась кремом для эпиляции (Уее!) за 24 ч до начала лечения. Мыши, крысы, кролики, свиньи и макаки были побриты до начала лечения.

ДНК-инъекции. Макаки были успокоены инъекцией кетамина. Все остальные животные были успокоены ингаляционно изофлураном. Всем животным было введено внутрикожно (способ Манту - 29калибровая инсулиновая игла) 50 мкл 1хРВ§, содержащих желаемую дозу плазмиды. Мышам вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу 50 мкл 1хРВ§, содержащих нужную дозу плазмиды. Макакам вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу 400 мкл 1хРВ§, содержащих нужную дозу плазмиды. Пустой вектор был добавлен для поддержания равного количества ДНК для каждой группы.

Устройство кожной электропорации. Сразу же после инъекции ДНК кожное устройство было применено к месту кожной инъекции. Массив двигали в месте инъекции, чтобы обеспечить хороший контакт, и электропередачу достигали за счет генерации импульса либо от Е1деп 1000, либо от цепи батареи низкого напряжения. Используемые параметры: три импульса по 15 В длительностью 100 мс.

Электропорация мышц. Сразу же после ΙΜ инъекции была выполнена электропорация в месте инъецированной мышцы путем применения 27 С, массива из 2 игл с расстоянием между электродами 4 мм. Два 125 В/см импульса длительностью 60 мс каждый были доставлены с использованием Е1деп 1000.

Визуализация кожи. Образцы кожи или биопсии были отобраны посмертно от животных после окончания и хранились на льду до визуализации с помощью визуализирующего микроскопа ОУ 100 (Апй Сапсег 1пс., §ап И1едо, СА) при 480 нм.

Гистопатология. Образцы кожи или биопсии были отобраны посмертно от животных после окончания и сразу же консервировались в 10% нейтральном буферном растворе формалина и были отправлены в Расйгс Ра1йо1оду, §ап И1едо, СА, для обработки и гистопатологического анализа. Соответствующие ткани были отделены, обработаны, парафинированы, секционно нарезаны примерно по 5 мкм и окрашены гематоксилином и эозином. В результате слайды были рассмотрены советом сертифицированных патологоанатомов. Секции были визуализированы с помощью микроскопа 2еЙ5 Ахюр1ап с 10х объективом в Вцгпйат 1п81йи1е, 8ап И1едо, СА.

Обнаружение ИР антител в сыворотке иммунизированных мышей. Антитела против ИР были оценены способом ИФА с использованием сыворотки от иммунизированных мышей. У мышей брали кровь ретроорбитально через две недели после последней иммунизации. Νιιικ Мах1-8огр 1ттипо Р1а1е8 были покрыты NΡ (5 мкг/мл, 1тдепех ΙΜΚ-274) при 4°С в течение ночи. Несвязанные антигены были смыты в устройстве автоматического мытья пластин с использованием РВ§ с 0,05% Тетееп-20. Пластины были заблокированы для неспецифического связывания добавлением 200 мкл РВ§ с 0,5% В8А в течение 1 ч при температуре 37°С. После мытья, как указано выше, сыворотку развели 1:50 в РВ§ с 0,2% В8А и 0,05% Тетееп-20 и добавили в первую лунку. Серийное разведение было сделано путем разбавления 1:3 до 1:5 для каждой лунки. Сыворотку инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С до мытья. Антитела мыши против фС-биотин (В9904-5 мл; δ^дта-Л1й^^сЬ, δΐ Ьошк, МО, И8А) разбавляли 1:10000 и 50 мкл добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при 37°С до мытья. Затем добавляли в ка- 8 025705 ждую лунку 50 мкл разбавленного 1:1000 стрептавидин-НКР (§ои1йет Βίοίοαίι. ВттпдНапт ЛЬ, И8А) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С до мытья. Последним шагом было добавление 50 мкл субстрата НКР (Р-9187, §1§ша-Л1бг1сЬ) и инкубация при комнатной температуре в темном месте в течение 10 мин перед определением оптической плотности (ΟΌ) при 450 нм. Определение считалось положительным, если ΟΌ в три раза выше, чем ΟΌ от необработанной сыворотки мышей. Результаты были представлены в качестве конечной точки титра, то есть последнего разбавления, где ΟΌ была больше или ровно в три раза выше, чем в необработанной сыворотке.

