ES2898688T3 - Procedimiento de detección - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, que comprende: a. someter una muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas y generar una salida de espectro de masas; b. identificar en dicha salida de espectro de masas un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina, en el que dicho primer pico definido es un pico presente en una salida de espectro de masas para el lípido A modificado por fosfoetanolamina y en el que dicho primer pico definido está ausente de una salida de espectro de masas correspondiente para el lípido A nativo; y c. en el que la presencia de dicho primer pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección
[0001] La presente invención se refiere a la detección de bacterias resistentes a los antibióticos, en particular bacterias resistentes a los antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos.
[0002] La tendencia creciente en la resistencia a los antibióticos continúa amenazando la salud mundial debido a la limitada oferta de nuevos antibióticos. La resistencia a múltiples fármacos en bacterias gram-negativas es de especial preocupación, ya que puede estar asociada, en aislados únicos, con la resistencia a las tres clases principales de antibióticos que son (i) las p-lactamas con p-lactamasas de espectro extendido codificadas por plásmidos (ESBL) que hidrolizan cefalosporinas y con carbapenemasas que hidrolizan adicionalmente carbapenémicos, (ii) los aminoglucósidos con metilasas de ARNr 16S que modifican su diana celular y confieren resistencia a los panaminoglucósidos, (iii) las fluoroquinolonas en su mayoría con mutaciones de topoisomerasas. Debido a la escasez de antibióticos restantes para el tratamiento de infecciones, los antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos (por ejemplo, las polimixinas, tales como la colistina y la polimixina B) se han convertido en el último recurso en particular para el tratamiento de infecciones debidas a Enterobacteriaceae resistentes a carbapenémicos. Además, estas Enterobacteriaceae resistentes a carbapenémicos son cada vez más prevalentes en todo el mundo, lo que lleva a un mayor uso de polimixinas como tratamiento de primera línea para infecciones altamente invasivas (por ejemplo, bacteriemia) en países "endémicos". Por ejemplo, según la Red europea de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos (EARS-Net), la prevalencia de Klebsiella pneumoniae resistente a los carbapenémicos aislada de cultivo de sangre alcanzó el 35% en Italia y el 63% en Grecia en 2015 en comparación con el 1,3% y el 43,5% en 2009, respectivamente. Desafortunadamente, este aumento de la resistencia a los carbapenémicos en Enterobacteriaceae, que llevó a un mayor uso de polimixinas, está fuertemente correlacionado con una mayor resistencia a las polimixinas.
[0003] La resistencia adquirida a la colistina en Enterobacteriaceae resulta mayormente de la modificación de la diana de polimixina, el lipopolisacárido. El lipopolisacárido (LPS), compuesto por el antígeno O, el núcleo de oligosacárido y el lípido A, es el principal glicolípido de superficie ubicado en la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Las polimixinas (por ejemplo, colistina, polimixina B y polimixina M) son antibióticos, con una estructura general que tiene un péptido cíclico con una cola hidrófoba. Alteran la estructura de la membrana celular bacteriana al interactuar con sus fosfolípidos. Después de unirse al lipopolisacárido (LPS) en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, las polimixinas alteran tanto la membrana externa como la interna. La cola hidrófoba es importante en provocar daño a la membrana, lo que sugiere un modo de acción similar al de un detergente.
[0004] La adición de fosfoetanolamina, grupos catiónicos de 4-amino-L-arabinosa o ambos al lipopolisacárido (por ejemplo, al lípido A) disminuye la unión del antibiótico de péptido catiónico cíclico (por ejemplo, polimixina) a la membrana externa bacteriana. La adición de estos grupos puede deberse a mecanismos codificados por cromosomas (por ejemplo, mutaciones en los sistemas de dos componentes PmrAB o PhoPQ o alteraciones del gen mgrB). Tal alteración conduce a una menor carga negativa de la membrana externa de la bacteria, lo que conduce a una interacción reducida de esta membrana con un antibiótico de péptido catiónico cíclico (por ejemplo, polimixina). Un informe reciente reveló que la adición de fosfoetanolamina también puede estar mediada por plásmidos a través del gen mcr-1, que confiere la primera resistencia conocida codificada por plásmido a la colistina en aislados de humanos y animales. Más recientemente, el gen mcr-1 se identificó en varias cadenas principales de plásmidos, principalmente en Escherichia coli. Por tanto, existe una necesidad urgente de una prueba que permita la detección rápida de la resistencia a la polimixina en bacterias (por ejemplo, Enterobacteriaceae) y que pueda contribuir a su contención.
[0005] La técnica de referencia estándar para la determinación de la susceptibilidad a polimixinas es la microdilución en caldo, que requiere una atención fastidiosa y un largo tiempo (24 h) para la realización. Se han propuesto otras técnicas para determinar la susceptibilidad a las polimixinas (difusión en disco y Etest), pero requieren de 18 a 24 horas para obtener resultados. Debido a la mala difusión de las moléculas de polimixina en agar, las tasas de falsa susceptibilidad son altas (hasta el 32%).
[0006] También se ha utilizado una prueba bioquímica (la prueba rápida NP de polimixina) que detecta el crecimiento bacteriano en presencia de una concentración definida de una polimixina. En esta prueba colorimétrica, la detección (o ausencia) del crecimiento bacteriano se basa en el metabolismo de los carbohidratos. La formación de ácido asociada con el metabolismo de carbohidratos en Enterobacteriaceae se puede observar a través del cambio de color de un indicador de pH. La interpretación de los resultados de esta prueba es subjetiva, lo que genera problemas de reproducibilidad y requiere más vigilancia por parte de los técnicos de laboratorio, lo que genera errores de lectura. Si bien es una mejora con respecto a otros procedimientos convencionales, esta prueba bioquímica puede tardar hasta 2 horas en producir un resultado.07
[0007] Debido a la variedad de genes que pueden estar involucrados en la resistencia a antibióticos de péptifod catiónicos cíclicos (por ejemplo, polimixina) (por ejemplo, genes similares a mcr codificados por plásmidos, tales como mcr-1 y mcr-2, comparten solo el 79% de identidad; y los genes codificados por el cromosoma relacionados con la resistencia a la polimixina son numerosos), el uso de herramientas de biología molecular (por ejemplo, amplificación y secuenciación de genes diana) para la detección de bacterias resistentes a la polimixina no es fiable. Para los genes codificados por cromosomas asociados con la resistencia a la polimixina, las modificaciones génicas (alteraciones, mutaciones por deleciones) implicadas tampoco se describen ni caracterizan sistemáticamente. En cuanto a la resistencia codificada por plásmidos, se conocen cinco familias de genes mcr en Enterobacteriaceae. MCR-2, MCR-3, MCR-4 y MCR-5 comparten solo el 81%, 34%, 33% y 31% de identidad de aminoácidos con MCR-1, respectivamente. Esta diversidad conduciría inevitablemente a un fallo en la detección sistemática de la resistencia a la polimixina cuando depende de la utilización de herramientas de biología molecular disponibles dedicadas a la detección de mcr-1 y/o mcr-2.
[0008] Otros enfoques convencionales han empleado el uso de espectrometría de masas (EM). De hecho, la EM se ha convertido en una técnica estándar disponible en la mayoría de los laboratorios clínicos. Los sistemas "Bioyper" de Bruker y los sistemas "VITEK-MS" de bioMerieux son ejemplos de sistemas de espectrometría de masas estándar y se han utilizado para la identificación de bacterias según el perfil del espectro de masas obtenido mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS). El sistema permite la discriminación de bacterias basada principalmente en proteínas. De hecho, todas las aplicaciones de diagnóstico actuales con EM se basan en el perfil de proteínas. Esto se debe a que las proteínas se pueden ionizar más fácilmente que las moléculas hidrófobas y fuertemente hidrófilas, tales como los lípidos y los polisacáridos, respectivamente. Por lo tanto, el análisis de l Ps y la modificación de la composición de LPS en bacterias, que tiene lugar durante la resistencia al altibiótico de péptidos catiónicos cíclicos (por ejemplo, polimixina) a través de MALDI-TOF MS, son un desafío.
[0009] Recientemente, esta tecnología también se ha desarrollado para detectar los mecanismos de resistencia a los antimicrobianos (por ejemplo, al antibiótico de p-lactama) mediante la detección de la presencia o ausencia de algunas p-lactamasas (por ejemplo ESBL o carbapenemasa). Aquí, la degradación (es decir, la hidrólisis) de la p-lactama es seguida por el análisis de EM para generar un espectro de masas: la ausencia del pico correspondiente a la p-lactama nativa indica resistencia antimicrobiana a los antibióticos de p-lactama. Sin embargo, en el caso de la polimixina, la resistencia no se debe a las modificaciones o la destrucción del antibiótico en sí; por lo tanto, la estrategia para detectar la modificación o destrucción de la polimixina utilizando MALDI-TOF MS para detectar bacterias resistentes a la polimixina no es aplicable.
[0010] Hasta la fecha, el uso de procedimientos basados en la espectrometría de masas (por ejemplo, MALDI-TOF MS) en la detección de lípido A y lípido A modificado ha requerido la purificación de la molécula real (lípido A) a partir de grandes cantidades de cultivo (por ejemplo desde 500 ml hasta varios litros). El procedimiento global tarda aproximadamente de 2 a 3 semanas, lo que no es compatible con el análisis clínico. Por tanto, los procedimientos convencionales son costosos y/o consumen mucho tiempo y/o son ineficaces para la detección de bacterias resistentes a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos (por ejemplo, polimixina) en una muestra y requieren una cantidad significativa de mano de obra especializada y equipo costoso. Ningún procedimiento actual basado en EM es adecuado para detectar bacterias resistentes a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos (por ejemplo, polimixina) en una muestra cruda que comprenda bacterias intactas.
[0011] Arroyo et al. (Antimicrobial agents and chemotherapy, 2011, 55, 8, pág. 3743-3751) describe que el operón pmrCAB media la resistencia a la polimixina en Acinetobacter baumannii ATCC 17978 y aislados clínicos a través de la modificación con fosfoetanolamina del lípido A. Tran et al. (Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, 53, pág.
55780-55791) describe la escisión periplásmica y la codificación del grupo 1-fosfato del lípido A de Helicobacter pylori. Pendela et al. (Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009, 23, 12, pág. 1856-1862) describe la caracterización de sustancias relacionadas con la dihidroestreptomicina mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con trampa de iones. Pelletier y col. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013, 57, 10, p. 4831-4840) describe modificaciones estructurales en el lipopolisacárido de cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a la colistina. Qureshi et al. (Clinical Infectious Diseases, 2015, 60, 9, pág. 1295-1303) describe Acinetobacter baumannii resistente a la colistina. Park et al. (Clinical Microbiology and Infection, 2015, 21, 8, pág.
765.e1-7) describe que el análisis transcriptómico de cepas aisladas susceptibles y resistentes a la colistina identifica genes asociados con la resistencia a la colistina en Acinetobacter baumannii. El documento US 2012/197535A1 describe procedimientos para identificar bacterias.
[0012] La presente invención resuelve al menos un (por ejemplo, más de uno) de los problemas mencionados anteriormente, al permitir la detección de bacterias resistentes a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una muestra que comprende una bacteria intacta, o membranas bacterianas. Por lo tanto, la presente invención es exclusivamente compatible con la clínica (por ejemplo, análisis clínico) y puede permitir la detección de una bacteria resistente al antibiótico de polipéptido catiónico cíclico (por ejemplo, polimixina) en menos de 15 minutos.
[0013] Ventajosamente, dicho procedimiento no requiere la purificación de una molécula de lípido A, y de hecho permite la identificación de cualquier lípido A y cualquier lípido A modificado directamente en bacterias intactas o en una muestra no purificada que contiene membranas bacterianas o fragmentos de las mismas. Además, el presente procedimiento se puede utilizar con una pequeña muestra bacteriana (por ejemplo, que comprende menos de 107 células bacterianas). Esto permite reducir ampliamente el tiempo y los materiales necesarios para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico en una muestra.
[0014] Ventajosamente, el procedimiento permite la detección de bacterias resistentes a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos codificados por plásmidos y codificadas por cromosomas en un único análisis. Por ejemplo, cuando las bacterias se han aislado de un paciente infectado, esto permite separar a los pacientes infectados con tales bacterias, por ejemplo, para la cuarentena de pacientes infectados con bacterias resistentes a polimixina codificadas por plásmido. Además, la detección de bacterias resistentes a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos codificadas por cromosomas a través de un procedimiento de la presente invención, que proporciona información ventajosa sobre el estado fisiológico del lípido A, evita la necesidad de análisis molecular de muestras que requieren la amplificación y secuenciación de muchos genes, cuya mutación puede dar lugar a resistencia a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos.
[0015] La presente invención proporciona procedimientos rápidos (15 minutos) y precisos (por ejemplo, procedimientos de diagnóstico), proporcionando mayores avances para la detección de la resistencia a la polimixina evaluando directamente modificaciones del lípido A, la diana celular de las polimixinas, en bacterias intactas. La combinación de excelente rendimiento, rentabilidad y escalabilidad de alto rendimiento son atributos deseables que distinguen los procedimientos actuales de la técnica anterior. Finalmente, los procedimientos de la presente invención usan tecnología que ya está disponible en muchos laboratorios de microbiología clínica, lo que permite una implementación sin costos y sin complicaciones.
[0016] La presente invención se define por las reivindicaciones. En el presente documento se describe un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, que comprende:
a. someter una muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas y generar una salida de espectro de masas; b. identificar en dicha salida de espectro de masas un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina, en el que dicho primer pico definido es un pico presente en una salida de espectro de masas para el lípido A modificado por fosfoetanolamina y en el que dicho primer pico definido está ausente de una salida de espectro de masas correspondiente para el lípido A nativo; y
c. en el que la presencia de dicho primer pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.
[0017] En un aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, que comprende:
a. someter una muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas y generar una salida de espectro de masas; en el que dicha muestra de ensayo comprende una membrana bacteriana o un fragmento de la misma, en el que el fragmento comprende un componente que no es de lípido A;
b. identificar en dicha salida de espectro de masas un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina, en el que dicho primer pico definido es un pico presente en una salida de espectro de masas para el lípido A modificado por fosfoetanolamina y en el que dicho primer pico definido está ausente de una salida de espectro de masas correspondiente para el lípido A nativo; y
c. en el que la presencia de dicho primer pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipeptídico catiónico, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.
[0018] El término "bacteria", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una bacteria Gram-negativa. Una bacteria puede ser una bacteria intacta o una bacteria fragmentada. La bacteria puede haber sido sometida a cualquier tratamiento químico (por ejemplo, tratamiento con agentes alcalinos) o físico (por ejemplo, calentamiento, agitación o pipeteo).
[0019] El término "muestra de ensayo", tal como se usa en el presente documento, no es una muestra purificada de Lípido A nativo o Lípido A modificado. La "muestra de ensayo" modificada comprende una membrana bacteriana o un fragmento de la misma. La membrana bacteriana comprende un lípido A nativo o un lípido A modificado. Adecuadamente, la membrana bacteriana puede comprender un lípido A modificado. Adecuadamente, un lípido A nativo o un lípido A modificado está presente como parte integral de la membrana bacteriana o un fragmento de la misma en la muestra de ensayo.
[0020] Ventajosamente, la utilización de una muestra de ensayo que comprende una membrana bacteriana o un fragmento de la misma (por ejemplo, una muestra en bruto) en un procedimiento de la presente invención evita la necesidad de purificar el lípido A y/o lípido A modificado (por ejemplo, de grandes volúmenes de cultivo bacteriano) antes de la detección de dichas moléculas de lípido A (por ejemplo, mediante espectrometría de masas). Por tanto, la presente invención se distingue de los procedimientos de la técnica anterior que requieren purificación (por ejemplo, purificación previa) del lípido A y/o del lípido A modificado.
[0021] El término "fragmento" como se usa en el contexto de una membrana bacteriana se refiere a un fragmento que comprende un componente no lípido A opcionalmente en combinación con un lípido A natuivo o lípido A modificado.
En una realización, un "fragmento" es un componente no lípido A opcionalmente en combinación con un lípido A modificado.
[0022] En una realización, una membrana bacteriana es parte de una bacteria intacta.
[0023] La "muestra de ensayo" puede ser una muestra biológica, tal como una muestra clínica. En una realización, una muestra de ensayo es sangre completa, suero, plasma, muestras orales, tales como saliva, pus, muestra vaginal, muestras de heces, vómito, líquido cefalorraquídeo, líquido lagrimal, líquido sinovial, esputo, muestras clínicas preparadas o procesadas (por ejemplo, para la eliminación de sal), muestras ambientales (por ejemplo, muestras de agua, suelo, aire), líquidos en grandes volúmenes, material de animal sacrificado, productos farmacéuticos y matrices biológicas. Puede prepararse una muestra de ensayo, por ejemplo, cuando sea apropiado, diluida o concentrada, o dializada y almacenada por medios estándar. Una muestra de ensayo generalmente comprende o se sospecha que comprende una bacteria (entre 101 y 1010 células bacterianas). Una muestra de ensayo también incluye homogeneizados de tejido, secciones de tejido y muestras de biopsia de un sujeto vivo o tomadas postmortem. Alternativamente, una muestra de ensayo puede ser una colonia o suspensión bacteriana recuperada de cualquier medio de crecimiento bacteriano o muestra clínica, muestra clínica preparada o procesada o muestra ambiental, tal como se describe anteriormente.
[0024] La muestra de ensayo puede comprender, o puede ser sospechosa de comprender una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico. De forma adecuada, la muestra de ensayo puede comprender una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.
[0025] Una muestra biológica puede ser una muestra clínica. La muestra clínica puede ser una muestra clínica que se ha sometido a una o más etapas de procesamiento. Por ejemplo, diálisis (por ejemplo, para reducir la concentración de una sal en dicha muestra). En una realización, la muestra de ensayo se procesa para eliminar la sal. La concentración reducida de sal puede permitir la prevención de la detección de especies que no son lípido A indeseables en un espectro de masas, mejorando así la interpretabilidad del espectro de masas. Se conocen en la técnica técnicas estándar para reducir la concentración de una sal (por ejemplo, diálisis). En una realización, la muestra de ensayo se somete a varias rondas de lavado (por ejemplo, centrifugación y resuspensión en un tampón bajo en sal o en un tampón sin sal). Una muestra de ensayo puede comprender una concentración de sal de menos de 200 mM o 100 mM. Adecuadamente, una muestra de ensayo puede comprender una concentración de sal de menos de 50 mM, 30 mM o 10 mM.
[0026] El término "detectar", tal como se usa en el presente documento, significa confirmar la presencia o ausencia de bacterias resistentes a un antibiótico de polipéptido cíclico catiónico (por ejemplo, polimixina) en una muestra. La detección se puede realizar en la muestra de ensayo, o indirectamente en un extracto de la misma, o en una dilución o concentrado de la misma. El término "identificar", tal como se usa en este documento, significa confirmar la presencia o ausencia de un pico asignado a un Lípido A modificado en la salida del espectro de masas. Dicho pico identificado también permite la cuantificación del lípido A modificado. En los procedimientos de la invención, la cuantificación se puede realizar midiendo la intensidad (por ejemplo, el valor más grande del eje y) de un pico en una salida del espectro de masas.
[0027] El término "análisis por espectrometría de masas" abarca cualquier técnica de espectrometría de masas adecuada para la determinación de la relación masa a carga de una molécula biológica, y abarca tanto los modos de iones negativos como positivos de la espectrometría de masas. Dichas técnicas de espectrometría de masas incluyen espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización de desorción láser mejorada en superficie (SELDI-TOF MS), espectrometría de masas con acelerador, EM-cromatografía de gases, EM-cromatografía líquida, EM de plasma acoplado inductivamente, espectrometría de masas de relación de isótopos (IRMS), espectrometría de masas de ionización por evaporación rápida (REIMS) y espectrometría de movilidad iónica-EM. Preferiblemente, el análisis de espectrometría de masas comprende (o consiste en) espectrometría de masas MALDI-TOF.
[0028] El MALDI es una técnica de ionización utilizada en espectrometría de masas, que permite el análisis de biomoléculas (biopolímeros, tales como ADN, proteínas, péptidos y azúcares) y moléculas orgánicas grandes (tales como polímeros, dendrímeros y otras macromoléculas), que tienden a ser frágiles y se fragmentan cuando se ionizan mediante otros procedimientos de ionización. En una realización, la solución matriz actúa como fuente de protones para estimular la ionización del analito (por ejemplo, lípido A).
[0029] En una realización, el análisis de espectrometría de masas comprende la ionización de un analito. En una realización, el análisis por espectrometría de masas comprende la ionización del lípido A o un lípido A modificado.
[0030] El término "salida del espectro de masas" abarca todos los datos que proporcionan la relación de masa/carga (m/z) de una molécula (por ejemplo, analito) en una muestra de ensayo junto con una estimación de la cantidad de dicha molécula en una muestra de ensayo, por ejemplo, en el intervalo de 400 m/z a 30.000 m/z, de 1.600 m/z a 2.200 m/z o de 1.000 m/z a 3.000 m/z. El procedimiento experimental de la invención puede optimizarse para proporcionar selectivamente la m/z de las moléculas de lípido A con un fondo mínimo (por ejemplo, donde "fondo" son datos m/z sobre especies que no son de lípido A).
[0031] El término "lípido A nativo" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un lípido A que no ha sido modificado, es decir, no comprende una modificación con fosfoetanolamina y/o 4-amino-L-arabinosa. El término "lípido A nativo" abarca (entre otros): hexa-acil difosforil lípido A que contiene cuatro C14:03-OH, un C14:0 y un C12:0; Lípido A con hidroxilación (-OH) de la cadena C'-2 acil-oxo-acilo; Lípido A con palmitoilación (-C-16) de la cadena C-1 aciloxo-acilo; y Lípido A con hidroxilación (-OH) de la cadena C'-2 acil-oxo-acilo y palmitoilación (-C-16) de la cadena C-1 acil-oxo-acilo.
[0032] En una realización, el lípido A nativo comprende una o más de las si uientes estructuras:
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[0033] En realizaciones en las que la bacteria es Escherichia coli, Klebsiella spp., Shigella spp., o Salmonella spp., el lípido A nativo comprende la estructura como se define en (a) anteriormente.
[0034] En realizaciones en las que la bacteria es Klebsiella spp, el lípido A nativo comprende la estructura como se define en (b) anterior. En realizaciones en las que la bacteria es Pseudomonas aeruginosa, el lípido A nativo comprende la estructura definida en (c) anteriormente.
[0035] En realizaciones en las que la bacteria es Acinetobacter baumannii, el lípido A nativo comprende la estructura como se define en (d) anteriormente.
[0036] En una realización, el lípido A nativo comprende una o más de las siguientes estructuras:
Figure imgf000007_0001
[0037] En realizaciones en las que la bacteria es Eschenchia coli, Klebsiella spp, Shigella spp, o Salmonella spp (preferiblemente Klebsiella spp.), lípido A nativo comprende la estructura como se define en uno cualquiera de (a)-(d) anterior.
[0038] En una realización, el lípido A con hidroxilación (-OH) de la cadena C'-2 acil-oxo-acilo comprende la estructura como se define en (b) anterior. De manera adecuada, dicho Lípido A comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z. En una realización, el lípido A con palmitoilación (-C-16) de la cadena C-1 acil-oxo-acilo comprende la estructura definida en (c) anteriormente. De manera adecuada, dicho Lípido A comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2060 a aproximadamente 2066 m/z, preferiblemente 2063 m/z. En una realización, el lípido A con hidroxilación (-OH) de la cadena C'-2 acil-oxo-acilo y palmitoilación (-C-16) de la cadena C-1 acil-oxo-acilo comprende la estructura definida en (d) anterior. De manera adecuada, dicho Lípido A comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2076 a aproximadamente 2082 m/z, preferiblemente 2079 m/z.
[0039] El término "lípido A modificado" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un lípido A que se ha modificado con una fosfoetanolamina y/o una 4-amino-L-arabinosa. Alternativamente, la 4-amino-L-arabinosa puede denominarse 4-amino-4-desoxi-L-arabinosa. El lípido A modificado con 4-amino-L-arabinoasa y/o fosfoetanolamina puede ser un biomarcador de resistencia a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos (por ejemplo, polimixina).
[0040] La estructura del lípido A se conoce en la técnica y puede variar entre las bacterias (por ejemplo, entre géneros, especies o cepas). La presente invención implica diferentes estructuras de lípido A que comprenden una modificación con fosfoetanolamina y/o una 4-amino-L-arabinosa en la posición 4' fosfato y/o 1' fosfato.
[0041] El "lípido A modificado" (por ejemplo, modificado con 4-amino-L-arabinoasa y/o fosfoetanolamina) es distinto (tanto estructural como funcionalmente) de un lípido A nativo. Sin desear estar ligado a la teoría, se cree que la modificación del lípido A con fosfoetanolamina y/o 4-amino-L-arabinosa conduce a una menor carga negativa de la membrana externa de una bacteria, lo que conduce a una interacción reducida de esta membrana con un antibiótico de péptido catiónico cíclico (por ejemplo, polimixina). Se cree que dicha modificación del lípido A con fosfoetanolamina y/o 4-amino-L-arabinosa provoca la remodelación de la membrana externa bacteriana y disminuye la permeabilidad de la membrana. Ventajosamente, la presente invención proporciona un procedimiento que permite sorprendentemente la detección tanto de un lípido A nativo como de un lípido A modificado en una muestra de ensayo que comprende una membrana bacteriana o un fragmento de la misma. La capacidad de detectar tanto un lípido A nativo como un lípido A modificado en la misma muestra de ensayo es particularmente ventajosa, ya que las cantidades relativas (por ejemplo, concentraciones) de un lípido A nativo y un lípido A modificado en la misma muestra de ensayo pueden compararse directamente y contrastarse.
[0042] En una realización, el lípido A modificado con fosfoetanolamina comprende una modificación con fosfoetanolamina en el fosfato 1' y/o 4' fosfato de lípido A. De manera adecuada, el lípido A modificado con fosfoetanolamina comprende una modificación con fosfoetanolamina en el fosfato 1'.
[0043] En una realización, el lípido A modificado con fosfoetanolamina comprende una modificación con fosfoetanolamina en el fosfato 1' del lípido A con la pérdida concomitante del grupo fosfato 4'. En otra realización, el lípido A modificado con fosfoetanolamina comprende una modificación con fosfoetanolamina en el grupo fosfato 4' del lípido A con pérdida concomitante del grupo fosfato 1'. De forma adecuada, el lípido A modificado con fosfoetanolamina comprende una modificación con fosfoetanolamina en el grupo fosfato 1' del lípido A con pérdida concomitante del grupo fosfato 4'.
[0044] En una realización, el lípido A modificado con 4-amino-L-arabinosa comprende una modificación con 4-amino-L-arabinosa en el fosfato 1' del lípido A. En una realización, el lípido A modificado con 4-amino-L-arabinosa comprende una modificación con 4-amino-L-arabinosa en el fosfato 4' del lípido A. De manera adecuada, el lípido A modificado con 4-amino-L-arabinosa comprende una modificación con 4-amino-L-arabinosa en el fosfato 4' del lípido A.
[0045] En una realización, el lípido A modificado con fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una modificación con fosfoetanolamina en el fosfato 1' y/o fosfato 4' del lípido A. De manera adecuada, el lípido A modificado con fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una modificación con fosfoetanolamina en el fosfato 1' y una modificación con 4-amino-L-arabinosa en el fosfato 4'.
[0046] A modo de ejemplo, un lípido A de Escherichia coli, Klebsiella spp, Shigella spp, o Salmonella spp modificado
Figure imgf000008_0001
[0047] En una realización, el lípido A modificado con 4-amino-L-arabinosa comprende una modificación con 4-amino-L-arabinosa en el fosfato 1' y/o el 4' fosfato del lípido A, preferiblemente en la fosfato 4'.
[0048] Preferiblemente, el lípido A modificado por fosfoetanolamina puede comprender una o más de las siguientes estructuras:
Figure imgf000009_0001
[0049] En realizaciones en las que la bacteria es Escherichia coli, Klebsiella spp., Shigella spp., o Salmonella spp, el lípido A modificado por fosfoetanolamina puede comprender la estructura, tal como se define en (a) anteriormente. En realizaciones en las que la bacteria es Acinetobacter baumannii, el lípido A modificado por fosfoetanolamina puede comprender la estructura definida en (b) anterior. En una realización, el lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende la estructura definida anteriormente para E. coli, Klebsiella spp., Shigella spp. y Salmonella spp.
[0050] Preferiblemente, el lípido A modificado con 4-amino-L-arabinosa puede comprender una o más de las siguientes estructuras:
Figure imgf000010_0001
[0051] El procedimiento de la invención puede usarse para diagnosticar la infección de un sujeto con una bacteria resistente a un antibiótico de polipeptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plasmidos, o la infección de un sujeto con una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de resistencia codificada por cromosoma.
[0052] El término "diagnóstico" tal como se utiliza en este documento abarca la identificación, confirmación y/o caracterización de infecciones bacterianas resistentes a polipéptidos catiónicos cíclicos. Los procedimientos de diagnóstico que implican un procedimiento de acuerdo con la invención son útiles para confirmar la existencia de una infección. Los procedimientos de diagnóstico también son útiles en procedimientos para la evaluación del cribado clínico, el pronóstico, la elección de la terapia, la evaluación del beneficio terapéutico, es decir, para el cribado y el desarrollo de fármacos. Un diagnóstico eficiente permite identificar rápidamente el tratamiento más apropiado (disminuyendo así la exposición innecesaria a los efectos secundarios dañinos de los medicamentos) y reducir las tasas de recaída.
[0053] También se proporciona un procedimiento para monitorizar la eficacia de una terapia para infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos, que comprende identificar y/o cuantificar el lípido A modificado en una muestra de ensayo tomada de un sujeto a través de un procedimiento de la presente invención después de terapia. En los procedimientos de monitorización, las muestras de ensayo pueden tomarse en más de una ocasión. El procedimiento puede comprender además comparar el nivel del lípido A modificado en una muestra de ensayo con uno o más controles y/o con una o más muestras de ensayo anteriores tomadas anteriormente del mismo sujeto de prueba, por ejemplo, antes del comienzo de la terapia, y/o del mismo sujeto de prueba en una etapa anterior de la terapia. El procedimiento puede comprender detectar un cambio en el nivel de un lípido A modificado en muestras de ensayo tomadas en diferentes ocasiones.
[0054] En una realización, el primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación de masa/carga (m/z) de aproximadamente 120 a aproximadamente 125 unidades m/z (preferiblemente de aproximadamente 123 unidades m/z) mayor que un segundo pico definido indicativo de la presencia de lípido A nativo.
[0055] En una realización, el segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella entérica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1614 a aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa; o
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1907 a aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, para Acinetobacter baumannii.
[0056] En una realización, el segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1847 a aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2059 a aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1614 a aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1907 a aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, para Acinetobacter baumannii.
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp;
j. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp; o
k. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2031 a aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
[0057] En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente aproximadamente 1796,2 m/z para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca). En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1847 a aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2059 a aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización más, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1614 a aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1907 a aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, para Acinetobacter baumannii. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2031 a aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
[0058] En algunas realizaciones, el primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1960 a aproximadamente 1966 m/z, preferiblemente 1963 m/z para Klebsiella pneumoniae; entre aproximadamente 1970 y aproximadamente 1976 m/z, preferiblemente 1973 m/z para Klebsiella pneumoniae; entre aproximadamente 2182 y aproximadamente 2188 m/z, preferiblemente 2185 m/z para Klebsiella pneumoniae; entre aproximadamente 2198 y aproximadamente 2204 m/z, preferiblemente 2201 m/z para Klebsiella pneumoniae; entre aproximadamente 1918 y aproximadamente 1920 m/z, preferiblemente aproximadamente 1919,2 m/z para Salmonella spp.; entre aproximadamente 1944 y aproximadamente 1950 m/z, preferiblemente 1947 m/z, para Salmonella spp., entre aproximadamente 2154 y aproximadamente 2160 m/z, preferiblemente 2157 m/z, para Salmonella spp.; entre aproximadamente 1913 y aproximadamente 1924 m/z, o entre aproximadamente 1918 y aproximadamente 1920 m/z, preferiblemente aproximadamente 1919,2 m/z para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp., Klebsiella oxytoca; entre aproximadamente 1940 y aproximadamente 1951 m/z, o entre aproximadamente 1946 y aproximadamente 1947 m/z, preferiblemente aproximadamente 1946,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae; entre aproximadamente 1734 y aproximadamente 1745 m/z, o entre aproximadamente 1939 y aproximadamente 1741 m/z, preferiblemente aproximadamente 1740,2 m/z para Pseudomonas aeruginosa; y entre aproximadamente 2027 y aproximadamente 2038 m/z, o entre aproximadamente 2032 y aproximadamente 2034 m/z, preferiblemente aproximadamente 2033,3 m/z, para Acinetobacter baumannii.
[0059] En algunas realizaciones, el primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación de masa/carga (m/z) entre aproximadamente 1913 y aproximadamente 1924 m/z, o entre aproximadamente 1918 y aproximadamente 1920 m/z, preferiblemente aproximadamente 1919,2, m/z para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp., Klebsiella oxytoca; entre aproximadamente 1940 y aproximadamente 1951 m/z, o entre aproximadamente 1946 y aproximadamente 1947 m/z, preferiblemente aproximadamente 1946,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae; entre aproximadamente 1734 y aproximadamente 1745 m/z, o entre aproximadamente 1939 y aproximadamente 1741 m/z, preferiblemente aproximadamente 1740,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa; y entre aproximadamente 2027 y aproximadamente 2038 m/z, o entre aproximadamente 2032 y aproximadamente 2034 m/z, preferiblemente aproximadamente 2033,3 m/z, para Acinetobacter baumannii.
[0060] En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1913 y aproximadamente 1924 m/z, o entre aproximadamente 1918 y aproximadamente 1920 m/z, preferiblemente aproximadamente 1919,2 m/z para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp., Klebsiella oxytoca. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1940 y aproximadamente 1951 m/z, o entre aproximadamente 1946 m/z y aproximadamente 1947 m/z, preferiblemente aproximadamente 1946,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización más, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1614 y aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1734 y aproximadamente 1745 m/z, o entre aproximadamente 1939 y aproximadamente 1741 m/z, preferiblemente aproximadamente 1740,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1907 y aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) entre aproximadamente 2027 y aproximadamente 2038 m/z, o entre aproximadamente 2032 y aproximadamente 2034 m/z, preferiblemente aproximadamente 2033,3 m/z, para Acinetobacter baumannii. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z para Klebsiella pneumoniae y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1960 a aproximadamente 1966 m/z, preferiblemente 1963 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1847 a aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z para Klebsiella pneumoniae y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1970 y aproximadamente 1976 m/z, preferiblemente 1973 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2059 a aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2182 y aproximadamente 2188 m/z, preferiblemente 2185 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z para Klebsiella pneumoniae y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2198 y aproximadamente 2204 m/z, preferiblemente 2201 m/z para Klebsiella pneumoniae.
[0061] En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1918 y aproximadamente 1920 m/z, preferiblemente aproximadamente 1919,2 m/z para Salmonella spp. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1944 y aproximadamente 1950 m/z, preferiblemente 1947 m/z, para Salmonella spp. En otra realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2031 a aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp y un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2154 y aproximadamente 2160 m/z, preferiblemente 2157 m/z, para Salmonella spp.
[0062] La intensidad se puede normalizar al lípido A nativo. En una realización, se puede calcular una relación entre un pico definido y el lípido A nativo.
[0063] El término "intensidad" se refiere al valor más alto de un pico a lo largo del eje y de una salida de espectro de masas, lo que representa la intensidad de señal del ión (por ejemplo, analito).
[0064] El experto en la materia entiende que un "pico" en un espectro de masas tiene un valor de intensidad minimus por encima de la de fondo. En una realización, un pico puede ser cualquier valor m/z que tenga una intensidad de al menos dos veces (por ejemplo, 2x) la intensidad de la intensidad promedio de los picos de fondo. De forma adecuada, un pico puede ser cualquier valor m/z que tenga una intensidad de al menos seis veces (por ejemplo, 6x) u ocho veces (por ejemplo, 8x) la intensidad de la intensidad promedio de los picos de fondo. De forma adecuada, un pico puede ser cualquier valor m/z que tenga una intensidad de al menos diez veces (por ejemplo, 10x) o doce veces (por ejemplo, 12x) la intensidad de la intensidad promedio de los picos de fondo.
[0065] En una realización, una relación de intensidad del primer pico definido (indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina) con respecto al segundo pico definido (indicativo de la presencia de lípido A nativo) es al menos 0,10.
[0066] De forma adecuada, la relación de intensidad del primer pico definido (indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina) con respecto al segundo pico definido puede ser al menos aproximadamente 0,10:1, 0,15:1, 0,30:1, 0,45:1, 1:1, 1,15:1, 1,30:1, 1,45:1,2:1, 2,15:1, 2,30:1 o 2,45:1. Preferiblemente, la relación puede estar entre 0,15:1 y 2,5:1, o la relación puede estar entre 0,15:1 y 1:1.
[0067] Ventajosamente, una relación de al menos aproximadamente 0,10, tal como se describe anteriormente, indica la presencia de bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico (por ejemplo, polimixina). El cálculo de esta relación puede evitar la detección de falsos positivos de la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico (por ejemplo, debido a picos de fondo).
[0068] En una realización, un procedimiento de la invención comprende además identificar en una salida de espectro de masas un tercer pico definido que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 22 a aproximadamente 28 unidades m/z (preferiblemente 25 unidades m/z) mayor que un segundo pico definido. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que dicho tercer pico definido sólo se detecta en una muestra de ensayo que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido. Ventajosamente, los procedimientos de la invención permiten por tanto la detección de bacterias resistentes a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos codificadas por plásmidos y codificadas por cromosomas en un único análisis. Por ejemplo, cuando las bacterias se han aislado de un paciente infectado, esto permite separar a los pacientes infectados con dichas bacterias, por ejemplo, para la cuarentena de pacientes ifnectados con bacterias resistentes a polimixina codificada por plásmido.
[0069] En una realización, dicho tercer pico definido como se identifica en una salida de espectro de masas en cualquier procedimiento de la presente invención es indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina. En una realización preferible, dicho tercer pico definido identificado en una salida del espectro de masas en cualquier procedimiento de la presente invención es indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina en el grupo fosfato 1' del lípido A con pérdida concomitante del grupo fosfato 4'.
[0070] En una realización, el segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae.
c. pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1847 a aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2059 a aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp; o
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2031 a aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
[0071] En una realización, el segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae.
[0072] En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, o entre aproximadamente 1796 y aproximadamente 1797 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa-carga (m/z) de entre aproximadamente 1837 y aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1847 y aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2059 y aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2075 y aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp. En una realización, un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 28 unidades m/z, preferiblemente aproximadamente 25 unidades m/z, mayor que un segundo pico definido, en el que un segundo pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2031 y aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
[0073] En una realización, un tercer pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1818 a aproximadamente 1824 m/z, preferiblemente 1821 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1845 a aproximadamente 1852 m/z, preferiblemente 1848,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1863 a aproximadamente 1868 m/z, preferiblemente 1865 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1872 a aproximadamente 1878 m/z, preferiblemente 1875 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2084 a aproximadamente 2090 m/z, preferiblemente 2087 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2100 a aproximadamente 2105 m/z, preferiblemente 2103 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1818 a aproximadamente 1824 m/z, preferiblemente 1821,2 m/z, para Salmonella spp;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1846 a aproximadamente 1852 m/z, preferiblemente 1849 m/z, para Salmonella spp; o
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2056 a aproximadamente 2062 m/z, preferiblemente 2059 m/z, para Salmonella spp.
[0074] En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) entre aproximadamente 1818 y aproximadamente 1824 m/z, preferiblemente aproximadamente 1821 m/z para Escherichia coli, Shigella, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre 1845 y aproximadamente 1852 m/z, preferiblemente 1848,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1837 y aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre 1863 y aproximadamente 1868 m/z, preferiblemente 1865 m/z, para Klebsiella pneumoniae.
[0075] En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1847 y aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1872 y aproximadamente 1878 m/z, preferiblemente 1875 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2059 y aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2084 y aproximadamente 2090 m/z, preferiblemente 2087 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2075 y aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2100 y aproximadamente 2105 m/z, preferiblemente 2103 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1818 y aproximadamente 1824 m/z, preferiblemente 1821,2 m/z, para Salmonella spp. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1846 y aproximadamente 1852 m/z, preferiblemente 1849 m/z, para Salmonella spp. En una forma de realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa-carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) entre aproximadamente 1846 y aproximadamente 1852 m/z, preferiblemente 1849 m/z, para Salmonella spp. En una realización, el lípido A nativo (segundo pico definido) comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2031 y aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z y un tercer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de entre 2056 y aproximadamente 2062 m/z, preferiblemente 2059 m/z, para Salmonella spp.
[0076] Ventajosamente, la identificación de la presencia de la tercera definido como se describe anteriormente indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmidos, preferiblemente en el que dicha bacteria es de la familia Enterobacteriaceae. Asimismo, la ausencia del tercer pico definido puede indicar la ausencia de una bacteria resistente a un polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido, preferiblemente en donde dicha bacteria es de la familia Enterobacteriaceae.
[0077] En una realización, la presencia de dicho tercer pico definido indica la presencia de una bacteria de la familia Enterobacteriaceae (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticus o Citrobacteryoungae) resistentes a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico mediante resistencia codificada por plásmidos.
[0078] En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, que comprende:
a. someter una muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas y generar una salida de espectro de masas; en el que dicha muestra de ensayo comprende una membrana bacteriana o un fragmento de la misma, en el que el fragmento comprende un componente que no es lípido A;
b. identificar en dicha salida de espectro de masas un primer pico definido y/o un tercer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina, en el que dicho primer pico definido y/o tercer pico definido es un pico presente en una salida de espectro de masas para lípido A modificado por fosfoetanolamina y en el que dicho primer pico definido y/o dicho tercer pico definido está ausente de una salida de espectro de masas correspondiente para el lípido A nativo; y
c. en el que la presencia de dicho primer pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico; y/o
en el que la presencia de dicho tercer pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico a través de la resistencia codificada por plásmido, y en el que la ausencia de dicho tercer pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido.
[0079] En una realización, una relación de intensidad de:
el tercer pico definido; con respecto al
segundo pico definido es al menos aproximadamente 0,15:1, o al menos aproximadamente 0,6:1.
[0080] De forma adecuada, la relación de intensidad del tercer pico definido con respecto al segundo pico definido puede estar entre al menos aproximadamente 0,15:1 y aproximadamente 2,5:1. De forma adecuada, la relación puede estar entre aproximadamente 0,6:1 y aproximadamente 1:1. De forma adecuada, la relación puede ser de al menos aproximadamente 0,15:1, 0,3:1, 0,45:1, 0,6:1, 0,75:1, 0,9:1, 1,15:1, 1,3:1; 1,45:1, 1,6:1, 1,75:1, 1,9:1, 2,15:1, 2,3:1 o 2,45:1.
[0081] Así, en una realización, una relación de intensidad del tercer pico definido con respecto al segundo pico definido, en la que la relación es al menos aproximadamente 0,15:1, indica la presencia de una bacteria (por ejemplo, de la familia Enterobacteriaceae) resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido. Asimismo, una relación de menos de 0,15:1 indica la ausencia de una bacteria resistente a un polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido.
[0082] En una realización, una relación de:
la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido; con respecto a la intensidad del segundo pico definido es de al menos aproximadamente 0,15:1.