ЕЬТЗро! анализ. Через две недели после вакцинации из каждой группы мышей были выделены спленоциты. Одноклеточные суспензии были очищены от красных клеток крови с помощью КВС буфера лизиса (еВюкшепсе). Комплект ЕЫЗРОТ анализа был приобретен у Κ&Ό §у81ет8. 96-луночные ЕЫЗРОТ планшеты (МгШроге) были покрыты моноклональным антителом против мышиного интерферона (ΙΕΝ)-γ. После инкубации в течение ночи при температуре 4°С лунки промыли и заблокировали блокирующим буфером в соответствии с протоколом от Κ&Ό §у81ет8. Объединенные спленоциты из каждой группы были добавлены в лунки и инкубированы с 1 мкг/мл №147 (ТУОРТРАЙУ Вю8уп1Ье818 1пс.) в течение 48

ч. Затем планшеты промывали и обрабатывали в соответствии с протоколом, описанным производителем. Точки были подсчитаны и проанализированы Се11и1аг Тесйпо1оду Ь1б.

Стимуляция интраназального гриппа. ВЛЬВ/с мышей в группах из 10 были иммунизированы на 0, 3 и 6 неделе. Мыши были иммунизированы Ргипе 30+30 мкг неделя 0, Вооз! 30+30 мкг неделя 3, Вооз! 100+100 мкг неделя 10. На 12-й неделе эксперименты по контрольному заражению гриппом были проведены с использованием В§Ь IV протоколов в Тйе №бопа1 М1сгоЫо1оду ЬаЬогаЮгу, РиЬНс НеаНН Адепсу о£ Сапаба, Щ|пп1ред, МВ, Сапаба, в соответствии с этическими принципами их этического комитета. 100χΕΌ50 доза Η5Ν1 А/У1е1пат/1203/04 штамма была использована для назального контрольного заражения. Мышей контролировали по выживанию и массе тела ежедневно в течение 21 дня после заражения.

ΗΑΙ-анализы. Образцы крови и сыворотки животных без промедления были помещены на хранение на сухом льду перед отправкой в ВЮриАЕ КоскуШе, ΜΌ, для обработки. Сыворотку обрабатывали ферментом, разрушающим рецепторы, путем разбавления 1 части сыворотки 3 частями фермента и инкубировали в течение ночи при 37°С на водяной бане. Фермент инактивировали в течение 30 мин инкубации при 56°С, после чего добавляли 6 частей фосфатного буферного раствора для окончательного разведения 1/10. ΗΑΙ-анализы были проведены в 96-луночном микропланшете с У-образным дном лунок, используя 4 единицы вируса гемагглютинации и 1% красных кровяных клеток, как описано выше. Вирус, используемый для ΗΑΙ-анализов, был получен из отделения гриппа СЭС.

Пример 1. Результаты электропорации с помощью минимально инвазивного устройства в трудоемкой трансфекции гена-репортера.

Устройство с минимально инвазивным электродом (ΜΙΕΌ) было разработано для использования при доставке ДНК-вакцины. Этот новый аппликатор состоит из игольчатых электродов из позолоченной стали с заточенными троакарами (электроды имеют кончик на дистальном конце, который тупой, но с острием) на 1,5 мм расстоянии в 4x4 массиве (фиг. 4а и 4с). Переменные ряды по четыре электрода могут быть активированы с обратной полярностью: положительной или отрицательной. Электроды фиксируются в электрические розетки с пластиковой ручкой, что позволяет каждому электроду адресоваться индивидуально для альтернативной модели активации. Устройство предназначено только для вступления в контакт с поверхностью кожи, а не для непосредственного проникновения в ткани. При надлежащем контакте острота электродов может позволить массиву устройства нарушить барьер рогового слоя, обеспечивая последовательное изменение импеданса в результате повторяемых процедур электропорации. Прототип устройства был построен с присоединением шнура для связи с генератором импульсов (фиг. 4Ь).

Изучались нижние пределы параметров напряжения, необходимые для успешной трансфекции и иммунного ответа с помощью этого нового устройства с минимально инвазивными иглами электрода (ΜΙΕΌ). В отдельные участки кожи на боку морской свинки было введено 50 мкл 1 мг/мл плазмиды СЕР с использованием техники Манту и сразу использовано импульсное ΜΙΕΌ с установкой на более низком напряжении 15 В (фиг. 5а). Надежная и воспроизводимая СЕР-трансфекция была видна через 8 ч после лечения с максимумом через 3 дня. Минимальная СЕР-трансфекция или ее отсутствие обнаруживалась после самостоятельной инъекции СЕР-плазмиды (данные не представлены). В то время как целый ряд электрических параметров и напряжений в результате трансфекции СЕР, импульсы величиной 15 В, более воспроизводимы (данные не представлены). Воспроизводимость была количественной и оценивалась положительным числом пикселей после флуоресцентной микроскопии в стандартных условиях. Наиболее последовательное количество пикселей в пределах определенной области было получено при параметрах 10-15 В. Фактические модели трансфекции СЕР проявили различные острова вокруг точки контакта между электродами (фиг. 5Ь). Эффективная ЕР небольшая и сильно локализована около электрода при низком напряжении, таким образом, нет никакой серьезной трансфекции ниже базальных слоев эпидермиса.