[0083] De forma adecuada, la relación de la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido es de al menos 0,15:1, 0,3:1, 0,45:1, 0,6 :1, 0,75:1, 0,9:1, 1,15:1, 1,3:1; 1,45:1, 1,6:1, 1,75:1, 1,9:1, 2,15:1, 2,3:1 o 2,45:1.
[0084] En una realización preferible, una relación de:
la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido; con respecto a la intensidad del segundo pico definido es de al menos aproximadamente 0,5:1.
[0085] De forma adecuada, la relación de la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido es de al menos aproximadamente 0,5:1, 0,75:1, 0,9:1, 1,15:1, 1,3:1; 1,45:1, 1,6:1, 1,75:1, 1,9:1, 2,15:1, 2,3:1, 2,45:1,2,6:1, 2,75:1, 2,9:1, 3,15:1, 3,3:1, 3,45:1, 3,6:1, 3,75:1, 3,9:1,4,15:1, 4,3:1, 4,45:1, 4,6:1, 4,75:1, 4,9:1 o 5:1.
[0086] De manera ventajosa, en una bacteria (por ejemplo, de la familia Enterobacteriaceae, tal como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella spp., Salmonella spp) resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, al comparar la relación de intensidad del tercer pico definido con el segundo pico definido proporciona más información sobre el mecanismo subyacente al mecanismo de resistencia. La detección de una bacteria (por ejemplo, de la familia Enterobacteriaceae) resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido en una muestra de ensayo es de particular importancia, ya que dichas muestras de ensayo o pacientes de los que se derivan dichas muestras de ensayo deben estar contenidas de forma segura/puestas en cuarentena para evitar la propagación (o el riesgo de la misma) del plásmido transmisible a otra bacteria, propagando así la resistencia codificada por el plásmido.
[0087] En una realización, una relación de la suma de la intensidad del pico primero definido y la intensidad de la tercera pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido de al menos aproximadamente 0,5:1 es indicativa de la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido.
[0088] En una realización, una relación de:
la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido; con respecto a
la intensidad del segundo pico definido está entre aproximadamente 0,1:1 y 0,5:1.
[0089] De forma adecuada, la relación de la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido está entre aproximadamente 0,15:1 y 0,45:1, entre aproximadamente 0,2:1 y 0,4:1 o entre aproximadamente 0,25:1 y 0,35:1.
[0090] En una realización, una relación de la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido de entre aproximadamente 0,1:1 y 0,5:1 es indicativo de la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosomas.
[0091] En una realización, una relación de:
la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido; con respecto a
la intensidad del segundo pico definido es menor de aproximadamente 0,1:1.
[0092] De forma adecuada, la relación de la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido es menor que aproximadamente 0,1:1, 0,08:1, 0. 06:1, 0,04:1, 0,02:1 o 0,01:1.
[0093] En una realización, la relación de la suma de la intensidad del primer pico definido y la intensidad del tercer pico definido con respecto a la intensidad del segundo pico definido de menos de aproximadamente 0.1:1 es indicativo de la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.
[0094] En una realización, un procedimiento descrito en este documento comprende además identificar en dicha salida de espectro de masas un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa, que comprende una relación de masa/carga de aproximadamente 129 a 133 unidades m/z (preferiblemente aproximadamente 131 unidades m/z) mayores que el segundo pico definido indicativo de la presencia de lípido A nativo.
[0095] En una realización, el segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella entérica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1847 a aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2059 a aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1614 a aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1907 a aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, para Acinetobacter baumannii;
1. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp;
j. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp; o
k. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2031 a aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
[0096] En una realización, el cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1924 a aproximadamente 1930 m/z, preferiblemente 1927,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1951 a aproximadamente 1957 m/z, preferiblemente 1954,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1968 a aproximadamente 1974 m/z, preferiblemente 1971 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1978 a aproximadamente 1984 m/z, preferiblemente 1981 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2190 a aproximadamente 2196 m/z, preferiblemente 2193 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2206 a aproximadamente 2212 m/z, preferiblemente 2209 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1745 a aproximadamente 1751 m/z, preferiblemente 1748,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2038 a aproximadamente 2044 m/z, preferiblemente 2041,3 m/z, para Acinetobacter baumannii;
I. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1924 a aproximadamente 1930 m/z, preferiblemente 1927,2 m/z, para Salmonella spp;
j. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1952 a aproximadamente 1958 m/z, preferiblemente 1955 m/z, para Salmonella spp; o
k. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2162 a aproximadamente 2168 m/z, preferiblemente 2165 m/z, para Salmonella spp.
[0097] En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1924 y aproximadamente 1930 m/z, preferiblemente 1927,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter. spp. y Klebsiella oxytoca. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1951 y aproximadamente 1957 m/z, preferiblemente 1954,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa-carga (m/z) de entre aproximadamente 1837 y aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1968 y aproximadamente 1974 m/z, preferiblemente 1971 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1847 y aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación de masa a carga (m/z) de entre aproximadamente 1978 y aproximadamente 1984 m/z, preferiblemente 1981 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2059 y aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa-carga (m/z) de entre aproximadamente 2190 y aproximadamente 2196 m/z, preferiblemente 2193 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2075 y aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación de masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2206 y aproximadamente 2212 m/z, preferiblemente 2209 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1614 y aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa-carga (m/z) de entre aproximadamente 1745 y aproximadamente 1751 m/z, preferiblemente 1748,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1907 y aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2038 y aproximadamente 2044 m/z, preferiblemente 2041,3 m/z, para Acinetobacter baumannii. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa-carga (m/z) entre aproximadamente 1924 y aproximadamente 1930 m/z, preferiblemente 1927,2 m/z, para Salmonella spp. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1952 y aproximadamente 1958 m/z, preferiblemente 1955 m/z, para Salmonella spp. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2031 y aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, y un cuarto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa-carga (m/z) entre aproximadamente 2162 y aproximadamente 2168 m/z, preferiblemente 2165 m/z, para Salmonella spp.
[0098] En una realización, la presencia de dicho cuarto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosoma. En una realización, la ausencia de dicho cuarto pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de una resistencia codificada por cromosomas.
[0099] En una realización, la presencia de dicho primer pico definido (por ejemplo, indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina) y la ausencia de dicho cuarto definido pico indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de resistencia codificada por plásmido. En una realización, la ausencia de dicho primer pico definido y la presencia de dicho cuarto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosoma. La resistencia a la polimixina codificada por plásmido se asocia típicamente con el lípido A modificado por fosfoetanolamina (por ejemplo, no modificado adicionalmente por 4-amino-L-arabinosa).
[0100] En una realización, la presencia de dicho tercer pico definido (por ejemplo, indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina en el grupo fosfato 1' con pérdida concomitante del fosfato 4') y la ausencia de dicho cuarto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmidos y la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosomas. En una realización, la ausencia de dicho tercer pico definido y la presencia de dicho cuarto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de una resistencia codificada por cromosomas y la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmidos.
[0101] En un aspecto, se demuestra un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, que comprende:
a. someter una muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas y generar una salida de espectro de masas; en el que dicha muestra de ensayo comprende una membrana bacteriana o un fragmento de la misma, en el que el fragmento comprende un componente que no es de lípido A;
b. identificar en dicha salida del espectro de masas un cuarto pico definido (por ejemplo, cualquier cuarto pico definido como se definió anteriormente) indicativo de la presencia de lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa, en el que dicho cuarto pico definido es un pico presente en una salida de espectro de masas para el lípido A modificado por 4-amino-L-arabinosa y en el que dicho cuarto pico definido está ausente de una salida del espectro de masas correspondiente para el lípido A nativo; y
c. en el que la presencia de dicho cuarto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, y en el que la ausencia de dicho cuarto pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.
[0102] En una realización, un procedimiento, tal como se describe en el presente documento, comprende además identificar en dicha salida de espectro de masas un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa, que comprende una relación masa/carga de aproximadamente 253 a 257 unidades m/z (preferiblemente aproximadamente 254 unidades m/z) mayor que el segundo pico definido indicativo de la presencia de lípido A nativo.
[0103] En una realización, el segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella entérica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1837 a aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1847 a aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2059 a aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1614 a aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1907 a aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, para Acinetobacter baumannii;
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1793 a aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp;
j. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1820 a aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp; o
k. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2031 a aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
[0104] En una realización, el quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2047 a aproximadamente 2053 m/z, preferiblemente 2050 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella entérica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca;
b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2074 a aproximadamente 2080 m/z, preferiblemente 2077 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2091 a aproximadamente 2097 m/z, preferiblemente 2094 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2101 a aproximadamente 2107 m/z, preferiblemente 2104 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2313 a aproximadamente 2319 m/z, preferiblemente 2316 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2329 a aproximadamente 2335 m/z, preferiblemente 2332 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 1868 a aproximadamente 1874 m/z, preferiblemente 1871,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2161 a aproximadamente 2167 m/z, preferiblemente 2164,3 m/z, para Acinetobacter baumannii;
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2047 a aproximadamente 2053 m/z, preferiblemente 2050,2 m/z, para Salmonella spp;
j. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2075 a aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Salmonella spp; o
k. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 2285 a aproximadamente 2291 m/z, preferiblemente 2288 m/z, para Salmonella spp.
[0105] En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2047 y aproximadamente 2053 m/z, preferiblemente 2050 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1820 y aproximadamente 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2074 y aproximadamente 2080 m/z, preferiblemente 2077 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1837 y aproximadamente 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación de masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2091 y aproximadamente 2097 m/z, preferiblemente 2094 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1847 y aproximadamente 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2101 y aproximadamente 2107 m/z, preferiblemente 2104 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2059 y aproximadamente 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2313 y aproximadamente 2319 m/z, preferiblemente 2316 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2075 y aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación de masa a carga (m/z) de entre aproximadamente 2329 y aproximadamente 2335 m/z, preferiblemente 2332 m/z, para Klebsiella pneumoniae. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1614 y aproximadamente 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1868 y aproximadamente 1874 m/z, preferiblemente 1871,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1907 y aproximadamente 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2161 y aproximadamente 2167 m/z, preferiblemente 2164,3 m/z, para Acinetobacter baumannii. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 1793 y aproximadamente 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2047 y aproximadamente 2053 m/z, preferiblemente 2050,2 m/z, para Salmonella spp. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2075 y aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2075 y aproximadamente 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Salmonella spp. En una realización, el lípido A nativo comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2031 y aproximadamente 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z y un quinto pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa comprende una relación masa/carga (m/z) de entre aproximadamente 2285 y aproximadamente 2291 m/z, preferiblemente 2288 m/z, para Salmonella spp.
[0106] En una realización, la presencia de dicho quinto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosoma. En una realización, la ausencia de dicho quinto pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de una resistencia codificada por cromosomas. La resistencia a la polimixina codificada por cromosomas puede asociarse típicamente con el lípido A modificado por fosfoetanolamina y/o el lípido A modificado tanto con fosfoetanolamina como con 4-amino-L-arabinosa (por ejemplo, la presencia tanto del primer pico definido como del quinto pico definido).
[0107] En una realización, la presencia de dicho primer pico definido (por ejemplo, indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina) y la ausencia de dicho quinto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de resistencia codificada por plásmido. En una realización, la ausencia de dicho primer pico definido y la presencia de dicho quinto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosoma.
[0108] En una realización, la presencia de dicho tercer pico definido (por ejemplo, indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina en el grupo fosfato 1' con pérdida concomitante del fosfato 4') y la ausencia de dicho quinto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido y la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosomas. En una realización, la ausencia de dicho tercer pico definido y la presencia de dicho quinto pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de una resistencia codificada por cromosomas y la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmidos.
[0109] Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de resistencia codificada por plásmido comprende un plásmido que tiene un gen mcr-1, mcr-2, un gen similar a mcr o una combinación de los mismos. Una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido puede comprender un plásmido que tiene un gen mcr-1 (por ejemplo, mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, mcr-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9 y/o mcr-1.10), un gen mcr-2 (por ejemplo, mcr-2 y/o mcr-2.2), un gen mcr-3 (por ejemplo, mcr-3 y/o mcr-3.2), un gen mcr-4 (por ejemplo, mcr-4), un gen mcr-5 (por ejemplo, mcr-5), un gen similar a mcr o una combinación de los mismos. Adecuadamente, el lípido A modificado con fosfoetanolamina en el grupo fosfato 1' del lípido A con pérdida concomitante del grupo fosfato 4' (por ejemplo, como para el tercer pico definido descrito en el presente documento) solo es detectable en una bacteria que comprende un plásmido que comprende uno o más de dichos genes mcr, y no es detectable en una bacteria que carece de dicho plásmido.
[0110] En una realización, una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmidos o una bacteria de la familia Enterobacteriaceae resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmidos comprende un plásmido que tiene un gen de resistencia a la colistina movilizado. En una realización, un gen de resistencia a la colistina movilizado comprende uno o más de mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, mcr-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, gen mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4, mcr-5 o un gen similar a mcr. En una realización, un gen de resistencia a colistina movilizadoa comprende uno o más de mcr-1, mcr-2 o un gen similar a mcr.
[0111] Un "gen similar o de tipo mcr" como se usa en el presente documento es un gen que comprende una secuencia que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido equivalente funcionalmente y/o estructuralmente al polipéptido codificado por un gen mcr-1 o mcr-2. Un "gen similar o de tipo mcr" como se usa en este documento es un gen que comprende una secuencia que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido funcional y/o estructuralmente equivalente al polipéptido codificado por mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, mcr-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4 o mcr-5.
[0112] En una realización, un gen similar a mcr es un gen que comprende una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con mcr-1, mcr-1,1, mcr-1,2, mcr-1,3, mcr-1,4, mcr-1,5, mcr -1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4 o mcr-5. En una realización, dicho gen similar a mcr comprende al menos 60% o 70% de identidad de secuencia con mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, mcr-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4 o mcr-5. Adecuadamente, el gen similar a mcr comprende al menos 80% o 90% (por ejemplo, al menos 95%) de identidad de secuencia con mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, m c r-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4 o mcr-5.
[0113] En una realización, un gen similar a mcr es un gen que comprende una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con mcr-1 o mcr-2. En una realización, dicho gen similar a mcr comprende al menos 60% o 70% de identidad de secuencia con mcr-1 o mcr-2. De manera adecuada, el gen similar a mcr comprende al menos 80% o 90% (por ejemplo, al menos 95%) de identidad de secuencia con mcr-1 o mcr-2.
[0114] En una realización, un gen mcr-1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con las mismas, adecuadamente al menos 60%, 70 %, 80% o 90% de identidad de secuencia con las mismas. En una realización, un gen mcr-1 tiene la secuencia SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la misma, adecuadamente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con la misma.
[0115] En una realización, un gen mcr-2 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la misma, adecuadamente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con las mismas. En una realización, un gen mcr-2 tiene la secuencia SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la misma, adecuadamente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con la misma.
[0116] En una realización, un gen mcr-3 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con las mismas, adecuadamente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con las mismas.
[0117] En una realización, un gen mcr-4 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la misma, adecuadamente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con la misma.
[0118] En una realización, un gen mcr-5 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16, o una secuencia que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la misma, adecuadamente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con la misma.
[0119] Una bacteria puede ser resistente a un antibiótico polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosomas. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por cromosomas comprende una mutación en uno o más genes seleccionados entre pmrA, pmrB, pmrC, pmrD, pmrE, pmrR, phoP, phoQ, mgrB, arnA, arnB, arnC, arnD, arnE, arnF, arnF, arnT, cptA, eptB y combinaciones de los mismos. Dichas mutaciones pueden resultar, directa o indirectamente, en la modificación del lípido A con 4-amino-L-arabinosa y/o fosfoetanolamina. Una "mutación" abarca cualquier alteración de la secuencia de nucleótidos de un gen, una mutación puntual, una mutación de sentido alterado o erróneo (“missense”), una mutación sin sentido, una inserción, una deleción, una duplicación, una mutación por desplazamiento del marco o una expansión repetida.
[0120] En una realización, una muestra de ensayo se mezcla con una solución matriz antes de someter dicha muestra de ensayo al análisis de espectrometría de masas. Una solución matriz facilita la espectrometría de masas de una muestra de ensayo, adecuadamente en la que la espectrometría de masas es espectrometría de masas MALDI-TOF.
[0121] En una realización, una solución matriz como se describe en el presente documento permite la extracción selectiva, co-cristalización e ionización de lípido A nativo y/o lípido A modificado como una parte integral de una membrana bacteriana. En una realización, una solución matriz como se describe en el presente documento permite la identificación de un pico asignado al lípido A nativo y/o al lípido A modificado (por ejemplo, al permitir la extracción selectiva, co-cristalización e ionización del lípido A nativo y/o lípido A modificado) como parte integral de una membrana bacteriana.
[0122] Así, en un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición preparada para su uso en la espectrometría de masas, comprendiendo dicha composición una membrana bacteriana o fragmento de la misma y una solución matriz.
[0123] En una realización, una solución matriz comprende ácido 2,5-dihidroxibenzoico suspendido en un disolvente orgánico. En una realización, una solución matriz comprende ácido 2,5-dihidroxibenzoico suspendido en un disolvente orgánico a una concentración de aproximadamente 1 a 100 mg/ml. En una realización, una solución matriz comprende ácido 2,5-dihidroxibenzoico suspendido en un disolvente orgánico a una concentración de aproximadamente 7 a 13 mg/ml. Preferiblemente, el ácido 2,5-dihidroxibenzoico se suspende en un disolvente orgánico a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml.
[0124] En una realización, una solución matriz comprende uno o más seleccionados de norharmane (NRM), 3-hidroximetil-p-carbolina, 3-metil-a-carbolina, 2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-carbolina-3-carboxilato de etilo, p-carbolina-3-carboxilato de etilo, ácido 1-metilindol-2-carboxílico, metyoduro de norharman, N-metilamida del ácido p-carbolina-3-carboxílico, clorhidrato de harmalina deshidratado, ácido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolin-1-carboxílico, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido [3,4-b] indol, harmane, harmina, harmalina o una combinación de los mismos suspendidos en un disolvente orgánico. En una realización, una solución matriz comprende uno o más seleccionados de norharmane (NRM), 3-hidroximetil-p-carbolina, 3-metil-a-carbolina, 2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-carbolina-3-carboxilato de etilo, pcarbolina-3-carboxilato de etilo, ácido 1-metilindol-2-carboxílico, metyoduro de norharman, N-metilamida del ácido pcarbolin-3-carboxílico, clorhidrato de harmalina deshidratado, ácido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolin-1-carboxílico, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido [3 ,4-b] indol, harmane, harmina, harmalina o una combinación de los mismos suspendidos en un disolvente orgánico a una concentración de 1 a 100 mg/ml. En una realización, una solución matriz comprende uno o más seleccionados de norharmane (NRM), 3-hidroximetil-p-carbolina, 3-metil-a-carbolina, 2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-carbolina -3-carboxilato de etilo, p-carbolina-3-carboxilato de etilo, ácido 1-metilindol-2-carboxílico, metyoduro de norharman, N-metilamida del ácido p-carbolina-3-carboxílico, clorhidrato de harmalina deshidratado, ácido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-1-carboxílico, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido [3,4-b] indol, harmane, harmina, harmalina o una combinación de las mismas suspendida en un disolvente orgánico a una concentración de 7 a 13 mg/ml. En una realización preferible, una solución matriz comprende uno o más seleccionados de norharmane (NRM), 3-hidroximetilp-carbolina, 3-metil-a-carbolina, 2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-carbolina-3-carboxilato de etilo, p-carbolina-3-carboxilato de etilo, ácido 1-metilindol-2-carboxílico, metyoduro de norharman, N-metilamida del ácido p-carbolina-3-carboxílico, clorhidrato de harmalina deshidratado, ácido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-1-carboxílico, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido [3,4-b] indol, harmane, harmina, harmalina o una combinación de los mismos suspendidos en un disolvente orgánico en una concentración de 10 mg/ml.
[0125] En una realización, una solución matriz comprende norharmane (NRM) suspendido en un disolvente orgánico. En una realización, una solución matriz comprende norharmane suspendido en un disolvente orgánico a una concentración de 1 a 100 mg/ml. En una realización, una solución matriz comprende norharmane suspendido en un disolvente orgánico a una concentración de 7 a 13 mg/ml. En una realización preferible, una solución matriz comprende norharmane suspendido en un disolvente orgánico a una concentración de 10 mg/ml.
[0126] En una realización, un disolvente orgánico comprende cloroformo y metanol en una relación de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 12:1, o de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 10:1. De forma adecuada, un disolvente orgánico comprende cloroformo y metanol en una relación de aproximadamente 9:1 v/v.
[0127] En una realización, el disolvente orgánico comprende uno o más de cloroformo, metanol, diclorometano, éter, dietil éter, éter de petróleo, isopropanol, butanol, hexano o una combinación de los mismos.
[0128] En una realización, el disolvente orgánico comprende uno o más de ácido acético, acetona, acetonitrilo, benceno, 1-butanol, 2-butanol, 2-butanona, alcohol t-butílico, tetracloruro de carbono, clorobenceno, cloroformo, ciclohexano, 1,2-dicloroetano, dietilenglicol, éter dietílico, diglima (éter dimetílico de dietilenglicol), 1,2-dimetoxietano (glima, DME), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), 1,4-dioxano, etanol, acetato de etilo, etilenglicol, glicerina, heptano, hexametilfosforamida (HMPA), hexametilfósforo triamida (HMPT), hexano, metanol, metil t-butil éter (MTBE), cloruro de metileno, N-metil-2-pirrolidinona (NMP), pentano, éter de petróleo (ligroína), 1-propanol, 2-propanol, piridina, tetrahidrofurano (THF), tolueno, trietilamina, agua, agua (pesada), o-xileno, m-xileno, p-xileno.
[0129] En una realización, la relación de la muestra de ensayo con respecto a la solución de la matriz es de entre aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 2:1 v/v, o de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 0,7:1 v/v. De manera adecuada, la relación entre la muestra de ensayo y la solución matriz es de aproximadamente 0,66:1 v/v.