Для того чтобы показать, что надежная трансфекция не является специфическим явлением для морских свинок, СЕР-локализация была проведена на ряде видов. В участки кожи мышей, кроликов, крыс и

- 9 025705 свиней вводили 50 мкл (30 мкл для мышей) 1 мг/мл плазмиды СРР и сразу использовали импульсный ΜΙΕΌ. Все виды продемонстрировали надежную кожную трансфекцию СРР после электропорации по сравнению с минимальным или вообще необнаруженным уровнем после трансфекции плазмиды СРР при самостоятельной инъекции (фиг. 6). Для всех видов сильная положительность СРР была обнаружена во всех образцах кожи после электропорации. Однако только образцы кролика показали картину своеобразного острова, наблюдаемую в образцах морских свинок (фиг. 5). СРР-локализация на коже крыс, мышей и свиней оказалась более размытой. Фактически трансфицированная область была одинаковой у крыс, кроликов и свиней (около 4 мм²), так как это была функция от размера пузыря инъекции. Трансфицированная область на коже мышей была немного меньше из-за меньшего объема впрыска. На панели мышей показана вся кожа мышей, так, что относительный размер может быть оценен. СРРположительные клетки были обнаружены только на поверхности образцов кожи крыс, кроликов и свиней. Отсутствие сигнала СРР наблюдали на нижней стороне этих образцов. Нижняя часть кожи мыши имела, кажется, позитивный сигнал СРР. Однако, как представляется, это связано с тонкостью кожи образца.

Эти данные свидетельствуют, что ΜΙΕΌ может эффективно передавать плазмиды в кожу больших и малых моделей животных.

Пример 2. Электропорация с использованием минимально инвазивного устройства.

Гистологический анализ показывает трансфекцию в верхние слои эпидермиса. Для рассмотрения эффекта электропорации с ΜΙΕΌ на клеточном уровне было проведено гистологическое исследование. В участки кожи морских свинок вводили 50 мкл 1 мг/мл плазмиды СРР и сразу использовали импульсный ΜΙΕΌ. Образцы биопсии были забраны через 3 дня после лечения, обработаны, зафиксированы, секционно парафинированы и Н&Е окрашены (слайд не показан). Патологический анализ не выявил связанных повреждений тканей после электропорации с минимально инвазивным устройством. Мощная микроскопия показала, что большинство трансфекции СРР произошло в зернистый слой эпидермиса (слайд не показан). СРР-положительные клетки были также обнаружены в базальном слое. С другой стороны, лишь немногие СРР-положительные клетки были обнаружены в биопсии, которая получила самостоятельные инъекци СРР-плазмиды. Это было прямо противоположно надежному сигналу, наблюдаемому в образце биопсии ткани, которая получила электропорацию. Визуальная оценка повышения экспрессии будет превышать в 100-1000 раз, в зависимости от количества СРР-положительных клеток по отношению к ДНК в одиночку.

Пример 3. Электропорация с использованием минимально инвазивного устройства приводит к надежной клеточной реакции и обеспечивает 100% защиту против летальной стимуляции у мышей.

Мыши были иммунизированы ДНК, кодирующей антигены гриппа ΝΓ и М2: Рптс 30+30 мкг неделя 0, Βοοδΐ 30+30 мкг неделя 3, Βοοδΐ 100+100 мкг неделя 10. Соответствующий NР-антиген от штамма РисгЮ Κίοο/39 и соответствующий М2-антиген от штамма Νρ» ί'.';·ιΡάοηί;·ι/99 были оптимизированы, синтезированы и потом клонированы в основу клинически утвержденного для млекопитающих вектора экспрессии, рМВ76.5. ΝΓ- и М2е-антигены были выбраны для оценки преимущественно клеточного иммунитета. Эти белки не способны индуцировать нейтрализующие антитела.