[0130] En una realización, una muestra de ensayo comprende menos de aproximadamente 1010 células bacterianas. De manera adecuada, una muestra de ensayo puede comprender menos de aproximadamente 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102 o 101 células bacterianas.
[0131] En una realización, una muestra de ensayo comprende entre aproximadamente 101 y aproximadamente 1010 células bacterianas. De manera adecuada, una muestra de ensayo comprende entre aproximadamente 102y aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 106, o de aproximadamente 104 a aproximadamente 105 células bacterianas.
[0132] En una realización, el antibiótico de polipéptido catiónico cíclico es un antibiótico de polimixina. De forma adecuada, un antibiótico de polimixina puede ser uno o más de colistina (polimixina E), polimixina B, matacina (polimixina M) o una sal de las mismas.
[0133] Preferiblemente, un antibiótico de polimixina puede ser colistina (polimixina E) o una sal de la misma. Una sal de colistina (polimixina E) puede ser sulfato de colistina o colistimetato de sodio.
[0134] En una realización una bacteria tal como se usa en el presente documento puede ser una o más seleccionadas de los siguientes géneros: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Raoultella o combinaciones de los mismos.
[0135] Convenientemente, una bacteria puede ser una o más seleccionadas de entre las siguientes especies: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella entérica, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter youngae o combinaciones de los mismos.
[0136] Cualquier cepa de tales géneros o especies puede ser adecuada para su uso en un procedimiento de la invención.
[0137] En una realización, una bacteria está inactivada por calor. Una bacteria puede inactivarse por calor usando cualquier técnica conocida en el sector, por ejemplo usando un baño seco o un baño de agua. Cuando se usa un baño seco o un baño de agua, una bacteria puede inactivarse por calor calentando entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 minutos a 70 a 90 °C (adecuadamente durante 30 minutos a 80 °C). En algunas realizaciones, una bacteria puede inactivarse por calor calentando durante al menos aproximadamente 45 minutos (preferiblemente al menos 1 hora) hasta al menos aproximadamente 80°C (preferiblemente al menos 90°C).
[0138] En algunas realizaciones, la bacteria no está inactivada por calor.
[0139] En una realización, un procedimiento de la presente invención comprende la etapa de registrar los datos obtenidos en la etapa (a) en un soporte de datos adecuado. Por tanto, la presente invención también proporciona un soporte de datos que comprende los datos obtenidos en la etapa (a) de un procedimiento del presente documento.
[0140] En un aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de cribado para identificar un inhibidor de la resistencia a los antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, que comprende:
a. incubar una muestra que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico con un inhibidor candidato;
b. someter dicha muestra a análisis de espectrometría de masas según un procedimiento de la presente invención y generar una salida de espectro de masas; y
c. identificar la presencia o ausencia de dicho primer pico definido en la salida del espectro de masas;
en el que la presencia de dicho primer pico definido indica que dicho inhibidor candidato no es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica que dicho inhibidor candidato es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a los antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria.
[0141] En un aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de cribado para identificar un inhibidor de la resistencia a los antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, que comprende:
a. incubar una muestra que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico con un inhibidor candidato;
b. someter dicha muestra a análisis de espectrometría de masas según un procedimiento de la presente invención y generar una salida de espectro de masas; y
c. identificar la presencia o ausencia de dicho primer pico definido y/o dicho tercer pico definido en la salida del espectro de masas;
en el que la presencia de dicho primer pico definido y/o dicho tercer pico definido indica que dicho inhibidor candidato no es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido y/o dicho tercer pico definido indica que dicho inhibidor candidato es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria.
[0142] En un aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de cribado para identificar un inhibidor de la resistencia a los antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, que comprende:
a. incubar una muestra que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico con un inhibidor candidato;
b. someter dicha muestra a análisis de espectrometría de masas según un procedimiento de la presente invención y generar una salida del espectro de masas; y
c. identificar la presencia o ausencia de dicho primer pico definido, dicho tercer pico definido, dicho cuarto pico definido y/o dicho quinto pico definido en la salida del espectro de masas;
en el que la presencia de dicho primer pico definido, dicho tercer pico definido, dicho cuarto pico definido y/o dicho quinto pico definido indica que dicho inhibidor candidato no es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos del polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido y/o dicho tercer pico definido indica que dicho inhibidor candidato es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria.
[0143] Dicho procedimiento o procedimientos de cribado abarcan el uso correspondiente de espectrometría de masas para la identificación de un inhibidor de la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria.
[0144] En una realización, en el que dicho procedimiento de cribado falla para identificar un inhibidor de la resistencia a los antibióticos de polipéptido catiónico cíclico (por ejemplo, polimixina) en una bacteria, las etapas a. - c. se repiten con un inhibidor candidato diferente. Esta secuencia puede repetirse iterativamente hasta que se identifique la ausencia del primer pico definido, lo que indica que el inhibidor candidato es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos del polipéptido catiónico cíclico en una bacteria. Una vez que se identifica la ausencia del primer pico definido, dicho inhibidor candidato puede usarse como inhibidor de la resistencia a antibióticos del polipéptido catiónico cíclico en una bacteria.
[0145] En una realización, un procedimiento de cribado para identificar un inhibidor de la resistencia a los antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria comprende incubar una muestra que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido cíclico catiónico con un inhibidor candidato y, posteriormente, probar dicha bacteria para la susceptibilidad a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, en el que el análisis de espectrometría de masas de acuerdo con un procedimiento de la presente invención se usa para confirmar si una sustancia es capaz o no es capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria mediante la identificación de la presencia o ausencia de dicho primer pico definido y/o dicho tercer pico definido en una salida de espectro de masas.
[0146] En una realización, una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico puede aislarse de una muestra clínica. En una realización alternativa, la bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico puede cultivarse en condiciones de laboratorio.
[0147] Un inhibidor candidato puede ser capaz de inhibir directa o indirectamente la modificación de lípido A con 4-amino-L-arabinosa y/o fosfoetanolamina.
[0148] En una realización, un inhibidor candidato se selecciona de un inhibidor de molécula pequeña, un péptido, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo.
[0149] En una realización, un inhibidor candidato es una sustancia química o farmacéutica conocido seleccionada de una biblioteca de tales inhibidores candidatos.
[0150] En una realización, una muestra que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico con un inhibidor candidato es una muestra de un animal no humano o humano. Un animal no humano puede ser, por ejemplo, un primate no humano, caballo, vaca, cabra, gato, perro, oveja, roedor (por ejemplo, ratón, rata o conejillo de Indias), pez o anfibio (por ejemplo, Xenopus).
[0151] En un aspecto, se proporciona el uso de una muestra de ensayo en el análisis de espectrometría de masas para la detección de la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico (por ejemplo, en dicha muestra de ensayo).
[0152] Los procedimientos para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico son conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, cuando se evalúa la identidad de la secuencia de ácido nucleico, una secuencia que tiene un número definido de nucleótidos contiguos puede alinearse con una secuencia de ácido nucleico (que tiene el mismo número de nucleótidos contiguos) de la porción correspondiente de una secuencia de ácido nucleico de la presente divulgación. Las herramientas conocidas en la técnica para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico incluyen Nucleotide BLAST.
[0153] Puede usarse cualquiera de una variedad de procedimientos de alineación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluidos, sin limitación, procedimientos globales, procedimientos locales y procedimientos híbridos, tales como, por ejemplo, procedimientos de aproximación por segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica. Los procedimientos globales alinean las secuencias desde el principio hasta el final de la molécula y determinan la mejor alineación sumando puntuaciones de pares de residuos individuales e imponiendo penalizaciones por huecos. Los procedimientos no limitantes incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W, ver, por ejemplo, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, ver, por ejemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Los procedimientos locales alinean secuencias identificando uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los procedimientos no limitativos incluyen, por ejemplo, Match-box, ver, por ejemplo, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, por ejemplo, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208­ 214 (1993); Align-M, véase, por ejemplo, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).
[0154] Por lo tanto, la identidad de secuencia en porcentaje se determina mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineación utilizando una penalización de apertura de hueco de 10, una penalización de extensión de hueco de 1 y la matriz de puntuación "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (ibid.), tal como se muestra a continuación (los aminoácidos se indican mediante los códigos estándar de una letra).
PUNTUACIONES DE ALINEACIÓN PARA DETERMINAR LA IDENTIDAD DE LA SECUENCIA
[0155]
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R-1 5
N -2 0 6
D-2-2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q-1 1 0 0 - 35
E -1 0 0 2-4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2-1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3-3-1 0 0-3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 10-1 0 0 0-1 -2-2 0-1 -2-1 4
T 0 -10-1-1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 - 2 - 115
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1-4-3-211
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0-3 -3 -3 -1 -2 -2 -3-3 3 1 -2 1 -1 -2 -20-3-1 4
[0156] El porcentaje de identidad se calcula entonces como:
Número total de emparejamientos idénticos
-------------------------------------------------------------------------------x 100
[longitud de la secuencia más larga más el número de
huecos introducidos en la secuencia más larga a efectos
de alinear las dos secuencias]
[0157] Los polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativos (véase más adelante) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad del polipéptido; pequeñas deleciones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad.
SUSTITUCIONES DE AMINOÁCIDOS CONSERVATIVOS
Básico: arginina
lisina
histidina
Ácido: ácido glutámico
ácido aspártico
Polar: glutamina
asparagina
Hidrófobo: leucina
isoleucina
valina
Aromático: fenilalanina
triptófano
tirosina
Pequeño: glicina
alanina
serina
treonina
metionina
[0159] Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina) pueden ser sustituidos por residuos de aminoácidos de los polipéptidos descritos en este documento. Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden sustituirse por residuos de aminoácidos polipeptídicos. Los polipéptidos descritos en el presente documento también pueden comprender residuos de aminoácidos de origen no natural.
[0160] Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxi-prolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenil-alanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen varios procedimientos en la técnica para incorporar residuos de aminoácidos de origen no natural en proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro, en el que se suprimen mutaciones sin sentido utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Se conocen en la técnica procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). En un segundo procedimiento, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). Dentro de un tercer procedimiento, las células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que deba reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del aminoácido o aminoácidos no naturales deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido de origen no natural se incorpora al polipéptido en lugar de su homólogo natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Los residuos de aminoácidos de origen natural se pueden convertir en especies de origen no natural mediante modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con mutagénesis dirigida al sitio para ampliar aún más la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
[0161] Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos de origen no natural y aminoácidos no naturales puede ser sustituidos por residuos de aminoácidos de los polipéptidos descritos en este documento.
[0162] Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos descritos en el presente documento pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de rastreo de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Los sitios de interacción biológica también pueden determinarse mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas, tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos del posible sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEb S Lett. 309: 59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden inferirse del análisis de homologías con componentes relacionados (por ejemplo, la translocación o componentes de proteasa) de los polipéptidos descritos en el presente documento.
[0163] Las sustituciones de múltiples aminoácidos pueden realizarse y probarse usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc Natl Acad Sci. USA 86: 2152 - 6, 1989). Brevemente, estos autores describen procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar el polipéptido funcional y a continuación secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permitidas en cada posición. Otros procedimientos que se pueden usar incluyen la expresión en fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Patente de EE.UU. No. 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
[0164] Las sustituciones de múltiples aminoácidos pueden realizarse y probarse usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc Natl Acad Sci. USA 86: 2152 - 6, 1989). Brevemente, estos autores describen procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar el polipéptido funcional y a continuación secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permitidas en cada posición. Otros procedimientos que se pueden usar incluyen la expresión en fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Patente de EE.UU. No. 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
[0165] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta divulgación.
[0166] Esta divulgación no está limitada por los procedimientos y materiales de ejemplo descritos en el presente documento, y cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede usarse en la práctica o ensayo de realizaciones de esta divulgación. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
[0167] Los encabezamientos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la presente divulgación.
[0168] Otras definiciones de términos pueden aparecer en toda la memoria. Antes de que las realizaciones de ejemplo se describan con más detalle, debe entenderse que esta divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas y, como tal, puede variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgación estará definido únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
[0169] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido dentro de esta divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el que alguno, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también está comprendido dentro de esta divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de estos límies incluidos también están incluidos en esta divulgación.
[0170] Hay que señalar que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una bacteria" incluye una pluralidad de dicha bacteria y la referencia a "la bacteria" incluye la referencia a una o más células bacterianas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
[0171] Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí mencionado debe interpretarse como una admisión de que tales publicaciones constituyen la técnica anterior a las reivindicaciones adjuntas.
[0172] La presente invención se describirá ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los siguientes Ejemplos.
FIGURAS
[0173] Las realizaciones de la presente invención se describirán ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras que se acompañan, en las cuales:
La figura 1 muestra un esquema que representa el análisis de lípidos en bacterias intactas mediante espectrometría de masas. La muestra de ensayo se coloca (11) en la diana MALDI (10) y se cubre con una solución matriz adecuada (12). La espectrometría de masas en modo de iones negativos o positivos se lleva a cabo utilizando cualquier máquina de espectrometría de masas adecuada (12) (por ejemplo, 4800 MALDI TOF/TOF Analyzer de Applied Biosystems). La EM puede implicar el uso de una matriz de disolventes atípicos (disolventes orgánicos, CHCh , MeOH, PE, DE). MS = espectrometría de masas; CHCh = cloro; MeOH = metanol; PE = éter de petróleo; DE = éter dietílico.
La Figura 2 (A) muestra estructuras típicas de: lípido A nativo (21) que tiene un tamaño de 1976 m/z; Lípido A modificado con fosfoetanolamina (pETN) en el fosfato 1' con pérdida concomitante del fosfato 4' (22) que tiene un tamaño de 1821 m/z; (B) muestra el lípido A modificado con pETN que tiene un tamaño de 1919 m/z (23); y Lípido A modificado con 4-amino-L-arabinosa (L-Ara4N) y pETN. Los números indican el número de átomos de carbono en cada cadena de ácido graso.
La Figura 3 muestra un esquema de modificaciones del lípido A relacionadas con la resistencia a antibióticos de polipéptido cíclico (por ejemplo, polimixina) en una bacteria de la familia Enterobacteriaceae. La modificación del lípido A (31) con fosfoetanolamina (pETN) se produce en bacterias que comprenden un plásmido que tiene un gen de resistencia a colistina movilizado (MCR) o similar a mcr (32). La modificación del lípido A con 4-amino-L-arabinosa (L-Ara4N) y/o fosfoetanolamina (33) se produce en bacterias que comprenden ciertas alteraciones en genes (por ejemplo, pmrA, pmrB, pmrC, pmrD, pmrE, pmrR, phoP, phoQ , mgrB, arnA, arnB, arnC, arnD, arnE, arnF, arnF, arnT, cptA, eptB).
La Figura 4 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados por un procedimiento de la presente invención, que demuestran la discriminación entre Escherichia coli (A ) susceptible a polimixina, E. coli (B) resistente a polimixina codificada por cromosomas y E. coli resistente a polimixina codificada por plásmido (por ejemplo, mcr-1 positivo) (C). Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1796,2 se asignó al lípido A nativo, el pico en m/z 1919,2 se asignó al lípido A modificado por fosfoetanolamina, y el pico en 1821,2 se asignó al lípido A modificado por fosfoetanolamina en la posición 1' con pérdida concomitante del fosfato 4'.
La Figura 5 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados por un procedimiento de la presente invención, que demuestran la discriminación entre Escherichia coli susceptible a polimixina (por ejemplo, E. coli J53) (panel superior) y E. coli resistente a polimixina codificada por plásmido (por ejemplo, mcr-1 positivo) (por ejemplo, E. coli R4) (panel inferior). Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1796,2 (50) se asignó al lípido A nativo (por ejemplo, un segundo pico definido), el pico en m/z 1919,2 (51) se asignó al lípido A modificado por fosfoetanolamina (por ejemplo, un primer pico definido).
La Figura 6 muestra la distribución de las Relaciones de Resistencia a la Polimixina (PPR) para las 79 cepas de E. coli probadas (ver Figura 18). Se realizaron tres experimentos independientes para cada cepa. Los valores de corte para la discriminación entre la resistencia a la polimixina y la susceptibilidad a la polimixina (0,1) y para la discriminación entre la resistencia codificada por cromosomas y MCR a la polimixina (0,5) se indican mediante líneas punteadas grises y negras, respectivamente. PRR e. coli = (11919 + I 1821 )/I 1796. I = Intensidad (por ejemplo, intensidad de pico en un espectro de masas).
La Figura 7 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados por un procedimiento de la presente invención, que demuestran la discriminación entre Klebsiella pneumoniae susceptible a polimixina (panel superior) y K. pneumoniae resistente a polimixina codificada por plásmido (por ejemplo mcr-1 positivo) (panel inferior). Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1796,2 ym/z 1840 (71) se asigna al Lípido A nativo, el pico en m/z 1919,2 (72) se asigna al Lípido A modificado por fosfoetanolamina.
La Figura 8 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados por un procedimiento de la presente invención, que demuestran la discriminación entre Klebsiella spp. susceptible a polimixina. (primer panel), Klebsiella spp resistente a polimixina codificada por cromosoma (segundo panel), Klebsiella spp resistente a polimixina codificada por plásmido (por ejemplo mcr-1 positivo) (tercer panel) y Klebsiella spp. que son resistentes a polimixinas codificadas por plásmidos y cromosomas (panel inferior). Para cada espectro de masas, los picos en m/z 1824, m/z 1840, m/z 2062 y m/z 2078 se asignaron al lípido A nativo, los picos en m/z 1971 y m/z 2209 se asignaron al lípido A modificado por L-Ara4N y los picos m/z 1963 y m/z 2201 se asignaron al lípido A modificado por pETN.
La Figura 9 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados con las cepas S1 y R1 de A. baumannii. Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1910,3 (90) se asigna al lípido A nativo, el pico en m/z 2033,3 (91) se asigna al lípido A modificado por fosfoetanolamina. El panel superior representa los espectros de masas obtenidos de A. baumannii S1 susceptible a polimixina. El panel inferior representa los espectros de masas obtenidos de A. baumannii R1 resistente a polimixina.
La Figura 10 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados con las cepas de E. coli S1 J53, R4 J53, R4 y R1. Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1796,2 se asigna al lípido A nativo (por ejemplo, un segundo pico definido), el pico en m/z 1919,2 se asigna al lípido A modificado por fosfoetanolamina (por ejemplo, un primer pico definido). El pico en m/z 1821 (+ 25 m/z del lípido A nativo) (por ejemplo, un tercer pico definido) es típico de un espectro de masas generado mediante un procedimiento de la invención con bacterias Enterobacteriaceae resistentes a polimixinas codificadas por plásmido (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticun o Citrobacter youngae). El panel superior representa los espectros de masas obtenidos de E. coli J53 susceptible a polimixina. El panel del medio representa los espectros de masas obtenidos de E. coli R4 resistente a polimixina codificada por plásmido. El panel inferior representa los espectros de masas obtenidos de E. coli R1 resistente a polimixina.
La Figura 11 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados con las cepas de K. pneumoniae S32, R46, R42. Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1796,2 se asigna al lípido A nativo (por ejemplo, un segundo pico definido), el pico en m/z 1919,2 se asigna al lípido A modificado por fosfoetanolamina (por ejemplo, un primer pico definido). El pico en m/z 1821 (+ 25 m/z del lípido A nativo) (por ejemplo, un tercer pico definido) es típico de un espectro de masas generado a través de un procedimiento de la invención con bacterias Enterobacteriaceae resistentes a la polimixina codificadas por plásmidos (por ejemplo, Escherichia co li, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticun o Citrobacter youngae). El panel superior representa los espectros de masas obtenidos de K. pneumoniae S32 susceptible a la polimixina. El panel del medio representa los espectros de masas obtenidos de K. pneumoniae R46 resistente a polimixina codificada por plásmido. El panel inferior representa los espectros de masas obtenidos de K. pneumoniae KpR42 resistente a polimixina codificada por cromosomas.
La Figura 12 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados por un procedimiento de la presente invención, que demuestran la discriminación entre Salmoella spp. susceptible a polimixina. (panel superior), Salmonella spp. resistente a la polimixina codificada por cromosomas (panel central) y Salmonella spp resistente a polimixina codificada por plásmido (panel inferior). Para cada espectro de masas, el pico en m/z 1796 se asignó al lípido A nativo, los picos en m/z 1919 y m/z 2034 se asignaron al lípido A modificado por fosfoetanolamina, el pico en m/z se asignó a lípido A modificado con L-Ara4N, y los picos en 1919 y 2157 se asignaron al lípido A modificado por fosfoetanolamina.
La Figura 13 muestra un gráfico de relaciones de ejemplo de lípido A modificado con fosfoetanolamina con respecto a lípido A nativo, obtenido para E. coli susceptible a polimixina (n = 44) y resistente a polimixina (n = 8), calculado de la siguiente manera: intensidad del pico del lípido A modificado por fosfoetanolamina/intensidad del pico de lípido A nativo, por ejemplo Intensidad del pico m/z 1919/Intensidad del pico m/z 1796. El diagrama de caja representa los datos por sus cuartiles.
La Figura 14 muestra ejemplos de espectros de masas MALDI generados por un procedimiento de la presente invención de E. coli cultivada en varios medios clínicamente relevantes. (A ) muestra espectros de masas para bacterias cultivadas en medio Mueller-Hinton; se muestran espectros de masas representativos para bacterias susceptibles a la polimixina (panel superior) que tienen PRR e coli = 0, bacterias resistentes a la polimixina codificadas por plásmido (panel central) que tienen PRRe. coli = 3,83, y bacterias resistentes a polimixina codificadas por cromosomas (panel inferior) que tienen PRR e. coli = 0,24. (B) muestra espectros de masas para bacterias cultivadas en medio de caldo de lisogenia; se muestran espectros de masas representativos para bacterias susceptibles a la polimixina (panel superior) que tienen PRR e coli = 0, bacterias resistentes a la polimixina codificadas por plásmidos (panel central) que tienen PRR e. con = 2,89 y bacterias resistentes a la polimixina codificadas por cromosomas (panel inferior) que tiene PRR e. coli = 0,35. (C) muestra espectros de masas para bacterias cultivadas en medio Mueller-Hinton Polimixina B (1 mg/ml); se muestran espectros de masas representativos para bacterias resistentes a polimixina codificadas por plásmido (panel superior) que tienen PRR-e. con = 4,58, y bacterias resistentes a polimixina codificadas por cromosomas (panel inferior) que tienen PRR e. coli = 0,37. (D) muestra espectros de masas para bacterias cultivadas en medio Mueller-Hinton Polimixina B (2 mg/ml); se muestran espectros de masas representativos para bacterias resistentes a polimixina codificadas por plásmido (panel superior) que tienen PRR e. coli = 5,69, y bacterias resistentes a polimixina codificadas por cromosomas (panel inferior) que tienen PRR e. con = 0,21. Las cepas de E. coli utilizadas fueron: J53 (susceptible), J53 mcr-1 (resistente codificada por plásmido) y CNR20160235 (resistente codificada por cromosoma).
La Figura 15 Resumen de los perfiles de picos de interés (por ejemplo, de interés particular) observados en Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp (por ejemplo, Salmonella entérica) y Acinetobacterbaumannii. La Figura 16 muestra el alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de variantes de MCR.
La Figura 17 muestra la divergencia de la variante MCR de diferentes familias.
La Figura 18 muestra las características y los resultados de la prueba de MALDIxin para las cepas de E. coli. a Las cepas de laboratorio están subrayadas, todas las demás cepas son aislados clínicos. b Para mecanismos desconocidos, la ausencia de mutación en mgrB, pmrA, pmrB, phoP y phoQ se verificó mediante PCR y secuenciación, y la cepa fue negativa para genes similares a m cr.c Las carbapenemasas se muestran en negrita y las p-lactamasas de espectro extendido están subrayadas.d PRR son las siglas de Relación de resistencia a polimixina. eLa E. coli R12 F5 productora de MCR-2 ha sido descrita previamente por Xavier BB et al. (Euro surveillance 2016; 21 (27)). * Plásmidos naturales, el plásmido portador de mcr-5 natural ha sido descrito previamente por Borowiak M et al. (Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2017), 72 (12), 3317-3324).** gen funcional similar a mcr clonado en pDM1, un derivado de Tet R inducible por IPTG (concentración final 0,5 mM) de pACYC184. Los genes mcr-1, mcr-2 y mcr-5 se clonaron en los sitios Sacl/Xmal del vector, mientras que para mcr-3, se usaron los sitios Ndel/Xmal.
La Figura 19 muestra los resultados de un procedimiento de la presente invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin) en colonias bacterianas después de 24 horas, 48 horas, una semana y dos semanas.a Las cepas de laboratorio están subrayadas, todas las demás cepas son aislados clínicos.b Para mecanismos desconocidos, la ausencia de mutación en mgrB, pmrA, pmrB, phoP y phoQ se ha verificado mediante PCR y secuenciación, y la cepa fue negativa para genes similares a mcr. PRR son las siglas de Relación de resistencia a polimixina. * plásmido natural.
EJEMPLOS
Materiales y procedimientos
Cepas bacterianas
[0174] Las siguientes cepas bacterianas, representativas de los aislados clínicos, fueron utilizadas en un procedimiento de la presente invención: E. coli S1 J53, E. coli R4 J53, E. coli R1, K. pneumoniae R46, K. pneumoniae R42, A. baumannii S1 y A. baumannii R1.
[0175] Adicionalmente, se utilizó una colección de 79 cepas de E. coli, incluyendo 33 aislados resistentes a polimixina, de los cuales 29 fueron productores de MCR (18 MCR-1, dos MCR-1.5, tres MCR-2, dos MCR-3 y cuatro m Cr-5). Las 46 cepas de E. coli susceptibles a la polimixina fueron de varios fenotipos, desde el tipo salvaje hasta los productores de carbapenemasas (Figura 18). La prueba MALDIxin se evaluó prospectivamente utilizando una colección de 78 cepas de E. coli productoras de carbapenemasas recibidas durante octubre y noviembre de 2016, del Centro Nacional de Referencia (NRC) francés para la Resistencia a Antimicrobianos (Tabla 2).
[0176] Las cepas bacterianas resistentes a polimixina codificadas por plásmido comprenden un plásmido que tiene un gen similar a mcr, tal como gen mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, mcr-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4 o mcr-5 gen, o una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. La adición de fosfoetanolamina al lípido A en tales cepas es un plásmido mediado a través del gen similar al mcr, que confiere resistencia codificada por plásmido a antibióticos de polimixina (por ejemplo, colistina) en aislados de humanos y animales.
[0177] Las cepas bacterianas resistentes a polimixina codificada por el cromosoma comprenden una mutación y/o truncamiento en cualquiera de los genes pmrA, pmrB, pmrC, pmrD, pmrE, pmrR, phoP, phoQ, mgrB, arnA, arnB, arnC, arnD, arnE, arnF, arnF, arnT, cptA, eptB. Por ejemplo, las mutaciones (“missense”) en pmrA o pmrB pueden causar la activación constitutiva del sistema PmrA/PmrB, lo que conduce a la regulación positiva de pmrC y el operón arnBCADTEF y, por lo tanto, a la síntesis y adición de fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa al lípido A. La alteración (por ejemplo, mutación o truncamiento) de mgrB evita la retroalimentación negativa sobre el sistema regulador PhoP/PhoQ, lo que lleva a la adición de fosfoetanolamina y 4-amino-L-arabinosa al lípido A. La alteración de mgrB puede deberse a la inactivación por inserción (por ejemplo, con ISKpn25).
Pruebas de susceptibilidad
[0178] Las concentraciones mínimas inhibidoras (MIC) se determinaron mediante DMO de acuerdo con las directrices del subcomité conjunto CLSI y EUCAST. Los resultados se interpretaron utilizando el punto de corte de EUCAST actualizado en 2017.
Procedimientos
[0179] Se recogió una punta de un microlitro (equivalente a una o menos de una colonia equivalente a de 104 a 107 células bacterianas) de bacterias, recuperadas de colonias cultivadas en cualquier medio de cultivo de bacterias o de cualquier medio líquido de enriquecimiento (incluyendo cultivos de sangre u otras muestras clínicas con suficiente cantidad de bacterias). Esta colonia se transfirió a un tubo Eppendorf (0,5 a 2 ml) que contenía 100 microlitros de agua (destilada o doblemente destilada). El medio de cultivo fue agar de caldo Luria; o se pueden usar otros medios no selectivos, tales como agar sangre o agar sangre chocolate, medios selectivos gram-negativos, tales como medios Drigalski o MacConkey, y varios medios cromogénicos. Las cepas se pueden cultivar en condiciones aeróbicas en medio de agar de caldo Luria a 37 °C durante la noche.
[0180] A continuación, las bacterias se inactivaron por calor (etapa facultativa) usando un baño seco o un baño de agua durante 30 min a 80°C, o alternativamente durante 1 h a 90°C.
[0181] Las bacterias se sedimentaron y se lavaron al menos una vez con 200 |il de agua doblemente destilada para eliminar el exceso de sales que resultan del medio de cultivo. No lavar el sedimento bacteriano para eliminar las sales restantes puede dar lugar a un fondo no deseado en el espectro final de MALDI-TOF, entorpeciendo o eliminando la interpretabilidad de los resultados. Alternativamente, las bacterias pueden lavarse a través de una solución disponible comercialmente (por ejemplo, columnas de absorción de sal). Las bacterias pueden lavarse tres veces con 0,5 ml de agua doblemente destilada y centrifugarse a 9000 xg durante 5 min.
[0182] Las bacterias lavadas se volvieron a suspender en 50 |il de agua doblemente destilada para proporcionar una suspensión bacteriana a una concentración final de aproximadamente 104 a 107 bacterias por |il y se cargaron 0,4 |il en la diana de MALDI-TOF. Tales dianas clásicas de MALDI-TOF tal como se usan en un laboratorio de microbiología clínica habitual son adecuadas para usar con la presente invención.
[0183] Se mezclaron 0,6 |jl (o 0,8 |jl) de una matriz atípica diseñada con 0,4 |jl de suspensión bacteriana. De forma adecuada, la matriz atípica comprende ácido 2,5-dihidroxibenzoico a una concentración final de 10 mg/ml suspendido en disolventes orgánicos, normalmente Cloroformo/Metanol 9:1 v/v. Los disolventes orgánicos adicionales adecuados para su uso con la invención incluyen cloroformo, diclorometano, metanol, éter, éter dietílico, éter de petróleo, isopropanol, butanol, hexano. La Tabla 1 proporciona ejemplos de disolventes adecuados para su uso con la presente invención. La muestra y la solución matriz se depositaron sobre la diana (por ejemplo, la diana de MALDI), se mezclaron con una micropipeta y se secaron suavemente bajo una corriente de aire. Después de la optimización, este sistema disolvente y la relación entre el sistema disolvente y la muestra permiten la ionización selectiva del lípido A (por ejemplo, en bacterias intactas).
[0184] Alternativamente, se recogen dos colonias de células bacterianas cultivadas en cualquier medio de cultivo de bacterias o de cualquier medio líquido de enriquecimiento (incluidos cultivos de sangre u otras muestras clínicas con suficiente cantidad de bacterias) y se transfieren a un tubo Eppendorf (0,5 a 2 ml). Esto puede ir seguido de la suspensión de las colonias en agua (destilada o doblemente destilada) seguido de sedimentación y lavado de las bacterias al menos una vez (por ejemplo, 2-5 veces) con agua destilada o doblemente destilada, por ejemplo, para eliminar el exceso de sales. Las bacterias se pueden resuspender en ácido acético al 2% en agua (por ejemplo, 200 |j| de ácido acético al 2% en agua). La suspensión bacteriana se puede calentar a continuación mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, usando un bloque de calor, preferiblemente durante 2 horas a 100 °C. Esto puede ir seguido de la sedimentación de las bacterias (por ejemplo, centrifugando durante 5 segundos a 15.000 g) y la resuspensión de las bacterias en agua destilada o doblemente destilada (por ejemplo, 50 |il de ddH2O). Se puede mezclar la matriz de Norharmane (por ejemplo, N6252 Sigma) o cualquiera de sus derivados (por ejemplo, 3-hidroximetil-p-carbolina; 3-metil-a-carbolina; 2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-carbolina-3-carboxilato de etilo ; p-carbolina-3-carboxilato de etilo; ácido 1-metilindol-2-carboxílico; metyoduro de norharman; N-metilamida del ácido p-carbolina-3-carboxílico; clorhidrato de harmalina deshidratado; ácido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolin-1-carboxílico; 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido [3,4-b] indol; Harmane; Harmine; Harmaline) con la suspensión bacteriana. De forma adecuada, se pueden mezclar 0,6 j l de dicha matriz con 0,4 j l de suspensión bacteriana. De forma adecuada, la matriz de Norharmane o cualquiera de sus derivados (como se indica anteriormente) está presente a una concentración final de 10 mg/ml suspendida en disolventes orgánicos, normalmente Cloroformo/Metanol 9:1 v/v. Este protocolo es particularmente adecuado para usar en un procedimiento de la presente invención en el que se está investigando la composición de lípido A de bacterias Klebsiella y/o Salmonella.
[0185] Se generó un espectro de masas. Las máquinas de espectrometría de masas MALDI-TOF típicas adecuadas para su uso en un procedimiento de la presente invención incluyen Bioyper de Bruker Daltonics y VITEK-MS de bioMerieux. Alternativamente, el análisis MALDI-TOF MS se realiza en un analizador 4800 Proteomics (con óptica TOF-TOF, Applied Biosystems) (por ejemplo, usando el modo reflectrón). Las muestras se analizan típicamente operando a 20 kV en el modo de iones negativos usando un tiempo de retardo de extracción establecido en 20 ns. Normalmente, los espectros de 500 a 2000 disparos láser se suman para obtener el espectro final. Todos los experimentos se llevan a cabo típicamente en tres muestras independientes y en tres réplicas técnicas. El control negativo consistió en 0,5 j l de agua doblemente destilada y 0,5 j l de la solución matriz. Los datos de espectrometría de masas se analizan normalmente con la versión 4.9 de Data Explorer de Applied Biosystems. El espectro de masas puede escanearse entre m/z 1000 y 2200, preferiblemente entre m/z 1500 y 2500.
[0186] Se analizó el espectro de masas resultante, y se identificaron los picos correspondientes a lípido A intacto (por ejemplo 1796 m/z para Escherichia coli) y lípido A modificado (adición de fosfoetanolamina (PETN) [+ 123 m/z]) y se utilizaron para calcular las relaciones de intensidad. La relación de lípido A modificado con respecto a lípido A nativo se usa para discriminar entre bacterias susceptibles a polimixina y resistentes a polimixina. Para Enterobacteriaceae resistentes a polimixina, la discriminación entre la resistencia codificada por plásmidos y la resistencia codificada por cromosomas se ha evaluado utilizando el tercer pico [+ 25 m/z] (por ejemplo, 1821 m/z para Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae).
[0187] Los pacientes infectados con bacterias resistentes a polimixina codificadas por plásmidos, tal como se determina por un procedimiento de la presente invención, fueron puestos en cuarentena para prevenir la transmisión a otros pacientes y/o sujetos.
[0188] Este procedimiento (por ejemplo, de acuerdo con las reivindicaciones) permitió la detección de la resistencia a la polimixina directamente en bacterias (por ejemplo, usando muestras que comprenden una membrana bacteriana) en menos de 15 minutos.
Análisis estadístico
[0189] Los datos se compararon de dos en dos utilizando la prueba t de Welch no emparejada. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente diferentes.
Tabla 1
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EJEMPLO 1
Detección de la presencia o ausencia de Escherichia co li resistente a polimixina en una muestra de ensayo
[0191] Las muestras de ensayo que comprenden células bacterianas intactas de E. coli (por ejemplo, suspensiones bacterianas, lavadas para eliminar la sal), de la siguiente manera, se sometieron a espectrometría de masas de acuerdo con un procedimiento de la presente invención: (i) E. coli susceptible a polimixina; (ii) E. coli resistente a polimixina codificada por cromosomas; y (iii) E. coli resistente a polimixina codificada por plásmido (que comprende un plásmido que tiene el gen mcr-1).
[0192] Para E. coli susceptible a polimixina, el espectro de masas estaba dominado por un pico en m/z 1796,2 (Figura 5, panel superior, y la Figura 10, panel superior) asignado a lípido A nativo. La ausencia de un pico que indica la presencia de lípido A modificado con fosfoetanolamina a m/z 1919,2 (es decir, 123 unidades de masa mayor que el lípido A nativo) indicó con éxito la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polimixina.
[0193] En E. coli resistente a polimixina codificado por plásmido, el espectro de masas comprendía además picos en m/z 1919,2 (es decir, 123 m/z unidades mayores que el lípido A nativo), asignados al lípido A modificado por fosfoetanolamina y un pico sin asignar en m/z 1821,2 (es decir, 25 unidades de masa mayor que el lípido A nativo, m/z 1796,2) (Figura 5, panel inferior; y Figura 10, panel central). En una realización, dicho pico no asignado en m/z 1821.2 se asigna al lípido A modificado con pETN en el grupo fosfato 1' con pérdida concomitante del grupo fosfato 4'.
[0194] Para E. coli resistente a polimixina codificado por el cromosoma, el espectro de masas comprendía además picos en m/z 1919,2 (es decir, 123 unidades de masa mayores que el lípido A nativo), asignados a lípido A modificado con fosfoetanolamina, y no comprendía el pico no asignado (que los presentes inventores han asignado al lípido A modificado con pETN en el grupo fosfato 1' con pérdida concomitante del grupo fosfato 4') en m/z 1821,2.
[0195] El procedimiento de la presente invención se validó adicionalmente con cepas de E. coli S1 J53, E. coli R4 J53 y E. coli R1 (Figura 10).
EJEMPLO 2
Detección de la presencia o ausencia de Klebsiella pneum oniae resistente a polimixina en una muestra de ensayo
[0196] Las muestras de ensayo que comprendían células bacterianas intactas de K. pneumoniae (por ejemplo, suspensiones bacterianas, lavadas para eliminar la sal), de la siguiente manera, se sometieron a espectrometría de masas de acuerdo con un procedimiento de la presente invención: (i) K. pneumoniae R46 resistente a polimixinas codificado por el cormosoma; y (ii) K. pneumoniae R42 resistente a polimixinas codificado por el plásmido (que comprendía un plásmido que comprende el gen mcr-1).
[0197] Para K. pneumoniae susceptible a polimixinas, el espectro de masas estaba dominado por un pico en m/z 1840.2 y m/z 1796,2 (Figura 7, panel superior; y la Figura 11, panel superior) asignado al lípido A nativo. La ausencia de un pico que indica la presencia de lípido A modificado con fosfoetanolamina a m/z 1919,2 (es decir, 123 unidades de masa mayor que el lípido A nativo) indicó con éxito la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polimixina.
[0198] En K. pneumoniae resistente a polimixinas, el espectro de masas comprendía un pico en m/z 1919,2 (es decir, 123 unidades de masa mayores que el lípido A nativo, m/z 1796,2), asignado al lípido A modificado por fosfoetanolamina (Figura 7, panel inferior; y Figura 11, panel central). La presencia de un pico que indica la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina indicó con éxito la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polimixina.
[0199] De manera similar a E. coli, un pico no asignado (que los presentes inventores han asignado a lípido A modificado con PETN en el grupo fosfato 1' con la pérdida concomitante del grupo fosfato 4') a m/z 1821,2 (es decir, 25 unidades de masa mayor que el lípido A nativo, m/z 1796) también fue indicativo de la presencia de una bacteria K. pneumoniae (por ejemplo, Enterobacteriaceae) resistente a un antibiótico de polimixina a través de la resistencia a polimixina codificada por el plásmido (Figura 11, panel central). Dicha m/z 1821,2 no estaba presente para una bacteria K. pneumoniae (por ejemplo, Enterobacteriaceae) resistente a un antibiótico de polimixina a través de la resistencia a la polimixina codificada por cromosomas (Figura 11, panel inferior; y Figura 15), destacando la aplicabilidad de este pico para discriminar entre los dos mecanismos de resistencia (resistencia codificada por plásmido y cromosoma).
Detección de la presencia o ausencia de un Acinetobacter baumanni resistente a la polimixina en una muestra de ensayo
[0200] Las muestras de ensayo que comprenden células bacterianas intactas de A. baumanni (por ejemplo, suspensiones bacterianas, lavadas para eliminar la sal), de la siguiente manera, se sometieron a espectrometría de masas de acuerdo con un procedimiento de la presente invención: (i) A. baumanni susceptible a polimixinas; (ii) A. baumanni resistente a polimixinas.
[0201] En A. baumanni susceptible a polimixinas, el espectro de masas estaba dominado por un pico en m/z 1910,3 (Figura 9, panel superior) asignado a lípido A nativo. La ausencia de un pico que indica la presencia de fosfoetanolamina indicó con éxito la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polimixina.
[0202] En A. baumanni resistente a polimixina, el espectro de masas comprendía además un pico en m/z 2033,3 (es decir, 123 unidades de masa mayores que el lípido A nativo), asignado al lípido A modificado por fosfoetanolamina (Figura 9, panel inferior).
EJEMPLO 4
Las relaciones de intensidad máxima permiten la detección de la presencia o ausencia de una bacteria resistente a la polimixina en una muestra de ensayo.
[0203] El cálculo de la relación entre la intensidad del lípido A modificado por fosfoetanolamina y la intensidad del pico correspondiente al lípido A nativo permite detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a polimixina en una muestra de ensayo.
[0204] Esta relación se mostró que era típicamente entre 0,10 y 1,7 en una bacteria resistente a polimixina, y cerca de 0 (típicamente menos de 0,05) en una bacteria susceptible a polimixina (Figura 13).
EJEMPLO 5
Detección adicional de la presencia o ausencia de E scherichia co li resistente a polimixina en una muestra de ensayo
[0205] En las cepas de E. coli susceptibles a polimixina, el espectro de masas negativo escaneado entre m/z 1600 y 2200 estaba dominado por un conjunto de picos asignados a hexa-acil lípido A bis-fosforilado (Figura 4). Se sabe que el pico principal en m/z 1796.2 corresponde al hexa-acil difosforil lípido A que contiene cuatro C14:0 3-OH, un C14:0 y un C12:0, y se refiere como lípido A nativo (Figura 2A (21)).
[0206] En todas las cepas de E. coli resistentes a polimixina, se observó un pico adicional en m/z 1919,2 (Figura 4B y 4C) independiente del mecanismo de resistencia implicado (codificado por cromosoma o el plásmido). Este pico corresponde a la adición de un resto pETN sobre el grupo fosfato en la posición 4 del lípido A nativo (Figura 2B (23)), lo que lleva a un aumento de 123 unidades de masa en comparación con la masa asignada al lípido A nativo (Figura 4B y C).
[0207] En el caso de resistencia codificada por el plásmido (genes tipo mcr en Enterobacteriaceae), se observó sistemáticamente un tercer pico en m/z 1821,2, además de los picos correspondientes al lípido A nativo (m/z 1796,2) y el lípido A modificado con pETN (m/z 1919,2) (Figura 4C). Este pico m/z 1821.2 se asignó a la adición de un resto pETN sobre el grupo fosfato en la posición 1' del lípido A nativo con la pérdida concomitante del grupo fosfato en la posición 4 (Figura 2A (22)), y es un marcador específico de enzimas similares a MCR.