Группы мышей были подвергнуты электропорации или с минимально инвазивным кожным устройством, или с Ε1§βη 1000 внутримышечным устройством (Ιηονίο Рйагтасеийсак, 1пс., В1ие Ве11, РА). Индукцию потенциального клеточного и гуморального ответа на мышиной модели измеряли по ΕΡΙδροΐ тестам антигенспецифических Т-клеток, и титры антител были обнаружены у всех мышей. Антигенспецифические СТЬ-ответы были 200±57,9 8РИ/10^-6 спленоцитов против ΝΓ для ΜΙΕΌ и 85±36,3 8РИ/10^-6 спленоцитов против ΝΓ для ΙΜ (фиг. 7А). Эти животные, электропорированные внутрикожно, показали более высокие титры антител и клеточных реакций, хотя эти данные не являются статистически значимыми.

В попытке определить, является ли индуцированный иммунный ответ способным к воздействию на инфекцию, мышей заражали летальной дозой вируса гриппа А/Н5Ш/У1е1пат/1203/04 через интраназальную (ί.η.) прививку (фиг. 7В). νΝ/1203/04 (Η5Ν1) штамм гриппа, как известно, вызывает быструю заболеваемость и смертность. В то время как 100% необработанных мышей стали жертвой заражения на 11-й день, 100% мышей, иммунизированных ΜΙΕΌ, были защищены от заболеваемости и смертности через 15 дней (конец эксперимента). Кроме того, на 15-й день 90% ΙΜ положительно иммунизированных контрольных животных выжили.

Пример 4. Электропорация с использованием минимально инвазивного устройства приводит к гуморальной иммуногенности и защитным ΗΙ-титрам.

Морские свинки.

Трудно использовать в качестве цели дерму у мышей в связи с чрезвычайно тонкой структурой кожи и непосредственной близостью от основных мышц. По этой причине часто индуцированный иммунный ответ у мышей представляет собой сочетание кожи и мышц. Таким образом, ΜΙΕΌ было протестировано на более крупной животной модели - морских свинках, у которых более четко определяется структура кожи.

Морские свинки были иммунизированы описанной ранее консенсус-вакциной δνιη:οη^ΙΛ1 внутри- 10 025705 кожно с помощью электропорации ΜΙΕΌ. Животные были привиты вакциной коктейля плазмид (100 мкг/плазмиды), содержащей рСХ2005 (вакцина конструкции δΥΝΟΘΝ™, которая кодирует консенсуспоследовательность Н1НА) и рСХ2009 (вакцина конструкции δΥΝί'ΌΝ™. которая кодирует консенсуспоследовательность свиного Н1НА), в объеме 50 мкл, разведенных в 1хРВ8. Через две недели после двух прививок каждое животное выработало надежные ΗΑΙ-титры около 1:40 против Η1Ν1 пандемического штамма Мехюо/2009, а также штамма Α/Η3Ν2 ВпкЪаие, и частично против штамма Α/Η5Ν1 У1е1иаш/2005 (фиг. 8).

Макаки.

Макаки были привиты ранее описанной консенсус-вакциной против гриппа из коктейля плазмид (100 мкг/плазмиды), содержащей рСХ2005 (вакцина конструкции δΥΝΟΘΝ™, которая кодирует консенсус-последовательность Н1НА) и рСХ2009 (вакцина конструкции δΥΝΟΘΝ™, которая кодирует консенсус-последовательность свиного Н1НА), в объеме 50 мкл либо внутрикожной (ΜΙΕΌ), либо внутримышечной электропорацией (Е1деп 1000). После двух прививок у четырех из четырех животных развивались НА1-титры около 1:40 против штамма Н1Ш/Мех1Со/2009 и против штамма ΑΉ1Ν1/ №ν Са1ебоша, когда иммунизацию проводили внутрикожно с ΜΙΕΌ (фиг. 9).

Пример 5. Исследование переносимости с минимально инвазивным устройством.

Для оценки уровня боли ЕР с минимально инвазивным ЕР устройство применяется для эпидермальных слоев между роговым слоем и базальным слоем. Визуальный ответ тестирования с животными, подвергнутыми анестезии, не производит мышечные подергивания, видимые при более высокой мощности импульсов или при использовании массивов инвазивных электродов, демонстрируя при этом эффективную трансфекцию корреспондентных генов и иммунный ответ с антигенными плазмидами. Импульсное напряжение до 15 В и ток до примерно 30 мА производит только мягкие ощущения, но вызывает защитные иммунные реакции против гриппа у морских свинок и резус макак.

Ιη νίνο ЕР применялась с использованием устройства с инвазивным кожным массивом и показала выраженное снижение боли по сравнению с внутримышечным устройством с инвазивным массивом. Ожидается, что результаты ΜΙΕΌ покажут еще большее уменьшение боли.

Ιη νίνο ЕР применялась с использованием массива ΜΙΕΌ после ГО-инъекции 0,9% физиологического раствора в зернистый слой. Больным вводили 0,15 мл физиологического раствора в зернистый слой, а затем ЕР осуществлялась с помощью ί'ΈΕΕΕί'ΤΒΛ® 2000 (адаптивное устройство постоянного тока или, альтернативно, устройство Ε1^η 1000, Ιηονίο РЬагтасеийсаП, Шс., В1ие Ве11, ΡΑ). ЕР-параметры: 15 В, импульс 100 мс и 3 импульса в целом.

Для каждого субъекта боль в месте инъекции будет оцениваться с использованием визуальной аналоговой оценки (νΑδ), которая определяется сразу после ЕР.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Устройство электропорации, содержащее генератор напряжения и массив электродов в электрической связи с генератором напряжения, в котором каждый из электродов разнесен от соседнего электрода на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения выполнен с возможностью обеспечения с помощью электродов электрического потенциала от около 0,01 до примерно 70 В в эпидермальной ткани, а электроды имеют кончик, который представляет собой острие на дистальном конце, выполненное с возможностью проникновения в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями, для приложения электрического потенциала от генератора напряжения к эпидермальной ткани.
2. Устройство электропорации, содержащее генератор напряжения и массив электродов в электрической связи с генератором напряжения, в котором каждый из электродов разнесен от соседнего электрода на расстояние от около 0,5 до примерно 2,5 мм; генератор напряжения выполнен с возможностью обеспечения с помощью электродов электрического потенциала от около 0,01 до примерно 70 В в эпидермальной ткани; и электроды выполнены с возможностью проникновения в эпидермальную ткань на глубину 0,1 мм или менее.
3. Устройство по п.1, в котором электроды выполнены с возможностью проникновения в эпидермальную ткань на глубину 0,1 мм или менее.
4. Устройство по любому из пп.1, 2, в котором электроды выполнены с возможностью проникновения в эпидермальную ткань на глубину приблизительно от 0,01 до около 0,04 мм.
5. Устройство по любому из пп.1-4, в котором электроды выполнены с возможностью разнесения на расстоянии около 1,5 мм от каждого соседнего электрода.
6. Устройство по любому из пп.1-5, в котором генератор напряжения выполнен с возможностью доставки в эпидермальную ткань электрического потенциала от около 1 до примерно 15 В.
7. Устройство по любому из пп.1-6, в котором генератор напряжения выполнен с возможностью доставки в эпидермальную ткань электрического потенциала при токе в диапазоне от 1 до примерно 50 мА.
8. Устройство по любому из пп.1-6, в котором генератор напряжения выполнен с возможностью доставки в эпидермальную ткань электрического потенциала на период в пределах от примерно 5 до около 250 мс.

- 11 025705
9. Способ доставки биомолекул в клетки эпидермальной ткани путем электропорации с помощью устройства электропорации по п.1, содержащий введение биомолекулы в клетки; контакт электродов с эпидермальной тканью так, чтобы электроды проникли через роговой слой и находились в слоях выше базальных слоев; и доставку электрического потенциала от генератора напряжения к клеткам эпидермального слоя с помощью электродов.
10. Способ по п.9, в котором этап контакта включает в себя управление электродами для проникновения в эпидермальную ткань на глубину 0,1 мм или менее.
11. Способ по п.9, в котором этап контакта включает в себя управление электродами для проникновения в эпидермальную ткань на глубину приблизительно от 0,01 до около 0,04 мм.
12. Способ по любому из пп.9-11, в котором этап доставки включает доставку электрического потенциала, который создает боль, по оценке указанного субъекта, которая находится рядом с точкой безболезненности, измеряемой по визуальной аналоговой шкале.
13. Способ по любому из пп.9-11, в котором этап доставки включает доставку электрического потенциала, который приводит к минимальному повреждению ткани указанных клеток субъекта.
14. Способ по любому из пп.9-13, в котором этап доставки включает доставку электрического потенциала от около 0,1 до примерно 15 В к клеткам.
15. Способ по любому из пп.9-14, в котором этап доставки включает доставку электрического потенциала в текущем диапазоне от примерно 1 до около 50 мА в клетки.
16. Способ по любому из пп.9-15, в котором этап доставки включает доставку электрического потенциала на период в пределах от около 5 до примерно 250 мс.