[0208] Para respaldar aún más esta observación, se analizaron 73 aislados de E. coli, incluidas 46 cepas susceptibles a la polimixina con varios fenotipos de resistencia a los antimicrobianos. De estas cepas, cuatro cepas poseen resistencia codificada por cromosomas a la polimixina y 23 son productoras de MCR (Figura 18). La intensidad de los picos correspondientes al lípido A nativo (m/z 1796,2), el lípido A modificado con pETN (m/z 1919,2) y el marcador específico de resistencia a MCR (m/z 1821,2) se registraron de tres experimentos independientes. La relación (denominada relación de resistencia a la polimixina (PRR) de aquí en adelante) de la suma de las intensidades de los picos asociados con el lípido A modificado (para los picos de E. coli en m/z 1919,2 y m/z 1821 , 2) sobre la intensidad del pico de lípido A nativo (para E. coli m/z 1796 , 2) permite una distinción precisa entre aislados susceptibles a polimixina y resistentes a polimixina, pero también discriminación entre resistencia codificada por cromosomas y relacionada con MCR (es decir, codificada por plásmido) a polimixina (Figura 6). Se encontró que el valor de PRR para todas las cepas de E. coli susceptibles era 0 (Figura 18 y Figura 6). La relación osciló entre 0,109 y 0,481 (promedio de 0,245) para las cepas de E. coli con resistencia codificada por cromosomas a la polimixina, y de 0,533 a 4,844 (promedio de 2,340) para todos los productores de MCR (Figura 18 y Figura 6). La distribución de los valores de PRRecoií de aislados susceptibles de polimixina en comparación con cepas de E. coli con resistencia codificada por cromosomas a la polimixina, y productores de MCR fueron todos significativamente diferentes (p < 0,01, test t de Welch). El análisis de las curvas ROC permitió la definición de dos valores de corte para PRR e. coli (0,1 y 0,5) que discriminan aislados susceptibles a polimixina (PRR e. con <0 , 1) y aislados resistentes a polimixina (PRR e. con > 0 , 1) y también permite una mayor discriminación entre la resistencia codificada por cromosomas (0 , 1 <PRR e. coii 0,5) y la resistencia codificada por plásmido (PRR e. coii > 0 , 5).
EJEMPLO 6
Detección de la presencia o ausencia de Escherichia co li resistente a polimixina cultivada en medios clínicamente relevantes
[0209] El funcionamiento de los procedimientos de la invención (por ejemplo, la "prueba de MALDIxin") fue probada usando colonias cultivadas en medios utilizados habitualmente para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, es decir, agar Mueller-Hinton (MH). Además, debido al rápido aumento de Enterobacteriaceae productoras de MCR-1 desde 2016, también se ha sugerido examinar a los pacientes infectados utilizando medios complementados con polimixina. En consecuencia, los procedimientos de la invención se llevaron a cabo en tres cepas de E. coli (una cepa de tipo salvaje, una cepa con resistencia codificada por cromosomas y una cepa productora de MCR-1), cultivadas en agar LB, agar MH y agar MH suplementado con polimixina B a concentraciones finales de 1 mg/l o 2 mg/l. Tal como se muestra en la Figura 14, se obtuvieron espectros similares independientemente del medio de crecimiento, con el PRR e. coii estando entre 2,89 y 5,69 para las cepas productoras de MCR-1 y entre 0,21 y 0,37 para las cepas que albergan resistencia codificada por cromosomas. Para identificar cualquier impacto de la edad de las colonias cultivadas en agar LB y MH, se realizó un procedimiento de la invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin) en colonias frescas (incubación durante la noche), colonias envejecidas 48 horas, una semana y dos semanas ( las placas de agar se mantuvieron a 4 °C). Se obtuvieron espectros similares para todas las colonias ensayadas, lo que no produjo diferencias significativas en su PRR E. coli (Figura 19).
EJEMPLO 7
Validación del procedimiento en una colección prospectiva de E. coli productora de carbapenemasas de la NRC francesa
[0210] Para validar los procedimientos de la invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin), todas las E. coli productoras de carbapenemasas recibidas de la NRC francesa durante octubre y noviembre de 2016 se analizaron a ciegas por triplicado (tres colonias seleccionadas de la misma placa de agar MH). La colección de 78 cepas de E. coli productoras de carbapenemasas que se obtuvieron incluyó dos productoras de KPC, once productoras de NDM, dos productoras de VIM, 63 productoras similares a OXA-48 y un aislado que produjo dos carbapenemasas (Tabla 2). Entre estos aislados, también se encontró que dos productores de NDM-1 y uno de OXA-48 eran resistentes a la colistina con MIC de 4 mg/l. El análisis de PCR reveló que estos tres aislados eran positivos para el gen mcr-1 (Tabla 2). Cuando se analizaron utilizando los procedimientos de la invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin), todos los aislados susceptibles a polimixina (n = 75) mostraron una PRRe. coli de 0, correspondiente a la susceptibilidad a la polimixina, mientras que para los tres aislados productores de MCR-1 se obtuvo una PRR de e. coli superior a 0,5 (más específicamente 1,73 ± 0,23 y 2,34 ± 0,12 para los dos productores de NDM-1 y 1,29 ± 0,63 para el productor de Ox A-48), clasificándolas con precisión como resistentes a la polimixina mediante un mecanismo codificado por plásmido (Tabla 2). Por lo tanto, en este estudio, los procedimientos de la invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin) identificaron de manera fiable y rápida todas las cepas productoras de MCR donde los procedimientos convencionales habrían necesitado de 24 a 48 horas (procedimiento de dilución en caldo (alrededor de 16 a 24 horas) y posterior extracción de ADN y PCR para mcr-1 y mcr-2 en aislamientos resistentes (alrededor de 4 horas)).
Resistencia a polimixina Resultados MADI-TOF Carbapenemasa N MIC de mcr-1/-2
colistina (mg/l) PCR PRRe . coli Interpretación KPC-2 1 0,25 - 0 Susceptible KPC-3* 1 0,25 - 0 Susceptible NDM-1 3 0,25 - 0 Susceptible NDM-1 1 0,5 - 0 Susceptible NDM-1 1 4 + (m cr-1) 1,73 ± 0,23 Resistencia codificada por plásmido NDM-1 1 4 (m cr-1) 2,34 ± 0,12 Resistencia codificada por plásmido NDM-5 2 0,25 - 0 Susceptible NDM-5 3 0,5 - 0 Susceptible VIM-1 1 0,5 - 0 Susceptible VIM-4 1 0,25 - 0 Susceptible OXA-48 27 0,25 - 0 Susceptible OXA-48 26 0,5 - 0 Susceptible OXA-48 1 1 - 0 Susceptible OXA-48* 1 4 + (m cr-1) 1,29 ± 0,63 Resistencia codificada por plásmido OXA-181 4 0,25 - 0 Susceptible OXA-204 1 0,25 0 Susceptible OXA-244 1 0,25 0 Susceptible OXA-244 1 0,5 0 Susceptible OXA-181 NDM- 1 0,25 - 0 Susceptible 5
Tabla 2. Detección y caracterización de resistencia a polimixina utilizando técnicas convencionales (MIC y PCR) y un procedimiento de la presente invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin) sobre 78 cepas de E. coli productoras de carbapenemasas recibidas por al NRC francesa durante octubre y noviembre de 2016. N, número de aislados; MIC, concentración mínima de inhibición; PPR, relación de resistencia a polimixina; , PCR positiva; - PCR negativa para el gen indicado en paréntesis. *Estas dos cepas se aislaron del mismo paciente.
EJEMPLO 8
Análisis de genes de la familia mcr
[0211] Los genes codificados por cromosomas asociados con la resistencia a la polimixina son numerosos, y las modificaciones génicas (alteraciones, mutaciones por deleciones) implicadas no están descritas ni caracterizadas sistemáticamente. En cuanto a la resistencia codificada por plásmidos, se conocen cinco familias de genes mcr en Enterobacteriaceae.
[0212] Se analizó la homología de secuencia de MCR-2, MCR-3, MCR-4 y MCR-5 con MCR-1. MCR-2, MCR-3, MCR-4 y m CR-5 comparten solo el 81%, 34%, 33% y 31% de identidad de aminoácidos con MCR-1, respectivamente (Figura 17). Esta diversidad conduciría inevitablemente a un fallo en la detección sistemática de la resistencia a la polimixina, si se basa en el uso de herramientas de biología molecular disponibles dedicadas a la detección de mcr-1 y/o mcr-2 (Figura 16).
[0213] Estos problemas son superados por los procedimientos de la presente invención (por ejemplo, la prueba MALDIxin), que proporciona una herramienta rentable (procedimiento) basado en la tecnología MALDI-TOF que tiene por objetivo detectar la resistencia a la polimixina utilizando una sola colonia bacteriana Gram-negativa, en menos de 15 minutos.
SECUENCIAS
[0214]
SEQ ID NO: 1 (mcr-1)
AT GAT GCAGCAT ACTT CT GT GT GGT ACCGACGCT CGGT CAGT CCGTTT GTT CTT GT GGC G AGT GTT GCCGTTTT CTT GACCGCG ACCGCC AATCTT ACCTTTTTT G AT AAAAT C AGCCA AACCTATCCCATCGCGGACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTCTTTG GCGCGAT GCT ACT GAT C ACC ACGCTGTTAT CATCGTATCGCTATGTGCT AAAGCCT GT G TT GATTTTGCT ATT AATCAT GGGCGCGGT G ACC AGTT ATTTT ACT G AC ACTT AT GGC ACG GT CT AT GAT ACG ACC AT GCTCC AAAAT GCCCT AC AGACCG ACC A AGCCG AGACC A AGG AT CT ATT AAACGCAGCGTTT ATCAT GCGT ATCATT GGTTT GGGT GT GCT ACCAAGTTT GC TT GT GGCTTTT GTT AAGGTGGATT ATCCGACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTT G ATCGT GGCA AGT CTT GCGCT G ATTTT ACTGCCT GT GGT GGCGTT C AGC AGT C A TT AT GCCAGTTTCTTTCGCGT GCAT AAGCCGCT GCGT AGCT AT GT CAAT CCGAT CAT GC CAATCTACTCGGTGGGTAAGCTT GCC AGT ATT G AGT AT AA A AA AGCC AGT GCGCC A A AA GAT ACC ATTT AT C ACGCCAA AGACGCGGT AC AAGC AACC A AGCCT GAT AT GCGT A AGCC ACGCCTAGTGGT GTT CGT CGT CGGT G AGACGGCACGCGCCGAT CAT GT CAGCTT CAAT GGCTAT G AGCGCGAT ACTTTCCCACAGCTT GCC AAGAT CGAT GGCGT GACCAATTTT AG CAAT GTC AC AT CGT GCGGC ACAT CG ACGGCGT ATT CTGTGCCGTGTAT GTT C AGCT AT C T GGGCGCGGAT GAGT AT GAT GTCGAT ACCGCCAAAT ACCAAGAAAAT GT GCT GGAT AC GCTGGATCGCTTGGGCGTAAGTATCTTGTGGCGTGATAATAATTCGGACTCAAAAGGCG T GATGGAT AAGCT GCCAAAAGCGCAATTT GCCGATT AT AAATCCGCGACCAACAACGCC AT CT GC A AC ACCA ATCCTT AT A ACGA AT GCCGCG AT GT CGGT ATGCT CGTT GGCTT AGA T GACTTT GT CGCTGCCAAT AACGGCAAAGAT AT GCT GAT CAT GCT GC ACCAAAT GGGCA AT CACGGGCCT GCGT ATTTTA AGCG AT AT GAT G AAA AGTTT GCC AA ATT C ACGCC AGT G T GT GAAGGT AAT GAGCTTGCCAAGT GCGAACAT CAGT CCTT GAT CAAT GCTT AT GACAAT GCCTT GCTT GCC ACCGAT GATTT CAT CGCT C AAAGT AT CCAGT GGCT GCAGACGCACAG C A ATGCCT AT GAT GTCT CAAT GCTGTATGT C AGCGAT CAT GGCGA AAGTCT GGGT GAGA ACGGTGTCTATCT ACAT GGT AT GCCAAAT GCCTTT GC ACC AAAAG AACAGCGCAGT GT G CCTGCATTTTTCT GGACGGAT AAGCAAACT GGCAT CACGCCAAT GGCAACCGAT ACCGT CCT G ACCCAT G ACGCG AT C ACGCCG AC ATT ATT AA AGCT GTTT GAT GTC ACCGCGG AC A AAGTCAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCTGA
E Q ID NO: 2 (m c r-1.2 ) ATGATGCTGCATACTTCTGTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGC GAGT GTT GCCGTTTT CTT G ACCGCG ACCGCC AAT CTT ACCTTTTTT GAT AAAAT CAGCCA AACCT AT CCCAT CGCGGACAAT CT CGGCTTT GT GCT GACGATCGCT GTCGT GCT CTTT G GCGCGATGCTACTGATCACCACGCTGTTATCATCGTATCGCTATGTGCTAAAGCCTGTG TT G ATTTT GCTATT AAT C AT GGGCGCGGT G ACCAGTT ATTTT ACT G AC ACTT AT GGC ACG GT CT AT GAT ACGACCAT GCTCCAAAAT GCCCTACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGG ATCT ATT A AACGC AGCGTTT AT C AT GCGTAT C ATT GGTTTGGGT GT GCTACC AAGTTT GC TT GT GGCTTTT GTT AAGGT GGATT ATCCG ACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTTGATCGT GGC A AGT CTT GCGCT G ATTTT ACTGCCT GT GGTGGCGTTC AGC AGTC A TTAT GCC AGTTT CTTT CGCGT GC AT A AGCCGCT GCGT AGCT ATGT C A AT CCGATC AT GC C AATCT ACTCGGT GGGT AAGCTT GCC AGT ATT GAGT AT A AAAAAGCC AGT GCGCC AAAA GAT ACC ATTT AT C ACGCC AA AGACGCGGTAC AAGC AACCA AGCCT G ATAT GCGT A AGCC ACGCCT AGTGGT GTT CGTCGT CGGT GAGACGGCACGCGCCGAT CAT GTCAGCTT CAAT GGCT AT GAGCGCGAT ACTTTCCCACAGCTT GCC AAGAT CG AT GGCGT GACCAATTTT AG CAAT GT CACAT CGT GCGGCACAT CGACGGCGT ATT CT GT GCCGT GT AT GTT CAGCTAT C T GGGCGCGGAT GAGT AT GAT GTCGAT ACCGCCAAAT ACCAAG AAAAT GT GCT GGAT AC GCT GG ATCGCTT GGGCGT A AGT AT CTT GT GGCGT GAT AAT A ATT CGG ACT C AA AAGGCG T GAT GGAT AAGCT GCCAAAAGCGCAATTT GCCGATT AT AAATCCGCGACCAACAACGCC ATCT GC A AC ACC A ATCCTT AT A ACGA AT GCCGCG AT GTCGGT ATGCT CGTT GGCTT AGA T GACTTT GT CGCT GCCAAT A ACGGCAAAGATATGCT GAT C ATGCT GCACCAAAT GGGCA AT CACGGGCCT GCGT ATTTT A AGCGAT AT GAT G A AAAGTTT GCCAAATT CACGCCAGT G TGT GAAGGTAAT G AGCTT GCC AAGT GCGA AC AT CAGT CCTT GAT CAAT GCTTAT GAC A AT GCCTTGCTT GCC ACCG AT GATTT C ATCGCT CAA AGT AT CC AGT GGCT GC AGACGC AC AG CAAT GCCT AT GAT GTCTCAAT GCT GT AT GTCAGCGAT CAT GGCGAAAGT CT GGGT GAGA ACGGT GTCTATCT ACAT GGT AT GCCAAAT GCCTTTGCACCAAAAGAACAGCGCAGT GT G CCT GC ATTTTTCT GG ACGG AT AAGC AAACT GGCAT CACGCCAAT GGC AACCG AT ACCGT CCT GACCCAT GACGCGATCACGCCGAC ATTATT AAAGCT GTTT GAT GT CACCGCGGACA AAGT CAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCT GA
E Q ID NO: 3 (m c r-1.3 )
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E Q ID NO: 4 (m c r-1.4 )
AT G AT GCAGC AT ACTT CTGTGTGGT ACCG ACGCTCGGT C AGT CCGTTT GTT CTT GT GGC G AGT GTT GCCGTTTT CTT G ACCGCG ACCGCC AAT CTT ACCTTTTTT G ATAA AAT C AGCC A AACCTATCCCATCGCGGACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTCTTTG GCGCGAT GCT ACT G AT CACCACGCT GTT AT C AT CGT AT CGCT AT GT GCT AAAGCCT GT G TT G ATTTT GCTATTAATC AT GGGCGCGGT G ACC AGTT ATTTT ACT G AC ACTT AT GGC ACG GTCTATGATACGACCATGCTCCAAAATGCCCTACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGG ATCT ATT AAACGC AGCGTTT AT CAT GCGT AT C ATT GGTTT GGGT GTGCT ACC AAGTTT GC TT GT GGCTTTT GTTAAGGTGGATTAT CCGACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTTGATCGT GGC A AGT CTT GCGCT GATTTT ACTGCCTGTGGT GGCGTT C AGC AGTCA TT AT GCC AGTTT CTTTCGCGT GCATAAGCCGCT GCGT AGCT AT GT CAAT CCGATCAT GC CAATCTACTCGGTGGGTAAGCTTGCCAGTATTGAGTATAAAAAAGCCAGTGCGCCAAAA GAT ACC ATTT AT C ACGCCAAAGACGCGGT AC AAGC AACC A AGCCT GAT ATGCGT A AGCC ACGCCT AGT GGT GTT CGT CGT CGGT GAGACGGCACGCGCCGAT CAT GT CAGCTT CAAT GGCTAT GAGCGCG AT ACTTT CCC AC AGCTT GCC A AG ATCG AT GGCGTG ACC AATTTT AG CAAT GT CACAT CGT GCGGCACAT CGACGGCGTATT CT GT GCCGT GT AT GTT CAGCTAT C T GGGCGCGGAT GAGT AT GAT GTCGAT ACCGCCA AAT ACCAAG AA A AT GT GCT GGAT AC GCT GG ATCGCTT GGGCGT AAGT AT CTT GT GGCGT GAT AAT AATT CGG ACT C AA AAGGCG T GAT GGAT AAGCT GCC AAAAGCGCAATTT GCCG ATT AT AA AT CCGCGACCAAC AACGCC ATCT GC A AC ACC A ATCCTT AT A ACGA ATGCCGCG ATGTCGGT ATGCT CGTT GGCTT AGA T GACTTT GT CGCT GCCAAT A ACGGCAAAGATATGCT GAT C ATGCT GC ACCAAAT GGGCA AT C ACGGGCCT GCGT ATTTTAAGCGAT AT GAT GAAA AGTTT GCCAA ATT C ACGCC AGT G T GT GA AGGT AAT G AGCTT GCC A AGT GCG A AC AT C AGT CCTT GAT CAAT GCTT AT GAC AAT GCCTT GCTT GCCACCGATAATTTCAT CGCT C AAAGT ATCCAGTGGCT GCAGACGCACAG CAAT GCCT AT GAT GT CT CAAT GCT GT AT GTC AGCG ATCAT GGCG AA AGTCT GGGT GAGA ACGGT GT CT AT CT ACAT GGT AT GCCAAAT GCCTTTGCACCA AA AG AACAGCGC AGT GT G CCT GCATTTTTCT GGACGGAT AAGCAAACT GGCATCACGCCAAT GGCAACCGAT ACCGT CCT G ACCC AT G ACGCG AT C ACGCCGAC ATT ATT A AAGCT GTTT GAT GT CACCGCGGAC A AAGTCAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCTGA
E Q ID NO: 5 (m c r -1.5 ) ATGATGCAGCATACTTCTGTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGC G AGT GTT GCCGTTTTCTT G ACCGCG ACCGCC AATCTT ACCTTTTTT G AT AAAAT CAGCCA A ACCT ATCCCATCGCGGAC A AT CTCGGCTTT GT GCT G ACGATCGCT GTCGTGCT CTTT G GCGCGAT GCT ACT G ATCACCACGCT GTT AT CAT CGT AT CGCT AT GT GCT A AAGCCT GT G TT GATTTT GCT ATT AAT CAT GGGCGCGGT G ACCAGTT ATTTT ACT GACACTT AT GGCACG GTCT AT GATACGACCATGCT CCAAAAT GCCCTACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGG ATCT ATT A AACGC AGCGTTT AT CAT GCGT AT C ATT GGTTT GGGT GTGCT ACC A AGTTT GC TT GT GGCTTTT GTT AAGGTGGATTAT CCGACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTT G ATCGT GGC AAGT CTT GCGCT GATTTT ACTGCCTGTGGT GGCGTT C AGC AGT CA TTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGCATAAGCCGCTGCGTAGCTATGTCAATCCGATCATGC CAATCT ACTCGGT GGGT AAGCTT GCC AGT ATT GAGT AT AAAAAAGCCAGT GCGCCAAAA GATACCATTTATCACGCCAAAGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAGCC ACGCCT AGT GGT GTT CGTCGT CGGT G AG ACGGC ACGCGCCGAT CAT GT C AGCTT C A AT GGCTATGAGCGCGATACTTTCCCACAGCTTGCCAAGATCGATGGCGTGACCAATTTTAG CAAT GTCACATCGTGCGGCACAT CGACGGCGT ATTCT GT GCCGT GT AT GTTCAGCT ATC T GGGCGCGGAT GAGTAT GAT GTCGAT ACCGCCAAAT ACCAAGAAAAT GT GCTGGAT AC GCT GG ATCGCTT GGGCGT AAGT ATCTT GT GGCGT GAT AAT AATT CGGACTCAA AAGGCG T GAT GGAT AAGCTGCCAAAAGCGCAATTT GCCGATT AT AAATCCGCGACCAAC AACGCC ATCTGCAACACCAATCCTTATAACGAATGCCGCGATGTCGGTATGCTCGTTGGCTTAGA T GACTTT GT CGCTGCCA AT A ACGGCAAAGAT AT GCTGAT CAT GCT GCACCA AATGGGCA AT C ACGGGCCT GCGT ATTTTA AGCG AT AT GAT G A AA AGTTT GCC AA ATT C ACGCC AGTG TGT GAAGGT AAT G AGCTT GCC AAGT GCGA AC AT CAGTCCTT GAT CAAT GCTTAT GAC A AT GCCTT GCTT GCCACCGAT GATTT CAT CGCT CAAAGT AT CCAGT GGCT GCAGACGT ACAG CAAT GCCTAT GAT GT CT CAAT GCT GT AT GTC AGCG AT CAT GGCG AA AGT CTGGGT GAGA ACGGTGTCTATCT AC AT GGTAT GCC A AAT GCCTTT GC ACC AAAAG AACAGCGC AGT GT G CCT GCATTTTT CT GGACGGAT AAGCAAACT GGCATCACGCCAAT GGCAACCGAT ACCGT CCT GACCCAT GACGCGAT CACGCCGACATTATT AAAGCT GTTT GAT GT CACCGCGGACA AAGTCAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCTGA
SEC ID NO: 6 ímcr-1.6)
AT GAT GCAGCAT ACTT CT GT GT GGT ACCG ACGCT CGGT C AGT CCGTTT GTT CTT GT GGC GAGT GTT GCCGTTTT CTT G ACCGCG ACCGCC AAT CTT ACCTTTTTT G AT AAAAT C AGCC A AACCTATCCCATCGCGGACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTCTTTG GCGCGAT GCTACT GAT CACC ACGCT GTT AT CATCGT ATCGCTATGTGCT AAAGCCT GT G TT G ATTTT GCTATTAATCAT GGGCGCGGT G ACC AGTT ATTTT ACT GAC ACTT AT GGC ACG GT CT AT GAT ACGACCAT GCT CCAAAAT GCCCTACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGG ATCT ATT A AACGC AGCGTTT ATC ATGCGT ATC ATT GGTTTGGGT GT GCTACC AAGTTT GC TT GT GGCTTTT GTT AAGGT GGATT AT CCG ACTTGGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTT G ATCGT GGC AAGTCTT GCGCT G ATTTT ACTGCCT GTGGT GGCGTTC AGC AGT C A TT AT GCC AGTTT CTTT CGCGTGC AT AAGCCGCT GCGT AGCT AT GT C A AT CCGAT C AT GC CAAT CTACTCGGT GGGT AAGCTT GCC AGT ATT GAGT AT AAAAAAGCC AGT GCGCC AA AA GAT ACCATTT AT CACGCCAA AGACGCGGT ACAAGCAACCA AGCCT GAT AT GCGT AAGCC ACGCCT AGT GGT GTT CGT CGT CGGT GAGACGGCACGCGCCGAT CAT GT CAGCTT CAAT GGCT AT GAGCGCGAT ACTTT CCCAC AGCTT GCCAAG AT CGAT GGCGT GACCAATTTT AG CAAT GT CACAT CGT GCGGCACAT CGACGGCGT ATT CT GT GCCGT GT AT GTT CAGCTAT C T GGGCGCGGAT GAGT AT GAT GTCGAT ACCGCCAAAT ACCAAGAAAAT GT GCT GGAT AC GCT GG AT CGCTT GGGCGT A AGT ATCTT GT GGCGT G ATA AT A ATT CGG ACT C AA AAGGCG T GAT GGAT AAGCT GCCAAAAGCGCAATTTGCCGATT AT AA ATCCGCGACCAACAACGCC ATCT GCAACACCAATCCTT AT AACGAAT GCCGCG AT GT CGGT AT GCT CGTT GGCTT AGA TGACTTTGTCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATGCTGATCATGCTGCACCAAATGGGCA AT C ACGGGCCT GCGT ATTTTA AGCG AT AT GAT G A AA AGTTT GCC AA ATT C ACGCC AGT G T GT GAAGGT AAT G AGCTT GCC A AAT GCGAACAT C AGT CCTT GAT CAAT GCTTAT GAC AAT GCCTT GCTT GCC ACCGAT GATTT CAT CGCTC AAAGT ATCC AGT GGCT GC AGACGC AC AG CAAT GCCTAT GAT GTCT C AATGCT GTATGT C AGCG AT CAT GGCG AA AGT CTGGGT GAGA ACGGT GTCT ATCTACAT GGT AT GCCAAAT GCCTTT GCACCAAAAGAACAGCGCAGT GT G CCT GCATTTTTCT GGACGGAT AAGCAA ACT GGCAT CACGCCAAT GGCAACCGAT ACCGT CCT GACCC AT GACGCGAT CACGCCGACATT ATT AAAGCT GTTT GAT GT C ACCGCGGACA AAGT CAA AGACCAC ACCGCATT CATCCGCT GA
SEC ID NO: 7 ímcr-1.7) ATGATGCAGCATACTTCTGTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGC GAGTGTTGCCGTTTTCTTGACCGCGACCGCCAATCTTACCTTTTTTGATAAAATCAGCCA A ACCT ATCCC AT CGCGGAC AAT CT CGGCTTT GT GCT G ACG ATCGCT GTCGT GCT CTTT G GCGCGAT GCT ACT GAT CACCACGCT GTT AT CAT CGT AT CGCTAT GT GCT AAAGCCT GT G TT GATTTT GCT ATT AAT CAT GGGCGCGGT GACCAGTT ATTTT ACT GACACTT AT GGCACG GTCTAT GAT ACG ACC AT GCT CC AAA AT GCCCTAC AGACCG ACC AAGC CGAG ACC A AGG AT CT ATT AAACGCAGCGTTT AT CATGCGT ATCATT GGTTTGGGT GT GCT ACCAAGTTT GC TT GT GGCTTTT GTT AAGGT GGATT ATCCG ACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTT GAT CGT GGCAAGT CTT GCGCT GATTTT ACTGCCT GT GGTGGCGTTC AGC AGT CA TTAT GCC AGTTT CTTT CGCGT GC AT AAGCCGCTGCGTAGCTATGT C AATCCGATC AT GC CAATCT ACT CGGT GGGT AAGCTT GCCAGT ATT GAGT AT A AA AA AGCC AGT ACGCC AAAA GAT ACCATTT AT CACGCCAAAGACGCGGT ACAAGC AACCAAGCCT GAT AT GCGT AAGCC ACGCCT AGT GGT GTT CGT CGT CGGT GAGACGGCACGCGCCGATCAT GT CAGCTT CAAT GGCT AT GAGCGCGAT ACTTTCCCACAGCTT GCC AAGATCG ATGGCGT GACCAATTTT AG CAAT GT CACAT CGT GCGGCACATCGACGGCGTATT CT GT GCCGT GT AT GTT CAGCTAT C T GGGCGCGGAT GAGTAT GAT GTCGAT ACCGCCAAATACCAAGAAAAT GT GCT GGAT AC GCT GG AT CGCTT GGGCGT A AGT AT CTT GT GGCGT G ATA AT A ATT CGG ACT C AA AAGGCG T GAT GGAT AAGCT GCCAAAAGCGCAATTTGCCGATTAT AAATCCGCGACCAACAACGCC ATCT GC A AC ACC A AT CCTT AT A ACGA AT GCCGCG AT GTCGGT ATGCTCGTT GGCTT AGA T GACTTT GT CGCT GCCAAT A ACGGCAA AG AT ATGCT GAT C ATGCT GCACC AAAT GGGCA AT C ACGGGCCT GCGT ATTTT AAGCGAT AT GAT GAAA AGTTT GCCAA ATT C ACGCC AGT G T GT GA AGGT AAT G AGCTT GCC A AGT GCG A AC AT C AGTCCTT G ATC A AT GCTT AT G AC A AT GCCTTGCTT GCC ACCG AT GATTT CAT CGCT CAA AGT AT CC AGT GGCT GC AGACGC AC AG CAAT GCCT AT GAT GT CTCAAT GCT GT AT GTCAGCGAT CAT GGCGAAAGT CT GGGT GAGA ACGGT GT CT AT CT ACAT GGT AT GCCAAAT GCCTTT GCACCAAAAGAACAGCGCAGT GT G CCT GCATTTTT CT GGACGGAT AAGCAAACT GGCATCACGCCAAT GGCAACCGAT ACCGT CCT G ACCC AT G ACGCG AT C ACGCCG AC ATT ATT AA AGCT GTTT GAT GT CACCGCGG AC A AAGTCAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCTGA
SEC ID NO: 8 ímcr-1.8) ATGATGCGGCATACTTCTGTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGC GAGTGTTGCCGTTTTCTTGACCGCGACCGCCAATCTTACCTTTTTTGATAAAATCAGCCA A ACCT ATCCC AT CGCGGAC AAT CT CGGCTTT GT GCT G ACG ATCGCT GTCGT GCT CTTT G GCGCGAT GCT ACT GAT CACCACGCT GTT AT CAT CGT ATCGCT AT GT GCT AAAGCCT GT G TT GATTTT GCT ATT AAT CAT GGGCGCGGT GACCAGTT ATTTT ACT GACACTT AT GGCACG GT CT AT GAT ACGACC AT GCT CCAAA AT GCCCT ACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGG AT CT ATT AAACGCAGCGTTT AT CATGCGT ATCATT GGTTTGGGT GT GCT ACCAAGTTT GC TT GT GGCTTTT GTT AAGGT GGATTATCCGACTTGGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT G GGCTT G ATCGT GGC A AGT CTT GCGCT GATTTT ACTGCCT GT GGTGGCGTTC AGC AGT C A TTAT GCC AGTTT CTTT CGCGT GC AT AAGCCGCT GCGTAGCT AT GT C AATCCGATC AT GC CAATCT ACT CGGT GGGT AAGCTT GCC AGT ATT GAGT AT AAAAAAGCCAGT GCGCCAAAA GATACCATTTATCACGCCAAAGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAGCC ACGCCT AGT GGT GTT CGT CGT CGGT GAGACGGCACGCGCCGATCAT GT CAGCTT CAAT GGCT AT GAGCGCGAT ACTTTCCCACAGCTT GCC AAGATCG ATGGCGT GACCAATTTT AG CAAT GT CACATCGT GCGGCACATCGACGGCGT ATT CT GT GCCGT GT AT GTT C AGCT AT C T GGGCGCGGAT GAGTAT GAT GTCGAT ACCGCCAAAT ACCAAGAAAAT GT GCT GGAT AC GCT GG AT CGCTT GGGCGT A AGT AT CTT GT GGCGT G ATA AT A ATT CGG ACT C AA AAGGCG T GAT GGAT AAGCT GCCAAAAGCGCAATTT GCCGATT AT AAATCCGCGACCAACAACGCC ATCT GC AAC ACC AAT CCTTATAACGAATGCCGCG AT GTCGGT AT GCT CGTT GGCTT AG A T GACTTT GT CGCT GCCAAT A ACGGCAAAG AT ATGCT GATC ATGCT GCACCAAAT GGGCA AT C ACGGGCCTGCGT ATTTTAAGCGAT AT GAT GAAA AGTTT GCCAA ATT C ACGCC AGT G T GT GAAGGT AAT G AGCTT GCC A AGT GCGA AC AT CAGTCCTT GAT CAAT GCTTAT GAC A AT GCCTTGCTT GCC ACCGAT G ATTT C ATCGCT CAA AGT ATCC AGT GGCT GC AG ACGC AC AG CAAT GCCT AT GAT GT CTCAAT GCT GT AT GTC AGCG AT CAT GGCGAAAGT CT GGGT GAGA ACGGT GT CT AT CT ACAT GGT AT GCCAAAT GCCTTTGCACCAAAAG AACAGCGCAGT GT G CCT GCATTTTT CT GGACGGAT AAGCAAACT GGCATCACGCCAAT GGCAACCGAT ACCGT CCT GACCCAT GACGCGAT CACGCCGAC ATTATT AAAGCT GTTT GAT GT CACCGCGGACA AAGT CAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCT GA
SEC ID NO: 9 ímcr-1.9) GTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGCGAGTGTTGCCGTTTTCTT GACCGCGACCGCCAATCTTACCTTTTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCATCGCGG ACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTCTTTGGCGCGATGCTACTGATC ACCACGCT GTT AT CAT CGT AT CGCT AT GT GCT AAAGCCT GT GTT GATTTT GCT ATT AAT C AT GGGCGCGGT GACC AGTT ATTTT ACT GAC ACTT ATGGC ACGGT CT AT G AT ACG ACC AT GCTCCAAAATGCCCTACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGGATCTATTAAACGCAGCG TTT AT CAT GCGTAT C ATT GGTTT GGGTGTGCT ACC AAGTTT GCTT GT GGCTTTT GTT A AG GT GGATT ATCCGACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT GGGCTT GAT CGT GGCAA GT CTT GCGCT GATTTT ACTGCCT GT GGT GGCGTT CAGCAGT CATT AT GCCAGTTT CTTT C GCGT GCAT AAGCCGCTGCGTAGCTAT GT CAAT CCGATCATGCCAAT CT ACT CGGT GGGT AAGCTT GCCAGT ATT GAGT AT AAAAA AGCCAGT GCGCC AAAAGAT ACC ATTTAT CACGC CAAAGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAGCCACGCCTAGTGGTGTTC GTCGTCGGT G AGACGGCACGCGCCG ATCAT GT CAGCTT CAAT GGCTAT G AGCGCG AT A CTTT CCC AC AGCTT GCC A AGAT CG AT GGCGT GACCA ATTTTAGC AAT GT C AC ATCGT GC GGCACATCGACGGCGTATTCTGTGCCGTGTATGTTCAGCTATCTGGGCGCGGATGAGT AT GAT GT CGAT ACCGCCAAAT ACCAAGAAAAT GTGCTGGATACGCT GGATCGCTT GGGC GTAAGTATCTTGTGGCGT GAT AAT A ATT CGGACT CAAAAGGCGT GAT GG AT AAGCT GCC AAAAGCGCAATTT GCCGATT AT AAATCCGCGACCA ACAACGCCAT CT GCAACACCAATC CTT AT AACGAAT GCCGCGAT GT CGGT AT GCT CGTTGGCTT AGAT GACTTT GT CGCT GCC AAT AACGGCAAAGAT AT GCT GATCAT GCTGCACCAAAT GGGC AAT CACGGGCCT GCGT A TTTT A AGCG AT AT GAT GAA AAGTTT GCC AA ATTC ACGCCAGCGT GT GA AGGT AATG AGCT T GCCAAGT GCGAACATCAGT CCTT GATCAAT GCTT AT GACAAT GCCTT GCTT GCCACCG AT GATTT CAT CGCTCAAAGT AT CCAGT GGCT GCAGACGCACAGCAAT GCCT AT GAT GT C TCAAT GCT GT AT GT CAGCGATCAT GGCGAAAGT CT GGGT GAGAACGGT GTCT AT CT ACA T GGT AT GCCAAAT GCCTTT GCACCAAAAGAACAGCGC AGT GT GCCT GCATTTTT CT GGA CGGAT AAGCAAACT GGCAT CACGCCA AT GGCAACCGATACCGTCCT GACCCAT GACGC GATCACGCCGACATT ATT AAAGCT GTTT GAT GT CACCGCGGACAAAGTCAAAGACCGCA CCGCATT CAT CCGCT GA
SEC ID NO: 10 ímcr-1.10)
GT GT GGT ACCGACGCTCGGTCAGT CCGTTT GTT CTT GT GGCGAGT GTT GCCGTTTT CTT GACCGCGACCGCC AAT CTT ACCTTTTTT GATAAAAT CAGCCAAACCT ATCCCATCGCGG ACAAT CT CGGCTTT GT GCT GACGAT CGCT GTCGTGCTCTTT GGCGCG AT GCT ACT GAT C ACCACGCT GTT AT CAT CGTAT CGCT AT GTGCT AAAGCCTGTGTT GATTTT GCT ATT AAT C AT GGGCGCGGT GACCAGTT ATTTT ACT GACACTT AT GGCACGGTCT AT GAT ACGACCAT GCTCCAAAAT GCCCT ACAGACCGACCAAGCCGAG ACCAAGGATCTATT AAACGCAGCG TTT ATCATGCGTAT C ATT GGTTT GGGT GTGCT ACC AAGTTT GCTT GT GGCTTTT GTT A AG GT GG ATT ATCCG ACTT GGGGC A AGGGTTT GAT GCGCCG ATT GGGCTT GATCGT GGC A A GT CTT GCGCT GATTTT ACTGCCTGTGGT GGCGTT CAGCAGT CATT AT GCCAGTTT CTTT C GCGTGC AT AAGCCGCT GCGTAGCT AT GT C AAT CCG AT C ATGCC AAT CT ACTCGGT GGGT AAGCTT GCCAGT ATT GAGT AT AA A AA AGCC AGTGCGCCAAAAGAT ACCATTT ATCACGC CAAAGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAGCCACGCCTAGTGGTGTTC GT CGTCGGT G AG ACGGCAC GCGCCG AT CAT GT C AGCTT C A ATGGCTAT G AGCGCG AT A CTTT CCC AC AGCTT GCC A AGAT CG AT GGCGT G ACC A ATTTT AGC AAT GT C AC ATCGT GC GGCACATCGACGGCGTATTCTGTGCCGTGTATGTTCAGCTATCTGGGCGCGGATGAGT ATGATGTCGAT ACCGCC AAATACC A AGAAAAT GTGCTGGAT ACGCT GG ATCGCTT GGGC GTAAGTATCTTGT GGCGT GAT AAT AATT CGG ACT C A AA AGGCGT GAT GGAT AAGCTGCC AAAAGCGCAATTT GCCGATT ATAAATCCGCGACCAACAACGCCAT CT GCAACACCAAT C CTT AT AACG AAT GCCGCGAT GTCGGT AT GCTCGTTGGCTT AGAT GACTTT GTCGCT GCC AAT A ACGGC AA AG AT AT GCT GAT CAT GCT GCACC A AAT GGGC AAT CACGGGCCT GCGT A TTTT AAGCGAT AT GAT GAAAAGTTT GCCAAATTC ACGCCAGCGT GT G AAGGT AAT GAGCT T GCC AAGT GCGA AC AT C AGTCCTT GAT C A AT GCTT AT G AC AATGCCTT GCTT GCC ACCG AT GATTT CAT CGCT CAAAGTAT CCAGT GGCT GCAGACGCACAGCAAT GCCT AT GAT GT C TCAATGCTGTATGTCAGCGATCATGGCGAAAGTCTGGGTGAGAACGGTGTCTATCTACA T GGT AT GCCAAAT GCCTTT GCACCAAAAGAACAGCGC AGT GT GCCT GCATTTTT CT GGA CGGAT AAGCAAACT GGCAT CACGCCAAT GGCAACCGATACCGTCCT GACCCAT GACGC GATCACGCCGACATTATTAAAGCTGTTTGATGTCACCGCGGACAAAGTCAAAGACCGCA CCGCATT CAT CCGCT GA
SEC ID NO: 11 ímcr-2) ATGACATCACATCACTCTTGGTATCGCTATTCTATCAATCCTTTTGTGCTGATGGGTTTG GT GGCGTT ATTTTT GGC AGCG AC AGCG AACCT G AC ATTTTTT G AA AA AGCG AT GGCGGT CTATCCTGTATCGGATAACTTAGGCTTTATCATCTCAATGGCGGTGGCGGTGATGGGTG CT AT GCT ACT G ATT GT CGTGCT GTT AT CCT ATCGCTAT GT GCT AA AGCCT GTCCT G ATTT TGCTACTGATTATGGGTGCGGTGACGAGCTATTTTACCGATACTTATGGCACGGTCTAT GACACCACCATGCTCCAAAATGCCATGCAAACCGACCAAGCCGAGTCTAAGGACTTGAT GAATTT GGCGTTTTTT GT GCGAATT AT CGGGCTT GGCGT GTT GCCAAGT GT GTT GGTCG C AGTT GCC A AAGT C AATT ATCC AAC AT GGGGC A AAGGTCT G ATT C AGCGT GCGAT G ACA T GGGGT GT C AGCCTT GTGCT GTT GCTT GT GCCGATT GG ACT ATTTAGC AGT C AGT ATGC GAGTTT CTTT CGGGT GCAT AAGCCAGT GCGTTTTT AT ATCAACCCGATTACGCCGATTT A TT CGGT GGGT AAGCTT GCCAGTAT CGAGT ACAAAAAAGCCACT GCGCCAACAGAC ACCA T CT AT C AT GCCA AAGACGCCGT GCAGACCACCAAGCCGAGCGAGCGT AAGCC ACGCCT AGT GGT GTT CGT CGT CGGT GAGACGGCGCGT GCT GACCAT GTGCAGTT CAAT GGCT AT GGCCGT GAGACTTT CCCGCAGCTT GCCAA AGTT G ATGGCTT GGCG AATTTTAGCCAAGT GACAT CGT GT GGCACAT CGACGGCGTATT CTGTGCCGT GT AT GTT CAGCT ATTT GGGT C AAGAT GACT AT GAT GTCGAT ACCGCCA A AT ACCAAG AA A ATGTGCTAG AT ACGCTT GAC CGCTT GGGT GT GGGT AT CTT GTGGCGT G AT AAT AATT C AG ACT C AA AAGGCGT G ATGGA T A AGCT ACCTGCCACGCAGT ATTTT G ATT AT AA AT C AGC AACC A AC A ATACCAT CT GT AA C ACC AATCCCTAT AACG A AT GCCGTGATGT CGGT AT GCTT GT CGGGCT AG AT GACT AT G T C AGCGCC AAT AAT GGC A AAGAT AT GCT C AT C AT GCT AC ACCA AAT GGGC A AT C ATGGG CCGGCGT ACTTT AAGCGTTAT GAT GAGCAATTT GCCAAATT CACCCCCGT GT GCGAAGG CAACGAGCTTGCCAAATGCGAACACCAATCACTCATCAATGCCTATGACAATGCGCTAC TT GCGACT GAT GATTTT AT CGCCAAAAGCAT CGATT GGCT AAAAACGCAT GAAGCGAAC T ACGAT GTCGCCAT GCT CT AT GT C AGT G ACC ACGGCG AG AGCTT GGGCG AA A ATGGT G TCT AT CT GCAT GGT ATGCCAAAT GCCTTT GCACCAAAAGAAC AGCGAGCT GT GCCT GCG TTTTTTT GGTC AA AT AAT ACG AC ATT C AAGCC A ACT GCC AGCG AT ACT GT GCT G ACGC AT GAT GCGATT ACGCCAACACT GCTT AAGCT GTTT GAT GT CACAGCGGGCAAGGTCAAAGA CCGCGCGGCATTT AT CC AGT AA
SEC ID NO: 12 (mcr-2.2) GTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGCGAGTGTTGCCGTTTTCTT GACCGCGACCGCCAATCTTACCTTTTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCATCGCGG ACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTCTTTGGCGCGATGCTACTGATC ACCACGCT GTT AT C AT CGTAT CGCT ATGT GCTAAAGCCT GTGTT GATTTT GCTATT AAT C AT GGGCGCGGT GACCAGTT ATTTT ACT GACACTT AT GGCACGGT CT AT GAT ACGACCAT GCT CCAAAATGCCCTACAGACCGACC AAGCCGAGACCAAGGATCTATT AAACGCAGCG TTT AT CATGCGT ATC ATT GGTTTGGGT GTGCT ACC AAGTTT GCTTGT GGCTTTT GTTAAG GT GGATT AT CCGACTT GGGGCAAGGGTTT GAT GCGCCGATT GGGCTT GAT CGT GGCAA GT CTTGCGCT GATTTT ACTGCCTGTGGT GGCGTT C AGC AGT C ATT AT GCC AGTTT CTTT C GCGTGCAT AAGCCGCT GCGT AGCT AT GT C AAT CCGAT CAT GCCAAT CT ACT CGGT GGGT A AGCTT GCCAGT ATT GAGT AT A AAAA AGCC AGT GCGCC A AA AGAT ACC ATTT AT C ACGC CA AAG ACGCGGTACAAGC AACCAAGCCT GAT AT GCGT AAGCCACGCCT AGT GGT GTT C GT CGT CGGT GAG ACGGCACGCGCCG AT CAT GT C AGCTT C A AT GGCTAT G AGCGCG AT A CTTT CCCAC AGCTT GCCA AGATCG AT GGCGT GACCA ATTTT AGC AAT GTC AC AT CGT GC GGCACAT CGACGGCGTATTCT GT GCCGT GT AT GTTCAGCT ATCTGGGCGCGGAT GAGT AT GAT GT CG AT ACCGCC AA AT ACCA AGA AA AT GT GCT GG AT ACGCT GG ATCGCTT GGGC GT AAGT AT CTT GTGGCGT GAT AAT AATT CGGACT CAAAAGGCGT GAT GGAT AAGCTGCC AAAAGCGCAATTTGCCGATT AT AAATCCGCGACCAACAACGCCAT CT GCAACACCAAT C CTTATAACGAATGCCGCGATGTCGGTATGCTCGTTGGCTTAGATGACTTTGTCGCTGCC AAT AACGGCAAAGATAT GCT GATCAT GCT GCACCAAAT GGGC AAT CACGGGCCT GCGTA TTTTAAGCGAT AT GAT GAAAAGTTT GCCAAATTC ACGCCAGCGT GT GAAGGT AAT GAGCT T GCC AAGT GCGA ACAT C AGTCCTT GATC A AT GCTT AT G AC AAT GCCTT GCTT GCC ACCG AT GATTT CAT CGCT CAAAGTAT CCAGT GGCT GC AGACGCACAGCAAT GCCTAT GAT GT C T C A AT GCTGTATGT C AGCG AT CAT GGCGA AAGT CT GGGT GAG AACGGT GTCTATCT ACA T GGT AT GCCAAATGCCTTTGCACC AAAAGAACAGCGCAGT GT GCCT GCATTTTTCTGGA CGGATAAGCAAACTGGCATCACGCCAATGGCAACCGATACCGTCCTGACCCATGACGC GATCACGCCGACATTATTAAAGCTGTTTGATGTCACCGCGGACAAAGTCAAAGACCGCA CCGCATTCATCCGCTGA
SEC ID NO: 13 ímcr-3)
AT GCCTT CCCTT AT AAAAAT AAAAATT GTT CCGCTT AT GTT CTTTTT GGCACT GT ATTTT G CATTT ATGCTG AACT GGCGT GGAGTTCTCCATTTTT ACGAAAT CCTTT ACAAATT AGAAG ATTTTAAGTTT GGTTTCGCCATTT C ATT ACC AAT ATT GCTTGTT GC AGCGCTT A ACTTT GT
GT GC A AT CGTT AGTT AC AC AAT GAT G AAGT ATAGAGTCTT GTTT G ATC AA AAC AT G ATT C AG AAT ATTTTT G AA ACC AATCAA AAT G AGGCGTT AGC AT ATTT AAGCTT ACC A ATT AT AGT AT GGGTT ACTATT GCT GGTTTT AT CCCT GCCATTTT ACTTTT CTTT GTT GAAATT GAAT AT GAGGAAAAAT GGTTCA AAGGGATTCTAACT CGT GCCCT AT CGAT GTTT GCAT CACTT AT A GT GATT GCGGTT ATT GCAGCACT AT ACT AT CAAGATT AT GT GT CAGT GGGGCGCA ACAA TT CAAACCTCC AGCGT GAG ATT GTTCC AGCC AATTT CGTT AAT AGT ACCGTT A AAT ACGT TTAC AATCGTT AT CTT GCT G AACC A AT CCC ATTT ACA ACTTT AGGT GAT GAT GC AA AACG GGAT ACTAATCAAAGT AAGCCCACGTT GAT GTTT CT GGT CGTT GGT GAAACCGCT CGT G GT AA AAATTT CTCGAT GAAT GGCT AT GAG AAAG AC ACC AAT CC ATTT ACC AGT AAAT CT G GTGGCGTGATCTCCTTTAATGATGTTCGTTCGTGTGGGACTGCAACCGCTGTATCCGTC CCCTGCAT GTTCTCCAATAT GGGGAGAAAGGAGTTT GAT GAT AAT CGCGCTCGCAATAG CG AGGGCCTGCT AG AT GT GTT GC A AA AAACGGGG AT CT CC ATTTTTT GGAAGG AG A ACG ATGGAGGCTGCAAAGGCGTCTGCGACCGAGTACCTAACATCGAAATCGAACCAAAGGA T CACCCT AAGTT CT GCGAT AAAAACACAT GCT AT GACGAGGTT GT CCTT CAAGACCT CG AT AGT GAAATT GCTC AA AT GA A AGGGG AT A AGCT GGTT GGCTT CC ACCT GAT AGGT AGC CAT GGCCCAACCT ACTACA AGCGCT ACCCT GAT GCT CAT CGT CAGTT CACCCCT GACT G TCC ACGC AGT GAT ATT GA A AACT GC AC AG AT G AAG AGCT C ACC AAC ACCT AT GAC AAC A CCAT CCGCT AC ACCGATTT CGT GATT GGAGAGAT GATT GCCAAGTT GAAAACCT ACGAA GAT AAGT AC A AC ACCGCGTT GCTCT ACGT CTCCGAT CAT GGT GAAT C ACT GGGAGC ATT AGGGCTTTACCTACACGGT ACACCGT ACCAGTTT GCACCGGAT GAT CAGACCCGT GTT C CT AT GC AGGT GT GGAT GT CACCT GGATTT ACCAA AGAGAAAGGCGTT GAT AT GGCGT GT TT GC AGC AG AAAGCCGCT GAT ACTCGTTACT C AC ACG AT AAT ATTTTCTC ATCT GT ATT G GGT AT CTGGGACGT CAAAACATCAGTTT ACGAAAAGGGT CT AGAT ATTTT CAGT CAAT GT CGTAATGTTCAATAA
SEC ID NO: 14 ímcr-3.2)
AT GCCTT CCCTT AT AAAAAT AAAAATT GTT CCGCTTATGTT CTTTTTGGCACT GT ATTTT G CATTTATGCTGAACTGGCGTGGAGTTCTCCATTTTTACGAAATCCTTTACAAATTAGAAG ATTTT AAGTTT GGTTT CGCCATTT CATT ACC AAT ATT GCTT GTTGCAGCGCTT AACTTT GT ATTT GTT CC ATTTT CG AT ACGGT ATTT AAT A AAGCCTTTTTTT GC ACTT CTT AT CGCACTT A GT GC A AT CGTT AGTT AC AC A AT GAT G AAGT ATAGAGT CTT GTTT G ATC AA A AC AT G ATT C AGAAT ATTTTT GAA ACCAAT CAAA AT GAGGCGTT AGCAT ATTT A AGCTT ACC AATT AT AGT AT GGGTT ACT ATTGCT GGTTTT ATCCCT GCC ATTTT ACTTTT CTTT GTT G A AATT G AAT AT GAGGAAAAAT GGTT CA AAGGGATT CTAACT CGT GCCCT AT CGAT GTTTGCAT CACTT AT A GT GATT GCGGTT ATT GCAGCACT AT ACT AT CAAG ATT AT GT GT CAGT GGGGCGCAACAA TT C A AACCT CC AGCGT G AGATT GTTCC AGCCAATTTCGTT AAT AGT ACCGTT A AAT ACGT TT AC AAT CGTT AT CTT GCT G AACC AATCCCATTT AC AACTTT AGGT GAT GATGC AAAACG GGATACT AAT C A AAGT A AGCCC ACGTT GAT GTTT CTGGTCGTT GGT GA A ACCGCT CGTG GT AAAAATTT CT CGAT GAAT GGCT AT GAG AAAGAC ACC AATCCATTT ACC AGT AAATCT G GT GGCGT GAT CT CCTTT AAT GAT GTT CGTTCGT GTGGG ACTGCAACCGCT GT ATCCGT C CCCT GCAT GTT CTCCAATAT GGGGAGA A AGGAGTTT GAT GAA AAT CGCGCT CGC AAT AG CGAGGGCCT GCT AGAT GT GTT GCAAAAAACGGGGAT CT CCATTTTTT GGAAGGAGAACG AT GGAGGCT GCAAAGGCGT CT GCGACCGAGT ACCT AACATCGAAAT CG AACC AAAGGA TC ACCCT A AGTT CT GCG AT A AA A AC AC AT GCTAT G ACGAGGTT GT CCTT C A AG ACCT CG AT AGT GAAATT GCT CAAAT GAA AGGGGATAAGCT GGTT GGCTTCCACCT GAT AGGT AGC CATGGCCCAACCTACTACAAGCGCTACCCTGATGCTCATCGTCAGTTCACCCCTGACTG T CCACGCAGT GAT ATT GAAAACTGCACAGAT GAAGAGCT CACCAACACCT AT GACAACA CC ATCCGCT AC ACCG ATTT CGT GATT GGAGAG AT GATT GCC AAGTT G AAA ACCT ACG AA GAT AAGT AC AAC ACCGCGTT GCT CT ACGT CTCCG AT CATGGT GAAT CACT GGGAGC ATT AGGGCTTT ACCTACACGGT ACACCGTACCAGTTT GCACCGG AT GAT C AGACCCGT GTT C CT AT GCAGGT GT GGAT GTCACCT GGATTT ACCAAAG AGAAAGGCGTT GAT AT GGCGT GT TT GC AGC AGA A AGCCGCT GAT ACTCGTT ACTC AC ACG AT AAT ATTTT CT C AT CTGT ATT G GGTATCTGGGACGTCAAAACATCAGTTTACGAAAAGGGTCTAGATATTTTCAGTCAATGT CGT AAT GTT CAATAA
SEC ID NO: 15 ímcr-4)
GT GATTT CT AGATTT AAGACGTT AT CGGTT AACCAATT CACTTT CAT C ACT GCGTT GTTTT AT GTT GCCATTTT CAAT CT ACCGCTCTTT GGT AT AGTGCGAAAAGGAATT GAAAAACAAC CAGAAGTT GAT CCCCTTTTCAT CGCATCTATGCCGCTATTTTT AACATTT GCGCT GAGTT TTTT GTTTT CAATTTTT ACCGT C A A ATACCT GCT GA AGCCCTTTTTT ATCGT ATT G ACGTT ACTTTCCT C AAGT GT ATTTTTT GC AGCCTAT CAAT AC AAT GT CGT GTTT G ACT ACGGC AT GAT AGAAAACACGTTTCA AACACATCCT GCT G AAGCATT GAT GT AT GT AAATCTTGC AT C A ATT ACC A AT CT ACTGCT GACT GGGCT ATT ACCGT CAT AT CTT ATTT AT AAGGCCG AT ATT C ATT AT C AGCCCTTTTTT A AGG AGTT ATT GCAT AA ATT AGCCTTT AT GCT GCT AAT GTTCG TT GGC ATT GGG AT AGTCGCCTTTTTTTACT AT C A AGATT ATGCT GC ATTT GTT CG AAAC AA C AGT GAGTT A AGGCGTT AC ATT GTCCCT ACCT ATTTT GTC AGT AGT GCAT CTA AATATCT CAAT GAGCACT ATTT GCAGACGCCCAT GGAAT ACCAACAACTT GGCCT AGAT GCGAAGA AT GCC AGTCGT AACCCGAAC ACT AA ACCT AACTT ATT AGTGGTT GTTGT GGGT GAAACT GCGCGCT CAAT GAGCT AT CAAT ATT AT GG AT AT A AC AAGCC AACCA AT GCT CAT ACCC AA AATCAGGGGCT GATT GCGTTT AACGAT ACT AGCTCAT GCGGC ACGGCCACGGCGGT GT CTCTACCCTGTAT GTTTT C ACG AAT GGGGCGGGCAGACT AT G ATCCTCGCCGT GCT AAT GCT C AAG AC AC AGT GATT GAT GT GTT AAGT CAT AGT GGT AT AA A AGT AC AGT GGTTT GAT AAT GATT CTGGCTGT AA AGGT GTGTGT GAT C AGGTT GA A AAT CT CACG AT AGATTT GAAG AGT G ATCCGAAGCT GTGTTCT GGCCA AT ATT GTTTT GACC AAGT ATT GCT C AAC AAATT A GAT AAAATTCTGGC AGT AGCACCA AGTCAAG AT ACAGT A ATTTTTTT GCAT AT CATTGGT AGT CAT GGACCAACTT ATT ATCTTAGATACCCGCCAGAGCATCGT AAATTT AT ACCGGAT T GTCCGCGCAGT GAT ATT CAAAATT GCAGT C AAG AAGAACTGATTAACACCT ACGACAA C ACT ATT CTATAT ACGG ATTTT ATT CTC AGTG A AGT GGT G AAT AAATT AA AAGGT A AGC A GGATAT GTT CG AT ACT GC A AT GCTGTATCT CT CT G ACCATGGT G AGT CTTT GGGT G AA AA GGGC AT GT ATTT AC AT GGT GCGCCCT AT AGT ATTGCACCG A AAG AAC AA ACT AGCGT AC CAAT GCT GGCTT GGGT AT CT AAT G ACTTTAGCC AAG AT AAT CAGTT G A ACAT G ACTT GT G TTGCACAGCGAGCAGAACAGGGCGGCTTTTCCCACGACAATTTGTTCGACAGTTTGCTA GGACTT AT GAAT GT AAAAACCACCGT CTAT CAGAGCCAACTCGAT ATTTTT GCACCTT GC AGGTATTAG

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, que comprende:
a. someter una muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas y generar una salida de espectro de masas; b. identificar en dicha salida de espectro de masas un primer pico definido indicativo de la presencia de lípido A modificado por fosfoetanolamina, en el que dicho primer pico definido es un pico presente en una salida de espectro de masas para el lípido A modificado por fosfoetanolamina y en el que dicho primer pico definido está ausente de una salida de espectro de masas correspondiente para el lípido A nativo; y
c. en el que la presencia de dicho primer pico definido indica la presencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica la ausencia de una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho lípido A modificado por fosfoetanolamina es una parte integral de una membrana bacteriana o un fragmento de la misma; y/o
en el que dicho análisis de espectrometría de masas comprende análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF; y/o en el que dicho primer pico definido comprende una relación masa/carga (m/z) de 120 a 125 unidades m/z mayor que un segundo pico definido indicativo de la presencia de lípido A nativo.
3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que dicho segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1793 a 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella entérica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca; b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1820 a 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1837 a 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1847 a 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 2059 a 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 2075 a 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1614 a 1620 m/z, preferiblemente 1617,2 m/z, para Pseudomonas aeruginosa;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1907 a 1913 m/z, preferiblemente 1910,3 m/z, para Acinetobacter baumannii;
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1793 a 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp;
j. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1820 a 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp; o
k. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 2031 a 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp; y/o
en el que una relación de intensidad de:
el primer pico definido; con respecto al
segundo pico definido es al menos 0,10:1.
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además identificar en dicha salida de espectro de masas un tercer pico definido que comprende una relación masa/carga (m/z) de 22 a 28 unidades m/z mayor que un segundo pico definido indicativo de la presencia de lípido A nativo.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que dicho segundo pico definido se selecciona del grupo que consiste en:
a. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1793 a 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Escherichia coli, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter spp. y Klebsiella oxytoca; b. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1820 a 1826 m/z, preferiblemente 1823,9 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
c. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1837 a 1843 m/z, preferiblemente 1840 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
d. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1847 a 1853 m/z, preferiblemente 1850 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
e. un pico que comprende una relación masa-carga (m/z) de 2059 a 2065 m/z, preferiblemente 2062 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
f. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 2075 a 2081 m/z, preferiblemente 2078 m/z, para Klebsiella pneumoniae;
g. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1793 a 1799 m/z, preferiblemente 1796,2 m/z, para Salmonella spp;
h. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 1820 a 1826 m/z, preferiblemente 1824 m/z, para Salmonella spp; o
i. un pico que comprende una relación masa/carga (m/z) de 2031 a 2037 m/z, preferiblemente 2034 m/z, para Salmonella spp.
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una relación de intensidad de: el tercer pico definido; con respecto al
segundo pico definido es al menos 0,15:1, o al menos 0,6:1; y/o
en el que una relación de:
la suma de la intensidad de dicho primer pico definido y la intensidad de dicho tercer pico definido; con respecto a la intensidad de dicho segundo pico definido es al menos 0,15:1; preferiblemente al menos 0,5:1.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico a través de la resistencia codificada por plásmido comprende un plásmido que tiene un gen de resistencia a colistina movilizado; opcionalmente
en el que dicho gen de colistina movilizado comprende uno o más de un gen similar a mcr, mcr-1, mcr-1.1, mcr-1.2, mcr-1.3, mcr-1.4, mcr-1.5, mcr-1.6, mcr-1.7, mcr-1.8, mcr-1.9, mcr-1.10, mcr-2, mcr-2.2, mcr-3, mcr-3.2, mcr-4, mcr-5, SEQ ID: 1, SEQ ID: 2, SEQ ID: 3, SEQ ID: 4, SEQ ID: 5, SEQ ID: 6, SEQ ID: 7, SEQ ID: 8, SEQ ID: 9, SEQ ID: 10, SEQ ID: 11, SEQ ID: 12, SEQ ID: 13, SEQ ID: 14, SEQ ID: 15, SEQ ID: 16, o una secuencia que tiene al menos un 50% de homología con las mismas.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de ensayo se mezcla con una solución matriz antes de someter dicha muestra de ensayo a análisis de espectrometría de masas, opcionalmente en el que dicha solución matriz permite la extracción selectiva, co-cristalización e ionización de lípido A nativo y/o lípido A modificado como parte integral de una membrana bacteriana; y/o
en el que la solución matriz comprende ácido 2,5-dihidroxibenzoico suspendido en un disolvente orgánico, opcionalmente en el que dicho disolvente orgánico comprende cloroformo y metanol en una relación de 6:1 a 12:1, o en una relación de 9:1 v/v.
en el que dicho disolvente orgánico comprende cloroformo, metanol, diclorometano, éter, éter dietílico, éter de petróleo, isopropanol, butanol, hexano o una combinación de los mismos; opcionalmente
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que la relación de la muestra de ensayo con respecto a la solución matriz está entre 0,1:1 y 2:1 v/v, o 0,66:1 v/v.
10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de ensayo comprende entre 101 y 1010 células bacterianas; y/o
en el que dicho antibiótico de polipéptido catiónico cíclico es un antibiótico de polimixina; preferiblemente en el que dicho antibiótico de polimixina es uno o más de colistina (polimixina E), polimixina B, matacina (polimixina M) o una sal de las mismas.
11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha bacteria se selecciona entre los siguientes géneros: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Raoultella y combinaciones de los mismos; y/o
en el que dicha bacteria se selecciona entre las siguientes especies: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter youngae y combinaciones de las mismas.
12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha bacteria se inactiva por calor o en el que dicha bacteria no se inactiva por calor; y/o en el que dicha muestra de ensayo se procesa para eliminar la sal; y/o
que comprende además la etapa de registrar los datos obtenidos en la etapa (a) en un soporte de datos adecuado.
13. Procedimiento de cribado para identificar un inhibidor de la resistencia a antibióticos de polipéptidos catiónicos cíclicos en una bacteria, que comprende:
a. incubar una muestra que comprende una bacteria resistente a un antibiótico de polipéptido catiónico cíclico con un inhibidor candidato;
b. someter dicha muestra a análisis de espectrometría de masas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y generar una salida de espectro de masas; y
c. identificar la presencia o ausencia de dicho primer pico definido en la salida del espectro de masas;
en el que la presencia de dicho primer pico definido indica que dicho inhibidor candidato no es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria, y en el que la ausencia de dicho primer pico definido indica que dicho inhibidor candidato es una sustancia capaz de inhibir la resistencia a antibióticos de polipéptido catiónico cíclico en una bacteria.
14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que dicho inhibidor candidato se selecciona entre cualquiera de un compuesto natural, un compuesto químico sintético, péptido, un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de anticuerpo, preferiblemente en el que dicho inhibidor candidato es una sustancia química o sustancia farmacéutica seleccionada de una biblioteca de tales inhibidores candidatos; y/o en el que dicha muestra es de un ser humano o de un animal no humano.
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